CZ401497A3 - P-selektinové ligandy a příbuzné molekuly a způsoby - Google Patents

P-selektinové ligandy a příbuzné molekuly a způsoby

Info

Publication number
CZ401497A3
CZ401497A3 CZ974014A CZ401497A CZ401497A3 CZ 401497 A3 CZ401497 A3 CZ 401497A3 CZ 974014 A CZ974014 A CZ 974014A CZ 401497 A CZ401497 A CZ 401497A CZ 401497 A3 CZ401497 A3 CZ 401497A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
selectin
cells
molecule
psgl
sialyl
Prior art date
Application number
CZ974014A
Other languages
English (en)
Inventor
Brian Seed
Tara Pouyani
Original Assignee
The General Hospital Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The General Hospital Corporation filed Critical The General Hospital Corporation
Publication of CZ401497A3 publication Critical patent/CZ401497A3/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/02—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4727—Mucins, e.g. human intestinal mucin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/473—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used alpha-Glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Description

Tento vynález se týká molekul ligandu Ρ-selektinu, DNA a jejich použití.
Dosavadní stav techniky
P-selektin je integrální membránový lektin C-typu, který je nacházen ve Weibel-Paladeho tělískách endoteliálních buněk a alfa granulích destiček (McEver et al., J. Clin. Invest., 84:
- 99, 1989; Bonfanti et al., Blood, 73: 1109 - 1112, 1989; Hsu-Lin et al., J. Biol. Chem., 259: 9121 - 9126, 1984; Stenberg et al., J. Cell Biol., 101: 880 - 886, 1985). Jeho translokace do buněčné membrány může být indukována trombinem, histaminem a jinými mediátory uvolňovanými aktivací žírných buněk, komplexem C5b-9 komplementu nebo C5a fragmentem, peroxidy a oxidovaným lipoproteinem o nízké densitě (Hsu-Lin et al., J. Biol. Chem.,
259: 9121 - 9126, 1984; Stenberg et al., J. Cell Biol., 101: 880
- 886, 1985; Hattori et al., J. Biol. Chem., 264: 9053 - 9060, 1989; Kubeš and Kanwar, J. Immunol., 152: 3570 - 2577, 1994; Thorlacius et al., Biochem. Biophys. Res. Communications, 203:
1043 - 1049, 1994; Foreman et al., J. Clin. Invest., 94: 1147
- 1155, 1994; Patelset al., J. Cell Biol., 112: 749 - 759, 1991; Lehr et al., Laboratory Invest., 71: 380 - 386, 1994; Gebuhrer et al., Biochem. J., 306: 293 - 298, 1995). Pokud je vyjádřen na povrchu buněk, potom podporuje P-selektin připojení myelomonocytů na destičky nebo endoteliální buňky (Larsen et al., Cell, 59:
305 - 312, 1989; Hamburger and McEver, Blood, 75: 550 - 554, • · 4 4 4 4 ···· 4 444 · 4
4 4 4 4 4 4 4 4 4 β · · 4 44 4 44 4 4
1990; Geng et al., Nátuře, 343: 757 - 760, 1990; Gamble et al., Science, 249: 414 - 417, 1990). Dále, jeho přítomnost značí, že probíhá tkáňový insult a podporuje počáteční krok v extravasaci leukocytů, posun neutrofilů podél stěny postkapilární venuly {Lawrence and Springer, Cell, 65: 859 - 873, 1991). Myši, které jsou homozygotně deficitní pro strukturální gen pro P-selektin vykazují sníženou migraci leukocytů a vykazují zpomalený přesun granulocytů do míst experimentálně indukovaného zánětu (Mayadas et al., Cell, 74: 541 - 554, 1993). Obecně, mediátory, které indukují expresi P-selektinu, se účastní v signalizaci traumatu nebo zranění. Jednou z prvně poznaných odpovědí na tkáňové trauma je aktivace žírných buněk, která je doprovázena uvolněním histaminu, serotoninu a jiných difundovatelných mediátorů. Jiné obvyklé děje zahrnují tvorbu trombu v místě cévní ruptury a alternativní dráhu komplementu spuštěnou cizorodými tělísky. Exprese P-selektinu je indukována signály generovanými v každém z těchto kontextů. Ačkoliv indukce P-selektinem zprostředkované migrace neutrofilů byla považována za nezbytný následek chirurgické intervence, kromolyn, agens, které blokuje degranulaci žírných buněk, brání takové migraci, což poskytuje elegantní demonstraci role žírných buněk jako spojovacího článku mezi traumatem a extravasaci (Kubeš and kanwar, J. Immunol.,
152: 3570 - 3577, 1994).
V prvním aspektu se vynález týká organické molekuly, na kterou je kovaléntně navázána sialyl-Le^ determinantna a sulfátovaná determinanta, kdy alespoň jedna z těchto determinant je umístěna na nepřirozeném místě molekuly.
Ve druhém aspektu se vynález týká ligandu P-selektinu vybraného ze skupiny skládající se z (a) aminokyselin 21 - 57 • · · • tt podle obrázku 8A a (b) aminokyselin 38 - 57 podle obrázku 8A.
Ve třetím aspektu se vynález týká fusních proteinů, které obsahují ligand P-selektinu připojený na doménu protilátky (například, jednu nebo více pantových, CH2 a CH3 domén).
V souvisejících aspektech se vynález týká purifikované nukleové kyseliny kódující obsahující místa pro připojení sialyl-Le^ determinanty a sulfátované determinanty, kdy je alespoň jedna z těchto determinant umístěna v nepřirozeném místě proteinu; purifikované nukleové kyseliny kódující jakýkoliv z ligandů P-selektinu podle předkládaného vynálezu; purifikované nukleové kyseliny kódující fúsní protein P-selektin-protilátka; a vektorů a rekombinantních buněk obsahujících jakékoliv z těchto nukleových kyselin. Vynález také obsahuje použití ligandů P-selektinu nebo organických molekul nesoucích takové ligandy (pokud je to žádoucí, pak v kombinaci s jinými proteiny jako je protilátka nebo domény a - kyselého glykoproteinu) ve výrobě léčiv pro léčbu jakýchkoliv stavů popsaných níže.
V jiných souvisejících aspektech se vynález týká metod pro inhibici vazby buněk nesoucích P-selektinový protein na molekulu nebo na buňku nesoucí sialyl-Le^ determinantu a sulfátovanou determinantu. Způsob obsahuje kontaktování buněk nesoucích P-selektinový protein s buď organickou molekulou nesoucí sialyl-Le3* a sulfátované determinanty, kdy alespoň jedna z těchto determinant je umístěna na přirozeně se nevyskytujícím místě na molekule; fusním proteinem P-selektin-protilátka; nebo s jakýmikoliv ligandy P-selektinu podle předkládaného vynálezu.
V jiném souvisejícím aspektu se vynález týká metody pro • · · · · • · · ··· ···· • · · · · · · · · · · • · · · · · «··· · ··· · · • · · · ··· ··« ·· ·· ·· · · e ·» redukci zánětu u savců, kde tato metoda obsahuje podání terapeuticky účinného množství bud' organické molekuly nesoucí sialyl-Le^ a sulfátované determinanty, kdy alespoň jedna z těchto determinant je umístěna na přirozeně se nevyskytujícím místě na molekule; fušního proteinu P-selektin-protilátka; nebo jakéhokoliv ligandu P-selektinu podle předkládaného vynálezu pacientovi.
V ještě jiném aspektu se vynález týká metody pro redukci nebo ochranu savců před jakoukoliv nežádoucí reakcí spojenou s extravasací (včetně, ale bez omezení, na extravasaci závislého orgánového poškození a/nebo zahlcení asociovaného se syndromem respirační tísně u dospělých, glomerulonefritidou, a ischemickým poškozením myokardu). Metoda obsahuje podání terapeuticky účinného množství buď organické molekuly na kterou jsou kovalentně navázány sialyl-Le3* a sulfátované determinanty, kdy alespoň jedna z těchto determinant je umístěna na přirozeně se nevyskytujícím místě na molekule; fúsrtího proteinu
P-selektin-protilátka; nebo jakéhokoliv ligandu P-selektinu podle předkládaného vynálezu savci.
V posledním aspektu se vynález týká metody pro redukování nebo pro ochranu savců před nežádoucí imunitní reakcí, kde tato metoda obsahuje podání terapeuticky účinného množství buď organické molekuly na kterou jsou kovalentně navázány sialyl-Le^ a sulfátované determinanty, kdy alespoň jedna z těchto determinant je umístěna na přirozeně se nevyskytujícím místě na molekule; fúsního proteinu P-selektin-protilátka; nebo jakéhokoliv ligandu P-selektinu podle předkládaného vynálezu savci. Preferovaně tato metoda obsahuje léčbu savců pro nežádoucí imunitní reakci, která je indukována mikrobiálním • · • · · · · · ···· 9 · · · « · · · a · · • · · · · · ···· · «·· · · ···· · · · · · · faktorem. Takové mikrobiální faktory obsahují, bez omezení, lipopolysacharidy gram negativních bakterií (LPS), peptidoglykany z gram pozitivních organismů, mannan ze stěny buněk hub, pólysacharidy, extracelulární enzymy {např. streptokinasa) a toxiny {např. enterotoxin toxického šoku stafylokoků). V jiných preferovaných provedeních metoda obsahuje léčbu savců pro nežádoucí imunitní reakci, která je indukována faktorem hostitele. Takové faktory hostitele zahrnují, bez omezení, metaboity komplementu, kinin, a koagulační systémy, faktory uvolňované ze stimulovaných buněk (např. cytokiny jako je interleukin-1 (IL-1) a tumor nekrosis faktor-α (TNF)), enzymy a oxidanty z polymorfonukleárních leukocytů (PMN), vasopeptidy (např. histamin), a produkty metabolismu kyseliny arachidonové.
V jiných preferovaných provedeních je nežádoucí imunitní reakce indukována rekombinantním TNF-a nebo je indukována rekombinantním IL-1. V ještě jiných preferovaných provedeních je nežádoucí imunitní reakcí septičký šok nebo to je septikemie.
V preferovaných provedeních každého z výše uvedených aspektů organická molekula nebo protein také inhibuje vazbu buněk nesoucích E-selektinový (ELAM-1) protein na molekulu nesoucí sialyl-Le^ determinantu a tak inhibuje E-selektinem zprostředkovanou zánětlivou reakci, na extravasaci závislé nežádoucí reakce, a nežádoucí imunitní reakce; sialyl-Le^ a sulfátované determinanty jsou přítomné na ligandu pro P-selektin skládajícím se v podstatě z: aminokyselin 21 - 57 podle obrázku 8A (například aminokyselin 38-7 odle obrázku 8A); sialyl-Le^ determinanta je N-vázaná nebo je O-vázaná; molekula nebo protein obsahují mnohotné sialyl-Le^ a/nebo sulfátované determinanty; organická molekula je protein (například protilátka (například IgG nebo IgM), ar -kyselý • · · ·· · · · ·
nežádoucí reakce, a nežádoucí imunitní reakce; sialyl-Le^ a sulfátované determinanty jsou přítomné na ligandu pro P-selektin skládajícím se v podstatě z: aminokyselin 21 - 57 podle obrázku 8A (například aminokyselin 38-7 odle obrázku 8A); sialyl-Le^ determinanta je N-vázaná nebo je O-vázaná; molekula nebo protein obsahují mnohotné sialyl-Le^ a/nebo sulfátované determinanty; organická molekula je protein (například protilátka (například IgG nebo IgM), -kyselý glykoprotein (AGP), nebo protilátkový fúsní protein (například, AGP-protilátka fúsní protein); protein je protilátka, AGP, nebo protilátkový fusní protein (např. AGP-protilátka fúsní protein), na který je připojen jakýkoliv ligand P-selektinu zde popsaný (například, na amino-konec proteinu); protilátka nebo protilátkový fúsní protein (například, AGP-protilátka úsní protein) obsahuje, jako protilátkovou část, IgGl CH2, CH3 a/nebo pantovou doménu; protilátka, AGP nebo protilátkový fúsní protein obsahují jedno nebo více N-vázaných glykan adičních míst α kyselého glykoproteinu; protilátková část molekuly nese jednu nebo více přirozeně se nevyskytujících sialyl-Le^ determinant; sialyl-Le^ determinanta interferuje se schopností protilátky fixovat komplement nebo se vázat na Fc receptor (například tak, že je sialyl-Le3* determinanta připojena na jednu nebo více aminokyselin 274, 287 nebo 322 sekvence ukázané na obrázku 10 A-E); a organická molekula je rozpustná.
Výraz ligand P-selektinu jak je zde použit je míněn tak, že znamená jakoukoliv aminokyselinovou sekvenci schopnou zprostředkování interakce s receptorem P-selektinu a obsahuje ty proteiny, které jsou označovány jako změněný list
0 0 0 0 0 ·
• · 0 0 0 0 · · · · 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 • 0 · 0 0 000··· 0000 0 0000 00 0 ···
00 00 0 00 ·0 umístění .
Zánět znamená patologický proces sestávající z cytologické a histologické reakce, která se vyskytuje v postižených krevních kapilárách a přilehlé tkáni v odpovědi na poškození nebo abnormální stimulaci způsobenou fyzikálními, chemickými nebo biologickými agens. Zánět, jak je zde použito, zahrnuje jakoukoliv akutní zánětlivou odpověď (například, během nebo po syndromu dechové tísně u dospělých nebo ischemickém poškození myokardu), stejně jako jakoukoliv chronickou zánětlivou odpověď (například, revmatoidní artritidu, psoriasu nebo pemphigus vulgaris).
Purifikovanou nukleovou kyselinou je míněna DNA, která je prostá genů, které, v přirozeném genomu organismu, od kterého je DNA podle předkládaného vynálezu odvozena, obklopují gen. Termín proto zahrnuje, například, rekombinantní DNA, která je inkorporována do vektoru; do autonomně se replikujícího plasmidu nebo viru; nebo do genomové DNA prokaryont nebo eukaryont; nebo která existuje jako separátní molekula (např. cDNA nebo genomový nebo cDNA fragment produkovaný PCR nebo trávením restrikčními enzymy) nezávislá na jiných sekvencích. Také zahrnuje rekombinantní DNA, která je částí hybridního genu kódujícího další polypeptidové sekvence.
N-vázaný znamená vázaný na amidový dusík asparaginového zbytku proteinu.
0-vázaný znamená vázaný na kyslík hydroxylové skupiny serinového, threoninového nebo hydroxylysinového zbytku proteinu.
A A AAAA
A A
A · A ·· A AAA AAAA
AA A AAAA AAAA
A A AA· · A A·A A AAAA A
AAAA AAA AAA
AAA AA AA A AA AA
Na extravasaci závislá nežádoucí reakce znamená jakoukoliv reakci, která je školivá pro hostitele a která je přímým nebo nepřímým důsledkem nevhodného přilnutí neutrofilů na endotel v nebo poblíž místa zánětu, tkáňového poškození nebo tvorby trombu a vede k migraci těchto neutrofilů do postižené cévy nebo orgánu. Orgány, které mohou být postižené takovým poškozením zahrnují, bez omezení, srdce, plíce a ledviny.
Nežádoucí imunitní reakcí je míněna jakákoliv reakce zprostředkovaná imunitními buňkami (jako jsou například jakékoliv B-buňky, T buňky, monocyty/makrofágy, přirození zabíječi, žírné buňky, basofily nebo granulocyty) a která je pro hostitele poškozující.
Oblast vynálezu
Nejprve budou stručně popsány obrázky.
Obrázek 1 je schematickou representací struktury PSGL-1 delečních mutantů. Systematická delece ektodomény PSGL-1 byla provedena konvenčními PCR metodami. Representativní 10 zbytkový opakující se úsek (tečkovaný; SEQ ID NO: 1) a transmembránová doména (šrafovaně) jsou ukázány. Obrázek IB je histogram, který representuje vazebnou aktivitu P-selektinu u trasfektovaných COS buněk exprivujících delece ukázané na obrázku IA. slCr-značeným buňkám byla umožněna adhese na solubilní P-selektin adsorbovaný na mikrotitrační jamky. Buňky byly promyty, navázané buňky byly potom lyžovány a hladina 51Cr byla odečítána. Deleční konstrukty byly zavedeny do buněk buď za absence (sloupec 2) nebo za přítomnosti (zbývajících 7 sloupců) lidské FTVII • · ···· • · • ·
4· ·4 fukosyltransferasy.
Obrázek 2 je schematickou representací chimér PSGL-1 a CD43. Membránová proximální extracelulární doména, transmembránová a intracelulární doména PSGL-1 byly nahrazeny příbuznými sekvencemi CD43. Vzniklá molekula nemá cysteiny a proto nemůže vytvářet disulfidově vázaný dimer. Obrázek 2B je histogram representující vazebnou aktivitu P-selektinu transfektovaných COS buněk exprivujících chiméry ukázané na obrázku 2A. FTVIIh, kotransfekce s lidskou FTVII fukosyltransferasou.
Obrázek 3A je schematická representace chimérických mucinů nesoucích PSGL-1 apikální doménu připojenou k intaktnímu nebo ke zkrázcenému C-konci mucinu. PSGL-1 N-konec (tečkovaný; SEQ ID NO: T) a transmembránové (TM) domény (šrafovaně) jsou ilustrovány. Sekvence PSGL-1-NH2/CD43 repeatů jsou representovány SEQ ID NO: 2. PSGL-1 byl fušován na N-konec předpokládaných zralých CD34 a GlyCAM-l molekul a na N-konec opakujícího se regionu CD43. Obrázek 3B je histogram representující vazebnou aktivitu P-selektinu transfektovaných COS buněk exprivujících chiméry ukázané na obrázku 3A. FTVIIh, lidská FTVII fukosyltransferasa.
Obrázek 4A je schematickou representací PSGL delečních mutantů. Aminoterminální doména byla připojena na PSGL molekuly mající různý počet opakujících se elementů. Obrázek 4B je histogram representující vazebnou aktivitu P-selektinu transfektovaných COS buněk exprivujících chiméry ukázané na obrázku 4A.
Obrázek 5 je fotografie autoradiogramu mucin:imunoglobulin • · 9 9 99 • ♦9 99 99 ♦ « 9 99« 9*99 *· 9 9999 9 9 9 ·
9999 9999 9 999 9 9 •999 999 999
9-9 «9 9 99 «9 fúsních proteinů značených 3SS-stilfátem a elektroforesovaných na 8% denaturačním polyakrylamidovém gelu za redukčních podmínek. Linie A: supernatant CDM8 transfektovaných buněk; linie B: supernatant buněk transfektovaných Ig expresním vektorem (žádný mucinový insert); linie C: supernatant buněk exprivujících PSGL-l:Ig; linie D: supernatant buněk exprivujících CD43:Ig; linie E: supernatant buněk exprivujících CD34:Ig: a linie F: supernatant buněk exprivujících GlyCAM-1:Ig.
Obrázek 6A a 6B jsou histogramy representující vazbu COS buněk exprivujících PSGL-l na imobilizovaný P- a E- selektin s nebo bez fukosyltransferasy a za přítomnosti nebo za absence 10 mM NaClO . Obrázek 6A j e histogram representuj ící vazbu buněk na P-selektin. Obrázek 6B je histogram representující vazbu buněk na E-selektin.
Obrázek 7 je fotografie autoradiogramu PSGL-l/imunoglobulin fúsních proteinů značených 3sS-sulfátem za přítomnosti nebo za absence 10 mM NaC103 a elektroforesovaných na 8% denaturačním polyakrylamidovém gelu za redukčních podmínek. Fotografie ukazuje, že chlorečnan inhibuje inkorporaci 35S-sulfátu do solubilních mucinových chimér. Linie A: supernatant CDM8 transfektovaných buněk za absence chlorečnanu, linie B: supernatant buněk exprivujících PSGL-l:Ig za absence chlorečnan; linie C: supernatant CDM8 buněk za přítomnosti chlorečnanu; linie D: supernatant buněk exprivujících PSGL-l:Ig za přítomnosti chlorečnanu .
Obrázek 8A je seznam koncových sekvencí různých PSGL-l delečních mutantů (ukázaných šipkami). Horní sekvence je SEQ ID • · • 4 4 ♦ • 4 · 4 · · · · · · · • · 4 4 4 4444·· ···· · ···· ··· ··· ·· ·· ·· · ·· · · absence 10 mM NaC103 a elektroforesovaných na 8% denaturačním pólyakry1amidovém gelu za redukčních podmínek. Fotografie ukazuje, že chlorečnan inhibuje inkorporaci 35S-sulfátu do solubilních mucinových chimér. Linie A: supernatant CDM8 transfektovaných buněk za absence chlorečnanu;linie B: supernatant buněk exprivujících PSGL-1:Ig za absence chlorečnanu; linie C: supernatant CDM8 buněk za přítomnosti chlorečnan; linie D: supernatant buněk exprivujících PSGL-1:Ig za přítomnosti chlorečnanu.
Obrázek 8A je seznam koncových sekvencí různých PSGL-1 delečních mutantů (ukázaných šipkami). Horní sekvence je SEQ ID NO: 3; střední sekvence je SEQ ID NO: 13 a spodní sekvence je SEQ ID NO: 14. Obrázek 8B je histogram representující vazebnou aktivitu P-selektinu transfektovaných COS buněk exprivujících deleční mutanty mající konce ukázané na obrázku 8A.
Obrázek 9A je schematický diagram konstruktů použitých pro měření účinku připojení přirozených a mutantních variant PSGL-1 zbytků 38 - 57 na deletovaný PSGL-1 nebo CD43. Insertované sekvence jsou ukázány vlevo dole. Obrázek 9B je histogram representující vazebnou aktivitu P-selektinu transfektovaných GOS buněk exprivujících chiméry ukázané na obrázku 9A.
Obrázek 10 A-E je seznam sekvencí nukleotidů (SEQ ID NO: 8) kódujících IgGl (SEQ ID NO: 9) a mutací vytvořených pro vznik adičních míst pro N-vázaný glykan (SEQ ID NO: 12).
Obrázek 11 A-B je nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 10) a obrázek 11B je aminokyselinová sekvence (SEQ ID NO: 11)
AGP-IgGl fušního proteinu.
změněný list
0440
4 44 44 • 4 4 4 4 4 0 0 · • 0 ·00· 00 00
000 000000 0000 0 • 4 9 000 000
Linie C, supernatant buněk transfektovaných WT-hlgG.
Linie D, supernatant buněk transfektovaných Y/F-hlgG.
Linie E, supernatant buněk transfektovaných T/A-hlgG.
Linie F, supernatant buněk transfektovaných Y/F-T/A-hlgG. Obrázek 12C je fotografie 8% polyakrylamidového gelu použitého pro hodnocení inkorporace (3SS)sulfátu fúsnimi proteiny ukázanými na obrázku 12A po transfekci do COS buněk. Navíc nebyl obsažen kontrolní fúsní protein nenesoucí žádnou amino-terminální adici (linie B). Linie C až G korespondují liniím B až F na obrázku 12B.
Obrázek 13 je sloupcový graf interagujících HL-60 buněk na videem zachycené pole. Buňky byly infusovány do paralelních plotnových průtokových komůrek předem potažených buď chimérou P-selektin-imunoglobulin nebo kontrolní chimérou
CD4-imunoglobulin. Buňky byly podrobeny střihovému stresu 0,75 dynes/cm2. Každý sloupec representuje průměrný počet buněk (± SEM) na pole z osmi rámečků odebraných v 15 sekundových intervalech. Buňky posunující se nebo protékající se jeví na videoobrazu jako skvrny. Sloupce representují, zleva doprava; HL-60 buňky posunující se nebo protékající přes chiméru P-selektin-imunoglobulin, HL-60 buňky předem ošetřené v mediu bez sulfátu s 10 mM chloridu sodného a HL-60 buňky protékající přes chiméru CD4-imunoglobulin.
O Sialyl-Lewis X (sialyl-Le^) a sulfatovaných determinantách bylo ukázáno, že intetagují s P-selektinem a usnadňují vazbu v následujících pokusech. Tyto příklady jsou presentovány pro ilustraci, nikoliv pro omezení, vynálezu, nejprve budou popsány metody použité v následujících pokusech.
• « ·· ·· » 99 99
9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 99
9999 9999 9 999 9 · • 9 9 9 9 9 9 9 9 ·
9 9 9 9 9 9 9 9 9 ·
Příklady provedení vynálezu
Produkce solubilního P-selektinu
Ig chiméry P-selektinu a E-selektinu byly připraveny transientní expresí expresního plasmidu kódujícího lektin, EGF-příbuzné a první dvě s konsensuálním opakujícím se úsekem příbuzné domény P-selektinu připojené na pantovou, CH2 a CH3 domény lidského IgGl (Aruffo et al., EMBO J., 6: 3313 - 3316, 1991; Walz et al. , Science, 250: 1132 - 1135, 1990). PSGL-1 cDNA kódující sekvence byla získána PCR amplifikací HL-60 cDNA knihovny a sekvence byla potvrzena DNA sekvencováním. Kódující segment pro zralou extracelulární, transmembránovou a intracelulární doménu byl insertován do expresního vektoru založeného na CDM8, kterému chybí zdroj replikace od polyoma viru a který obsahuje leader sekvenci pro CD5 antigen umístěnou ihned upstream od kódujícího regionu pro epitop tag chřipkového hemaglutinin (flu) peptidu (Field et al., M01. Cell. Biol.,
8: 2159 - 2165, 1988) .
Konstrukce PSGL-1 delecí
Aminoterminální PSGL-1 deleční konstrukty byly připraveny PCR amplifikací za použití primerů kódujících požadovaný konec delečního mutantu umístěný downstream od Xbal místa v rámečku dvě (kóduje Leu a Asp). Vzniklá sekvence kóduje polypeptid, ve kterém jsou zbytky uvedené dále ihned po kyselině aspartatové (D) Xba místa: A118, A128, A138, A148, A158, A168, G178, A188, A198, A208, A218, A228, A238, A248, A258 a T268 prekursoru PSGL-1. PCR fragmenty byly potom insertovány do CD5 leaderu ·« φφ • φ · φ φ · φφ φφφφ φ φ φ φ • φ φ φ • φ φφ··
ΦΦ ΦΦ·· φφ φ · φφφ φφφ φ · φ φ φ φ * φ φφφφ φ φ φφ φφ φφ >expresního vektoru s flu smyčkou použitého pro expresi intaktního PSGL-1. Flu smyčka končí v Xbal místě v rámečku popsaném výše. Sekvence ve spojení flu smyčky byly potvrzeny a exprese byla potvrzena v COS buňkách nepřímou imunofluorescenční mikroskopií a průtokovou cytometrií. Serie vnitřních delecí s Eco RI místem v místě delece v rámečku jedna (kóduje glutamovou kyselinu fenylalanin) byla také připravena nejprve vytvořením delečních variant s amino koncem (zbytky ihned následující fenylalanin (F) EcoRI místa korespondující A118, A128, A138, A148, A158, A168, G178, A188, A198, A208,
A218, A228, A238, A248, A258 peptidové sekvence prékursoru. Každá z těchto delečních variant byla připojena na aminoterminální PSGL-1 doménu s flu smyčkou končící EcoRI místem v rámečku kyseliny glutamové fenylalaninu ihned downstréam od A117 prékursoru PSGL-1.Vzniklý konstrukt obsahoval delece mezi A117 a různými konci uvedenými výše.
Výměnné mucinové domény
CD34, CD43 a GlyCAM-1 muciny byly připraveny pro adici PSGL-1 aminoterminální domény připojením EcoRI místa buď na zralý amino konec (CD34 nebo GlyCAM-l) nebo na počátek regionu opakujících se úseků bohatých na threonin/prolin (CD43). Stejně jako výše, EcoRI místo bylo v rámečku kyseliny glutamové fenylalaninu (rámeček 1). CD34 sekvence začíná ve zbytku F30 prékursoru, Gly-CAM-1 v L19 prékursoru a CD43 v 1135 prékursoru. Na každý z nich byla připojena PSGL-1 doména opatřená flu smyčkou končící v EcoRI jak je popsáno výše. AMino konec a opakující se elementy PSGL-1 byly připojeny na proximální membránovou, transmembránovou a intracelulární domény CD43 v EcoRI místě v rámečku kyseliny glutamové φφ φφφφ φφ φφ • « φ φ φ φ φφ φφφφ φ • φ φ
ΦΦ φ φ φ φ φφφ φ φ φ φφφφ φ φ φφφφ φφφφ φφφφ φ φ φ φφ φφ φφ φ fenylalaninů umístěném ihned upstream od sekvencí S225 CD43 prekursorů. Komplementární fragment z PSGL-1 korespondoval aminoterminálním zbytkům prekursorů od T267.
Mapování jemné struktury amino-koncové domény
Podobná strategie byla použita pro konstrukci delecí v aminokoncové doméně, ve které byly vytvořeny PCR generované delece za použití primerů nesoucích Xbal místo v rámečku leucin kyselina aspartatová (rámeček 2). Ihned downstream od zbytků kódujících kyselinu aspartatovou byly PSGL-1 sekvence korespondující k R38, E58, P78 a A98 prekursorů. Přo definování aminokoncové domény byly syntetizovány duplexní oligonukleotidy korespondující zbytkům mezi 38 a 87 s ukázanými změnami sekvence pro mutaci zbytků threoninu nebo tyrosinu na alanin nebo na fenylalanin. Všechny konstrukty byly potvrzeny dideoxy sekvencováním.
Testy buněčné adhese
Transfektované buňky byly odebrány z kultivačních misek s 0,5 mM EDTA ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (PBS) 48 až 60 hodin po transfekcí. Buňky byly potom značeny 100 μΐ sxCrO4 (1 mCi/ml; DuPont, Boston, MA) do 0,9% NaCl plus 100 ml media pomocí jejich inkubování při 37 °C po 1 hodinu. Značené buňky byly promyty dvakrát v PBS a byly resuspendovány v 0,2% BSA, 0,15 M NaCl, 3 mM CaCl2. Variace ve stupni značení (množství inkorporovane na buňku) mezi buňkami připravenými paralelně ve stejné lázni značeného chromátu byla typicky minimální. Značené buňky byly potom inkubovány v jamkách 96 jamkových mikrokultivačních ploten, které byly potaženy afinitně purifikovanou kozí anti-lidský IgG protilátkou (100 μΐ » 4444
4 ·* · 44 44 • · · 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 «4
4 4 4444 4 444 4 4 • 4 4 4 4 4
4« 4 44 44 ^g/ml anti-lidský IgG Fc (specifické pro těžký řetězec) v PBS) po 2 hodiny ve vlhké komůrce při pokojové teplotě. Potom byly plotny dvakrát promyty v PBS, další vazebná místa pro protein byla blokována inkubací přes noc s 200 μΐ 3% BSA v PBS. Plotny byly čtyřikrát promyty v PBS a inkubovány se 200 μΐ supernatantů fúsního proteinu po 2 hodiny. Po třech promytích v PBS a po jednom dalším promytí (v 0,2% BSA, 0,15 M NaCl, 3 mM CaCl2) bylo přidáno 2 x 10s buněk/jamku (v 0,2% BSA, 0,15 M NaCl, 3 mM CaCl^) a byla umožněna vazba po 15 minut při pokojové teplotě za rotace plotny na rotačním přístroji (80 rpm). Plotna byla promyta třikrát naplněním jamek 200 μΐ 0,15 M NaCl/3 mM CaCl^ a potom obrácením plotny. Adherentní buňky byly lysovány přidáním 200 μΐ 2% SDS a značený Chromát byl odečítán spektrometrem pro gamma paprsky.
Imunofluorescenční analýza
Buňky byly připraveny pro cytometrii inkubací s primární monoklonální protilátkou (ředění 1:2000 ascitu nebo 5 ptg/nil purifikované protilátky je vhodné) v PBS obsahujícím 3% BSA po 30 až 45 minut. Buňky byly promyty dvakrát PBS a inkubovány s 2 ^g/ml FITC-kojugované afinitně purifikované protilátky k buď myšímu IgG (12CA5) nebo k myšímu IgM (CSLEX-1) po 30 až 45 minut v PBS/3% BSA. Buňky byly potom dvakrát promyty PBS a resuspendovány v 1 ml 1% čerstvě depolymerisovaného paraformaldehydu v PBS před analýzou. Pro imunofluorescenční mikroskopii byly transfektované buňky fixovány 4% čerstvě depolymerisovaným paraformaldehydem, promyty, vystaveny 3% BSA v PBS po 30 minut a potom inkubovány s primární protilátkou (ascitickou, 1:250) po 30 - 45 minut. Buňky byly potom dvakrát ·· 44«· · ·♦ 44 • · · 4 4 4 4 « « · • · 4 444» 44 44 • · 4 4 4 4 4444 4 444 4 4 ♦♦44 444 44« ·· *4 44 4 ·· «« promyty v PBS a inkubovány 30 - 45 minut s FITC-konjugovanou afinitně purifikovanou protilátkou k myšímu IgG (Cappell; 2 ^g/ml v PBS obsahujícím 3% BSA). Nakonec byly buňky dvakrát promyty PBS a analyzovány.
Metabolické značení s 3sSO
COS buňky transfektované expresními plasmidy kódujícími chiméry mucin:imunoglobulin byly trypsinizovány jeden den po transfekci a byly přeneseny na nové plotny v kompletním mediu (DMEM s 10% telecím sérem). Před značením bylo medium odebráno, buňky byly jedenkrát promyty PBS a medium bylo nahrazeno buď mediem bez cysteinu a methioninu pro značení (35S) cysteinem a methioninem (TransLabel, ICN) nebo CRCM-30 mediem (Sigma Chemical Co.) pro značení 35S04.Serum nebylo přidáno a radionuklid byl typicky přítomen v koncentraci 200 pCi/ml. Po značícím intervalu 12 až 16 hodin byly supernatanty odebrány a fúsní proteiny byly odebrány adsorbcí na kozí anti-lidský IgG agarosu (Cappell). Adsorbované proteiny byly podrobeny denaturační elektroforese na 8% polyakrylamidových gelech za redukčních podmínek.
Inhibice adhese chlorečnanem
COS buňky byly transfektovány DEAE dextranem a inkubovány ihned v DMEM obsahujícím 10% telecí sérum a 10 mM chlorečnan sodný. Jeden den po transfekci byly buňky trypsinizovány a inkubovány na čerstvých miskách ve stejném mediu po 6 hodin. Medium bylo potom odstraněno, buňky byly promyty PBS a potom inkubovány po dalších 18 hodin v obvykle připraveném DMEM mediu
0000
0· 0
0 0
0 0
0 0 0
00
0
0 0
0 0 0 • 0 0000 0
0 0
(Life Technologies) bez sulfátu a obsahujícím 2% běžné hladiny cysteinu a methioninu s 10% dialyzovaným fetálním hovězím sérem za přítomnosti 10 mM chlorečnan sodný (Baeuerle and Huttner, Biochem. Biophys. Res. Comm., 141: 870 - 877, 1996). Buňky byly potom sklízeny pro použití v testech adhese a imunofluorescence. Kontrolní buňky byly ošetřeny podobně, ale byly inkubovány v DMEM obsahujícím nedialyzované sérum.
Pohyb HL-60 buněk
Video obrazy pohybu HL-60 buněk po paralelních plotnách rektangulární průtokové komůrky (FCS2, Bioptechs, Incorporated, Butler, PA) s teplotou kontrolovanou na 37 °C byly získány AIMS Technology (Bronx, NY) CCD kamerou přimontovanou na Zeiss ICM 405 invertovaný mikroskop vybavený 2,5 x objektivem. Výška komůrky byla 250 μπι. Buňky procházely komůrkou v definované průtokové rychlosti pomocí injekční pumpy od Harvard Apparatus (South Natick, MA) model I/W 22. Snímky byly analyzovány za použití NIH Image. Pro inhibici sulfatace byly HL-60 buňky promyty jedenkrát PBS a kultivovány po 18 hodin v mediu bez sulfátu obsahujícím 2% normální hladiny cysteinu a methioninu, 10 mM chlorečnan sodný a dialyzované sérum jak bylo popsáno výše. Pro každý pokus bylo 10€ buněk suspendováno v 1 ml 0,15 M NaCl, 3 mM CaCl2 a proběhnuto komůrkou. Skleněná krycí sklíčka byla potaženy afinitně purifikovanou kozí anti-lidský IgG protilátkou v koncentraci 10 ^g/ml v 50 mM Tris-HCl (pH 9,0) po 2 hodiny, promyty dvakrát PBS a blokovány přes noc 0,2% BSA v PBS. Ošetřená krycí sklíčka byla potom ponořena v supernatantech COS buněk transfektovaných vhodnými expresními plasmidy pro imunoglobulinové chiméry, promyty dvakrát v PBS a shromážděny v průtokové komůrce.
4444 ·· · 44 44 ·· 4 444 ·44·
4· 4 4444 4 4 44 • 4 4 4 4 4 4··· 4 444 4 4 •444 44 4 444
44 44 4 44 44
Amino konec PSGL-l je nezbytný pro vazbu P-selektinu
Delece aminokonců PSGL-l mucinu byly vytvořeny PCR technikami a vzniklé zkrácené cDNA byly insertovány downstream od sekvence sékrečního peptidu, která byla fúsována na kratší oligopeptidovou smyčku odvozenou od chřipkového hemaglutininu (HA). Expresní plasmidy kódující zkrácené molekuly (obrázek IA) byly transfektovány do COS buněk za přítomnosti specifické myeloidní fukosyltransferasy označené FTVII, která exklusivně řídí expresi sLEx determinant (Sasaki et al., J. Biol. Chem., 269: 14730 - 14737, 1994; Natsuka et al., (publikované erratum je v J. Biol. Chem. 269: 20806, 1994, J. Biol. Chem., 269:
16789 - 16794, 1994). Exprese delečních mutantů na povrchu buněk byla potvrzena nepřímou imunoflourescencí za použití ant i-HA monoklonálních protilátek. Přítomnost sLE3* na povrchu buněk byla podobně potvrzena za použití monoklonální protilátky CSLEX-1. Byla určena schopnost radioznačených transfektováných buněk vázat se na plastové jamky předem potažené fúsním proteinem P-selektin:imunoglobulin. Tyto pokusy ukázaly, že delece aminokoncových 100 zbytků (zde označovaných jako apikální doména) PSGL-l je dostatečná pro zrušení vazby transfektantů na imobilizovaný P-selektin (obrázek 1B). Tyto pokusy také ukázaly, že sLex zprostředkuje vazbu P-selektinu, protože exprese FTVII byla nutná pro vazbu P-selektinu (obrázek 1B; srovnej sloupec 2 se sloupcem 3). Exprese delečních variant na buněčném povrchu byla potvrzena nepřímou imunofluorescencí za použití anti-HA monoklonálních protilátek a přítomnost sLex na povrchu buněk byla potvrzena za použití monoklonální protilátky CSLEX-1. Tabulka 1 ukazuje průměrnou intensitu fluorescence (MFI) COS buněk, které byly kotransfektovány lidskou FTVIIh a delečními konstrukty (ukázanými na obrázku ·· 0000 00 · ·· • * 0 0 0 0 0 0 0 · • · 0 0000 00 00 • · 0 0 0 0 0000 0 000 0 0 •••••0 0 000
ΙΑ), a které byly podrobeny nepřímé imunofluorescenei s protilátkou proti aminokoncovému flu peptidu nebo sLex.
Tabulka 1
Konstrukt Exprese (MFI)
Flu Sle3*
PSGL-l-flu 5,0 37
Xbal 17,0 26
Xba3 20, 0 28
Xba6 21,0 28
Xba9 12,0 26
Xbal2 6,0 30
Xbal 6 6,0 25
V kontextu větších, sulfátovaných mucinů je aminokonec
PSGL-1 dostatečný pro vazbu P-selektinu
Pro určení toho, zda jsou jiné sekvence PSGL-l než jsou ty, které jsou nacházeny v prvních 100 N-terminálních aminokyselinách (t.j. apikální doméně) PSGL-1 nutné pro vazbu na P-selektin byly transmembránové a cytoplasmatické regiony PSGL-1 nahrřazeny regiony CD43 antigenu (Pallant et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 86: 1328 - 1332, 1989; Shelley et al, Proč. Nati. Acad. Sci., 86: 2819 - 2823, 1989). Vzniklá molekula, která neobsahovala cysteinové zbytky, vázala P-selektin se stejnou účinností jako PSGL-l (obrázky 2A a 2B). Tak, ani tvorba disulfidové vazby ani specifický kotvící membránový segment nejsou vyžadovány pro vazebnou aktivitu pro P-selektin
J
Určených prvních 100 aminokyselin PSGL-1 bylo potom geneticky přeneseno do aminokonce mucinu podobných opakujících • tt ···· • · · • · tt ·* tttt • · · • · * • ·
tt se elementů několika nepříbuznýeh mucinů pro určení toho, zda je či není apikální PSGL-l doména dostatečná pro P-selektinovou ligandovou (t.j. counterreceptorovou) aktivitu (obrázek 3A) . Některé z těchto chimérických mucinů byly schopné podporovat vazbu P-selektinu v tomto provedení. CD34 a CD43, dva relativně velké muciny nacházené predominantně na lidských hematopoetických buňkách, byly oba schopné podporovat vazbu. Oproti tomu, arteficiálně ukotvená varianta GlyCAM-l, mucinu exprivovaného vysoce endoteliálních venulách, která má L-selektinovou ligandovou aktivitu (Lásky et al., Science, 258: 964 - 969, 1992), byla inaktivní v tomto testu (obr. 3B). GluCAM-1 mucinová doména byla v tomto testu umístěna na povrch buněk prostřednictvím extracelulární stopky, transmembránové domény a cytoplasmatických kotvících segmentů CD7 (Aruffo et al., EMBO J., 6: 3313 - 3316, 1987). Exprese různých mucinů a mucinových chimér na povrchu buněk byla potvrzena nepřímou fluorescencí za použití protilátek proti flu smyčce, sLe^ nebo příslušným mucinům. Tabulka 2 ukazuje měření průměrné intensity fluorescence (MFI) exprese flu smyčky nebo sLe^ COS buňkami transfektovanými konstrukty analyzovanými na obrázku 3B. CD34 a CD43 byly pozitivní na expresi nepřímou imunofluorescencí za použití příbuzných anti-CD protilátek.
·· ··<· • 4 4 94 49
9 9 9 4 4 4 4 9 4 • · · ···· ···· • · · · 4 · 4944 4 449 4 4 • 4 4 9 9 4 4 9 9 4
44 9 4 · ·· · ·
Tabulka 2
Konstrukt Exprese (MFI)
Flu sLeX
FTVIIh — 52
PSGL-1-flu 9,8 43
CD43 — 60
PSGL-1-NH2/CD43 rep. 12 67
CD34 — 50
PSGL-1-NHa/CD34-GOOH 8,0 33
GlyCAM-flu 12 32
PSGL-1-NH2/GlyCAM-COOH 8,0 28
Zřejmé molekulové hmotnosti CD43 a CD34 exprivovaných v COS buňkách jsou popisovány mezi 100 - 130 kDa (Shelley et al., Proč. Nati. Acad. Sci. 86: 2819 - 2823, 1989) a 100 kDa (Simmons et al., J. Immunol., 148: 267 - 271, 1992) , v příslušném pořadí; PSGL-1 monomer vykazuje efektivní molekulovou hmotnost 110 kDa (Sako et al., Cell 75: 1179 1186, 1993). GlyCAM-l, ve svém nativním (nepřipevněném) stavu migruje spolu s 50 kDa proteiny, což naznačuje, že je významně menší (Lásky et al., Science, 258: 964 - 969, 1992). V našich studiích byly větší muciny schopné podporovat vazbu P-selektinu, pokud byly apikální domény PSGL-1 připojeny na aminokonec mucinů. Sekvenční delece vnitřních opakujících se elementů PSGL-1 nám umožnili zkrátit molekulu systematickým způsobem bez narušení potenciálních globálních terciálních asociací (obrázek 4A). Jakmile byly tyto opakující se úseky deletovány, byla vazebná aktivita PSGL-l snížena, což jev ·» ···· ·· ·»
9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 « · · · · ····
9 9 9 9 9 9999 9 999 9 ·
9 9 9 9 9 9 9 9 9
99 99 9 9· 99 souladu s tím, že vzdálenost od plasmatické membrány je významnou determinantou P-selektinové vazebné aktivity {obrázek 4B) .
Naše data také ukazují, že sulfatace je jednou z determinant schopnosti mucinů podporovat vazbu zaměřenou na apikální doménu. Hodnotili jsme schopnost různých mucinů podléhat sulfataci v COS buňkách. PSGL-1, GD34, CD43 a GlyCAM-1 solubilní mucinové chiméry snadno inkorporovaly 3SS-sulfát sodný, když byly exprivovány v COS buňkách {obrázek 5).
Inhibice sulfatace blokuje vazbu PSGL-l na P-selektin
Objevili jsme, že inhibice sulfatace blokuje vazbu PSGL-1 na P-selektin. COS buňky byly kotransfektovány PSGL-1 a FTVII nebo byly transfektovány PSGL-1 a FTVII separátně. Během doby, ve které bylo očekáváno maximum syntesy PSGL-1, byly buňky inkubovány v DMEM mediu bez sulfátu a obsahujícím 10 mM chlorečnan sodný, relativně silný inhibitor sulfatace (NaC103). Pozorovali jsme signifikantní snížení schopnosti chlorečnanem ošetřených kotransfektovaných buněk vázat se na imobilizovaný P-selektin (obrázek 6A), zatímco stejné buňky vykazovaly malé nebo žádné snížení vazby na imobilizovaný E-selektin (obrázek 6B). Exprese sLex antigenu a PSGL-1 aminoterminální smyčky na povrchu buněk nebyla inhibována ošetřením NaC103. Skutečně, jak je ukázáno v tabulce 3, zvýšení průměrné intensity fluorescence transfektováných buněk, representujících anti-sLe^ a anti-flu smyčku, bylo pozorováno po ošetření chlorečnanem, což naznačuje že chlorečnan může ovlivňovat internalizaci nebo export na buněčný povrch.
AA AA
A
AA A··· • · ·
AAA A A A A
A A A A • A AA
AA A • A A
A AAA
A A AAAA A
AAA • A A • A A A A • AA A A A
AA
AA
Tabulka 3
Exprese (MFI) w/o NaC103 w/10 mM sLex NaClO 3 flu
sLex flu
FTVIIh 23 — 30 —
PSGL-1-flu — 9 — 22
PSGL-1flu + FTVIIh 15 10 35 34
Solubilní PSGL-l imunoglobulinová chiméra syntetizovaná za srovnatelných podmínek vykazovala v podstatě úplnou inhibici inkorporace 35S-sulfátu (obrázek 7), za podmínek, za kterých není proteinová syntesa, jak je měřena inkorporaci (3sS)-cysteinu a methioninu, inhibována. Tato data ukazují, že sulfatace P-selektinového ligandu je nutná pro P-selektinovou vazebnou aktivitu.
Analýza jemných strukturálních delecí apikální domény PSGL-1
Pro lokalizaci elementů ve 100 aminokyselinách apikální domény, které udělují P-selektinovou ligandovou aktivitu jsme připravili soubor delečních mutantů, ve kterých byly deletovány různé regiony apikální domény (obrázek 8A). Každý aminoterminální deleční mutant byl potom umístěn downstream od CD5 leader/flu smyčka elementu pro monitorování exprese na buněčném povrchu. Jemné strukturální deleční mutanty vykazovaly malou variabilitu v jejich schopnosti exprivovat epitop smyčky, jak bylo hodnoceno nepřímou fluorescencí. Odstranění prvních 20 aminokyselin N-konce zralého PSGL-1 neovlivňovalo P-selektinovou vazebnou aktivitu. Oproti tomu, odstranění • 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 000 00000 0 0 0 0 0 0 0 00 00 00 0 prvních 40 aminokyselin N-konce rušilo vazbu (obrázek 8B).
Další delece PSGL neovlivňovaly P-selektinovou vazebnou aktivitu. V souladu s tím, aminokyselinové zbytky 20 až 40 PSGL (t.j. zbytky 38 - 57 určeného prekursoru majícího signální sekvenci) jsou nutné pro vazbu P-selektinu.
Pro demonstraci toho, zda jsou zbytky 38 - 57 dostatečné pro aktivitu zaměřenou na apikální doménu PSGL-1 jsme připojili tento segment na amino konec PSGL-1 a CD43 mucinová jádra, ze kterých byly apikální domény deletováňy (obrázek 9A). V obou případech, adice aminokyselin 38 - 57 PSGL-1 peptidového elementu udělovalo P-selektinovou vazebnou aktivitu mucinovému jádru. V obou případech byla hladina P-selektinové vazebné aktivity ekvivalentní hladině pro nativní PSGL-1 (obrázek 9B).
Specifické zbytky v aminokoncovém peptidu jsou nutné pro
P-selektinovou vazebnou aktivitu
Region o 20 aminokyselinách, který je nezbytný pro vazbu P-selektinu obsahuje tři potenciální sulfatační místa pro tyrosin a dva threoninové zbytky pro 0-vázanou glykosylaci. Pro hodnocení významu těchto zbytků byl tyrosin konvertován na fenylalanin (obrázek 9A). Ve druhém peptidu byly threoniny konvertovány na alaniny. Navíc byl připraven třetí peptid obsahující pětinásobnou mutaci tak, že obě konverse byly provedeny v jednom peptidu. Každý mutovaný peptid byl potom umístěn separátně downstream od flu smyčky a upstream od buď (1) zkráceného PSGL-1 postrádajícího apikální doménu, nebo (2) CD43 opakujících se elementů a transmembránové domény. Buňky exprivující vzniklé chiméry byly testovány na jejich schopnost • · · • · ·
4» · vázat se na imobilizovaný P-selektin (obrázek 9A). Konverse tyrosinů na fenylalaniny vedla ke ztrátě vazebné aktivity k P-selektinu. Nahrazení threoninových zbytků alaninem zmenšilo vazbu, ale nerušilo ji zcela. Exprese flu smyčky nebo sLe* epitopu nebyla ovlivněna v těchto buňkách. Vazba zprostředkovaná apikálními 20 zbytky byla, podobně jako u nativního PSGL-1, závislá na přítomnosti vápníku. Tato data naznačují, še sulfatace tyrosinů v pozicích 46, 48 a 51 je nutná pro P-selektinovou vazebnou aktivitu. E-selektinová vazba nebyla ovlivněna za stejných podmínek. Kromě toho, tato data ukazují, že threoniny v pozici 44 a 57 jsou nezbytné. Tyto threoninové zbytky mohou sloužit jako místa pro O-vázanou glykanovou adici. Tyto pokusy, spolu s našimi pokusy ukazujícími, še exprese FTVII je nezbytná pro P-selektinovou vazbu, poskytují důkaz, še P-selektinová vazba vyžaduje sLe3* v threoninech 44 a 57. Dohromady, výše uvedené pokusy ukazují, že aminokyseliny 38 - 57, které obsahují tři zbytky pro sulfatace a dva zbytky pro adici sLex, jsou dostatečné pro udělení P-selektinové vazebné aktivity.
Zbytky v aminoterminálních 20 aminokyselinách jsou sulfatovány na tyrosinů
Pro určení toho, zda je aminoterminální segment schopen být sulfátová in vivo jsme vytvořili fúsní proteiny přirozených nebo mutantních peptidových sekvencí připojených ne lidský imunoglobulin Gl (IgGl) (obrázek 12A). Vzniklé fúsní proteiny byly exprivovány v COS buňkách a jejich schopnost asimilovat organický sulfát byla hodnocena (obrázek 12 B). Imunoglobulinové chiméry nesoucí přirozené peptidové sekvence byly schopné inkorporace sulfátu, zatímco ty, které měly fenylalanin substituovaný za tyrosin nebyly (obrázek 12C). Náhrada
• 4 · · · · threoninu alaninem neměla žádný účinek na inkorporaci sulfátu (obrázek 12C).
Inhibitory sulfatace blokují HL-60 pohyb na
P-selektin-imunoglobulin chimérách.
Pro vyšetření toho, zda inhibice sulfatace bude narušovat fyziologicky relevantní adhesi jsme podrobili HL-60 buňky kultivaci na mediu obsahujícím chlorečnana vyšetřovali jsme schopnost vzniklých buněk přilnout a posunovat se na krycích sklíčkách potažené chimérami P-selektin-imunoglobulin za podmínek definovaného střihového stresu kapaliny (Lawrence et al., Blood, 75: 227 - 237, 1990). HL-60 buňky byly schopné přilnutí a pohybu po krycích sklíčkách předem potažených chimérami P-selektin-imunoglobulin, zatímco žádné takové interakce nebyly pozorovány pro krycí sklíčka potažená chimérou CD4-imunoglobulin (obrázek 13). Kultivace HL-60 buněk v chlorečnanu dramaticky redukovala frekvenci buněčných interakcí se substrátem (obrázek 13) .
Protilátky a protilátkové fúsní proteiny nesoucí sialyl-Le31 a sulfátované determinanty
V jednom provedení se vynález týká protilátky nesoucí sialyl-Le^ a sulfátované determinanty. Tak může být vytvořena protilátka zavedením sulfatačních míst (t.j. tyrosinu v acidickém kontextu) do existující molekuly protilátky v okolí zavedeného nebo existujícího sialyl-Le^ adičního místa (například, standartní místně řízenou mutagenesí).
Alternativně, vhodná sialyl-Le^ a/nebo sulfatační místa mohou být přidána připojením jakhokoliv sekvence P-selektinového ligandu (například, jakékoliv P-selektinové domény zde popsané) • · « · • · · · ·
O Q · · · · ·
ZO , o · · · · • · · · · · ·· ·· ··
k přirozené sekvenci protilátky (napříkladIgG nebo IgM) standartními rekombinantními DNA technikami za produkce fúsního proteinu P-selektin-protilátka. Preferovaně, sekvence
P-selektinového ligandu je připojena na aminokonec protilátkové molekuly. Takové protilátky jsou užitečné v narušení nežádoucích interakcí mezi buňkami nebo proteiny, nebo, obecně, pro narušení jakýchkoliv interakcí mezi dvěma molekulami, z nichž jedna nese determinantu rozpoznávanou protilátkou. Protože tyto determinanty normálně účinkují pro usnadnění interakcí obsahujících E-selektin a P selektin (např. interakce mezi néutřofili a endoteliálními buňkami na stěně krevních cév), poskytuje schopnost narušovat takové interakce mnoho terapeutických aplikací, například, v minimalizaci zánětlivého procesu a snížení na extravasaci závislého orgánového postižení a/nebo srážení.
Kromě toho, pokud je to žádoucí, jedna nebo více sialyl-Le^ skupin, které maskují CH2 část imunoglobulinové molekuly a tak inhibují fixaci komplementu a vazbu Fc receptoru, mohou být také inkorporovány do sekvence protilátky. Protože uhlovodanové skupiny blokují imunoglobulínovou doménu, která spouští fixaci komplementu a vazbu na Fc receptor, nebudou takové protilátky vyvolávat nežádoucí vedlejší účinky (t.j. ty, které vznikají v důsledku fixace komplementu a vazby Fc receptoru) často asociované s terapií založenou na protilátkách. Preferovaně neslouží uhlovodanová skupina pouze pro inhibici nežádoucí fixace komplementu a vazby Fc receptoru, ale také účinkuje v kompetitivní inhibici E-selektinem a/nebo
P-selektinem zprostředkované intracelulární interakce.
Pro inhibici fixace komplementu a vazby Fc receptoru mohou
29:
• · • · často asociované s terapií založenou na protilátkách. Preferovaně neslouží uhlovodanová skupina pouze pro inhibici nežádoucí fixace komplementu a vazby Fc receptoru, ale také účinkuje v kompetitivní inhibici E-selektinem a/nebo P-selektinem zprostředkované intracelulární interakce.
Pro inhibici fixace komplementu a vazby Fc receptoru mohou být sialyl-Le3* determinanty přidány k molekule protilátky v jakémkoliv vhodném místě. N-vázaná glykan adiční místa jsou dobře známá: Ν X S/T (kde N je asparagin, S je serin, T je threonin a X je jakákoliv aminokyselina kromě prolinu). V souladu s tím může být projektována jakákoliv příkladná molekula, která obsahuje několik takových míst pro připojení sialyl-Le3* postraních řetězců. Inspekce IgGl sekvence (obrázek 10 A - E) ukazuje alespoň pět míst, do kterých může být zavedeno N-vázané adiční místo pro glykan do molekuly ve výhodném umístění, kde tímto procesem je narušena fixace komplementu a vazebná schopnost pro Fc receptor. Tyto místa zahrnují aminokyselinové zbytky 274, 287, 295, 322 a 335. Ačkoliv toto jsou preferovaná místa pro N-vázanou adici glykanu, nejsou to jediní kandidáti; mohou být identifikována jiná použitelná místa a mohou být inkorporována do IgGl sekvence za použití následujících kriterií jako návodu: (1) místa jsou preferovaně umístěna v CH2 regionu imunoglobulinové molekuly, t.j. v části molekuly odpovědné za fixaci komplementu a vazbu Fc receptoru;
(2) místa jsou umístěna v regionech sekvence, určených podle jejich hydrofobního charakteru, jako zevní vzhledem k imunoglobulinové molekule a proto dostupné pro enzymy odpovědné za připojení uhlovodanového postraního řetězce; (3) místa jsou umístěna v regionu, který je minimálně narušítelný k primární aminokyselinové sekvenci a tak k určené sekundární změněný list aminokyselinové struktuře. Například, přirozené místo, které se liší od N-vázaného adičního místa pro glykan v jedné aminokyselině bude preferováno před místem vyžadujícím dvě alterace v aminokyselinové sekvenci. Kromě toho, je preferováno vytvoření N-vázaného adičního místa pro glykan substitucí aminokyselin stejného náboje nebo polarity (např. jedné nenabité aminokyseliny za jinou). Jedna nebo více substitucí N-vázaných adičních míst pro glykan může být zpracována do určité IgGl kódující sekvence; takové sekvence (t.j. ty, které kódují molekulu protilátky, na kterou jsou připojeny sialyl-Le^ skupiny) jsou nazývány IgGl-sialyl-Le3* nebo IgGl-Le3*.
Zavedení dalších glykosylačních míst v aminokyselinách č.
274, 287 a 322 v CH2 doméně vytváří molekulu, která není rozpoznávána Fc receptorem nebo komplementem za použití testů, které jsou v oboru standartní; příkladné testy pro fixaci komplementu j sou popsány v Weir et al., Handbook of Experimental Immunology, Blackwell, Oxford; a v Goligan et al., Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1995.
Jednotlivá IgGl molekula nesoucí sialyl-Le^ skupiny je produkována následujícím způsobem. IgGl gen je veřejně dostupný a jeho sekvence je ukázána na obrázku 10. Gen je mutagenizován standartními metodami in vitro místně řízené mutagenese pro zavedení jednoho nebo více adičních míst pro N-vázaný glykan (např. těch, které jsou popsány výše a ukázány nad přirozenou sekvencí podle obrázku 10A-E). Gen je potom insertován do vektoru vytvořeného pro expresi proteinu v eukaryotických buňkách (viz napřílad ty vektory, které popisuje Gillies et al., U.S patent č. 4663281, terý je zde uveden jako odkaz). Eukaryotickou hostitelskou buňkou je preferovaně savčí buňka (například CHO změněný list • 0* ·
0 0 0 • · být exprivován z vektoru odlišného od vektoru kódujícího IgGl-Le3*, nebo mohou být oba geny neseny na jednom vektoru a z něj exprivovány. Savčí buňky jsou zejména použitelnými hostitely pro syntesu IgGl-Le^, protože poskytují všechny nutné prekursory pro produkci sialyl-Le^.
Pro produkci sialyl-Le^-modifikovaných a sulfatovaných protilátek podle předkládaného vynálezu je gen kódující sekvenci protilátky preferovaně exprivován v buňkách, které také exprivují a(1,3) fukosyltransferasu, která exklusivně katalyzuje a(1,3) fúkosové vazby; takový enzym je popsán v Walz et al., Science 250: 1132 - 1135 (1990 a v Seed, U.S.S.N. 08/483151 nazvaném Fucosyltransferase Genes and Uses Thereof, podaném 7.6.1995 (zde je uveden jako odkaz). Méně výhodně může být využita a(1,3) fukosyltransferasová cDNA popsaná v Lowe et al., (Cell, 63: 475, 1990). Tato fukosyltransferasa rozpoznává sialyzovanou prekursorovou molekulu a připojuje buď a (1,3)nebo a(l,4)- vázanou fúkosovou skupinu k N-acetylglukosaminovým postraním řetězcům. Sialyl-Le^ determinanta je charakterizována a(l,3) vazbou a enzym a(l,3) fukosyltransferasa podle Lowe (výše) produkuje jak požadované sialyl-Le*-molekuly, tak produkty mající α(1,4)-vázanou fukosu která, ačkoliv není aktivní ve vazbě na P-selektin a E-selektin, neinterferuje s účinkem sialyl-Le^-modifikovaných molekul ani neprodukuje jiné nežádoucí vedlejší účinky.
Hostitelské buňky produkující a(l,3) fukosyltransferasu a protilátku, která má být modifikována, jsou kultivovány standartními metodami a protilátka je purifikována z lyzátu buněk na základě její afinity k Protein A koloně nebo je purifikována jakoukoliv jinou standartní technikou izolace » 9 9 *
9 9 • 9 9 9 4
9 4
9 9 9 protilátek purifikace.
Fúsní proteiny -kyselý glykoprotein - protilátka nesoucí sialyl-Le3* a sulfátované determinanty
Jak bylo uvedeno výše, protilátkové fúsní proteiny modifikované sulfatací a adicí sialyl-Le^ mají významné terapeutické a diagnostické použití. Předešlé práce ukázaly, že velká množství protilátkových fúsních proteinů mohou být generovány a secernovány transientně z transfektovaných savčích buněk (například COS buněk). Obecně jsou pro produkci AGP protilátkového fúsního proteinu podle předkládaného vynálezu DNA kódující AGP a P-selektinovóu ligandovou doménu fúsovány v rámečku na lidské IgG domény (například konstantní domény) standartními technikami a fúsní protein je exprivován, také za použití standartních technik. Protilátková část molekuly usnadňuje purifikaci fúsního proteinu a také prodlužuje plasmatický poločas krátkou dobu přežívajících polypeptidů nebo polypeptidových domén. Preferovaně jsou protilátkové fúsní proteiny exprivovány podle metody popsané v Seed, U.S.S.N. 08/483151 nazvaném Fucosyltransferase Genes and Uses Thereof, podaném 7.6.1995 (zde je uveden jako odkaz), například za použití IgG nebo IgM protilátek nebo jejich částí (viz také Zettlemeisl et al., DNA Cell Biol. 9: 347 (1990) pro IgM fúsní proteiny).
Rekombinantní plasmidy exprivující jednotlivé AGP-protilátka fúsní proteiny (např. AGP-Pant-CH2-CH3 a AGP-CH2-CH3 proteiny) byly konstruovány následovně. cDNA kódující α^-AGP gen akutní fáze byla klonována z lidské jaterní cDNA knihovny polymerasovou řetězovou reakcí (PCR) za použití • · · proteiny).
Rekombinantní plasmidy exprivující jednotlivé AGP-protilátka fúsní proteiny (např. AGP-Pant-CH2-CH3 a AGP-CH2-CH3 proteiny) byly konstruovány následovně. cDNA kódující α^-AGP gen akutní fáze byla klonována z lidské jaterní cDNA knihovny polymerasovou řetězovou reakcí (PCR) za použití oligonukleotidových primerů korespondujících 5' a 3' kódujícím regionům o^-AGP (Board et al., Gene 44: 127, 1986) podle standartnich technik. 5' AGP primer byl vytvořen tak, aby obsahoval HindiII restrikční místo a 3' primer byl vytvořen tak, aby obsahoval BamHI restrikční místo spíše než AGP stop kodon. PCR amplifikovaný produkt byl tráven HindiII/BamHI a klonován do HindiΙϊ/BamHI Sestřižené plasmidové expresní kazety (viz Aruffo et al., Cell 61: 1303, 1990) obsahující konstantní domény lidského IgGl (t.j. pant-CH2-CH3 nebo CH2-CH3). Sekvence nukleotidů a aminokyselinová sekvence tohoto AGP-IgG fúsního proteinu jsou ukázány na obrázku 11A-B a obrázku 11C, v příslušném pořadí.
Pro vytvoření molekul, které blokují P-selektinem zprostředkované interakce jsou místa pro sulfataci, a pokud je nutné, pro adici sialyl-Le3*, zavedena do sekvence protilátkového fúsního proteinu (například, protilátkových fúsních proteinů popsaných výše). Taková místa mohou být inkorporována do existující fúsní molekuly, například, zavedením jednoho nebo více míst pro sulfataci (t.j. tyrosinu v acidickém kontextu) do okolí zavedených nebo existujících sialyl-Le^ adičních míst (například standartními technikami místně řízené mutagenese), nebo může být sekvence P-selektinového ligandu (například, jakákoliv sekvence změněný list ·· φφφφ ·· · φφφφ • φ · φ φ · φφφφ • Φ · φφφφ φφφφ • φ φφφφ φφφφ φ ·ΦΦ φ · φ φ φ φ φφφ φφφ produkci solubilních protilátkových fúsních proteinů.
Pro přípravu protilátkových fúsních proteinů schopných inhibice fixace komplementu a vazby Fc receptorů mohou být adiční sialyl-Le^ konsensuální glykosylační místa (N-X-T/S) zavedena do CH2 domény lidského IgGl jak je popsáno výše.
Na základě této konstrukční strategie může být vytvořen jakýkoliv počet rekombinantních P-selektin-AGP-protilátkových fúsních proteinů majících dlouhý plasmatický poločas a schopnost inhibovat nežádoucí interakce buňka-buňka (například interakce mezi leukocyty a selektin-nesoucími buňkami). Pro generování molekul se zvýšeným inhibičním potenciálem jsou vyrobeny kandidátové molekuly a jsou vyšetřovány za použití testů popsaných výše. V jednom určitém příkladu mohou být molekuly vyšetřovány na svou schopnost inkorporovat sialyl-Le^ a sulfátované determinanty a blokovat vazbu neutrofilů na aktivované endoteliální buňky; takové molekuly nacházejí uplatnění v selektin-dependentních zánětlivých reakcích a tkáňovém poškození způsobeném invazí leukocytů.
Molekuly, které jsou schopné interferovat se P-selektinem zprostředkovanými a E-selektinem zprostředkovanými interakcemi
Protože jak P-selektinem zprostředkované, tak E-selektinem zprostředkované intracelulární interakce jsou zahrnuty v zánětlivém procesu a protože rozhodující determinanty zahrnuté v těchto interakcích byly nyní identifikovány, je možné vytvořit jednotlivou molekulu schopnou interference s oběma typy škodlivých interakcí. Konkrétně, Mohou být konstruovány molekuly (například proteiny), které obsahují jak
4444 • 4 4 4 4 44 · 444 4««4
4 444· 4444
4444 4444 4 444 4 · • · · · 444 444
44 44 4 44 44
P-selektinovou ligandovou doménu (t.j. doménu nesoucí sialyl-Le^ a sulfátované skupiny) a E-selektinovou ligandovou doménu (t.j. doménu nesoucí sialyl-Le3'1 skupinu). Taková molekula může být konstruována kombinováním domén, například, připojením P-selektinové ligandové domény na sialyzovanou molekulu (například sialyzovanou protilátku nebo protilátkový fúsní protein zde popsaný). Alternativně, vhodná sialyl-Le^ a/nébo sulfatační místa mohou být zavedena dó existující sekvence, například místně řízenou mutagenesí.
Glykosylace nebo sulfatace zpracovaných molekul může být testována, například, jak je popsáno zde a v Walz et al., Science 250: 1132 - 1135 (1190). Schopnost sialyl-Le^-modifikovaných a/nebo sulfatovaných molekul interferovat s intracelulárními interakcemi může být také testována jak popisuje Walz et al., výše, nebo jakoukoliv jinou standartní technikou, například, testováním schopnosti zvýšených koncentrací determinantu nesoucí molekuly inhibovat adherenci T-lymfocytů nebo myeloidních buněk na imobilizovaný P-selektin a/nebo E-selektin.
Použití
Pro podání proteinu nebo organické molekuly podle předkládaného vynálezu pacientovi je farmaceuticky čistá molekula nebo protein suspendována v akceptovatelném nosiči, např. fyziologickém roztoku, a je podána pacientovi jakoukoliv vhodnou cestou (například intravenosně) v jednotlivé dávce nebo v několika dávkách. Optimálně, dostatečné množství léčiva je poskytnuto tak, aby byla saturována všechna P-selektinová, a pro molekuly s duální funkcí, všechna E-selektinová vazebná • 4 444 4
4 44 44
4 444 4444
4 4444 4444
4 4 4 4 4 4444 4 444 4 4
4444 44 4 444
44 44 4 44 44 místa na endoteliálních buňkách. Typicky může být tohoto dosaženo dávkami 0,1 mg/kg nebo vyššími. Preferované dávkování je v rozsahu 0,1 - 2,0 mg/kg.
Sialyl-Le^ modifikované a sulfátované molekuly a proteiny podle předkládaného vynálezu (například modifikované protilátky a protilátkové fúsní proteiny zde popsané) mohou být použity, v jednom příkladu, pro léčbu na extravasaci závislého orgánového poškození a/nebo srážení. Konkrétně, protože P-selektin zprostředkuje připojení neutrofilů do místa zánětu nebo tkáňového poškození nebo urychluje tvorbu trombu, poskytují molekuly a protiny podle předkládaného vynálezu užitečná teraputika pro blokování takových interakcí. Například, P-selektin pravděpodobně zprostředkuje migraci neutrofilů do plic po syndromu respirační tísně dospělých a do srdce po ischemickém poškození myokardu (t.j. infarktu), a může hrát roli v glomerulárním poškození ledvin za jistých stavů. V souladu s tím, sialyl-Le^-modifikované a sulfátované molekuly a proteiny podle předkládaného vynálezu mohou být podány pacientů s takovými onemocněními nebo chorobnými stavy. Taková léčba zmírňuje poškození závislé na extravasaci kompetitivní inhibici interakcí mezi invadujícími neutrofily a endoteliálními buňkami cév nebo orgánů. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu, jednotlivě fúsní proteiny P-selektinový ligand-AGP a fúsní proteiny P-selektinový ligand-AGP-protilátka, mohou být také použity, jak je popsáno výše, v léčbě septického šoku nebo septikemie.
Kromě toho, protilátky nebo protilátkové fúsní proteiny podle předkládaného vynálezu mohou být použity v konvenčních technikách terapií založených na protilátkách nebo v • 0
0 0
0
000 0
0
0
0
0 0 000 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00 0000 0000 0 0 0 0 0 0 0
0000 00 0 diagnostice in vivo, za využití specificity protilátky k cílovému teraputickému nebo diagnostickému místu. V jednom určitém provedení, P-selektinová ligandová doména protilátkového fúsního proteinu podle předkládaného vynálezu navádí tento protein do místa zánětu a poskytuje jak teraputické použití (užitečné pro blokování škodlivých P-selektinem zprostředkovaných intracelulárních interakcí) tak dignostické použití (užitečné pro zaměření místa zánětu). Opět, připojené sialyl-Le^ determinanty mohou být použity pro maskování CH2 domény protilátky a pro blokování nežádoucích účinků fixace komplementu a vazby Fc receptoru.
Jiná provedení
Další provedení jsou v rozsahu patentových nároků.
Například, za účelem blokování interakcí mezi buňkami a proteiny může být jakákoliv jiná vhodná molekula nosiče, na kterou mohou být připojeny síalyl-Le^ a sulfátované determinanty, využita ve vynálezu. Obecně jsou preferovány proteiny vzhledem k jejich relativně dlouhému poločasu v séru. Jedna třída proteinových nosičů jsou sérové proteiny jako je albumin (například hovězí sérový albumin nebo lidský sérový albumin), transferin, nebo a-2 makroglobulin. Proteinové nosiče mohou obsahovat endogení sulfatační nebo glykanová adiční místa kromě těch míst, která jsou zavedena do DNA sekvence proteinového nosiče (jak je popsáno výše) například pomocí místně řízené mutagenese. Molekula nosiče může být méně výhodně lipid. V jednom příkladu je lipid s jednou nebo více připojenými sialyl-Le3*2 nebo sulfátovanými determinantami podán jako liposom do cílové buněčné stěny (například stěny endoteliálních buněk). Liposom může blokovat buněčné nebo • · ·· ·00·
0 0 0
0 00
0 0 0 0
0 · • · · · · · • · « · · · · • · · · · · ···· • · · · · · 0 0000 00 0 proteinové interakce nebo může být použit pro dopravu léčiva do vhodného místa účinku. Produkce molekul nosičů nesoucích sialyl-Le3* a sulfátované determinanty může být provedena v buňce, preferovaně v eukaryotické buňce jiné než kvasince.
Savčí buňky, například, savčí buněčné linie, poskytují zejména vhodné hostitele. Tyto buňky obecně syntetizují nezbytné prekursorové molekuly a produkují, nebo mohou být zpracovány tak, aby produkovaly, enzymy odpovědné za sulfataci nebo připojení uhlovodanů. Pro připojení sialyl-Le^ determinant jsou zejména vhodné savčí buněčné linie jako je CHO a lecll. Alternativně, jedna nebo obě z sialyl-Le^ a sulfatovaných determinant mohou být připojeny na molekulu nosiče in vitro, t.j. extracelulárně. V jednom příkladu bude a(1,3) fukosyltransferasa navázána na pevný nosič (například kolonu} a sulfatovaná molekula nosiče bude probíhat přes navázaný fukosyltransferasový enzym, za podmínek, které usnadní připojení sialyl-Le2* skupin na jejich příslušná místa na molekule nosiče.
Vynález také zahrnuje použití sulfátovaných a sialyl-Le^-modifikovaných fúsních proteinů AGP-protilátka pro ochranu před, inhibici a nebo léčbu šok-indukujících stavů, klinicky manifestovaného šoku nebo obou těchto stavů, které jsou způsobeny mikrobiálními faktory (např. 1ipopolysacharidy (LPS)), mikrobiálními toxiny (např. enterotoxiny toxického šoku), mediátory hostitele (např. cytokiny), nebo protinádorovou terapií (např. podáním tumor nekrososo faktoru (TNF) nebo interleukinu - 1 (IL-l)), nebo jakoukoliv jejich kombinací. Například, takový protilátkový fúsní protein může být podán člověku pro zmírnění účinků septického šoku indukovaného LPS. Schopnost protilátkového fúsního proteinu • · · tt · ♦ • · · · · · · • · · · · · ·»*♦ • · · · · · tt tttt tttt tttt · • · tt· • · • tttt· · tt · tt· ·· chránit před, léčit nebo inhibovat účinky šoku (např. septikemie nebo syndromu toxického šoku) je hodnocena standartními metodami v oboru známými (např. ty, které jsou popsány v Libert et al., (1994), J. Exp. Med. 180: 1571 1575).
Všechny publikace, patenty a patentové přihlášky zde zmíněné jsou zde uvedeny jako odkazy ve stejném rozsahu, v jakém byla jednotlivá publikace, patent, a patentová přihláška specificky a jednotlivě uvedena jako odkaz.

Claims (8)

1. Organická molekula, na kterou je kovalentně navázána sialyl-Le2* determinanta a sulfátovaná determinanta, kdy alespoň jedna z těchto determinant je umístěna na nepřirozeném místě na uvedené molekule.
2. Organická molekula podle nároku 1, kde uvedená molekula obsahuje mnohotné sialyl-Le351 determinanty nebo mnohotné sulfátované determinanty.
3. Organická molekula podle nároku l, kde uvedená molekula je rozpustná.
4. Organická molekula podle nároku 1, kde uvedená molekula obsahuje P-selektinový ligand skládající se v podstatě z aminokyselin 21 - 57 podle obrázku 8A, nebo jeho část, který je schopen zprostředkovat interakci s P-selektinovým receptorem.
5. Organická molekula podle nároku 4 kde uvedená molekula obsahuje P-selektinový ligand skládající se v podstatě z aminokyselin 38 - 57 podle obrázku 8A.
6. Organická molekula podle nároku 1 nebo 4, kde uvedená molekula obsahuje ot^-kyselý glykoprotein (AGP) .
7. Organická molekula podle nároku 1 nebo 4, kde uvedená molekula obsahuje molekulu protilátky.
8. Purifikovaná nukleová kyselina kódující jakoukoliv organickou molekulu podle nároků 4 - 7.
CZ974014A 1995-06-14 1996-06-11 P-selektinové ligandy a příbuzné molekuly a způsoby CZ401497A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US21395P 1995-06-14 1995-06-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ401497A3 true CZ401497A3 (cs) 1998-07-15

Family

ID=21690430

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ974014A CZ401497A3 (cs) 1995-06-14 1996-06-11 P-selektinové ligandy a příbuzné molekuly a způsoby

Country Status (14)

Country Link
EP (1) EP0833650A4 (cs)
JP (1) JPH11508131A (cs)
KR (1) KR19990022954A (cs)
AR (1) AR003436A1 (cs)
AU (1) AU6272996A (cs)
BR (1) BR9608918A (cs)
CA (1) CA2224625A1 (cs)
CZ (1) CZ401497A3 (cs)
HU (1) HUP9901131A2 (cs)
IL (1) IL122590A0 (cs)
NO (1) NO975862L (cs)
TR (1) TR199701620T1 (cs)
WO (1) WO1997000079A1 (cs)
ZA (1) ZA965032B (cs)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999043834A2 (en) * 1998-02-27 1999-09-02 Genetics Institute, Inc. P-selectin ligand protein, including tetrameric fusion proteins
RU2003123101A (ru) * 2000-12-29 2005-03-10 Сейвиент Фармасьютикэлс, Инк. (Us) Изолированные молекулы, включающие эпитопы, содержащие сульфатированные остатки, антитела для эпитопов и их использование
JP4599027B2 (ja) * 2002-10-30 2010-12-15 東洋水産株式会社 Ｌ−セレクチン結合阻害剤

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0714912B1 (en) * 1990-07-17 2002-09-25 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma GMP-140 ligand
US5318890A (en) * 1991-05-06 1994-06-07 The Regents Of The University Of California Assays for inhibitors of leukocyte adhesion
EP0668907A1 (en) * 1992-11-16 1995-08-30 Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Glycoprotein ligand for p-selectin and methods of use thereof
AU2361395A (en) * 1994-04-28 1995-11-29 Genetics Institute Inc. Novel P-selectin ligand protein

Also Published As

Publication number Publication date
TR199701620T1 (xx) 1998-05-21
IL122590A0 (en) 1998-06-15
CA2224625A1 (en) 1997-01-03
BR9608918A (pt) 1999-06-15
AR003436A1 (es) 1998-08-05
AU6272996A (en) 1997-01-15
NO975862L (no) 1998-02-12
EP0833650A1 (en) 1998-04-08
WO1997000079A1 (en) 1997-01-03
HUP9901131A2 (hu) 1999-07-28
KR19990022954A (ko) 1999-03-25
NO975862D0 (no) 1997-12-12
ZA965032B (en) 1997-03-14
JPH11508131A (ja) 1999-07-21
EP0833650A4 (en) 2005-01-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3662021B2 (ja) 補体関連蛋白質および炭水化物よりなる組成物、ならびに該組成物の製法および使用方法
Saginario et al. MFR, a putative receptor mediating the fusion of macrophages
JP3096305B2 (ja) Ｇｍｐ―１４０に対する糖タンパク質リガンド
JP2000325092A (ja) 細胞接着蛋白質と糖質リガンドとの間の相互作用阻害に使用し得る抗体
WO1994029342A1 (en) Cell surface lamp expression and selectin-dependent adhesion
KR20040039440A (ko) 셀렉틴 매개 염증의 펩티드 및 ｏ-글리칸 억제제
Mery et al. The NH2-terminal region of C5aR but not that of FPR is critical for both protein transport and ligand binding.
IL180967A (en) A nucleic acid molecule that encodes a homologue of a toll-like receptor and a chimeric molecule that includes it
CA2134756C (en) Selectin variants
JPH08502886A (ja) 新規ｐ−セレクチンリガンド蛋白質
WO1994013312A1 (en) Mucosal vascular addressin, dna and expression
US5648465A (en) Cloning and expression of neurocan, a chondroitin sulfate proteoglycan
JPH08501535A (ja) 疾患を治療するためのペプチド薬剤
WO1994003601A9 (en) Cloning, expression and uses for neurocan as a chondroitin sulfate proteoglycan
US20040181037A1 (en) Phosphatidyl serine receptors and uses thereof
US7399847B1 (en) Nucleic acids encoding artificial P-selectin ligands
Basmaciogullari et al. Mapping the CD4 binding domain of gp17, a glycoprotein secreted from seminal vesicles and breast carcinomas
CZ401497A3 (cs) P-selektinové ligandy a příbuzné molekuly a způsoby
US6670135B1 (en) Semaphorin polypeptides
KR20010085287A (ko) 단백질 타이로신 포스파타아제의 세포내 도메인에 대한 항체
KR100463567B1 (ko) 셀렉틴매개염증의펩티드및0-글리칸억제제
JP4180881B2 (ja) ヒアルロン酸結合性ペプチド
WO2005051973A2 (en) Peptides derived from natural cytotoxicity receptors and methods of use thereof
Fourie The expression and metabolism of low density lipoprotein receptors in familial hypercholesterolaemia
Teixeira Structural analysis of the biliary glycoprotein (BGP) binding site