JP2005503756A - 硫酸化部分を含むエピトープを含む単離分子、当該エピトープに対する抗体、及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、がん細胞表面に存在して細胞ローリング、転移及び炎症などの生理現象で重要な役割を果たすエピトープ類を提供する。該エピトープ類に結合しうる抗体類を使用した治療診断方法及び組成物も提供される。本発明の方法と組成物は腫瘍の成長や転移を含めたがん、白血病、自己免疫疾患及び炎症性疾患などの疾患の診断治療に使用することができる。

Description

【０００１】
発明の背景技術
［１．］ 本発明は、がん細胞、転移性細胞、白血病細胞及び血小板などの細胞表面に存在し、かつ細胞ローリングや転移、炎症、自己免疫疾患たとえば特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、細胞接着、血栓症及び／又は再狭窄、凝集など多様な生理現象で重要な役目を果たすエピトープに関連する。本発明は該エピトープへの抗体を使用した治療診断方法及び治療診断用組成物に関連する。本発明はまた、ターゲット細胞に特異的に結合するペプチド及びポリペプチドの、ファージ提示型ライブラリー技術の援用による、組織ターゲッティング及び同定という分野に関連する。さらに詳細には、該ペプチド及びポリペプチドは抗がん活性、抗転移活性、抗白血病活性、抗ウイルス活性、抗感染活性、及び／又は他疾患たとえば炎症性疾患、異常な又は病因性の細胞接着、血栓症及び／又は再狭窄を伴う疾患、異常又は病因性凝集を伴う疾患、及び自己免疫疾患、心臓血管疾患たとえば心筋梗塞、網膜疾患、硫酸化チロシン依存性タンパク質−タンパク質相互作用に起因する疾患、及び病変細胞一般に対抗する活性を有するであろう。
【０００２】
発明の背景技術
抗体、ファージ提示、及び組織ターゲッティング
［２．］ 治療薬の組織選択的ターゲティングは製薬産業の新分野である。ターゲッティングを基礎にした新しいがん治療は副作用を緩和しながら治療の特異性と効能を強めることにより、全般的な有効性を高めることを狙っている。腫瘍関連抗原へのマウス・モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は腫瘍への毒素、放射性ヌクレオチド及び化学療法用コンジュゲートのターゲティングに使用されてきた。また分化抗原のＣＤ１９やＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５は造血組織悪性腫瘍の治療でがん特異的ターゲットとされてきた。広範囲にわたる研究にもかかわらず、このアプローチにはいくつかの限界がある。第１に選択的結合を示す好適なモノクローナル抗体の単離が困難である。第２に抗体の単離を成功させる前提条件として高い抗体免疫原性が求められる。第３に最終生成物は非ヒト配列を含むため、非ヒト物質への免疫応答（たとえばヒト抗マウス抗体−ＨＡＭＡ応答）を引き起こす。このＨＡＭＡ応答はしばしば血清半減期を短縮する結果となり反復治療の妨げとなるため、抗体の治療上の価値を減じる。そのため、マウス起源のキメラ又はヒト化モノクローナル抗体の設計とヒト抗体の発見に関心が向けられようになった。このアプローチには既知の精製抗原だけを対象とする単一抗体種しか単離できないという限界もある。また、この方法は悪性細胞だけでなく正常細胞にも存在する細胞表面マーカーへの抗体の単離を許すという意味で非選択的である。
【０００３】
［３．］ がん治療面でのＭＡｂの治療有効性を左右する因子はたくさんある。たとえば腫瘍細胞表面での抗原発現の特異性や発現レベル、抗原異質性、腫瘤のアクセスビリティーなどである。白血病とリンパ腫は一般に充実性腫瘍たとえばがん腫よりも抗体治療への感受性が高い。ＭＡｂは血流中で白血病及びリンパ腫細胞と急速に結合し、リンパ組織内の悪性細胞へと容易に侵入するので、リンパ腫はＭＡｂ療法の格好の候補となる。理想的なシステムは、悪性子孫細胞を産生する幹細胞の表面マーカーを認識するＭＡｂの同定を伴う。
【０００４】
［４．］ ファージ提示型ライブラリーは単離された所定のターゲットタンパク質たとえば抗体、ホルモン及び受容体に結合するランダム単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）の選択に使用する。さらに、一般に抗体ライブラリーの使用、特にファージ提示型ｓｃＦｖライブラリーの使用は、特異的な（ただし未認識、未判明の）細胞表面部分をターゲッティングするための独特の分子を発見する代替手段を容易にする。
【０００５】
［５．］ 白血病、リンパ腫及び骨髄腫は骨髄及びリンパ組織に起源をもつがんであり、細胞の無制約的な増殖を伴う。急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）は特異な臨床的、免疫学的特徴によって定義される不均一な疾患である。ほとんどのＢ細胞ＡＬＬ（Ｂ−ＡＬＬ）の決定的な原因は他種ＡＬＬの場合と同様不明であるが、この疾患は多くの場合、単細胞ＤＮＡに生じた後天的遺伝子変異に起因し、該細胞を異常化し連続的に増殖させる。Ｂ−ＡＬＬ患者の予後は小児、成人どちらの場合も他の白血病患者に比して著しく悪い。
【０００６】
［６．］ 急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、正常条件下で骨髄性系の最終分化細胞（赤血球、顆粒球、単球及び血小板）となる前駆細胞をもつ不均一腫瘍群である。ＡＭＬは他の腫瘍形成と同様に後天性遺伝子変異に関連し、そうした変異の結果として比較的未分化の芽細胞が正常分化骨髄性細胞に取って代わり、１つ又は複数のタイプの初期骨髄性分化を示す。ＡＭＬは一般に骨髄で、またある程度まで二次造血器でも起こる。ＡＭＬ患者は主に成人であり、罹患率のピーク年齢層は１５〜４０歳であるが、小児と高齢者もＡＭＬにかかることが判明している。ほぼすべてのＡＭＬ患者は、循環未分化芽細胞の異常レベルが解消された臨床的寛解期を迎えるためには、診断後ただちに治療を受ける必要がある。
【０００７】
［７．］ これまでに、腫瘍細胞への細胞溶解活性を誘発するような多様なモノクローナル抗体が開発されてきた。Ｐ１８５増殖因子受容体（ＨＥＲ２）の細胞外ドメインへのヒト化モノクローナル抗体ＭｕＭＡｂ４Ｄ５はＦＤＡ（米国食品治療薬品局）の承認をすでに受け、ヒト乳がんの治療に使用されている（米国特許第５，８２１，３３７号及び５，７２０，９５４号）。この抗体は結合後、増殖因子受容体ＨＥＲ２に依存する腫瘍細胞の増殖を阻害することができる。加えて、リンパ腫に関連するものを含めた末梢血Ｂ細胞の急速な減少を引き起こすＣＤ２０へのキメラ抗体も最近ＦＤＡの承認を受けた（米国特許第５，８４３，４３９号）。この抗体はターゲット細胞に結合すると補体依存性溶解を招く。この抗体製品は最近承認され、現在、軽度悪性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫の治験に使用されている。
【０００８】
［８．］ 他に数種のヒト化及びキメラ抗体が開発中又は治験段階にある。また、ほとんどのタイプの骨髄性白血病細胞だけでなく正常骨髄性細胞の表面でも発現するＣＤ３３抗原と特異的に反応するヒト化Ｉｇを抗がん薬カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）に結合したＣＭＡ−６７６も生まれている［Ｓｉｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， ３０８， ５０４ａ （１９９７）］。このコンジュゲートはＭｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）という商品名で知られ、すでにＦＤＡの承認を受けている［Ｃａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， ７３， １０４９−１０５６ （１９９４）］。その細胞溶解活性に照らして追加の抗ＣＤ３３抗体（ＨｕｍＭ１９５）（目下治験段階にある）が、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）毒素を含む数種の細胞毒に結合されたり［ＭｃＧｒａｗ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．， ３９， ３６７−３７４ （１９９４）］、放射性同位体^１３１Ｉ ［Ｃａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８３， １７６０−１７６８ （１９９４）］、^９０Ｙ ［Ｊｕｒｃｉｃ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， ９２， ６１３ａ （１９９８）］、及び^２１３Ｂｉ ［Ｈｕｍｍ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， ３８：２３１Ｐ （１９９７）］に結合されたりしている。
【０００９】
［９．］ 白血球抗原ＣＤ４５へのキメラ抗体（ｃＨｕＬｙｍ３）はヒト白血病及びリンパ腫の治験段階にある［Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．， ４８， ５９５−６０２ （２０００）］。ｉｎ ｖｉｔｒｏのＡＤＣＣ （抗体依存性細胞媒介性細胞障害）アッセイでは特異的細胞溶解が観察された［Ｈｅｎｋａｒｔ， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， １， ３４３−３４６ （１９９４）； Ｓｑｕｉｅｒ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６， ４４７−４５２ （１９９４）］。
【００１０】
［１０．］ マウスモノクローナル抗体のヒト化やキメラ抗体の構築とは対照的に、ファージ提示技術の使用は完全ヒト配列を含むｓｃＦｖの単離を可能にする。ファージ提示技術に由来するｓｃＦｖクローンを土台にしたヒトＴＧＦｂ２受容体への完全ヒト抗体が最近開発された。このｓｃＦｖは、ＴＧＦｂ２の結合と競合しうる完全ヒトＩｇＧ４へと変換されると［Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２２７， １７−２９ （１９９９）］、強い抗増殖活性をもつ。この周知技術は以下の出版物にさらに詳しく記載されている： Ｓｍｉｔｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２８， １３１５ （１９８５）； Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９， ３８６−３９０ （１９９０）； Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， ８７， ６３７８−６３８２ （１９９０）； Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９， ４０４−４０６ （１９９０）； Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １３（１４）， ３２４５−３２６０ （１９９４）； Ｂａｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ８， ３０９−３１４ （１９９０）； ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３４８， ５５２−５５４ （１９９０）； Ｎｉｓｓｉｍ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １３， ６９２−６９８ （１９９４）； 米国特許第５，４２７，９０８号、５，４３２，０１８号、５，２２３，４０９号及び５，４０３，３８４号明細書。
【００１１】
単離 ｓｃＦｖ 抗体分子に対応するリガンド
［１１．］ 血小板、フィブリノゲン、ＧＰＩｂ、セレクチン及びＰＳＧＬ−１は各々、いくつかの病因性状態又は病態たとえば異常又は病因性炎症、異常又は病因性免疫反応、自己免疫反応、転移、異常な又は病因性の細胞接着、血栓症及び／又は再狭窄、異常又は病因性凝集で重要な役割を果たす。従って、血小板やこれらの分子と交差反応する抗体はこれらや他の病因性状態を伴う疾患及び障害の診断治療に有用であろう。
【００１２】
血小板
［１２．］ 血小板は特性の解明が進んだ血液系成分であり、止血や血栓症及び／又は再狭窄、及び再狭窄でいくつかの重要な役割を果たす。血管の損傷は一連の連続事象を特徴とする止血過程を発動させる。血管損傷への最初の反応は血管内壁患部への血小板の接着である。次の段階では、前段階で接着した血小板の上に多層の血小板が凝集し、止血栓を形成する。この血小板の塊が血管壁をふさぐ。止血栓はフィブリンポリマーの沈着により強化される。この凝血塊は損傷が修復されて初めて分解される。
【００１３】
転移における血小板の重要性
［１３．］ 腫瘍の転移はおそらくがん患者の生存を限定する最大の因子である。蓄積データによれば、腫瘍細胞の宿主血小板との相互作用能は不可欠の転移決定因である。Ｌｅｓｌｉｅ Ｏｌｅｋｓｏｗｉｃｚ， Ｚ．Ｍ．， “Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｕｍｏｒ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ： Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｌａｔｅｄ ＧＰＩｂ ａｎｄ ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩ ａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｂｙ ＭＣＦ−７ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ，”（血小板の腫瘍凝集の解析： ＭＣＦ−７乳がん細胞による免疫関連ＧＰＩｂ及びＧＰＩＩｂ／ＩＩＩ ａ発現の役割） Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７９： ２６１−２７４ （１９９５）．
【００１４】
［１４．］ 腫瘍細胞の血小板凝集能が腫瘍細胞の転移能と相関することは証明済みであり、血小板の腫瘍凝集の阻害が転移の抑制と相関することもすでにげっ歯類モデルで示されている。すでに証明されているように、腫瘍細胞と血小板の相互作用は膜接着分子とアゴニスト分泌に関連する。腫瘍細胞株では免疫関連血小板糖タンパク質の発現がすでに確認されている。免疫関連血小板糖タンパク質ＧＰＩｂ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩ ａ、ＧＰＩｂ／ＩＸ及びインテグリンα_ｖサブユニットが乳がん細胞株の表面で発現することは証明済みである。Ｏｌｅｋｓｏｗｉｃｚ， Ｚ．Ｍ．， “Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｕｍｏｒ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ： Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｌａｔｅｄ ＧＰＩｂ ａｎｄ ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩ ａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｂｙ ＭＣＦ−７ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ，”（血小板の腫瘍凝集の解析： ＭＣＦ−７乳がん細胞による免疫関連ＧＰＩｂ及びＧＰＩＩｂ／ＩＩＩ ａ発現の役割） Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７９： ２６１−２７４ （１９９５）； Ｋａｍｉｙａｍａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， “Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｆａｃｔｏｒｓ： ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｎｄ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ， ｉｍｍｕｎｅ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ ｐｕｒｐｕｒａ， ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ−ｒｅｌａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ ｐｕｒｐｕｒａ， ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ，”（血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩ ａ−フィブリノゲン結合の血清因子による阻害： 血友病、免疫性血小板減少紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス関連免疫性血小板減少紫斑病及び全身性エリテマトーデスの患者を対象とした循環免疫複合体及び血小板抗体の研究） Ｊ． Ｌａｂ Ｃｌｉ Ｍｅｄ １１７（３）： ２０９−１７ （１９９１）．
【００１５】
［１５．］ Ｇａｓｉｃ ［Ｊ．Ｔ．Ｂ． Ｇａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ６１： ４６−５２ （１９６８）］と共同研究者たちは、抗体誘発血小板減少症がＣＴ２６大腸腺がん、Ｌｅｗｉｓ肺腺がん及びＢ１６メラノーマによって産生される転移巣の数と体積を著しく減少させることを示した。Ｋａｒｐａｔｋｉｎ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．， “Ｒｏｌｅ ｏｆ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｔｕｍｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ，”（ｉｎ ｖｉｔｒｏ血小板腫瘍相互作用及びｉｎ ｖｉｖｏ転移巣形成における接着タンパク質の役割） Ｊ． Ｃｌｉ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８１ （４）： １０１２−９ （１９９８）； Ｃｌｅｚａｒｄｉｎ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．， “Ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｉｂ／ＩＸ ａｎｄ ＩＩｂ／ＩＩＩ ａ， ａｎｄ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｌｐｈａ−ｇｒａｎｕｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ ｃｅｌｌｓ，”（ヒト骨肉種細胞が誘発する血小板凝集における血小板膜糖タンパク質Ｉｂ／ＩＸ 及び ＩＩｂ／ＩＩＩ ａと血小板α顆粒タンパク質の役割） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３（１９）： ４６９５−７００ （１９９３）． さらに、ＧＰＩｂと密接に関連しかつ不完全又は異常Ｏ−グリコシル化ＧＰＩｂαサブユニットに対応する単鎖ポリペプチド （６０ｋｄ）がＨＥＬ細胞の表面膜上で発現することが見い出された。Ｋｒｉｅｆｆｅｒ， Ｎ． ｅｔ ａｌ．， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｂ ａｌｐｈａ ｉｎ ＨＥＬ ｃｅｌｌｓ，”（ＨＥＬ細胞での血小板ＧＰＩｂαの発現） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６１（３４）： １５８５４−６２ （１９８６）．
【００１６】
ＧＰＩｂ 複合体
［１６．］ 止血過程の各段階は血小板表面受容体の存在を必要とする。止血で重要な一受容体はＧＰ（糖タンパク質）Ｉｂ−ＩＸ複合体（別名ＣＤ４２）である。この受容体は血管内皮下層中のフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）を結合することにより損傷部位血管壁への血小板の接着（初期結合）を媒介する。この受容体はまた、止血で重要な他の２つの血小板機能すなわち（ａ）動脈狭窄部の高ずり応力により誘発される血小板凝集及び（ｂ）低トロンビン濃度により誘発される血小板活性化でも決定的な役割を担う。
【００１７】
［１７．］ ＧＰＩｂ−ＩＸ複合体は血小板細胞膜外表面の主要成分でもある。ＧＰＩｂ−ＩＸ複合体は３つの膜スパンポリペプチドすなわちジスルフィド結合したＧＰＩｂの１３０ｋＤａ α鎖と２５ｋＤａ β鎖、それに非共有的に結合したＧＰＩＸ（２２ｋＤａ）を含む。血小板膜上には４ユニットすべてが等量比で存在し細胞表面でのＣＤ４２複合体の効率的な発現と機能を実現するが、このことは細胞膜上での完全な発現には３サブユニットが複合体へと適正に構成される必要があることを示唆する。ＧＰＩｂのα鎖は３つの明確な構造ドメインからなる： （１）ロイシンリッチリピート配列とＣｙｓ結合隣接配列とを含む球状のＮ末端側ペプチドドメイン； （２）高グリコシル化ムチン様マクログリコペプチドドメイン； 及び（３）ＧＰＩｂβとのジスルフィド結合と膜貫通及び細胞質内配列を含む膜会合Ｃ末端側領域。
【００１８】
［１８．］ いくつかの証拠によれば、ＧＰＩｂ−ＩＸ複合体のｖＷＦ及びトロンビン結合ドメインはＧＰＩｂαのＮ末端側の約３００アミノ酸にまたがる球状ドメインに存在する。ヒト血小板ＧＰＩｂ−ＩＸ複合体は血小板の機能と反応性の両方を媒介する重要な膜受容体である。内皮下層ｖＷＦのＧＰＩｂによる認識は血管損傷部への血小板の接着を可能にする。さらにＧＰＩｂαへのｖＷＦの結合もまた、ＧＰＩｂ−ＩＸの細胞質内ドメインの細胞骨格又はホスホリパーゼＡ２との相互作用を伴う場合もある血小板の活性化を誘発する。さらに、ＧＰＩｂαはαトロンビンの高アフィニティー結合部位を含むが、αトロンビンもまた、未解明の点が多い機構により、血小板の活性化を促す。
【００１９】
［１９．］ ＧＰＩｂαのＮ末端側球状ドメインは負荷電アミノ酸群を含む。いくつかの証拠によれば、ＧＰＩｂ−ＩＸ複合体を発現する形質転換ＣＨＯ細胞と血小板ＧＰＩｂαでは、このドメインに含まれる３個のチロシン残基（Ｔｙｒ−２７６、Ｔｙｒ−２７８、Ｔｙｒ−２７９）が硫酸化している。
【００２０】
タンパク質の硫酸化
［２０．］ タンパク質の硫酸化は広く見られる翻訳後修飾であり、糖側鎖又はポリペプチド骨格への硫酸基の酵素的共有結合を伴う。この修飾はゴルジ体トランス層で起こるので、トランス層を横断するタンパク質だけに影響する。そうしたタンパク質の例は分泌タンパク質、顆粒へと導かれるタンパク質、及び細胞膜タンパク質の細胞外領域などである。硫酸化されることが目下判明しているアミノ酸はチロシンである。Ｊ．Ｗ． Ｋｅｈｏｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌ． ７： Ｒ５１−Ｒ６１ （２０００）． おそらく他のアミノ酸たとえばトレオニンもまた、特に病変細胞では硫酸化されるであろう。
【００２１】
［２１．］ 多数のタンパク質がチロシン硫酸化をこうむると判明しているが、ＧＰＩｂのように単一ポリペプチド中に３個以上の硫酸化チロシンが存在するのは珍しい。ＧＰＩｂα （ＣＤ４２）は血小板と巨核球により発現され、ｖＷＦとの結合を介して内皮下層への、また内皮下層上での、血小板の結合とローリングを媒介するが、それに加えてＮ末端側ドメインに多数の負電荷を含む。そうした高酸性及び親水性環境は硫酸化の必要条件であると考えられる。というのは、チロシン硫酸化酵素は酸性アミノ酸残基に隣接するチロシンを特異的に認識し硫酸化するからである。Ｊ．Ｒ． Ｂｕｎｄｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．， ＪＢＣ ２７１： ２１７００−２１７０５ （１９９７）． ＧＰＩｂαの酸性領域の完全硫酸化により著しく高い負電荷密度の領域（１９アミノ酸の区間に１３の負電荷）が出現し、そこが他タンパク質との静電的相互作用の候補部位となる。
【００２２】
セレクチンと ＰＳＧＬ−１
［２２．］ Ｐ−、Ｅ−及びＬ−セレクチンは、血管内皮細胞上での白血球ローリングの媒介などを行う細胞接着分子ファミリーである。Ｐ−セレクチンは血小板の顆粒中に貯蔵され、トロンビン、ヒスタミン、ホルボールエステル又は他の刺激分子による活性化後に表面へと運ばれる。Ｐ−セレクチンは活性化内皮細胞上でも発現される。Ｅ−セレクチンは内皮細胞上で、またＬ−セレクチンは好中球、単球、Ｔ細胞及びＢ細胞上で、それぞれ発現される。
【００２３】
［２３．］ ＰＳＧＬ−１ （Ｐ−Ｓｅｌｅｃｔｉｎ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｇａｎｄ−１、別名ＣＤ１６２）はＰ−セレクチン、Ｅ−セレクチン及びＬ−セレクチンのムチン糖タンパク質リガンドである。ＰＳＧＬ−１はＰＡＣＥ（塩基性アミノ酸対変換酵素）切断部位をもつジスルフィド結合ホモ二量体である。ＰＳＧＬ−１はまた３つの潜在的なチロシン硫酸化部位とそれに続く、プロリン、セリン及びトレオニンに富む約１５の十量体繰返し配列をもつ。ＰＳＧＬ−１の細胞外部分は３つのＮ結合型グリコシル化部位を含み、また多数のシアリル化、フコシル化Ｏ結合型オリゴ糖分枝鎖をもつ。Ｋ．Ｌ． Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， ＪＢＣ １１８：４５５−４５６ （１９９２）． 大部分のＮ−グリカン部位と多数のＯ−グリカン部位は占有されている。ヒトＨＬ−６０細胞に由来するＰＳＧＬ−１のＯ−グリカンの構造はすでに決定されている。これらのＯ−グリカンのサブセットは、セレクチンへの結合に必要とされるコア−２、シアリル化及びフコシル化構造である。Ｐ−セレクチンとＬ−セレクチンへの結合ではＰＳＧＬ−１のＮ末端側領域のチロシン硫酸化もまた必要とされる。さらに、おそらく翻訳後に切断されると思われるＮ末端側ポリペプチドが存在する。
【００２４】
［２４．］ ＰＳＧＬ−１はＨＬ６０細胞では３６１残基を有し、うち２６７残基は細胞外領域に、２５残基は膜貫通領域に、また６９残基は細胞内領域に、それぞれ存在する。ＰＳＧＬ−１のコード配列は単一エキソン内にあるため選択的スプライシングは不可能なはずである。しかし、ＰＳＧＬ−１はＨＬ−６０細では、また大部分の細胞株でも、細胞外領域に存在する１０残基コンセンサス配列からなる１５の連続繰返し配列をもつが、多形核白血球、単球、及び他の数種の細胞株たとえば大部分の天然白血球ではこの繰返し配列が１４及び１６である。ＰＳＧＬ−１は細胞表面でジスルフィド結合ホモ二量体を形成する。Ｖ． Ａｆｓｈａｒ−Ｋｈａｒｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９７：３３０６−３３１２ （２００１）．
【００２５】
［２５．］ ＰＳＧＬ−１は好中球表面では２５０ｋＤａ及び１６０ｋＤａの両見かけ分子質量の二量体として発現するが、ＨＬ−６０表面では二量体型は〜２２０ｋＤａである。還元条件下で分析すると各サブユニットは分子質量が半減する。分子質量の差は、異なる数の十量体繰返し配列の存在に起因する分子の多形性によるものであろう。Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＶＩ． Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｔ． Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９９７）．
【００２６】
［２６．］ ＰＳＧＬ−１はほとんどの血中白血球たとえば好中球、単球、白血球、Ｂ細胞サブセット及び諸々のＴ細胞の表面で発現し、Ｐ−セレクチン上での好中球ローリングを媒介する。Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＶＩ． Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｔ． Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９９７）． ＰＳＧＬ−１はまたＬ−セレクチンとの結合を介して好中球−好中球相互作用を媒介し、もって炎症を媒介する可能性もある。Ｓｎａｐｐ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９１（１）：１５４−６４ （１９９８）．
【００２７】
［２７．］ ＰＳＧＬ−１は活性化内皮細胞上、活性化血小板上、及び他の白血球及び炎症部位上での白血球ローリングを媒介する。
【００２８】
［２８．］ ヒトＰＳＧＬ−１への市販のモノクローナル抗体（ＫＰＬ１）が生成され、ＰＳＧＬ−１とＰ−セレクチンとの、またＰＳＧＬ−１とＬ−セレクチンとの相互作用を阻害することが示された。ＫＰＬ１のエピトープをマッピングによりＰＳＧＬ−１のチロシン硫酸化コンセンサスモチーフ（ＹＥＹＬＤＹＤ）と同定した。ＫＰＬ１はこの特定エピトープだけを認識し、他の細胞たとえばＢ−ＣＬＬ細胞、ＡＭＬ細胞、転移性細胞、多発性骨髄腫細胞などの表面に存在する硫酸化エピトープとは交差反応しない。
【００２９】
［２９．］ 白血球ローリングは炎症で重要であり、血管壁上での白血球の係留とローリングには（活性化内皮細胞により、また傷害部位に動員される赤血球上で、発現される） Ｐ−セレクチンとＰＳＧＬ−１の相互作用が関係している。Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ９８ （１８）：１０１６６−７１ （２００１）； Ａｆｓｈａｒ−Ｋｈａｒｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９７（１０）：３３０６−７ （２００１）．
【００３０】
［３０．］ 白血球ローリングは転移でも重要であり、内皮細胞上のＰ−及びＥ−セレクチンは転移細胞に結合して、血流から周囲組織への溢出を容易にする。
【００３１】
［３１．］ 血小板もまた転移過程に関与する。すなわち、転移がん細胞が血流に入ると、腫瘍細胞を被覆する血小板と白血球からなる多細胞複合体が形成される。これらの複合体は、微小栓子といってもよいが、腫瘍が免疫系から逃れるのを手助けする。血小板による腫瘍細胞の被覆では血小板によるＰ−セレクチンの発現が必要となる。
【００３２】
［３２．］ Ｐ−及びＬ−セレクチンの阻害物質であるヘパリンによる処理は腫瘍細胞−血小板相互作用を阻害する。シアリル化、フコシル化ムチンリガンドを解離するＯ−シアロ糖タンパク質分解酵素による腫瘍の前処理もまた、腫瘍細胞−血小板間の複合体の形成を阻害した。ｉｎ ｖｉｖｏ実験ではいずれの処理も単球の循環腫瘍細胞との会合を増進する結果となるが、これは血小板の結合を抑制すると免疫細胞による循環腫瘍細胞へのアクセスが増すことを示唆する。Ｖａｒｋｉ ａｎｄ Ｖａｒｋｉ， Ｂｒａｚ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｓ． ３４（６）： ７１１−７ （２００１）．
【００３３】
［３３．］ ＰＳＧＬ−１とＧＰＩｂは構造的に類似しており、ムチン様の高グリコシル化リガンド結合領域を有する。Ａｆｓｈａｒ−Ｋｈａｒｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９７（１０）： ３３０６−７ （２００１）．
【００３４】
［３４．］ ＰＳＧＬ−１は各種の白血球すなわち単球、リンパ球、活性化末梢血Ｔ細胞、顆粒球、好酸球、血小板の表面で、またある種のＣＤ３４陽性幹細胞やＢ細胞サブセットの表面でも検出されている。Ｐ−セレクチンは活性化血小板及び内皮細胞の表面で発現される。Ｐ−セレクチンとＰＳＧＬ−１の間の相互作用は血管壁上での白血球ローリングを促進し、また血管部位への白血球の異常集積は種々の病理的炎症を招く。Ｐ−セレクチンのＰＳＧＬ−１への結合ではＰＳＧＬ−１上の個別チロシン硫酸の立体特異的寄与が重要である。結合には電荷もまた重要であり、ＮａＣｌを（１５０ｍＭから５０ｍＭへと）薄めると結合が強まった（Ｋｄ〜７５ｎＭ）。ＰＳＧＬ−１上でのチロシン硫酸化はＰＳＧＬ−１のＰ−セレクチンへの接着を強めるが、究極の必要条件ではない。ＰＳＧＬ−１チロシン硫酸化はあらゆるずり速度でローリング接着の減速を支援し、またずっと大きいずり速度でのローリング接着を支援する。Ｒｏｄｇｅｒｓ ＳＤ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ． ８１：２００１−９（２００１）．
【００３５】
フィブリノゲン
［３５．］ 正常ヒト・フィブリノゲンには２つの型がある。すなわち、フィブリノゲンγメジャーとフィブリノゲンγ’マイナー変異体であり、どちらも正常個体で検出される。正常フィブリノゲンは存在量が多く（人体で検出されるフィブリノゲンの〜９０％）、２個の同一５５ｋＤａアルファ（α）鎖、２個の同一９５ｋＤａベータ（β）鎖、及び２個の同一４９．５ｋＤａガンマ（γ）鎖からなる。正常変異体フィブリノゲンは存在量が少なく（人体で検出されるフィブリノゲンの〜１０％）、２個の同一５５ｋＤａアルファ（α）鎖、２個の同一９５ｋＤａベータ（β）鎖、及び１個の４９．５ｋＤａガンマ（γ）鎖と１個の５０．５ｋＤａガンマプライム（γ’）鎖からなる。γ鎖とγ’鎖はどちらも同一の遺伝子がコードするが、３’末端で選択的スプライシングが起こる。正常γ鎖はアミノ酸１〜４１１からなる。正常変異体γ’鎖は４２７アミノ酸からなり、うちアミノ酸１〜４０７は正常γ鎖と同じであり、またアミノ酸４０８〜４２７はＶＲＰＥＨＰＡＥＴ ＥＹＤＳＬＹＰＥＤＤＬである。通常、この領域はトロンビン分子が占める。
【００３６】
［３６．］ フィブリノゲンはイオン化カルシウムの存在下にトロンビンの作用でフィブリンへと変換され、血液の凝固を引き起こす。フィブリンは血栓や急性炎症性滲出液の成分でもある。
【００３７】
［３７．］ 血小板や（フィブリノゲン、ＧＰＩｂ、セレクチン、ＰＳＧＬ−１などのような）細胞−細胞相互作用や細胞−マトリックス相互作用、血小板−血小板相互作用、血小板−細胞相互作用、血小板−マトリックス相互作用、細胞ローリング及び接着、止血で重要な役割を果たす分子はまた、種々の病因的状態又は病態、たとえば異常又は病因的炎症、異常又は病因的免疫反応、自己免疫反応、転移、異常な又は病因的な細胞接着、血栓症及び／又は再狭窄、異常又は病因的凝集などでも重要な役割を果たす。従って血小板と、またこれらの分子と、交差反応する抗体はこれらや他の病因的状態を伴う疾患や障害の治療診断に有用であろう。従ってこれらの分子に共通するエピトープを同定し、またそれと交差反応しうる抗体を同定する必要がある。
【００３８】
［３８．］ 抗体は断片、複合体及び多量体など多様な形態で提供してもよい。抗体断片の例は単鎖Ｆｖ （ｓｃＦｖ）フラグメントやＦａｂフラグメントなどである。
【００３９】
［３９．］ ｓｃＦｖはフルサイズの抗体よりも小さいため、より短時間で組織に侵入し血液から排泄されることが立証済みである。Ａｄａｍｓ， Ｇ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７７， １４０５−１４１２ （１９８８）； Ｈｕｄｓｏｎ， Ｐ．Ｊ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１（５）， ５４８−５５７ （１９９９）； Ｗｕ， Ａ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｕｍｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ４， ４７ （１９９９）． 従ってｓｃＦｖはしばしば、放射性標識の体外排泄を速める目的で腫瘍画像診断など放射性標識を使用する診断に使用される。最近、多数のがんターゲッティングｓｃＦｖ多量体がｉｎ ｖｉｖｏ安定性及び効能に関する前臨床評価を受けた。Ａｄａｍｓ， Ｇ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７７， １４０５−１４１２ （１９８８）； Ｗｕ， Ａ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｕｍｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ４， ４７ （１９９９）．
【００４０】
［４０．］ 単鎖Ｆｖ （ｓｃＦｖ）フラグメントは抗体の重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）と軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）からなり、両者はポリペプチドリンカーで結合されている。該リンカーは十分に長いので（Ｖ_Ｈ）及び（Ｖ_Ｌ）ドメインは機能的Ｆｖドメインへと折りたたまれる。そのためｓｃＦｖはそのターゲットを認識し、親抗体に優るとも劣らないアフィニティーでターゲットと結合することができる。
【００４１】
［４１．］ 一般にｓｃＦｖ単量体はＶ_ＨドメインのＣ末端をポリペプチドリンカーでＶ_ＬドメインのＮ末端に結合した形に設計する。あるいはその逆に、Ｖ_ＬドメインのＣ末端をポリペプチドリンカーでＶ_ＨドメインのＮ末端に結合してもよい。Ｐｏｗｅｒ， Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． Ｍｅｔｈ． ２４２， １９３−２０４ （２００４）． ポリペプチドリンカーは一般に長さが約１５アミノ酸である。リンカーを約３〜７アミノ酸に短縮すると、ｓｃＦｖは機能的Ｆｖドメインへと折りたたまれなくなり、その代わりに第２のｓｃＦｖと会合してダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）を形成する。リンカーの長さを３アミノ酸未満へとさらに短縮すると、ｓｃＦｖの会合によりリンカーの長さや、組成、Ｆｖドメインの向きに応じて三量体、四量体が形成される。Ｂ．Ｅ． Ｐｏｗｅｒｓ， Ｐ．Ｊ． Ｈｕｄｓｏｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． Ｍｅｔｈ． ２４２ （２０００） １９３−１９４．
【００４２】
［４２．］ 最近、多価抗体断片たとえばｓｃＦｖの二量体、三量体及び四量体はしばしば、親抗体のターゲットへの結合よりも高いアフィニティーを示すことが発見された。腫瘍ターゲッティング用途ではこの高アフィニティーは薬物動態の改善など潜在的利点につながる。さらに科学者たちは、白血球の係留やローリングに関与するＰ−セレクチンとそのリガンドＰＳＧＬ−１の研究から、二量体型ＰＳＧＬ−１を発現する細胞のほうがこの高結合アフィニティーのために、より安定的なローリング接着を示すと結論した。これらの接着はよりずり抵抗が大きく、ローリング速度の変動も少ない。Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， ｖｏｌ． ９８ （１８）： １０１６６−７１ （２００１）．
【００４３】
［４３．］ これら多価体の結合アフィニティーの向上は診断や治療計画にも有利であろう。たとえばｓｃＦｖは、ターゲット受容体に結合して「天然」リガンドの結合を阻む遮断薬として使用される場合もあろう。その場合には、ｓｃＦｖと受容体の間の会合アフィニティーを高めて解離しにくくし、天然リガンドのターゲットへの望ましくない結合を防げるようにするのがよい。さらに、この高アフィニティーはターゲット受容体が接着やローリングに関与する場合又はターゲット受容体が高ずり流動領域内の細胞たとえば血小板の表面にある場合にも有利であろう。
【００４４】
［４４．］ 本発明の一目的は単離エピトープを提供することであるが、該エピトープは細胞ローリングや炎症、免疫反応、感染、自己免疫反応、転移、細胞接着、血栓症及び／又は再狭窄、凝集などの過程に有用であってかつ病変細胞たとえばＡＭＬ細胞、Ｂ−ＣＬＬ細胞、多発性骨髄腫細胞、転移性細胞などの表面に存在する多様な分子に由来する。
【００４５】
［４５．］ 本発明の別の目的はそうした単離エピトープの使用方法を提供することであるが、該方法の目的は細胞ローリングや炎症、免疫反応、感染、自己免疫反応、転移、細胞接着、血栓症及び／又は再狭窄、凝集などの過程に有用であってかつ病変細胞たとえばＡＭＬ細胞、Ｂ−ＣＬＬ細胞、多発性骨髄腫細胞、転移性細胞などの表面に存在する分子上のエピトープを認識しそうしたエピトープと交差反応するような抗体の開発である。
【００４６】
［４６．］ 本発明の他の目的は、細胞ローリングや炎症、免疫反応、感染、自己免疫反応、転移、細胞接着、血栓症及び／又は再狭窄、凝集などを阻害するための薬、及び疾患たとえばＡＭＬ、Ｂ−ＣＬＬ、多発性骨髄腫、転移、心臓血管疾患たとえば心筋梗塞、網膜疾患、硫酸化チロシン依存性タンパク質−タンパク質相互作用に起因する疾患、及び前記のような細胞機能又は作用が重要な役割を果たす他疾患を治療するための薬の開発と提供へのそうした抗体の使用を含む。
【００４７】
［４７．］ 個人の多様の病態たとえばＡＭＬ、Ｂ−ＣＬＬ、多発性骨髄腫及び転移、又は細胞ローリングや炎症、免疫反応、感染、自己免疫反応、転移、細胞接着、血栓症及び／又は再狭窄、凝集などのような細胞機能又は作用が重要な役割を果たす他疾患の診断方法に前記エピトープ及び抗体を利用することも本発明の目的である。
【００４８】
［４８．］ 多価体の抗体、断片及び複合体の提供も本発明の目的である。より具体的には、本明細書でそれぞれダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トライアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）及びテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）とも呼ぶ二量体、三量体及び四量体を提供することが本発明の一目的である。
【００４９】
［４９．］ 本明細書では本発明のこれらや他の目的について記載する。
【００５０】
発明の要約
［５０．］ 本発明は炎症、免疫反応、転移、細胞接着、血栓症、再狭窄、凝集など多様な過程で重要な役割を果たすリガンド及び受容体上で検出されるエピトープを提供する。本発明のエピトープは白血病／腫瘍細胞特に骨髄性白血病細胞の表面でも検出される。従って、これらのエピトープはこれらの過程の治療的媒介のための有用なターゲットである。こうしたエピトープへの抗体はがん治療薬（抗腫瘍薬、抗転移薬）や、白血病、自己免疫疾患、炎症性疾患、心臓血管疾患たとえば心筋梗塞、網膜疾患及び血小板機能異常を伴う他疾患、硫酸化チロシン依存性タンパク質−タンパク質相互作用に起因する疾患の治療薬として有用である。本発明は該抗体、該抗体を含む組成物、該抗体を使用する治療診断方法を提供する。
【００５１】
［５１．］ 本発明は以下の式：
【化１１】

を含む単離エピトープを提供する。式中、
Ｗは、アスパラギン酸とグルタミン酸とを除く任意のアミノ酸であり、
Ｙは、硫酸化可能な任意の天然部分であり、
Ｐは、
【化１２】

であり、
Ｓは、スルフェート又は硫酸化分子であり、
Ｘは、任意のアミノ酸であり、但し、アスパラギン酸、グルタミン酸又はチロシンを除く、
【００５２】
Ａは、任意の負荷電アミノ酸、もしくはロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、セリン又はグリシンであり、
ｑは、１〜６であり、
ｚは、０、１又は２であり、
ｒは、０又は１であり、
ｔは、１、２又は３であり、
ｕは、０〜２であり、
ｎは、０〜３であり、
ｍは、０〜３
であるが、ここで、ｎ＝０ならばｍ＞０； ｍ＝０ならばｎ＞０； ｑ＝１ならばｒ＝１であり、またｑ＞１ならば１以上のＹが硫酸化している； さらに、単離エピトープにはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む第１超可変領域をもつ抗体、その抗原結合性断片、又は抗体又はその結合性断片を含むその複合体が結合しうる。
【００５３】
［５２．］ 本発明は、式（Ｉ）を含む単離エピトープであって、硫酸化部分がペプチドコンジュゲート又はグリココンジュゲート又はリポコンジュゲートもしくはそれらの複合体である単離エピトープを提供する。
【００５４】
［５３．］ 本発明はまた、式Ｉを含む単離エピトープであって、Ｗがグリシンであり、Ｙがチロシンのペプチドコンジュゲートもしくはアスパラギン、セリン又はトレオニンのグリココンジュゲートであり、Ａがグルタミン酸、γカルボキシグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、ｑが１、２又は３である単離エピトープを提供する。これらのうちある種の実施態様ではＹはチロシンのペプチドコンジュゲートであり、ｑは３、ｒは１である。
【００５５】
［５４．］ 本発明は以下の式：
【化１３】

を含む単離エピトープを提供する。式中、
Ｗは、アスパラギン酸とグルタミン酸とを除く任意のアミノ酸であり、
Ｙは、硫酸化可能な任意の天然部分であり、
Ｐは、
【化１４】

であり、
Ｓは、スルフェート又は硫酸化分子であり、
Ｘは、任意のアミノ酸であり、但し、アスパラギン酸、グルタミン酸又はチロシンを除く、
【００５６】
Ａは、任意の負荷電アミノ酸、もしくはロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、セリン又はグリシンであり、
ｚは、０、１又は２であり、
ｒは、０又は１であり、
ｔは、１、２又は３であり、
ｕは、０〜２であり、
ｎは、０〜３であり、
ｍは、０〜３
であるが、ここで、ｎ＝０ならばｍ＞０； ｍ＝０ならばｎ＞０である； １以上のＹが硫酸化している； さらに、単離エピトープにはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む第１超可変領域をもつ抗体、その抗原結合性断片、又は抗体又はその結合性断片を含むその複合体が結合しうる。
【００５７】
［５５．］ 本発明は、式（ＩＩ）を含む単離エピトープであって、硫酸化部分がペプチドコンジュゲート又はグリココンジュゲート又はリポコンジュゲートもしくはそれらの複合体である単離エピトープを提供する。
【００５８】
［５６．］ 本発明はまた、式（ＩＩ）を含む単離エピトープであって、Ｗがグリシンであり、Ｙがチロシンのペプチドコンジュゲートもしくはアスパラギン、セリン又はトレオニンのグリココンジュゲートであり、Ａがグルタミン酸、γカルボキシグルタミン酸又はアスパラギン酸、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、セリン又はグリシンである単離エピトープを提供する。これらのうちある種の実施態様ではＹはチロシンのペプチドコンジュゲートであり、ｑは３、ｒは１である。
【００５９】
［５７．］ 本発明は以下の式：
【化１５】

を含む単離エピトープを提供する。式中、
Ｇは、グリシンであり、
Ｅは、グルタミン酸であり、
Ｄは、アスパラギン酸であり、
Ｙは、チロシンであり、
Ｓは、スルフェート又は硫酸分子であり、
Ｘは、前記以外の任意のアミノ酸であり、
ｚは、０、１又は２であり、
ｔは、１、２又は３であり、
ｒは、０又は１であり、
ｕは、０〜２であり、
ｎは、０〜３であり、
ｍは、０〜３
であるが、ここで、１以上のＹが硫酸化している； ｎ＝０ならばｍ＞０； ｍ＝０ならばｎ＞０；さらに、単離エピトープにはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む第１超可変領域をもつ抗体、その抗原結合性断片、又は抗体又はその結合性断片を含むその複合体が結合しうる。
【００６０】
［５８．］ 本発明は式（ＩＩＩ） を含み、式中ｒが１である単離エピトープを提供する。
【００６１】
［５９．］ 以上いずれの実施態様でも、Ｙは脂質、糖質、ペプチド、糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、及び／又はリポ多糖分子を含んでもよい。
【００６２】
［６０．］ 本発明はまた前記エピトープの誘導体、同族体、模倣体又は変異体を提供し、また硫酸化に加えて１以上の翻訳後修飾を受けた前記エピトープを提供する。
【００６３】
［６１．］ 本発明は１つ又は複数の前記単離エピトープを含む組成物を提供する。前記エピトープの少なくとも一部分をコードする単離ヌクレオチドもまた提供される。
【００６４】
［６２．］ 本発明はまた、１以上の前記エピトープと結合又は交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を提供する。
【００６５】
［６３．］ １以上の前記エピトープと結合又は交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を生産する方法もまた提供される。該方法は次のステップを含む： （ａ）ファージ提示型ライブラリーを準備する、（ｂ）前記エピトープのうちの１つを準備する、（ｃ）該ファージ提示型ライブラリーをパニングして、該単離エピトープと結合しうるオリゴペプチド又はポリペプチドを提示するファージ粒子を選び出す、及び（ｄ） 該単離エピトープと結合しうる該オリゴペプチド又はポリペプチドを含む抗体、その結合性断片、又は該抗体又はその結合性断片を含むその複合体を生産する。
【００６６】
［６４．］ 本発明はまた、抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５ ［Ｙ１ ｓｃＦｖ］及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０３ ［Ｙ１７ ｓｃＦｖ］のｓｃＦｖ抗体断片の結合能を有する抗体、その断片又は複合体を提供する。
【００６７】
［６５．］ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８ ［Ｙ１ ＣＤＲ３］又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０ ［Ｙ１７ ＣＤＲ３］を含む第１超可変領域をもつペプチド又はポリペプチドの結合能を有する抗体、抗体断片又は抗体複合体が提供される。これらのうちある種の実施態様では、該ペプチド又はポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１５を含む第２超可変領域及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１４を含む第３超可変領域をもつ。
【００６８】
［６６．］ １以上の硫酸化チロシンと２以上の酸性アミノ酸とを含むおよそ３〜１２６アミノ酸残基の長さのペプチドエピトープ又はポリペプチドエピトープに結合しうる抗体、抗体断片又は抗体複合体が提供される。これらのうちある種の実施態様では、該エピトープはさらに１以上のロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、セリン又はグリシン残基を含む。これらのうちある種の実施態様では、２以上の酸性アミノ酸残基のうち１つ又は複数がロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、セリン又はグリシン残基に置き換わる。他実施態様では該エピトープはＤＹＤ又はＥＹＥを含む。ある種の実施態様では該エピトープはＤＹＤ又はＥＹＥである。さらに別の実施態様では該エピトープはＤＹＥ又はＥＹＤを含む。
【００６９】
［６７．］ ある種の実施態様では、本発明に基づいて提供される抗体、抗体断片及び抗体複合体は糖質、ペプチド、糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質及び／又はリポ多糖分子上のエピトープに結合することができる。好ましくは、本発明の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体は糖質、ペプチド、糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質及び／又はリポ多糖エピトープに結合することができる。数多くの実施態様では、該糖質、ペプチド、糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質及び／又はリポ多糖分子は１以上の硫酸化部分を含む。
【００７０】
［６８．］ 本発明は、抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体であって、ＰＳＧＬ−１、フィブリノゲンγ’、ＧＰＩｂα、ヘパリン、ルミカン、補体複合体４（ＣＣ４）、インターαインヒビター及びプロトロンビンからなる群より選択される２以上の異なる分子に、必ずしも同時にではないが、結合しうる抗体、その断片又はその複合体を提供する。また本発明の抗体、抗体断片又は複合体は、受容体エピトープが原型を保つ限り、これらのタンパク質の任意の類縁体にも結合しよう。
【００７１】
［６９．］ ある種の好ましい実施態様では、抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体であって、ＰＳＧＬ−１、フィブリノゲンγ’、ＧＰＩｂα、ルミカン、補体複合体４、インターαインヒビター、プロトロンビン及びヘパリンからなる群より選択される２以上のタンパク質に結合しうる、また病変細胞たとえばＢ−ＣＬＬ細胞、ＡＭＬ細胞、多発性骨髄腫細胞及び転移性細胞に結合しうる抗体、その断片又はその複合体が提供される。ある種の実施態様では、抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体であって、ＰＳＧＬ−１、フィブリノゲンγ’、ＧＰＩｂα、ヘパリン、ルミカン、補体複合体４（ＣＣ４）、インターαインヒビター及びプロトロンビンの各々に結合しうる抗体、その断片又はその複合体が提供される。ある種の実施態様では、抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体であって、ＰＳＧＬ−１、フィブリノゲンγ’、ＧＰＩｂα及びヘパリンの各々に結合しうる抗体、その断片又はその複合体が提供されるし、またある種の好ましい実施態様ではこれらの抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体は病変細胞たとえばＢ−ＣＬＬ細胞、ＡＭＬ細胞、多発性骨髄腫細胞及び転移性細胞にも結合しうる。
【００７２】
［７０．］ 本発明は、抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体であって、ＰＳＧＬ−１、フィブリノゲンγ’、ヘパリン、ＧＰＩｂα、ルミカン、補体複合体４（ＣＣ４）、インターαインヒビター及びプロトロンビンからなる群より選択される２以上の異なる分子に結合しうる、かつさらに糖質及び／又は脂質分子上のエピトープに結合しうる抗体、その断片又はその複合体を提供する。これらのうちある種の実施態様では、糖質及び／又は脂質分子上のエピトープは１以上の硫酸化部分を含む。
【００７３】
［７１．］ 本発明は抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体であって、各々酸性アミノ酸群内に１つ又は複数の硫酸化チロシン残基を含む２以上のエピトープと交差反応しうる抗体、その断片又はその複合体を提供する。これらのうちある種の実施態様では、抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体は、Ｂ−ＣＬＬ細胞、ＡＭＬ細胞、多発性骨髄腫細胞及び転移性細胞からなる群より選択される１以上の細胞型と交差反応しうる。これらのうちある種の他実施態様では、抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体はＰＳＧＬ−１と交差反応しうる。好ましくは、ＰＳＧＬ−１と交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体は１以上の硫酸化チロシン残基を含むエピトープＱＡＴＥＹＥＹＬＤＹＤＦＬＰＥＴＥに結合する。
【００７４】
［７２．］ これらのうちある種の他実施態様では、抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体はＧＰＩｂ−αと交差反応しうる。好ましくは、ＧＰＩｂ−αと交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体は１以上の硫酸化チロシン残基を含むエピトープＤＥＧＤＴＤＬＹＤＹＹＰＥＥＤＴＥＧＤ、１以上の硫酸化チロシン残基を含むエピトープＴＤＬＹＤＹＹＰＥＥＤＴＥ、１以上の硫酸化チロシン残基を含むエピトープＧＤＥＧＤＴＤＬＹＤＹＹＰ、１以上の硫酸化チロシン残基を含むエピトープＹＤＹＹＰＥＥ、及び／又は１以上の硫酸化チロシン残基を含むエピトープＴＤＬＹＤＹＹＰに結合する。
【００７５】
［７３．］ これらのうちさらなる他実施態様では、抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体はフィブリノゲンγ’と交差反応しうる。好ましくは、フィブリノゲンγ’と交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体は１以上の硫酸化チロシン残基を含むエピトープＥＰＨＡＥＴＥＹＤＳＬＹＰＥＤに結合する。
【００７６】
［７４．］ これらのうちさらなる他実施態様では、ヘパリンと交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体が提供される。
【００７７】
［７５．］ これらのうちさらなる他実施態様では、補体複合体４ （ＣＣ４）と交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体が提供される。好ましくは、ＣＣ４と交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体は１以上の硫酸化チロシン残基を含むエピトープＭＥＡＮＥＤＹＥＤＹＥＹＤＥＬＰＡＫに結合する。
【００７８】
［７６．］ 本発明はまた、前述のタンパク質の断片、類縁体、変異体及び模倣体に、エピトープが本質的に原型を保つ限りで、結合しうる抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を提供する。
【００７９】
［７７．］ 本発明は、Ｂ−ＣＬＬ細胞、ＡＭＬ細胞、多発性骨髄腫細胞及び転移性細胞からなる群より選択される１以上の細胞型と交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を提供する。
【００８０】
［７８．］ 本発明はまた、以下の能力を有する抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を提供する： 細胞ローリング阻害； 炎症阻害； 自己免疫疾患阻害； 血栓症阻害； 再狭窄阻害； 転移阻害； 腫瘍細胞成長及び／又は複製阻害； 腫瘍細胞死増進； 白血病細胞成長及び／又は複製阻害； 白血病細胞死増進； 病変細胞の抗疾病薬への感受性の増進； 腫瘍細胞の抗がん薬への感受性の増進； 白血病細胞の抗白血病薬への感受性の増進； 腫瘍患者における腫瘍細胞数増加の抑制； がん患者における腫瘍細胞数の減少； 白血病患者における白血病細胞数増加の抑制； 白血病患者における白血病細胞数の減少； 細胞−細胞、細胞−マトリックス、血小板−マトリックス、血小板−血小板及び／又は細胞−血小板間の複合体形成の阻害； 細胞−細胞、細胞−マトリックス、血小板−マトリックス、血小板−血小板及び／又は細胞−血小板間の接着の阻害； 凝集。
【００８１】
［７９．］ 着目する疾患及び／又は状態の作用を阻害し、治療し又は緩和し、もしくは着目する疾患及び／又は状態を予防する有効量の、本発明の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を含有する製剤組成物が提供される。
【００８２】
［８０．］ 本発明は、本発明の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の、着目する疾患及び／又は状態の作用を阻害、治療又は緩和し、もしくは着目する疾患及び／又は状態を予防するための薬の製造への使用を規定する。
【００８３】
［８１．］ 本発明は、着目する疾患及び／又は状態の作用を阻害、治療又は緩和し、もしくは着目する疾患及び／又は状態を予防する医薬として用いる、本発明の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を提供する。
【００８４】
［８２．］ 本発明は、着目する疾患及び／又は状態の作用を阻害、治療又は緩和し、もしくは着目する疾患及び／又は状態を予防する方法であって、そうした処置を必要とする患者に、本発明の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を有効量含有する製剤組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【００８５】
［８３．］ 本発明の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体は薬剤と複合又は結合してもよい。
【００８６】
［８４．］ 本発明は、抗がん薬、抗転移薬、抗白血病薬、抗疾病薬、抗接着薬、抗血栓薬、抗再狭窄薬、抗自己免疫薬、抗凝集薬、抗菌薬、抗ウイルス薬及び抗炎症薬からなる群より選択される薬剤と複合又は結合した抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を提供する。
【００８７】
［８５．］ 本発明はまた、１つ又は複数の毒素、放射性同位体及び治療薬と複合又は結合した抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を提供する。
【００８８】
［８６．］ 本発明は、１つ又は複数の薬剤との結合又は複合が可能な基剤又は担体と結合又は複合した抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を提供する。そうした基剤又は担体の例はデキストラン、親油性ポリマー、ＨＰＭＡ及びリポソームなどである。
【００８９】
［８７．］ 本発明はまた、放射性同位体又は他の造影剤と結合又は複合した抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を提供する。本発明の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を含む診断キットもまた提供される。
【００９０】
［８８．］ 本発明は、アミノ酸２７６、２７８及び２７９のうちの１以上のアミノ酸が硫酸化されたＧＰＩｂαアミノ酸配列Ｔｙｒ２７６〜Ｇｌｕ２８２を含む単離エピトープを提供する。好ましい実施態様では、該エピトープはＧＰＩｂαアミノ酸２８３〜２８５をさらに含む。
【００９１】
［８９．］ 本発明はまた、アミノ酸２７６、２７８及び２７９のうちの１以上のアミノ酸が硫酸化されたＧＰＩｂαアミノ酸配列Ｔｙｒ２７６〜Ｇｌｕ２８２を含むエピトープに結合しうる抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を提供するが、該エピトープがＧＰＩｂαアミノ酸２８３〜２８５をさらに含むと該結合は強化される。
【００９２】
［９０．］ 配列ＹＤＹＹＰＥＥのエピトープを含み該エピトープ中の１以上の硫酸化チロシン残基を含む見掛け分子質量約４０ｋＤａの単離ＧＰＩｂα Ｎ末端側ペプチド、及びアミノ酸２７６、２７８及び２７９のうちの１以上のアミノ酸が硫酸化しているアミノ酸１〜２８２からなる単離ＧＰＩｂαペプチドもまた提供される。
【００９３】
［９１．］ 本発明はまた、ヒト・モノクローナル抗体ｓｃＦｖ Ｙ１の軽鎖可変領域と相互反応するポリクローナル抗体、抗体断片又は抗体複合体を提供する。ある種の実施態様では、該ポリクローナル抗体、抗体断片又は抗体複合体はヒト・モノクローナル抗体Ｙ−１の軽鎖可変領域のＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ制限断片と交差反応する。そうしたポリクローナル抗体を含む診断キットもまた提供される。
【００９４】
用語の定義
［９２．］ 抗体（Ａｂ）又は免疫グロブリン（Ｉｇ）は抗原に結合するタンパク質分子であり、ジスルフィド結合で連結された４個のポリペプチド鎖（２×重鎖、２×軽鎖）からなる。各ポリペプチド鎖は定常領域と可変領域をもつ。抗体又は免疫グロブリンはその軽鎖成分に応じてＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥの５クラスにわけられる。ＩｇＧにはＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３及びＩｇＧ_４などを含むいくつかのサブクラスがある。免疫グロブリンは生体内でＢリンパ球により産生され、特定の外来抗原決定基を認識し、また該抗原の排泄を容易にする。
【００９５】
［９３．］ 抗体は抗体複合体などを含む多様な形態で生産、使用されよう。ここで使用する「抗体複合体」は１つ又は複数の抗体と別の抗体との、又は単数・複数の抗体断片との複合体、もしくは２以上の抗体断片からなる複合体を意味する。抗体断片の例はＦｖ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ’）及びＦｄフラグメントなどである。
【００９６】
［９４．］ 本明細書と特許請求の範囲で使用するＦｖは、ヒト抗体の重鎖可変領域とヒト抗体の軽鎖可変領域とからなる分子であって、重鎖可変領域が軽鎖可変領域へと連結、結合、融合又は共有結合もしくは会合している分子をいうが、両ヒト抗体は同じでも異なってもよい。Ｆｖは単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）でもジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）でもよい。ｓｃＦｖはフレキシブルなアミノ酸ポリペプチドスペサー又はリンカーで結合された抗体重鎖、軽鎖各々の可変ドメインからなる。リンカーは分枝型でも直鎖型でもよい。リンカーは０〜１５アミノ酸残基からなるのが好ましく、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３であるのが最も好ましい。
【００９７】
［９５．］ Ｆｖ分子自体は第１鎖と第２鎖からなり、各鎖は第１、第２及び第３超可変領域をもつ。重鎖及び軽鎖の可変ドメイン内のこれらの超可変ループは相補性決定領域（ＣＤＲ）という。重鎖、軽鎖にはそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域が存在する。これらの領域は抗原結合部位を形成すると考えられており、特異的に修飾することにより結合活性を高めることができる。これらの領域のうち天然で最も可変的なのは重鎖のＣＤＲ３領域である。このＣＤＲ３領域はＩｇ分子で最も露出した領域であると考えられており、また本明細書に記載するように、、観測された選択的及び／又は特異的結合特性に主に寄与する部位である。
【００９８】
［９６．］ Ｆｖ分子の断片は、原Ｆｖより小さな任意の分子であって、原Ｆｖの選択的及び／又は特異的結合特性をなお維持している分子と定義される。そうした断片の非限定的な例は、（１） Ｆｖ重鎖だけの断片を含むミニボディー（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、（２）抗体重鎖可変領域の小さな部分単位を含むマイクロボディー（ｍｉｃｒｏｂｏｄｙ）（ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＩＬ９９／ ００５８１）、（３）軽鎖断片を含む類似体、及び（４）軽鎖可変領域の機能的単位を含む類似体である。
【００９９】
［９７］ ここで使用する「Ｆａｂフラグメント」は免疫グロブリンの一価抗原結合性断片である。Ｆａｂフラグメントは軽鎖と重鎖の一部とからなる。
【０１００】
［９８．］ Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントはペプシン消化によって得られる免疫グロブリンの二価抗原結合性断片である。両軽鎖と両重鎖の一部とからなる。
【０１０１】
［９９．］ Ｆｃフラグメントは免疫グロブリンの非抗原結合性部分である。重鎖のカルボキシル末端側部分とＦｃ受容体に対応する結合部位とを含む。
【０１０２】
［１００．］ Ｆｄフラグメントは免疫グロブリン重鎖の可変領域と第１定常領域である。
【０１０３】
［１０１．］ ポリクローナル抗体は免疫応答産物であり、多数の異なるＢリンパ球により形成される。モノクローナル抗体は単一細胞に由来する。
【０１０４】
［１０２．］ カセットは、ポリペプチドに適用し本発明で定義する意味では、フレームワークとして機能する所定配列の連続アミノ酸をいい、また単一単位とみなされ、そのようなものとして操作される。その一端又は両端ではアミノ酸の置換、挿入、除去又は付加が可能である。同様に、その一端又は両端では一連のアミノ酸の置換、挿入、除去又は付加が可能である。
【０１０５】
［１０３．］ ここで使用する用語「エピトープ」は抗原決定基又は抗原結合部位であって、抗体、抗体断片、抗体複合体又はその結合性断片を含む複合体、又はＴ細胞受容体と相互作用するものをいう。エピトープという用語はここではリガンド、ドメイン及び結合領域という用語と互換的に使用している。
【０１０６】
［１０４．］ 選択性はここでは、ターゲティング分子が細胞型又は細胞時期の混合物すなわち諸々の細胞型又は細胞時期から該ターゲッティング分子に対し特異的である１つの細胞型又は細胞時期を選択しそれと結合する能力をいう。
【０１０７】
［１０５．］ ここで使用する用語「アフィニティー」は受容体（抗体上の一結合部位など）とリガンド（抗原決定基など）の結合力の指標（結合定数）である。抗体上の単一抗原結合部位と単一エピトープの間の非共有相互作用の力の合計が該エピトープへの抗体のアフィニティーである。低アフィニティー抗体は抗原との結合が弱いため解離しやすく、高アフィニティー抗体は抗原との結合がより強いため、より長く結合状態を維持する。用語「アビディティー」は抗原−抗体相互作用の結合価を反映するものであり、アフィニティーとは異なる。
【０１０８】
［１０６．］ 抗体−抗原相互作用の特異性： 抗原−抗体反応は特異的であるとはいえ、ある抗原によって誘発された抗体が別の無関係の抗原と交差反応する場合もある。そうした交差反応が起こるのは、２つの異なる抗原が相同又は類似のエピトープ又はそのアンカー領域を共有する場合、又はあるエピトープに対して特異的な抗体が、類似の化学的性質をもつ無関係のエピトープに結合する場合である。
【０１０９】
［１０７．］ 血小板は巨核球の円板様細胞質断片であり、骨髄腔で産生され、その後末梢血流中を循環する。血小板には血栓の形成で果たす大きな役割などを含めていくつかの生理的機能がある。血小板は中心部に顆粒を、周辺部に透明な原形質を含むが、はっきりした核はない。
【０１１０】
［１０８．］ 凝集反応（ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ）はここでは懸濁した細菌、細胞、円板又は類似サイズの他粒子が互いに接着し塊を形成する過程を意味する。この過程は沈降に類似するが、粒子は沈降の場合よりも大きいし、溶液状態ではなく懸濁状態にある。
【０１１１】
［１０９．］ 凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）はｉｎ ｖｉｔｒｏで誘発させた血小板の塊状化及び血栓又は止血栓の形成につながる連続機構の一部としてのトロンビンとコラーゲンの塊状化を意味する。
【０１１２】
［１１０．］ 保存的アミノ酸置換はペプチド、ポリペプチド又はタンパク質、もしくはそれらの断片の１個又は２個のアミノ酸を変化させることによるアミノ酸組成の変化である。これは、性質（たとえば酸性、塩基性、芳香族、サイズ、正又は負荷電、極性、非極性など） が一般に類似したアミノ酸同士の置換であり、この置換によってペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の性質（電荷、ＩＥＦ、アフィニティー、アビディティー、立体構造、可溶性など）又は活性が実質的に大きく変わることはない。こうした保存的アミノ酸置換は一般に以下のアミノ酸グループ間の置換となろう：
（ｉ） グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びイソロイシン（Ｉ）
（ｉｉ） アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）
（ｉｉｉ） アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）及びトレオニン（Ｔ）
（ｉｖ） ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）
（ｖ） アスパラギン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）
（ｖｉ） フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）
【０１１３】
［１１１．］ 保存的アミノ酸置換は、該分子の選択的及び／又は特異的結合特性に主に寄与する超可変領域の両側や、他の部分たとえば重鎖可変領域のカセットなどでも可能である。追加的又は代替的に、分子を再構成することで変異を起こし、フルサイズの抗体、ダイアボディー（二量体）、トライアボディー（三量体）及び／又はテトラボディー（四量体）を、又はミニボディーやマイクロボディーを、形成することもできる。
【０１１４】
［１１２．］ ファスミドはプラスミドＤＮＡをもつファージ粒子である。ファスミドは繊維状ファージ由来の複製起点たとえばｍ１３又はｆｄを含むよう設計されたプラスミドベクターである。ファスミド粒子はプラスミドＤＮＡをもつため、ファージゲノム全体を収めるにはスペースが足りない。ファージゲノムから欠落させる部分はファージ粒子のパッケージングに不可欠の情報である。従ってファージを増殖させるには、欠落パッケージング情報を補ってくれるヘルパーファージ株と一緒に所望のファージ粒子を培養する必要がある。
【０１１５】
［１１３．］ プロモーターはＤＮＡ上の、ＲＮＡポリメラーゼが結合し転写を開始する領域である。
【０１１６】
［１１４．］ ファージ提示型ライブラリー（ファージペプチド／抗体ライブラリー、ファージライブラリー、又はペプチド／抗体ライブラリーともいう）は、各ファージ粒子が異なるペプチド又はポリペプチド配列を提示している大個体群のファージ（一般に１０^８〜１０^９個）を含む。これらのペプチド又はポリペプチド断片は可変長に構築してもよい。提示のペプチド又はポリペプチドはヒト抗体重鎖又は軽鎖に由来してもよいが、それだけに限らない。
【０１１７】
［１１５．］ 製剤組成物は本発明のペプチド又はポリペプチドと製薬上許容しうるその担体、賦形剤又は希釈剤とを含む製剤である。
【０１１８】
［１１６．］ 薬剤はヒト、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、イヌ、ネコ又は他の任意の温血動物を非限定的に含む哺乳動物の疾患予防、治療又は診断に有用な物質をいう。薬剤は放射性同位体、毒素、オリゴヌクレオチド、組換えタンパク質、抗体断片及び抗がん薬を含む群より選択される。そうした薬剤の非限定的な例は抗ウイルス薬たとえばアシクロビル、ガンシクロビル及びジドブジン； 抗血栓／再狭窄薬たとえばシロスタゾール、ダルテパリンナトリウム、レビパリンナトリウム及びアスピリン； 抗炎症薬たとえばザルトプロフェン、プラノプロフェン、ドロキシカム、ａｃｅｔｙｌ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ １７、ジクロフェナク、イブプロフェン、デキシブプロフェン、スリンダク、ナプロキセン、アムトルメチン、セレコキシブ、インドメタシン、ロフェコキシブ及びニメスリド； 抗自己免疫薬たとえばレフルノマイド、デニロイキンジフチトクス（ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ ｄｉｆｔｉｔｏｘ）、スブロイム（ｓｕｂｒｅｕｍ）、ＷｉｎＲｈｏ ＳＤＦ、デフィブロチド及びシクロホスファミド； 及び抗接着／抗凝集薬たとえばリマプロスト、クロルクロメン及びヒアルロン酸などである。
【０１１９】
［１１７．］ 抗白血病薬は抗白血病活性をもつ薬剤である。抗白血病薬はたとえば白血病細胞又は未熟な前白血病細胞の成長を阻害し又は停止させる薬剤、白血病又は前白血病細胞を傷害する薬剤、白血病又は前白血病細胞の他抗白血病薬への感受性を増進する薬剤、及び白血病細胞の転移を阻害する薬剤などである。本発明では、抗白血病薬は腫瘍の血管新生を予防、阻害、抑制し又は停止させる抗血管新生薬でもよい。
【０１２０】
［１１８．］ 遺伝子の発現パターンは、たとえば多様な条件下で、特定の時期に、又は多様な組織中で産生される遺伝子産物の量を分析することによって研究することができる。遺伝子が「過剰発現」とみなされるのは遺伝子産物の量が正常対照又は非異常対照に見られる量を上回る場合である。
【０１２１】
［１１９．］ 特定の細胞はその表面に特定の抗体に対応する結合部位をもつタンパク質を発現するであろうが、その結合部位は第１段階（段階Ｉ）とも呼べる状態にある細胞では隠れた形で存在しよう（たとえば立体障害を受ける、又は抗体の結合に必要とされる機構を欠く）。段階Ｉはたとえば正常、健康な非異常状態であろう。エピトープは、隠れた形で存在するときは、所定の抗体によって認識されない。すなわちこのエピトープには、又は段階Ｉの所定の細胞には、抗体は結合しない。しかし、エピトープはたとえば自ら変異を受けることにより、又は近くの又は会合した分子が変異を受けることにより、露出することもあろう。変異の例は折りたたみの変化、翻訳後修飾の変化、リン脂質化の変化、硫酸化の変化、グリコシル化の変化などである。そうした変異は細胞が第２段階（段階ＩＩ）とも呼べる異なる状態に移るときに起こることもあろう。段階ＩＩの例は活性化、増殖、形質転換、又は悪性状態などである。変異を受けたエピトープは露出するので、抗体が結合しよう。
【０１２２】
［１２０．］ ペプチド模倣体（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）は小分子、ペプチド、ポリペプチド、脂質、多糖又はそれらのコンジュゲートであって、別の化学種たとえば抗体と同じ機能的作用又は活性をもつものである。
【０１２３】
発明の詳細な説明
［１７２．］ 本発明では、特異的受容体が未判明又は未解明である場合に、全細胞を使用して白血病細胞表面の決定基を認識する特異的抗体を選択するようにした。さらに、多段階バイオパニング法を利用して１以上の細胞型へのパニングによりファージを選択した。これは、抗原特異的ファージ抗体の選択が固定化単一抗原へのバイオパニングに大きく依存し、ターゲットとしての全細胞を使用する選択の比重が小さかった先行技術の方法と比べると著しい改善である。
【０１２４】
［１７３．］ この多段階法で同定されたある種のエピトープは、好ましくは２個以上の酸性アミノ酸からなるアミノ酸群内の硫酸化部分たとえば硫酸化チロシン残基又は硫酸化糖質又は脂質部分の存在を特徴とし、また炎症、免疫反応、感染、自己免疫反応、転移、細胞接着、血栓症及び／又は再狭窄、細胞ローリング、及び凝集などの多様な過程で重要な役割を果たすリガンドや受容体の表面で検出される。この種のエピトープは病変細胞たとえばＢ−ＣＬＬ細胞、ＡＭＬ細胞、多発性骨髄腫細胞、及び転移性細胞などの表面でも検出される。これらのエピトープはこれらの過程の治療的調節のターゲット及び診断方法のターゲットとして有用である。
【０１２５】
［１７４．］ これらのエピトープは可変の一次アミノ酸配列を有するものの、この種の硫酸化エピトープに対して産生される抗体はしばしば複数個の分子上の複数個のこの種エピトープと、必ずしも同時ではないにせよ、結合又は交差反応する。そうした抗体は（抗腫瘍薬、抗転移薬としての）がん治療薬や、白血病、自己免疫疾患、ウイルス性疾患、異常凝集を伴う疾患、異常接着を伴う疾患、梗塞、心臓血管疾患及び炎症性疾患などの治療薬として有効である。
【０１２６】
［１７５．］ 血小板に結合する抗体の同定を目的に固定化ヒト血小板スクリーニング用のファージ提示型ヒト抗体ライブラリーからヒトｓｃＦｖ Ｙ１抗体を単離した。数クローン（異なるｓｃＦｖ抗体）を単離し解析した。そのうちの１クローン（Ｙ１と命名）は意外にも、ＡＭＬ患者及びある種の他白血病患者に由来する白血病細胞と結合することが判明した。固定化血小板へのパニングにより単離された別のクローン（Ｙ１７）もまたヒト血液に結合することが判明した。
【０１２７】
［１７６．］ ヒト血小板から抽出したタンパク質を、ＳＤＡ−ＰＡＧＥ上でＹ１ ｓｃＦｖ抗体とＹ１７ ｓｃＦｖ抗体を使用したウェスタンブロット解析にかけ、両抗体が結合する血小板表面上の受容体の同定を試みた。この方法により、血小板上のＹ１ ｓｃＦｖ及びＹ１７ ｓｃＦｖエピトープはＣＤ４２複合体のサブユニットの１つ、グリコカリシンであることが判明した。
【０１２８】
［１７７．］ ヒト血小板由来グリコカリシンの細胞外断片を活性化血小板から精製した。それを種々のプロテアーゼたとえばフィシン、モカラギン、カテプシンＧなどで切断し、グリコカリシン分子上のＹ１結合エピトープの位置を正確に特定するようにした。Ｙ１抗体を検出手段としてウェスタンブロット解析を行った。さらに、市販の抗グリコカリシン抗体類（グリコカリシンの様々なエピトープに結合することが知られている抗体類）を使用して、グリコカリシン上のＹ１結合エピトープを決定するためのＹ１抗体との競合的結合を評価した。
【０１２９】
［１７８．］ その結果から、Ｙ１のグリコカリシンへの結合ではグリコカリシンのアミノ酸２７２〜２８５が大きな役割を果たしているとの結論に達した。また、Ｅ． ｃｏｌｉ由来組換えグリコカリシンのＮ末端側ポリペプチド（アミノ酸１〜３４０及び１〜４８０）はＹ１抗体によっては検出されなかったので、Ｙ１のエピトープへの結合はＥ． ｃｏｌｉでは起こることが知られていないグリコシル化又は硫酸化などの翻訳後修飾に依存するとの結論に達した。
【０１３０】
［１７９．］ この仮説を検証するために、タンパク質からＮ結合型及びＯ結合型の糖鎖を遊離させる酵素（グリコシダーゼ）及びタンパク質から硫酸基を遊離させる酵素（スルファターゼ）で精製グリコカリシンを処理した。グリコカリシン又はグリコカリシン断片へのＹ１抗体の結合はグリコシダーゼの影響を受けなかった。この結果はグリコカリシンへのＹ１の結合には硫酸基が不可欠であることを示唆する。
【０１３１】
［１８０．］ これらの結果をさらに検証するために、同定したエピトープ（グリコカリシンのアミノ酸２７２〜２８５）を基に硫酸化及び非硫酸化合成ペプチドを調製、使用して、その存在下にグリコカリシンへのＹ１抗体の結合特異性を評価した（ＥＬＩＳＡ法）。硫酸化ペプチドはグリコカリシンへのＹ１抗体の結合を関連の非硫酸化ペプチドの場合よりも何倍も強く阻害したが、そのことは結合には硫酸化が必要であることを示唆した。
【０１３２】
［１８１．］ 以上の実験結果から、Ｙ１抗体に対応するエピトープはグリコカリシン上の、負荷電アミノ酸群が存在するアミノ酸２７２と２８５の間に位置すると結論した。
【０１３３】
［１８２．］ 平行して、ＫＧ−１細胞（ＡＭＬ患者由来のヒト細胞株）、種々のヒト血漿由来タンパク質及び白血病患者の一次血液試料へのＹ１抗体の結合を調べた。
【０１３４】
［１８３．］ Ｙ１抗体は、２種類のヒト血漿由来タンパク質すなわちフィブリノゲンγ’と同定された分子質量〜５０ｋＤのタンパク質と補体複合体４（ＣＣ４）及びヒト・ルミカンと同定された分子質量〜８０ｋＤのタンパク質に比較的低いアフィニティーで結合すると判明した。これらのタンパク質は硫酸化チロシン残基とそれらに付随する一連の負荷電アミノ酸群を含んでいる。
【０１３５】
［１８４．］ ＫＧ−１細胞表面のＹ１リガンドは、Ｅ−、Ｌ−及びＰ−セレクチンの受容体であるＰＳＧＬ−１と同定された。ＰＳＧＬ−１をＫＧ−１細胞表面のＹ１抗体リガンドであると同定した根拠は競合的結合測定法 （種々の市販抗ＰＳＧＬ−１抗体の存在下にＫＧ−１細胞へのＹ１抗体の結合を検定した）及びＰＳＧＬ−１のＮ末端側部位に由来する硫酸化及び非硫酸化合成ペプチドを使用した一連の実験の結果である。ＰＳＧＬ−１のＮ末端側部位は硫酸化チロシン残基とそれらに付随する一連の負荷電アミノ酸群を含んでいる。
【０１３６】
［１８５．］ Ｙ１抗体はいくつかの分子たとえば血小板表面のグリコカリシン、フィブリノゲンγ’、ヒト血漿の補体複合体４、及びＧＫ−１細胞表面のＰＳＧＬ−１分子などに結合するものの、ＡＭＬ患者か又は多発性骨髄腫患者に由来する一次白血病細胞へのそのアフィニティーは前述のエピトープの場合と比べて何桁も高い。さらに、市販の抗ＰＳＧＬ−１抗体（ＫＰＬ１）は患者由来血液試料中の病変した一次白血病細胞をすべて認識するわけではない（１２中７を認識）がＹ１抗体はそれらを特異的、選択的に認識するという事実は、原発生白血病細胞の表面にはＫＧ−１細胞表面のエピトープとは異なる追加のＹ１抗体対応エピトープが存在することを示唆する。
【０１３７】
［１８６．］ 本発明の硫酸化エピトープの例は式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）で示されるものや、その誘導体、同族体、模倣体、変異体などである。
式（Ｉ）：
【化１６】

式中、
Ｗは、アスパラギン酸とグルタミン酸とを除く任意のアミノ酸であり、
Ｙは、硫酸化可能な任意の天然部分であり、
Ｐは、
【化１７】

であり、
Ｓは、スルフェート又は硫酸化分子であり、
Ｘは、任意のアミノ酸であり、但し、アスパラギン酸、グルタミン酸又はチロシンを除く、
【０１３８】
Ａは、任意の負荷電アミノ酸、もしくはロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、セリン又はグリシンであり、
ｑは、１〜６であり、
ｚは、０、１又は２であり、
ｒは、０又は１であり、
ｔは、１、２又は３であり、
ｕは、０〜２であり、
ｎは、０〜３であり、
ｍは、０〜３
であるが、ここで、ｎ＝０ならばｍ＞０； ｍ＝０ならばｎ＞０； ｑ＝１ならばｒ＝１であり、またｑ＞１ならば１以上のＹが硫酸化している； さらに、単離エピトープにはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む第１超可変領域をもつ抗体、その抗原結合性断片、又は抗体又はその結合性断片を含むその複合体が結合しうる。
【０１３９】
［１８７．］ 好ましいエピトープは式Ｉで示されエピトープであって、式中Ｗはグリシンであり、Ｙはチロシンのペプチドコンジュゲートもしくはアスパラギン、セリン又はトレオニンのグリココンジュゲートであり、Ａはグルタミン酸、γカルボキシグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、ｑは１、２又は３である。ある種の実施態様ではＹはチロシンのペプチドコンジュゲートであり、ｑは３、ｒは１である。
【０１４０】
式（ＩＩ）：
【化１８】

式中、
Ｗは、アスパラギン酸とグルタミン酸とを除く任意のアミノ酸であり、
Ｙは、硫酸化可能な任意の天然部分であり、
Ｐは、
【化１９】

であり、
Ｓは、スルフェート又は硫酸化分子であり、
Ｘは、任意のアミノ酸であり、但し、アスパラギン酸、グルタミン酸又はチロシンを除く、
【０１４１】
Ａは、任意の負荷電アミノ酸、もしくはロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、セリン又はグリシンであり、
ｚは、０、１又は２であり、
ｒは、０又は１であり、
ｔは、１、２又は３であり、
ｕは、０〜２であり、
ｎは、０〜３であり、
ｍは、０〜３
であるが、ここで、ｎ＝０ならばｍ＞０； ｍ＝０ならばｎ＞０である； １以上のＹが硫酸化している； さらに、単離エピトープにはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む第１超可変領域をもつ抗体、その抗原結合性断片、又は抗体又はその結合性断片を含むその複合体が結合しうる。
【０１４２】
［１８８．］ 好ましいエピトープは式（ＩＩ）で示されるエピトープであり、式中Ｗはグリシンであり、Ｙはチロシンのペプチドコンジュゲートもしくはアスパラギン、セリン又はトレオニンのグリココンジュゲートであり、Ａはグルタミン酸、γカルボキシグルタミン酸又はアスパラギン酸、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、セリン又はグリシンである。ある種の実施態様では、Ｙはチロシンのペプチドコンジュゲートであり、ｑは３、ｒは１である。
【０１４３】
式（ＩＩＩ）：
【化２０】

式中、
Ｇは、グリシンであり、
Ｅは、グルタミン酸であり、
Ｄは、アスパラギン酸であり、
Ｙは、チロシンであり、
Ｓは、スルフェート又は硫酸分子であり、
Ｘは、前記以外の任意のアミノ酸であり、
ｚは、０、１又は２であり、
ｔは、１、２又は３であり、
ｒは、０又は１であり、
ｕは、０〜２であり、
ｎは、０〜３であり、
ｍは、０〜３
であるが、ここで、１以上のＹが硫酸化している； ｎ＝０ならばｍ＞０； ｍ＝０ならばｎ＞０である；さらに、単離エピトープにはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む第１超可変領域をもつ抗体、その抗原結合性断片、又は抗体又はその結合性断片を含むその複合体が結合しうる。
【０１４４】
［１８９．］ 好ましいエピトープは式（ＩＩＩ） で示され、ｒが１である。
【０１４５】
［１９０．］ いずれの式でも、硫酸化部分はペプチドコンジュゲート又はグリココンジュゲート又はリポコンジュゲートでよい。Ｙは脂質及び／又は糖質分子を含んでもよい。エピトープは硫酸化に加えて１以上の翻訳後修飾を受けてもよい。
【０１４６】
［１９１．］ こうしたエピトープはＧＰＩｂやＰＳＧＬ−１などのような多様な分子上で検出されるし、またある種の病変細胞たとえばＢ−ＣＬＬ細胞、ＡＭＬ細胞、多発性骨髄腫細胞、転移性細胞の表面でも検出される。これらのエピトープへの結合ではチロシン及び／又は他分子の硫酸化が特に重要である。チロシン硫酸化を受けることが知られているヒトタンパク質の例は次のとおりである：
【０１４７】

【０１４８】
Ｙ１ −産生と選択
［１９２．］ 式（Ｉ）〜（ＩＩＩ） のエピトープに結合する本発明の抗体の一例は完全ヒト・モノクローナル抗体Ｙ１である。Ｙ１の選択、産生及び初期解析は米国特許出願第０９／７５１，１８１号及び６０／２５８，９４８号に詳しく記載されている。簡単に言えば、ｓｃＦｖ抗体断片を提示するファージ提示型ライブラリーを利用してターゲッティング分子を獲得、生産し、フローサイトメトリー特に蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によりターゲット細胞を認識するペプチド又はポリペプチドを提示する特異的ファージクローンを同定、単離した。ここで使用したファージ提示型ライブラリーは非免疫ドナーのヒト末梢血リンパ球から構築した。
【０１４９】
［１９３．］ ファージクローンは多段階バイオパニング法により選択し同定した。バイオパニングは、タンパク質リガンド変異体を提示するファージ（ファージ提示型ライブラリー）をターゲットと共にインキュベートし、洗浄により未結合ファージを除去し、結合ファージを特異的に溶出するという方法で行った。溶出したファージは随意に増幅した後、追加の結合及び随意増幅サイクルにかけて特異的配列の集まりを濃縮し、ターゲットへの最良結合を示す抗体断片を含むファージクローンの濃度を高めるようにした。数ラウンド後、個別ファージクローンの特性解析を行い、クローンによって提示されたペプチドの配列をファージビリオンの対応ＤＮＡの配列解析によって決定した。
【０１５０】
［１９４．］ 本発明では、当初のバイオパニングステップ用に不確定エピトープを対象とする血小板のスクリーニングを行い、それに続くクローン選択は細胞表面マーカー未判明の所望のターゲット細胞（たとえばＢ−ＣＬＬ細胞やＡＭＬ細胞、多発性骨髄腫細胞、転移性細胞など）を用いて行った。
【０１５１】
［１９５．］ 悪性及び病変（白血病又は骨髄腫などの）血液細胞は、通常は部分的に分化した造血前駆細胞で検出されるような細胞表面タンパク質を発現する未熟細胞として位置付けられる。従って、血小板は病変又は悪性血液細胞で発現される未熟細胞表面マーカーを同定するための格好の材料である。
【０１５２】
［１９６．］ 血小板及び骨髄性白血病細胞特にＡＭＬ細胞に結合するｓｃＦｖクローン、Ｙ１を選択した。Ｙ１ ｓｃＦｖはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５の配列をもつ。Ｙ１の結合特性は主にその重鎖ＣＤＲ３に由来するが、それはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８の配列をもつ。完全Ｙ１−ＩｇＧ抗体も産生させた。
【０１５３】
［１９７．］ 血小板及びヒト骨髄性白血病細胞特にＡＭＬ細胞に由来する細胞株に結合する第２のｓｃＦｖクローン、Ｙ１７もまた選択した。Ｙ１７ ｓｃＦｖはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０３の配列をもつ。Ｙ１７の結合特性は主にその重鎖ＣＤＲ３に由来するが、それはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０の配列をもつ。完全Ｙ１７−ＩｇＧ抗体も産生させた。
【０１５４】
抗体の産生
［１９８．］ 本発明のＣＤＲをカセットに挿入して抗体を産生するようにしてもよい。カセットは、ポリペプチドに適用し本発明で定義する意味では、フレームワークとして機能する所定配列の連続アミノ酸をいい、また単一単位とみなされ、そのようなものとして操作される。その一端又は両端ではアミノ酸の置換、挿入、除去又は付加が可能である。同様に、その一端又は両端では一連のアミノ酸の置換、挿入、除去又は付加が可能である。
【０１５５】
［１９９．］ カセットのアミノ酸配列は表向き固定して、置換、挿入又は付加配列をきわめて可変的にしてもよい。カセットは、それぞれが最終構成体に不可欠の機能を担ういくつかのドメインからなってもよい。
【０１５６】
［２００．］ 本発明の抗体の超可変領域は本発明の抗体の抗原結合部位を形成する。抗原結合部位は抗体の結合相手となるエピトープの構造と相補的であるため、相補性決定領域（ＣＤＲ）ともいう。抗体の重鎖と軽鎖には各々３つのＣＤＲがあり、各ＣＤＲはＶ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインのβストランドを結合するループ上に位置する。
【０１５７】
［２０１．］ 本発明の一実施態様のカセットはＮ末端から順にフレームワーク領域１ （ＦＲ１）、ＣＤＲ１、フレームワーク領域２ （ＦＲ２）、ＣＤＲ２及びフレームワーク領域３ （ＦＲ３）を含む。
【０１５８】
［２０２．］ 本発明の一実施態様では、カセット内の識別可能な領域を置き換えることができる。たとえばカセットのＣＤＲ２及びＣＤＲ１超過変領域は非保存的又は好ましくは保存的アミノ酸置換によって置き換え又は変更してもよい。もっと具体的には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０〜１１３又はその断片からなる群より選択される連続アミノ酸配列のカセットのＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１５及び１１４で置き換えることができる。さらに具体的には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０〜３２、３５、３７〜３９、４１、４３、４５、４６、４８、５１、５４、５７、５９〜６８、７０、７１、７６〜８５、８７、９８〜９２、９４、９７、９９、１０３、１０６、１１２及び１１３又はその断片からなる群より選択される連続アミノ酸配列のカセットのＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１５及び１１４で置き換えることができる。
【０１５９】
［２０３．］ 本発明の好ましい実施態様では、ペプチド又はポリペプチドは重鎖と軽鎖を含み、各鎖はそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２にほかならない第１、第２及び第３超可変領域をもつ。その結合選択性及び特異性は特にＣＤＲ３領域により、おそらくは軽鎖のＣＤＲ３により、好ましくは重鎖のＣＤＲ３領域により、また二次的には軽鎖の、また好ましくは重鎖のＣＤＲ２及びＣＤＲ２領域により、決まる。この結合選択性及び特異性は二次的には第１、第２及び／又は第３超可変領域に隣接する上流又は下流領域による影響を受ける場合もある。
【０１６０】
［２０４．］ 好ましい実施態様ではペプチド又はポリペプチドのＣＤＲ３領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８〜２４からなる群より選択されるアミノ酸配列をもつ。
【０１６１】
［２０５．］ より好ましい実施態様では、重鎖のＣＤＲ３領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８〜２４からなる群より選択されるアミノ酸配列をもち、ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１５と同一のアミノ酸配列をもち、またＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１４と同一のアミノ酸配列をもつ。
【０１６２】
［２０６．］ 最も好ましい実施態様ではＣＤＲ３領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８と同一のアミノ酸配列をもつ。
【０１６３】
［２０７．］ 本発明の好ましい実施態様は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８と同一のＣＤＲ３配列をもつｓｃＦｖ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５と同一の完全ｓｃＦｖ配列である。
【０１６４】
［２０８．］ 本発明の最も好ましい実施態様では、ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８、１１５及び１１４のアミノ酸配列をもつ。
【０１６５】
［２０９．］ 本発明の一実施態様ではＦｖペプチドは、それ自体ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０〜１１３からなる群より選択されるアミノ酸配列をもつカセットを含む重鎖可変領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８〜２４からなる群より選択されるアミノ酸配列をもつ、好ましくは重鎖可変領域のＣＤＲ３領域； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７のアミノ酸配列をもつＣＤＲ３領域の隣接下流領域； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６のアミノ酸配列をもつＣＤＲ３領域の隣接上流領域； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３又は１２４の０〜２０アミノ酸残基のスペーサー； 及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の配列をもつ軽鎖可変領域を含む。
【０１６６】
［２１０．］ 同様に、別の実施態様では、ＣＤＲ２に隣接する上流領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１９のアミノ酸配列をもち、ＣＤＲ２に隣接する下流領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１８のアミノ酸配列をもち、ＣＤＲ１に隣接する上流領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２１のアミノ酸配列をもち、またＣＤＲ１に隣接する下流領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２０のアミノ酸配列をもつ。
【０１６７】
［２１１．］ 本発明の好ましい実施態様は、ペプチド又はポリペプチドであって、第２及び第３超可変領域がそれぞれＣＤＲ２及びＣＤＲ１であり、ＣＤＲ３のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８、ＣＤＲ２のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５、ＣＤＲ１のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４、ＣＤＲ３に隣接する上流領域のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７、ＣＤＲ３に隣接する下流領域のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６、ＣＤＲ２に隣接する上流領域のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９、ＣＤＲ２に隣接する下流領域のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８、ＣＤＲ１に隣接する上流領域のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１、ＣＤＲ１に隣接する下流領域のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０であるペプチド又はポリペプチドを提供する。
【０１６８】
［２１２．］ 本発明の別の好ましい実施態様は、随意に１つ又は複数のタグをもつＦｖ分子であって、第１、第２及び第３超過変領域を有する第１鎖と第１、第２及び第３超過変領域を有する第２鎖とを含み、第１鎖の超可変領域の１つがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８〜２４からなる群より選択されるアミノ酸配列をもち、第２鎖の超可変領域の１つがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １〜６及び１２５〜２０２からなる群より選択されるアミノ酸配列をもち、また第１、第２及び第３超過変領域がそれぞれＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１であり、さらにＦｖがｓｃＦｖ又はｓｃＦｖであるＦｖ分子を提供する。
【０１６９】
［２１３．］ 本発明の別の実施態様は、ペプチド又はポリペプチドであって、（ｉ）第１及び第２鎖が各々ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８〜２４からなる群より選択される第１超可変領域をもつか、又は（ｉｉ） 第１及び第２鎖の第１超可変領域が同一であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８〜２４からなる群より選択されるか、又は（ｉｉｉ）第１鎖の第１超可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８〜２４からなる群より選択され、第２鎖の第１超可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜６及び１２５〜２０２からなる群より選択されるか、又は（ｉｖ） 第１鎖の第１超可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜６及び１２５〜２０２からなる群より選択され、第２鎖の第１超可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８〜２４からなる群より選択されるペプチド又はポリペプチドを提供する。
本発明のさらなる実施態様は、第１鎖の第２及び第３超可変領域がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４及び１１５であるペプチド又はポリペプチドを提供する。
【０１７０】
［２１４．］ 本発明のさらなる実施態様として、ここで開示し詳述する２５アミノ酸残基以下のすべてのアミノ酸配列（ＣＤＲ領域、ＣＤＲ隣接領域など）は、その範囲内に１つ又は２つのアミノ酸置換を含むものとし、また該置換は好ましくは保存的アミノ酸置換であるものとする。本発明のさらなる実施態様として、ここで開示し詳述する２５アミノ酸残基超のすべてのアミノ酸配列は、その範囲内に原配列に対して９０％以上の配列類似性を有するアミノ酸配列を含むものとする［Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２５， ３３８９−３４０２ （１９９７）］。類似又は相同アミノ酸は、類似の性質たとえば酸性、塩基性、芳香族、サイズ、正又は負荷電、極性、非極性などの性質を示す非同一アミノ酸をいう。
【０１７１】
［２１５．］ 百分率アミノ酸類似性又は相同性もしくは配列類似性は２つの異なるペプチド又はポリペプチドのアミノ酸配列を比較して決定する。２つの配列のアラインメントを、通常は専用のコンピュータプログラムを用いて行い、各位置のアミノ酸残基を比較する。次にアミノ酸の同一性又は相同性を決定する。次いでアルゴリズムを用いて百分率アミノ酸類似性を決定する。一般にアミノ酸配列を比較するほうが、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質分子の間の微妙な関係の検出感度が大幅に増すので好ましい。タンパク質の比較では、非同一アミノ酸が類似の物理的及び／又は化学的性質をもっているとミスマッチでもなおプラスの得点を生み出しかねないような保存的アミノ酸置換の存在を計算に入れることができる［Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２５， ３３８９−３４０２ （１９９７）］。
【０１７２】
［２１６．］ 本発明の一実施態様では、軽鎖、重鎖各々の３つの超可変領域は２鎖間でも、また鎖内及び／又は鎖間の３超可変領域間でも、互換可能である。
【０１７３】
Ｖ _Ｌ （Ｙ１ 由来 ） へのポリクローナル抗体
［２１７．］ ヒト抗体のＶ_Ｌドメイン（軽鎖可変領域）をコードするＤＮＡ断片を、Ｙ１クローンからＰＣＲクローニングした［同一ＤＮＡ断片はＮｉｓｓｉｍＩライブラリー（Ｎｉｓｓｉｍ ｅｔ ａｌ．， 「免疫化学試薬としての ‘シングルポット’ ファージ提示型ライブラリーに由来する抗体断片」“Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ａ ‘ｓｉｎｇｌｅ ｐｏｔ’ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ ａｓ ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅａｇｅｎｔｓ，” ＥＭＢＯ Ｊ． １３（３）： ６９２−６９８， １９９４）中の他の任意のクローンから、又は同じ方法によりヒトゲノムからでさえも、得ることができる］。このＰＣＲには次の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いた： オリゴ５’−ＮｄｅＩ （ＴＴＴ ＣＡＴ ＡＴＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＣＴ ＣＡＧ ＧＡＣ ＣＣＴ ＧＣＴ）及びオリゴ３’−ＥｃｏＲＩ （ＴＴＴ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＴＡ ＴＴＴ ＴＧＣ ＴＴＴ ＴＧＣ ＧＧＣ）。ＰＣＲによる増幅（ＰＣＲ条件： ９４℃１’， ５６℃２’， ７２℃２’を３０回、次いで６５℃５’）、得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し同じ酵素で消化済みのプラスミドにクローニングした。該プラスミドは組換えタンパク質のＥ． ｃｏｌｉ中での原核発現に使用されるＩＰＴＧ誘導性発現ベクターである。Ｅ． ｃｏｌｉ細胞はライゲーション混合液で形質転換し、陽性クローンを前記オリゴヌクレオチドプライマー使用のＰＣＲ増幅で選択した。このプラスミドを収めた細胞を増殖させ、ＩＰＴＧで発現を誘導した。ＩＰＴＧによる発現誘導後の培養液１リットルから遠心で集菌し、封入体を単離し、グアニジン−ＨＣｌ＋ＤＴＥに溶かし、トリス−アルギニン−ＥＤＴＡを含む緩衝液で希釈して再生した。５〜１０℃で４８時間再生した後、タンパク質を含む溶液を２０ｍＭグリシンｐＨ ９に透析、濃縮した。タンパク質を含む透析液を、イオン交換カラムＨｉＴｒａｐＱを用いて再精製しＮａＣｌのグラジエントで溶出した。主ピークをＳＤＡ−ＰＡＧＥで、またゲルろ過で解析した。当初の１リットル培養液から少なくとも１０ｍｇの精製Ｖ_Ｌが得られた。
【０１７４】
［２１８．］ ウサギの免疫処理を、まずＣＦＡ（フロイント完全アジュバント）の存在下にＶ_Ｌ（４００ｍｇ）で、次いで２〜４週間の間隔でＩＦＡ（フロイント不完全アジュバント）の存在下にＶ_Ｌ（２００ｍｇ）で、それぞれ行った。得られた力価は低かった（１：５０〜１：１００）。おそらくヒト及びウサギ由来Ｖ_Ｌ間の高相同性のためであろう。
ｓｃＦｖ抗体へのポリクローナル抗体
【０１７５】
［２１９．］ ＮｉｓｓｉｍＩファージ提示型抗体ライブラリー（Ｎｉｓｓｉｍ ｅｔ ａｌ． 前掲）に由来する２つの個別ｓｃＦｖ抗体クローン（Ｙ１とＮ１４）を別々に培養した。ＩＰＴＧによる発現誘導後、菌株を２２℃で１６時間増殖させた。細菌細胞の周辺質からｓｃＦｖ抗体断片を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムで精製した。細菌クローン培養、発現誘導プロトコール、ｓｃＦｖ抗体断片の回収及び精製の手順はすべてＨａｒｒｉｓｏｎ Ｊ．Ｌ．， Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｓ．Ｃ．， Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ．， ａｎｄ Ｎｉｓｓｉｍ Ａ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６７：８３−１０９ （１９９６）に従って実行した。基本的に、任意の２以上の個別ｓｃＦｖクローンをＮｉｓｓｉｍＩファージ提示型抗体ライブラリーから選択して、Ｎｉｓｓｉｍライブラリー中に存在する任意の個別ｓｃＦｖ抗体を認識する、もしくは同じＶ_Ｌ又はその断片を含む限りで任意のＩｇＧ又はその断片を認識する、ウサギ由来ポリクローナル抗体を調製することができる。
【０１７６】
［２２０．］ ウサギの免疫処理を、まずＣＦＡの存在下に精製ｓｃＦｖ抗体断片の１：１混合物４００ｍｇで、次いで２〜４週間の間隔でＩＦＡの存在下に同じ混合物２００ｍｇで、それぞれ行った。
【０１７７】
［２２１．］ 細胞へのｓｃＦｖ抗体結合のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による検出又はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での各種タンパク質画分へのｓｃＦｖ抗体結合のウェスタンブロット法による検出では、ポリクローナル抗ｓｃＦｖ抗体を免疫ウサギの血清から直接、又はＰｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムで精製後に、用いた。
【０１７８】
血小板上の Ｙ１ 結合部位の解析
［２２２．］ 循環血小板は巨核球の周縁から放出される細胞質粒子である。血小板は止血で重要な役割を果たす。血管が損傷すると損傷組織表面に血小板が接着し、また互いに付着し合う（粘着）。この一連の事象は急速に起こり、血管損傷部に無構造の塊（一般に血小板栓又は血栓という）を形成する。この粘着現象は凝集ともいうが、種々の物質又はアゴニストたとえばコラーゲン、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、エピネフリン、セロトニン及びリストセチンなどによってｉｎ ｖｉｔｒｏで起こすことができる。凝集は血小板機能を調べる様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ試験の１つである。
【０１７９】
［２２３．］ 先行技術中のいくつかの証拠によれば、ＧＰＩｂαのＡｓｐ２６９とＡｓｐ２８７の間の負荷電アミノ酸群は血小板へのウォンビルラント因子（ｖＷＦ）の結合にとって重要であり、該結合自体は損傷血管への血小板の接着、動脈狭窄部位における高ずり応力によって誘発される血小板凝集、及び低濃度のトロンビンによって誘発される血小板活性化を媒介する。Ｗａｒｄ， Ｃ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５（１５）： ４９２９−３９ （１９９６）． ｖＷＦとＧＰＩｂの相互作用は、マトリックスに結合したとき又はずり応力を受けたときのｖＷＦ構造の活性化事象又はコンホメーション変化に依存する。この過程はｖＷＦに結合する特異的モジュレーターたとえばリストセチン及びボトロセチンによりｉｎ ｖｉｔｒｏでほぼ再現される。
【０１８０】
血小板抽出物への Ｙ１ の反応性
［２２４．］ 血小板表面膜上のＹ１対応エピトープの同定には免疫ブロット法及びエンドプロテアーゼ切断法を使用した。ＧＰＩｂα分子上のエンドプロテアーゼ切断部位は図１に示す。
【０１８１】
ウェスタンブロット解析
［２２５．］ Ｙ１ ｓｃＦｖをファージ抗体ライブラリーからヒト血小板へのパニングにより選択し、それが固定及び洗浄ヒト血小板に結合することを見い出した。Ｙ１の解析はＥＬＩＳＡ法とＦＡＣＳ法で実施した。
【０１８２】
［２２６．］ Ｙ１と結合する血小板上のエピトープを解析するために、血小板表面タンパク質を（還元、非還元の両条件下で）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ビオチン標識Ｙ１を使用して還元及び非還元条件下で免疫ブロット法にかけた。この実験の結果は、Ｙ１が還元条件下で分子質量１３５ｋＤａのタンパク質と反応し、また非還元条件下で分子質量〜１６０ｋＤａのタンパク質と反応することを示している。これらの分子質量は還元条件下で１３５ｋＤａの分子質量をもつ血小板ＧＰＩｂαに対応する。非還元条件下では、ＧＰＩｂβ鎖とジスルフィド結合したＧＰＩｂα鎖の分子質量は１６０ｋＤａ（図２）である。
【０１８３】
［２２７．］ ＧＰＩｂα鎖はＧＰＩｂβ鎖とジスルフィド結合して血小板膜タンパク質ＧＰＩｂを形成している。モノクローナル抗体のＭＣＡ４６６Ｓ （Ｓｅｒｏｔｅｃ）とＳ．Ｃ．７０７１ （Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）はそれぞれＧＰＩｂαのＣ末端側断片とＮ末端に結合することが知られているが、還元及び非還元条件下でＹ１の反応相手となる同じ断片に結合することを見い出した（Ｓ．Ｃ．は非還元条件下だけで使用した）。これらの結果は、Ｙ１がＧＰＩｂα血小板表面タンパク質に結合することをさらに確認するものである。
【０１８４】
［２２８．］ 半精製ＧＰＩｂ断片（グリコカリシン）をウェスタン法でさらに解析し、Ｙ１がＧＰＩｂ複合体のαサブユニットに確かに結合することを確認した。
【０１８５】
［２２９．］ Ｅ． ｃｏｌｉで発現させた組換えＧＰＩｂはＹ１とは反応しないことがウェスタン解析で証明された。従ってＹ１の結合にはＥ． ｃｏｌｉでは起こらない翻訳後修飾が必要となる模様である。Ｎ−又はＯ−グリカナーゼのいずれもＫＧ−１へのＹ１結合には影響しない。しかし、Ｙ１の結合はアリールスルファターゼによるリガンドの処理により又はプロテアーゼにより不活性化することができる（図３）。
【０１８６】
グリコカリシン （ＧＣ） ＧＰＩｂ α断片上の Ｙ１ エピトープ部位の定位
［２３０．］ Ｙ１結合部位をさらに定位するために、切断部位が判明している特異的プロテアーゼでＧＰＩｂを消化し、その断片についてＹ１結合試験を行った。
【０１８７】
血小板 ＧＰＩｂ αへの Ｙ１ 結合への Ｏ− シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼの効果［２３１．］ Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ （Ｃｅｄａｒｌａｎ ＣＬＥ １００）由来の酵素Ｏ−シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼはヒト血小板ＧＰＩｂαを選択的に切断し、しかもシアリル化したＯ−結合型グリカンを含むタンパク質だけを特異的に切断する。Ｏ−シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼはＮ結合型糖タンパク質又は非グリコシル化タンパク質を切断しない。この酵素は、高Ｏ−グリコシル化ＧＰＩｂを切断するがＧＰＩＩｂ−ＩＩＩ ａ又は他の血小板上受容体は切断しないことが報告されている。ＧＰＩｂαをＯ−シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼで切断したのは、ＧＰＩｂα分子へのＹ１結合をさらに立証するためである。
【０１８８】
［２３２．］ 免疫ブロット（図４及び５）及びＦＡＣＳ解析（図６）から、洗浄血小板をＯ−シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼとインキュベートするとＧＰＩｂαへのモノクローナル抗体ＭＣＡ４６６Ｓ （Ｓｅｒｏｔｅｃ）だけでなくＹ１もまた結合しなくなることが証明された。該エンドプロテアーゼはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩ ａへの（抗ＣＤ６１）モノクローナル抗体の結合には影響を及ぼさない（図４）。これらの結果は、血小板膜上のＹ１受容体がＧＰＩｂαであることを示す追加の証拠となる。
【０１８９】
ＧＰＩｂ のモカラギン切断− Ｙ１ エピトープのマッピング
［２３３．］ モカラギン（Ｓｉｇｍａ Ｌ４５１５ａ）はコブラ毒メタロプロテアーゼであり、血小板ＧＰＩｂαを残基ｇｌｕ−２８２とａｓｐ−２８３の間の単一部位で特異的に切断して２つの安定産物すなわち上清中に放出される〜４５ｋＤａ Ｎ末端側断片（Ｈｉｓ１−Ｇｌｕ２８２）と膜結合〜９５ｋＤａ Ｃ末端側断片を生成する。
【０１９０】
［２３４．］ 洗浄血小板をモカラギンで処理して、血小板溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、ニトロセルロースに転写した。モカラギン処理洗浄血小板の溶解物をＹ１によりウェスタンブロット解析するとＧＰＩｂαに対応するバンド（１３５ｋＤａ）の消失とＮ末端側〜４５ｋＤａトリプシン消化断片へのＹ１の結合が見られた。ＧＰＩｂαのＣ末端側断片に対して産生させモノクローナル抗体（ＭＣＡ４６６Ｓ）は〜９５ｋＤａ Ｃ末端側断片と反応し、またＧＰＩｂαのＮ末端側断片に対して産生させたモノクローナル抗体（Ｓ．Ｃ．７０７１）はＹ１が認識したのと同じ〜４５ｋＤａ断片と反応した（図７）。
【０１９１】
［２３５．］ グリコカリシン（ＧＰＩｂαの可溶性細胞外断片）のモカラギン処理は洗浄血小板で観察されたものと類似する結果をもたらした。これはＧＰＩｂαの〜４５ｋＤａ Ｎ末端側断片へのＹ１及びモノクローナル抗体Ｓ．Ｃ．７０７１の結合を示す（図８）。以上の結果はＹ１のエピトープが配列Ｈｉｓ１−Ｇｌｕ２８２内に含まれることを示唆する。
【０１９２】
Ｙ１７ クローンの解析− ＧＰＩｂ への結合
［２３６．］ 本発明の第２のｓｃＦｖヒト抗体断片Ｙ１７をＹ１の場合と同じ要領で選択し、Ｙ１の場合と同じ方法を用いて解析した（実施例１７参照）。簡単に言えば、ファージ抗体ライブラリーからＹ１７を、ヒト血小板へのパニングにより選択した。Ｙ１７の特性解析にはＥＬＩＳＡ法とＦＡＣＳ解析を用いた。Ｙ１７は固定、洗浄両ヒト血小板に結合することが判明した。Ｙ１７と結合する血小板上の受容体をさらに解析するために、血小板タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、還元及び非還元条件下でビオチン標識Ｙ１７を使用して免疫ブロット法にかけた。その結果から、Ｙ１７が還元条件下で見掛け分子質量１３５ｋＤａのタンパク質と反応し、また非還元条件下で見掛け分子質量〜１６０ｋＤａのタンパク質と反応することが証明された。これらの結果は血小板ＧＰＩｂαに対応する。すなわち、ＧＰＩｂαは還元条件下で１３５ｋＤａの分子質量をもち、非還元条件下でＧＰＩｂβにジスルフィド結合し１６０ｋＤａ分子質量をもつ。ＧＰＩｂαのＣ末端側断片へのモノクローナル抗体ＭＣＡ４６６Ｓ （Ｓｅｒｏｔｅｃ）とＧＰＩｂαのＮ末端側断片を認識するモノクローナル抗体Ｓ．Ｃ．７０７１ （Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）は還元及び非還元条件下でＹ１７と同じバンドに反応する（図２）。
【０１９３】
［２３７．］ ウェスタンブロット解析によればＹ１とＹ１７は同じように血小板溶解物に結合する（図９）。
【０１９４】
［２３８．］ Ｙ１とＹ１７はまた、Ｏ−シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼ又はフィシンによる切断後のグリコカリシンにも同じように結合する（図５及び１０）。
【０１９５】
［２３９．］ ＦＡＣＳ解析によれば、Ｙ１は血小板とＫＧ−１に対して類似の結合プロフィールを示す。さらに、どちらもＲａｊｉ及びＴ２細胞には結合しない。対照的に、ＴＭ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９）、Ｙ１６ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０）及びＹ４５は前述のいずれのヒト細胞株にも結合しない。
【０１９６】
［２４０．］ これらの結果から、本発明の２つのモノクローナル抗体であるＹ１とＹ１７は種々の細胞でエピトープを共有すること、及びそれら以外の試験モノクローナル抗体はいずれもこのエピトープを認識しないことが明らかである。
【０１９７】
ＧＰＩｂ のカテプシン Ｇ による切断− Ｙ１ エピトープのマッピング
［２４１．］ 好中球セリンプロテアーゼのカテプシンＧ （Ｓｉｇｍａ Ｃ４４２８）はグリコカリシンを、残基Ｌｅｕ−２７５とＴｙｒ−２７６の間の第１切断部位と残基Ｖａｌ−２９６とＬｙｓ−２９７の間の第２切断部位で切断する。グリコカリシンをカテプシンＧで処理すると、２つのＮ末端側断片すなわち４２ｋＤａの小さなＮ末端側断片（Ｈｉｓ１−Ｌｅｕ２７５）と４５ｋＤａの大きなＮ末端側断片（Ｈｉｓ１−Ｖａｌ−２９６）、及び対応する〜９５ｋＤａ Ｃ末端側断片が生成する（図１）。
【０１９８】
［２４２．］ グリコカリシンとカテプシンＧによる消化で生成されるグリコカリシン断片とをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけ、ニトロセルロースに転写してウェスタンブロット法で解析した。免疫ブロットでは、Ｙ１は大きいＮ末端側断片（Ｈｉｓ１−Ｖａｌ−２７５）に結合したが、小さいＮ末端側断片（Ｈｉｓ１−Ｌｅｕ２７５）にもＣ末端側断片にも結合しなかった。同様に、ＧＰＩｂα上の残基Ｔｙｒ２７６とＧｌｕ２８２の間のエピトープを認識するはずの市販モノクローナル抗体ＳＺ２ （Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ ０７１９）もまた大きいＮ末端側断片としか反応しない（図１１及び１２）。
【０１９９】
［２４３．］ さらに、Ｈｉｓ１とＬｅｕ２７５の間のエピトープを認識することが知られているモノクローナル抗体Ｓ．Ｃ．７０７１は両Ｎ末端側断片に結合した。Ｙ１はＳ．Ｃ．７０７１が結合したＨｉｓ１−Ｌｅｕ２７５断片には結合しない。これらの結果は、Ｙ１のエピトープが第１及び第２カテプシンＧ切断部位の間に、すなわち配列Ｔｙｒ２７６−Ｖａｌ２９６内に、又はより確からしくはアミノ酸〜２７６−２８２の間に、位置することを示唆する。
【０２００】
精製グリコカリシン及び洗浄血小板 （ＷＰ） への Ｙ１ 結合への合成部分 ＧＰＩｂ αペプチドの効果
［２４４．］ 精製グリコカリシンへのＹ１結合へのＧＰＩｂ由来合成ペプチドの効果を評価するためにＥＬＩＳＡ法を実施した。加えて、洗浄血小板を使用するＦＡＣＳ解析も実施した。競合的結合ＦＡＣＳ解析はＧＰＩｂのＹ１結合部位内の硫酸化チロシンの重要性を評価することを目的に実施した。すなわち、濃度１μｇのＹ１−ｓｃＦｖを濃度２．５及び２００ μＭの種々のペプチドとプレインキュベートした。室温で３０分間のプレインキュベーション後、洗浄血小板〜１０^７個の入ったチューブに混合液を加え、ポリクローナル・ウサギ抗ｓｃＦｖ−ＰＥを用いて洗浄血小板へのＹ１結合を評価した。対照結合（Ｙ１単独）と比較したペプチドの阻害効果を、洗浄血小板へのＹ１の残余結合を測定することにより評価した。使用ペプチドと結果は表１に記すとおりであり、同じペプチドを使用したＥＬＩＳＡ法での観測結果（表Ｂ）と類似している。いずれの評価方法でも対照Ｙ１結合レベルは次の要領で決定した。ポリスチレン製マイクロタイターＭａｘｉＳｏｒｐプレートを（ａ）精製グリコカリシン又は（ｂ）洗浄血小板でコートし、十分に洗浄後、０．５μｇ／ウェルのＹ１を添加した。次にプレートをウサギ抗ｓｃＦｖとインキュベートし、次いで抗ウサギ−ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）及びＨＲＰ基質を添加した。抗ウサギ−ＨＲＰの結合レベルを発色強度によって測定した。抗ウサギ−ＨＲＰの結合レベルは抗Ｙ１−ｓｃＦｖの結合レベル及びＹ１の結合レベルと相関する。４０５ｎｍでの吸光度Ａ_４０５を測定した。各試料は２回検定し、その平均値を求めた。
【０２０１】
［２４５．］ 精製グリコカリシンへのＹ１結合への合成ＧＰＩｂαペプチドの効果を次の要領で評価した。種々の濃度のペプチドを定量のＹ１と混和した。室温で３０分間プレインキュベートした後に混合液を、ペプチド不存在下でのＹ１結合の評価に関する前述の要領で、精製グリコカリシンをコートしたポリスチレン製マイクロタイターＭａｘｉＳｏｒｐプレートに添加した。ペプチドの阻害効果は、ペプチド不存在下でのＹ１結合の評価に関する前述の要領で、ウサギ抗Ｙ１ｓｃＦｖ及び抗ウサギ−ＨＲＰ抗体を用いてＹ１の残余結合を測定して評価した。この研究では配列２６８〜２８５の多様なサブセットに対応する４つのペプチドと対照ペプチドを使用した。各ペプチドを種々の濃度すなわち２００μＭ、２５μＭ、２．５μＭ及び０．５μＭで試験した。
【０２０２】
［２４６．］ 前記５ペプチドは表１のとおりである：
【０２０３】
【表１】

【０２０４】
［２４７］ これらのアッセイから得られた結果は次の表２及び３のとおりである。
【０２０５】
【表２】

【０２０６】
［２４８．］ これらの結果から明らかなように、硫酸化チロシンをもつペプチドの阻害効果は非硫酸化ペプチドのそれを大幅に上回る。この効果は用量依存的であり、より長いＮ’（上流）隣接配列をもつペプチドは延長Ｃ’（下流）隣接配列をもつペプチドよりも阻害効果が大きい。これらの結果は、ＧＰＩｂαへのＹ１結合には硫酸化チロシンが必要であり、また硫酸化領域の上流及び下流がＧＰＩｂαへのＹ１結合を強化するという結論を明らかに支持する。
【０２０７】
【表３】

【０２０８】
［２４９．］ これらの結果は、ＧＰＩｂ上でのＹ１認識には特定領域内の硫酸化チロシンが重要であることをさらに裏付ける。概して、モカラギン及びカテプシンＧによるＮ末端側ペプチドのタンパク質分解断片の解析結果は、ＧＰＩｂαアミノ酸配列Ｔｙｒ２７６−Ｇｌｕ２８２がＹ１結合のための重要なエピトープそのものであるか又はそうしたエピトープを含むことを示唆する（ＦＩＧＳ． Ｔａｂ １Ｃ ｐｐ．６−７）。さらなる解析からＹ１認識部位にはグリコカリシンの残基２７６−２８２ （硫酸化陰イオン配列）に加えて上流アミノ酸２８３−２８５も関与するらしいと判明した。
【０２０９】
血小板機能への Ｙ１ ｓｃＦｖ 、 Ｙ１７ ｓｃＦｖ 及び ＩｇＧ Ｙ１ の生物活性
［２５０．］ 定位実験では、Ｙ１結合部位は血小板凝集にとって重要であるαトロンビン及びｖＷＦ結合部位に存在することが示唆された。そこで、洗浄血小板及び多血小板血漿（ＰＲＰ）へのＹ１ ｓｃＦｖ、Ｙ１７ ｓｃＦｖ及びＩｇＧ Ｙ１の結合を調べ、該結合の血小板凝集への効果を評価することにした。
【０２１０】
洗浄血小板 （Ｗ．Ｐ．） 凝集反応への Ｙ１ ｓｃＦｖ 及び Ｙ１７ ｓｃＦｖ の効果
［２５１．］ 凝集はＰＲＰ中で凝集誘発物質の存在下に測定し、凝集反応は洗浄血小板中で測定した。洗浄血小板の凝集反応へのＹ１（ｓｃＦｖ）の効果を種々のＹ１濃度で試験した。血小板はＹ１ ｓｃＦＶ、Ｙ１７ ｓｃＦｖ、Ｙ１６ ｓｃＦｖ又は対照ＴＭ−１ ｓｃＦｖとプレインキュベート（３７℃、４分間）後に血小板凝集反応及び凝集の誘発物質であるリストセチンに接触させた。
【０２１１】
［２５２．］ この研究の結果は表４及び図１５のとおりである。血小板のＹ１ ｓｃＦｖ（濃度２５μｇ／ｍｌ）とのプレインキュベーションはリストセチン誘発性の洗浄血小板凝集反応を阻害した。Ｙ１濃度１２．５μｇ／ｍｌでは血小板凝集反応の部分的阻害が観測されたにすぎない。Ｙ１濃度４μｇ／ｍｌでは血小板凝集反応がまったく観測されなかった。これらの結果は洗浄血小板凝集反応へのＹ１の阻害活性が用量に依存することを示唆する。血小板の陰性対照ｓｃＦｖ ＴＭ１とのインキュベーションはリストセチン誘発性の血小板凝集反応への効果がまったくなかった。Ｙ１の場合と同じファージ提示ライブラリーから同じ多段階パニング法で選択した別のｓｃＦｖクローンであるＹ１７もＹ１６も洗浄血小板凝集反応をほとんど阻害しなかった。
【０２１２】
【表４】

【０２１３】
多血小板血漿 （ＰＲＰ） 凝集への Ｙ１ ｓｃＦｖ 及び Ｙ１７ ｓｃＦｖ の効果
［２５３．］ 多血小板血漿（ＰＲＰ）凝集へのＹ１ （ｓｃＦｖ）効果を種々のＹ１濃度で試験した。ＰＲＰをＹ１ ｓｃＦＶ、Ｙ１７ ｓｃＦｖ又は対照ＴＭ−１ ｓｃＦｖとプレインキュベート（３７℃、４分間）後に血小板凝集反応及び凝集の誘発物質であるリストセチンに接触させた。ＰＲＰにｓｃＦｖを添加してからリストセチンを添加すると、用量依存的な可逆的阻害効果が観測された。
【０２１４】
［２５４．］ この研究の結果は表５及び図１６のとおりである。終濃度５０μｇ／ｍｌのＹ１は最初の４分間でＰＲＰ中での血小板のリストセチン凝集を〜８０％阻害した。Ｙ１濃度２５μｇ／ｍｌでは血小板凝集の阻害があまり見られなかった。Ｙ１７は血小板凝集を阻害しなかった。濃度５０μｇ／ｍｌの陰性対照ＴＭ−１ ｓｃＦｖと血小板をインキュベートしてもリストセチン凝集には効果がなかった（表５）。
【０２１５】
［２５５．］ 洗浄血小板とＰＲＰの比較からは次のことが窺えた： （１）ｓｃＦｖ Ｙ１はリストセチン誘発性の血小板凝集及び凝集反応への阻害効果をもつ； （２）その効果は用量依存的である； （３）阻害効果はＰＲＰ中よりも洗浄血小板中のほうが高かった； （４）ＰＲＰ中では可逆的阻害効果が観測された； （５）ＴＭ１、Ｙ１６いずれのｓｃＦｖ抗体断片も効果がなかった； 及び（６）このアッセイではＹ１７は陰性対照である。
【０２１６】
【表５】

【０２１７】
洗浄血小板 （Ｗ．Ｐ．） 凝集反応への Ｙ１−ＩｇＧ の効果
［２５６．］ 全Ｙ１−ＩｇＧはその天然構造のためにＧＰＩｂα上に２つの結合部位とＦｃ受容体に対応する１つの結合部位をもつ。全Ｙ１−ＩｇＧは、もしも２つのＧＰＩｂα分子に結合するとすれば、血小板を活性化し血小板凝集反応を誘発する可能性が高い。さらに、血小板はＦｃ受容体をもつため、Ｙ１−ＩｇＧはＧＰＩｂαに結合しＦｃ受容体にも結合することにより血小板凝集反応を誘発し、もって各Ｙ１−ＩｇＧが血小板３個に結合することにより血小板凝集反応を引き起こすことができる。そこで、洗浄血小板凝集へのＹ１−ＩｇＧの効果を種々のＹ１−ＩｇＧ濃度でリストセチンの存在及び不存在下に試験した。Ｙ１−ＩｇＧによる血小板凝集の誘発を３７℃で４分間試験し、次にリストセチンを添加した。
【０２１８】
［２５７．］ その結果は表６及び図１７のとおりである。Ｙ１−ＩｇＧ単独（終濃度５０μｇ／ｍｌ）で通常の洗浄血小板凝集反応の〜３９％を誘発した。Ｙ１−ＩｇＧによる血小板凝集反応の誘発を３７℃で４分間試験し、次いでリストセチンを添加した。リストセチン添加後は血小板凝集反応への追加効果がまったく見られず、通常の血小板凝集反応が観測された。しかし、血小板を濃度１μｇ／ｍｌのＹ１とインキュベートしても血小板凝集反応の誘発はまったくなかった。
【０２１９】
［２５８．］ 上述の要領でＧＰＩｂα （ＣＤ４２）への市販の（血小板凝集反応を阻害する）モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）、又は対照ヒトＩｇＧ−Ｌａｍｂｄａ （Ｓｉｇｍａ）を使用しても血小板凝集反応の阻害はなかった。
【０２２０】
【表６】

【０２２１】
多血小板血漿 （ＰＲＰ） 凝集への Ｙ１−ＩｇＧ の効果
［２５９．］ ＰＲＰ凝集へのＹ１−ＩｇＧの効果を種々のＹ１−ＩｇＧ濃度でリストセチンの存在及び不存在下に試験した。Ｙ１−ＩｇＧによる血小板凝集の誘発を３７℃で４分間試験し、次にリストセチンを添加した。
【０２２２】
［２６０．］ 結果は表７及び図１８のとおりである。リストセチン添加後は血小板凝集への効果が見られず、通常の血小板凝集が観測された。終濃度５０μｇ／ｍｌのＹ１−ＩｇＧはリストセチン添加前、ＰＲＰ中で血小板凝集を誘発した。濃度２５μｇ／ｍｌのＹ１−ＩｇＧはリストセチン添加前、血小板凝集を部分的に誘発したにすぎない。濃度１０μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ又は１μｇ／ｍｌのＹ１−ＩｇＧでは血小板凝集の誘発が見られなかった。濃度２０μｇ／ｍｌで血小板凝集を阻害する市販の、ＧＰＩｂα （ＣＤ４２）へのモノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）は、血小板凝集を誘発しなかった。Ｙ１−ＩｇＧと同じ濃度の対照ヒトＩｇＧ−Ｌａｍｂｄａ （Ｓｉｇｍａ）もまた血小板凝集を誘発しなかった。
【０２２３】
【表７】

【０２２４】
Ｙ１ 血漿可溶性リガンド及び細胞株の同定
［２６１．］ ＧＰＩｂα（ＣＤ４２ｂ）への抗体は血小板溶解物とグリコカリシンを認識するが、ＫＧ−１細胞溶解物（Ｙ１結合陽性の骨髄腫細胞株）又はＲａｊｉ細胞溶解物（ＫＧ−１細胞がＹ１結合陽性となる濃度でＹ１結合陰性であるＢ細胞株）を認識しない。それに対して、Ｙ１はグリコカリシン、血小板溶解物及びＫＧ−１細胞をいずれも認識するが、Ｒａｊｉ細胞抽出物を認識しない。陰性対照のｓｃＦｖ−１８１はいずれの関連タンパク質も認識しない（図２０）。
【０２２５】
［２６２．］ Ｙ１の交差反応性のこうした独自性は、Ｙ１とＳＺ２ （ＧＰＩｂの硫酸化領域へのＭＡｂ）の比較分析でも明らかにされた。ＳＺ２とは対照的に、Ｙ１はＧＰＩｂに結合するだけでなく、以下述べるように血漿タンパク質や骨髄腫由来細胞抽出物にも結合する。
【０２２６】
ヒト血漿中の Ｙ１ リガンド
［２６３．］ 正常血漿、白血病患者血漿のいずれでも２種類のタンパク質がＹ１と免疫反応した。すなわち（１）還元条件下での分子質量が〜５０ｋＤａ、非還元条件下での分子質量が＞３００ｋＤａであり、凝固後は血清から完全に消滅する Ｈ Ｐ−リガンド１、及び（１） 還元、非還元両条件下での分子質量が〜８０ｋＤａであり、凝固後も血清中にとどまる Ｈ Ｐ−リガンド２である。〜５０ｋＤａリガンドはＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム逆相クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ） ２Ｄゲル電気泳動による精製及びペプチドマッピング後に、ヒト・フィブリノゲンγ鎖の正常変異体（γ’）と同定された。その配列ＶＲＰＥＨＰＡＥＴＥＹＤＳＬＹＰＥＤＤＬはフィブリノゲンγ’中に存在するだけであるが、豊富に存在するフィブリノゲンγ型ではなく、また硫酸化チロシンを含むＧＰＩｂ陰イオン領域に類似する。これはたぶんＹ１結合部位であろう。〜８０ｋＤａは補体複合体４ （ＣＣ４）及びルミカンと同定された。それは前述のように、硫酸化チロシン残基と付随する負荷電アミノ酸群とを含む。
【０２２７】
一次白血病細胞への Ｙ１ の結合
［２６４．］ ＦＡＣＳ解析によれば、Ｙ１は白血病細胞に選択的に結合するが、正常血液試料中の正常血液細胞と白血病血液試料中の正常細胞には結合しない。患者試料の解析結果をまとめると以下の表のようになる。
【０２２８】
【表８】

【０２２９】
【表９】

【０２３０】
骨髄性細胞 （ＫＧ−１） 上の Ｙ１ エピトープの解析
［２６５．］ ＫＧ−１細胞膜からのＹ１エピトープの精製を目的に約２５０億個のＫＧ−１細胞を回収した。ＫＧ−１膜調製品は、Ｙ１の結合先となる少なくとも２つのサブユニットすなわち〜１１０ｋＤａサブユニットと〜１２０ｋＤａサブユニットを含んでいた。Ｙ１は、該〜１１０ｋＤａサブユニットの二量体であると見られる〜２２０ｋＤａサブユニットにも結合する。Ｙ１エピトープの精製はＹ１使用の免疫沈降法、及びＲＰ−ＨＰＬＣで行った。集めた画分のうち２μｌはｓｃＦｖ Ｙ１使用のウェスタンブロット法に、また４０μｌは銀染色に用いた。（図２１）
【０２３１】
［２６６．］ Ｙ１のさらなる特性解析を行った。その方法はプロテアーゼ、グリカナーゼ及びスルファターゼによる酵素的処理； Ｙ１、抗ＣＤ４２抗体、抗ＣＤ１６２抗体及び１８１の使用によるウェスタンプロット法； Ｙ１及び抗ＣＤ１６２抗体の使用による免疫沈降法； Ｙ１及び抗ＣＤ１６２抗体の使用によるＦＡＣＳ解析； 及び配列解析であった。
［２６７．］ 次の表はＫＧ−１細胞上のＹ１結合部位の解析と定位を目的に実行した生化学実験のまとめである。
【０２３２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ 還元ゲル上での Ｙ１ によるウェスタンブロット解析
【０２３３】
【表１０】

【０２３４】
［２６８．］ 要するに、エンドペプチダーゼで処理するとＹ１シグナルは切断され、検出不能になる。おそらくＹ１結合部位を含む画分はＮ’末端側にあるが、前記実験に使用した条件の下では小さすぎて検出できないのであろう。さらに、硫酸基を（ＫＧ−１細胞抽出物内の）タンパク質から遊離させるものの（ヘパリン上の）糖部分からは遊離させないアリールスルファターゼ処理で得られた結果は、Ｙ１の認識には硫酸基が必要であるとの仮説を裏付ける。興味深いことに、Ｏ−シアロ糖タンパク質エンドペプチダーゼはＧＣ切断産物中のＹ１シグナルを増強する。この処理により、Ｙ１結合部位がＣ’末端側に位置するようになり、Ｙ１結合にさらに好都合なように露出されるためと考えられる。
【０２３５】
Ｙ１ と ＰＳＬＧ−１ 抗体 ＫＰＬ１ の相関 ： ウェスタンプロット解析
［２６９．］ ｓｃＦｖ Ｙ１抗体及び市販抗ＰＳＧＬ−１モノクローナル抗体（ＫＰＬ１）の、ＫＧ−１細胞由来のＫＰＬ１免疫沈降（ＩＰ）膜タンパク質への結合を評価した。Ｒａｊｉ細胞溶解物をＹ１及びＫＰＬ１陰性対照として使用した。
【０２３６】
［２７０．］ ＫＧ−１細胞の膜画分をＫＰＬ１で免疫沈降した。そのＩＰ画分をさらにｓｃＦｖ Ｙ１抗体又はＫＰＬ１で免疫沈降した。非沈降（溶出液）画分をｓｃＦｖ Ｙ１又はＫＰＬ１抗体の使用によるウェスタンブロット法で解析した。
【０２３７】
［２７１．］ 免疫沈降スキームと結果を共に図２４に示す。ＫＰＬ１はグリコカリシンを認識しない。しかし、ｓｃＦｖ Ｙ１、ＫＰＬ１両抗体はＫＧ−１細胞上の膜タンパク質を認識する。
【０２３８】
［２７２．］ 細胞株及び一次白血球に由来する溶解物をＣＤ１６２抗体で免疫沈降し、遠心分離により上清と溶出液を生成した。ｓｃＦｖ Ｙ１及び抗ＣＤ１６２抗体を使用して溶出液及び上清に含まれるタンパク質のウェスタンブロット解析を行った。ＫＧ−１膜調製品は、抗ＣＤ１６２ （ＰＳＧＬ−１）抗体の結合相手となる２つのサブユニット（〜１１０ｋＤａと〜１２０ｋＤａ）を含む。それに対して、正常白血球膜調製品はもっと小さなサブユニットだけを含む。ＡＭＬ患者由来の膜調製品はもっと大きなサブユニットだけを含む。ｓｃＦｖ Ｙ１はある明確な化学種に結合するが、それは免疫沈降法の上清に存在し抗ＣＤ１６２抗体の結合相手とはならない（図２５）。
【０２３９】
ＦＡＣＳ 解析
［２７３．］ 抗ＰＳＧＬ−１ （抗ＣＤ１６２）抗体（ＫＰＬ１）の存在下でのＫＧ−１細胞へのＹ１抗体（ｓｃＦｖ型とＩｇＧ型の両方）の結合を競合的結合測定法とＦＡＣＳ解析で評価した。この目的には、種々の市販抗ＰＳＧＬ−１抗体すなわちＫＰＬ１ （ＰＳＧＬ−１の硫酸化チロシンＮ末端側ドメインを識別する抗体）、ＰＬ１ （ＰＳＧＬ−１の非硫酸化Ｎ末端側ドメインを識別する抗体）及びＰＬ２ （ＰＳＧＬ−１受容体の非硫酸化内側ドメインを識別する抗体）を使用した。ＫＧ−１細胞へのＹ１の結合を完全に阻害するのはＫＰＬ１だけであり、ＰＬ１は部分的に結合を阻害する。ＰＬ２抗体の存在下では結合阻害は見られない（図２６）。Ｒａｊｉ細胞はＫＰＬ１抗体に結合しなかった。同様に、種々の濃度の全ＩｇＧ Ｙ１はＫＧ−１細胞へのＫＰＬ１抗体の結合を用量依存的に阻害する（図２７）。同様に、ＫＰＬ−１抗体はＫＧ−１細胞への全ＩｇＧ Ｙ１の結合を用量依存的に阻害する（図２８）。
【０２４０】
一次白血病細胞への Ｙ１ 結合と ＫＰＬ１ 結合の相関
［２７４．］ 病変細胞へのｓｃＦｖ Ｙ１抗体と抗ＣＤ１６２抗体の結合を解析すると、ｓｃＦｖ Ｙ１と抗ＣＤ１６２抗体は結合特性が異なることもわかる。特にヒト患者由来の前駆Ｂ−ＡＬＬ、ＨＣＬ、ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬ、Ｂ−ＣＬＬ、未分化性白血病、Ｂ−ＰＬＬ及び多発性骨髄腫の各細胞へのＹ１及び抗ＣＤ１６２の結合をＦＡＣＳ解析すると、２抗体は異なる結合プロフィールを示した（表Ｆ）。白血病細胞へのＹ１の結合は１２中１０試料で見られるが、抗ＣＤ１６２の結合は１２中５試料に限られる。１２中５試料はＹ１に結合するが、抗ＣＤ１６２には結合しない。従って、白血病細胞ではｓｃＦｖ Ｙ１は抗ＣＤ１６２が認識するリガンドとは別のリガンドに結合するとの結論になろう。
【０２４１】
【表１１】

【０２４２】
［２７５．］ 概して、ＧＰＩｂα、フィブリノゲン（Ｆｎｇ）γ’及びＰＳＧＬ−１の含硫酸化チロシンＹ１結合ドメインはそれぞれＤＥＧＤＴＤＬＹＤＹＹＰＥＥＤ ＴＥＧＤ （アミノ酸２６９−２８７）、ＥＨＰＡＥＴＥＹＤＳＬＹＰＥＤ （アミノ酸４１１−４２７）及びＱＡＴＥＹＥＬＤＹＤＦＬＰＥＴＥ （アミノ酸１−１７）である。おそらく一次白血病細胞の表面ではＹ１へのアフィニティーがもっと高い追加の結合部位が発現するであろう。興味深いことに、ｓｃＦｖ Ｙ１と抗ＣＤ１６２の両方に対して陽性の血液試料はＡＭＬ患者に由来するが、Ｂ細胞は抗ＣＤ１６２に対して陰性である。
【０２４３】
Ｙ１ への硫酸化ペプチド結合の解析
［２７６．］ Ｙ１へのペプチドの結合における硫酸化チロシンの存在と位置の重要性を競合的結合ＥＬＩＳＡ法で評価した。
【０２４４】
［２７７．］ グリコカリシンをＭａｘｉＳｏｒｐプレート上に固定化した。ｓｃＦｖ Ｙ１を着目ペプチドと１０分間、３つの異なる濃度（１μＭ、１０μＭ及び１００μＭ）でプレインキュベートし用量応答を調べた（表１２）。プレインキュベーション後、この混合液（Ｙ１＋ペプチド）をプレートに添加し、ｓｃＦｖ Ｙ１のＶ_Ｌ鎖を認識するポリクローナル・ウサギ抗Ｖ_Ｌを、次いで抗ウサギＨＲＰを、用いてｓｃＦｖ Ｙ１の結合を評価した。該ペプチドがｓｃＦｖ Ｙ１に結合した混合液では、グリコカリシンへのｓｃＦｖ Ｙ１の結合が対照結合に比して増大した。該ペプチドがｓｃＦｖ Ｙ１に結合しなかった混合液では、グリコカリシンへのｓｃＦｖ Ｙ１の結合は対照結合に比して変化しなかった。
【０２４５】
［２７８．］ 実験は２回実施した。その結果をＥＬＩＳＡグラフで示す（図２９）。フィブリノゲン由来ペプチドは硫酸化にもかかわらずＹ１の結合を阻害しなかった。ＰＳＧＬ−１由来の非硫酸化ペプチドはグリコカリシンへのＹ１の結合を阻害しなかった。ＰＳＧＬ−１由来の硫酸化ペプチドはみなグリコカリシンへのＹ１の結合を阻害した。阻害効果が最も高いのはペプチドＰ−ＹＹＹ＊及びＰ−ＹＹ＊Ｙ＊であり、以下順にＰ−Ｙ＊ＹＹ＊、Ｐ−ＹＹ＊Ｙ、Ｐ−Ｙ＊Ｙ＊Ｙ、Ｐ−Ｙ＊ＹＹと続いた。グリコカリシン由来の非硫酸化ペプチドはグリコカリシンへのＹ１の結合を阻害しなかったが、同じ配列でチロシンが３個とも硫酸化しているグリコカリシン由来ペプチド（Ｇ−Ｙ＊Ｙ＊Ｙ＊）はＰ−ＹＹ＊Ｙと同程度の結合阻害効果があった。
【０２４６】
［２７９．］ 従って明らかなように、すべての硫酸化ペプチドがｓｃＦｖ Ｙ１に同程度に結合するわけではない。また重要なことに、これらの結果は、ペプチドＰ−Ｙ＊ＹＹ及びＰ−ＹＹＹ＊の例で明らかなように、結合に必要なのはただ１個の硫酸化チロシンであることを示す。さらに硫酸化チロシンを取り巻くアミノ酸配列もＹ１結合に影響することがわかる。たとえば（配列ＥＹ＊Ｅ中に１個の硫酸化チロシンを含む） Ｐ−Ｙ＊ＹＹは１００μＭの濃度でようやく結合を効果的に阻害するのに対して、（配列ＤＹ＊Ｄ中に１個の硫酸化チロシンを含む）Ｐ−ＹＹＹ＊は１μＭの濃度で結合を効果的に阻害する。
【０２４７】
【表１２】

【０２４８】
仮説 ／ 結論
［２８０．］ （１） Ｙ１は硫酸化タンパク質と糖部分の両方を認識するＬ−セレクチンに類似し、また硫酸化チロシンだけを認識するＰ−セレクチンとは異なる。従ってＹ１は両タンパク質の結合をめぐり競合しうる。
【０２４９】
［２８１．］ （２） 分化及び細胞増殖時の硫酸化の変異はＹ１結合に影響を及ぼすであろう。従ってＹ１はＰ−、Ｌ−両セレクチンとそれぞれの硫酸化リガンドへの結合をめぐり競合するであろう。
【０２５０】
白血病特異的抗体の有効性を評価するための ｉｎ ｖｉｖｏ モデル
［２８２．］ 免疫不全マウスとアッセイ系で２つのヒト白血病モデルを発現させた。
【０２５１】
［２８３．］ 使用したヒト細胞株はＴ細胞白血病患者由来のＭＯＬＴ４細胞とＡＭＬ患者由来のＫＧ−１細胞である。移植悪性細胞の同定と定量は各細胞株上の関連ヒト抗原に対して特異的な抗体を使用して行った。
【０２５２】
Ｔ−ＡＬＬ （ＭＯＬＴ４） モデル
［２８４．］ Ｔ−ＡＬＬのｉｎ ｖｉｖｏマウスモデルには、Ｔ細胞白血病患者由来のＭＯＬＴ４細胞を注射したＳＣＩＤマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用する。
【０２５３】
［２８５．］ 一実験では、ＳＣＩＤマウスをＣｙｔｏｘａｎ （ＣＴＸ、注射用シクロホスファミド、Ｍｅａｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ） １００ｍｇ／ｋｇで前処置した。ＣＴＸ注射の１１日後、ＭＯＬＴ４細胞を尾部血管に静脈注射した。対照マウスにはＰＢＳだけを注射した。ＭＯＬＴ４注射の１週間後、次のうちいずれかをマウスに注射した： ＣＯＮＹ１−ドキソルビシン、すなわちカルボキシル基末端にアミノ酸残基ＫＡＫをもつｓｃＦｖ ＣＯＮ Ｙ１ポリペプチドとドキソルビシン（Ｄｏｘ）とを短い有機リンカーで連結したコンジュゲート； ＣＯＮＹ１、すなわちＹ１ ｓｃＦｖ由来のｓｃＦｖ抗体断片であってＹ１のｍｙｃタグをコードするＤＮＡ配列を除去して代わりにアミノ酸リシン、アラニン及びリシン（ＫＡＫ）をコードするＤＮＡ配列を導入したｓｃＦｖ抗体断片； 又は遊離ドキソルビシン。マウスへの注射は週３回、３週間にわたり実施した。対照マウスにはＰＢＳを注射し、また別の対照群は無処置とした。（表Ｍ）
【０２５４】
【表１３】

【０２５５】
［２８６．］ マウスは細胞接種の３２日後に死に始めたので、その時点で生存マウスを犠牲にした。抗ヒトＣＤ４４−ＦＩＴＣ及びＹ１−ビオチン／ＳＡＶ−ＰＥ使用のフローサイトメトリーで骨髄細胞を解析した。数頭の動物に由来する血液試料を調べて血小板と白血球を計数した。肝臓を計量し、腫瘍発現の有無を調べた。他器官についても腫瘍発現の有無を調べた。
【０２５６】
［２８７．］ 結果は図３０〜３２のとおりである。ＭＯＬＴ−４細胞を注射したすべてのマウスの肝臓に大きな腫瘍成長（白色の瘤塊）が見られた。しかし、ＭＯＬＴ−４を注射しＣＯＮＹ１又はＣＯＮＹ１−Ｄｏｘコンジュゲートで処置したマウスの肝臓はＭＯＬＴ−４を注射し遊離Ｄｏｘで処置したマウス又は無処置のマウスの肝臓に比べて著しく軽量であった（図３０）。
【０２５７】
［２８８．］ 骨髄中に検出されたＭＯＬＴ−４細胞の百分率はきわめて低かった（図３１）。
【０２５８】
［２８９．］ 概して、これらの結果はＭＯＬＴ−４モデルが白血病細胞の肝臓転移の有用モデルとして使用しうることを証明する。
【０２５９】
［２９０．］ 第２の実験では、シクロホスファミド処置５日後、ＳＣＩＤマウスに２×１０^７ ＭＯＬＴ−４細胞／マウスを静注した。ＭＯＬＴ−４細胞注射後５日目以降、週３回３週間にわたり、抗がん薬又はＰＢＳ（陰性対照動物）を注射した。３５日目に動物から採血し、動物を犠牲にしてその肝臓を摘出し計量した。ＭＯＬＴ−４細胞を注射した無処置の（ＰＢＳ注射）動物では、肝臓にきわめて大きな腫瘍成長が見られ、またそのサイズはＭＯＬＴ−４細胞を注射せずＰＢＳを注射した対照動物に比して２〜３倍も大きくなっていた。
【０２６０】
この実験では次の５実験群を使用した：
１． ＭＯＬＴ−４細胞を注射せずＰＢＳを注射した対照群
２． ＭＯＬＴ−４細胞を注射しＰＢＳを注射した対照群
３． Ｙ１ ｓｃＦｖ （ＣＯＮＹ１） ７５μｇ／マウスで処置したＭＯＬＴ−４群
４． ＣＯＮＹ１−Ｄｏｘ ７５μｇ／マウスで処置したＭＯＬＴ−４群
５． Ｄｏｘ ０．１ｍｇ／ｋｇで処置したＭＯＬＴ−４群。
【０２６１】
［２９１．］ 平行して、肝組織の一部を組織学用、及びＦＡＣＳ解析のための細胞分離用に採取した。別の処置マウス群の生存率を対照無処置マウス群のそれと比較して記録した。
【０２６２】
［２９２．］ ３５日目の肝重量を図３３に示す。図に示すように、肝重量は腫瘍マウスの陰性対照ＰＢＳ注射群では対照ＰＢＳ注射・非ＭＯＬＴ−４注射群に比してほぼ３倍に増加した。低用量Ｄｏｘで処置したマウスの肝重量はＰＢＳ注射腫瘍マウスとほぼ同じであった。他方、ＣＯＮＹ１ ｓｃＦｖ及びＣＯＮＹ１ ｓｃＦｖ−Ｄｏｘコンジュゲートによる処置は肝臓の腫瘍成長を著しく阻害した（肝重量の増大がずっと小幅）。
【０２６３】
［２９３．］ 同じＳＣＩＤ／ＭＯＬＴ−４プロトコールによる第３の実験では、次の６群を使用した：
１． ＭＯＬＴ−４細胞を注射せずＰＢＳを注射した対照群
２． ＭＯＬＴ−４細胞を注射しＰＢＳを注射した対照群
３． ＣＯＮＹ１ ｓｃＦｖ ７５μｇ／マウスで処置したＭＯＬＴ−４群
４． ＮｉｓｓｉｍＩライブラリー由来の非特異的ｓｃＦｖ抗体 ７５μｇ／マウスで処置したＭＯＬＴ−４群（対照）
５． Ｙ１−ＩｇＧ ５μｇ／マウスで処置したＭＯＬＴ−４群。
６． 非特異的ヒトＩｇＧ ５μｇ／マウスで処置したＭＯＬＴ−４群（対照）。
【０２６４】
［２９４．］ 図３４に示す結果から、ＣＯＮＹ１ ｓｃＦｖ又はＹ１ ＩｇＧによる処置は（肝重量に基づく限り）腫瘍の成長を阻害する一方で、非特異的抗体による処置はほとんど又はまったく効果がなかったことが窺える。
【０２６５】
［２９５．］ 継続的処置を受けた３群のマウスで生存を評価したが、結果は図３５のとおりである。図に示すように、ＣＯＮＹ１ ｓｃＦｖで処置したマウスの生存だけが延びた。
【０２６６】
ＡＭＬ ＫＧ−１ モデル
［２９６．］ ヒトＡＭＬのｉｎ ｖｉｖｏマウスモデルには、ヒトＡＭＬ細胞株由来のＫＧ−１細胞を注射したＳＣＩＤ／ＮＯＤマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用する。
【０２６７】
［２９７．］ 第１の実験では、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスをＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標） １００ｍｇ／ｋｇで前処置した。ＣＹＴＯＸＡＮ注射の４日後、ＫＧ−１細胞を６群のマウスの尾部に静脈注射した（表Ｎ、群２及び５−９）。１群のマウス（表Ｎ、群１）にはＰＢＳだけを注射した（対照）。
ＫＧ−１注射の１９日後からマウスを次のうちいずれかで処置した： ＣＯＮＹ１、Ｄｏｘ（ドキソルビシン）、ＣＯＮＹ１−Ｄｏｘコンジュゲート又はＭｙｌｏｔａｒｇ （登録商標） ［Ｍｙｌｏｔａｒｇはカルキアマイシンにモノクローナル抗体（抗ＣＤ３３抗体）を化学的に結合したコンジュゲートであり、最初の再発に見舞われた６０歳以上のＡＭＬ患者の治療用として最近ＦＤＡの承認がおりた］。マウスは週１回又は３回、３週間にわたり処置した。ＫＧ−１接種マウスのうち１群（群２）は無処置のままとした（表Ｎ）。他の２群（群３及び４）のマウスには、１％ ＢＳＡ添加の無血清ＲＰＭＩ中、４℃で１時間 ＣＯＮＹ１又は１８１−ｓｃＦｖ （陰性対照の非特異的抗体）とプレインキュベートしておいたＫＧ−１細胞を注射した。抗体の使用濃度は０．２５ｍｇ−ｓｃＦｖ／１０^８個−細胞（７５μｇ／マウス）であった。プレインキュベートしたＫＧ−１細胞はマウスに注射する前に洗浄し、ＲＰＭＩ中に再懸濁した。ＲＰＭＩに再懸濁したＫＧ−１細胞を７５μｇ−ｓｃＦｖ／０．２ｍｌ−ＲＰＭＩ／マウスの濃度でマウスに注射した。群３マウスにはＫＧ−１＋ＣＯＮＹ１を、また群４マウスにはＫＧ−１＋１８１−ｓｃＦｖをそれぞれ接種した（表Ｎ）。この処置（群３及び４）は群１−２及び５−９の接種の１日後に、すなわちＣＹＴＯＸＡＮ注射の５日後に、実施した。
【０２６８】
【表１４】

【０２６９】
［２９８．］ マウスは細胞接種の６０〜６５日後に犠牲にした。骨髄及び血液試料をマウス抗ヒトＣＤ３４−ＦＩＴＣ （ＩＱＰ １４４Ｆ） ［又は抗ＣＤ４４−ＦＩＴＣ （ＭＣＡ８９Ｆ， Ｓｅｒｏｔｅｃ）］及びＹ１−ビオチン／ＳＡＶ−ＰＥ使用のフローサイトメトリーで解析した。マウスＩｇＧ１−ＦＩＴＣ （ＩＱＰ １９１−Ｆ）をアイソタイプ対照として使用し、またマウスＩｇＧ２ａ−ＦＩＴＣ （ＭＣＡ ９２９Ｆ， Ｓｅｒｏｔｅｃ）を陰性対照として使用した。フローサイトメトリーにはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒシステムとＣｅｌｌＱｗｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｉｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用した。
【０２７０】
［２９９．］ 結果はＦＩＧＳ． Ｔａｂ ６， ｐｐ．５−６に示すとおりである。遊離Ｄｏｘ ５ｍｇ／ｋｇで処置したＫＧ−１細胞注射マウス（群７）１０頭のうち９頭は処置開始後３週間以内に死んだ。
【０２７１】
［３００．］ ＫＧ−１細胞注射・無処置マウス（群２）の骨髄は骨髄細胞総数の平均３０％程度のＫＧ−１細胞を含んでいた。群２のマウスはすべて白血病を発現した。
【０２７２】
［３０１．］ 該して、骨髄中のＫＧ−１細胞が平均３０％（ＦＡＣＳ解析で測定）になるとほぼすべてのマウスが白血病を発現した。一般に移植ＫＧ−１細胞は骨髄中に限定されたが、１０％未満のＫＧ−１細胞が血液中で検出された。１例では腹膜壁に充実性腫瘍が観察された。
【０２７３】
［３０２．］ ＫＧ−１細胞注射・遊離Ｄｏｘ ０．１ｍｇ／ｋｇ処置マウス（群６）は群２に比して骨髄中ＫＧ−１細胞率が統計的に有意に（ｐ＜０．０５）低かった。
【０２７４】
［３０３．］ ＫＧ−１細胞注射・ＣＯＮＹ１−Ｄｏｘコンジュゲート処置マウス（群５）は群２に比して骨髄中ＫＧ−１細胞率が低かった（１６．３％対３０．４％）。しかし、この差は統計的に有意とは認められなかった。実験中にＣＯＮＹ１−Ｄｏｘがリポ多糖（ＬＰＳ）で汚染されていたことが判明したためである。従って最適濃度のＣＯＮＹ１−Ｄｏｘの使用が不可能となったので、実験終了前にこの処置を中止した。
【０２７５】
［３０４．］ ＣＯＮＹ１又は１８１−ｓｃＦｖとｉｎ ｖｉｔｒｏでプレインキュベートしたＫＧ−１細胞を注射したマウス（それぞれ群３及び４）は骨髄中ＫＧ−１細胞率が有意に低かった。
【０２７６】
［３０５．］ ＰＢＳだけを注射したマウス（陰性対照）とＫＧ−１細胞を注射しＭｙｌｏｔａｒｇで処置したマウス（群９）はどちらも骨髄中にＫＧ−１細胞が検出されなかった。これらの結果はこのｉｎ ｖｉｖｏモデルが有用なＡＭＬモデルであることを証明している。
【０２７７】
［３０６．］ 種々のマウス群の血流中の全ＫＧ−１細胞率は総じてきわめて低く、また群内の差異が大きかった。なお、Ｍｙｌｏｔａｒｇで処置した１頭のマウスは骨髄中ではなく血中で比較的高いＫＧ−１細胞率を示した。
【０２７８】
［３０７．］ マウスの骨髄中及び血流中での（ＫＧ−１起源）ヒト白血病細胞の同定をＦＡＣＳ解析で行ったが、これにはＹ１ ｓｃＦｖ抗体と平行して市販の抗ヒトＣＤ３４又はＣＤ４４抗体を使用した。
【０２７９】
［３０８．］ 解析１日目には、ＫＧ−１細胞だけを注射したマウス（群２）はより高い骨髄中ＫＧ−１細胞率を示し、ＣＯＮＹ１−Ｄｏｘで処置したマウス（群８）に比して著しい差が見られた。解析３日目にはこの状況が逆転し、骨髄中ＫＧ−１細胞率は群８のマウスのほうが群２のマウスよりも高くなった。これは次のような事情に起因した可能性がある： Ａ）全身状態がより悪いマウスを１日目に選択した、Ｂ）処置終了後の期間中に群８のマウスでＫＧ−１細胞が増殖した、及びＣ）各群のマウスが少なすぎて統計的に有意の結果を出せなかった。
【０２８０】
［３０９．］ 追加の実験としてシクロホスファミド処置５日後のＳＣＩＤ−ＮＯＤマウスに３×１０^４個ＭＯＬＴ−４細胞／マウスを静注した。１４日目以降に週３回、抗がん薬又はＰＢＳを静注した。６０日目に採血後、動物を犠牲にした。骨髄を抽出し、市販抗ＣＤ４４抗体を使用してＦＡＣＳ法で解析し、マウス骨髄中のＭＯＬＴ−４細胞を検出した。
【０２８１】
［３１０．］ この研究には次の７群を用いた：
１． ＭＯＬＴ−４細胞を注射しないＰＢＳ対照
２． ＰＢＳで処置したＫＧ−１対照
３． ＣＯＮＹ１ ｓｃＦｖ ７５μｇ／マウスで処置したＫＧ−１群
４． ＣＯＮＹ１ ｓｃＦｖ−Ｄｏｘ ７５μｇ／マウスで処置したＫＧ−１群
５． Ｄｏｘ ０．１ｍｇ／ｋｇで処置したＫＧ−１群
６． Ｄｏｘ ３ｍｇ／ｋｇで週１回処置したＫＧ−１群
７． Ｍｙｌｏｔａｒｇ ７μｇ／マウスで週１回処置したＫＧ−１群（Ｍｙｌｏｔａｒｇは化学療法薬に結合した抗体であり、白血病治療用としてＦＤＡの承認を受けている）。
【０２８２】
［３１１．］ 研究結果を図３８に示す。図に示すように、ＫＧ−１細胞を移植したマウスは骨髄中腫瘍細胞率が高い。ＣＯＮＹ１ ｓｃＦｖ単体では悪性腫瘍の発現に対して効果がなかった。Ｍｙｌｏｔａｒｇは骨髄中腫瘍細胞の増加を阻害した。Ｄｏｘは単体でもＣＯＮＹ１ ｓｃＦｖ−Ｄｏｘコンジュゲートの形でも骨髄中腫瘍細胞数の５０％減少を招いた。
【０２８３】
免疫抑制マウスにおける ＣＯＮＹ１ の薬物動態
［３１２．］ ＣＯＮＹ１ ｓｃＦｖを^１２５Ｉ−Ｂｏｌｔｏｎ Ｈｕｎｔｅｒ試薬（対リシン）で標識した。^１２５Ｉ−Ｂｏｌｔｏｎ Ｈｕｎｔｅｒ試薬と４℃、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）中で標識させた^１２５Ｉ−ＣＯＮＹ１をＰＤ−１０クロマトグラフィーカラムで精製した。この放射性タンパク質を次に無標識ＣＯＮＹ１と混合して生理食塩水中に２．５×１０^６ ＣＰＭ／ｍｌを含むＣＯＮＹ１濃度７５μｇ／ｍｌの溶液とする。
【０２８４】
［３１３．］ 雄のＢａｌｂ−Ｃマウスを０．９％ ＮａＩ ０．５ｍｌ／マウスの腹腔内注射で前処置した。２時間後、マウスに標識ＣＯＮＹ１溶液０．２ｍｌを静脈内注射した。これにより^１２５Ｉ−ＣＯＮＹ１の投与量は結果的に１５μｇ （２．５×１０^５ ＣＰＭ）／マウスとなった。
【０２８５】
［３１４．］ 注射後、様々な時点でＥＤＴＡ採血してからマウスを犠牲にし、組織を摘出した。試料及び器官は注射の５、１５及び３０分後と１、２、４、８及び２４時間後に採取、摘出した。時点あたり２〜４頭のマウスを使用した。血漿を分離し、ガンマ線放射能を測定するか又はトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で沈殿させるかした。遠心後、ＴＣＡ沈殿のガンマ線放射能を測定した。肝臓、肺、腎臓、脾臓及び骨髄試料を計量し、ガンマ放射能を測定した。血漿ＴＣＡ沈殿の放射能と時間の関係をグラフにし、２コンパートメント薬物動態モデルをあてはめた。器官／組織の全放射能及び非放射能の値を計算した。その結果を図３９〜４１に示す。
【０２８６】
［３１５．］ 血液と血漿の放射能値を比較すると、ＣＯＮＹ１はほぼ全量が血漿中に存在し、赤血球には接着しないことがわかった。血漿の放射能値はＴＣＡ沈殿の放射能値とほぼ同じであったが、これは両者が非分解タンパク質に関連していることを示唆する。図３９は投与後の血漿中ＣＯＮＹ１レベルを時系列に示している。その値を２コンパートメント・モデルへと統計的にあてはめると、得られた血液クリアランス半減期の値はそれぞれ３５分、１９０分であった。
【０２８７】
［３１６．］ 投与後の所定時点の多様な組織における放射能分布を比放射能及び全放射能として、それぞれ図４０及び４１に示す。ほとんどの組織では、血液との比放射能比較から明らかなように、放射能の特異的蓄積は見られなかった。やや高い値が４時間後の腎臓と４及び８時間後の骨髄で見られたが、これはおそらく分解産物の排出に関連するものであろう。
【０２８８】
［３１７．］ 諸結果は、マウスではＣＯＮＹ１が３５分の半減期で排出されることを示唆している。第２コンパートメントの排出速度は重要性が小さいし、また注射物質の何らかのポリマー体の存在に起因する可能性がある。体組織へのＣＯＮＹ１の大きな特異的取込みはなく、例外として骨髄中での若干の上昇が見られる。
【０２８９】
抗体及び断片の産生
［３１８．］ 抗体、その断片、それらの構成体、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質及びそれらの断片及び構成体は原核又は真核発現系で産生させることができる。原核及び真核発現系で抗体や断片を産生させる方法は技術上周知である。
【０２９０】
［３１９．］ 真核細胞系は本発明の定義及び以下の説明では、遺伝子工学的方法により真核宿主細胞中でペプチド又はポリペプチドを産生させるための発現系をいう。真核発現系は哺乳動物系でもよいが、哺乳動物系で発現させたペプチド又はポリペプチドは精製後、哺乳動物の汚染物質を実質的に含まないのが好ましい。他の有用な真核発現系の例は酵母発現系などである。
【０２９１】
［３２０．］ 本発明のペプチド又はポリペプチドを産生させる好ましい原核発現系は発現ベクター用宿主としてＥ． ｃｏｌｉを使用する。Ｅ． ｃｏｌｉ系で産生されるペプチド又はポリペプチドは精製後、Ｅ． ｃｏｌｉの汚染タンパク質を実質的に含まない。原核発現系の使用は、本発明で提供されるいくつかの、又はすべての配列のＮ末端側にメチオニン残基の付加を伴う場合がある。ペプチド又はポリペプチド産生後のＮ末端側メチオニン残基の解離によるペプチド又はポリペプチドの完全な発現は技術上周知の要領で、たとえば好適条件下でのＡｅｒｏｍｏｎａｓ ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅの使用により実現することができる。
【０２９２】
抗体、断片及び構成体の種類
［３２１．］ 本発明は抗体又はその抗原結合性断片、その構成体、又は断片の構成体を提供する。本発明の抗体の例はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭなどである。ＩｇＧクラスはＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３及びＩｇＧ_４などのサブクラスに分かれる。
【０２９３】
［３２２．］ 本発明の抗体断片の例はＦｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ_２及びＦｄフラグメントなどである。もっと小さな断片たとえばＦｖフラグメント類の断片もまた、それらが元の抗体又はフラグメントの結合特性を保持している限り、本発明の「断片」に属する。そうした断片の例は、（１） Ｆｖ重鎖だけの断片を含むミニボディー、（２）抗体重鎖可変領域の小さな部分単位を含むマイクロボディー （ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＩＬ９９／ ００５８１）、（３）軽鎖断片を含む類似体、及び（４）軽鎖可変領域の機能的単位を含む類似体である。構成体の例はダイアボディー、トラアボディー及びテトラボディーなどの多量体である。用語「抗体、その結合性断片、又は抗体又はその結合性断片を含む複合体」及び「抗体又は断片」は、特に断らない限り又は文脈や技術的な知見に照らして不適切でない限り、これらすべての分子だけでなく、その誘導体や同族体、模倣体、変異体をも包含する。
【０２９４】
［３２３．］ 所望の結合能をもつ抗体、断片又は構成体がひとたび選択及び／又は作製されてしまえば、当業者は本明細書を手引きにして原抗体の特性を保持した構成体や断片を作製することができる。たとえば、当初に選択又は作製された抗体、断片又は構成体の所望特性を保持するような完全な抗体分子、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ_２フラグメント、二量体、三量体又は他の構成体などを作製することができる。
【０２９５】
［３２４．］ 抗体又は断片の特性を保持しながらもアミノ酸を置換するのが望ましいのであれば、保存的アミノ酸置換という周知の技術がある。抗体又は断片には、その結合特性を変えずに治療薬又は診断薬への結合といった改変を加えてもよい。抗体又は断片には、その特異性を変えずに他の改変たとえば抗体又は断片の安定化を目的とした改変を加えてもよい。たとえばペプチド修飾、セミペプチド修飾、環状ペプチド修飾、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合修飾、骨格修飾及び残基修飾などである。また当業者は本明細書を手引きにすれば、改変抗体又は断片の結合特性が変質したかどうかを試験して評価することができる。
【０２９６】
［３２５．］ 同様に、当業者は本明細書を手引きにすれば、抗体、断片又は構成体の結合特性を変えて、より望ましい特性を備えた分子を得ることもできる。たとえば望ましい特性をもつある抗体がひとたび同定されたら、ランダム又は特異的突然変異誘発法により該抗体の変異体を生成し、そこからさらに望ましい性質をもつ変異体をスクリーニングすることができる。
【０２９７】
［３２６．］ 本発明の抗体及び断片はまた、その調製や識別及び診断に役立つタグを挿入又は付加した分子でもよい。該タグは後で分子から除去することができる。有用なタグの例はＡＵ１、ＡＵ５、ＢＴａｇ、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＡ、Ｈｉｓ６、ＨＳＶ、ＨＴＴＰＨＨ、ＩＲＳ、ＫＴ３、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ、Ｓ−Ｔａｇ（登録商標）、Ｔ７、Ｖ５及びＶＳＶ−Ｇなどである［Ｊａｒｖｉｋ ａｎｄ Ｔｅｌｍｅｒ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎ．， ３２， ６０１−６１８ （１９９８）］。タグはｃ−ｍｙｃであるのが好ましい。
【０２９８】
多量体型の抗体
［３２７．］ 本発明はｓｃＦｖ分子を含むＹ１又はＹ１７ペプチド又はポリペプチドを提供する。ｓｃＦｖはここでは、ヒト抗体の重鎖可変領域とヒト抗体の軽鎖可変領域とからなる分子であって、重鎖可変領域が軽鎖可変領域と連結、結合、融合又は共有結合もしくは会合している分子をいうが、両ヒト抗体は同じでも異なっていてもよい。
【０２９９】
［３２８．］ Ｙ１及びＹ１７ ｓｃＦｖ構成体は、Ｙ１及びＹ１７抗体の１つ又は複数の超可変領域をもつｓｃＦｖ分子の多量体（二量体、三量体、四量体など）でもよい。ｓｃＦｖ由来の構成体及び断片はすべて増進結合特性を維持することにより、他細胞に優先してターゲット細胞に選択的及び／又は特異的に結合する。この結合選択性及び／又は特異性は主に超可変領域によって決まる。
【０３００】
［３２９．］ 軽鎖及び重鎖の可変領域内の超可変ループは相補性決定領域（ＣＤＲ）という。軽鎖と重鎖には各々ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域がある。これらの領域のうち最も可変的なのは重鎖のＣＤＲ３領域である。このＣＤＲ３領域はＩｇ分子中の最も露出された領域であると考えらており、また本明細書で規定するように、、観測された選択的及び／又は特異的結合特性に主に寄与する部位である。
【０３０１】
［３３０．］ 本発明のＹ１及びＹ１７ペプチド又はポリペプチドは多価型Ｆｖへと折りたたまれるように構築することができる。Ｙ１及びＹ１７多量体型を構築した目的は、結合アフィニティー及び特異性の改善と血中半減期の延長である。
【０３０２】
［３３１．］ 多価型ｓｃＦｖはすでにほかでも作製されている。まず２つのｓｃＦｖをリンカーで連結するというアプローチがある。別のアプローチでは２つのｓｃＦｖをジスルフィド結合で連結する。二量体又は三量体型のＦｖを作製する最も単純なアプローチはＨｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， ９０， ６４４４−６４４８ （１９９３）及びＡ． Ｋｏｒｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．， １０， ４２３−４３３ （１９９７）が報告している。そうした方法の１つは、ｓｃＦｖのＣ末端にＦＯＳ及びＪＵＮタンパク質領域を付加して両者の間にロイシンジッパーを形成することによりｓｃＦｖ二量体を作製するというものである。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ＳＡ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９２ Ｍａｒ １， １４８（５）：１５４７−５３； Ｄｅ Ｋｒｕｉｆ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９６ Ｍａｒ ２９， ２７１ （１３）：７６３０−４． 別の方法は、ｓｃＦｖのＣ末端にストレプトアビジン・コード配列を付加して四量体を作製するというものである。ストレプトアビジンは４つのサブユニットからなるため、ｓｃＦｖ−ストレプトアビジンが折りたたまれるとき４つのサブユニットはそれに順応して変化し四量体を形成する。Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ＳＭ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ， １９９５， ６（３）：９３−１０１． さらに別の方法では、二量体、三量体及び四量体の作製を目的に着目のタンパク質に遊離システインを導入する。着目のタンパク質を遊離システインへと結合させるには可変数（２〜４）のマレイミド基をもつペプチド系架橋試薬が使用された。Ｃｏｃｈｒａｎ ＪＲ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ２０００ Ｍａｒ， １２（３）：２４１−５０．
【０３０３】
［３３２．］ 本発明のシステムでは、抗体Ｆｖ領域の一価型への折りたたみが可能なｓｃＦｖを提示するようにファージライブラリー（前述）を設計した。さらに、またやはり前述のように、該構成体は細菌での発現に好適である。この遺伝子組換えによるｓｃＦｖは、連続１５アミノ酸のフレキシブルペプチドスペーサーによって連結された重鎖と軽鎖の可変領域を含む。好ましいスペーサーは（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３である。このスペーサーの長さはアミノ酸構成とも相俟って非かさ高スペーサーをもたらすことになるが、それはＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域がターゲットへの効果的な結合を実現する機能的Ｆｖドメインへと折りたたまることを可能にする。
【０３０４】
［３３３．］ 本発明は任意の公知技術の方法によって形成されるＹ１及びＹ１７多量体に関連する。好ましい多量体（特に二量体）形成方法ではシステイン残基を使用して２単量体間にジスルフィド結合を形成させる。この実施態様では、二量体を形成しやすくするためにｓｃＦｖのカルボキシル基末端にシステインを付加して二量体を形成する（Ｙ１−ｃｙｓ ｓｃＦｖ又はＹ１二量体という）。ＤＮＡコンストラクトの作製（Ｅｘａｍｐｌｅ ２Ｄ及び６Ｄを参照）とトランスフェクションへの使用により、Ｙ１二量体を生産ベクター中で発現させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質を再生するようにした。このタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ及びＦＡＣＳで解析した。しかし、二量体が形成されたことを示す結果はいずれでも得られなかった。そこで、同じ手順を繰返したが、今度は２リットルの回分発酵による抗体産生を試みた。Ｙ１−ｃｙｓをＥ． ｃｏｌｉ中で発現させた後、アルギニン中で再生した。再生したタンパク質をＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅとゲルろ過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ７５）で透析、精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ （非還元）とゲルろ過により２つのピークが検出された。２つのピークを別々に回収し、ＦＡＣＳで解析した。単量体と二量体のＪｕｒｋａｔ細胞への結合をＦＡＣＳで調べた。二量体による結合は同レベルの染色に１／１００の量の単量体型抗体を必要としただけであり、これは二量体のほうが高アビディティーであることを示唆した。二量体の再生条件を決定し、また後続の透析、クロマトグラフィー及びゲルろ過ステップを経て二量体含有量（ｍｇ単位の量）が９０％超の物質を得た。この精製二量体をゲルろ過と酸化条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。二量体の結合能を放射受容体測定、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ解析で確認した。
【０３０５】
［３３４．］ ｓｃＦｖ単量体（別名ＣＯＮＹ１）とＹ１二量体の結合を比較するために、ＫＧ−１細胞上でｉｎ ｖｉｔｒｏ結合競合実験を行った。また、この実験では全Ｙ１ ＩｇＧとｓｃＦｖ Ｙ１の結合も比較した。この研究ではＹ１ ＩｇＧをビオチンで標識した。この研究によりＹ１ ＩｇＧはＹ１ ＩｇＧ−ビオチンと競合することが判明した。非関連ヒトＩｇＧは標識Ｙ１ ＩｇＧと競合しなかった。Ｙ１ ｓｃＦｖ （５μｇ及び１０μｇ）はＹ１ ＩｇＧ−ビオチン（５０ｎｇ）と部分的に競合した。この研究では、無血清では１ｎｇのＹ１ ＩｇＧ−ＦＩＴＣがＫＧ−１細胞に１μｇのＹ１ ｓｃＦｖ−ＦＩＴＣと同程度に結合するが、血清の存在下ではこの結合がほぼ阻止されることも判明した。また、放射受容体測定、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ解析からＹ１二量体の結合はＹ１ ｓｃＦｖ単量体の結合より２０倍以上も強いと判明した。
【０３０６】
［３３５．］ さらに別の実施態様では、カルボキシル基末端にシステインとは別にリシン−アラニン−リシンを付加した（これはＹ１−ｃｙｓ−ｋａｋ ｓｃＦｖと呼ぶ）。このｓｃＦｖ構成体のアミノ酸配列は次のとおりである（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２）。
【０３０７】
６１ ＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴ ＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬ ＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥ ＤＴＡＶＹＹＣＡＲＭＲＡＰＶＩＷＧＱＧＴ ＬＶＴＶＳＲＧＧＧＧ １２０１２１ ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ ＳＳＥＬＴＱＤＰＡＶ ＳＶＡＬＧＱＴＶＲＩ ＴＣＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳＷＹＱＱＫＰＧ ＱＡＰＶＬＶＴＹＧＫ １８０１８１ ＮＮＲＰＳＧＩＰＤＲ ＦＳＧＳＳＳＧＮＴＡ ＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥ ＤＥＡＤＹＹＣＮＳＲＤＳＳＧＮＨＶＶＦＧ ＧＧＴＫＬＴＶＬＧＧ ２４０２４１ ＧＧＣＫＡＫ
【０３０８】
［３３６．］ Ｙ１−ｃｙｓ−ｋａｋは細菌中λ−ｐＬベクターで産生させた。λ−ｐＬベクターでの発現は温度を４２℃に高めて誘発した。発現誘発培養液から封入体を回収し、水溶液により半精製して不要の可溶性タンパク質を除去した。封入体をグアニジンで可溶化し、ＤＴＥで還元し、アルギニン／ｏｘ−グルタチオン系の溶液でｉｎ ｖｉｔｒｏ再生した。再生したタンパク質はＴＦＦ（クロスフローろ過）法で尿素／燐酸緩衝液を含む緩衝液に透析、濃縮した。このタンパク質をＳＰカラムでイオン交換クロマトグラフィーにより再精製、濃縮した。
【０３０９】
［３３７．］ 二量体はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、ゲルろ過クロマトグラフィー、ＥＬＩＳＡ、放射受容体測定、及びＦＡＣＳで解析した。二量体の見掛けアフィニティーはアビディティー効果のため単量体よりも高かった。この効果はグリコカリシンへのＥＬＩＳＡ、ＫＧ−１細胞へのＦＡＣＳ、及び放射受容体測定における競合により確認された。
【０３１０】
［３３８．］ 再生及びＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ゲルろ過カラムによる精製後の二量体をＨＰＬＣにより解析した。図４２ではＹ１−ｃｙｓ−ｋａｋ（二量体）は左側の第１ピーク（〜１０．８分）であり、その後続ピーク（〜１２分）は単量体である。同カラムに使用したタンパク質サイズマーカーによれば、二量体は約５２ｋＤａであり単量体は２６ｋＤａである。二量体と単量体の間の均衡は再生条件（再生緩衝液の酸化剤濃度とタンパク質濃度）を変えることにより変化させることができる。二量体と単量体はＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラムで分離した。
【０３１１】
［３３９．］ 図４３は二量体と単量体が混在したゲルを示す。還元型では２単量体間の結合が還元されるため単量体が見られ、また非還元型では（ゲルろ過実験の場合と同様に）が約３０ｋＤａの単量体画分と約６０ｋＤａの二量体画分の混在が見られる。
【０３１２】
［３４０．］ 血小板由来の抗原ＧＰＩｂ（グリコカリシン）への二量体（Ｙ１ ｓｃＦｖ、別名Ｙ１−ｋａｋ）と二量体Ｙ１−ｃｙｓ−ｋａｋ （システイン二量体）の結合の違いをＥＬＩＳＡ法で確認した。ＧＰＩｂへの結合の検出にはポリクローナル抗単鎖抗体及び／又は新規ポリクローナル抗Ｖ_Ｌ（ウサギ由来）及び抗ウサギＨＲＰを使用した。二量体は単量体よりも結合活性が約１００倍高かった。たとえば０．８ ＯＤの実現に使用された単量体は１２．８μｇ／ｍｌであるのに対し、二量体は０．１μｇ／ｍｌにすぎない。図１９を参照。
【０３１３】
［３４１．］ さらにＫＧ−１細胞への結合に関するＦＡＣＳ解析から、２段階又は３段階の結合検定では二量体のほうが単量体より高感度であると判明した。ＦＩＴＣで直接標識した二量体は単量体よりもやや有利であった（使用量が１０分の１）。二量体を競合物質として使用したＫＧ−１細胞への放射受容体測定では、二量体のほうが単量体よりも３０倍も効率的であると判明した。
【０３１４】
［３４２．］ スペーサーの長さを加減するのも二量体、三量体及び四量体（当業界ではそれぞれダイアボディー、トライアボディー、テトラボディーともいう）を形成する好ましい方法である。二量体は、同じｓｃＦｖの２本の可変鎖を連結するスペーサーを一般に５〜１２アミノ酸残基に短縮するような条件下で形成する。この短縮スペーサーは同じ分子に由来する２本の可変鎖が１つの機能的Ｆｖドメインへと折りたたまれるのを防ぐ。代わりに両ドメインはそれぞれもう１つの分子の相補ドメインとペアを組んで２つの結合ドメインを形成する。好ましい方法では、わずか５アミノ酸残基のスペーサー（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）をダイアボディーの構築に使用した。この二量体は２個の同種ｓｃＦｖから、又は２個の異種ｓｃＦｖから、形成することができ、また親ｓｃＦｖの増進型の選択的及び／又は特異的結合活性を維持したり、さらに高い結合力又はアフィニティーを示したりすることができる。
【０３１５】
［３４３．］ 同様にトライアボディーは、同じｓｃＦｖの２本の可変鎖を連結するスペーサーを一般に５未満のアミノ酸残基に短縮するような条件下で形成される。これにより同じ分子に由来する２本の可変鎖が１つの機能的Ｆｖドメインへと折りたたまれるのを防ぐ。代わりに３個のｓｃＦｖ分子が会合して三量体を形成する。好ましい方法では、このフレキシブルスペーサーを完全になくすことによりトラアボディーが得られた。トライアボディーは３個の同種ｓｃＦｖから、又は２〜３種のｓｃＦｖから形成することができ、また親ｓｃＦｖの増進型の選択的及び／又は特異的結合活性を維持したり、さらに高い結合力又はアフィニティーを示したりすることができる。
【０３１６】
［３４４．］ テトラボディーもまた、同じｓｃＦｖの２本の可変鎖を連結するスペーサーを一般に５未満のアミノ酸残基に短縮するような条件下で形成される。これにより同じ分子に由来する２本の可変鎖が１つの機能的Ｆｖドメインへと折りたたまれるのを防ぐ。代わりに４個のｓｃＦｖ分子が会合して四量体を形成する。テトラボディーは４個の同種ｓｃＦｖから、又は１〜４個の異種ｓｃＦｖから形成することができ、また親ｓｃＦｖの増進型の選択的及び／又は特異的結合活性を維持したり、さらに高い結合力又はアフィニティーを示したりすることができる。
【０３１７】
［３４５．］ スペーサーの長さを一般に５未満のアミノ酸残基とする条件下でトラアボディー又はテトラボディーが形成されるかどうかは混合液中の特定ｓｃＦｖのアミノ酸配列と反応条件とに依存する。
【０３１８】
［３４６．］ 好ましい方法では、ビオチン／ストレプトアビジン会合を利用して四量体を形成する。酵素的にビオチン標識することができる新規の発酵構成体（ここではＹ１−Ｂｉｏｔａｇ又はＹ１−Ｂと呼ぶ）を創製した。ＢｉｒＡ酵素の基質に当る配列をＹ１のＣ末端に付加した。ＢｉｒＡ酵素は該配列内のリシン残基にビオチンを付加する。このＹ１−ＢｉｏｔａｇをＥ． ｃｏｌｉ中で発現させた。封入体のタンパク質を単離し、再生した。折りたたまれた状態のこのタンパク質は純度が９５％超であり、１リットルの培養液（小規模、非至適条件）から１００ ｍｇ余りが得られた。その分子質量はｓｃＦｖとほぼ同じであることがＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＭＳから判明した。Ｙ１−Ｂｉｏｔａｇは最も安定したＦＡＣＳ解析用試薬であると判明した。しかし、ＫＧ−１細胞へのＹ１−Ｂｉｏｔａｇの結合を血清の存在下で調べるときの所要量は血清不存在下での同等の結合に比して多くなる（約１０倍）。それにもかかわらず、この構成体は特異的ビオチニル化の利点、すなわち分子の結合部位が原型のまま残されるという利点をもたらす。また、各分子はビオチン１個だけで標識され、各分子がＣ末端で１個のビオチンを受け取るにすぎない。
【０３１９】
［３４７．］ 所望位置に分子あたり１個のビオチンという限定標識法はストレプトアビジンとの併用による四量体の生産を可能にした。この四量体はＹ１−Ｂをストレプトアビジン−ＰＥとインキュベートして形成した。
【０３２０】
［３４８．］ ＦＡＣＳ解析によれば、Ｙ１−Ｂとストレプトアビジン−ＰＥによって作製される四量体はＹ１ ｓｃＦｖ単量体と比べて１００〜１０００倍も高感度であった。Ｙ１−Ｂ／ストレプトアビジン−ＰＥ四量体はＹ１−反応性細胞株の１つ（ＫＧ−１）に特異的に結合する模様である。この反応のバックグラウンド結合との差異はきわめて大きいため、少量の受容体を高感度で検出することができた。Ｙ１ＢＳＡＶ四量体を使用した正常全血のＦＡＣＳ評価によれば、高反応性の化学種は存在しなかった。単球と顆粒球はわずかに陽性であったが、結果が陽性と出た細胞株たとえばＫＧ−１細胞では該四量体の反応性はその１００倍以上であった。
【０３２１】
［３４９．］ 次に、四量体を細胞試料とインキュベートした。Ｙ１四量体は低用量（５ｎｇ）で細胞株（ＫＧ−１）によく結合し、その応答は以前に他の抗体型で観測された応答より１０〜２０倍も高かった。
【０３２２】
診断治療用のコンジュゲート
［３５０．］ 本発明の抗体及びその断片は多様な薬剤たとえば薬物、毒素及び放射性同位体へと、随意に製薬用担体と共に、会合、結合、融合又は連結させて疾病予防及び／又は抗がん活性を有する薬剤−ペプチド組成物、融合体又はコンジュゲートを形成することができる。そうしたコンジュゲート及び融合体はまた診断目的に使用してもよい。
【０３２３】
［３５１．］ 本発明に有用な担体の例はデキストラン、ＨＰＭＡ（親油性ポリマー）又は他の任意のポリマーなどである。あるいは修飾リポソームたとえばｓｃＦｖ Ｙ１分子で修飾したリポソーム（例： 多量のドキソルビシンを含有する市販リポソームＤｏｘｉｌ）などを使用することもできる。その種のリポソームは１つ又は複数の薬剤を含有するように調製し、高薬剤／抗体比となるように本発明の抗体と混和することができる。
【０３２４】
［３５２．］ あるいは、抗体又はその断片と薬剤との結合は直接結合でもよい。２以上の隣接分子の直接結合は分子中の要素又は要素群の間の化学結合を介して実現してもよい。化学結合はたとえばイオン結合、共有結合、疎水結合、親水結合、静電結合又は水素結合でもよい。それらの結合はたとえばアミン結合、カルボキシル結合、アミド結合、ヒドロキシル結合、ペプチド結合及び／又はジスルフィド結合でもよい。直接結合はプロテアーゼ抵抗性結合であるのが好ましい。
【０３２５】
［３５３．］ ペプチドと薬剤との、又はペプチドと担体との、又は担体と薬剤との結合はリンカー化合物を介した結合でもよい。リンカー化合物は、本明細書及び特許請求の範囲では、２以上の部分を結合する化合物をいう。リンカーは直鎖型でも分枝型でよい。分岐型リンカー化合物は二分枝、三分枝、又は四分枝以上の化合物からなってもよい。本発明に有用なリンカー化合物は、たとえばジカルボン酸、マレイミドヒドラジド、ＰＤＰＨ、カルボン酸ヒドラジド及び小ペプチドを含む群より選択される。
【０３２６】
［３５４．］ 本発明の有用リンカーのもっと具体的な例は次のとおりである：
ａ． ジカルボン酸たとえばコハク酸、グルタル酸及びアジピン酸など；
ｂ． マレイミドヒドラジドたとえばＮ−［ −マレイミドカプロン酸］ヒドラジド、４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジド、及びＮ−［ −マレイミドウンデカン酸］ヒドラジドなど；
ｃ． ＰＤＰＨリンカーたとえばスルフヒドリル反応性タンパク質と結合した（３−［２−ピリジルジチオ］プロピオニルヒドラジド）； 及び
ｄ． 炭素原子数２〜５のカルボン酸ヒドラジド。
【０３２７】
［３５５．］ 小ペプチドを使用したダイレクトカップリングによる結合もまた有用である。たとえば、抗がん薬ドキソルビシンなどの遊離糖とｓｃＦｖとのダイレクトカップリングは小ペプチドを使用して実現してもよい。小ペプチドの例はＡＵ１、ＡＵ５、ＢＴａｇ、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＡ、Ｈｉｓ６、ＨＳＶ、ＨＴＴＰＨＨ、ＩＲＳ、ＫＴ３、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ、Ｓ−Ｔａｇ（登録商標）、Ｔ７、Ｖ５及びＶＳＶ−Ｇなどである。
【０３２８】
［３５６．］ 本発明の抗体及びその断片は造影剤（指示マーカーともいう）たとえば放射性同位体と結合、抱合、複合し、又は他の形で結び付けてコンジュゲートとし、それを診断及び画像解析目的に使用してもよい。そうした放射性同位体−抗体（又は抗体断片）コンジュゲートを含むキットが提供される。
【０３２９】
［３５７．］ 診断に有用な放射性同位体の例は^１１１インジウム、^１１３インジウム、^９９ｍレニウム、^１０５レニウム、^１０１レニウム、^９９ｍテクネチウム、^１２１ｍテルル、^１２２ｍテルル、^１２５ｍテルル、^１６５ツリウム、^１６７ツリウム、^１６８ツリウム、^１２３ヨウ素、^１２６ヨウ素、^１３１ヨウ素、^１３３ヨウ素、^８１ｍクリプトン、^３３キセノン、^９０イットリウム、^２１３ビスマス、^７７臭素、^１８フッ素、^９５ルテニウム、^９７ルテニウム、^１０３ルテニウム、^１０５ルテニウム、^１０７水銀、^２０３水銀、^６７ガリウム及び^６８ガリウムなどである。好ましいはのは、Ｘ線又は常磁性イオンを通さない放射性同位体である。
【０３３０】
［３５８．］ 指示マーカー分子は蛍光マーカー分子でもよい。蛍光マーカー分子の例はフルオレセイン、フィコエリトリン又はローダミンもしくはそれらの修飾体又はコンジュゲートなどである。
【０３３１】
［３５９．］ 指示マーカーに結合した抗体又は断片は病態の診断又はモニタリングに使用してもよい。そうしたモニタリングはｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏいずれで行ってもよい。モニタリング又は診断をｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで行う場合には、造影剤は患者に許容限度を超える害を及ぼさないという意味で生理的に許容しうるものが好ましい。許容レベルの害は、臨床医が病気の重篤度や代替品の利用可能性といった基準を用いて決定することになろう。
【０３３２】
［３６０．］ 本発明は治療前・中・後のｉｎ ｖｉｔｒｏ治療有効性解析用の診断キットであって、指示マーカー（又は造影剤）に結合した本発明のペプチドを含む造影剤などからなる診断キットを提供する。本発明はさらに、がん特に腫瘍の診断的定位及び画像解析に造影剤を使用する方法であって、
ａ） 細胞を造影剤と接触させるステップ
ｂ） 細胞に結合した放射能を計測するステップ、及び
ｃ） 腫瘍を視覚化するステップ
を含む方法を提供する。
【０３３３】
［３６１．］ 好適な造影剤の例はＦＩＴＣ、ＰＥなどの蛍光色素、及びグリーン蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質である。他の例は、基質と反応して識別可能な変化たとえば色の変化を引き起こす放射性分子及び酵素などである。
【０３３４】
［３６２．］ 一例では、キットの造影剤はＦＩＴＣなどの蛍光色素であり、キットはがん特に血液関連のがんたとえば白血病、リンパ腫及び骨髄腫の治療有効性の解析に供する。疾患の各段階たとえば診断時、治療時、寛解期及び再発期に造影剤で染色された細胞の百分率及び染色強度の決定にはＦＡＣＳ解析を用いる。
【０３３５】
［３６３．］ 本発明の抗体及びその断片は抗がん薬、抗白血病薬、抗ウイルス薬、抗転移薬、抗炎症薬、抗血栓薬、抗再狭窄薬、抗凝集薬、抗自己免疫薬、抗接着薬、抗心臓血管病薬、又は他の抗疾病薬又は薬剤と結合し、複合し又は他の形で結び付けてもよい。薬剤は、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、イヌ、ネコ又は他の任意の温血動物を非限定的に含む哺乳動物の疾患予防、治療又は診断に有用な物質をいう。
【０３３６】
［３６４．］ そうした薬剤の非限定的な例は抗ウイルス薬たとえばアシクロビル、ガンシクロビル及びジドブジン； 抗血栓／再狭窄薬たとえばシロスタゾール、ダルテパリンナトリウム、レビパリンナトリウム及びアスピリン； 抗炎症薬たとえばザルトプロフェン、プラノプロフェン、ドロキシカム、ａｃｅｔｙｌ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ １７、ジクロフェナク、イブプロフェン、デキシブプロフェン、スリンダク、ナプロキセン、アムトルメチン、セレコキシブ、インドメタシン、ロフェコキシブ及びニメスリド； 抗自己免疫薬たとえばレフルノマイド、デニロイキンジフチトクス（ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ ｄｉｆｔｉｔｏｘ）、スブロイム（ｓｕｂｒｅｕｍ）、ＷｉｎＲｈｏ ＳＤＦ、デフィブロチド及びシクロホスファミド； 及び抗接着／抗凝集薬たとえばリマプロスト、クロルクロメン及びヒアルロン酸などである。
【０３３７】
［３６５．］ 他の薬剤例はドキソルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビシン（モルホリノドキソルビシン）、アドリアマイシン、シスプラチン、タキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンα、ヒドロキシウレア、テモゾロマイド、サリドマイド及びブレオマイシン、並びにその誘導体及び組合せなどである。
【０３３８】
［３６６．］ 抗がん薬は抗がん活性を有する物質である。抗がん薬の例は、がん細胞又は未成熟前がん細胞の成長を阻害し又は停止させる物質、がん細胞又は前がん細胞を傷害する物質、がん細胞又は前がん細胞の他抗がん薬への感受性を増進する物質、及びがん細胞の転移を阻害する物質などである。本発明では、抗がん薬は腫瘍の血管新生を防止、阻害又は抑制する抗血管新生活性を有する物質でもよい。
【０３３９】
［３６７．］ がん細胞の成長の阻害はたとえば（ｉ）がん又は転移細胞の成長防止、（ｉｉ）がん又は転移細胞の成長抑制、（ｉｉｉ）がん細胞を無傷のまま生存させた状態での、その成長過程又は転移過程の完全防止、又は（ｉｖ）がん細胞の傷害を含む。
【０３４０】
［３６８．］ 抗白血病薬は抗白血病活性を有する物質である。抗白血病薬の例は、白血病細胞又は未成熟前白血病細胞の成長を阻害し又は停止させる物質、白血病細胞又は前白血病細胞を傷害する物質、白血病細胞又は前白血病細胞の他抗白血病薬への感受性を増進する物質、及び白血病細胞の転移を阻害する物質などである。本発明では、抗白血病薬は腫瘍の血管新生を防止、阻害又は抑制する抗血管新生活性を有する物質でもよい。
【０３４１】
［３６９．］ 白血病細胞の成長の阻害はたとえば（ｉ）白血病又は転移細胞の成長防止、（ｉｉ）白血病又は転移細胞の成長抑制、（ｉｉｉ）白血病細胞を無傷のまま生存させた状態での、その成長過程又は転移過程の完全防止、又は（ｉｖ）白血病細胞の傷害を含む。
【０３４２】
［３７０．］ 本発明の抗体又は断片を有用に結合してもよい抗疾病薬、抗がん薬、及び抗白血病薬の例には毒素、放射性同位体及び治療薬が含まれる。
【０３４３】
［３７１．］ 毒素の例はｇｅｌｏｎｉｎ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）、ＰＥ４０、ＰＥ３８、ジフテリア毒、リシン（ｒｉｃｉｎ）、もしくはそれらの修飾体又は誘導体などである。
【０３４４】
［３７２．］ 放射性同位体の例は、診断及び／又は治療用のγ放出体、陽電子放出核及びＸ線放出体、それに治療用のβ放出体及びα放出体などである。
【０３４５】
［３７３．］ 治療用の放射性同位体の具体例は^１１１インジウム、^１１３インジウム、^９９ｍレニウム、^１０５レニウム、^１０１レニウム、^９９ｍテクネチウム、^１２１ｍテルル、^１２２ｍテルル、^１２５ｍテルル、^１６５ツリウム、^１６７ツリウム、^１６８ツリウム、^１２３ヨウ素、^１２６ヨウ素、^１３１ヨウ素、^１３３ヨウ素、^８１ｍクリプトン、^３３キセノン、^９０イットリウム、^２１３ビスマス、^７７臭素、^１８フッ素、^９５ルテニウム、^９７ルテニウム、^１０３ルテニウム、^１０５ルテニウム、^１０７水銀、^２０３水銀、^６７ガリウム及び^６８ガリウムなどである。
【０３４６】
［３７４．］ 抗がん薬又は抗白血病薬の非限定的な例はドキソルビシン、アドリアマイシン、シスプラチン、タキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンα、ヒドロキシウレア、テモゾロマイド、サリドマイド及びブレオマイシン、並びにその誘導体及び組合せなどである。
【０３４７】
製剤組成物
［３７５．］ 本発明の抗体、構成体、コンジュゲート、及び断片はそれを必要とする患者に任意好適の方法で投与してよい。投与方法の例は静脈内、筋内、皮下、局所、髄腔内、腹腔内、リンパ管内、経鼻、舌下、経口、直腸、膣、呼吸器、口腔、皮内、経皮又は胸腔内投与などである。
【０３４８】
［３７６．］ 静脈内投与用の組成物は、約０．１ｍｇ〜約１０００ｍｇの有効量の所望組成物が患者に投与されるよう調製するのが好ましい。より好ましくは、投与量が約１ｍｇ〜約５００ｍｇの範囲の所望組成物となるようにする。本発明の組成物は広い投与量範囲にわたり有効であるが、該範囲は種々の因子たとえば治療対象疾患の詳細、ペプチド又はポリペプチド系製剤組成物の患者体内での半減期、薬剤や製剤組成物の物理化学的性質、製剤組成物の投与方法、治療又は診断対照患者の詳細、及び／又は主治医が重要と判断する他のパラメーターなどに依存する。
【０３４９】
［３７７．］ 経口投与用の製剤組成物は任意好適の剤型でよい。例は錠剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤、丸剤、カプレット剤及びカプセル剤などである。製剤方法は技術上周知であり、たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ， Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ． Ｇｅｎｎｎａｒｏ （Ｅｄ．）， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ （Ｐｕｂ．）を参照。
【０３５０】
［３７８．］ 製剤組成物は時限、持続、間欠又は連続放出を容易にするように調製してもよい。製剤組成物はまた時限、持続、間欠又は連続放出手段に収めて投与してもよい。
【０３５１】
［３７９．］ 局所投与用の製剤組成物は任意好適の剤型たとえばクリーム、軟膏、ローション、パッチ、溶液、懸濁液及びジェルなどとすることができる。
【０３５２】
［３８０．］ 本発明の抗体、構成体、コンジュゲート及び断片を含む組成物は慣用の、製薬上許容しうる希釈剤、賦形剤、担体等を含んでもよい。錠剤、丸剤、カプレット剤及びカプセル剤は慣用の賦形剤たとえばラクトース、デンプン及びステアリン酸マグネシウムなどを含んでもよい。座剤はワックスやグリセリンなどの賦形剤を含んでもよい。注射剤は発熱物質を含まない滅菌溶媒たとえば生理食塩水などを含んでよいし、緩衝剤、安定化剤又は防腐剤を含んでもよい。慣用の腸溶コーティングも使用してよい。
【０３５３】
実施例
［３８１．］ 以下の実施例は本発明の理解に資するのが目的であり、その範囲を何ら限定するものではない。具体的な試薬や反応条件を挙げてはいるが、種々の変更が可能であり、それらもまた本発明の範囲に包摂されるものとする。従って、以下の実施例は本発明のさらなる説明が目的である。
【０３５４】
実施例 １： 血小板の調製
１．１ 洗浄血小板の調製
［３８２．］ ＡＣＤ（酸性クエン酸−デキストロース）加濃縮血小板を血液センターから入手し、血小板を分離して、ＡＣＤと生理食塩水を７：１の比で含む緩衝液で１回洗浄した。血小板は各洗浄後に８００×ｇで１０分、遠心分離し、タイロード液（２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．６８ ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、０．１％グルコース、５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ及び０．３５％アルブミン、ｐＨ ７．３５）に再懸濁し、細胞数をカウントした。
【０３５５】
１．２ 多血小板血漿の調製
［３８３．］ ３．８％クエン酸ナトリウム入りチューブに採血し、２５０×ｇ、１０分の遠心で多血小板血漿を調製した。
【０３５６】
実施例 ２： 血小板凝集
［３８４．］ 血小板凝集研究では、多血小板血漿（ＰＲＰ）と洗浄血小板を全血Ｌｕｍｉａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒ （Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ， Ｈａｖｅｒｔｏｗｎ， ＰＡ）により３７℃、５００ｒｐｍでかき混ぜた。血小板懸濁液と懸濁媒の透光度の差を１００％凝集とした。血小板凝集へのＹ１の効果を、種々の濃度のＹ１をアゴニスト添加前に添加して評価し、またその効果を４分間記録した。
【０３５７】
実施例 ３： 血小板のエンドプロテアーゼ処理
３．１ モカラギンによる血小板の処理
［３８５．］ モカラギン消化では、１ｍＭ塩化カルシウム添加ＴＳ緩衝液（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ ７．４）に懸濁させた洗浄血小板１０^８個を（終濃度）１２μｇ／ｍｌのモカラギンにより２２℃で１時間処理し、ＥＤＴＡを０．０１Ｍまで加えて消化を止めた。
【０３５８】
３．２ カテプシン Ｇ によるグリコカリシンの処理
［３８６．］ １ｍＭ塩化カルシウム添加ＴＳ緩衝液に懸濁させた洗浄血小板１０^８個を（終濃度）１．８μｇ／ｍｌのカテプシンＧにより２２℃で４時間処理し、ＰＭＳＦを１ｍＭまで加えて消化を止めた。
【０３５９】
３．３ Ｏ− シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼによるグリコカリシンの処理
［３８７．］ ０．２％アルブミンとプロテアーゼインヒビター（１０μＭロイペプチン、０．２４ｍＭ ＰＭＳＦ）とを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させた血小板１０^６個をＯ−シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼ０．１４ ｍｇ／ｍｌ（終濃度）と３７℃で４５分間インキュベートし、試料緩衝液の添加と沸騰により消化を停止させた。使用した試料緩衝液は３％ ＳＤＳ、１２％グリセリン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２％ βメルカプトエタノール及び０．０３％ブロモフェノールブルーを含む。
【０３６０】
実施例 ４： エンドプロテアーゼによるグリコカリシンの切断
モカラギンによるグリコカリシンの切断
［３８８．］ モカラギン消化では、１ｍＭ塩化カルシウム添加ＴＳ緩衝液に溶かしたグリコカリシンを（終濃度）１０μｇ／ｍｌのモカラギンにより２２℃で１時間処理し、ＥＤＴＡを０．０１Ｍまで加えて消化を止めた。
【０３６１】
カテプシン Ｇ によるグリコカリシンの切断
［３８９．］ １ｍＭ塩化カルシウム添加ＴＳ緩衝液に溶かしたグリコカリシンを（終濃度）３．４μｇ／ｍｌのカテプシンＧにより２２℃で４時間処理した後、ＰＭＳＦを１ｍＭまで加えて消化を止めた。
【０３６２】
Ｏ− シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼによるグリコカリシンの切断
［３９０．］ ０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ ７．４）に溶かしたグリコカリシンをＯ−シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼ１．２ｍｇ／ｍｌ（終濃度）と３７℃で１５分間インキュベートし、（実施例３（ＹＨ）で述べた）試料緩衝液の添加と沸騰により消化を止めた。
【０３６３】
実施例 ５： フルサイズ Ｙ１ ＩｇＧ の構築
［３９１．］ 全ＩｇＧ分子はＦｖ型に比して、長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期やｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞応答たとえばＡＤＣＣ又はＣＤＣ（補体依存型細胞傷害性； Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ５， ８３−８９， １９９３）を介した細胞応答の誘発能などいくつかの利点をもつ。後述の分子クローニング手法により、Ｙ１ Ｆｖ領域をフルサイズＩｇＧ１分子に変換した。Ｙ１−ＩｇＧ１の構築は次の順序でｃＤＮＡの断片を互いにつなぎ合わせることで実現した。なおＹ１−ＩｇＧ重鎖及び軽鎖の配列は図４８のとおりである。図ではＹ１−ＨＣのヌクレオチド配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０５）、Ｙ１−ＨＣのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６）、Ｙ１−ＬＣのヌクレオチド配列のＯＲＦ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０７）及びＹ１−ＬＣのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８）を示す。
【０３６４】
［３９２．］ 哺乳動物発現系のためのリーダー配列： 全ＩｇＧ分子に要求される諸エレメントの便利な挿入を可能にするよう、互換性のある系を設計した。推定リーダー配列をコードする以下の相補二本鎖オリゴヌクレオチドを合成し、アニールし、ｐＢＪ−２哺乳動物発現ベクターの（ＳＲα５プロモーター支配下の）ＸｈｏＩ部位にライゲートした：
【０３６５】
５’−ＴＣＧＡＣＣ ＴＣＡＴＣＡ ＣＣＡＴＧＧ ＣＣＴＧＧＧ ＣＴＣＴＧＣ ＴＧＣＴＣＣ ＴＣＡ ＣＣＣ ＴＣＣＴＣＡ ＣＴＣＡＧＧ ＡＣＡＣＡＧ ＧＧＴＣＣＴ ＧＧＧＣＣＧ ＡＴ及び
【０３６６】
５’−ＧＡＴＣＧＡ ＴＴＧＣＡＣ ＣＡＧＣＴＧ ＧＡＴＡＴＣ ＧＧＣＣＣＡ ＧＧＡＣＣＣ ＴＧＴ ＧＴＣ ＣＴＧＡＧＴ ＧＡＧＧＡＧ ＧＧＴＧＡＧ ＧＡＧＣＡＧ ＣＡＧＡＧＣ ＣＣＡＧＧＣ ＣＡＴＧＧＴ ＧＡＴＧＡＧ Ｇ。
【０３６７】
開始コドンＡＴＧの上流に２つのＫｏｚａｋエレメントを導入した。またリーダー配列の推定切断部位とＸｈｏＩ部位の間に内部ＥｃｏＲＶ部位を導入して、可変領域のサブクローニングができるようにした。この改変ベクターはｐＢＪ−３と命名した。
【０３６８】
［３９３．］ Ｙ１ ｓｃＦｖ ｃＤＮＡ配列に由来するＶ_Ｌコード配列をリーダー配列と軽鎖定常領域コード配列の間に挿入した。同様に、Ｙ１ ｓｃＦｖ ｃＤＮＡ配列に由来するＶ_Ｈコード配列をリーダー配列と重鎖定常領域コード配列の間に挿入した。これは原Ｙ１をコードするベクターｐＨＥＮ−Ｙ１のＰＣＲ増幅によりＶ_Ｌ及びＶ_Ｈ領域を個別に獲得して実現した。
【０３６９】
オリゴヌクレオチド
［３９４．］ Ｖ_Ｌ ＰＣＲ反応には５’−ＴＴＴＧＡＴ ＡＴＣＣＡＧ ＣＴＧＧＴＧ ＧＡＧＴＣＴ ＧＧＧＧＧＡ （センス鎖）と５’−ＧＣＴＧＡＣ ＣＴＡＧＧＡ ＣＧＧＴＣＡ ＧＣＴＴＧＧＴ （アンチセンス鎖）を使用した。期待サイズ〜３５０ｂｐの産物ｃＤＮＡを精製し、配列解析し、ＥｃｏＲＶ及びＡｖｒＩＩ制限酵素で消化した。同じ方法により、下記のセンス鎖及びアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドを用いてＶ_Ｈ ｃＤＮＡ領域を増幅し、精製した：
【０３７０】
［３９５．］ ５’−ＧＧＧＡＴＡ ＴＣＣＡＧＣ ＴＧ（Ｃ／Ｇ）（Ａ／Ｔ）ＧＧ ＡＧＴＣＧＧ ＧＣ及び５’−ＧＧＡＣＴＣ ＧＡＧＡＣＧ ＧＴＧＡＣＣ ＡＧＧＧＴＡ ＣＣＴＴＧ。
【０３７１】
［３９６．］ 定常領域： ＩｇＧ１ ｃＤＮＡ用の定常λ３ （ＣＬ−λ３）領域と重鎖定常領域ＣＨ１−ＣＨ３を次の要領で個別に合成した：
【０３７２】
［３９７．］ 定常ＣＬ−λ３領域を得るために、正常末梢血Ｂ細胞（ＣＤ１９＋細胞）プールから抽出したｍＲＮＡとセンス鎖５’−ＣＣＧＴＣＣ ＴＡＧＧＴＣ ＡＧＣＣＣＡ ＡＧＧＣＴＧ Ｃ及びアンチセンス鎖５’−ＴＴＴＧＣＧ ＧＣＣＧＣＴ ＣＡＴＧＡＡ ＣＡＴＴＣＴ ＧＴＡＧＧＧ ＧＣＣＡＣＴ ＧＴオリゴヌクレオチドを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。期待サイズ〜４００ｂｐのＰＣＲ産物を精製、配列解析し、ＡｖｒＩＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化した。
【０３７３】
［３９８．］ 定常ＩｇＧ１領域（γ鎖）を得るために、ＢＴＧで不死化させたヒトＢ細胞クローン（ＣＭＶ−クローン＃４０）をＰＣＲ増幅用に選択した。このクローンはヒトＣＭＶに対してＩｇＧ１を分泌すること、またｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでＡＤＣＣ応答を誘発することが明らかにされた。ＣＨ１−ＣＨ３ ｃＤＮＡ用に、オリゴヌクレオチド５’−ＡＣＣＧＣＴ ＣＧＡＧＴＧ Ｃ（Ｔ／Ｃ）ＴＣＣＡ ＣＣＡＡＧＧ ＧＣＣＣＡＴ Ｃ（Ｇ／Ｃ）Ｇ ＴＣＴ ＴＣ （センス鎖）及び
５’−ＴＴＴＧＣＧ ＧＣＣＧＣＴ ＣＡＴＴＴＡ ＣＣＣ（Ａ／Ｇ）ＧＡ ＧＡＣＡＧＧ ＧＡＧＡＧＧ ＣＴ （アンチセンス鎖）を合成し、ＰＣＲ増幅に使用した。ＣＬ ｃＤＮＡコード配列の場合と同様に、期待配列〜１５００ｂｐのＰＣＲ産物を精製、配列解析し、ＡｖｒＩＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化した。
【０３７４】
［３９９．］ 最終発現ベクターを得るために、ＥｃｏＲＶ−ＮｏｔＩ消化済みｐＢＪ−３ベクター、ＥｃｏＲＶ−ＡｖｒＩＩ可変領域ｃＤＮＡ及びＡｖｒＩＩ−ＮｏｔＩ定常領域を用いて三重ライゲーションを実行した。重鎖及び軽鎖用の最終発現ベクターはそれぞれｐＢＪ−Ｙ１−ＨＣ及びｐＢＪ−Ｙ１−ＬＣと命名した。
【０３７５】
［４００．］ ピューロマイシン耐性遺伝子（ＰＡＣ）に基づく二重選択を可能にするため、ｐＢＪ−Ｙ１−ＬＣを基礎にして追加ベクターｐＢＪ−Ｙ１−ＬＰを構築した。このベクターではｐＢＪ−Ｙ１−ＬＣベクターのネオマイシン耐性遺伝子がＰＡＣ遺伝子に対応する〜１６００ｂｐの断片（ｐＭＣＣ−ＺＰベクターに由来）に置き換わっている。
【０３７６】
［４０１．］ Ｙ１−ＨＣ、Ｙ１−ＬＣ双方のＯＲＦとそれぞれがコードしているアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０５〜２０８のとおりである。
【０３７７】
［４０２．］ 下線部がリーダー配列である。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域は太字のアミノ酸配列に対応し、その後にはＩｇＧ１ （重鎖の場合）又はλ３（軽鎖の場合）定常領域配列が続く。
【０３７８】
［４０３．］ ＣＨＯ細胞でのＹ１重鎖及び軽鎖の発現： ベクターｐＢＪ−Ｙ１−ＨＣ及びｐＢＪ−Ｙ１−ＬＣを個別に、重鎖又は軽鎖を発現する安定細胞のトランスフェクションと選択に使用した。Ｇ４１８に基づく選択と細胞増殖の後、上清中の分泌タンパク質についてＩｇＧ１の発現を、以下述べるようにキャプチャーＥＩＡ法及びウェスタンブロット法で解析した。
【０３７９】
［４０４．］ キャプチャーＥＩＡ法： ９６穴プレートのウェルをマウス抗ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ （Ｓｉｇｍａ）でコートした。前記の上清をウェルに加え、重鎖ＩｇＧ１の存在をビオチニル化ヤギ抗γ鎖特異抗体（Ｓｉｇｍａ）、ストレプトアビジン−ＨＲＰ及び基質を用いて検出した。ＥＬＩＳＡプレートリーダーでＡ_４０５での発色をモニターした。
【０３８０】
［４０５．］ ウェスタンブロット解析： 前記細胞の上清を１２．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけた。各鎖の発現を（ａ）重鎖検出用のヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ （Ｈ＋Ｌ； Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ ＃Ａ８６６７）及び（ｂ）軽鎖検出用のビオチニル化ヤギ抗ヒトλ３鎖（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ， Ｃａｔ ＃２０７０−０８）で検出した。
【０３８１】
［４０６．］ 両鎖の発現を上記のアッセイで確認し、コトランスフェクションによりフルサイズＹ１−ＩｇＧ１を得た。
【０３８２】
ＩｇＧ−Ｙ１ の発現と精製
［４０７．］ 細胞培養とトランスフェクション： ＣＨＯ細胞を、３７℃、５％ ＣＯ_２雰囲気中、１０％ウシ胎仔血清と４０μｇ／ｍｌゲンタマイシンとを添加したＦ−１２培地で培養した。トランスフェクションの１日前に、０．８〜１×１０^６細胞を９０ｍｍディッシュに植え込んだ。培養細胞に１０μｇの軽鎖及び重鎖ＤＮＡをＦｕＧｅｎｅ （Ｒｏｃｈｅ）トランスフェクション試薬法でコトランスフェクションした。非選択培地で２日間増殖後、５５０μｇ／ｍｌネオマイシンと３μｇ／ｍｌピューロマイシンとを添加したＦ−１２培地で細胞を１０〜１２日間培養した。細胞をトリプシン処理し、Ｃｏｓｔａｒ ９６穴プレートを用いて細胞０．５個／ウェルの限界希釈法でクローニングした。個別コロニーを取り出し、６穴ディッシュで増殖させ、フラスコに移した。
【０３８３】
［４０８．］ 重鎖及び軽鎖分泌の測定： トランスフェクションしたＣＨＯ細胞の上清中に分泌された抗体の濃度をサンドウィッチＥＬＩＳＡ法で測定した。抗体濃度の測定には以下の試薬を使用した： コート抗体としてのモノクローナル抗ヒトＩｇＧ１（Ｆｃ） （Ｓｉｇｍａ）、検出試薬としてのヤギ抗ヒトＩｇＧ （γ鎖特異的）ビオチンコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ）、及びスタンダードとしての純粋ヒトＩｇＧ１λ （Ｓｉｇｍａ）。このＥＬＩＳＡ法によれば産生速度は３〜４μｇ／ｍｌの範囲であった。
【０３８４】
［４０９．］ ＭＡｂの細胞からの産生と精製： 細胞をローラーボトルにより、１０％ウシ胎仔血清とネオマイシン及びピューロマイシンを添加したＦ−１２培地中で終濃度１〜２×１０^８細胞／ボトルとなるまで増殖させた。産生用として、細胞を同じ培地（ただし２％ウシ胎仔血清を添加）でさらに２日間培養した。
【０３８５】
［４１０．］ 分泌抗体をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製した。結合には２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ ７．０を、溶離には０．１Ｍグリシン緩衝液ｐＨ ２．５−３．０をそれぞれ用いた。精製抗体の量はＵＶ吸光度法で求め、純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分析した。非変性条件下では全ＩｇＧ抗体は期待分子質量が１６０ｋＤである。変性ゲル中では重鎖、軽鎖の期待サイズはそれぞれ５５ｋＤ、２８ｋＤである。
【０３８６】
［４１１．］ フルサイズＩｇＧ−Ｙ１分子の結合： ＩｇＧ−Ｙ１分子とｓｃＦｖ−Ｙ１分子の結合レベルを比較測定するために結合実験を行った。二段階染色法を採用して、５ｎｇのＩＧＧ−Ｙ１をＲＡＪＩ細胞（陰性対照、図４４）及びＪｕｒｋａｔ細胞（Ｙ１陽性細胞、図４４）の両方と反応させた。検出にはＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを使用した。同様に、１μｇのｓｃＦｖ−Ｙ１をＪｕｒｋａｔ細胞と反応させ（図４４）、またＰＥ標識ウサギ抗ｓｃＦｖを検出に使用した。ＩｇＧ−Ｙ１もｓｃＦｖ−Ｙ１もＪｕｒｋａｔ細胞に結合するが、ｓｃＦｖ−Ｙ１ではＩＧＧ−Ｙ１と同程度の検出レベルを実現するには約１０^３倍の量が必要になるとの結果が出た。
【０３８７】
実施例 ６： 全 ＩｇＧ−Ｙ１ 抗体由来の Ｆａｂ 及び Ｆ（ａｂ ’ ） _２ フラグメントの調製
細胞培養と一過性トランスフェクション
［４１２．］ ＣＨＯ細胞を、３７℃、５％ ＣＯ_２雰囲気中、１０％ウシ胎仔血清と４０μｇ／ｍｌゲンタマイシンとを添加したＦ−１２培地で培養した。トランスフェクションの１日前に、１〜１．５×１０^６細胞を９０ｍｍディッシュに植え込んだ。培養細胞に、それぞれ別個の真核発現系に収めたＹ１抗体の軽鎖及び重鎖可変領域をコードする１０μｇのＤＮＡをコトランスフェクションした。トランスフェクションにはＦｕＧｅｎｅ （Ｒｏｃｈｅ）トランスフェクション試薬法を用いた。
【０３８８】
［４１３．］ 非選択増殖培地で２日間増殖後、５５０μｇ／ｍｌネオマイシンと３μｇ／ｍｌピューロマイシンとを添加したＦ−１２培地で細胞を１０〜１２日間培養した。細胞をトリプシン処理し、Ｃｏｓｔａｒ ９６穴プレートを用いて細胞０．５個／ウェルの限界希釈法でクローニングした。個別コロニーを取り出し、６穴ディッシュで増殖させ、フラスコに移し（発現レベルと増殖培地中抗体分泌レベルを測定するための）さらなる選択に回した。
【０３８９】
細胞培養と長期トランスフェクション
［４１４．］ ＣＨＯ細胞を、３７℃、５％ ＣＯ_２雰囲気中、１０％ウシ胎仔血清と４０μｇ／ｍｌゲンタマイシンとを添加したＦ−１２培地で培養した。トランスフェクションの１日前に、０．８〜１×１０^６細胞を９０ｍｍディッシュに植え込んだ。培養細胞に、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）プロモーターの支配下にクローニングしたＹ１抗体の軽鎖及び重鎖をコードする１０μｇのＤＮＡとｓｖ−４０プロモーターの支配下にクローニングしたｄｈｆｒ遺伝子とをコトランスフェクションした。トランスフェクションはＦｕＧｅｎｅ （Ｒｏｃｈｅ）トランスフェクション試薬法で行った。非選択培地で２日間増殖した後、１００ｎＭ〜５μＭメトトレキサート（ＭＴＸ）と透析処理したウシ胎仔血清とを含む培地で細胞を培養し、（限界希釈法後に）全Ｙ１抗体を一段と高レベルに発現するクローンを選択した。
【０３９０】
重鎖及び軽鎖分泌の測定
［４１５．］ トランスフェクションしたＣＨＯ細胞の上清中に分泌される抗体の濃度を測定するためにサンドウィッチＥＬＩＳＡ法を確立した。抗体濃度の測定には以下の試薬を使用した： コート抗体としてのモノクローナル抗ヒトＩｇＧ１（Ｆｃ） （Ｓｉｇｍａ）、検出試薬としてのヤギ抗ヒトＩｇＧ （γ鎖特異的）ビオチンコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ）、及びスタンダードとしての純粋ヒトＩｇＧ１λ （Ｓｉｇｍａ）。
【０３９１】
ＭＡｂ の細胞からの産生と精製
［４１６．］ 細胞をローラーボトルにより、（前述のように）１０％ウシ胎仔血清とネオマイシン及びピューロマイシンを添加したＦ−１２培地中で終濃度１〜２×１０^８細胞／ボトルとなるまで増殖させた。抗体産生用として、細胞を同じ培地（ただし２％ウシ胎仔血清）でさらに２日間培養した。
【０３９２】
［４１７．］ 分泌抗体をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）とイオン交換カラム−Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製した。結合には２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ ７．０を、溶離には０．１Ｍグリシン緩衝液ｐＨ ２．５−３．０をそれぞれ用いた。精製抗体の量はＵＶ吸光度及びＥＬＩＳＡ法で求め、純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥとＨＰＬＣで分析した。非変性条件下では全ＩｇＧ抗体は期待分子質量が１６０ｋＤである。変性ゲル中では重鎖、軽鎖の期待サイズはそれぞれ５５ｋＤ、２８ｋＤである。
【０３９３】
Ｙ１ ＩｇＧ の Ｆａｂ 及び Ｆ（ａｂ ’ ） _２ フラグメントへの断片化
［４１８．］ ＩｇＧ分子は２個の同じ軽鎖と２個の同じ重鎖からなる。これらの軽鎖及び重鎖は非共有的相互作用と共有結合（ジスルフィド結合）の組合せによりまとめられて折りたたみ構造（ドメイン）をなす。軽鎖は１つの可変ドメインと１つの定常ドメインからなる。重鎖は１つの可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）と３つの離れた定常ドメイン（ＣＨ １、２及び３）からなる。重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）と重鎖定常ドメイン２ （ＣＨ２）の間の「ヒンジ」領域は酵素によるタンパク質分解作用を受けやすい。このヒンジ領域の切断によりＦａｂ又はＦ（ａｂ’）_２フラグメントとＦｃフラグメントが生じる。Ｆａｂフラグメントは原型ＩｇＧ分子の抗原結合能を保持するが、非特異的結合能は低い。Ｆａｂフラグメントは、エフェクター機能を欠く抗原結合能が求められるような状況に最適である。
【０３９４】
［４１９．］ Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）_２フラグメントは診断又は治療薬としてｉｎ ｖｉｖｏで使用される。がん化学療法薬を、すべての細胞を傷害する薬剤ではなく腫瘍特異的薬剤にするには、薬剤を腫瘍の細胞表面抗原に結合する抗体に連結すればよい。原型ＩｇＧの使用ではなくＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２フラグメントの使用には次のような利点がある。
【０３９５】
［４２０．］ （１）フラグメントは容易に毛管を通過し組織表面に拡散しうる。
【０３９６】
［４２１．］ （２）コンジュゲートを結合していないフラグメントは同様の原型ＩｇＧよりもすみやかに排泄されよう。従って、ターゲット領域に到達するフラグメント−治療薬の量が多くなろう。
【０３９７】
［４２２．］ 一価及び二価抗体断片を調製しようとする試みでは当初から固定化フィシンが使用されてきた（Ｐｉｅｒｃｅ）。１ｍＭシステインの存在下にフィシンで切断するとＦ（ａｂ’）_２フラグメントが生じる。また消化緩衝液のシステインアクチベーター濃度を１０ｍＭに高めると原ＩｇＧからＦａｂフラグメントを生成させることができる。
【０３９８】
［４２３．］ 消化後のフラグメントは固定化Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラムで精製する。Ｆ（ａｂ’）２及びＦａｂフラグメントは１０ｋＤａ又は３０ｋＤａをカットオフ分子質量とするマイクロコンセントレーターで濃縮した。タンパク質の回収は２８０ｎｍでの吸光度から判定した。フラグメントの純度はゲル電気泳動で測定した。
【０３９９】
Ｆａｂ フラグメント調製の詳細手順
［４２４．］ システインＨＣｌ濃度２ｍｇ／ｍｌ ［Ｆ（ａｂ’）２フラグメント調製用］及び２０ｍｇ／ｍｌ （Ｆａｂフラグメント調製用）の消化用緩衝液を入れた２ｍｌ固定化フィシン・カラムに精製Ｙ１抗体１ｍｇを添加し、３７℃で５時間（Ｆａｂの場合）及び２０時間［Ｆ（ａｂ’）の場合］反応させた。ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ結合用緩衝液４ｍｌで消化物を溶離することにより反応を停止させた。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラムと結合用緩衝液を使用して未消化ＩｇＧ及びＦｃフラグメントからＦａｂ又はＦ（ａｂ’）フラグメントを通過液として分離した。２８０ｎｍでの吸光度を読み取ることで、フラグメントを含むピーク画分を集めた。１０ｋＤａ又は３０ｋＤａをカットオフ分子質量とするマイクロコンセントレーターでフラグメントを濃縮しＰＢＳに対して透析した。タンパク質の回収、純度測定及び解析は２８０ｎｍでの吸光度、ゲル電気泳動及びＨＰＬＣで行った。
【０４００】
細胞抽出物 （ 溶解物 ） の調製
［４２５．］ ２×１０^６個の細胞を回収しマイクロ遠心機にかけた（１３００ｒｐｍ、４℃、５分間）。洗浄のため、ペレットに０．５〜１ ｍｌ ＰＢＳ＋ｐｉを加え静かに混合した。混合液を前述の要領で遠心した。０．５〜１ ｍｌ ＰＢＳ＋ｐｉによる洗浄を繰り返し、混合液を前述の要領で遠心した。ペレット化した細胞を溶解用緩衝液に再懸濁した（２００μｌ／２０×１０^６個細胞ペレット）。使用緩衝液は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．４、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１％ＮＰ−４０及び１ｍＭ ＥＤＴＡであるが、他の好適な緩衝液でもよい。懸濁液を氷上で約３０分間インキュベートし、次いで遠心にかけた（３０００ｒｐｍ、４℃、５分間）。上清を回収して一定量に分割した。
【０４０１】
粗製膜画分の調製と膜タンパク質の抽出
［４２６．］ 凝縮細胞に対し２０倍量のホモジナイズ緩衝液を加えた。使用ホモジナイズ緩衝液は２％（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０、１ｍＭ ＭｇＳＯ_４、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．４であった。以下のプロテアーゼインヒビターを添加した： １ｍＭ ＰＭＳＦ、５μｇ／ｍｌロイペプチン及び５μｇ／ｍｌアプロトニン。回転式Ｔｅｆｌｏｎペスル（Ｕｌｔｒａ Ｔｏｒｅｘ）付Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザーで３〜５ストロークして細胞をホモジナイズした。試料はホモジナイズ処理時に保冷し続け、次いで氷浴で１時間かき混ぜた。ホモジナイザーで試料にさらに数ストローク加え、次いで試料を３０００×ｇ、４℃で３０分間遠心した。上清を回収し、４５０００×ｇ （１９０００ｒｐｍローターｓｓ−３４）、４℃で１時間遠心した。上清を棄て、ペレットに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０及びプロテアーゼインヒビターの溶液を加え、溶解ペレットを１時間氷上においた。
【０４０２】
ＨＰＬＣ による膜画分の精製
［４２７．］ ＲＰＣカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｔｙｐｅ ＰＬＲＰ−Ｓ ３００Ａ）を使用して膜画分を精製した。使用緩衝液は（Ａ） ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０及び（Ｂ） ６０％プロパノール＋ＤＤＷである。流速は１ｍｌ／分としたが、洗浄ステップだけは２ｍｌ／分とした。全手順は周囲温度で実行した。
【０４０３】
［４２８．］ Ｊｕｒｋａｔ又はＫＧ−１膜画分の免疫沈降（ＩＰ）後の溶出試料に、緩衝液Ａで１：４希釈した試料緩衝液（６２ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ６．８、１０％グリセリン、３％ＳＤＳ、７２０ｍＭメルカプトエタノール）を加えた。
【０４０４】
［４２９．］ 試料をカラムに送り、通過液を回収した。カラムを緩衝液（Ａ）で、流れの吸光度がゼロに下がるまで洗った。
【０４０５】
［４３０．］ 次のプログラムに従ってカラムからタンパク質を溶離した： ８０％ （Ａ）で５分間、次いで（Ａ） ８０−０％、（Ｂ） ２０−１００％のグラジエント４０分間。次に第２グラジエントをかけて溶離液の組成を８０％ （Ａ）とし、この組成を用いてカラムをさらに５回洗った。溶出液をフラクションコレクターで１ｍｌずつ分画しながら回収した。
【０４０６】
［４３１．］ 試料をＳｐｅｅｄ−Ｖａｃエバポレーターで蒸発濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロット解析で分析した。
【０４０７】
Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ カラムによる正常ヒト血漿の精製
［４３２．］ ５ｍｌの正常ヒト新鮮凍結血漿を開始緩衝液で１：１０希釈し、０．４５μｍシリンジフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ， ｃａｔ ＃１６５５５）でろ過した。開始緩衝液はプロテアーゼインヒビター（５μｇ／ｍｌロイペプチン、５μｇ／ｍｌアプロチニン及び１ｍＭ ＰＭＳＦ）を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌである。
【０４０８】
［４３３．］ ５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ， ｃａｔ ＃１７−１１５４−０１）をＰ−１ペリスタポンプ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に取り付けた。カラムをメーカープロトコールに従って約４ｍｌ／分の流速で洗った。希釈ろ過血漿をカラムに通し、通過液を回収した。カラムを２０容積分の０．３Ｍ ＮａＣｌ／開始緩衝液で洗った。タンパク質を０．６Ｍ、０．８Ｍ及び１．０Ｍ ＮａＣｌ／開始緩衝液で溶離した。溶離液量はそれぞれ５０、２０及び２０ｍｌであった。全手順は４℃で実施した。
【０４０９】
［４３４．］ 溶出画分を二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、次いでビオチニル化Ｙ１及び陰性対照としての抗体１８１を使用するウェスタンブロット解析にかけた。０．６Ｍ ＮａＣｌ溶出画分からはフィブリノゲンγ’が検出された。１．０Ｍ ＮａＣｌ溶出画分には補体複合体４ （ＣＣ４）、ルミカン、プロトロンビン及びインターαインヒビターが含まれていた。
【０４１０】
ＨＰＬＣ カラムによる正常ヒト血漿の精製
［４３５．］ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅで精製した正常ヒト血漿を次の物質と、記載の終濃度となるよう混合した： 尿素（終濃度８Ｍ以上）、ＤＴＴ （終濃度３０ｍＭ）及びＴＦＡ （終濃度０．１％）。
【０４１１】
［４３６．］ 精製血漿溶液を３ｍｌ ＲＰＣカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に送り、通過液を回収した。カラムを緩衝液（Ａ）で、流れの吸光度がゼロに下がるまで洗った。次のプログラムに従ってカラムからタンパク質を溶離した： ９０％ （Ａ）で５分間、次いで（Ａ） ９０−０％、（Ｂ） １０−１００％のグラジエント４０分間。次に第２グラジエントをかけて溶離液の組成を９０％ （Ａ）とし、この組成を用いてカラムをさらに５回洗った。使用緩衝液は（Ａ） ０．１％ ＴＦＡ／ＤＤＷ及び（Ｂ） ８０％ ＣＡＮと０．１％ ＴＦＡ／ＤＤＷである。流速は１ｍｌ／分としたが、洗浄ステップだけは２ｍｌ／分とした。
【０４１２】
［４３７．］ 溶出液をフラクションコレクターで１ｍｌずつ分画しながら回収した。全手順を周囲温度で実施した。
【０４１３】
［４３８．］ 試料をＳｐｅｅｄ−Ｖａｃエバポレーターで蒸発濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロット解析で分析した。
【０４１４】
非標識 ＣＤ１６２ 抗体との間接免疫ブロット法
［４３９．］ 試料の１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥをＳｉｇｍａ Ｚ３７， ５０３−９装置により１４０〜１６０Ｖで３．５時間行った。電気泳動した試料を室温、Ｔｒｉｓ Ｇｌｙｃｉｎｅ緩衝液（２０％ ＭｅＯＨ、１９２ｍＭグリシン、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．３）中、２０Ｖで一晩ニトロセルロースフィルターに転写した。ニトロセルロースフィルターを５％スキムミルク／ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）により室温で１時間ブロッキングした。ニトロセルロースフィルターを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで３回、各５分間洗った。フィルターをＳｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ混合液（Ｐｉｅｒｃｅ）と５分間、メーカープロトコールに従ってインキュベートし、次いで過剰液を乾燥除去した。フィルターをＸ線フィルム（富士写真フィルム）に露光した後、フィルムを現像した。
【０４１５】
Ｙ１ 受容体のウェスタンブロット解析−ブロット後のフィルターの処理
［４４０．］ ニトロセルロースフィルターを５％スキムミルクにより室温で１時間ブロッキングした。次いでフィルターを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ／ＰＢＳにより室温で３回、各５分間洗った。フィルターを２％スキムミルク／ＰＢＳ中、室温で１時間、Ｙ１−ビオチン（又は１８１−ビオチン） ５μｇ／ｍｌとインキュベートした。次いでコールドルーム（約４〜１０℃）でフィルターを冷０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳにより３回、各５分間洗った。次いでフィルターをコールドルームで、２％スキムミルク＋ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎで１：１０００希釈したＳＡＶ−ＨＲＰ（ストレプトアビジン−ＨＲＰ）溶液とインキュベートした。希釈は室温（約２５℃）で行い、希釈したＳＡＶ−ＨＲＰを１０〜１５分間氷冷してから使用した。インキュベーションは静かに撹拌しながら１時間行った。ＳＡＶ−ＨＲＰとのインキュベーション後、フィルターを前述の要領で洗った。次いでフィルターをＳｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ混合液（Ｐｉｅｒｃｅ）と５分間、メーカープロトコールに従ってインキュベートし、次いで過剰液を乾燥除去した。フィルターをＸ線フィルム（富士写真フィルム）に露光した後、フィルムを現像した。
【０４１６】
実施例 ７： 組換えグリコカリシンの原核系による発現
［４４１．］ グリコカリシン（ＧＣ、ＧＰＩｂαのアミノ酸１〜アミノ酸４９３）をＩＰＴＧ誘導性原核ベクターカセット中にクローニングした。この新規構築プラスミドを収めたＥ． ｃｏｌｉ （ＢＬ２１ ＤＥ３）細胞を３７℃で吸光度０．７〜０．８まで増殖させ、次いで発現誘導用ＩＰＴＧの存在下に３７℃で３時間増殖させた。
【０４１７】
［４４２．］ 半精製したヒト血小板由来グリコカリシン（ＧＣ）又は発現誘導又は非誘導細胞に由来するＥ． ｃｏｌｉ細胞溶解物（総体）を電気泳動した後のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを解析した。ビオチニル化Ｙ１−ｓｃＦｖ、ウサギ抗ヒトＧＣポリクローナル抗体、市販マウス抗ヒトＣＤ４２モノクローナル抗体（ＳＺ２ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ、ＰＭ６４０ Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＨＩＰ１ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、ＡＮ５１ ＤＡＫＯ）及びＧＰＩｂαのＮ末端へのポリクローナル抗体（Ｓ．Ｃ．−７０７１、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いてウェスタンブロット解析を行った。
【０４１８】
［４４３．］ ２つのポリクローナル抗体は細菌由来組換えグリコカリシンとヒト血小板由来天然グリコカリシンの両方を認識した。Ｙ１−ｓｃＦｖと市販抗体はヒト由来天然グリコカリシンを認識したが、細菌由来組換え血小板グリコカリシンを認識しなかった（図４５）。
【０４１９】
［４４４．］ 原核生物（たとえばＥ． ｃｏｌｉ）系は翻訳後修飾機構たとえばグリコシル化及び硫酸化機構を欠く。従って、細菌に産生させたグリコカリシンをＹ１−ｓｃＦｖが認識しないことはグリコシル化や硫酸化などの翻訳後修飾がグリコカリシンへのＹ１−ｓｃＦｖの結合には不可欠であるとの結論を裏付ける。
【０４２０】
血液 ／ 骨髄試料に関する ＦＡＣＳ プロトコール
［４４５．］ 試料は病院から提供を受ける。患者試料３０μｌ／チューブ。５μｌ／チューブのＣＤ３３−ＡＰＣ（ＡＭＬ場合）又はＣＤ１９−ＡＰＣ（Ｂ−ＣＬＬの場合）又はＣＤ３８−ＡＰＣ（多発性骨髄腫の場合）を加える。５μｌ／チューブのＣＤ４５−ＰｅｒＣｐ及び５μｌのｓｃＦｖ−Ｙ１又は対照ｓｃＦｖ−Ｎ３１又はＣＤ１６２−ＰＥ（ＫＰＬ１）を加える。チューブを４℃で３０分間、ゆっくり振とうしながらインキュベートする。２ｍｌ ＰＢＳを加えて洗い、１２００ｒｐｍで５分間遠心する。上清を棄てる。
【０４２１】
［４４６．］ ワンステップアッセイの場合には次の溶解ステップに進む：
【０４２２】
［４４７．］ ｄｄＨ_２Ｏ（患者試料に３００μｌ）で１：１０希釈した５００μｌ ＢＤリシン溶液を加える。高速でボルテックスし、４℃で１２分間インキュベートする。前述の要領で洗う。上清を棄て５００μｌ ＰＢＳを加える。国際規格に従った血液試料データ収集セットアップを使用してＦＡＣＳで試料を読み取る。
【０４２３】
［４４８．］ ２以上のアッセイの場合： ワーキングバッファーはＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ＋０．０５％アジ化ナトリウムである。インキュベーションと洗浄は前述のとおり。
【０４２４】
［４４９．］ 赤血球の溶解は本アッセイの最終ステップであり、あとは５００μｌ ＰＢＳに再懸濁する。
【０４２５】
実施例 ８： トライアボディーの構築
［４５０．］ 原Ｙ１をコードするベクターｐＨＥＮ−Ｙ１を、Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ両領域を個別に対象とするＰＣＲにより増幅した。Ｖ_Ｌ−ＰＣＲにはセンス鎖オリゴヌクレオチド５’−ＡＡＣＴＣＧ ＡＧＴＧＡＧ ＣＴＧＡＣＡ ＣＡＧＧＡＣ ＣＣＴとアンチセンス鎖オリゴヌクレオチド５’−ＴＴＴＧＴＣ ＧＡＣＴＣＡ ＴＴＴＣＴＴ ＴＴＴＴＧＣ ＧＧＣＣＧＣ ＡＣＣを使用した。期待サイズ〜３５０ｂｐの産物ｃＤＮＡを増幅し、配列解析し、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化した。
【０４２６】
［４５１．］ 同じ手順でＶ_Ｈ領域を増幅した（センス鎖オリゴヌクレオチド５’−ＡＴＧＡＡＡ ＴＡＣＣＴＡ ＴＴＧＣＣＴ ＡＣＧＧとアンチセンス鎖オリゴヌクレオチド５’−ＡＡＣＴＣＧ ＡＧＡＣＧＧ ＴＧＡＣＣＡ ＧＧＧＴＡＣ Ｃを使用）。Ｖ_Ｈ−ＰＣＲ産物をＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化した。ＮｃｏＩ−ＮｏｔＩで消化済みのｐＨＥＮベクターへの三重ライゲーションを実施した。最終ベクターをｐＴｒｉａ−Ｙ１と命名した。
【０４２７】
［４５２．］ Ｅ． ｃｏｌｉの形質転換後、数クローンを選び出してさらなる解析によりＤＮＡ配列、タンパク質発現、細菌の細胞周辺腔からの抽出などを確認した。Ｙ１トライアボディーのサイズの確認には還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット解析を行った。
【０４２８】
実施例 ９： ダイアボディーの構築
［４５３．］ 実施例８に由来するｐＴｒｉａ−Ｙ１ベクターをＸｈｏＩ制限酵素で線状化し、２本の相補的合成オリゴヌクレオチド（５’−ＴＣＧＡＧＡ ＧＧＴＧＧＡ ＧＧＣＧＧＴと５’−ＴＣＧＡＡＣ ＣＧＣＣＴＣ ＣＡＣＣＴＣ）をプレアニール後に、Ｙ１の重鎖と軽鎖の間のＸｈｏＩ部位にライゲートした。この新しいベクターはｐＤｉａ−Ｙ１と命名した。トライアボディーの場合と同様にして、ＤＮＡ配列とタンパク質の発現を確認した。
【０４２９】
実施例 １０： ダイアボディーとトライアボディーの発現と精製
［４５４．］ Ｅ． ｃｏｌｉでの発現は本質的に、ｓｃＦｖ−Ｙ１に関する説明と同じであった。しかし、形質転換Ｅ． ｃｏｌｉの周辺質由来Ｙ１ダイアボディー及びトライアボディーの精製は異なった。ｓｃＦｖ−Ｙ１単量体型はタンパク質Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズのアフィニティーカラムで精製することができる。しかし、多量体型Ｙ１にはこの方法での精製は無効である。そこで細菌から抽出した周辺質タンパク質を６０％硫酸アンモニウムで一晩沈殿させ、Ｈ_２Ｏに再懸濁し、０．１×ＰＢＳで予め平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ−２００ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）サイズ排除カラムに添加した。画分を回収し、ＨＰＬＣで分析し、また二量体又は三量体を含む別個の画分を回収してＦＩＴＣ標識とＦＡＣＳ解析に回した。
【０４３０】
実施例 １１： Ｙ１ ダイアボディー及びトライアボディーの細胞への結合
［４５５．］ 「三段階染色法」を用いてＪｕｒｋａｔ細胞のＦＡＣＳ解析を行った。まず粗製抽出物又は精製未標識ｓｃＦｖを、次いでマウス抗ｍｙｃ抗体を、最後にＦＩＴＣ−又はＰＥ−結合抗マウス抗体を、それぞれ染色した。ＦＡＣＳ解析には、Ｆｉｃｏｌｌで精製しＰＢＳ＋１％ ＢＳＡに再懸濁した５〜８×１０^５個の細胞が必要である。結合は４℃で１時間行った。各ステップ後に細胞を洗いＰＢＳ＋１％ ＢＳＡに再懸濁した。最終染色ステップ後、細胞をＰＢＳ、１％ＢＳＡ、２％ホルムアミドに再懸濁して固定し、次いでＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で読み取った。
【０４３１】
［４５６．］ Ｙ１−ｓｃＦｖの結合をダイアボディー及びトライアボディーの結合と比較した。この解析（図４４）では３つのＹ１型すべての結合プロフィールがきわめて類似していた。これは、前述のようなＹ１改変がＹ１のリガンドへの見掛け結合アフィニティーを変更、隠蔽又は破壊しないことを示唆する。
【０４３２】
実施例 １２： 放射受容体測定による ＫＧ−１ 細胞への Ｓ−Ｓ Ｙ１ 二量体のアフィニティーの、 ＣＯＮＹ１ 及び Ｙ１−ＩｇＧ との比較研究
［４５７．］ この測定では、クロラミンＴを使用してＹ１−ＩｇＧ構成体又はＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ（ＣＯＮＹ１）試薬を^１２５Ｉでヨウ化して調製した放射性リガンドを使用した。測定用チューブには０．２ｍｌあたり５×１０^６個のＫＧ−１細胞と標識トレーサー＋可変量の無標識競合物質とをＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ （ｐＨ ７．４）中に混ぜたものを入れた。かき混ぜながら４℃で１時間インキュベートした後、細胞を冷緩衝液で十分に洗い、放射能測定に回した。
【０４３３】
［４５８．］ 放射受容体測定（ＲＲＡ）には２ｎｇ／チューブの^１２５Ｉ−Ｙ１−ＩｇＧを使用し、３分子それぞれとの競合を行わせた。結果は図４６のとおりである。図が示すようにＳ−Ｓ Ｙ１二量体はアフィニティーが全Ｙ１抗体の大半よりも低く（２分の１）、またＣＯＮＹ１よりも３０倍高かった。この実験ではＹ１−ＩｇＧのアフィニティー概算値は２×１０^−８Ｍである。従って、対応する二量体のアフィニティーは４×１０^−８Ｍである。
【０４３４】
［４５９．］ 標識ＣＯＮＹ１を使用した第２のＲＲＡでは、１００ｎｇ／チューブの^１２５Ｉ−Ｙ１−ＩｇＧを使用し、３分子それぞれとの競合を行わせた。結果は図４６のとおりである。図が示すようにＳ−Ｓ二量体はＣＯＮＹ１と比べてアフィニティーが２０倍高かった。この実験ではＣＯＮＹ１のアフィニティー概算値は１０^−６Ｍである。従って、対応する二量体のアフィニティーは５×１０^−８Ｍである。
【０４３５】
実施例 １３： Ｙ１−ｃｙｓ−ｋａｋ （ システイン二量体 ） の生産
［４６０．］ １リットルのλｐＬ−ｙｌ−ｃｙｓ−ｋａｋ培養菌を４２℃で２〜３時間誘導した。培養菌を５０００ｒｐｍで３０分間遠心した。ペレットを１８０ｍｌのＴＥ （５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．４、２０ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁した。８ｍｌのリゾチーム（５ｍｇ／ｍｌストックに由来）を加え、１時間インキュベートした。２０ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌと２５ｍｌの２５％ Ｔｒｉｔｏｎを加え、さらに１時間インキュベートした。この混合液を４℃、１３０００ｒｐｍで６０分間遠心し、上清を棄てた。ティッシュマイザー（又はホモジナイザー）を利用してペレットをＴＥに再懸濁した。この手順を封入体（ペレット）が灰／茶褐色になるまで３〜４回反復した。封入体を６ＭグアニジンＨＣｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．４、２ｍＭ ＥＤＴＡで可溶化した（１．５ｇ−封入体／１０ｍｌ−可溶化緩衝液から〜１０ｍｇ／ｍｌの可溶化タンパク質を得た）。これを少なくとも４時間インキュベートした。タンパク質を濃度測定して１０ｍｇ／ｍｌの濃度とした。ＤＴＡを加えて終濃度を６５ｍＭとし室温で一晩インキュベートした。タンパク質の再生を、１０ｍｌのタンパク質を０．５Ｍアルギニン、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．９ｍＭ ＧＳＳＧを含む溶液に滴下して希釈することにより開始した。再生溶液を〜１０℃で４８時間インキュベートした。タンパク質を含む再生溶液を、２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ ６と１００ｍＭ尿素とを含む緩衝液中で透析し、５００ｍｌに濃縮した。この透析／濃縮溶液をＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに結合させ、ＮａＣｌの（１Ｍまでの）グラジエントで溶出した。
【０４３６】
実施例 １４： グリコカリシン （ＧＣ） への ＥＬＩＳＡ
［４６１．］ １００ｍｌの精製グリコカリシンを９６穴平底ＭａｘｉＳｏｒｐプレートにより４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ （ＰＢＳ＋ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ）で３回洗い、次いで２００ｍｌのＰＢＳＴ−ミルク（ＰＢＳＴ＋ ２％脱脂乳）を室温で１時間にわたり添加した。プレートをＰＢＳＴで洗い、単量体又は二量体（１００ｍｌ）を種々の濃度のＰＢＳＴ−ミルクに室温で１時間にわたり添加した。次いでプレートを洗い、（ＰＢＳＴ−ミルクに１：１００希釈した）抗Ｖ_Ｌポリクローナル抗体（Ｙ１由来Ｖ_Ｌで免疫したウサギに由来）を１時間にわたり添加した。プレートを洗い、抗ウサギＨＲＰ抗体をさらに１時間にわたり添加した。プレートを５回洗い、１００μｌ ＴＭＢ基質を約１５分間にわたり添加し、次に１００μｌの０．５Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を加えて反応を止めた。プレートの４５０ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡリーダーで測定した。
【０４３７】
実施例 １５： 組換えグリコカリシン （ＧＣ） の Ｅ． ｃｏｌｉ による発現
［４６２．］ ヒト血小板ＧＰＩｂ−グリコカリシン（ＧＣ、アミノ酸１〜アミノ酸４９３）のＮ末端側可溶性部分をコードするＤＮＡ断片をＩＰＴＧ誘導性原核ベクターカセットにクローニングした。この新規作製プラスミドを収めたＥ． ｃｏｌｉ （ＢＬ２１ ＤＥ３）細胞を３７℃で吸光度０．７〜０．８まで増殖させ、次いで３７℃で３時間、発現誘導用ＩＰＴＧの存在下に増殖させた。血小板由来半精製ＧＣ又は誘導又は非誘導細胞に由来するＥ． ｃｏｌｉ細胞溶解物（タンパク質の総体を含有）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。ビオチニル化−Ｙ１ ｓｃＦｖ、ウサギ抗ヒトＧＣポリクローナル抗体、市販のマウス抗ヒトＣＤ４２モノクローナル抗体（ＳＺ２、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ； ＰＭ６４０、Ｓｅｒｏｔｅｃ； ＨＩＰ１、Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ； ＡＮ５１、ＤＡＫＯ）及びＧＰＩｂαのＮ末端へのポリクローナル抗体（Ｓ．Ｃ．−７０７１、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を使用してウェスタンブロット解析を行った。２つポリクローナル抗体は細菌由来組換えＧＣとヒト血小板由来天然ＧＣの両方を認識した。ｓｃＦｖ Ｙ１と市販抗体はヒト由来天然ＧＣだけを認識し細菌由来組換え血小板ＧＣを認識しなかった。
【０４３８】
［４６３．］ ｓｃＦｖ及び市販抗体のＧＣへの結合にはグリコシル化や硫酸化などの翻訳後修飾が不可欠である。原核（Ｅ． ｃｏｌｉ）系はグリコシル化や硫酸化などの翻訳後修飾機構を欠く。
【０４３９】
実施例 １６： Ｙ１ 四量体の生産
［４６４．］ Ｙ１のＣ末端にＰＣＲにより配列ＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥを付加した構成体を消化して、ＩＰＴＧ誘導性発現ベクターカセットにクローニングした。このクローンはＹ１−Ｂｉｏｔａｇと命名した。この配列は酵素ＢｉｒＡの基質であり、該酵素は遊離ビオチンの存在下にビオチンをリシン（Ｋ）残基に共有結合させることができる（Ａｌｔｍａｎ ＪＤ ｅｔ ａ．， 「抗原特異的Ｔリンパ球の表現型分析」Ｐｈｅｎｏｔｙｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９６ Ｏｃｔ ４， ２７４ （５２８４）： ９４−６）。この構成体はＢＬ２１細菌細胞で封入体として産生された。タンパク質の再生を前述の要領で行った。封入体をグアニジン−ＤＴＥで可溶化した。再生はアルギニン−トリス−ＥＤＴＡを含む緩衝液による希釈によって行った。透析、濃縮の後、ＨｉＴｒａｐＱイオン交換カラムで精製した。
【０４４０】
［４６５．］ 精製Ｙ１−ｂｉｏｔａｇ ｓｃＦｖをＢｉｒＡ酵素（Ａｖｉｄｉｔｙより購入）及びビオチンと、メーカーの助言に従ってインキュベートした。ビオチニル化Ｙ１−ｂｉｏｔａｇを（分子あたりビオチン量を推計する）ＨＡＢＡ試験で分析すると、およそ＞０．８ビオチン残基／分子の存在が判明した。
【０４４１】
［４６６．］ ビオチニル化Ｙ１−ｂｉｏｔａｇをストレプトアビジン−ＰＥ（フィコエリトリン）とインキュベートして複合体を形成し、また（Ｙ１陽性） ＫＧ−１細胞によるＦＡＣＳ実験に使用した。結合感度はアビディティーの上昇により少なくとも１００倍増大した。ストレプトアビジンからは４つのビオチニル化Ｙ１−ｂｉｏｔａｇ分子が形成されうる。
【０４４２】
［４６７．］ Ｙ１−ｂｉｏｔａｇの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１）は次のとおりである：
１ ＭＥＶＱＬＶＥＳＧＧ ＧＶＶＲＰＧＧＳＬＲ ＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦ ＤＤＹＧＭＳＷＶＲＱ
４１ ＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳ ＧＩＮＷＮＧＧＳＴＧ ＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴ ＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬ
８１ ＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥ ＤＴＡＶＹＹＣＡＲＭ ＲＡＰＶＩＷＧＱＧＴ ＬＶＴＶＳＲＧＧＧＧ
１２１ ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ ＳＳＥＬＴＱＤＰＡＶ ＳＶＡＬＧＱＴＶＲＩ ＴＣＱＧＤＳＬＲＳＹ
１６１ ＹＡＳＷＹＱＱＫＰＧ ＱＡＰＶＬＶＩＹＧＫ ＮＮＲＰＳＧＩＰＤＲ ＦＳＧＳＳＳＧＮＴＡ
２０１ ＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥ ＤＥＡＤＹＹＣＮＳＲ ＤＳＳＧＮＮＶＶＦＧ ＧＧＴＫＬＴＶＬＧＧ
２４１ ＧＧＬＮＤＩＦＥＡＱ ＫＩＥＷＨＥ
【０４４３】
実施例 １７： Ｙ１７ 活性の解析
［４６８．］ Ｐａｓｔｏｒａｌ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａに由来しヒト血小板ＧＰＩｂを選択的に切断する酵素、Ｏ−シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼを使用して、ＧＰＩｂαへのＹ１７の結合特異性の評価を試みた。Ｏ−シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼはシアリル化したＯ結合型グリカンを含むタンパク質だけを特異的に切断し、Ｎ結合型糖タンパク質又は非グリコシル化タンパク質を切断しない。この酵素は、高度にＯ−グリコシル化したＧＰＩｂを切断するがＧＰＩＩｂ−ＩＩＩ ａや血小板表面の他受容体は切断しないと報告されている。免疫ブロット解析やＦＡＣＳ解析で示されたように、ＧＰＩｂを切断したＯ−シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼを洗浄血小板とインキュベートするとＹ１７も、ＧＰＩｂαへのモノクローナル抗体（ＭＣＡ４６６Ｓ、Ｓｅｒｏｔｅｃ）も、ＧＰＩｂに結合しなくなる。これらのエンドプロテアーゼはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩ ａへの（抗ＣＤ６１）モノクローナル抗体の結合能には変化を及ぼさなかった（図４）。
【０４４４】
実施例 １８： 血小板 ＧＰＩｂ 上の Ｙ１７ エピトープの同定
［４６９．］ 血小板ＧＰＩｂ上のＹ１７エピトープの同定への興味深いアプローチでは、血小板ＧＰＩｂ上の切断部位が十分に解明されているエンドプロテアーゼ酵素を使用する。
【０４４５】
１８．１： Ｙ１ エピトープ・マッピングへのモカラギンの効果
［４７０．］ コブラ毒メタロプロテイナーゼのモカラギンは血小板ＧＰＩｂαを、残基ｇｌｕ−２８２とａｓｐ−２８３の間の単一部位で特異的に切断し、２つの安定生成物すなわち上清中に検出される４５ｋＤａのＮ末端側断片（Ｈｉｓ−１〜Ｇｌｕ−２８２）と膜に結合した１００ｋＤａのＣ末端側断片を生成する。
【０４４６】
［４７１．］ 洗浄血小板をモカラギンで処理し、血小板溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離しニトロセルロースに転写した。モカラギン処理した洗浄血小板のＹ１によるウェスタンブロット解析から、ＧＰＩｂ（１３５ ｋＤａ）に対応するバンドが消失し、Ｎ末端側４５ｋＤａトリプシン消化断片にＹ−１７が結合していることが判明した。ＧＰＩｂαのＣ末端側断片へのモノクローナル抗体ＭＣＡ４６６ＳはＣ末端側１００ｋＤａ断片と反応する一方で、ＧＰＩｂαのＮ末端を認識するモノクローナル抗体Ｓ．Ｃ．７０７１はＹ１が認識したのと同じＮ末端側４５ｋＤａ断片と反応した（図１４）。
【０４４７】
［４７２．］ グリコカリシンのモガラギン処理は洗浄血小板で観測された結果と同様の結果をもたらすが、それはＹ１とモノクローナル抗体Ｓ．Ｃ．７０７１がＧＰＩｂαのＮ末端側４５ｋＤａ切断断片に結合することを示す（図８）。これらの結果はＹ１７に対応するエピトープが配列Ｈｉｓ−１〜Ｇｌｕ−２８２内に含まれていることを示唆する。
【０４４８】
１８．２： Ｙ１７ エピトープ・マッピングへのカテプシン Ｇ の効果
［４７３．］ 好中球セリンプロテアーゼのカテプシンＧはグリコカリシンを、残基Ｌｅｕ−２７５とＴｙｒ−２７６の間及び残基Ｖａｌ−２９６とＬｙｓ−２９７の間の２つの部位で切断した。グリコカリシンをカテプシンＧで処理すると２つのＮ末端側断片すなわち小さいほうの４２ｋＤａ断片（Ｈｉｓ１〜Ｌｅｕ２７５）と大きいほうの４５ｋＤａ断片（Ｈｉｓ１〜Ｖａｌ２９６）、それに１つのＣ末端側〜９５ｋＤａ断片が生成する。グリコカリシンとカテプシンＧ消化で生成したグリコカリシン断片とをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースに転写した。Ｙ１７は大きいほうの断片（Ｈｉｓ１〜Ｖａｌ２９６）に結合したが、小さいほうの断片（Ｈｉｓ１〜Ｌｅｕ２７５）には結合しなかった。さらに、Ｈｉｓ１〜Ｌｅｕ２７５内のエピトープを認識するモノクローナル抗体Ｓ．Ｃ．７０７１は両断片をブロットした（図１２）。モカラギン及びカテプシンＧによるＮ末端側消化断片の解析結果は、ＧＰＩｂαのアミノ酸配列Ｔｙｒ２７６〜Ｇｌｕ２８２がＹ１７結合のための重要な認識モチーフであることを示唆する。
【０４４９】
実施例 １９： ｖＷＦ 依存凝集反応への Ｙ１７−ｓｃＦｖ の効果
［４７４．］ ｖＷＦ依存の血小板凝集反応へのＹ１７−ｓｃＦｖの効果を種々のＹ１７濃度で試験した。Ｙ１とは対照的に、Ｙ１７は１０、２５又は５０ μｇ／ｍｌの終濃度ではリストセチン誘発性のｖＷＦ依存洗浄血小板凝集反応を阻害しなかった。モカラギン及びカテプシンＧによるＮ末端側消化断片の解析結果は、ＧＰＩｂαのアミノ酸配列Ｔｙｒ２７６〜Ｇｌｕ２８２がＹ１７及びＹ１結合のための重要な認識モチーフであることを示唆する。Ｙ１７は血小板凝集を阻害しないので、Ｙ１とＹ１７は同じ配列にではなく重複した配列に結合する模様である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
［１２１．］ 図１はＧＰＩｂのα鎖上の、エンドプロテアーゼ類による切断部位を示す。
【図２】
［１２２．］ 図２は還元及び非還元条件下での血小板へのＹ１及びＹ１７の結合を示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図３】
［１２３．］ 図３はＹ１のエピトープへの結合に関する最適決定基の概要である。
【図４】
［１２４．］ 図４はＯ−シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼで血小板ＧＰＩｂを切断するとＹ１、Ｙ１７両方が結合しなくなることを示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図５】
［１２５．］ 図５はＹ１とＹ１７がＯ−シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼによる切断後の類似のグリコカリシン断片に結合することを示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図６】
［１２６．］ 図６はＧＰＩｂの特異的タンパク質分解によりＹ１が血小板に結合しなくなることを示すＦＡＣＳ解析の結果である。
【図７】
［１２７．］ 図７はモカラギン切断後の血小板ＧＰＩｂαのＮ末端側断片（Ｈｉｓ１−Ｇｌｕ２８２）へのＹ１の結合を示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図８】
［１２８．］ 図８はモカラギン切断後のグリコカリシンへのＹ１とＹ１７の結合を示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図９】
［１２９．］ 図９は血小板へのＹ１とＹ１７の結合を示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図１０】
［１３０．］ 図１０はフィシン（Ｆｉｃｉｎ）分解後のグリコカリシンにＹ１とＹ１７が同様に結合することを示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図１１】
［１３１．］ 図１１はＹ１がＧＰＩｂａαのカテプシンＧ切断で生成した大きいほうの断片と反応することを示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図１２】
［１３２．］ 図１２はＹ１とＹ１７がＧＰＩｂａαのカテプシンＧ切断で生成した大きいほうの断片と反応することを示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図１３】
［１３３．］ 図１３はグリコカリシンをモカラギンとカテプシンＧで切断するとＹ１が結合しなくなることを示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図１４】
［１３４．］ 図１４はモカラギンとカテプシンＧで切断した洗浄血小板溶解物へのＹ１とＹ１７の結合を示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図１５】
［１３５．］ 図１５は洗浄血小板の凝集反応のＹ１−ｓｃＦｖによる阻害を示すグラフである。
【図１６】
［１３６．］ 図１６は多血小板血漿中の血小板凝集のＹ１−ｓｃＦｖによる阻害を示すグラフである。
【図１７】
［１３７．］ 図１７は洗浄血小板の凝集反応のＹ１−ＩｇＧによる誘発を示すグラフである。
【図１８】
［１３８．］ 図１８は多血小板血漿中の血小板凝集のＹ１−ＩｇＧによる誘発を示すグラフである。
【図１９】
［１３９．］ 図１９はＥＬＩＳＡ法の結果である。
【図２０】
［１４０．］ 図２０はＹ１及びα−ＣＤ４２ （Ｎ１−１９）の、それぞれのリガンドへの結合の特異性を示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図２１】
［１４１．］ 図２１は免疫沈降法とＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製したＫＧ−１細胞膜上のＹ１−リガンドとのＹ１の反応性を示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図２２】
［１４２．］ 図２２はＹ１結合へのＯ−シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼ切断の効果を示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図２３】
［１４３．］ 図２３はＲＰ−ＨＰＬＣ精製ＫＧ−１細胞溶解物及びヘパリン−ＢＳＡへのＹ１結合へのアリールスルファターゼ切断の効果を示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図２４】
［１４４．］ 図２４はＹ１結合の特異性の解析に使用した免疫沈降法の概要であり、その解析結果はＦＩＧ．Ｔａｂ ２Ａ， ｐ． １７Ｂに示す。
【図２５】
［１４５．］ 図２５はＹ１及び抗ＣＤ１６２抗体の、ＡＭＬ患者由来細胞及び正常血液由来細胞への結合を比較したウェスタンブロット解析の結果である。
【図２６】
［１４６．］ 図２６は抗体ＫＰＬ１、ＰＬ１及びＰＬ２のＹ１との競合的結合能を示すＦＡＣＳ解析の結果である。
【図２７】
［１４７．］ 図２７はＹ１結合の特異性を示すＦＡＣＳ解析の結果である。
【図２８】
［１４８．］ 図２８もまたＹ１結合の特異性を示すＦＡＣＳ解析の結果である。
【図２９】
［１４９．］ 図２９は各種ペプチドの存在下でのＹ１結合阻害率を示すグラフである。
【図３０】
［１５０．］ 図３０は異なる処置群のマウスの肝重量を示すグラフである。
【図３１】
図３１は異なる処置群のマウスの骨髄中ＭＯＬＴ細胞率を示すグラフである。
【図３２】
［１５１．］ 図３２は異なる処置群のマウスの血中ＭＯＬＴ細胞率を示すグラフである。
【図３３】
［１５２．］ 図３３は３５日目のマウス肝重量（平均±ＳＥＭ）を示すグラフである。
【図３４】
［１５３．］ 図３４は３５日目のマウス肝重量（平均±ＳＥＭ）を示すグラフである。
【図３５】
［１５４．］ 図３５は処置の生存効果を示すグラフである。
【図３６】
［１５５．］ 図３６は異なる処置群の白血病発生率を示すグラフである。
【図３７】
［１５６．］ 図３７は異なる処置群の血中ＫＧ−１細胞率を示すグラフである。
【図３８】
［１５７．］ 図３８は実験動物の骨髄中ＫＧ−１細胞率を示すグラフである。
【図３９】
［１５８．］ 図３９はマウスへの^１２５Ｉ−ＣＯＮＹ１静注後の血漿中ＴＣＡ沈殿放射能の薬物動態を示すグラフである。ＣＯＮＹ１の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０４として示す。
【図４０】
［１５９．］ 図４０はマウスへの^１２５Ｉ−ＣＯＮＹ１静注後の種々の器官／組織の比放射能を示すグラフである。
【図４１】
［１６０．］ 図４１はマウスへの^１２５Ｉ−ＣＯＮＹ１静注後の種々の器官／組織の放射能分布を示すグラフである。
【図４２】
［１６１．］ 図４２はＹ１−ｃｙｓ−ｋａｋのＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラム溶出プロフィールである。
【図４３】
［１６２．］ 図４３は還元、非還元条件下での単量体と二量体のサイズ比較である。
【図４４】
［１６３．］ 図４４はＩｇＧ−Ｙ１分子とｓｃＦｖ−Ｙ１の結合レベルの比較を示すＦＡＣＳ解析結果である。
【図４５】
［１６４．］ 図４５はＹ１及び他抗体の、天然ヒト血小板由来グリコカリシン及びＥ． ｃｏｌｉ産生組換えグリコカリシンへの結合レベルを示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図４６】
［１６５．］ 図４６はＹ１単量体、Ｙ１ ｓｃＦｖ （ＣＯＮＹ１）及びＹ１ ＩｇＧの結合比較である。
【図４７】
［１６６．］ 図４７はＹ１ジスルフィド結合二量体とＹ１ ｓｃＦｖ （ＣＯＮＹ１）の結合比較である。
【図４８】
［１６７．］ 図４８はＹ１−ＩｇＧの重鎖（ＨＣ）と軽鎖（ＬＣ）のアミノ酸／ヌクレオチド配列である。Ｙ１−ＨＣのヌクレオチド配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０５）、Ｙ１−ＨＣのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０６）、Ｙ１−ＬＣのヌクレオチド配列のＯＲＦ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０７）及びＹ１−ＬＣのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０８）を示す。
【図４９】
［１６８．］ 図４９はＴＭ１のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０９）である。
【図５０】
［１６９．］ 図５０はＹ１６ ｓｃＦｖのアミノ酸／ヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１０）である。
【図５１】
［１７０．］ 図５１はＹ１ Ｂｉｏｔａｇのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１１）である。
【図５２】
［１７１．］ 図５２はＹ１−ｃｙｓ−ｋａｋ ｓｃＦｖのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１２）である。

Claims (323)

1. 以下の式：
   

   

   （式中、
   Ｗは、アスパラギン酸とグルタミン酸とを除く任意のアミノ酸であり、
   Ｙは、硫酸化可能な任意の天然部分であり、
   Ｐは、
   

   

   であり、
   Ｓは、スルフェート又は硫酸化分子であり、
   Ｘは、任意のアミノ酸であり、但しアスパラギン酸、グルタミン酸又はチロシンを除く、
   Ａは、任意の負荷電アミノ酸、もしくはロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、セリン又はグリシンであり、
   ｑは、１〜６であり、
   ｚは、０、１又は２であり、
   ｒは、０又は１であり、
   ｔは、１、２又は３であり、
   ｕは、０〜２であり、
   ｎは、０〜３であり、
   ｍは、０〜３
   であり、ここで、ｎ＝０ならばｍ＞０； ｍ＝０ならばｎ＞０； ｑ＝１ならばｒ＝１であり、またｑ＞１ならば１以上のＹが硫酸化している； さらに、単離エピトープには抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む第１超可変領域をもつ抗体、断片又は複合体が結合しうる。）
   を含む単離エピトープ。
2. 硫酸化部分がペプチドコンジュゲート又はグリココンジュゲート又はリポコンジュゲートである、請求項１の単離エピトープ。
3. Ｗがグリシンであり、Ｙがチロシンのペプチドコンジュゲートもしくはアスパラギン、セリン又はトレオニンのグリココンジュゲートであり、Ａがグルタミン酸、γカルボキシグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、ｑが１、２又は３である、請求項１の単離エピトープ。
4. Ｙがチロシンのペプチドコンジュゲートであり、ｑが３であり、ｒが１である、請求項３の単離エピトープ。
5. 以下の式：
   

   

   （式中、
   Ｗは、アスパラギン酸とグルタミン酸とを除く任意のアミノ酸であり、
   Ｙは、硫酸化可能な任意の天然部分であり、
   Ｐは、
   

   

   であり、
   Ｓは、スルフェート又は硫酸化分子であり、
   Ｘは、任意のアミノ酸であり、但し、アスパラギン酸、グルタミン酸又はチロシンを除く、
   Ａは、任意の負荷電アミノ酸、もしくはロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、セリン又はグリシンであり、
   ｚは、０、１又は２であり、
   ｒは、０又は１であり、
   ｔは、１、２又は３であり、
   ｕは、０〜２であり、
   ｎは、０〜３であり、
   ｍは、０〜３
   であるが、ここでｎ＝０ならばｍ＞０； ｍ＝０ならばｎ＞０である； １以上のＹが硫酸化している； さらに、単離エピトープにはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む第１超可変領域をもつ抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体が結合しうる。）
   を含む単離エピトープ。
6. 硫酸化部分がペプチドコンジュゲート又はグリココンジュゲート又はリポコンジュゲートである、請求項５の単離エピトープ。
7. Ｗがグリシンであり、Ｙがチロシンのペプチドコンジュゲートもしくはアスパラギン、セリン又はトレオニンのグリココンジュゲートであり、Ａがグルタミン酸、γカルボキシグルタミン酸又はアスパラギン酸、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、セリン又はグリシンである、請求項５の単離エピトープ。
8. Ｙがチロシンのペプチドコンジュゲートであり、ｑが３であり、ｒが１である、請求項７の単離エピトープ。
9. 以下の式：
   

   

   （式中、
   Ｇは、グリシンであり、
   Ｅは、グルタミン酸であり、
   Ｄは、アスパラギン酸であり、
   Ｙは、チロシンであり、
   Ｓは、スルフェート又は硫酸分子であり、
   Ｘは、前記以外の任意のアミノ酸であり、
   ｚは、０、１又は２であり、
   ｔは、１、２又は３であり、
   ｒは、０又は１であり、
   ｕは、０〜２であり、
   ｎは、０〜３であり、
   ｍは、０〜３
   であるが、ここで、１以上のＹが硫酸化している； ｎ＝０ならばｍ＞０； ｍ＝０ならばｎ＞０；さらに、単離エピトープにはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む第１超可変領域をもつ抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体が結合しうる。）
   を含む単離エピトープ。
10. ｒが１である、請求項９の単離エピトープ。
11. 硫酸化Ｙでありうる天然部分が脂質、糖質、ペプチド、糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、及び／又はリポ多糖分子を含む、請求項１〜８のいずれか１項の単離エピトープ。
12. 請求項１〜１０のいずれか１項の単離エピトープの同族体又は模倣体。
13. 硫酸化に加えて１以上の翻訳後修飾を含む、請求項１〜１０のいずれか１項の単離エピトープ。
14. 請求項１〜１０のいずれか１項の単離エピトープを含む組成物。
15. エピトープの結合能を改善することができる上流又は下流領域をさらに含む、請求項１４の組成物。
16. 上流又は下流領域がエピトープに隣接する、請求項１５の組成物。
17. 請求項１〜１０のいずれか１項の単離エピトープの少なくとも一部分をコードする単離ヌクレオチド。
18. 請求項１の単離エピトープと結合又は交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
19. 請求項５の単離エピトープと結合又は交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
20. 請求項９の単離エピトープと結合又は交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
21. 請求項２〜４、６〜８又は１０〜１３のいずれか１項の単離エピトープと結合又は交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
22. 請求項１〜１３のいずれか１項の単離エピトープと結合又は交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を生産する方法であって、
    （ａ） ファージ・ディスプレイ・ライブラリーを準備する；
    （ｂ） 請求項１〜１３のいずれか１項の単離エピトープを準備する；
    （ｃ） ファージ・ディスプレイ・ライブラリーをパニングして、該単離エピトープと結合しうるオリゴペプチド又はポリペプチドを提示するファージ粒子を選び出す； 及び
    （ｄ） 該単離エピトープと結合しうる該オリゴペプチド又はポリペプチドを含む抗体、その結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を生産する
    ステップを含む方法。
23. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０３のｓｃＦｖ抗体断片の結合能を有する抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
24. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む第１超可変領域をもつことを特徴とするペプチド又はポリペプチドの結合能を有する抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
25. ペプチド又はポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５を含む第２超可変領域及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４を含む第３超可変領域をもつことをさらなる特徴とする、請求項２３〜２４のいずれか１項の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
26. ２以上の酸性アミノ酸と１以上の硫酸化チロシンとを含むおよそ３〜１２６アミノ酸残基の長さのペプチドエピトープ又はポリペプチドエピトープに結合しうる抗体、抗体結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
27. エピトープがさらにプロリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、グリシン又はフェニルアラニン残基を含むことを特徴とする、請求項２６の抗体、抗体結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
28. 抗体又はその抗原結合性断片がさらに糖質、ペプチド、糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質及び／又はリポ多糖分子上のエピトープに結合しうることを特徴とする、請求項２３〜２７のいずれか１項の抗体、抗体結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
29. 糖質、ペプチド、糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質及び／又はリポ多糖分子上のエピトープが１以上の硫酸化部分を含むことをさらなる特徴とする、請求項２８の抗体、抗体結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
30. ＰＳＧＬ−１、フィブリノゲンγ’、ＧＰＩｂα、ヘパリン、ルミカン、補体複合体４（ＣＣ４）、インターαインヒビター及びプロトロンビンからなる群より選択される２以上の異なる分子に結合しうる抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
31. ＰＳＧＬ−１、フィブリノゲンγ’、ＧＰＩｂα、ヘパリン、ルミカン、補体複合体４（ＣＣ４）、インターαインヒビター及びプロトロンビンからなる群より選択される２以上の異なる分子に結合し、かつＢ−ＣＬＬ細胞、ＡＭＬ細胞、多発性骨髄腫細胞及び転移性細胞からなる群より選択される１以上の細胞型にも結合しうる抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
32. ＰＳＧＬ−１、フィブリノゲンγ’、ＧＰＩｂα及びヘパリンの各々に結合しうる、請求項３１の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
33. ＰＳＧＬ−１、フィブリノゲンγ’、ＧＰＩｂα及びヘパリンの各々に結合し、かつＢ−ＣＬＬ細胞、ＡＭＬ細胞、多発性骨髄腫細胞及び転移性細胞からなる群より選択される１以上の細胞型にも結合しうる、請求項３２の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
34. ＰＳＧＬ−１、フィブリノゲンγ’、ＧＰＩｂα、ヘパリン、ルミカン、補体複合体４（ＣＣ４）、インターαインヒビター及びプロトロンビンからなる群より選択される２以上の異なる分子に結合し、かつさらに脂質、糖質、ペプチド、糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質及び／又はリポ多糖分子上のエピトープにも結合しうる抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
35. 脂質、糖質、ペプチド、糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質及び／又はリポ多糖分子上のエピトープが１以上の硫酸化部分を含むことを特徴とする、請求項３４の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
36. ２以上のエピトープすなわち各々１つ又は複数の硫酸化チロシン残基と２以上の酸性アミノ酸からなる１以上のクラスターとを含む２以上のエピトープと交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
37. ＰＳＧＬ−１と交差反応しうる、請求項３６の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
38. １以上の硫酸化チロシン残基を含むＱＡＴＥＹＥＹＬＤＹ ＤＦＬＰＥＴＥに結合する、請求項３７の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
39. ＧＢ１ｂ−αと交差反応しうる、請求項３６の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
40. １以上の硫酸化チロシン残基を含むＤＥＧＤＴＤＬＹ ＤＹＹＰＥＥＤＴＥＧＤに結合する、請求項３６の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
41. １以上の硫酸化チロシン残基を含むＴＤＬＹＤＹＹ ＰＥＥＤＴＥに結合する、請求項３９の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
42. １以上の硫酸化チロシン残基を含むＧＤＥＧＤＴＤ ＬＹＤＹＹＰに結合する、請求項３９の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
43. １以上の硫酸化チロシン残基を含むＹＤＹＹＰＥＥに結合する、請求項３９の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
44. １以上の硫酸化チロシン残基を含むＴＤＬＹＤＹＹＰに結合する、請求項３９の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
45. フィブリノゲンγ’と交差反応しうる、請求項３６の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
46. １以上の硫酸化チロシン残基を含むＥＰＨＡＥＴＥ ＹＤＳＬＹＰＥＤに結合する、請求項４５の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
47. ヘパリンと交差反応しうる、請求項３６の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
48. 補体複合体４（ＣＣ４） と交差反応しうる、請求項３６の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
49. １以上の硫酸化チロシン残基を含むＭＥＡＮＥＤＹＥＤ ＹＥＹＤＥＬＰＡＫに結合する、請求項４８の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
50. Ｂ−ＣＬＬ細胞、ＡＭＬ細胞、多発性骨髄腫細胞及び転移性細胞からなる群より選択される１以上の細胞型と交差反応しうる、請求項３６の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
51. 細胞ローリングを阻害しうる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
52. 炎症を阻害しうる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
53. 自己免疫疾患を阻害しうる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
54. 血栓症を阻害しうる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
55. 再狭窄を阻害しうる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
56. 転移を阻害しうる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
57. 腫瘍細胞の成長及び／又は複製を阻害しうる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
58. 腫瘍細胞の死亡率を高めうる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
59. 白血病細胞の成長及び／又は複製を阻害しうる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
60. 白血病細胞の死亡率を高めうる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
61. 抗疾病薬による傷害への病変細胞の感受性を増進しうる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
62. 抗がん薬による傷害への腫瘍細胞の感受性を増進しうる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
63. 抗白血病薬による傷害への白血病の感受性を増進しうる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
64. 腫瘍患者の腫瘍細胞数の増加を阻害しうる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
65. がん患者の腫瘍細胞数を減少させうる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
66. 白血病患者の白血病細胞数の増加を阻害しうる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
67. 白血病患者の白血病細胞数を減少させうる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
68. 細胞−細胞、細胞−マトリックス、血小板−マトリックス、血小板−血小板及び／又は細胞−血小板間の複合体形成を阻害しうる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
69. 細胞−細胞、細胞−マトリックス、血小板−マトリックス、血小板−血小板及び／又は細胞−血小板間の接着を阻害しうる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
70. 細胞−細胞、細胞−マトリックス、血小板−マトリックス、血小板−血小板及び／又は細胞−血小板間の凝集を阻害しうる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
71. 抗がん薬、抗転移薬、抗白血病薬、抗疾病薬、抗接着薬、抗血栓薬、抗再狭窄薬、抗自己免疫薬、抗凝集薬、抗菌薬、抗ウイルス薬及び抗炎症薬からなる群より選択される薬剤と複合又は結合した請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
72. 薬剤がアシクロビル、ガンシクロビル及びジドブジンからなる群より選択される抗ウイルス薬であることを特徴とする、請求項７１に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
73. 薬剤がシロスタゾール、ダルテパリンナトリウム、レビパリンナトリウム及びアスピリンからなる群より選択される抗血栓／再狭窄薬であることを特徴とする、請求項７１に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
74. 薬剤がザルトプロフェン、プラノプロフェン、ドロキシカム、ａｃｅｔｙｌ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ １７、ジクロフェナク、イブプロフェン、デキシブプロフェン、スリンダク、ナプロキセン、アムトルメチン、セレコキシブ、インドメタシン、ロフェコキシブ及びニメスリドからなる群より選択される抗炎症薬であることを特徴とする、請求項７１に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
75. 薬剤がレフルノマイド、デニロイキンジフチトクス（ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ ｄｉｆｔｉｔｏｘ）、スブロイム（ｓｕｂｒｅｕｍ）、ＷｉｎＲｈｏ ＳＤＦ、デフィブロチド及びシクロホスファミドからなる群より選択される抗自己免疫薬であることを特徴とする、請求項７１に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
76. 薬剤がリマプロスト、クロルクロメン及びヒアルロン酸からなる群より選択される抗接着／抗凝集薬であることを特徴とする、請求項７１に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
77. 薬剤が毒素、放射性同位体及び治療薬からなる群より選択されることを特徴とする、請求項７１に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
78. 毒素がｇｅｌｏｎｉｎ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）、ＰＥ４０、ＰＥ３８、リシン（ｒｉｃｉｎ）、及びそれらの修飾体、誘導体からなる群より選択されることを特徴とする、請求項７７に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
79. 放射性同位体がγ放出体、陽電子放出核、Ｘ線放出体、β放出体及びα放出体からなる群より選択されることを特徴とする請求項７７に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
80. 放射性同位体が^１１１インジウム、^１１３インジウム、^９９ｍレニウム、^１０５レニウム、^１０１レニウム、^９９ｍテクネチウム、^１２１ｍテルル、^１２２ｍテルル、^１２５ｍテルル、^１６５ツリウム、^１６７ツリウム、^１６８ツリウム、^１２３ヨウ素、^１２６ヨウ素、^１３１ヨウ素、^１３３ヨウ素、^８１ｍクリプトン、^３３キセノン、^９０イットリウム、^２１３ビスマス、^７７臭素、^１８フッ素、^９５ルテニウム、^９７ルテニウム、^１０３ルテニウム、^１０５ルテニウム、^１０７水銀、^２０３水銀、^６７ガリウム及び^６８ガリウムからなる群より選択されることを特徴とする、請求項７７に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
81. 治療薬がドキソルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビシン（モルホリノドキソルビシン）、アドリアマイシン、シスプラチン、タキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンα、ヒドロキシウレア、テモゾロマイド、サリドマイド及びブレオマイシン、及びその誘導体・組合せからなる群より選択されることを特徴とする、請求項７７に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
82. １つ又は複数の薬剤との結合又は複合が可能な基剤又は担体と結合又は複合した請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
83. 基剤又は担体がデキストラン、親油性ポリマー、ＨＰＭＡ及びリポソームからなる群より選択されることを特徴とする請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
84. 放射性同位体又は又は他の造影剤と結合又は複合した請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
85. 請求項８４に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を含む診断キット。
86. 請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、細胞ローリングを阻害する有効量含有する製剤組成物。
87. 請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、炎症を阻害する有効量含有する製剤組成物。
88. 請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、自己免疫疾患を阻害する有効量含有する製剤組成物。
89. 請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、血栓症を阻害する有効量含有する製剤組成物。
90. 請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、再狭窄を阻害する有効量含有する製剤組成物。
91. 請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、転移を阻害する有効量含有する製剤組成物。
92. 請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、腫瘍細胞の成長及び／又は複製を阻害する有効量含有する製剤組成物。
93. 請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、腫瘍細胞の死亡率を高める有効量含有する製剤組成物。
94. 請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、白血病細胞の成長及び／又は複製を阻害する有効量含有する製剤組成物。
95. 請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、白血病細胞の死亡率を高める有効量含有する製剤組成物。
96. 請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、抗疾病薬による傷害への病変細胞の感受性を増進する有効量含有する製剤組成物。
97. 請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、抗がん薬による傷害への腫瘍細胞の感受性を増進する有効量含有する製剤組成物。
98. 請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、抗白血病薬による傷害への白血病の感受性を増進する有効量含有する製剤組成物。
99. 請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、腫瘍患者の腫瘍細胞数の増加を阻害する有効量含有する製剤組成物。
100. 請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、腫瘍患者の腫瘍細胞数を減少させる有効量含有する製剤組成物。
101. 請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、白血病患者の白血病細胞数の増加を阻害する有効量含有する製剤組成物。
102. 請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、白血病患者の白血病細胞数を減少させる有効量含有する製剤組成物。
103. 請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、細胞−細胞、細胞−マトリックス、血小板−マトリックス、血小板−血小板及び／又は細胞−血小板間の凝集を阻害する有効量含有する製剤組成物。
104. 請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、細胞−細胞、細胞−マトリックス、血小板−マトリックス、血小板−血小板及び／又は細胞−血小板間の複合体形成を阻害する有効量含有する製剤組成物。
105. 請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、細胞−細胞、細胞−マトリックス、血小板−マトリックス、血小板−血小板及び／又は細胞−血小板間の接着を阻害する有効量含有する製剤組成物。
106. 抗がん薬、抗転移薬、抗白血病薬、抗疾病薬、抗接着薬、抗血栓薬、抗再狭窄薬、抗自己免疫薬、抗凝集薬、抗菌薬、抗ウイルス薬及び抗炎症薬からなる群より選択される薬剤と複合又は結合した請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を含有する製剤組成物。
107. 薬剤がアシクロビル、ガンシクロビル及びジドブジンからなる群より選択される抗ウイルス薬であることを特徴とする、請求項１０６に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を含有する製剤組成物。
108. 薬剤がシロスタゾール、ダルテパリンナトリウム、レビパリンナトリウム及びアスピリンからなる群より選択される抗血栓／再狭窄薬であることを特徴とする、請求項１０６に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を含有する製剤組成物。
109. 薬剤がザルトプロフェン、プラノプロフェン、ドロキシカム、ａｃｅｔｙｌ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ １７、ジクロフェナク、イブプロフェン、デキシブプロフェン、スリンダク、ナプロキセン、アムトルメチン、セレコキシブ、インドメタシン、ロフェコキシブ及びニメスリドからなる群より選択される抗炎症薬であることを特徴とする、請求項１０６に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を含有する製剤組成物。
110. 薬剤がレフルノマイド、デニロイキンジフチトクス（ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ ｄｉｆｔｉｔｏｘ）、スブロイム（ｓｕｂｒｅｕｍ）、ＷｉｎＲｈｏ ＳＤＦ、デフィブロチド及びシクロホスファミドからなる群より選択される抗自己免疫薬であることを特徴とする、請求項１０６に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を含有する製剤組成物。
111. 薬剤がリマプロスト、クロルクロメン及びヒアルロン酸からなる群より選択される抗接着／抗凝集薬であることを特徴とする、請求項１０６に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を含有する製剤組成物。
112. 薬剤が毒素、放射性同位体及び治療薬からなる群より選択される、請求項１０６に記載の製剤組成物。
113. 毒素がｇｅｌｏｎｉｎ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）、ＰＥ４０、ＰＥ３８、リシン（ｒｉｃｉｎ）、及びそれらの修飾体、誘導体からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１０６に記載の製剤組成物。
114. 放射性同位体がγ放出体、陽電子放出核、Ｘ線放出体、β放出体及びα放出体からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１０６に記載の製剤組成物。
115. 放射性同位体が^１１１インジウム、^１１３インジウム、^９９ｍレニウム、^１０５レニウム、^１０１レニウム、^９９ｍテクネチウム、^１２１ｍテルル、^１２２ｍテルル、^１２５ｍテルル、^１６５ツリウム、^１６７ツリウム、^１６８ツリウム、^１２３ヨウ素、^１２６ヨウ素、^１３１ヨウ素、^１３３ヨウ素、^８１ｍクリプトン、^３３キセノン、^９０イットリウム、^２１３ビスマス、^７７臭素、^１８フッ素、^９５ルテニウム、^９７ルテニウム、^１０３ルテニウム、^１０５ルテニウム、^１０７水銀、^２０３水銀、^６７ガリウム及び^６８ガリウムからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１０６に記載の製剤組成物。
116. 治療薬がドキソルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビシン（モルホリノドキソルビシン）、アドリアマイシン、シスプラチン、タキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンα、ヒドロキシウレア、テモゾロマイド、サリドマイド及びブレオマイシン、及びその誘導体・組合せからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１０６に記載の製剤組成物。
117. １つ又は複数の薬剤との結合又は複合が可能な基剤又は担体と結合又は複合した請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を含有する製剤組成物。
118. 基剤又は担体がデキストラン、親油性ポリマー、ＨＰＭＡ及びリポソームからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１１７に記載の製剤組成物。
119. 細胞ローリングを阻害しうる医薬の製造への、請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
120. 炎症を阻害しうる医薬の製造への、請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
121. 自己免疫疾患を阻害しうる医薬の製造への、請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
122. 再狭窄を阻害しうる医薬の製造への、請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
123. 血栓症を阻害しうる医薬の製造への、請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
124. 転移を阻害しうる医薬の製造への、請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
125. 腫瘍細胞の成長及び／又は複製を阻害しうる医薬の製造への、請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
126. 腫瘍細胞の死亡率を高めうる医薬の製造への、請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
127. 白血病細胞の成長及び／又は複製を阻害しうる医薬の製造への、請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
128. 白血病細胞の死亡率を高めうる医薬の使用への、請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体使用。
129. 抗疾病薬による傷害への病変細胞の感受性を増進しうる医薬の製造への、請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
130. 抗がん薬による傷害への腫瘍細胞の感受性を増進しうる医薬の製造への、請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
131. 抗白血病薬による傷害への白血病の感受性を増進しうる医薬の製造への、請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
132. 腫瘍患者の腫瘍細胞数の増加を阻害しうる医薬の製造への、請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
133. 腫瘍患者の腫瘍細胞数を減少させうる医薬の製造への、請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
134. 白血病患者の白血病細胞数の増加を阻害しうる医薬の製造への、請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
135. 白血病患者の白血病細胞数を減少させうる医薬の製造への、請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
136. 細胞−細胞、細胞−マトリックス、血小板−マトリックス、血小板−血小板及び／又は細胞−血小板間の複合体形成を阻害しうる医薬の製造への、請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
137. 細胞−細胞、細胞−マトリックス、血小板−マトリックス、血小板−血小板及び／又は細胞−血小板間の凝集を阻害しうる医薬の製造への、請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
138. 細胞−細胞、細胞−マトリックス、血小板−マトリックス、血小板−血小板及び／又は細胞−血小板間の接着を阻害しうる医薬の製造への、請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
139. 抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を抗がん薬、抗転移薬、抗白血病薬、抗疾病薬、抗接着薬、抗血栓薬、抗再狭窄薬、抗自己免疫薬、抗凝集薬、抗菌薬、抗ウイルス薬及び抗炎症薬からなる群より選択される薬剤と複合又は結合することを特徴とする、請求項１１９〜１３８のいずれか１項の方法。
140. 薬剤がアシクロビル、ガンシクロビル及びジドブジンからなる群より選択される抗ウイルス薬であることを特徴とする、請求項１３９の方法。
141. 薬剤がシロスタゾール、ダルテパリンナトリウム、レビパリンナトリウム及びアスピリンからなる群より選択される抗血栓／再狭窄薬であることを特徴とする、請求項１３９の方法。
142. 薬剤がザルトプロフェン、プラノプロフェン、ドロキシカム、ａｃｅｔｙｌ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ １７、ジクロフェナク、イブプロフェン、デキシブプロフェン、スリンダク、ナプロキセン、アムトルメチン、セレコキシブ、インドメタシン、ロフェコキシブ及びニメスリドからなる群より選択される抗炎症薬であることを特徴とする、請求項１３９の方法。
143. 薬剤がレフルノマイド、デニロイキンジフチトクス（ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ ｄｉｆｔｉｔｏｘ）、スブロイム（ｓｕｂｒｅｕｍ）、ＷｉｎＲｈｏ ＳＤＦ、デフィブロチド及びシクロホスファミドからなる群より選択される抗自己免疫薬であることを特徴とする、請求項１３９の方法。
144. 薬剤がリマプロスト、クロルクロメン及びヒアルロン酸からなる群より選択される抗接着／抗凝集薬であることを特徴とする、請求項１３９の方法。
145. 薬剤が毒素、放射性同位体及び治療薬からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１３９の方法。
146. 毒素がｇｅｌｏｎｉｎ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）、ＰＥ４０、ＰＥ３８、リシン（ｒｉｃｉｎ）、及びそれらの修飾体、誘導体からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１３９の方法。
147. 放射性同位体がγ放出体、陽電子放出核、Ｘ線放出体、β放出体及びα放出体からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１３９の方法。
148. 放射性同位体が^１１１インジウム、^１１３インジウム、^９９ｍレニウム、^１０５レニウム、^１０１レニウム、^９９ｍテクネチウム、^１２１ｍテルル、^１２２ｍテルル、^１２５ｍテルル、^１６５ツリウム、^１６７ツリウム、^１６８ツリウム、^１２３ヨウ素、^１２６ヨウ素、^１３１ヨウ素、^１３３ヨウ素、^８１ｍクリプトン、^３３キセノン、^９０イットリウム、^２１３ビスマス、^７７臭素、^１８フッ素、^９５ルテニウム、^９７ルテニウム、^１０３ルテニウム、^１０５ルテニウム、^１０７水銀、^２０３水銀、^６７ガリウム及び^６８ガリウムからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１３９の方法。
149. 治療薬がドキソルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビシン（モルホリノドキソルビシン）、アドリアマイシン、シスプラチン、タキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンα、ヒドロキシウレア、テモゾロマイド、サリドマイド及びブレオマイシン、及びその誘導体・組合せからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１３９の方法。
150. 抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、１つ又は複数の薬剤との結合又は複合が可能な基剤又は担体と結合又は複合させることを特徴とする、請求項１１９〜１３８のいずれか１項の方法。
151. 基剤又は担体がデキストラン、親油性ポリマー、ＨＰＭＡ及びリポソームからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１５０の方法。
152. 細胞ローリングを阻害しうる医薬として用いる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
153. 炎症を阻害しうる医薬として用いる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
154. 自己免疫疾患を阻害しうる医薬として用いる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
155. 再狭窄を阻害しうる医薬として用いる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
156. 血栓症を阻害しうる医薬として用いる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
157. 転移を阻害しうる医薬として用いる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
158. 腫瘍細胞の成長及び／又は複製を阻害しうる医薬として用いる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
159. 腫瘍細胞の死亡率を高めうる医薬として用いる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
160. 白血病細胞の成長及び／又は複製を阻害しうる医薬として用いる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
161. 白血病細胞の死亡率を高めうる医薬として用いる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
162. 抗疾病薬による傷害への病変細胞の感受性を増進しうる医薬として用いる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
163. 抗がん薬による傷害への腫瘍細胞の感受性を増進しうる医薬として用いる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
164. 抗白血病薬による傷害への白血病の感受性を増進しうる医薬として用いる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
165. 腫瘍患者の腫瘍細胞数の増加を阻害しうる医薬として用いる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
166. 腫瘍患者の腫瘍細胞数を減少させうる医薬として用いる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
167. 白血病患者の白血病細胞数の増加を阻害しうる医薬として用いる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
168. 白血病患者の白血病細胞数を減少させうる医薬として用いる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
169. 細胞−細胞、細胞−マトリックス、血小板−マトリックス、血小板−血小板及び／又は細胞−血小板間の複合体形成を阻害しうる医薬として用いる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
170. 細胞−細胞、細胞−マトリックス、血小板−マトリックス、血小板−血小板及び／又は細胞−血小板間の凝集を阻害しうる医薬として用いる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
171. 細胞−細胞、細胞−マトリックス、血小板−マトリックス、血小板−血小板及び／又は細胞−血小板間の接着を阻害しうる医薬として用いる請求項１８〜２０、２３又は２４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
172. 抗がん薬、抗転移薬、抗白血病薬、抗疾病薬、抗接着薬、抗血栓薬、抗再狭窄薬、抗自己免疫薬、抗凝集薬、抗菌薬、抗ウイルス薬及び抗炎症薬からなる群より選択される薬剤と複合又は結合した、請求項１５２〜１７１のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
173. 薬剤がアシクロビル、ガンシクロビル及びジドブジンからなる群より選択される抗ウイルス薬であることを特徴とする、請求項１７２の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
174. 薬剤がシロスタゾール、ダルテパリンナトリウム、レビパリンナトリウム及びアスピリンからなる群より選択される抗血栓／再狭窄薬であることを特徴とする、請求項１７２の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
175. 薬剤がザルトプロフェン、プラノプロフェン、ドロキシカム、ａｃｅｔｙｌ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ １７、ジクロフェナク、イブプロフェン、デキシブプロフェン、スリンダク、ナプロキセン、アムトルメチン、セレコキシブ、インドメタシン、ロフェコキシブ及びニメスリドからなる群より選択される抗炎症薬であることを特徴とする、請求項１７２の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
176. 薬剤がレフルノマイド、デニロイキンジフチトクス（ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ ｄｉｆｔｉｔｏｘ）、スブロイム（ｓｕｂｒｅｕｍ）、ＷｉｎＲｈｏ ＳＤＦ、デフィブロチド及びシクロホスファミドからなる群より選択される抗自己免疫薬であることを特徴とする、請求項１７２の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
177. 薬剤がリマプロスト、クロルクロメン及びヒアルロン酸からなる群より選択される抗接着／抗凝集薬であることを特徴とする、請求項１７２の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
178. 薬剤が毒素、放射性同位体及び治療薬からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１７２の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
179. 毒素がｇｅｌｏｎｉｎ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）、ＰＥ４０、ＰＥ３８、リシン（ｒｉｃｉｎ）、及びそれらの修飾体、誘導体からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１７２の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
180. 放射性同位体がγ放出体、陽電子放出核、Ｘ線放出体、β放出体及びα放出体からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１７２の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
181. 放射性同位体が^１１１インジウム、^１１３インジウム、^９９ｍレニウム、^１０５レニウム、^１０１レニウム、^９９ｍテクネチウム、^１２１ｍテルル、^１２２ｍテルル、^１２５ｍテルル、^１６５ツリウム、^１６７ツリウム、^１６８ツリウム、^１２３ヨウ素、^１２６ヨウ素、^１３１ヨウ素、^１３３ヨウ素、^８１ｍクリプトン、^３３キセノン、^９０イットリウム、^２１３ビスマス、^７７臭素、^１８フッ素、^９５ルテニウム、^９７ルテニウム、^１０３ルテニウム、^１０５ルテニウム、^１０７水銀、^２０３水銀、^６７ガリウム及び^６８ガリウムからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１７２の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
182. 治療薬がドキソルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビシン（モルホリノドキソルビシン）、アドリアマイシン、シスプラチン、タキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンα、ヒドロキシウレア、テモゾロマイド、サリドマイド及びブレオマイシン、及びその誘導体・組合せからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１７２の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
183. １つ又は複数の薬剤との結合又は複合が可能な基剤又は担体と結合又は複合した、請求項１５２〜１７１のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
184. 基剤又は担体がデキストラン、親油性ポリマー、ＨＰＭＡ及びリポソームからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１８３の抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
185. アミノ酸２７６、２７８及び２７９のうち少なくとも１つが硫酸化していることを特徴とするＧＰＩｂαアミノ酸配列Ｔｙｒ２７６〜Ｇｌｕ２８２を含む単離エピトープ。
186. ＧＰＩｂαアミノ酸２８３〜２８５をさらに含む、請求項１８５の単離エピトープ。
187. 請求項１８５のエピトープに結合しうる抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体であって、請求項１８５のエピトープがＧＰＩｂαアミノ酸２８３〜２８５をさらに含むときに該結合が増進されることを特徴とする抗体、その抗原結合性断片、又は１以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
188. 配列ＹＤＹＹＰＥＥのエピトープを含む見掛け分子質量約４０ｋＤａの単離ＧＰＩｂα Ｎ末端側ペプチドであって、該配列中１以上のチロシン残基が硫酸化していることを特徴とするペプチド。
189. アミノ酸１〜２８２からなり、アミノ酸２７６、２７８及び２７９のうち少なくとも１つが硫酸化している単離ＧＰＩｂαペプチド。
190. 少なくとも第１及び第２抗原結合性断片を含む抗体多量体であって、少なくとも第１又は第２抗原結合性断片が、もしくは両断片が以下の式：
     

     

     （式中、
     Ｗは、アスパラギン酸とグルタミン酸とを除く任意のアミノ酸であり、
     Ｙは、硫酸化可能な任意の天然部分であり、
     Ｐは、
     

     

     であり、
     Ｓは、スルフェート又は硫酸化分子であり、
     Ｘは、任意のアミノ酸であり、但し、ただしアスパラギン酸、グルタミン酸又はチロシンを除く、
     Ａは、任意の負荷電アミノ酸、もしくはロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、セリン又はグリシンであり、
     ｑは、１〜６であり、
     ｚは、０、１又は２であり、
     ｒは、０又は１であり、
     ｔは、１、２又は３であり、
     ｕは、０〜２であり、
     ｎは、０〜３であり、
     ｍは、０〜３
     であるが、ここで、ｎ＝０ならばｍ＞０； ｍ＝０ならばｎ＞０； ｑ＝１ならばｒ＝１であり、またｑ＞１ならば１以上のＹが硫酸化している。）
     を含むエピトープと結合又は交差反応しうることを特徴とする抗体多量体。
191. Ｗがグリシンであり、Ｙがチロシンのペプチドコンジュゲートもしくはアスパラギン、セリン又はトレオニンのグリココンジュゲートであり、Ａがグルタミン酸、γカルボキシグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、ｑが１、２又は３であるエピトープと第１又は第２抗原結合性断片が、もしくは両断片が結合又は交差反応することを特徴とする、請求項１９０の抗体多量体。
192. Ｙがチロシンのペプチドコンジュゲートであり、ｑが３であり、ｒが１であるエピトープと第１又は第２抗原結合性断片が、もしくは両断片が結合又は交差反応することを特徴とする、請求項１９０の抗体多量体。
193. 少なくとも第１及び第２抗原結合性断片を含む抗体多量体であって、第１又は第２抗原結合性断片が、もしくは両断片が以下の式：
     

     

     （式中、
     Ｗは、アスパラギン酸とグルタミン酸とを除く任意のアミノ酸であり、
     Ｙは、硫酸化可能な任意の天然部分であり、
     Ｐは、
     

     

     であり、
     Ｓは、スルフェート又は硫酸化分子であり、
     Ｘは、任意のアミノ酸であり、但し、アスパラギン酸、グルタミン酸又はチロシンを除く、
     Ａは、任意の負荷電アミノ酸、もしくはロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、セリン又はグリシンであり、
     ｚは、０、１又は２であり、
     ｒは、０又は１であり、
     ｔは、１、２又は３であり、
     ｕは、０〜２であり、
     ｎは、０〜３であり、
     ｍは、０〜３
     であるが、ここで、ｎ＝０ならばｍ＞０； ｍ＝０ならばｎ＞０である； １以上のＹが硫酸化している。）
     を含むエピトープと結合又は交差反応しうることを特徴とする抗体多量体。
194. Ｗがグリシンであり、Ｙがチロシンのペプチドコンジュゲートもしくはアスパラギン、セリン又はトレオニンのグリココンジュゲートであり、Ａがグルタミン酸、γカルボキシグルタミン酸又はアスパラギン酸、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、セリン又はグリシンであるエピトープと第１又は第２抗原結合性断片が、もしくは両断片が結合又は交差反応することを特徴とする、請求項１９３の抗体多量体。
195. Ｙがチロシンのペプチドコンジュゲートであり、ｑが３であり、ｒが１であるエピトープと第１又は第２抗原結合性断片が、もしくは両断片が結合又は交差反応することを特徴とする、請求項１９３の抗体多量体。
196. 少なくとも第１及び第２抗原結合性断片を含む抗体多量体であって、少なくとも第１又は第２抗原結合性断片が、もしくは両断片が以下の式：
     

     

     （式中、
     Ｇは、グリシンであり、
     Ｅは、グルタミン酸であり、
     Ｄは、アスパラギン酸であり、
     Ｙは、チロシンであり、
     Ｓは、スルフェート又は硫酸分子であり、
     Ｘは、前記以外の任意のアミノ酸であり、
     ｚは、０、１又は２であり、
     ｔは、１、２又は３であり、
     ｒは、０又は１であり、
     ｕは、０〜２であり、
     ｎは、０〜３であり、
     ｍは、０〜３
     であるが、ここで、１以上のＹが硫酸化している； ｎ＝０ならばｍ＞０； ｍ＝０ならばｎ＞０。）
     を含むエピトープと結合又は交差反応しうることを特徴とする抗体多量体。
197. ｒが１であるエピトープと第１又は第２抗原結合性断片が、もしくは両断片が結合又は交差反応することを特徴とする、請求項１９６の抗体多量体。
198. 二量体、三量体又は四量体である、請求項１９０、１９３又は１９６の抗体多量体。
199. 二量体である、請求項１９８の抗体多量体。
200. 第１及び第２抗原結合性断片のうち少なくとも１つがＹ１及びＹ１７のｓｃＦｖフラグメントより選択される、請求項１９９の二量体。
201. 第１及び第２抗原結合性断片がジスルフィド結合によって結合される、請求項１９９の二量体。
202. 第１及び第２抗原結合性断片がＹ１−Ｃｙｓ−ＫＡＫである、請求項２０１の二量体。
203. 第１及び第２抗原結合性断片が、５〜２０アミノ酸のポリペプチドリンカーによって結合される、請求項１９９の二量体。
204. ポリペプチドリンカーが５アミノ酸を含む、請求項２０３の二量体。
205. ポリペプチドリンカーがＧｌｙ_４Ｓｅｒである、請求項２０４の二量体。
206. 三量体である、請求項１９８の抗体多量体。
207. ３つの抗原結合性断片を含み、そのうち少なくとも１つはＹ１ ｓｃＦｖフラグメント又はＹ１７ ｓｃＦｖフラグメントである、請求項２０６の三量体。
208. 抗原結合性断片がポリペプチドリンカーによって結合される、請求項２０７の三量体。
209. ポリペプチドリンカーが１〜５アミノ酸を含む、請求項２０８の三量体。
210. 四量体である、請求項１９８の抗体多量体。
211. ４つの抗原結合性断片を含み、そのうち少なくとも１つはＹ１ ｓｃＦｖフラグメント又はＹ１７ ｓｃＦｖフラグメントである、請求項２１０の四量体。
212. 抗原結合性断片がポリペプチドリンカーによって結合される、請求項２１１の四量体。
213. ポリペプチドリンカーが１〜５アミノ酸を含む、請求項２１２の四量体。
214. ４つの抗原結合性断片がストレプトアビジン−ビオチン会合を介して複合体を形成する、請求項２１０の四量体。
215. 同一の抗原結合性断片を含む、請求項１９８の抗体多量体。
216. 少なくとも第１又は第２抗原結合性断片がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８を含む第１超可変領域をもつ、請求項１９８の抗体多量体。
217. 少なくとも第１又は第２抗原結合性断片が、もしくは両断片がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む第１超可変領域をもつ、請求項１９８の抗体多量体。
218. 少なくとも第１又は第２抗原結合性断片が、もしくは両断片がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５を含む第２超可変領域及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４を含む第３超可変領域及をもつ、請求項２１６又は２１７の抗体多量体。
219. ＰＳＧＬ−１、フィブリノゲンγ’、ＧＰＩｂα、ヘパリン、ルミカン、補体複合体４（ＣＣ４）、インターαインヒビター及びプロトロンビンからなる群より選択される２以上の異なる分子に結合しうる、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項の抗体多量体。
220. ＰＳＧＬ−１、フィブリノゲンγ’、ＧＰＩｂα、ヘパリン、ルミカン、補体複合体４（ＣＣ４）、インターαインヒビター及びプロトロンビンからなる群より選択される２以上の異なる分子に結合し、かつＢ−ＣＬＬ細胞、ＡＭＬ細胞、多発性骨髄腫細胞及び転移性細胞からなる群より選択される１以上の細胞型にも結合しうる、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項の抗体多量体。
221. 第１及び第２抗原結合性断片を含む抗体二量体であって、該第１又は第２抗原結合性断片が、もしくは両断片がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８ ［Ｙ１ ＣＤＲ３］のアミノ酸配列を含む超可変領域をもつことを特徴とする抗体二量体。
222. 第１及び第２抗原結合性断片を含む抗体二量体であって、該第１又は第２抗原結合性断片が、もしくは両断片がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０ ［Ｙ１７ ＣＤＲ３］のアミノ酸配列を含む超可変領域をもつことを特徴とする抗体二量体。
223. 第１又は第２抗原結合性断片が、もしくは両断片がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５を含む第２超可変領域及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４を含む第３超可変領域及をもつ、請求項２２１又は２２２の抗体二量体。
224. 第１及び第２抗原結合性断片を含む抗体多量体であって、該第１又は第２抗原結合性断片が、もしくは両断片が２以上のエピトープすなわち各々１つ又は複数の硫酸化チロシン残基と２以上の酸性アミノ酸からなる１以上のクラスターとを含む２以上のエピトープと交差反応しうることを特徴とする抗体多量体。
225. ＰＳＧＬ−１と交差反応しうる、請求項２２４の抗体多量体。
226. １以上の硫酸化チロシン残基を含むＱＡＴＥＹＥＹＬ ＤＹＤＦＬＰＥＴＥに結合する、請求項２２４の抗体多量体。
227. ＧＢ１ｂ−αと交差反応しうる、請求項２２４の抗体多量体。
228. １以上の硫酸化チロシン残基を含むＤＥＧＤＴＤＬＹ ＤＹＹＰＥＥＤＴＥＧＤに結合する、請求項２２４の抗体多量体。
229. １以上の硫酸化チロシン残基を含むＴＤＬＹＤＹＹＰ ＥＥＤＴＥに結合する、請求項２２４の抗体多量体。
230. １以上の硫酸化チロシン残基を含むＧＤＥＧＤＴＤ ＬＹＤＹＹＰに結合する、請求項２２４の抗体多量体。
231. １以上の硫酸化チロシン残基を含むＹＤＹＹＰＥＥに結合する、請求項２２４の抗体多量体。
232. １以上の硫酸化チロシン残基を含むＴＤＬＹＤＹＹＰに結合する、請求項２２４の抗体多量体。
233. フィブリノゲンγ’と交差反応しうる、請求項２２４の抗体多量体。
234. １以上の硫酸化チロシン残基を含むＥＰＨＡＥＴ ＥＹＤＳＬＹＰＥＤに結合する、請求項２３３の抗体複合体。
235. ヘパリンと交差反応しうる、請求項２２４抗体多量体。
236. 補体複合体４（ＣＣ４）と交差反応しうる、請求項２２４の抗体多量体。
237. Ｂ−ＣＬＬ細胞、ＡＭＬ細胞、多発性骨髄腫細胞及び転移性細胞からなる群より選択される１以上の細胞型と交差反応しうる、請求項２２４の抗体多量体。
238. 請求項１、４、７、２７及び２８のいずれか１項に記載の抗体多量体を含有する製剤組成物。
239. 腫瘍細胞の死亡率を高める又は腫瘍細胞の抗がん薬による傷害への感受性を高める有効量の抗体多量体を含有する、請求項２３８の製剤組成物。
240. 白血病細胞の成長及び／又は複製を阻害する有効量の抗体多量体を含有する、請求項２３８の製剤組成物。
241. 異常な細胞−細胞、細胞−マトリックス、血小板−マトリックス、血小板−血小板、及び／又は血小板−細胞間の接着を阻害する有効量の抗体多量体を含有する、請求項２３８の製剤組成物。
242. 病変細胞の抗疾病薬による傷害への感受性を高める有効量の抗体多量体を含有する、請求項２３８の製剤組成物。
243. 白血病細胞の死亡率を高める又は白血病細胞の抗白血病薬による傷害への感受性を高める有効量の抗体多量体を含有する、請求項２３８の製剤組成物。
244. 抗がん薬、抗転移薬、抗白血病薬、抗疾病薬、抗接着薬、抗血栓薬、抗再狭窄薬、抗自己免疫薬、抗凝集薬、抗菌薬、抗ウイルス薬及び抗炎症薬からなる群より選択される薬剤と複合又は結合した、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体を含有する製剤組成物。
245. 薬剤が毒素、放射性同位体及び治療薬からなる群より選択される、請求項２４４に記載の製剤組成物。
246. 薬剤がアシクロビル、ガンシクロビル及びジドブジンからなる群より選択される抗ウイルス薬である、請求項２４４の製剤組成物。
247. 薬剤がシロスタゾール、ダルテパリンナトリウム、レビパリンナトリウム及びアスピリンからなる群より選択される抗血栓／再狭窄薬である、請求項２４４の製剤組成物。
248. 薬剤がザルトプロフェン、プラノプロフェン、ドロキシカム、ａｃｅｔｙｌ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ １７、ジクロフェナク、イブプロフェン、デキシブプロフェン、スリンダク、ナプロキセン、アムトルメチン、セレコキシブ、インドメタシン、ロフェコキシブ及びニメスリドからなる群より選択される抗炎症薬である、請求項２４４の製剤組成物。
249. 薬剤がレフルノマイド、デニロイキンジフチトクス（ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ ｄｉｆｔｉｔｏｘ）、スブロイム（ｓｕｂｒｅｕｍ）、ＷｉｎＲｈｏ ＳＤＦ、デフィブロチド及びシクロホスファミドからなる群より選択される抗自己免疫薬である、請求項２４４の製剤組成物。
250. 薬剤がリマプロスト、クロルクロメン及びヒアルロン酸からなる群より選択される抗接着／抗凝集薬である、請求項２４４の製剤組成物。
251. 放射性同位体がγ放出体、陽電子放出核、Ｘ線放出体、β放出体及びα放出体からなる群より選択される、請求項２４５の製剤組成物。
252. 放射性同位体が^１１１インジウム、^１１３インジウム、^９９ｍレニウム、^１０５レニウム、^１０１レニウム、^９９ｍテクネチウム、^１２１ｍテルル、^１２２ｍテルル、^１２５ｍテルル、^１６５ツリウム、^１６７ツリウム、^１６８ツリウム、^１２３ヨウ素、^１２６ヨウ素、^１３１ヨウ素、^１３３ヨウ素、^８１ｍクリプトン、^３３キセノン、^９０イットリウム、^２１３ビスマス、^７７臭素、^１８フッ素、^９５ルテニウム、^９７ルテニウム、^１０３ルテニウム、^１０５ルテニウム、^１０７水銀、^２０３水銀、^６７ガリウム及び^６８ガリウムからなる群より選択される、請求項２５１の製剤組成物。
253. 治療薬がドキソルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビシン（モルホリノドキソルビシン）、アドリアマイシン、シスプラチン、タキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンα、ヒドロキシウレア、テモゾロマイド、サリドマイド及びブレオマイシン、並びにその誘導体及び組合せからなる群より選択される、請求項２４５の製剤組成物。
254. １つ又は複数の薬剤との結合又は複合が可能な基剤又は担体と結合又は複合した、請求項２４４の製剤組成物。
255. 基剤又は担体がデキストラン、親油性ポリマー、ＨＰＭＡ及びリポソームからなる群より選択される、請求項２５４の製剤組成物。
256. 細胞ローリングを阻害する有効量の抗体多量体を含有する、請求項２３８の製剤組成物。
257. 炎症を阻害する有効量の抗体多量体を含有する、請求項２３８の製剤組成物。
258. 自己免疫疾患を阻害する有効量の抗体多量体を含有する、請求項２３８の製剤組成物。
259. 血栓症を阻害する有効量の抗体多量体を含有する、請求項２３８の製剤組成物。
260. 再狭窄を阻害する有効量の抗体多量体を含有する、請求項２３８の製剤組成物。
261. 転移を阻害する有効量の抗体多量体を含有する、請求項２３８の製剤組成物。
262. 腫瘍細胞の成長及び／又は複製を阻害し、腫瘍細胞の死亡率を高め、又は腫瘍細胞の抗がん薬による傷害への感受性を高める有効量の抗体多量体を含有する、請求項２３８の製剤組成物。
263. 白血病細胞の成長及び／又は複製を阻害し、白血病細胞の死亡率を高め、又は白血病細胞の抗白血病薬による傷害への感受性を高める有効量の抗体多量体を含有する、請求項２３８の製剤組成物。
264. 病変細胞の抗疾病薬による傷害への感受性を高める有効量の抗体多量体を含有する、請求項２３８の製剤組成物。
265. 細胞−細胞、細胞−マトリックス、血小板−マトリックス、血小板−血小板、及び／又は細胞−血小板間の凝集、接着又は複合体形成を阻害する有効量の抗体多量体を含有する、請求項２３８の製剤組成物。
266. 抗がん薬、抗転移薬、抗白血病薬、抗疾病薬、抗接着薬、抗血栓薬、抗再狭窄薬、抗自己免疫薬、抗凝集薬、抗菌薬、抗ウイルス薬及び抗炎症薬からなる群より選択される薬剤と複合又は結合した、請求項２３８の製剤組成物。
267. 薬剤がアシクロビル、ガンシクロビル及びジドブジンからなる群より選択される抗ウイルス薬である、請求項２６６の製剤組成物。
268. 抗体多量体が１つ又は複数の薬剤との結合又は複合が可能な基剤又は担体と結合又は複合した、請求項２３８の製剤組成物。
269. 基剤又は担体がデキストラン、親油性ポリマー、ＨＰＭＡ及びリポソームからなる群より選択される、請求項２３８の製剤組成物。
270. 細胞ローリングを阻害する医薬の製造への、請求項１、４、７、２７及び２８のいずれか１項に記載の抗体多量体の使用。
271. 炎症を阻害する医薬の製造への、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体の使用。
272. 自己免疫疾患を阻害する医薬の製造への、請求項１、４、７、２７及び２８のいずれか１項に記載の抗体多量体の使用。
273. 再狭窄を阻害する医薬の製造への、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体の使用。
274. 血栓症を阻害する医薬の製造への、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体の使用。
275. 転移を阻害する医薬の製造への、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体の使用。
276. 腫瘍細胞の成長及び／又は複製を阻害する医薬の製造への、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体の使用。
277. 腫瘍細胞の死亡率を高める医薬の製造への、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体の使用。
278. 白血病細胞の成長及び／又は複製を阻害する医薬の製造への、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体の使用。
279. 白血病細胞の死亡率を高める医薬の製造への、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体の使用。
280. 病変細胞の抗疾病薬による傷害への感受性を高める医薬の製造への、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体の使用。
281. 腫瘍細胞の抗がん薬による傷害への感受性を高める医薬の製造への、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体の使用。
282. 白血病細胞の抗白血病薬による傷害への感受性を高める医薬の製造への、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体の使用。
283. 腫瘍患者の腫瘍細胞数の増加を阻害する医薬の製造への、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体の使用。
284. 腫瘍患者の腫瘍細胞数を減少させる医薬の製造への、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体の使用。
285. 白血病患者の白血病細胞数の増加を阻害する医薬の製造への、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体の使用。
286. 白血病患者の白血病細胞数を減少させる医薬の製造への、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体の使用。
287. 細胞−細胞、細胞−マトリックス、血小板−マトリックス、血小板−血小板、及び／又は細胞−血小板間の複合体形成を阻害する医薬の製造への、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体の使用。
288. 細胞−細胞、細胞−マトリックス、血小板−マトリックス、血小板−血小板、及び／又は細胞−血小板間の凝集を阻害する医薬の製造への、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体の使用。
289. 細胞−細胞、細胞−マトリックス、血小板−マトリックス、血小板−血小板、及び／又は細胞−血小板間の接着を阻害する医薬の製造への、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体の使用。
290. 抗体多量体を抗がん薬、抗転移薬、抗白血病薬、抗疾病薬、抗接着薬、抗血栓薬、抗再狭窄薬、抗自己免疫薬、抗凝集薬、抗菌薬、抗ウイルス薬及び抗炎症薬からなる群より選択される薬剤と複合又は結合させることを特徴とする請求項２７０〜２８９のいずれか１項の方法。
291. 薬剤がアシクロビル、ガンシクロビル及びジドブジンからなる群より選択される抗ウイルス薬であることを特徴とする、請求項２９０の方法。
292. 薬剤がシロスタゾール、ダルテパリンナトリウム、レビパリンナトリウム及びアスピリンからなる群より選択される抗血栓／再狭窄薬であることを特徴とする、請求項２９０の方法。
293. 薬剤がザルトプロフェン、プラノプロフェン、ドロキシカム、ａｃｅｔｙｌ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ １７、ジクロフェナク、イブプロフェン、デキシブプロフェン、スリンダク、ナプロキセン、アムトルメチン、セレコキシブ、インドメタシン、ロフェコキシブ及びニメスリドからなる群より選択される抗炎症薬であることを特徴とする、請求項２９０の方法。
294. 薬剤がレフルノマイド、デニロイキンジフチトクス（ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ ｄｉｆｔｉｔｏｘ）、スブロイム（ｓｕｂｒｅｕｍ）、ＷｉｎＲｈｏ ＳＤＦ、デフィブロチド及びシクロホスファミドからなる群より選択される抗自己免疫薬であることを特徴とする、請求項２９０の方法。
295. 薬剤がリマプロスト、クロルクロメン及びヒアルロン酸からなる群より選択される抗接着／抗凝集薬であることを特徴とする、請求項２９０の方法。
296. 薬剤が毒素、放射性同位体及び治療薬からなる群より選択されることを特徴とする、請求項２９０の方法。
297. 毒素がｇｅｌｏｎｉｎ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）、ＰＥ４０、ＰＥ３８、リシン（ｒｉｃｉｎ）、もしくはそれらの修飾体又は誘導体からなる群より選択されることを特徴とする、請求項２９０の方法。
298. 放射性同位体がγ放出体、陽電子放出核、Ｘ線放出体、β放出体及びα放出体からなる群より選択されることを特徴とする、請求項２９０の方法。
299. 放射性同位体が^１１１インジウム、^１１３インジウム、^９９ｍレニウム、^１０５レニウム、^１０１レニウム、^９９ｍテクネチウム、^１２１ｍテルル、^１２２ｍテルル、^１２５ｍテルル、^１６５ツリウム、^１６７ツリウム、^１６８ツリウム、^１２３ヨウ素、^１２６ヨウ素、^１３１ヨウ素、^１３３ヨウ素、^８１ｍクリプトン、^３３キセノン、^９０イットリウム、^２１３ビスマス、^７７臭素、^１８フッ素、^９５ルテニウム、^９７ルテニウム、^１０３ルテニウム、^１０５ルテニウム、^１０７水銀、^２０３水銀、^６７ガリウム及び^６８ガリウムからなる群より選択されることを特徴とする、請求項２９０の方法。
300. 治療薬がドキソルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビシン（モルホリノドキソルビシン）、アドリアマイシン、シスプラチン、タキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンα、ヒドロキシウレア、テモゾロマイド、サリドマイド及びブレオマイシン、並びにその誘導体及び組合せからなる群より選択されることを特徴とする、請求項２９０の方法。
301. 抗体、その抗原結合性断片、又は抗体又はその抗原結合性断片を含むその複合体を、１つ又は複数の薬剤との結合又は複合が可能な基剤又は担体と結合又は複合させることを特徴とする、請求項２７０〜２８９のいずれか１項の方法。
302. 基剤又は担体がデキストラン、親油性ポリマー、ＨＰＭＡ及びリポソームからなる群より選択されることを特徴とする請求項３０１の方法。
303. 細胞ローリングを阻害する医薬として用いる、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体。
304. 炎症を阻害する医薬として用いる、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体。
305. 自己免疫疾患を阻害する医薬として用いる、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体。
306. 再狭窄を阻害する医薬として用いる、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体。
307. 血栓症を阻害する医薬として用いる、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体。
308. 転移を阻害する医薬として用いる、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体。
309. 腫瘍細胞の成長及び／又は複製を阻害する医薬として用いる、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体。
310. 腫瘍細胞の死亡率を高める医薬として用いる、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体。
311. 白血病細胞の成長及び／又は複製を阻害する医薬として用いる、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体。
312. 白血病細胞の死亡率を高める医薬として用いる、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体。
313. 病変細胞の抗疾病薬による傷害への感受性を高める医薬として用いる、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体。
314. 腫瘍細胞の抗がん薬による傷害への感受性を高める医薬として用いる、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体。
315. 白血病細胞の抗白血病薬による傷害への感受性を高める医薬として用いる、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体。
316. 腫瘍患者の腫瘍細胞数の増加を阻害する医薬として用いる、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体。
317. 腫瘍患者の腫瘍細胞数を減少させる医薬として用いる、請求項１９０、１９３、１９６、２１６及び２１７のいずれか１項に記載の抗体多量体。
318. ヒト・モノクローナル抗体ｓｃＦｖ−Ｙ１の可変長分子鎖と交差反応するポリクローナル抗体、抗体断片又は抗体複合体。
319. ヒト・モノクローナル抗体ｓｃＦｖ−Ｙ１の可変長分子鎖のＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ制限断片と交差反応する、請求項３１８のポリクローナル抗体、抗体断片又は抗体複合体。
320. 請求項３１８又は３１９の抗体又は抗体断片又は複合体を含む診断キット。
321. ドキソルビシンと結合した請求項３１８又は３１９の抗体又は抗体断片又は複合体を含む組成物。
322. 請求項３１８又は３１９の抗体又は抗体断片又は複合体を含む組成物とデキストラン、ＨＰＭＡ及び親油性ポリマーからなる群より選択される製薬上許容しうる担体とを含む組成物。
323. ドキソルビシン修飾リポソームと混和した請求項３１８又は３１９の抗体又は抗体断片又は複合体を含む組成物。

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