JPH11508131A

JPH11508131A - Ｐ−セレクチンリガンドおよび関連分子並びに方法

Info

Publication number: JPH11508131A
Application number: JP9503258A
Authority: JP
Inventors: ブライアンシード; ターラポウヤニ
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1995-06-14
Filing date: 1996-06-11
Publication date: 1999-07-21
Also published as: AR003436A1; CZ401497A3; IL122590A0; ZA965032B; NO975862L; CA2224625A1; AU6272996A; KR19990022954A; TR199701620T1; EP0833650A1; NO975862D0; BR9608918A; EP0833650A4; WO1997000079A1; HUP9901131A2

Abstract

(57)【要約】シアリル-Le^x決定基および硫酸決定基を共有結合している有機化合物分子であって、これらの決定基のうちの少なくとも一つが該分子の天然に生じたのではない部位に位置する、有機化合物分子を開示する。さらに、特定のP-セレクチンリガンドおよびP-セレクチンリガンド-抗体融合タンパク質も、開示する。これらの分子、リガンド、および融合タンパク質を、器官損傷および凝血のような、炎症及び血管外滲出依存性の有害な反応を、抑制または防御する方法に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 P-セレクチンリガンドおよび関連分子並びに方法連邦支援研究の申告本発明はNIH補助金DK43031によるアメリカ合衆国政府の支援で為され、およびこのため、アメリカ合衆国政府は本発明に対し一定の権利を有する。発明の背景本発明は、P-セレクチンリガンドの分子、DNAおよびそれらの使用に関する。 P-セレクチンは、膜内在性のC型レクチンで、内皮細胞のヴァイペル−パラーデ体、および血小板のアルファ顆粒内に見出される（McEverら、J．Clin．Inves t．，84: 92〜99，1989; Bonfantiら、Blood，73: 1109〜1112，1989; Hsu-Lin ら、J．Biol．Chem.，259: 9121〜9126，1984; Stenbergら、J．Cell Biol.，10 1: 880〜886,1985）。トロンビン、ヒスタミン、およびマスト細胞の活性化により放出されるその他のメディエーター、補体C5b-9複合体またはC5a断片、過酸化水素、ならびに酸化型低比重リポタンパク質により、P-セレクチンの形質膜への移動を、誘発することができる（Hsu-Linら、J．Biol．Chem.，259: 9121〜9126 ，1984; Stenbergら、J．Cell Biol.，101: 880〜886，1985; Hattoriら、J．Bi ol．Chem.，264: 9053〜9060，1989; KubesおよびKanwar，J．Immunol.，152: 3 570〜2577，1994; Thorlaciusら、Biochem．Biophys．Res．Communications，20 3: 1043〜1049，1994; Foremanら、J．Clin．Invest.，94: 1147〜1155，1994; Patelら、J．Cell Biol.，112: 749〜759，1991; Lehrら、Laboratory Invest. ，71: 380〜386，1994; Gebuhrerら、Biochem.J.，306: 293〜298，1995）。一旦細胞表面上に提示されると、P-セレクチンは、骨髄性単球が血小板または内皮細胞に接着するのを支持する（Larsenら、Cell，59: 305〜312，1989，Hamburge rおよびMcEver，Blood，75: 550〜554，1990; Gengら、Nature，343: 757〜760 ，1990; Gambleら、Science，249: 414〜417，1990）。後者の状態において、P- セレクチンは、下層組織の傷害に先駆けて出現し、ならびに、白血球が血管外滲出する最初の段階、即ち後毛細管小静脈壁に沿った好中球のローリングを支持する（Lawr enceおよびSpringer，Cell，65: 859〜873，1991）。P-セレクチンの構造遺伝子に関し、同型の対立遺伝子が欠損したマウスでは、白血球のローリングが減少し、実験的に誘発した炎症部位への顆粒球の動員が遅れる（Mayadasら、Cell，74: 541〜554，1993）。一般に、P-セレクチンの発現を誘発するメディエーターは、外傷または創傷のシグナルを発する際に働く。組織が外傷を受けた場合、最初に認識される反応の一つは、ヒスタミン、セロトニン、及びその他の拡散性メディエーターの放出を伴う、マスト細胞の活性化である。その他に通常の現象としては、血管断裂部位における血栓形成、および、異物による補体第２経路の活性化がある。P-セレクチンの発現は、これらの状況の各々において産生されるシグナルにより、誘発される。P-セレクチンを介して好中球のローリングが誘発されることは、外科的処置を施した場合には避けられない結果と考えられていたが、マスト細胞の脱顆粒を阻害する薬剤であるクロモリンは、そのようなローリングを阻止し、この結果として、外傷および血管外滲出の間に介在するマスト細胞の役割を見事に証明することが示された（Kubesおよびkanwar，J．Immunol.，152: 3570〜3577，1994）。発明の概要第１の形態として、本発明は、シアリル-Le^x決定基および硫酸決定基が共有結合している有機化合物分子であって、これらの決定基の少なくとも一つが、その分子の天然に生じたのではない部位に位置する、有機化合物分子を特徴とする。第２の形態としては、本発明は、基本的には（a）図8Aの第21〜57番目のアミノ酸、および（b）図8Aの第38〜57番目のアミノ酸から本質的になる群より選択される、P-セレクチンのリガンドを特徴とする。第３の形態として、本発明は、抗体の領域（例えば、ヒンジ、CH2、およびCH3 の各領域のうちのひとつまたはそれ以上）に結合したP-セレクチンリガンドを含む、融合タンパクを特徴とする。関連する形態として、本発明は、シアリル-Le^x決定基および硫酸決定基の付加部位を含むタンパク質であって、これらの決定基の少なくとも一つは、そのタンパク質の天然に生じたのではない部位に位置するタンパク質をコードする、精製された核酸；本発明のP-セレクチンリガンドのいずれか一つをコードする精製された核酸；P-セレクチン−抗体融合タンパク質をコードする精製された核酸；ならびに、これらの核酸のいずれかを含むベクターおよび組換え細胞を特徴とする。さらに本発明は、以下に述べるいずれかの症状に対する治療薬の製造において、P-セレクチンリガンド、またはそのようなリガンドを有する有機化合物分子（望ましければ、抗体またはα₁−酸性糖タンパク質ドメインのような他のタンパク質との組み合わせにおいて）を使用することも含む。もう一つの関連する形態として、本発明は、P-セレクチンタンパク質を有する細胞が、シアリル-Le^x決定基及び硫酸決定基を有する分子または細胞に結合するのを阻害する方法を特徴とする。その方法には、P-セレクチンタンパク質含有細胞を、シアリル-Le^x決定基および硫酸決定基を有する有機化合物分子であって、これらの決定基の少なくとも一つが、その分子の天然に生じたのではない部位に位置する、有機化合物分子；P-セレクチン−抗体融合タンパク質；または本発明のP-セレクチンリガンドのいずれかと、接触させることが含まれる。また別の関連する形態として、本発明は、治療有効量の、シアリル-Leｘ決定基および硫酸決定基を有する有機化合物分子であって、これらの決定基の少なくとも一つが、分子の天然では生じない部位に位置する、有機化合物分子；P-セレクチン−抗体融合タンパク質；または本発明のP-セレクチンリガンド、のいずれかを患者に投与することを含む、哺乳類において炎症を抑制する方法を特徴とする。また更に別の関連する形態として、本発明は、哺乳動物において、すべての血管外滲出依存性の有害な反応（血管外滲出依存性の器官損傷および／または成人呼吸促進症候群、糸球体腎炎、および虚血性心筋傷害に伴う凝血を含むが、これらに限定されるものではない）を抑制し、またはそれらから哺乳動物を保護する方法を特徴とする。その方法は、治療有効量のシアリル-Le^x決定基および硫酸決定基が共有結合した有機化合物分子であって、これらの決定基の少なくとも一つが、その分子の天然に生じたのではない部位に位置する、有機化合物分子；P-セレクチン−抗体融合タンパク質；または本発明のP-セレクチンリガンドのいずれかを、哺乳動物に投与することを含む。最後の形態として、本発明は、治療有効量のシアリル-Le^x決定基および硫酸決定基が共有結合した有機化合物分子であって、これらの決定基の少なくとも一つが、その分子の天然に生じたのではない部位に位置する、有機化合物分子；P-セレクチン−抗体融合タンパク質；または本発明のP-セレクチンリガンドのいずれかを、哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における有害な免疫反応を抑制し、またはそれらから哺乳動物を保護する方法を特徴とする。好ましくは、この方法は、微生物因子により誘導される有害な免疫反応に対して哺乳動物の治療を行うことを含む。そのような微生物因子としては、グラム陰性細菌のリポ多糖類（LPS）、グラム陽性生物のペプチドグリカン、真菌細胞壁由来のマンナン、多糖類、菌体外酵素（例えば、ストレプトキナーゼ）および毒素（例えば、ブドウ球菌の中毒性ショック腸管毒素）が含まれるが、これらに限定されるものではない。その他の好ましい態様において、その方法は、宿主要因により誘発されるすべての有害な免疫反応に対して、哺乳動物を治療することを含む。そのような宿主要因としては、補体、キニン、および凝固系の代謝産物、刺激を受けた細胞から放出される因子（例えば、インターロイキン１（IL-1）および腫瘍壊死因子α （TNF））、多形核白血球（PMNs）に由来する酵素及び酸化剤、バソペプチド（例えばヒスタミン）、およびアラキドン酸代謝産物が含まれるが、これらに限定されるものではない。その他の好ましい態様において、有害な免疫反応は、組換えTNF-αにより誘発されるか、または組換えIL-1により誘発される。更に他の好ましい態様において、有害な免疫反応は、敗血症性ショックであり、または敗血症である。上記の各々の形態に対する好ましい態様において、有機化合物分子またはタンパク質は、また、E-セレクチン（ELAM-1）を持つ細胞が、シアリルLe^x決定基を持つ分子または細胞に結合することを阻害し、このため、E-セレクチン介在の炎症、血管外滲出依存性の有害反応、および有害な免疫反応を阻害する；それらのシアリルLe^x決定基及び硫酸決定基は、図8Aの第21〜57番目のアミノ酸（例えば、図8Aの第38〜57番目のアミノ酸）を本質的に含むP-セレクチンリガンド上に存在する；そのシアリルLe^x決定基は、N-結合性またはO-結合性である；それらの分子またはタンパク質は、複数のシアリルLe^x決定基および／または複数の硫酸決定基を含む；その有機化合物分子は、タンパク質（例えば、抗体（例えば、Ig GまたはI gM）、α₁−酸性糖タンパク質（AGP）、または抗体融合タンパク質（例えば、AG P-抗体結合タンパク質））である；そのタンパク質は、抗体、AGP、または本明細書で述べるP-セレクチンリガンドのいずれかが（例えば、そのタンパク質のアミノ末端に）付加された、抗体融合タンパク質（例えば、AGP-抗体融合タンパク質）である；その抗体または抗体融合タンパク質（例えば、AGP-抗体融合タンパク質）は、抗体部分として、IgG1、CH2、CH3、および／またはヒンジ領域を含む；その抗体、AGPまたは抗体融合タンパク質は、α₁−酸性糖タンパク質のN-結合性糖鎖付加部位を、一つまたはそれ以上含む；その分子の抗体部分は、天然には生じないシアリルLe^x決定基を、一つまたはそれ以上有する；そのシアリルLe^x決定基は、（例えば、シアリルLe^x決定基が、図10で示される配列の第274、287または322番目のアミノ酸のうち一つまたはそれ以上に付加することにより）抗体が補体を固定する、またはFc受容体を結合する能力を妨げる；および、その有機化合物分子は、可溶性である。本明細書において、「P-セレクチンリガンド」とは、P-セレクチン受容体との相互作用を仲介しうるあらゆるアミノ酸配列を意味し、および、P-セレクチンカウンター受容体とされるタンパク質を含む。好ましいP-セレクチンリガンドとしては、図8Aの第21〜57番目のアミノ酸、更に好ましくは、第38〜57番目のアミノ酸を含むが、これらに限定されるものではない。本発明に従って、本発明に有用な融合タンパク質を産生するために、P-セレクチンリガンドに、さらにタンパク質領域（例えば抗体領域）を結合させて用いてもよい。「天然には生じない」とは、シアリルLe^x決定基または硫酸決定基が、天然には分子のそのアミノ酸の位置に結合しないことを意味する。「炎症」とは、物理的、化学的または生物学的要因によって引き起こされた傷害または異常な刺激に対する反応として、損傷を受けた血管及び隣接組織において起こる、細胞学的および組織学的反応からなる病理学的過程を意味する。本明細書においては、炎症は、すべての慢性的な炎症性反応（たとえばリウマチ性関節炎、乾癬、または尋常性天疱瘡）と同様に、すべての急性炎症性反応（例えば、成人呼吸促進症候群または虚血性心筋傷害の経過中またはその後）を含む。「精製された核酸」とは、本発明のDNAが由来する生物の、天然に存在するゲノムにおいて、その遺伝子に近接する遺伝子を含まないDNAを意味する。このため、本用語は、例えば、ベクター；自律的に複製するプラスミドまたはウイルス；もしくは原核生物または真核生物のゲノムDNAに組み込まれた組換えDNA；もしくは他の配列とは独立の別な分子として存在する（例えば、cDNAもしくはゲノムもしくはPCRまたは制限酵素による消化で産生されたcDNA断片）組換えDNAを含む。それはまた、さらに付加したポリペプチド配列をコードする雑種遺伝子の部分である、組換えDNAを含む。「N-結合性」とは、タンパク質のアスパラギン残基のアミド窒素に結合することを意味する。「O-結合性」とは、タンパク質のセリン、スレオニンまたは水酸化リジン残基の水酸基の酸素に結合することを意味する。「血管外滲出依存性の有害反応」とは、宿主に有害な、および炎症、組織傷害または血栓形成の部位またはその付近の内皮に、好中球が不適切に接着したことから直接または間接的に発生し、およびその結果としてそれらの好中球が、接着した血管または器官内へと移動していくような、全ての反応を意味する。そのような傷害に侵される可能性のある器官としては、心臓、肺、腎臓が含まれるが、これらに限定されるものではない。「有害な免疫反応」とは、免疫担当細胞（即ち、すべてのB細胞、T細胞、単球／マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、マスト細胞、好塩基球、または顆粒球）により仲介され、宿主に有害な、あらゆる反応を意味する。詳細な説明最初に図について簡単に述べる。図1Aは、PSGL-1欠損変異体の構造を模式的に示したものである。従来のPCR法を用いて、PSGL-1の外部領域を組織的に欠損させた。典型的な10残基の反復（点描部分；配列番号：1）および膜貫通ドメイン（斜線部分）が図示されている。図1Bは、図1Aに示した欠損変異体を発現する形質転換COS細胞の、P-セレクチン結合能を表す柱状図である。⁵¹Crで標識した細胞を、マイクロタイタープレートのウェルに吸着させた可溶性のP-セレクチンに接着させた。細胞を洗浄した後、結合した細胞を溶解し、および⁵¹Crのレベルを計数した。欠損体を、ヒトFTVII フコース転移酵素非存在下（棒グラフ2）または存在下（残りの7つの棒グラフ）のいずれかで、細胞に導入した。図2Aは、PSGL-1およびCD43のキメラ体を模式的に示したものである。PSGL-1の膜近傍の細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを、CD43の同等な配列と置換した。この結果できた分子はシステインを欠損しており、このためジスルフィド結合による二量体を形成できない。図2Bは、図2Aに示したキメラ体を発現する形質転換COS細胞の、P-セレクチン結合能を表す柱状図である。FTVII h、ヒトFTVIIフコース転移酵素と同時に形質転換した。図3Aは、完全なまたは途中までで切れたムチンC末端に、PSGL-1の先端領域を付加した構造を持つキメラムチンを、模式的に示したものである。PSGL-1のN-末端（点描部分；配列番号：1）および膜貫通（TM）ドメイン（斜線部分）が図示されている。PSGL-1-NH２/CD43「反復」配列は、配列番号：2に示されている。成熟型CD34およびGlyCAM-1分子の、予想されるN-末端、および、CD43の反復領域のN-末端に、PSGL-1を融合させた。図3Bは、図3Aに示された構造物を発現する形質転換したCOS細胞の、P-セレクチン結合能を表す柱状図である。FTVIIh、ヒトF TVIIフコース転移酵素。図4Aは、PSGLの欠損変異体を模式的に示したものである。アミノ末端領域を、様々な数の反復要素を持つPSGL分子に付加した。図4Bは、図4Aに示すキメラ体を発現する形質転換したCOS細胞の、P-セレクチン結合能を表す柱状図である。図5は、³⁵S-硫酸塩で標識し、および還元条件のもとで8%の変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した、ムチン：免疫グロブリン融合タンパク質のオートラジオグラムの写真である。レーンAは、CDM8形質転換細胞の上清；レーンBは、Ig の発現ベクター（ムチンは挿入されていない）を形質転換した細胞の上清；レーンCは、PSGL-1：Ig発現細胞の上清；レーンDは、CD43：Ig発現細胞の上清；レーンE、CD34：Ig発現細胞の上清；およびレーンFは、LGlyCAM-1：Ig発現細胞の上清を示す。図6Aおよび図6Bは、10 mM NaClO₃存在下または非存在下で、および、フコース転移酵素共存下または非存在下での、PSGL-1を発現するCOS細胞の、固定化P-およびE-セレクチンへの結合を表した柱状図である。図6Aは、P-セレクチンに対する細胞の結合を表す柱状図である。図6Bは、E-セレクチンに対する細胞の結合を柱状図である。図7は、10 mM NaClO₃存在下または非存在下で、³⁵S-硫酸塩で標識し、および還元条件のもとで8%の変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した、PSGL-1：免疫グロブリン融合タンパク質のオートラジオグラムの写真である。写真は、³⁵S- 硫酸塩が可溶性のムチンキメラに取り込まれるのを、塩素酸塩が阻害することを示す。レーンAは、塩素酸塩非存在下でのCDM8形質転換細胞の上清；レーンBは、塩素酸塩非存在下でのPSGL-1：Ig発現細胞の上清；レーンCは、塩素酸塩存在下でのCDM8の上清；およびレーンDは、塩素酸塩存在下でのPSGL-1：Ig発現細胞の上清を示す。図8Aは、様々なPSGL-1欠損変異体の配列の終末点（矢印で表示）のリストである。最上段の配列は、配列番号：3；中段の配列は、配列番号：13、最下段の配列は、配列番号：14である。図8Bは、図8Aで示した終末点を持つ欠損変異体を発現する形質転換COS細胞の、P-セレクチン結合能を表す柱状図である。図9Aは、欠損型のPSGL-1またはCD43に、野生型およびPSGL-1の38〜57番残基の変異体を付加することの効果を測定するために用いた構造を、模式的に図式に示したものである。挿入した配列は、下部左側に示されている。図9Bは、図9Aに図示したキメラ体を発現する形質転換COS細胞の、P-セレクチン結合能を表す柱状図である。図10は、IgG1（配列番号：9）をコードする塩基配列（配列番号：8）、および N-結合性グリカン付加部位を作成するために設計された変異体（配列番号：12）のリストである。図11Aは、AGP-IgG1融合タンパク質の塩基配列（配列番号：10）、および、図1 1Bは、AGP-IgG1融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：11）である。図12Aは、完全なPSGL-1（配列番号：4）またはヒトIgG1のヒンジ、CH2、およびCH3領域に結合した20残基のペプチドのいずれかを含む、免疫グロブリン融合タンパク質を、模式的に図式に示したものである。Y/F-hIgGという構造は、配列番号：5を有し；T/AhIgGという構造は、配列番号：6を有し；Y/F-T/A-hIgGという構造は、配列番号：7を有する。図12Bは、COS細胞に形質転換した後の、図12A に示した融合タンパク質による［³⁵S］システインおよびメチオニンの取り込みを評価するために用いた、8%ポリアクリルアミドゲルの写真である。レーンAは、CDM8 を対照として形質転換した細胞の上清を示す。レーンBは、PSGL-1-免疫グロブリン融合タンパク質を形質転換した細胞の上清を示す。レーンCは、WT-hIgGを形質転換した細胞の上清を示す。レーンD、Y/F-hIgGを形質転換した細胞の上清を示す。レーンEは、T/A-hIgGを形質転換した細胞の上清を示す。レーンFは、Y/F-T/ A-hIgGを形質転換した細胞の上清を示す。図12Cは、COS細胞に形質転換した後の、図12Aに示した融合タンパク質による［³⁵S］硫酸塩の取り込みを評価するために用いた、8%ポリアクリルアミドゲルの写真である。さらに、アミノ末端に何も付加していない対照の融合タンパク質も含む（レーンB）。レーンCからGは、図1 2Bの、レーンBからFに相当する。図13は、ビデオ撮影フィールド毎の、相互作用しているHL-60の棒グラフである。予め、P-セレクチン−免疫グロブリンキメラ体、または対照のCD4-免疫グロブリンキメラ体を塗布した平行プレートフローチャンバーに、細胞を注入した。細胞に、0.75 dynes/cm２で剪断負荷をかけた。各棒線は、15秒間隔で撮影した8 フレームの、各フィールド当たりの平均細胞数（±SEM）を表す。ローリングしているまたは浮遊している細胞は、ビデオ画像上では縞のように見える。棒線は、左から右へ：P-セレクチン−免疫グロブリンキメラ体の上をローリングしているまたは浮遊しているHL-60細胞、10 mM 塩化ナトリウムを含む無硫酸塩培地で前処理したHL-60細胞、および、CD4-免疫グロブリンキメラ体の上を浮遊しているHL-60細胞を示す。シアリル-ルイスX（シアリル-Le^x）および硫酸決定基は、以下の実験によって、P-セレクチンと相互作用し、結合を促進することが示された。これらの実施例は本発明の例証のためのものであり、本発明を限定するものではない。以下の実験で用いた方法を先に説明する。可溶性P-セレクチンの生成 P-セレクチンおよびE-セレクチンIgキメラ体は、レクチン、EGF-関連、およびヒトIgG1のヒンジ、CH2、およびCH3ドメインに結合したP-セレクチンの最初の２つの短い共通反復配列、をコードする発現プラスミドをCOS細胞に一過性に発現させることによって調製した(アルッフォ（Aruffo）ら、EMBO J.,6:3313〜3316,19 91；ワルツ（Walz）ら、Science,250:1132〜1135,1990)。PSGL-1 cDNAコード配列をHL-60 cDNAライブラリーのPCR増幅によって得て、配列をDNA配列解析によって確認した。ポリオーマウイルス複製起点を欠損し、インフルエンザ血球凝集素（flu）ペプチド（フィールドら（Field）、Mol.Cell.Biol.8:2159〜2165,1988 ）エピトープタグのコード領域のすぐ上流に位置するCD5抗原のリーダー配列を含むCDMBに基づく発現ベクターに、成熟細胞外、膜貫通、および細胞内ドメインに対するコード部分を挿入した。PSGL-1 欠失体の構成アミノ末端PSGL-1欠失体は、フレーム２（ロイシンアスパラギン酸をコードする）におけるXbaI部位の下流に位置する欠失変異体の望ましい終点をコードするプライマーを用いたPCR増幅によって調製した。得られた配列は、下記の残基がX ba部位のアスパラギン酸（D）の直後に続くポリペプチドをコードした：PSGL前駆体のA118、A128、A138、A148、A158、A168、G178、A188、A198、A208、A218、 A228、A238、A248、A258、およびT268。次に、無修飾のPSGL-1の発現のために用いられるCD5リーダーfluタグ発現ベクターに、PCR断片を挿入した。fluタグは上記フレームのXbaI部位で終了する。fluタグ結合部の配列を確認し、間接免疫蛍光顕微鏡による検鏡およびフローサイトメトリーによってCOS細胞における発現を確認した。フレーム１（グルタミン酸フェニルアラニンをコードする）での欠損部位におけるEcoRI部位による一連の内部欠損もまた、アミノ末端を有する欠失変異体をまず作製することによって調製した（前駆体のペプチド配列のA118、 A128、A138、A148、A158、A168、G178、A188、A198、A208、A218、A228、A238、 A248、およびA258に対応するEcoRI部位のフェニルアラニン[F]直後の残基）。これらの欠失変異体のそれぞれに対し、PSGL-1前駆体A117のすぐ下流のグルタミン酸フェニルアラニンフレームのEcoRI部位で終わるfluタグアミノ末端PSGL-1ドメインを付加した。得られた構成物は、A117から上記の様々な終点との間に欠失を含んだ。ムチンドメイン相互交換成熟アミノ末端（CD34またはGlyCAM-1）またはトレオニン／プロリンに富む反復配列の領域（CD34）の開始点のいずれかに、EcoRI部位を付加することによって、PSGL-1アミノ末端ドメインを加えるためにCD34、CD43、およびGlyCAM-1ムチンを調製した。上記のように、EcoRI部位はグルタミン酸フェニルアラニンフレーム（フレーム１）に存在した。CD34配列は前駆体のF30残基で始まり、Gly-CAM-1 は前駆体のL19、およびCD43は前駆体のI135で始まった。これらのそれぞれに対し、上記のEcoRIで終わるflu-タグPSGL-1ドメインを加えた。PSGL-１のアミノ末端および反復配列要素を、CD43前駆体の配列S225のすぐ上流に位置するグルタミン酸フェニルアラニンフレームにあるEcoRI部位を通じて、CD43の膜近位、膜貫通、および細胞内ドメインに付加した。PSGL-1からの相補的断片はT267までの前駆体のアミノ末端残基に対応した。アミノ末端ドメインの微細構造マッピング同様の方法を用いて、アミノ末端ドメインにおける欠失体を構成し、この場合、ロイシンアスパラギン酸フレーム（フレーム２）にXbaI部位を有するプライマーを用いて、PCRによって生じた欠失体を形成した。アスパラギン酸をコードする残基のすぐ下流は、前駆体R38、E58、P78、およびA98に対応するPSGL-1配列であった。アミノ末端ドメインを明らかにするために、示された配列がスレオニンまたはチロシン残基をアラニンまたはフェニルアラニンに変異した、38から57までの残基に対応する二本鎖オリゴヌクレオチドを合成した。ジデオキシ法配列解析によって全ての構造を確認した。細胞接着アッセイ形質転換細胞を、0.5 mM EDTAリン酸緩衝生理食塩水（PBS）によって形質転換後48〜60時間で培養皿から剥離させた。次に、⁵¹CrO₄（１ mCi/ml；デュポン、ボストン、MA）の0.9％塩化ナトリウム溶液100 μl＋培地100 mlを細胞に加えて、それらを37℃で１時間インキュベートした。標識を加えた細胞をPBSで２回洗浄し、0.2％BSA、0.15 M塩化ナトリウム、３ mM塩化カルシウム中に再懸濁した。同じロットのクロム酸塩によって同様に調製した細胞の標識率（細胞当たり取り込まれたカウント）の変動は、概して最小限であった。アフィニティー精製ヤギ抗ヒトIgG抗体（抗ヒトIgG Fc（重鎖特異的）のPBS溶液20 μg/mlを100μl）により室温で２時間湿潤チャンバー内でコーティングした96ウェルマイクロ培養プレートのウェル中で、標識細胞をインキュベートした。プレートをPBSで２回洗浄した後、３％BSAのPBS溶液200μlで一晩インキュベートすることによって、別のタンパク質結合部位をブロックした。プレートをPBSで４回洗浄し、融合タンパク質上清200μlと共に２時間インキュベートした。PBSで３回洗浄し、さらに１回洗浄した後（0.2％BSA、0.15 M塩化ナトリウム、３ mM塩化カルシウム中で）、２×1 0⁵個／ウェル（0.2％BSA、0.15 M塩化ナトリウム、３ mM塩化カルシウム200μl ）を加えて、プレートを回転プラットフォーム上で回転させながら（80 rpm）、室温で15分結合させた。プレートに0.15 M塩化ナトリウム／３ mM塩化カルシウム溶液200μlを満たし、次にプレートを逆転させることによって、３回洗浄した。２％SDS 200μlを加えて接着細胞を溶解し、標識クロム酸塩をガンマ線分光計によって計数した。免疫蛍光分析３％BSAを含むPBS中で一次モノクローナル抗体（腹水の200倍希釈または精製抗体５μg/mlが適している）と共に30〜45分インキュベートすることによって、細胞をサイトメトリー用に調製した。細胞をPBSで２回洗浄し、マウスIgG（12CA 5）またはマウスIgM（CSLEX-1）のいずれかに対するFITC結合アフィニティー精製抗体２μg/mlと共に、PBS／３％BSA中で30〜45分インキュベートした。次に細胞をPBSで２回洗浄して、分析前に１％の脱重合化したばかりのパラホルムアルデヒドのPBS溶液１ mlに再懸濁した。免疫蛍光顕微鏡による検鏡のために、形質転換した細胞を４％の脱重合化したばかりのパラホルムアルデヒドで固定し、洗浄して、３％BSAのPBS溶液に30分間暴露し、次に一次抗体（腹水、250倍希釈）と共に30〜45分インキュベートした。次に細胞をPBSで２回洗浄し、マウスIgGに対するFITC結合アフィニティー精製抗体（カッペル；３％BSA含有PBS溶液２μg/ ml）と共に30〜45分インキュベートした。最後に、細胞をPBSで２回洗浄して分析した。 ³⁵SO₄ による代謝標識ムチン：免疫グロブリンキメラ体をコードする発現プラスミドで形質転換させたCOS細胞を、形質転換後１日目にトリプシン処理を行って完全な培地（10％仔ウシ血清）の入った新しいプレートに移した。標識前に、培地を除去し、細胞を PBSで１回洗浄し、[³⁵S]システインで標識する場合にはシステインおよびメチオニン不含培地（トランスラベル、ICN）、または³⁵SO₄で標識する場合には硫酸塩不含CRCM-30培地（シグマケミカル社）のいずれかと、培地を交換した。血清は加えず、放射性核種は概して200μCi/mlの濃度で存在した。12〜16時間の標識時間後、上清を回収し、ヤギ抗ヒトIgGアガロース（カッペル）に吸着させることによって融合タンパク質を回収した。吸着タンパク質は、還元条件下で８％ポリアクリルアミドゲル上で変性電気泳動を行った。接着の塩素酸塩阻害 COS細胞をDEAEデキストランで形質転換し、10％仔ウシ血清および10 mM塩素酸ナトリウムを含むDMEM中で直ちにインキュベートした。形質転換１日後、細胞をトリプシン処理して、新しい培養皿に代えて同じ培地で６時間インキュベートした。次に培地を除去し、細胞をPBSで洗浄し、硫酸塩を含まず、10 mM塩素酸ナトリウムの存在下で10％透析ウシ胎児血清と共に通常量のシステインおよびメチオニンの２％を含有する特別製のDMEM培地（ライフテクノロジーズ）中でさらに18 時間インキュベートした（バウエール＆ハットナー（Baeuerle and Huttner）、 Biochem.Biophys.Res.Comm.,141:870〜877,1986）。次に接着および免疫蛍光アッセイで用いるために細胞を回収した。対照細胞は同様に処置したが、非透析血清を含むDMEM中でインキュベートした。HL-60 細胞ローリング 37℃で温度調節段を設定して、平行プレート直角フローチャンバー（FCS2、バイオプテックス社、バトラー、PA）の中のHL-60細胞ローリングのビデオ画像を、2.5×対物レンズを備えたツァイスICM 405倒立顕微鏡上に搭載したAIMSテクノロジー（ブロンクス、NY）CCDカメラにより得た。チャンバーの高さは250μmであった。ハーバードアパレイタス（サウスナティック、MA）モデルI/W 22シリンジポンプを用いて、既定の流速でチャンバーから細胞を回収した。硫酸化を阻害するため、HL-60細胞をPBSで１回洗浄し、正常レベルの２％システインおよびメチオニン、10 mM塩素酸ナトリウム、および上記の透析血清を含む硫酸塩不含培地中で18時間増殖させた。各実験について、0.15 M塩化ナトリウム、３ mM塩化カルシウム１ mlに細胞10⁶個を懸濁し、チャンバーを通じて採取した。カバーガラスをアフィニティー精製ヤギ抗ヒトIgG抗体の10μg/ml濃度の50 mMトリス塩酸（pH 9.0）溶液で２時間コーティングし、PBSで２回洗浄し、0.2％BSA PBS溶液で一晩ブロックした。処置したカバーガラスを次に、適当な免疫グロブリンキメラ体発現プラスミドで形質転換させたCOS細胞の上清に浸し、PBSで２回洗浄してフローチャンバーに集めた。PSGL-1 のアミノ末端はP-セレクチン結合に必要である PSGL-1ムチンのアミノ末端の欠失体はPCR技法によって作られ、得られた切断c DNAを、インフルエンザ血液凝集素（HA）に由来する短いオリゴペプチドタグと融合した分泌型ペプチド配列の下流に挿入した。切断分子をコードする発現プラスミド（図１A）を、sLe^x決定基のみの発現を指向し、FTVIIと命名される特異的骨髄フコシルトランスフェラーゼの存在下で、COS細胞に形質転換した（ササキら（Sasaki）J.Biol.Chem.，269:14730〜14737,1994；ナツカら（Natsuka）[出版正誤表がJ.Biol.Chem.,269:20806,1994にある],J.Biol.Chem.,269:16789〜167 94,1994）。細胞表面での欠失変異体の発現は、抗HAモノクローナル抗体を用いて間接免疫蛍光法によって確認した。細胞表面のsLe^xの存在はモノクローナル抗体CSLEX-1を用いて確認した。放射標識形質転換細胞が、P-セレクチン：免疫グロブリン融合タンパク質で予めコーティングしたプラスチックウェルに結合する能力を求めた。これらの実験により、PSGL-1のアミノ末端100残基の欠失（以降先端ドメインと呼ぶ）は、形質転換産物の固定化P-セレクチンへの結合を完全に破壊するためには十分であることが明らかになった（図１B）。これらの実験はまた、FTVIIの発現がP-セレクチン結合に必要であるように、sLe^xがP-セレクチン結合を媒介することを証明する（図１B；傍線２と傍線３の比較）。細胞表面の欠失変種の発現は、抗HAモノクローナル抗体を用いた間接免疫蛍光法によって確認し、細胞表面上のsLe^xの存在はモノクローナル抗体CSLEX-1を用いて確認した。表１は、ヒトFTVIIhおよび欠失体を同時に形質転換させ（図１Aに示す）、アミノ末端fluペプチドまたはsLe^xに対する抗体による間接免疫蛍光法を行ったC OS細胞の平均蛍光強度（MFI）を示す。大きい硫酸化ムチンの場合、PSGL-1のアミノ末端はP-セレクチン結合に十分である最初の100個のN-末端アミノ配列（すなわち先端ドメイン）に認められる配列以外のPSGL-1配列が、P-セレクチンの結合に必要であるか否かを明らかにするため、PSGL-1の膜貫通および細胞質ドメインをCD43抗原のものと取り替えた（パラントら（Pallant）,Proc.Natl.Acd.Sci.,86:1328〜1332,1989；シェリーら（She lley）,Proc.Natl.Acd.Sci.,86:2819〜2823,1989）。得られた分子は、システイン残基を含まないが、PSGL-1と同様の効率でP-セレクチンに結合した（図２Aおよび図２B）。このように、ジスルフィド結合形成または特異的膜接着部分のいずれもP-セレクチン結合活性に必要ではない。次に、PSGL-1先端ドメインがP-セレクチンリガンド（すなわち対受容体）活性に十分であるか否かを明らかにするため、PSGL-1の最初の100個の予測アミノ酸を、いくつかの無関係ムチンのムチン様反復配列要素のアミノ末端上に遺伝子的に移植した（図３A）。特定のこれらのキメラムチンは、この状況においてP-セレクチン結合を補佐することが可能であった。CD34およびCD43、というヒト造血細胞上に多く存在する２つの比較的大きいムチンはいずれも、結合を補佐することが可能であった。対照的に、GlyCAM-1の人工的接着変種、L-セレクチンリガンド活性を有する高内皮細静脈上に発現されるムチン（ラスキーら（Lasky）,Science ，258:964〜969,1992）は、このアッセイでは不活性であった（図３B）。これらの実験におけるGlyCAM-1ムチンドメインは、CD7の細胞外茎、膜貫通ドメイン、および細胞質接着部分を通じて細胞表面に係留された（アルッフォら（Aruffo） ,EMBO J.,6:3313〜3316,1987）。異なるムチンおよびムチンキメラの細胞表面発現は、fluタグ、sLe^xまたはそれぞれのムチンに対する抗体を用いた間接免疫蛍光法によって確認した。表２は、図３Bにおいて分析した構成物で形質転換させたCOS細胞によるfluタグまたはsLe^xの発現の平均蛍光強度測定（MFI）を示す。C D34およびCD43構成物は、同起源の抗CD抗体を用いた間接免疫蛍光法によって発現陽性であった。 COS細胞上に発現されるCD43およびCD34の見かけの分子質量はそれぞれ、100〜 130 kD（シェリーら（Shelley）,Proc.Natl.Acd.Sci.,86:2819〜2823,1989）および100 kD（シモンズら（Simmons）,J.Immunol.,148:267〜271,1992）であると報告されている；PSGL-1モノマーは110 kDの有効分子質量を示す（サコら（Sako） ,Cell，75:1179〜1186,1993）。GlyCAM-1は、その本来の（非拘束）状態では50 kDタンパク質と共に移動し、このことはそれが実質的により小さいことを示唆している（ラスキーら（Lasky）,Science,258:964〜969,1992）。われわれの試験では、PSGL-1の先端ドメインをムチンのアミノ末端に加えた場合、より大きいムチンがP-セレクチン結合を補佐することができた。PSGL-1の内部反復配列要素の連続的欠失により、われわれは可能性のある全体的な４価会合を損ねることなく系統的な方法で分子を短くすることができた（図４A）。これらの反復配列要素が欠失しているため、PSGL-1の結合活性は低下し、このことは、細胞膜からの距離がP-セレクチン結合活性の重要な決定因子であるという結論に一致した（図４ B）。われわれのデータは、硫酸化は先端ドメイン指向結合を補佐するムチンの能力の１つの決定因子であることも示している。われわれは、COS細胞において硫酸化を受ける様々なムチンの能力を評価した。PSGL-1、CD34、CD43、およびGlyCAM -1可溶性ムチンキメラは、COS細胞に発現されると、容易に³⁵S-硫酸塩を取り込んだ（図５）。硫酸化の阻害はP-セレクチンに対するPSGL-1結合を遮断するわれわれは、硫酸化の阻害がP-セレクチンに対するPSGL-1結合を遮断することを発見した。COS細胞をPSGL-1およびFTVIIに同時に形質転換させ、またはPSGL-1 およびFTVIIに別々に形質転換させた。PSGL-1の最大合成が予想される時間内に、硫酸塩を含まず、硫酸化の比較的選択的阻害剤である10 mM塩素酸ナトリウム（NaClO₃）を含む改変DMEM培地中で、細胞をインキュベートした。固定化P-セレクチンに対する塩素酸処置共形質転換細胞の結合能力の有意な減少を認めたが（図６A）、同じ細胞が固定化E-セレクチンに対する結合の減少をほとんどまたは全く示さなかった。sLe^x抗原またおよびPSGL-1アミノ末端タグ配列のいずれの細胞表面発現も、NaClO₃処置によって阻害されなかった。実際、表３に示すように、抗sLe^xおよび抗fluタグを共に表す形質転換細胞の平均蛍光強度の増加は、塩酸塩処置後に認められ、塩素酸塩がインターナリゼーションまたは細胞表面輸出に影響を及ぼす可能性があることを示唆している。同等条件下で合成した可溶性PSGL-1免疫グロブリンキメラは、[³⁵S]システインおよびメチオニン取り込みによって測定したタンパク質合成が阻害されない条件下で、本質的に完全な³⁵S-取り込みの阻害を示した（図７）。これらのデータは、P-セレクチンリガンドの硫酸化がP-セレクチン結合活性に必要であることを証明している。PSGL-1 の先端構造の微細構造欠失分析 P-セレクチン選択的リガンド活性に寄与する100アミノ酸先端ドメイン内の要素の位置を特定するために、われわれは、先端ドメインの様々な領域が欠失している一連の欠失変異株を調製した（図８A）。次に、各アミノ末端欠失変異株をC D5リーダー／fluタグ要素の下流に置いて、細胞表面発現をモニターした。微細構造欠失変異株は、間接免疫蛍光法によって評価すると、エピトープタグを発現する能力にほとんど変動がないことを示した。成熟PSGL-1のN末端の最初の20個のアミノ酸を除去しても、P-セレクチン結合活性には影響を及ぼさなかった。対照的に、N-末端の最初の40個のアミノ酸を除去すると結合が失われた（図８B）。PSGL-1のさらなる欠損はP-セレクチン結合活性に影響を及ぼさなかった。したがって、PSGLのアミノ残基20〜40（すなわち、シグナル配列を有する予想前駆体の残基38〜57）がP-セレクチンの結合に必要である。残基38〜57がPSGL-1先端ドメイン指向活性に十分であることを証明するために、先端ドメインが欠失しているPSGL-1およびCD43ムチンコアのアミノ末端にこの部分を加えた（図９A）。いずれの場合においても、PSGL-1ペプチド要素のアミノ酸38〜57を加えることは、ムチンコアにP-セレクチン結合活性を与えた。いずれの場合も、P-セレクチン結合活性のレベルは自然のPSGL-1のレベルと同等であった（図９B）。アミノ末端ペプチド内の特異的残基がP-セレクチン結合活性に必要である P-セレクチン結合に必要な20個のアミノ酸領域は、可能性のある３つのチロシン硫酸化部位およびO-結合グリコシル化のための２つのトレオニン残基を含む。これらの残基の重要性を評価するため、チロシンをフェニルアラニンに置換した（図９A）。第２のペプチドでは、スレオニンをアラニンに置換した。さらに、５箇所変異を含む第３のペプチドを、両置換が単ペプチド内で行われるように調製した。次に各変異ペプチドを別々に、fluタグの下流および（1）先端ドメインを欠損する切断PSGL-1または（2）CD43反復配列要素および膜貫通ドメイン、のいずれかの上流に配置した。得られたキメラを発現する細胞の固定化P-セレクチンに対する結合能を調べた（図９A）。チロシンからフェニルアラニンへの置換の結果、P-セレクチンの結合活性が失われた。トレオニン残基をアラニンと置換すると、結合が減少するが、完全には失われなかった。これらの細胞におけるfl uタグまたはsLe^xエピトープの発現は影響を受けなかった。先端20残基によって媒介される結合は、天然のPSGL-1と同様、カルシウムの存在に依存した。これらのデータは、46、48、および51位のチロシンの硫酸化がP-セレクチン結合活性に必要であることを示している。E-セレクチン活性は同じ条件下で影響を受けなかった。さらに、これらのデータは44および57位のスレオニンが必要であることを示している。これらのスレオニン残基は、O-結合グリカン付加部位として作用することができる。これらの実験は、FTVII発現がP-セレクチン結合に必要であることを示すわれわれの実験と併せて、P-セレクチン結合がスレオニン44および57 位でsLe^xを必要とする証拠を提供する。要するに、上記の実験は、硫酸化のための３つの残基およびsLe^x付加のための２つの残基を含むアミノ酸38〜57は、P-セレクチン結合活性を与えるには十分であることを証明している。アミノ末端20個のアミノ酸内の残基はチロシン上で硫酸化されるアミノ末端部分がインビトロで硫酸化を受けることができるか否かを明らかにするために、われわれは、本来のペプチド配列、またはヒト免疫グロブリンG1（ IgG1）と結合させた変異ペプチド配列から成る融合タンパク質を作製した（図12 A）。得られた融合タンパク質をCOS細胞で発現させ、無機硫酸の同化能を評価した（図12B）。本来のペプチド配列を有する免疫グロブリンキメラ体は硫酸を取り込むことが可能であったが、チロシンをフェニルアラニンに置換した配列はそうではなかった（図12C）。スレオニンをアラニンと置換しても、硫酸取り込みに影響を及ぼさなかった（図12C）。硫酸化を阻害すればP-セレクチン免疫グロブリンキメラ上のHL-60ローリングを遮断する硫酸化の阻害が生理学的に関連する接着を損ねるか否かを調べるため、HL-60 細胞を塩素酸塩を含む培地中で増殖させ、明確に定めた液体剪断応力の条件下で、得られた細胞が、P-セレクチン免疫グロブリンキメラ体を塗布したカバーガラス上に接着してローリングする能力を調べた（ローレンスら（Lawrence）Blood ，75:227〜237,1990）。HL-60細胞は、P-セレクチン免疫グロブリンキメラ体を予め塗布したカバーガラス上に接着してローリングすることが可能であったが、 CD4免疫グロブリンキメラ体を塗布したカバーガラス上ではそのような相互作用を認めなかった（図13）。塩素酸塩中でHL-60を増殖させると、基質と細胞相互作用の頻度が劇的に低下した（図13）。シアリルLe^xおよび硫酸決定基を有する抗体および抗体融合タンパク質一つの態様において、本発明はシアリル-Le^xおよび硫酸決定基を有する抗体を特徴とする。そのような抗体は、導入されたまたは既に存在するシアリル-Le^x付加部位（例えば、標準的な部位特異的変異によって）の近傍に既に存在する抗体分子への硫酸化部位（すなわち、酸性状況でのチロシン）の導入によって作製してもよい。または、標準的な組換え型DNA技法によって、P-セレクチンリガンド配列（例えば、本明細書に記載のいかなるP-セレクチンドメイン）を天然に生じる抗体配列（例えばIgGまたはIgM）に加えることによって、適当なシアリル-Le^x および／または硫酸化部位を加えてP-セレクチン抗体融合タンパク質を産生しもよい。P-セレクチンリガンド配列を抗体分子のアミノ末端に加えることが好ましい。そのような抗体は、細胞またはタンパク質の間の望ましくない相互作用を破壊するために、または一般に、その１つが抗体が保持する決定基を有する２つの分子間の相互作用を破壊するために有用である。これらの決定基は通常、E-セレクチンおよびP-セレクチンを含む相互作用を容易にするように作用するため（例えば、好中球と血管壁の内面に存在する内皮細胞との相互作用）、そのような相互作用の破壊能は、例えば、炎症を最小限にし、滲出依存型臓器障害および／または凝血を減少させる上で、多くの治療的適応を提供する。さらに、望ましければ、免疫グロブリン分子のCH2部分を隠し、それによって補体結合およびFc受容体結合を阻害する１つ以上のシアリル-Le^x部分を、抗体配列に組み込んでもよい。炭水化物部分は、補体結合およびFc受容体結合を誘発する免疫グロブリンドメインを遮断するため、そのような抗体は、抗体に基づく療法にしばしば関連する望ましくない副作用（すなわち、補体結合およびFc受容体結合の結果得られる作用）を誘発しない。炭水化物基は望ましくない補体結合およびFc受容体結合を阻害するばかりか、E-セレクチンおよび／またはP-セレクチン媒介細胞内相互作用の競合的阻害機能を行うために役立つことが好ましい。補体結合およびFc受容体結合を阻害するため、シアリル-Le^x決定基を抗体分子のいかなる部位に加えてもよい。N-結合グリカン付加部位は、N X S/T（ここで、Nはアスパラギン、Sはセリン、Tはスレオニン、およびXはプロリンを除くいかなるアミノ酸でもよい）であることが周知である。したがって、シアリル-Le^x側鎖の結合に適した部位をいくつか含む典型的な分子をデザインしてもよい。IgG1 配列（図10）を調べた結果、補体結合およびFc受容体結合能がこのプロセスによって損なわれるような有利な場所の分子に、N-結合グリカン付加部位を導入してもよい少なくとも５箇所の部位が明らかになった。これらの部位はアミノ酸残基 274、287、295、322、および335である。これらはN-結合グリカン付加の好ましい部位であるが、それらが唯一の候補部位ではない；その他の有用な部位を確認して、指針として以下の基準を用いてIgG1配列に組み入れてもよい：（1）部位は免疫グロブリン分子のCH2領域、すなわち補体結合およびFc受容体結合に関与する分子の部分、に位置することが好ましい；（2）部位はその疎水性特徴から、免疫グロブリン分子の外側に存在し、したがって炭水化物側鎖の結合に関与する酵素に接近可能となる、と予測される配列の領域に位置する；（3）部位は一次アミノ酸配列、およびこのように予測された二次アミノ酸構造への破壊が最小となる領域に位置する。例えば、単一のアミノ酸によるN-結合グリカン付加部位とは異なる本来起こるべき部位は、アミノ酸配列に２箇所の変更を必要とする部位が好ましいだろう。のみならず、同様の荷電または極性のアミノ酸を置換することによって（例えば、１つの帯電していないアミノ酸を別のアミノ酸に置換する）、N-結合グリカン付加部位を作製することが好ましい。１つ以上のN-結合グリカン付加部位を、特定のIgG1-コード配列に置換してもよい；そのような配列（すなわち、シアリル-Le^x部分を結合させる抗体分子をコードする配列）をIgG1-シアリル-Le *またはIgG1-Le^xと命名する。 CH2ドメイン内のアミノ酸#274、#287、および#322でのさらなるグリコシル化部位の導入は、当技術分野で定法であるアッセイを用いて、Fc受容体または補体によって認識されない分子を作製した；典型的な補体結合アッセイは、ワイアら（Weir）の「実験的免疫学ハンドブック（Handbook of Experimental Immunolog y）」Blackwell，Oxford；およびコリガンら（Coligan）の「免疫学の現在のプロトコール（Current Protocols In Immunology）」、Wiley Interscience，199 5である。シアリル-Le^x部分を有する特定のIgG1分子は以下のように生成する。IgG1遺伝子は一般に入手可能で、その配列を図10に示す。１つ以上のN-結合グリカン付加部位（例えば、上記および図10の上記の天然に生じる配列）を導入するために、インビトロ部位特異的変異誘発の定法によってこの遺伝子を変異させる。次に、真核細胞においてタンパク質を発現するよう設計されたベクターに、遺伝子を挿入する（例えば、参照として本明細書に組み入れられるギリーズら（Gillies）米国特許第4,663,281号に記載のベクター参照）。真核宿主細胞は哺乳類細胞（例えば、CHOまたはlecll細胞）であることが好ましく、変異IgG1-Le^x-コード配列を含む発現ベクターを、定法を用いて一過性または安定な形質転換によって宿主細胞に導入する。そのような宿主細胞もまた（一過性または安定に）、シアリル-Le^x基をグリコシル化部位で抗体分子に結合させることが可能なα(1,3)フコシルトランスフェラーゼを発現できるベクターで形質転換させる。α(1,3)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、IgG1-Le^xをコードするベクターとは異なるベクターによって発現してもよく、または両遺伝子を共通のベクターに存在させる、および共通のベクターから発現させてもよい。哺乳類細胞は、シアリル-Le^x生成に必要な全ての前駆体を提供するため、IgG1-Le^xの合成に特に有用な宿主である。本発明のシアリル-Le^x修飾および硫酸化抗体を生成するため、抗体配列をコードする遺伝子は、α(1,3)フコース結合のみを触媒するα(1,3)フコシルトランスフェラーゼをも発現する細胞において発現することが好ましい；そのような酵素はワルツら（Walz）、Science 250:1132〜1135（1990）およびシード（Seed）「フコシルトランスフェラーゼ遺伝子とその利用（Fucosyltransferase Genes and Uses Thereof）」と題した U.S.S.N.08/483,151、1995年６月７日ファイル（本明細書に参照として組み入れられる）に記述されている。ロウら（Lowe）（Cell 63:475,1990）が記述したα(1,3)フコシルトランスフェラーゼcDNAを用いてもよいが、あまり好ましくない。このフコシルトランスフェラーゼはシアリル前駆体分子を認識し、α(1,3)-またはα(1,4)-結合フコース部分のいずれかをN-アセチルグルコサミン側鎖に加える。シアリル-Le^x決定基は、α(1,3)-結合を特徴とし、ロウ（前記）のα(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ酵素は、それ自体、望ましいシアリル-Le^x修飾分子、およびP-セレクチンおよびE-セレクチンに対する結合に活性を示さないが、シアリル-Le^x-修飾分子の作用を妨害せず、その他の望ましからぬ副作用を生じないα(1,4)-結合フコースを有する産物を共に生成する。 α(1,3)フコシルトランスフェラーゼおよび修飾すべき抗体を発現している宿主細胞は、定法によって増殖させ、抗体は、プロテインAカラムに対する親和性に基づく細胞溶解物から、または抗体単離および精製のその他の標準的技法から精製する。シアリル-Le^xおよび硫酸決定基を有するα₁-酸糖タンパク質-抗体融合タンパク質本明細書で論じるように、硫酸化およびシアリル-Le^x付加によって修飾された抗体融合タンパク質は、重要な治療および診断に利用される。これまでの研究から、大量の抗体融合タンパク質は、形質転換させた哺乳類細胞（例えば、COS細胞）から産生および一過性に分泌させてもよいことが示された。一般に、本発明によるAGP抗体融合タンパク質、AGPコードタンパク質、およびP-セレクチンリガンドドメインは、標準的な技法によって、インフレームでIgGドメイン（例えば、一定のドメイン）と融合し、同様に定法によって融合タンパク質を発現させる。分子の抗体部分は、融合タンパク質精製を容易にし、またそうでなければ短命のポリペプチドまたはポリペプチドドメインの血漿半減期を延長させる。抗体融合タンパク質は、シードら（Seed）の「フコシルトランスフェラーゼ遺伝子とその利用（Fucosyltransferase Genes and Uses Thereof）」と題した U.S.S.N.08/483 ,151、1995年６月７日ファイル（本明細書に参照として組み入れられる）に開示された方法に従って、例えばIgGまたはIgM抗体またはその一部を用いて発現されることが好ましい（IgM融合タンパク質に関してはゼトルマイスルら（Zettlemei sl）、DNA Cell Biol.9:347（1990）も参照）。特定のAGP-抗体融合タンパク質を発現する組換えプラスミド（例えば、AGP-ヒンジ-CH2-CH3およびAGP-CH2-CH3タンパク質）は以下のように構成される。標準技法に従って、α₁-AGPの5'および3'コード領域（ボードら（Board）、Gene 44: 127,1986）に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって、ヒト肝cDNAライブラリから急性期α₁-AGP遺伝子をコードするcDNAをクローニングした。5'AGPプライマーはHindIII制限部位を含むように設計され、3'プライマーはAGP停止コドンよりむしろBamHI制限部位を含むように設計された。PCR-増幅産物をHindIII/BamHIで消化して、ヒトIgG1の一定のドメイン（すなわちヒンジ-CH2-CH3またはCH2-CH3）を含むHindIII/BamHI切断プラスミド発現カセットにクローニングした（アルッフォら（Aruffo）、Cell,61:1303 ,1990参照）。このAGP-IgG融合タンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をそれぞれ、図11Aおよび図11Bに示す。 P-セレクチン媒介相互作用を遮断する分子を作製するために、硫酸化部位、および必要な場合にはシアリル-Le^x付加を、抗体融合タンパク質配列（例えば、上記の抗体融合タンパク質）に導入する。そのような部位は、例えば１つ以上の硫酸化部位（すなわち酸性本体中のチロシン）を、導入されたまたは既に存在するシアリル-Le^x付加部位（例えば、部位特異的変異誘発の標準的技法によって）の近傍に導入することによって、既に存在する融合分子の中に組み入れてもよく、または組換えDNA技術の標準的技法を用いて、P-セレクチンリガンド配列（例えば、本明細書に記載のP-セレクチンリガンド配列）を抗体融合タンパク質配列に加えてもよい。次に、P-セレクチン-AGP-抗体融合タンパク質を発現プラスミドに導入し、適当なフコシルトランスフェラーゼ発現細胞にプラスミドを形質転換させて、可溶性抗体融合タンパク質を産生させる。補体結合およびFc受容体結合を阻害することが可能な抗体融合タンパク質を調製するため、別のシアリル-Le^x共通グリコシル化部位（N-X-T/S）を、上記のようにヒトIgG1のCH2ドメインに導入してもよい。この構成方法に基づき、血漿半減期が長く、望ましくない細胞-細胞相互作用（例えば、白血球とセレクチン含有細胞との相互作用）の阻害能を有する、いかなる数の組換えP-セレクチン-AGP-抗体融合タンパク質を設計してもよい。阻害能を高めた分子を産生するため、上記のアッセイを用いて、候補分子を設計してスクリーニングする。一つの特定の例では、シアリル-Le^xおよび硫酸決定基の取り込み能、および好中球の活性化内皮細胞への結合阻害能に関して、分子をスクリーニングしてもよい；そのような分子はセレクチン-依存型炎症反応および浸潤性白血球によって誘発された組織損傷の阻害に用いられる。P- セレクチン媒介およびE-セレクチン媒介相互作用を妨害可能な分子 P-セレクチンおよびE-セレクチン媒介細胞内相互作用のいずれも炎症に関与しているため、およびそれらの相互作用に関わる重要な決定基が今や特定されたため、両タイプの有害な相互作用を妨害することが可能な単一の分子を設計することが可能である。特に、P-セレクチンリガンドドメイン（すなわちシアリル-Le^x および硫酸化部分を有するドメイン）およびE-セレクチンリガンドドメイン（すなわち、シアリル-Le^x部分を有するドメイン）の双方を含む分子（例えばタンパク質）を構成してもよい。そのような分子はドメインを組み合わせることによって、例えば、P-セレクチンリガンドドメインをシアリル化分子（例えば、本明細書記載のシアリル化抗体または抗体融合タンパク質）に加えることによって構成してもよい。または、例えば、部位特異的変異誘発によって、適当なシアリル-L e^xおよび／または硫酸化部位を既に存在する配列に導入してもよい。操作分子のグリコシル化または硫酸化は、例えば、本明細書およびワルツら（ Walz）Science 250:1132〜1135（1990）に記載のように試験してもよい。シアリル-Le^x修飾および／または硫酸化分子の細胞内相互作用の妨害能はまた、前記のワルツら（Walz）が記載のように、または標準的な技法、例えば、決定因子含有分子の濃度増加の、固定化P-セレクチンおよび／またはE-セレクチンに対するT リンパ球または骨髄細胞の接着阻害能をアッセイすることによって、試験してもよい。利用本発明のタンパク質または有機化合物分子を患者に投与するために、薬学的に純粋なタンパク質または分子を、許容される担体、例えば生理食塩水に懸濁し、適当な経路によって（例えば、静脈内）１回投与または複数回投与として患者に投与する。最適には、全てのP-セレクチン、二重機能分子については全てのE-セレクチン結合部位を内皮細胞上で飽和させるために十分量の治療剤が提供される。典型的には、これは0.1 mg/kg以上の用量で得てもよい。好ましい投与量は0.1 〜2.0 mg/kgの範囲である。本発明のシアリル-Le^x修飾および硫酸化分子ならびにタンパク質（例えば、本明細書記載の修飾抗体および抗体融合タンパク質）を、１つの例において滲出依存性臓器障害および／または凝血の治療に用いてもよい。特に、P-セレクチンは炎症または組織障害部位、もしくは血栓形成部位近位に重層する好中球の接着を媒介するため、本発明の分子およびタンパク質はそのような相互作用を遮断する有用な治療を提供する。例えば、P-セレクチンは、成人呼吸促進症候群後の好中球の肺への遊走および虚血性心筋損傷（すなわち梗塞）後の心臓への遊走をおそらく媒介し、特定の条件下では腎臓の糸球体損傷に重要な役割を果たす可能性がある。したがって、本発明のシアリル-Le^x修飾および硫酸化分子またはタンパク質は、そのような疾患または状態に苦しむ患者に投与してもよい。そのような治療は、浸潤する好中球と血管または臓器の内皮細胞との相互作用を競合的に阻害することによって、滲出依存性損傷を低減する。本発明の化合物は、特に、P-セレクチンリガンド-AGP-融合タンパク質およびP-セレクチンリガンド-AGP-抗体融合タンパク質もまた、上記のように、敗血性ショックまたは敗血症の治療に用いてもよい。さらに、本発明による抗体または抗体融合タンパク質は、治療または診断部位を標的とする抗体の特異性を利用して、抗体に基づく療法の在来治療またはインビボ診断に用いてもよい。１つの特定の例では、本発明による抗体融合タンパク質のP-セレクチンリガンドドメインは、そのタンパク質を炎症部位に向け、治療法（有害なP-セレクチン媒介細胞内相互作用の遮断に有用な）および診断法（炎症の部位の標識に有用な）を共に提供する。再度、接着したシアリル-Le^x決定基は抗体のCH2ドメインを隠し、補体結合およびFc受容体結合の望ましくない効果を遮断するために用いてもよい。その他の態様その他の態様は請求の範囲内である。例えば、細胞またはタンパク質間の相互作用を遮断する目的で、シアリル-Le^xおよび硫酸決定基を接着すべきその他の適当な担体分子を本発明に用いてもよい。一般に、血清中での半減期が比較的長いタンパク質が好ましい。担体タンパク質の１つのクラスはアルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン、またはヒト血清アルブミン）、トランスフェリン、または α-2マクログロブリンのような血清タンパク質である。担体タンパク質は、例えば、部位特異的変異誘発によって担体タンパク質（上記のように）のDNA配列に部位が導入されることに加えて、内因性硫酸化およびグリカン付加部位を含んでもよい。担体タンパク質は脂質であってもよいがあまり好ましくない。１つの例において、１つ以上の結合シアリル-Le^xおよび硫酸化決定部位を有する脂質を、リポソームとして標的細胞壁（例えば、内皮細胞壁）に輸送する。リポソームは細胞またはタンパク質相互作用を遮断してもよく、薬物をその適当な作用部位に投与するために用いてもよい。シアリル-Le^xおよび硫酸決定基を有する担体分子の産生は、細胞内、好ましくは酵母以外の真核生物で行ってもよい。哺乳類細胞、例えば哺乳類細胞株は特に適した宿主である。これらの細胞は一般に、必要な前駆体分子を合成し、硫酸化および炭水化物結合に関与する酵素を産生または産生するよう操作することができる。シアリル-Le^x決定基の結合に関しては、CHOおよびlec11のような哺乳類細胞株は特に適している。または、シアリル-Le^xおよび硫酸決定基のいずれかまたは両方をインビトロで、すなわち細胞外で担体分子に結合してもよい。一つの例において、α(1,3)フコシルトランスフェラーゼは固体支持体（例えばカラム）に結合させ、硫酸化担体分子は、担体分子上のその適当な部位へのシアリル-Le^x 基を結合を容易にする条件下で、結合したフコシルトランスフェラーゼ酵素上を通過する。本発明はまた、微生物因子（例えば、リポ多糖類（LPS））、微生物毒素（例えば、毒性ショック腸管毒素）、宿主メディエーター（例えば、サイトカイン）、または抗腫瘍治療（例えば、腫瘍壊死因子（TNF）またはインターロイキン-1 （IL-1）の投与）、もしくはその組み合わせによって引き起こされたショック誘発現象、ショックの臨床症状、またはその両者の予防、阻害、または治療のための、硫酸化およびシアリル-Le^x修飾-AGP-抗体融合タンパク質の利用を含む。例えば、そのような抗体融合タンパク質をヒト患者に投与して、微生物LPSによって生じた敗血症ショックの効果を軽減することができる。抗体融合タンパク質が、ショック（例えば、敗血症または毒素ショック症候群）の効果を予防、治療、または阻害する能力は、当技術分野で既知の定法に従って評価される（例えば、リバートら（Libert）J.Exp.Med.180:1571〜1575に記載の方法）。本明細書で言及した全ての出版物、特許、および特許出願は、個々の出版物、特許および特許出願が特殊におよび個々に参照として組み入れられることが示される場合があれば、それと同じ程度に、本明細書に参照として組み入れられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 38/22 ＡＣＤＡ６１Ｋ 37/24 ＡＢＮＡＣＶＡＢＤＡＤＺＡＣＶＡＥＥＡＣＤＣ０７Ｋ 14/47 ＡＤＺ 14/705 ＡＢＡ 16/18 ＡＥＥ (72)発明者ポウヤニターラアメリカ合衆国マサチューセッツ州ボストンデパートメントオブジェネティックスハーバードメディカルスクールアンドモウルキュラーバイオロジーマサチューセッツジェネラルホスピタル

Claims

【特許請求の範囲】１．シアリル-Le^x決定基および硫酸決定基を共有結合している有機化合物分子であって、これらの決定基のうちの少なくとも一つが該分子の天然に生じたのではない部位に位置する、有機化合物分子。２．分子が複数のシアリル-Le^x決定基または複数の硫酸決定基を含む、請求項1 記載の有機化合物分子。３．分子が可溶性である、請求項1記載の有機化合物分子。４．分子が、図8Aの第21〜57番目のアミノ酸、またはP-セレクチン受容体との相互作用を仲介できるその一部分から本質的になる、P-セレクチンリガンドを含む、請求項1記載の有機化合物分子。５．分子が、図8Aの第38〜57番目のアミノ酸から本質的になるP-セレクチンリガンドを含む、請求項4記載の有機化合物分子。６．分子がα１-酸性糖タンパク質（AGP）を含む、請求項1または4記載の有機化合物分子。７．分子が抗体分子を含む、請求項1または4記載の有機化合物分子。８．請求項4〜7記載の有機化合物分子のいずれかをコードする、精製された核酸。９．核酸がさらに、（a）α１-酸性糖タンパク質（AGP）または（b）抗体分子のいずれかをコードする、請求項8記載の精製された核酸。 10．請求項8記載の核酸を含むベクター。 11．請求項8記載の核酸を含む細胞。 12．P-セレクチンタンパク質含有細胞を、請求項1記載の有機化合物分子に接触させることを含む、該P-セレクチンタンパク質含有細胞の、シアリル-Le^x決定基および硫酸決定基を有する分子または細胞への結合を阻害する方法。 13．有機化合物分子が、E-セレクチンタンパク質含有細胞の、シアリル-Le^x決定基有する分子または細胞への結合も阻害する、請求項12記載の方法。 14．治療有効量の請求項1記載の有機化合物分子を、哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において炎症を抑制する方法。 15．治療有効量の請求項1記載の有機化合物分子を、哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における血管外滲出依存性の有害反応を抑制し、またはそれらから哺乳動物を保護する方法。 16．血管外滲出依存性の有害反応が、血管外滲出依存性の器官損傷または成人呼吸促進症候群、糸球体腎炎、または虚血性心筋傷害に伴う凝血である、請求項15 記載の方法。 17．治療有効量の請求項1記載の有機化合物分子を、哺乳動物に投与することを含む、有害な免疫反応を抑制、またはそれらから哺乳動物を保護する方法。 18．有害な免疫反応が微生物因子または宿主因子により誘発される、請求項17記載の方法。 19．有害な免疫反応が敗血症性ショックまたは敗血症である、請求項17記載の方法。