MXPA97010114A - Ligandos de p-selectina y moleculas y metodos relacionados - Google Patents

Abstract

Se divulgan en la presente moléculas orgánicas a las cuales estáenlazadas covalentemente un determinante sialilo-lex y un determinante sulfatado, al menos uno de estos determinantes estando colocado en un sitio que no ocurre naturalmente en la molécula. También se divulgan ligandos de P-selectina y fusiones ligando-anticuerpo de P-selectina particulares. Estas moléculas, ligandos y proteínas de fusión encuentran uno en métodos de reducir o proteger contra reacciones de inflamación y reacciones adversas dependientes de extravasación, tales como daño deórganos y coagulación (por ejemplo, asociada con el síndrome de la enfermedad respiratoria de adultos o lesión isquémica del miocardio).

Description

LIGANDOS DE P-SELECTINA Y MOLÉCULAS RELACIONADAS Y MÉTODOS Declaración con Respecto a Investigación Patrocinada Federalmente Esta invención se hizo con el apoyo del gobierno de los Estados Unidos, bajo la concesión NIH DK43031, y por consiguien-te, el gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en esta invención. Antecedentes de la Invención Esta invención se refiere a moléculas de ligandos de P-selectina, ADNs, y usos de las mismas. La P-selectina es una lectina de tipo C de membrana integral que se encuentra adentro de los cuerpos de eibel-Palade de las células endoteliales y los granulos alfa de las plaquetas (McEver y colaboradores, J. Clin . Invest . , 84=92-99, 1989, Bonfanti y colaboradores Blood, 73:1109-1112, 1989; Hsu-Lin y colaboradores, J". Biol . Chem. , 259:9121-9126, 1984; Stenberg y colaboradores, J. Cell Biol . , 101.: 880-886, 1985). Su translocación a la membrana de plasma se puede inducir mediante trombina, histamina, y otros mediadores liberados por la activación de las células mástil, el complejo C5b-9 de complemento, ó el fragmento C5a, peróxidos, y lipoproteína de baja densidad oxidada (Hsu-Lin y colaboradores, J. Biol . Chem . , 259 :9121-9126. 1984; Stenberg y colaboradores, ". Cell Biol . , 101:880-886, 1985; Hattori y colaboradores, J. Biol . Chem. , 264:9053-9060, 1989; Kubes y Kan ar, J. Immunol . , 152:2570-2577, 1994; Thorlacius y colaboradores, Biochem. Biophys . Res . Communications, 203 : 1043-1049. 1994; Foreman y colaboradores, J. Clin, Invest . , 94:1147-1155, 1994; Patel y colaboradores, J. Cell Biol . , 112:749-759. 1991; Lehr y colaboradores, Labora tory Invest . , 21:380-386, 1994; Gebuhrer y colaboradores, Biochem. J. , 306:293-298, 1995). Una vez exhibida sobre la superficie celular, la P-selectina soporta la unión de los mielomonocitos con las plaquetas o las células endoteliales (Larsen y colaboradores, Cell , 59:305-312, 1989; Hamburger y McEver, Blood, 25:550-5541990; Geng y colaboradores, Nature, 343.: 757-760, 1990; Gamble y colaboradores, Science, 249.-414-417, 1990) . En la última posición, su apariencia presagia un insulto al tejido subyacente, y soporta el paso inicial en la extravasculación de leucocitos, el rodamiento de neutrófilos a lo largo de la pared de la vénula postcapilar (Lawrence y Springer, Cell , 6.5:859-873, 1991). Los ratones que son homocigóticamente deficientes para el gene estructural de P-selectina, exhiben una disminución en el rodamiento de leucocitos, y muestran un reclutamiento demorado de granulocitos hacia los sitios de inflamación experimentalmente inducida (Mayadas y colaboradores, Cell , 24:541-554, 1993). En general, los mediadores que inducen la expresión de P-selectina están involucrados en la señalización de trauma o herida. Una de las primeras respuestas reconocidas al trauma del tejido, es la activación de las células mástil, que está acompañada por una liberación de histamina serotonina, y otros mediadores difundibles. Otros eventos comunes incluyen formación de trombo en los sitios de la ruptura vascular y compromiso de la trayectoria alternativa de complemento por los cuerpos extraños. La expresión de P-selectina es inducida por las señales generadas en cada uno de estos contextos. Aunque se ha pensado que la inducción de la rodadura de neutrófilos mediada por P-selectina es una consecuencia inevitable de la intervención quirúrgica, se ha demostrado que el cromolín, un agente que bloquea la desgranulación de las células mástil, impide esta rodadura, proporcionando de esta manera una elegante demostración del papel de la célula mástil como el enlace entre el trauma y la extravasculación (Kubes y Kanwar, ". Jmmunol . , 152:3570-3577, 1994) . Compendio de la Invención En un primer aspecto, la invención proporciona una molécula orgánica a la que se enlaza covalentemente un determinante de sialilo-Lex y un determinante sulfatado, colocándose cuando menos uno de estos determinantes en un sitio que no se presenta naturalmente sobre la molécula. En un segundo aspecto, la invención proporciona un ligando de P-selectina seleccionado a partir del grupo que consiste esencialmente en: (a) los aminoácidos 21-57 de la Figura 8A, y (b) los aminoácidos 38-57 de la Figura 8A.

En un tercer aspecto, la invención proporciona proteínas de fusión que incluyen un ligando de P-selectina unido a un dominio de anticuerpo (por ejemplo, uno o más de los dominios de articulación, CH2 , y CH3) . En los aspecto relacionados, la invención proporciona ácido nucleico purificado que codifica una proteína que contiene sitios para la unión de un determinante de sialilo-Lex, y un determinante sulfatado, colocándose cuando menos uno de estos determinantes en un sitio que no se presenta naturalmente sobre la proteína; ácido nucleico purificado que codifica cualquiera de los ligandos de P-selectina de la invención; ácido nucleico purificado que codifica una proteína de fusión de P-selectina-anticuerpo; y vectores y células recombinantes que incluyen a cualquiera de estos ácidos nucleicos. También se incluye en la invención el uso de ligandos de P-selectina o moléculas orgánicas que llevan estos ligandos (si se desea, en combinación con otras proteínas, tales como los dominios de anticuerpo o de glicoproteína de ácido ax) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cualquiera de las condiciones descritas más adelante. En otro aspecto relacionado, la invención proporciona un método para inhibir la fijación de una célula que lleva una proteína de P-selectina a una molécula o célula que lleva un determinante de sialilo-Lex y un determinante sulfatado. El método involucra poner en contacto la célula que lleva la proteí-na de P-selectina con cualquiera de una molécula orgánica que lleve sialilo-Lex y determinantes sulfatados, colocándose cuando menos uno de estos determinantes en un sitio que no se presenta naturalmente sobre la molécula; una proteína de fusión de P-selectina-anticuerpo; o cualquiera de los ligandos de P-selectina de la invención. En otro aspecto relacionado, la invención proporciona un método para reducir la inflamación en un mamífero, el cual involucra administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de una molécula orgánica que lleve siali-lo-Lex y determinantes sulfatados, colocándose cuando menos uno de estos determinantes en un sitio que no se presenta naturalmente sobre la molécula; una proteína de fusión de P-selectina-anticuerpo; o cualquiera de los ligandos de P-selectina de la invención. En todavía otro aspecto relacionado, la invención proporciona un método para reducir o proteger a un mamífero contra cualquier reacción adversa dependiente de la extravascula-ción (incluyendo, sin limitación, daño a órgano dependiente de la extravasculación y/o coagulación asociada con síndrome de insuficiencia respiratoria de adultos, nefritis glomerular, y lesión isquémica al miocardio) . El método involucra administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de una molécula orgánica a la que se enlace covalentemente un sialilo-Lex y un determinante sulfatado, colocándose cuando menos uno de estos determinantes en un sitio que no se presente naturalmente sobre la molécula; una proteína de fusión de P-selectina-anticuerpo; o cualquiera de los ligandos de P-selectina de la invención. En un aspecto final, la invención proporciona un método para reducir o proteger a un mamífero contra una reacción inmune adversa, el cual involucra administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de una molécula orgánica a la que se enlace covalentemente un sialilo-Lex y un determinan-te sulfatado, colocándose cuando menos uno de estos determinantes en un sitio que no se presente naturalmente sobre la molécula; una proteína de fusión de P-selectina-anticuerpo; o cualquiera de los ligandos de P-selectina de la invención. De preferencia, este método involucra tratar al mamífero por una reacción inmune adversa que es inducida por un factor microbiano. Estos factores microbianos incluyen, sin limitación, lipopolisacáridos (LPS) de bacterias gram-negativas, peptidoglucanos de organismos gram-positivos, mañano de las paredes de células fúngales, polisacáridos, enzimas extracelulares (por ejemplo, estreptoquinasa) y toxinas (por ejemplo, enterotoxinas de choque tóxico de estafilococos) . En otras modalidades preferidas, el método involucra tratar a un mamífero por cualquier reacción inmune adversa que sea inducida por un factor del huésped. Los factores del huésped incluyen, sin limitación, metabolitos de complemento, quinina, y sistemas de coagulación, factores liberados de células estimula-das (por ejemplo citocinas tales como interleucina 1 (IL-1) , y factor de necrosis tumoral-a (TNF) ) , enzimas y oxidantes de leucocitos polimorfonucleares (PMNs) , vasopéptidos (por ejemplo, histamina) , y productos del metabolismo del ácido araquidónico. En otras modalidades preferidas, la reacción inmune adversa es inducida por factor de necrosis tumoral -a recombinante, o es inducida por interleucina-1 recombinante. En todavía otras modalidades preferidas, la reacción inmune adversa es choque séptico o es septicemia. En las modalidades preferidas de cada uno de los aspectos anteriores, la molécula orgánica o la proteína también inhibe la fijación de una célula que lleve una proteína de E-selectina (ELAM-1) a una molécula o célula que lleve un determinante de sialilo-Lex y por consiguiente, inhibe la inflación mediada por E-selectina, las reacciones adversas dependientes de la extravasculación y las reacciones inmunes adversas; el siali-lo-Lex y los determinantes sulfatados están presentes sobre un ligando de P-selectina que consiste esencialmente en: los aminoácidos de 21-57 de la Figura 8A (por ejemplo, los aminoácidos 38-57 de la Figura 8A) ; el determinante de sialilo-Lex está N-enlazado u O-enlazado; la molécula o la proteína contiene múltiples determinantes de sialilo-Lex y/o múltiples determinantes sulfatados; la molécula orgánica es una proteína (por ejemplo, un anticuerpo) , IgG ó IgM) , glicoproteína de ácido cx (AGP) , o una proteína de fusión de anticuerpo (por ejemplo, una proteína de fusión de anticuerpo-AGP) ; la proteína es un anticuerpo, AGP, o una proteína de fusión de anticuerpo (por ejemplo una proteína de fusión de anticuerpo-AGP) a la cual se le une cualquiera de los ligandos de P-selectina descritos en la presente (por ejemplo, en le término amino de la proteína) ; el anticuerpo o la proteína de fusión de anticuerpo (por ejemplo, la proteína de fusión de anticuerpo-AGP) incluye, como una porción del anticuerpo, un dominio de IgGl CH2 , CH3 , y/o de articulación; el anticuerpo, la AGP, o la proteína de fusión de anticuerpo, incluye uno o más de los sitios de adición de glucano N-enlazados de la glicoproteína de ácido 0^; la porción de anticuerpo de la molécula lleva uno o más determinantes de sialilo-Lex que no se presentan naturalmente; el determinante de sialilo-Lex interfiere con la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento o para fijar un receptor de Fc (por ejemplo, debido a un determinante de sialilo-Lex unido a uno o más de los aminoácidos 274, 287, ó 322 de la secuencia mostrada en la Figura 10) ; y la molécula orgánica es soluble. Un "ligando de P-selectina", como se utiliza en la presente, significa cualquier secuencia de aminoácidos capaz de mediar una interacción con un receptor de P-selectina, e incluye las proteínas referidas como contra-receptores de P-selectina. Los ligandos de P-selectina preferibles incluyen, sin limitación, los aminoácidos 21-57, y más preferiblemente los aminoácidos 38-57 de la Figura 8A. Los ligandos de P-selectina de conformidad con la invención, se pueden utilizar en conjunto con dominios de proteína adicionales (por ejemplo, dominios de anticuerpo) , para producir proteínas de fusión útiles en la invención. "Que no se presentan naturalmente" significa un determinante de sialilo-Lex o sulfatado que no es uno que se fije naturalmente a la molécula en la localización de ese aminoácido. "Inflamación" significa un proceso patológico que consiste en reacciones citológicas e histológicas que se presentan en los vasos sanguíneos afectados y en los tejidos adyacentes en respuesta a una lesión o estímulo anormal ocasionado por un agente físico, químico, o biológico. La inflación, como se utiliza en la presente, incluye cualquier respuesta inflamatoria aguda (por ejemplo, durante o enseguida de síndrome de insuficiencia respiratoria de adultos o de lesión isquémica al miocardio) , así como cualquier respuesta inflamatoria crónica (por ejemplo, artritis reumatoide, psoriasis, o pemfigus vulgaris) . "Acido nucleico purificado" significa ADN que está exento de genes que, en el genoma que se presenta naturalmente del organismo a partir del cual se derive el ADN de la invención, flanquea al gene. Por consiguiente, el término incluye por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector; en un plásmido o virus de réplica autónoma; o en el ADN genómico de un procariote o eucariote; o que exista como una molécula separada (por ejemplo, un ADNc o un fragmento de ADNc o genómico producido mediante reacción de cadena de polimerasa o mediante digestión de endonucleasa de restricción) independiente de otras secuencias.

También incluye un ADN recombinante que es parte de un gene híbrido que codifica la secuencia del polipéptido adicional . "N-enlazado" significa que está enlazado al nitrógeno de amida de un residuo de asparagina de una proteína. "0-enlazado" significa que está enlazado con el oxígeno del grupo hidroxilo de un residuo de serina, treonina, o hidroxi-lisina de una proteína. Una "reacción adversa dependiente de la extravascula-ción" significa cualquier reacción que sea perjudicial para el huésped, y que resulte directa o indirectamente de la unión inapropiada de neutrófilos al endotelio en o próxima a un sitio de inflamación, daño de tejido, o formación de trombo, y que da como resultado la emigración de estos neutrófilos hacia el vaso sanguíneo u órgano unido. Los órganos que pueden ser afectados por este daño incluyen, sin limitación, el corazón, los pulmones, y los ríñones . Una "reacción inmune adversa" significa cualquier reacción mediada por una célula inmune (es decir, cualquier célula B, célula T, monocito/macrófago, célula aniquiladora natural, célula mástil, basófilo, o granulocito) , y que es perjudicial para el huésped. Descripción Detallada Primero se describirán brevemente los dibujos. La Figura ÍA es una representación esquemática de la estructura de los mutantes de supresión PSGL-1. La supresión sistemática del ectodominio de PSGL-1 se realizó con métodos de reacción de cadena de polimerasa convencionales. Se ilustran una repetición de 10 residuos representativa (punteada; SEQ ID NO:l) , y el dominio transmembrana (sombreada) . La Figura IB es un histograma que representa la actividad de fijación de P-selectina de células COS transfectadas que expresan las supresiones mostradas en la Figura ÍA. Se permitió que las células etiquetadas con 51Cr se adhirieran a la P-selectina soluble adsorbida a las cavidades de microtitulación. Las células se lavaron, luego las células fijadas se lisaron, y se contaron los niveles de 51Cr. Se introdujeron construcciones de supresión en las células bien sea en ausencia (barra 2) o en la presencia (las 7 barras restantes) de la fucosiltransferasa FTVII humana) . La Figura 2A es una representación esquemática de quimeras de PSGL-1 y CD43. El dominio extracelular próximo de membrana, la transmembrana, y los dominios intracelulares de PSGL-1 fueron reemplazados con las secuencias conocidas de CD43. La molécula resultante carece de cisteínas, y por consiguiente, no puede formar un dímero enlazado con disulfuro. La Figura 2B es un histograma que representa la actividad de fijación de P-selectina de células COS transfectadas que expresan las quimeras mostradas en la Figura 2A. FTVIIh, cotransfección con la fucosiltransferasa FTVII humana. La Figura 3A es una representación esquemática de mucinas quiméricas que llevan el dominio apical de PSGL-1 unido a los términos C de mucina intactos o truncados. Se ilustran el término N de PSGL-1 (punteado; SEQ ID N0:1), y los dominios transmembrana (TM) (sombreados) . La secuencia de "repeticiones" PSGL-1-NH2/CD 3 esta representada por la SEQ ID NO: 2. La PSGL-1 se fundió con el término N de las moléculas de CD34 y GlyCAM-1 maduras predichas, y con el término N de la región de repetición de CD43. La Figura 3B es un histograma que representa la actividad de fijación de P-selectina de células COS transfectadas que expresan la construcciones mostradas en la Figura 3A. FTVIIh, fucosiltransferasa FTVII humana. La Figura 4A es una representación esquemática de mutantes de supresión PSGL. El dominio terminal de amino se unió a las moléculas PSGL que tenían diferentes números del elemento repetido. La Figura 4B es un histograma que representa la actividad de fijación de P-selectina de células COS transfectadas que expresan las quimeras ilustradas en la Figura 4A. La Figura 5 es una fotografía de un autorradiograma de proteínas de fusión de mucina: inmunoglobulina etiquetadas con 35S-sulfato, y pasadas por electroforesis sobre un gel de polia-crilamida desnaturalizante al 8 por ciento bajo condiciones de reducción. Pista A, sobrenadante de células transfectadas CDM8 ; Pista B, sobrenadante de células transfectadas con el vector de expresión de Ig (sin inserto de mucina) ; Pista C, sobrenadante de células que expresan PSGL-l:Ig; Pista D, sobrenadante de células que expresan CD43:Ig; Pista E, sobrenadante de células que expresan CD34:Ig; y Pista F, sobrenadante de células que expresan GlyCAM-l:Ig. La Figura 6A y la Figura 6B son histogramas que representan la fijación a P- y E-selectina inmovilizada de células COS expresan PSGL-1 con o sin fucosiltransferasa y en la presencia o en ausencia de NaCl03 10 mM. La Figura 6A es un histograma que representa la fijación de las células a P-selectina. La Figura 6B es un histograma que representa la fijación de las células a E-selectina. La Figura 7 es una fotografía de un autorradiograma de proteínas de fusión de PSGL-1: inmunoglobulina etiquetadas con 35S-sulfato en la presencia o en ausencia de NaCl03 10 mM, y pasadas por electroforesis sobre un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 8 por ciento bajo condiciones de reducción. La fotografía indica que el clorato inhibe la incorporación de 35S-sulfato en las quimeras de mucina solubles. Pista A, sobrenadante de células transfectadas CDM8 en ausencia de clorato; Pista B, sobrenadante de células que expresan PSGL-1: Ig en ausencia de clorato; Pista C, sobrenadante de CDM8 en la presencia de clora-to; y Pista D, sobrenadante de células que expresan PSGL-l:Ig en la presencia de clorato. La Figura 8A es un listado de los puntos de extremo de la secuencia de diferentes mutantes de supresión PSGL-1 (indicados por las flechas) . La secuencia más superior es la SEQ ID NO: 13; la secuencia media es la SEQ ID NO: 13; la secuencia más inferior es la SEQ ID NO: 14. La Figura 8B es un histograma que representa la actividad de fijación de P-selectina de células COS transfectadas que expresan los mutantes de supresión que tienen los puntos de extremo mostrados en la Figura 8A. La Figura 9A es un diagrama esquemático de las construcciones empleadas para medir el efecto de unir las variantes de tipo silvestre y mutantes de los residuos 38-57 de PSGL-1 a PSGL-1 suprimida o CD43. Las secuencias insertadas se muestran en la parte inferior izquierda. La Figura 9B es un histograma que representa la actividad de fijación de P-selectina de células COS transfectadas que expresan las quimeras ilustradas en la Figura 9A. La Figura 10 es un listado de la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:8) que codifica IgGl (SEQ ID NO: 9) , y las mutacio-nes diseñadas para crear los sitios de adición de glucano N-enlazado (SEQ ID N0:12). La Figura HA es la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO.10), y la Figura 11B es la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 11) de una proteína de fusión AGP-IgGl. La Figura 12A es un diagrama esquemático de proteínas de fusión de inmunoglobulina que consisten en PSGL-1 intacta (SEQ ID NO:4) , ó en péptidos de 20 residuos unidos a los dominios de articulación, CH2, y CH3 de IgGl humana. La construcción Y/F-hlgG lleva la SEQ ID NO. 5; la construcción T/AhlgG lleva la SEQ ID NO: 6; la construcción Y/F-T/A-hlgG lleva la SEQ ID NO: 7. La Figura 12B es un fotografía de un gel de poliacrilamida al 8 por ciento utilizado para evaluar la incorporación de [35S] cisteína y metionina por las proteínas de fusión mostradas en la Figura 12A en seguida de la transfección en células COS. Pista A, sobrenadante de células transfectadas con control de CDM8. Pista B, sobrenadante de células transfectadas con proteínas de fusión de PSGL-1-inmunoglobulina. Pista C, sobrenadante de células transfectadas con T-hlgG. Pista D, sobrenadante de células transfectadas con Y/F-hlgG. Pista E, sobrenadante de células transfectadas con T/A-hlgG. Pista F, sobrenadante de células transfectadas con Y/F-T/A-hlgG. La Figura 12C es una fotografía de un gel de poliacrilamida al 8 por ciento utilizado para evaluar la incorporación de [35S] sulfato por las proteínas de fusión mostradas en la Figura 12A en seguida de la transfección de las células COS. En adición, se incluyó una proteína de fusión de control que no llevaba adición amino-terminal (Pista B) . Las Pistas C a G corresponden a las Pistas B a F en la Figura 12B. La Figura 13 es una gráfica de barras de células HL-60 interactuantes por campo capturado por video. Las células se infundieron en una cámara de flujo de placa paralela previamente recubierta con quimera de P-selectina-inmunoglobulina o un control de quimera de CD4-inmunoglobulina. Las células se sometieron a una tensión de esfuerzo cortante de 0.75 dinas/cm2. Cada barra representa el número promedio de células (+ error medio estándar) por campo de 8 marcos tomados a intervalos de 15 segundos. Las células que ruedan o que fluyen aparecen como rayas en la imagen de video. Las barras representan, de izquierda a derecha: células HL-60 que ruedan o que fluyen sobre la quimera de P-selectina-inmunoglobulina, células HL-60 previamente tratadas en un medio exento de sulfato con clorato de sodio 10 mM, y células HL-60 que fluyen sobre la quimera de CD4- inmunoglobulina. Se demostró que los determinantes de sialilo-Lewis X (sialilo-Lex) y sulfatados, interactúan con la P-selectina, y facilitan la fijación, mediante los siguientes experimentos. Estos ejemplos se presentan para ilustrar, y no para limitar, la invención. Primero se describirán los métodos empleados en los siguientes experimentos. Producción de P-Selectina Soluble Se prepararon quimeras de Ig de P-selectina y E-selectina mediante la expresión transitoria en células COS de un plásmido de expresión que codificaba los dominios de lectina, relacionados con EGF, y los primeros dos dominios relacionados con la repetición en consenso corta de P-selectina unida a los dominios de articulación, CH2, y CH3 de IgGl humana (Aruffo y colaboradores, EMBO J. , 6.: 3313-3316, 1991; alz y colaboradores, Science, 250:1132-1135, 1990) . La secuencia de codificación del ADNc de PSGL-1 se obtuvo mediante amplificación de reacción de cadena de polimerasa de una biblioteca de ADNc de HL-60, y la secuencia se confirmó mediante el secuenciamiento del ADN. El segmento de codificación para el dominio maduro extracelular, transmembrana, e intracelular se insertó en un vector de expresión basado en CDM8 que carece del origen de réplica del virus de polioma, y contiene la secuencia líder para el antígeno CD5 colocado justo corriente arriba de la región de codificación para un rótulo de epítope del péptido de hemaglutinina de influenza (flu) (Field y colaboradores, Mol . Cell . Biol . , 8:2159-2165, 1998) . Construcción de Supresiones de PSGL-1 Se prepararon construcciones de supresión de PSGL-1 amino-terminales mediante amplificación de reacción de cadena de polimerasa, utilizando cebadores que codificaban el punto de extremo deseado del mutante de supresión localizado corriente abajo de un sitio Xbal en el marco 2 (que codifica Leu Asp) . Las secuencias resultantes codificaron un polipéptido en donde los residuos mencionados en seguida siguieron inmediatamente al ácido aspártico (D) del sitio Xba: A118, A128, A138, A148, A158, A168, G178, A188, A198, A208, A218, A228, A238, A248, A258, y T268 de precursor PSGL-1. Luego se insertaron los fragmentos de la reacción de cadena de polimerasa en el vector de expresión de rótulo de flu líder de CD5 utilizado para la expresión de la PSGL-1 intacta. El rótulo de flu termina en un sitio Xbal en el marco descrito anteriormente. Se verificaron las secuencias en la unión del rótulo de flu, y la expresión se confirmó en células COS mediante microscopio de inmunofluorescencia indirecta y citometría de flujo. También se preparó una serie de supresiones internas con un sitio EcoRI en el sitio de la supresión en el marco uno (que codifica fenilalanina de ácido glutámico) creando primero variantes de supresión con términos amino (los residuos inmediatamente en seguida de fenilalanina [F] ) del sitio EcoRI, correspondientes A118, A128, A138, A148, A158, A168, G178, A188, A198, A208, A218, A228, A238, A248, y A258 de la secuencia del péptido del precursor. A cada una de estas variantes suprimidas se le unió un dominio de PSGL-1 amino-terminal rotulado con flu que finalizaba con un sitio EcoRI en el marco de fenilalanina de ácido glutámico inmediatamente corriente abajo del precursor A117 de PSGL-1. Las construcciones resultantes contuvieron supresiones entre A117 y los diferentes puntos de extremo anteriores. Intercambios del Dominio de Mucina Se prepararon las mucinas CD34, CD43, y GlyCAM-1 para la adición del dominio amino-terminal de PSGL-1 mediante la unión de un sitio EcoRI bien sea al término amino maduro (CD34 ó GlyCAM-1) , o al principio de una región de repeticiones ricas en treonina/prolina (CD43) . Como antes, el sitio EcoRI estaba en el marco de fenilalanina de ácido glutámico (marco 1) . La secuencia de CD34 empezó en el residuo F30 del precursor, el Gly-CAM-1 en el precursor L19, y CD43 en el precursor 1135. A cada uno de éstos se le unió el dominio de PSGL-1 rotulado con flu que terminaba en EcoRI como anteriormente. El término amino y los elementos de repetición de PSGL-1 se unieron a los dominios proximal, transmembrana, e intracelular de la membrana de CD43 a través de un sitio EcoRI en el marco de fenilalanina de ácido glutámico colocado inmediatamente corriente arriba de las secuen-cias S225 del precursor CD43. El fragmento complementario de PSGL-1 correspondió a los residuos amino-terminales de precursor hasta T267. Mapeo de Estructura Fina del Dominio Amino-Terminal Se empleó una estrategia similar para la construcción de supresiones en el dominio amino-terminal, en donde se formaron supresiones generadas por reacción de cadena de polimerasa utilizando cebadores que llevaban un sitio Xbal en el marco de ácido aspártico de leucina (marco 2) . Inmediatamente corriente abajo de los residuos que codificaban ácido aspártico, estaban las secuencias de PSGL-1 correspondientes a los precursores R38, E58, P78, y A98. Para la definición del dominio amino-terminal, se sintetizaron oligonucleótidos dúplex correspondientes a los residuos entre 38 y 57 con los cambios de secuencia indicados para mutar los residuos de trionina o tirosina en alanina o fenilalanina. Todas las construcciones se confirmaron mediante secuenciamiento de didesoxi . Ensayos de Adhesión Celular Las células transfectadas se separaron de los platos de cultivo con EDTA 0.5 mM en suero regulado con fosfato (PBS) de 48 a 60 horas después de la transfección. Las células se cargaron entonces con 100 microlitros de 51Cr04 (1 mCi/ml; DuPont, Boston, MA) en NaCl al 0.9 por ciento más 100 mililitros de medio mediante su incubación a 37°C durante 1 hora. Las células cargadas se lavaron dos veces en suero regulado con fosfato, y se volvieron a suspender en albúmina de suero bovino al 0.2 por ciento, NaCl 0.15 M, CaCl2 3 mM. La variación en el índice de rotulación (cuentas incorporadas por célula) entre las células preparadas en paralelo con el mismo lote de cromato rotulado, fue típicamente mínima. Las células etiquetadas se incubaron en cavidades de platos de microcultivo de 96 cavidades que se habían recubierto con anticuerpo de cabra contra IgG humana purificado por afinidad (100 microlitros de 20 microgramos/mililitro de Fc contra IgG humana (específico de cadena pesada) en suero regulado con fosfato) durante 2 horas en una cámara húmeda a la temperatura ambiente. Después el plato se lavó dos veces con suero regulado con fosfato, se bloquearon sitios adicionales de fijación de proteína mediante una incubación durante la noche con 200 micro-litros de albúmina de suero bovino al 3 por ciento en suero regulado con fosfato. El plato se lavó con suero regulado con fosfato cuatro veces, y se incubó con 200 microlitros de sobrenadantes de proteína de fusión durante 2 horas. En seguida de tres lavados con suero regulado con fosfato y un lavado adicional (en albúmina de suero bovino al 0.2 por ciento, NaCl 0.15 M, CaCl2 3 mM) , se agregaron 2 x 105 células/cavidad (en 200 microlitros de albúmina de suero bovino al 0.2 por ciento, NaCl 0.15 M, CaCl2 3 mM) , y se dejaron fijarse durante 15 minutos a la temperatura ambiente mientras que el plato se giraba sobre una plataforma giratoria (80 rmp) . El plato se lavó tres veces llenando las cavidades con 200 microlitros de NaCl 0.15 M/CaCl23 mM, y luego se invirtió el plato. Las células adherentes se lisaron mediante la adición de 200 microlitros de SDS al 2 por ciento, y se contó el cromato etiquetado con un espectrómetro de rayos gamma. Análisis de Inmunofluorescencia Se prepararon células para la citometría mediante incubación con el anticuerpo monoclonal primario (una dilución de 1:200 de ascitas o 5 microgramos/mililitro de anticuerpo purificado es adecuada) en suero regulado con fosfato conteniendo albúmina de suero bovino al 3 por ciento durante 30 a 45 minutos. Las células se lavaron dos veces con suero regulado con fosfato, y se incubaron con 2 microgramos/mililitro de anticuerpo purificado por afinidad conjugado con FITC para IgG de ratón (12CA5) o IgM de ratón (CSLEX-1) durante 30 a 45 minutos en suero regulado con fosfato/albúmina de suero bovino al 3 por ciento. Luego las células se lavaron dos veces con suero regulado con fosfato, y se volvieron a suspender en un mililitro de paraformaldehído recién despolimerizado al 1 por ciento en suero regulado con fosfato antes del análisis. Para la microscopía de inmunofluorescencia, las células transfectadas se fijaron con paraformaldehído recién despolimerizado al 4 por ciento, se lavaron, se expusieron a albúmina de suero bovino al 3 por ciento en suero regulado con fosfato durante 30 minutos, y luego se incubaron con anticuerpo primario (ascitas, 1:250) durante 30 a 45 minutos. Entonces las células se lavaron dos veces con suero regulado con fosfato y se incubaron durante 30 a 45 minutos con anticuerpo purificado por afinidad conjugado con FITC para IgG de ratón (Cappell; 2 microgramos/mililitro en suero regulado con fosfato conteniendo albúmina de suero bovino al 3 por ciento) . Finalmente, las células se lavaron dos veces con suero regulado con fosfato, y se analizaron. Rotulación Metabólica con 35S01 Las células COS transfectadas con plásmidos de expresión que codificaban quimeras de mucina: inmunoglobulina, se tripsinizaron un día después de la transfección, y se transfirieron a platos nuevos en medio completo (DMEM con suero de becerro al 10 por ciento) . Antes de la rotulación, se removió el medio, las células se lavaron una vez con suero regulado con fosfato, y el medio fue reemplazado bien sea con medio exento de cisteína y metionina para la rotulación con [35S] cisteína y metionina (TransLabel, ICN) , o con medio CRCM-30 exento de sulfato (Sigma Chemical Co.) para la rotulación con 35S04. No se agregó suero, y el radionúclido estuvo típicamente presente en una concentración de 200 µCi/ml. Después de un intervalo de rotulación de 12 a 16 horas, se cosecharon los sobrenadantes, y se recolectaron las proteínas de fusión mediante adsorción en agarosa de cabra contra IgG humana (Cappel) . Las proteínas adsorbidas se sometie-ron a electroforesis de desnaturalización sobre geles de poliacrilamida al 8 por ciento bajo condiciones de reducción. Inhibición de Adhesión por Clorato Las células COS se transfectaron con dextrano de DEAE, y se incubaron inmediatamente en DMEM conteniendo suero de becerro al 10 por ciento y clorato de sodio 10 mM. Un día después de la transfección, las células se tripsinizaron y se incubaron en platos frescos en el mismo medio durante 6 horas. Luego se removió el medio, las células se lavaron con suero regulado con fosfato, y entonces se encubaron durante 18 horas adicionales en un medio DMEM preparado como se acostumbra (Life Technologies) careciendo de sulfato, y conteniendo el 2 por ciento de los niveles convencionales de cisteína y metionina con suero bovino fetal dializado al 10 por ciento en la presencia de clorato de sodio 10 mM (Baeuerle y Huttner, Biochem. Biophys . Res . Comm. , 141:870-877. 1986). Entonces las células se cosecharon para utilizarse en los ensayos de adhesión e inmunofluorescencia. Las células de control se trataron similarmente, pero se incubaron en DMEM conteniendo suero no dializado. Rodadura de Células HL-60 Se adquirieron imágenes de video de células HL-60 rodando a través de una cámara de flujo rectangular de placa paralela (FCS2, Bioptechs, Incorporated, Butler, Pennsylvania, Estados Unidos) con una etapa de temperatura controlada estable-cida a 37°C, con una cámara CCD AIMS Technology (Bronx, New York, Estados Unidos) montada en un microscopio Zeiss ICM 405 invertido equipado con un objetivo de 2.5x. La altura de la cámara fue de 250 mieras. Las células se retiraron a través de la cámara a una velocidad de flujo definida, con la ayuda de una bomba de jeringa Harvard Apparatus (South Natick, Massachusetts, Estados Unidos) modelo I/ 22. Las imágenes se analizaron utilizando un aparato de imágenes NIH. Para inhibir la sulfatación, las células HL-60 se lavaron una vez con suero regulado con fosfato, y se cultivaron durante 18 horas en medio exento de sulfato conteniendo el 2 por ciento de los niveles normales de cisteína y metionina, clorato de sodio 10 mM, y suero dializado como se describió anteriormente. Por cada experimento, se suspendieron 106 células en 1 mililitro de NaCl 0.15 M CaCl23 mM, y se retiraron a través de la cámara. Se recubrieron cubreobjetos de vidrio con anti-cuerpo de cabra contra IgG humana purificado por afinidad en una concentración de 10 microgramos/mililitro en Tris-HCl 50 mM (pH de 9.0) durante 2 horas, se lavaron dos veces con suero regulado con fosfato, y se bloquearon durante la noche con albúmina de suero bovino al 0.2 por ciento en suero regulado con fosfato. Los cubreobjetos tratados se sumergieron entonces en sobrenadantes de células COS transfectadas con los plásmidos de expresión de la quimera de inmonoglobulina apropiada, se lavaron dos veces con suero regulado con fosfato, y se ensamblaron en la cámara de flujo. El Término Amino de PSGL-1 es Necesario para la Fijación de P-Selectina Se crearon supresiones del término amino de la mucina de PSGL-1 con técnicas de reacción de cadena de polimerasa, y los ADNcs truncados resultantes se insertaron corriente abajo de una secuencia de péptido secretor que se había fundido con un rótulo de oligopéptido corto derivado a partir de hemaglutinina de influenza (HA) . Los plásmidos de expresión que codificaban las moléculas truncadas (Figura ÍA) se transfectaron en células COS en la presencia de una fucosiltransferasa mieloide específica, designada como FTVII, que dirige la expresión de determinantes sLex exclusivamente (Sasaki y colaboradores, ". Biol . Chem. , 269:14730-14737, 1994; Natsuka y colaboradores, [La fe de erratas publicada aparece en J". Biol . Chem. , 269:20806, 1994], J. Biol . Chem. , 269:16789-16794, 1994). La expresión de los mutantes de supresión en la superficie celular se confirmó mediante inmuno-fluorescencia indirecta utilizando anticuerpos monoclonales contra HA. La presencia de sLex sobre la superficie celular se confirmó similarmente utilizando el anticuerpo monoclonal CSLEX-1. Se determinó la capacidad de las células transfectadas radiorrotuladas para fijar las cavidades de plástico previamente recubiertas con proteína de fusión de P-selectina : inmunoglobulina. Estos experimentos revelaron que la supresión de los 100 residuos amino-terminales (referidos en la presente como el dominio apical) de PSGL-1 fue suficiente para abolir la fijación de los transfectantes a la P-selectina inmovilizada (Figura IB) .

Estos experimentos también demuestran que el sLex media la fijación de P-selectina, ya que se requirió la expresión de FTVII para la fijación de P-selectina (Figura IB; compare la barra 2 con la barra 3) . La expresión de las variantes de supresión en la superficie celular se confirmó mediante inmunofluorescencia indirecta utilizando anticuerpos monoclonales contra HA, y la presencia de sLex sobre la superficie celular se confirmó utilizando el anticuerpo monoclonal CSLEX-1. La Tabla 1 muestra la intensidad de fluorescencia promedio (MFI) de células COS que se cotransfectaron con FTVIIh humana y las construcciones de supresión (mostradas en la Figura ÍA) , y se sometieron a inmunofluorescencia indirecta con anticuerpo contra el péptido flu amino-terminal o sLex. Tabla 1 Construcción Expresión (Intensidad de Fluorescencia Promedio Flu Slex En el contexto de Mucinas Sulfatadas Grandes, el Término Amino de PSGL-1 es Suficiente Para la Fijación de P-Selectina Para determinar si se requerían otras secuencias de PSGL-1 diferentes de aquellas encontradas en los primeros 100 aminoácidos N-terminales (es decir, el dominio apical) de PSGL-1, para la fijación a P-selectina, las regiones transmembrana y citoplásmica de PSGL-1 fueron reemplazadas por aquellas del antígeno CD43 (Pallant y colaboradores, Proc . Nati . Acad . Sci . , 6.: 1328-1332, 1989; Shelley y colaboradores, Proc. Nati . Acad. Sci . , 86:2819-2823, 1989). La molécula resultante, que no contenía residuos de cisteína, fijo la P-selectina con la misma eficiencia que lo hizo la PSGL-1 (Figura 2A y Figura 2B) . Por consiguiente, no se requiere la formación de enlace de disulfuro ni un segmento de anclaje de membrana específico para la actividad de fijación de P-selectina. Los primeros 100 aminoácidos predichos de PSGL-1 se injertaron entonces genéticamente sobre los términos amino de los elementos de repetición de tipo de mucina de varias micinas no relacionadas, para determinar si el dominio apical de PSGL-1 es suficiente para la actividad del ligando de P-selectina (es decir, contra-receptor) (Figura 3A) . Algunas de estas mucinas quiméricas pudieron soportar la fijación de P-selectina en este establecimiento. CD34 y CD43, dos mucinas relativamente grandes que se encuentran predominantemente sobre las células hematopoyéticas humanas, fueron ambas capaces de soportar la fijación. En contraste, una variante artificialmente anclada de GlyCAM-1, una mucina expresada en las vénulas endoteliales superiores que tiene actividad de ligando de L-selectina (Lasky y colaboradores, Science, 258 : 964-969 , 1992), fue inactiva en este ensayo (Figura 3B) . El dominio de mucina GlyCAM-1 en estos experimentos se trabó a la superficie celular por medio del tallo extracelular, el dominio transmembrana, y los segmentos de anclaje citoplásmi-cos de CD7 (Aruffo y colaboradores, EMBO J. , 6:3313-3316, 1987) . La expresión en la superficie celular de las diferentes mucinas y quimeras de mucina, se confirmó mediante inmunofluorescencia indirecta, utilizando anticuerpos contra el rótulo de flu, sLex, o las mucinas respectivas. La Tabla 2 muestra las mediciones de intensidad de fluorescencia promedio (MFI) de la expresión del rótulo de flu o de sLex por las células COS transfectadas con las construcciones analizadas en la Figura 3B. Las construcciones CD34 y CD43 fueron positivas para la expresión mediante inmuno-fluorescencia indirecta utilizando anticuerpos contra CD conocidos .

Tabla 2 Construcción Expresión (Intensidad de Fluorescencia Promedio Flu SLe* Las masas moleculares aparentes de CD43 y CD34 expresadas en células COS, se reportan como de 100-130 kD (Shelley y colaboradores, Proc . Na ti . Acad. Sci . , 86:2819-2823, 1989) y de 100 kD (Simmons y colaboradores, J". Immunol . , 148:267-271, 1992), respectivamente; el monómero PSGL-1 exhibe una masa molecular efectiva de 110 kD (Sako y colaboradores, Cell , 75 : 1179-1186. 1993) . GlyCAM-1, en su estado nativo (no trabado) coemigra con proteínas de 50 kD, sugiriendo que es sustancialmente más pequeña (Lasky y colaboradores, Science, 258 : 964-969, 1992) . En nuestros estudios, las mucinas más grandes pudieron soportar la fijación de P-selectina cuando se unió el dominio apical de PSGL-1 al término amino de las mucinas. La supresión en secuencia de los elementos de repetición internos de PSGL-1 nos permitió acortar la molécula de una manera sistemática sin comprometer la asociaciones terciarias globales potenciales (Figura 4A) . A medida que se suprimieron estos elementos de repetición, declinó la activi-dad de fijación de PSGL-1, consistente con la conclusión de que la distancia desde la membrana del plasma es un determinante importante de la actividad de fijación de P-selectina (Figura 4B) . Nuestros datos también indican que la sulfatación es un determinante de la capacidad de las mucinas para soportar la fijación dirigida al dominio apical. Evaluamos la capacidad de diferentes mucinas para sufrir sulfatación en las células COS. Las quimeras de mucina solubles PSGL-1, CD34, CD43, y GlyCAM-1 incorporaron fácilmente 35S-sulfato de sodio cuando se expresaron en células COS (Figura 5) . La Inhibición de la Sulfatación Bloquea la Fijación de PSGL-1 a P-selectina Hemos descubierto que la inhibición de la sulfatación bloquea la fijación de PSGL-1 a P-selectina. Las células COS se cotransfectaron con PSGL-1 y FTVII, o se transfectaron con PSGL-1 y FTVII por separado. Durante el período de tiempo en el que se esperaba la máxima síntesis de PSGL-1, las células se incubaron en un medio DMEM modificado que carecía de sulfato, y que contenía clorato de sodio 10 mM, un inhibidor relativamente selectivo de la sulfatación (NaC103) . Observamos una disminución signifi-cativa en la capacidad de las células cotransfectadas tratadas con clorato para fijarse a la P-selectina inmovilizada (Figura 6A) , mientras que las mismas células mostraron poca o ninguna disminución en la fijación a E-selectina inmovilizada (Figura 6B) . La expresión de la superficie celular del antígeno es sLex o de la secuencia del rótulo amino-terminal de PSGL-1 no fue inhibida por el tratamiento con NaCl03. De hecho, como se muestra en la Tabla 3, se observó un incremento en la intensidad de fluorescencia promedio de las células transfectadas, que representaban tanto el rótulo contra sLex como contra flu, en seguida del tratamiento con clorato, sugiriendo que el clorato puede afectar la internalización o la exportación de la superficie celular. Tabla 3 Expresión (Intensidad de Fluorescencia Promedio) sin NaClO, con NaC103 10 mM Una quimera de inmunoglobulina de PSGL-1 soluble sintetizada bajo condiciones comparables, mostró una inhibición esencialmente completa de la incorporación de 35S-sulfato (Figura 7) , bajo condiciones en las que no se inhibió la síntesis de proteína medida mediante la incorporación de [35S] cisteína y metionina. Estos datos demuestran que se requiere la sulfatación del ligando de P-selectina para la actividad de fijación de P-selectina. Análisis de Supresión de Estructura Fina del Dominio Apical de PSGL-1 Para localizar los elementos dentro del dominio apical de 100 aminoácidos que contribuyen a la actividad del ligando de P-selectina, preparamos una colección de mutantes de supresión en donde se suprimieron diferentes regiones del dominio apical (Figura 8A) . Entonces cada mutante de supresión amino-terminal se colocó corriente abajo del elemento líder CD5/rótulo de flu para supervisar la expresión de la superficie celular. Los mutantes de supresión de estructura fina mostraron poca variabilidad en su capacidad para expresar el rótulo del epítope, como fue evaluado mediante inmunofluorescencia indirecta. La remoción de los primeros 20 aminoácidos del término N de la PSGL-1 madura no afectó la actividad de fijación de P-selectina. En contraste, la remoción de los primeros 40 aminoácidos del término N abrogó la fijación (Figura 8B) . Otras supresiones de PSGL no afectaron la actividad de fijación de P-selectina. De conformidad con lo anterior, los residuos de aminoácido 20 a 40 de PSGL (es decir, los residuos 38 a 57 del precursor predicho que tenía la secuencia de señal) son los requeridos para la fijación de P-selectina. Para demostrar que los residuos 38 a 57 son suficientes para la actividad dirigida al dominio apical de PSGL-1, agregamos este segmento a los términos amino de PSGL-1 y a los núcleos de mucina CD43 de donde se había suprimido los dominios apicales (Figura 9A) . En ambos casos, la adición de los aminoácidos 38-57 del elemento de péptido PSGL-1 confirió actividad de fijación de P-selectina sobre el núcleo de mucina. En ambos casos, el nivel de actividad de fijación de P-selectina fue equivalente a aquel de la PSGL-1 nativa (Figura 9B) . Se Requieren Residuos Específicos Dentro del Péptido Amino-Terminal Para la Actividad de Fijación de P-selectina La región de 20 aminoácidos que es necesaria para la fijación de P-selectina, contiene tres sitios de sulfatación de tirosina potenciales y dos residuos de treonina para la glicosilación O-enlazada. Para evaluar la importancia de estos residuos, las tirosinas se convirtieron en fenilalanina (Figura 9A) . En un segundo péptido, las treoninas se convirtieron en alaninas . En adición, se preparó un tercer péptido, que contenía una mutación quíntuple, de tal manera que ambas conversiones se hicieron en un solo péptido. Cada péptido mutado se colocó entonces, por separado, corriente abajo del rótulo de flu y corriente arriba de cualquiera de (1) la PSGL-1 truncada que carecía del dominio apical, o (2) los elementos de repetición CD43 y el dominio transmenbrana. Las células que expresaban las quimeras resultantes se probaron por su capacidad para fijarse a la P-selectina inmovilizada (Figura 9A) . La conversión de las tirosinas en fenilalaninas dio como resultado la pérdida de la actividad de fijación a la p-selectina. El reemplazo de los residuos de treonina con alanina disminuyó la fijación, pero no la abolió enteramente. La expresión de rótulo de flu o del epítope de sLex no afectó en estas células. La fijación medida por los 20 residuos apicales, como aquella de la PSGL-1 nativa, dependió de la presencia de calcio. Estos datos indican que se requiere la sulfatación de tirosinas en las posiciones 46, 48, y 51, para la actividad de fijación de P-selectina. La fijación de E-selectina no fue afectada bajo las mismas condiciones. En adición, estos datos indican que se requieren las treoninas en las posiciones 44 y 57. Estos residuos de treonina pueden servir como sitios para la adición de glucano O-enlazado. Estos experimentos, en conjunto con nuestros experimentos que muestran que se necesita la expresión de FTVII y para la fijación de P-selectina, proporcionan la evidencia de que la fijación de P-selectina requiere de sLex en las treoninas 44 y 57. En suma, los experimentos anteriormente descritos demuestran que los aminoácidos 38-57, que contienen 3 residuos para la sulfatación y 2 residuos para la adición de sLex, son suficientes para conferir la actividad de fijación de P-selectina. Los Residuos Dentro de los 10 Aminoácidos Amino-Terminales son Sulfatados Sobre Tirosina Para determinar si el segmento amino-terminal era capaz de ser sulfatado en vivo, creamos proteínas de fusión consistentes en las secuencias de péptido nativas o mutantes unidas a la inmunoglobulina humana Gl (IgGl) (Figura 12A) . Las proteínas de fusión resultantes se expresaron en células COS, y se evaluó su capacidad para asimilar sulfato inorgánico (Figura 12B) . Las quimeras de inmunoglobulina que llevaban las secuencias de péptido nativas pudieron incorporar sulfato, mientras que aque-lias que llevaban fenilalanina sustituyendo a la tirosina, no lo fueron (Figura 12C) . El reemplazo de treonina con alanina no tuvo efecto alguno sobre la incorporación de sulfato (Figura 12C) . Los Inhibidores de Sulfatación Bloquean la Rodadura de HL-60 Sobre Quimeras de P-Selectina-Inmunoqlobulina Para explorar si la inhibición de la sulfatación comprometería una adhesión fisiológicamente relevante, sometimos a las células HL-60 a un cultivo en un medio que contenía clorato, y examinamos la capacidad de las células resultantes para unirse y rodar sobre los cubreobjetos recubiertos con quimeras de P-selectina-inmunoglobulina bajo condiciones de tensión de esfuerzo cortante fluida definida (Lawrence y colaboradores, Blood, 25:227-237 , 1990) . Las células HL-60 pudieron unirse a, y rodar sobre, los cubreobjetos previamente recubiertos con quimeras de P-selectina-inmunoglobulina, mientras que no se observó esta interacción con los cubreobjetos recubiertos con una quimera de CD4-inmúnoglobulina (Figura 13) . El crecimiento de las células HL-60 en clorato, redujo dramáticamente la frecuencia de la interacción celular con el sustrato (Figura 13) . Anticuerpos y Proteínas de Fusión de Anticuerpos que Llevan Determinantes de Sialilo-Lex y Sulfatados En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo que lleva determinantes de sialilo-Lex y sulfatados. Este anticuerpo se puede crear mediante la introducción de sitios de sulfatación (es decir, una tirosina en un contexto ácido) en una molécula de anticuerpo existente en la vecindad de un sitio de adición de sialilo-Lex introducido o existente (por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio estándar) . De una manera alternativa, se puede agregar sitios de sialilo-Lex y/o de sulfatación apropiados mediante la unión de cualquier frecuencia de ligando de P-selectina (por ejemplo, cualquier dominio de p-selectina descrito en la presente) a una secuencia de anticuerpo que se presente naturalmente (por ejemplo, IgG ó IgM) mediante técnicas de ADN recombinante estándares, para producir una proteína de fusión de P-selectina-anticuerpo. De preferencia, la secuencia del ligando de P-selectina se une al término amino de la molécula del anticuerpo. Estos anticuerpos son útiles para interrumpir las interacciones indeseables entre las células o proteínas, o en general, para interrumpir cualquier interacción entre dos moléculas, una de las cuales lleve un determinante llevado por el anticuerpo. Debido a que estos determinantes normalmente actúan para facilitar las interacciones que involucran a E-selectina y P-selectina (por ejemplo, las interacciones entre los neutrófilos y las células endoteliales que revisten las paredes de los vasos sanguíneos) , la capacidad para interrumpir estas interacciones proporciona muchas aplicaciones terapéuticas, por ejemplo, para minimizar la inflamación y disminuir el daño de órgano y/o la coagulación dependientes de la extravasculación. En adición, si se desea, también se pueden incorporar una o más fracciones de sialilo-Lex que enmascaren la porción CH2 de la molécula de inmunoglobulina, y por consiguiente, inhiban la fijación del complemento y la fijación del receptor Fc, en la secuencia del anticuerpo. Debido a que las fracciones de carbohidrato bloquean el dominio de inmunoglobulina que desencadena la fijación del complemento y la fijación del receptor Fc, estos anticuerpos no provocan los efectos secundarios indeseables (es decir, aquellos que resultan de la fijación del complemento y de la fijación del receptor Fc) frecuentemente asociados con las terapias basadas en anticuerpos. De preferencia, los grupos de carbohidrato sirven no solamente para inhibir la fijación del complemento indeseable y la fijación del receptor Fc, sino también realizan la función de inhibir competitivamente una interacción intracelular mediada por E-selectina y/o P-selectina. Para inhibir la fijación del complemento y la fijación del receptor Fc, se pueden agregar determinantes de sialilo-Lex a la molécula de anticuerpo en cualquier sitio apropiado. Los sitios de adición de glucano N-enlazado son bien conocidos como: N X S/T (en donde N es asparagina, S es serina, T es treonina, y X es cualquier aminoácido excepto prolina) . De conformidad con lo anterior, se puede diseñar una molécula de ejemplo que incluya varios de estos sitios para la unión de las cadenas laterales de sialilo-Lex. La inspección de la secuencia de IgGl (Figura 10) revela cuando menos cinco sitios en los cuales se pueden introducir sitios de adición de glucano N-enlazado en la molécula en lugares convenientes, en donde se perjudicó la capacidad de fijación del complemento edificación del receptor Fc mediante el proceso. Estos sitios incluyen los residuos de aminoácido 274, 287, 295, 322, y 335. Aunque éstos son los sitios preferidos de la adición de glucano N-enlazado, no son los únicos candidatos; se pueden identificar otros sitios útiles, y se pueden incorporar en la secuencia de IgGl utilizando, como guía, los siguientes criterios: (1) los sitios se localizan de preferencia en la región CH2 de la molécula de inmunoglobulina, es decir, en la porción de la molécula responsable de la fijación del complemento y de la fijación del receptor Fc; (2) los sitios se localizan en regiones de la secuencia, predichas por su naturaleza hidrófila, para estar presentes sobre el exterior de la molécula de inmuno-globulina, y por consiguiente, accesibles para las enzimas responsables de la unión de las cadenas laterales de carbohidra-to; (3) los sitios se localizan en una región que es mínimamente interruptora de la secuencia de aminoácidos primaria, y por consiguiente, de la estructura de aminoácidos secundaria predi-cha. Por ejemplo, sería preferible un sitio que se presente naturalmente que difiera de un sitio de adición de glucano N-enlazado por un solo aminoácido, a un sitio que requiera de dos alteraciones en la secuencia de aminoácidos. Más aun, es preferible crear un sitio de adición de glucano N-enlazado sustituyendo aminoácidos de una carga o polaridad similar (por ejemplo, la sustitución de un aminoácido no cargado por otro) . Se pueden diseñar una o más sustituciones del sitio de adición de glucano N-enlazado en una secuencia de codificación de IgGl particular; estas secuencias (es decir, aquellas que codifican una molécula de anticuerpo a la que se unen las fracciones de sialilo-Lex) se denominan IgGl-sialilo-Lex ó IgGl-Lex. La introducción de sitios de glicosilación adicionales en los aminoácidos #274, #287, y #322 dentro del dominio CH2 , creo una molécula que no fue reconocida por el receptor Fc ó el complemento utilizando los ensayos que son convencionales en la técnica; los ensayos de fijación de complemento de ejemplo incluyen Weir y colaboradores, Handbook of Experimental Immuno-logy, Blackwell, Oxford; y Coligan y colaboradores, Current Protocols In Immunology, Wiley Interscience, 1995. Una molécula de IgGl particular que lleva fracciones de sialilo-Lex, se produce como sigue. El gene de IgGl está públi-camente disponible, y su secuencia se muestra en la Figura 10. El gene se mutageniza mediante métodos convencionales de mutagénesis dirigida al sitio in vi tro, con el objeto de introducir uno o más sitios de adición de glucano N-enlazado (por ejemplo, aquellos descritos anteriormente y mostrados arriba de la secuen-cia que se presenta naturalmente en la Figura 10) . Luego se inserta el gene en un vector diseñado para expresar la proteína en una célula eucariótica (ver, por ejemplo, aquellos vectores descritos en Gillies y colaboradores, patente de los Estados Unidos No. 4,663,281, incorporada a la presente como referencia) . La célula huésped eucariótica de preferencia es una célula de mamífero (por ejemplo, una célula CHO ó lecll) , y el vector de expresión que contiene a la secuencia que codifica IgGl-Lex mutada se introduce en la célula huésped mediante transección transitoria o estable empleando técnicas convencionales. Estas células huésped también se transfectan (de una manera transitoria o estable) con un vector capaz de expresar una a (1, 3) fucosil-transferasa capaz de unir los grupos sialilo-Lex a la molécula de anticuerpo en los sitios de glicosilación. El gene de a(l,3)fu-cosiltransferasa se puede expresar a partir de un vector distinto de aquel que codifica IgGl-Lex, o ambos genes pueden ser llevados sobre, y expresados a partir de, un vector común. Las células de mamífero son huéspedes particularmente útiles para la síntesis de IgGl-Lex, debido a que proporcionan todos los precursores requeridos para la producción de sialilo-Lex. Para producir los anticuerpos modificados con sialilo- Lex y sulfatados de la invención, el gene que codifica la secuencia del anticuerpo de preferencia se expresa en una célula que también exprese una o; (1, 3) fucosiltransferasa que catalice exclusivamente los enlaces de a (1, 3) fucosa; esta enzima se describe en Walz y colaboradores, Science, 250:1132-1135 (1990), y en Seed, solicitud de patente de los Estados Unidos No. de Serie 08/ 483,151, intitulada "Fucosiltransferasa Genes and Uses Thereof", presentada el 7 de junio de 1995 (incorporada a la presente como referencia) . De una manera menos preferible, se puede utilizar el ADNc de a (1, 3 ) fucosiltransferasa descrito en Lowe y colaboradores ( Cell 63.: 475, 1990) . Esta fucosiltransferasa reconoce una molécula precursora sialilada, y agrega bien sea una fracción de fucosa a(l,3)- o o; (1, 4) -enlazada, a las cadenas laterales de N-acetilglucosamina. El determinante de sialilo-Lex se caracteriza por un enlace o; (1,3), y como tal, la enzima de a; (1, 3) fucosil-transferasa de Lowe (supra) produce tanto las moléculas modificadas por sialilo-Lex deseadas, como productos que llevan fucosa (1,4) -enlazada que, aunque no es activa para fijarse a P-selectina y E-selectina, no interfiere con la acción de las moléculas modificadas por sialilo-Lex, ni produce otros efectos secundarios indeseables . Las células huésped que expresan a (1, 3) fucosiltrans-ferasa y el anticuerpo que se va a modificar, se cultivan mediante métodos estándares, y el anticuerpo se purifica a partir de un lisado celular basándose en su afinidad para una columna de proteína A, o cualquier técnica convencional de aislamiento y purificación de anticuerpos. Proteínas de Fusión de Glicoproteína de Acido a1-Anticuerpo que Llevan Determinantes de Sialilo-Lex y Sulfatados Como se discute en la presente, las proteínas de fusión de anticuerpos modificadas mediante sulfatación y adición de sialilo-Lex, tienen importantes usos terapéuticos y de diagnóstico. El trabajo anterior ha demostrado que se pueden generar grandes cantidades de proteínas de fusión de anticuerpos, y se pueden secretar transitoriamente a partir de las células de mamífero transfectadas (por ejemplo, células COS) . En general, para producir una proteína de fusión de anticuerpo AGP de conformidad con la invención, el ADN que codifica una AGP y un dominio de ligando de P-selectina se funden dentro del marco a los dominios de IgG humana (por ejemplo, dominios constantes) mediante técnicas estándares, y se expresa la proteína de fusión, también mediante técnicas estándares. La porción de anticuerpo de la molécula facilita la purificación de la proteína de fusión, y también prolonga la vida media en plasma de polipéptidos o dominios de polipéptido de otra manera de vida corta. De preferencia, las proteínas de fusión de anticuerpos se expresan de acuerdo con los métodos dados a conocer en Seed y colaboradores, solicitud de patente de los Estados Unidos No. de Serie 08/ 483,151 intitulada "Fucosiltransferase Genes and Uses Thereof", presentada el 7 de junio de 1995 (la cual se incorpora a la presente como referencia) , por ejemplo, utilizando anticuerpos IgG ó IgM, o porciones de los mismos (ver también Zettlemeisl y colaboradores, DNA Cell Biol . 9.:347 (1990) para las proteínas de fusión de IgM) . Se han construido plásmidos recombinantes que expresan proteínas de fusión de AGP-anticuerpo particulares (por ejemplo, proteínas de AGP-Articulación-CH2-CH3 y AGP-CH2-CH3) como sigue. Se clonó un ADNc que codifica al gene de a^-AGP de fase aguda a partir de una biblioteca de ADNc de hígado humano mediante reacción de cadena de polimerasa (PCR) , utilizando cebadores de oligonucleótido correspondientes a las regiones de codificación 5' y 3' de a^-AGP (Board y colaboradores, Gene 44:127, 1986), de acuerdo con las técnicas estándares. El cebado AGP 5' se diseñó para contener un sitio de restricción HindIII, y el cebador 3' se diseñó para contener un sitio de restricción BamHl en lugar del codón de detención a AGP. El producto amplificado mediante reacción de cadena de polimerasa se digirió con HindIII/BamHI, y se clonó en un cásete de expresión de plásmido de corte HindlII/-BamHI (ver Aruffo y colaboradores, Cell , 61:1303, 1990) que contenía dominios constantes de IgGl humana (es decir, articula-ción-CH2-CH3 ó CH2-CH3) . En la Figura HA y en la Figura 11B, se muestra una secuencia de nucleótidos y una secuencia de aminoácidos de esta proteína de fusión de AGP-IgG, respectivamente. Para crear una molécula que bloquee las interacciones mediadas por P-selectina, se introducen sitios para la sulfatación, y si es necesario, la adición de sialilo-Lex, en la secuencia de la proteína de fusión de anticuerpo (por ejemplo, las proteínas de fusión de anticuerpos descritas anteriormente) . Estos sitios se pueden incorporar en una molécula de fusión existente, por ejemplo, mediante la introducción de uno o más sitios de sulfatación (es decir, una tirosina en un contexto ácido) en la vecindad de un sitio de adición de sialilo-Lex introducido o existente (por ejemplo, mediante técnicas estándares de mutagénesis dirigida al sitio) , o se puede unir una secuencia de ligando de P-selectina (por ejemplo, cualquiera de las secuencias de ligando de P-selectina descritas en la presente) a la secuencia de la proteína de fusión de anticuerpo, empleando técnicas estándares de tecnología de ADN recombinantes. Luego se introducen los genes de fusión de P-selectina-AGP-anticuerpo en los plásmidos de expresión, y los plásmidos se transfectan en cualquier célula que exprese fucosiltransferasa apropiada para la producción de proteínas de fusión de anticuerpos solubles. Para preparar una proteína de fusión de anticuerpo capaz de inhibir la fijación del complemento y la fijación del receptor Fc, se pueden introducir sitios de glicosilación en consenso de sialilo-Lex adicionales (N-X-T/S) en el dominio CH2 de la IgGl humana, como se describió anteriormente. Basándose en esta estrategia de construcción, se puede diseñar cualquier número de proteínas de fusión de P-selectina-AGP-anticuerpo recombinantes que tengan vidas medias en plasma largas, y la capacidad para inhibir las interacciones de célula-célula indeseables (por ejemplo, las interacciones entre leucocitos y células que llevan selectina) . Para generar moléculas con una mayor potencia inhibidora, se diseñan moléculas candidatas, y se rastrean empleando los ensayos descritos anteriormente. En un ejemplo particular, las moléculas se pueden rastrear por su capacidad para incorporar los determinantes de sialilo-Lex y sulfatados, y para bloquear la fijación de los neutrófilos a las células endoteliales activadas; estas moléculas encuentran uso en la inhibición de las reacciones inflamatoria y dependientes de selectina y de la lesión del tejido infringida por leucocitos invasores . Moléculas Capaces de Interferir con las Interacciones Mediadas por P-selectina y Mediadas por E-selectina Debido a que tanto las interacciones intracelulares mediadas por P-selectina como por E-selectina están involucradas en la inflamación, y debido a que ahora se han identificado los determinantes cruciales involucrados en estas interacciones, es posible diseñar una sola molécula capaz de interferir con ambos tipos de interacciones perjudiciales. En particular, se pueden construir moléculas (por ejemplo, proteínas) que incluyan tanto un dominio de ligando de P-selectina (es decir, un dominio que lleve fracciones de sialilo-Lex y sulfatadas) , como un dominio de ligando de E-selectina (es decir, un dominio que lleve una fracción de sialilo-Lex) . Esta molécula se puede construir mediante la combinación de los dominios, por ejemplo, uniendo un dominio de ligando de P-selectina con una molécula sialilada (por ejemplo, un anticuerpo sialilado o una proteína de fusión de anticuerpos sialilada descritos en la presente) . De una manera alternativa, se pueden introducir sitios apropiados de sialilo-Lex y/o de sulfatación en una secuencia existente, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio. La glicosilación o la sulfatación de una molécula diseñada se puede probar, por ejemplo, como se describe en la presente y en Walz y colaboradores, Science 150.: 1132-1135 (1990) . La capacidad de una molécula modificada con sialilo-Lex y/o sulfatada para interferir con las interacciones intracelulares, también se puede probar como se describe en Walz y colaboradores, supra, o mediante cualquier técnica estándar, por ejemplo, mediante el ensayo de la capacidad para incrementar las concentraciones de la molécula que lleva determinante, para inhibir la adherencia de linfocitos T o células mieloides a la P-selectina y/o la E-selectina inmovilizadas. Uso Para administrar una proteína o molécula orgánica de la invención a un paciente, se suspende la proteína o la molécula farmacéuticamente pura en un vehículo aceptable, por ejemplo, suero fisiológico, y se aplica al paciente mediante la vía apropiada (por ejemplo, intravenosamente) en una sola dosis o en múltiples dosis. De una manera óptima, se proporciona una cantidad suficiente del producto terapéutico para saturar toda la P-selectina, y para una molécula de función doble, todos los sitios de fijación de E-selectina en una célula endotelial. Típicamente, esto se puede lograr con dosis de 0.1 miligramos/ki-logramo o mayores. La dosificación preferida está en la escala de 0.1 a 2.0 miligramos/kilogramo. Las moléculas y proteínas modificadas por sialilo-Lex y sulfatadas de la invención (por ejemplo, los anticuerpos y proteínas de fusión de anticuerpos modificados descritos en la presente) se pueden utilizar, en un ejemplo, para el tratamiento del daño de órgano y/o coagulación dependientes de la extravascu-lación. En particular, debido a que la P-selectina media la unión de los neutrófilos que se sobreponen a los sitios de inflamación o al daño de tejido o próximos a la formación de trombo, las moléculas y proteínas de la invención proporcionan productos terapéuticos útiles para el bloqueo de estas interacciones. Por ejemplo, la P-selectina media de la misma manera la emigración de neutrófilos hacia adentro del pulmón en seguida del síndrome de insuficiencia respiratoria de adultos, y hacia adentro del corazón en seguida de lesión isquémica al miocardio (es decir, infarto) , y puede tener un papel el daño glomerular a los ríñones bajo ciertas condiciones. De conformidad con lo anterior, una molécula o proteína modificada por sialilo-Lex y sulfatada de la invención, se puede administrar a un paciente que sufra de esta enfermedad o condición. Este tratamiento atenúa el daño dependiente de la extravasculación mediante la inhibición competitiva de la interacción entre los neutrófilos invasores y las células endoteliales del vaso sanguíneo u órgano. Los compuestos de la invención, particularmente las proteínas de fusión de ligando de P-selectina-AGP y proteínas de fusión de ligando de P-selectina-AGP-anticuerpo, también se pueden utilizar, como se describió anteriormente, para el tratamiento de choque séptico o septicemia. En adición, los anticuerpos o las proteínas de fusión de anticuerpos, de conformidad con la invención, se pueden utilizar en técnicas convencionales de terapias basadas en anticuerpos, o en diagnósticos en vivo, sacando ventaja de la especificidad del anticuerpo para los sitios terapéuticos o de diagnóstico objetivos. En un ejemplo particular, el dominio de ligando de P-selectina de una proteína de fusión de anticuerpos de conformidad con la invención, dirige esa proteína a una sitio de inflamación, y proporciona tanto una terapia (útil para bloquear las interacciones intracelulares perjudiciales mediadas por P-selectina) , como un diagnóstico (útil para dirigirse al sitio de la inflamación) . Nuevamente, se pueden utilizar determinantes de sialilo-Le unidos para enmascarar el dominio CH2 del anticuerpo, y bloquear los efectos indeseables de la fijación del complemento y la fijación del receptor Fc . Otras Formas de Realización Otras formas de realización están dentro del ámbito de las reivindicaciones. Por ejemplo, para el propósito de bloquear las interacciones entra las células o proteínas, se puede utilizar cualquier otra molécula portadora apropiada a la que se pueda unir un determinante de sialilo-Lex y un determinante sulfatado, en la invención. En general, se prefieren las proteínas debido a su vidas medias relativamente largas en suero. Una clase de proteínas portadoras son las proteínas de suero tales como albúmina (por ejemplo, albúmina de suero bovino o albúmina de suero humano) , transferrina, ó a-2-macroglobulina. Las proteínas portadoras pueden contener sitios de sulfatación y de adición de glucano endógenos en adición a los cuales se introducen sitios en la secuencia de ADN de la proteína portadora (como se describió anteriormente) mediante, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio. La molécula portadora, menos preferiblemente, puede ser un lípido. En un ejemplo, el lípido, con uno o más determinantes de sialilo-Lex y sulfatados unidos, se entrega como un liposoma a una pared celular objetivo (por ejemplo, una pared de células endotelial) . El liposoma puede bloquear una interacción de célula o proteína, o se puede utilizar para aplicar un fármaco a su sitio de acción apropiado. La producción de moléculas portadoras que llevan determinantes de sialilo-Lex y sulfatados, se puede realizar en una célula, de preferencia en una célula eucariótica diferente de levadura. Las células de mamífero, por ejemplo las líneas celulares de mamífero, proporcionan huéspedes particularmente adecuados. Estas células generalmente sintetizan las moléculas precursoras necesarias, y producen o se pueden diseñar para producir las enzimas responsables de la sulfatación y de la unión del carbohidrato. Para la unión de los determinantes de sialilo-Lex, son particularmente adecuadas las líneas celulares de mamífero tales como CHO y lecll. De una manera alternativa, cualquiera o ambos determinantes de sialilo-Lex y sulfatados se pueden unir a una molécula portadora in vi tro, es decir, extrace-lularmente . En un ejemplo, la a (1, 3) fucosiltransferasa se fijaría a un soporte sólido (por ejemplo, una columna) , y se pasaría una molécula portadora sulfatada sobre la enzima de fucosiltransferasa fijada, bajo condiciones que faciliten la unión de los grupos sialilo-Lex con sus sitios apropiados sobre la molécula portadora. La invención también abarca el uso de proteínas de fusión de anticuerpos-AGP modificadas por sialilo-Lex para la protección contra, la inhibición, o el tratamiento de un evento inductor de choque, las manifestaciones clínicas del choque, o ambos, que sean ocasionados por factores microbianos (por ejemplo, lipopolisacáridos (LPS) ) , toxinas microbianas (por ejemplo, enterotoxinas de choque tóxico) , mediadores huéspedes (por ejemplo, citocinas) , o terapias antitumorales (por ejemplo, administración de factor de necrosis tumoral (TNF) o interleuci-na-1 (IL-1) ) , o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, esta proteína de fusión de anticuerpos se puede administrar a un paciente humano para aliviar los efectos de choque séptico inducido por lipopolisacáridos microbianos. La capacidad de una proteína de fusión de anticuerpos para proteger contra, para tratar, o para inhibir los efectos del choque (por ejemplo, septicemia o síndrome de choque tóxico) se evalúa de conformidad con los métodos convencionales conocidos en la técnica (por ejemplo, aquellos descritos en Libert y colaboradores (1994) J". Exp. Med. 180: 1571-1575) . Todas las publicaciones, patentes, y solicitudes de patentes mencionadas en esta memoria descriptiva, se incorporan a la presente como referencia, hasta el mismo grado que si cada publicación, patente, y solicitud de patente individual se indicara de una manera específica e individual como incorporada como referencia.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: The General Hospital Corporation (ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: LIGANDOS DE P-SELECTINA Y MOLÉCULAS RELACIO-NADAS Y MÉTODOS (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 14 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: no relevante (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:l: Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 2 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: no relevante (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 2 : Met Ala Thr Asn Ser Leu Glu Thr Ser Thr Gly Thr Ser Gly Pro Pro 1 5 10 15 Val Thr (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 3 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 42 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: no relevante (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 3 : Gln Leu Trp Asp Thr Trp Ala Asp Glu Ala Glu Lys Ala Leu Gly Pro 1 5 10 15 Leu Leu Ala Arg Asp Arg Arg Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr Leu Asp 20 25 30 Tyr Asp Phe Leu Pro Glu Thr Glu Pro Pro 35 40 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: no relevante (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4: Arg Asp Arg Arg Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr Leu Asp Tyr Asp Phe 1 5 10 15 Leu Pro Glu Thr 20 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 5 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: no relevante (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 5 : Arg Asp Arg Arg Gln Ala Thr Glu Phe Glu Phe Leu Asp Phe Asp Phe 1 5 10 15 Leu Pro Glu Thr 20 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: no relevante (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 6 : Arg Asp Arg Arg Gln Ala Ala Glu Tyr Glu Tyr Leu Asp Tyr Asp Phe 1 5 10 15 Leu Pro Glu Ala 20 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 7 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: no relevante (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: Arg Asp Arg Arg Gln Ala Ala Glu Phe Glu Phe Leu Asp Phe Asp Phe 1 5 10 15 Leu Pro Glu Ala 20 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 8 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2287 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 8 : AAGCTTACCA CCATGGACTG GACCTGGAGG TTCCTCTTCT TTGTGGTGGC AGCAGCTACA 60 GGTGTCCAGT CCCAGGTGCA GCTGGTGCAG TCTGGGGCTG AGGTGAAGAA GCCTGGGTCC 120 TCGGTGAAGG TCTCCTGCAA GGCTTCTGGA GGCACCTTCA GCAGCTATGC TATCAGCTGG 180 GTGCGACAGG CCCCTGGACA AGGGCTTGAG TGGATGGGAG GGATCATCCC TATCTTTGGT 240 ACAGCAAACT ACGCACAGAA GTTCCAGGGC AGAGTCACGA TTACCGCGGA CGAATCCACG 300 AGCACAGCCT ACATGGAGCT GAGCAGCCTG AGATCTGAGG ACACGGCCGT GTATTACTGT 360 GCGAGAGATA ATGGAGCGTA TTGTAGTGGT GGTAGCTGCT ACTCGGGCTG GTTCGACCCC 420 TGGGGCCAGG GAACCCTGGT CACCGTCTCT TCAGGTGAGT ACTGAATTCT AGCTTTCTGG 480 GGCAGGCCAG GCCTGACCTT GGCTTTGGGG CAGGGAGGGG GCTAAGGTGA GGCAGGTGGC 540 GCCAGCAGGT GCACACCCAA TGCCCATGAG CCCAGACACT GGACGCTGAA CCTCGCGGAC 600 AGTTAAGAAC CCAGGGGCCT CTGCGCCTGG GCCCAGCTCT GTCCCACACC GCGGTCACAT 660 GGCACCACCT CTCTTGCAGC CTCCACCAAG GGCCCATCGG TCTTCCCCCT GGCACCCTCC 720 TCCAAGAGCA CCTCTGGGGG CACAGCGGCC CTGGGCTGCC TGGTCAAGGA CTACTTCCCC 780 GAACCGGTGA CGGTGTCGTG GAACTCAGGC GCCCTGACCA GCGGCGTGCA CACCTTCCCG 840 GCTGTCCTAC AGTCCTCAGG 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Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1894 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10: ATGGCGCTGT CCTGGGTTCT TACAGTCCTG AGCCTCCTAC CTCTGCTGGA AGCCCAGATC 60 CCATTGTGTG CCAACCTAGT ACCGGTGCCC ATCACCAACG CCACCCTGGA CCAGATCACT 120 GGCAAGTGGT TTTATATCGC ATCGGCCTTT CGAAACGAGG AGTACAATAA GTCGGTTCAG 180 GAGATCCAAG CAACCTTCTT TTACTTCACC CCCAACAAGA CAGAGGACAC GATCTTTCTC 240 AGAGAGTACC AGACCCGACA GGACCAGTGC ATCTATAACA CCACCTACCT GAATGTCCAG 300 CGGGAAAATG GGACCATCTC CAGATACGTG GGAGGCCAAG AGCATTTCGC TCACTTGCTG 360 ATCCTCAGGG ACACCAAGAC CTACATGCTT GCTTTTGACG TGAACGATGA GAAGAACTGG 420 GGGCTGTCTG TCTATGCTGA CAAGCCAGAG ACGACCAAGG AGCAACTGGG AGAGTTCTAC 480 GAAGCTCTCG ACTGCTTGCG CATTCCCAAG TCAGATGTCG TGTACACCGA TTGGAAAAAG 540 GATAAGTGTG AGCCACTGGA GAAGCAGCAC GAGAAGGAGA GGAAACAGGA GGAGGGGGAA 600 TCGGATCCCG AGGGTGAGTA CTAAGCTTCA GCGCTCCTGC CTGGACGCAT CCCGGCTATG 660 CAGCCCCAGT CCAGGGCAGC AAGGCAGGCC CCGTCTGCCT CTTCACCCGG AGCCTCTGCC 720 CGCCCCACTC ATGCTCAGGG AGAGGGTCTT CTGGCTTTTT CCCAGGCTCT GGGCAGGCAC 780 AGGCTAGGTG CCCCTAACCC AGGCCCTGCA CACAAAGGGG CAGGTGCTGG GCTCAGACCT 840 GCCAAGAGCC ATATCCGGGA GGACCCTGCC CCTGACCTAA GCCCACCCCA AAGGCCAAAC 900 TCTCCACTCC CTCAGCTCGG ACACCTTCTC TCCTCCCAGA TTCCAGTAAC TCCCAATCTT 960 CTCTCTGCAG AGCCCAAATC TTGTGACAAA ACTCACACAT GCCCACCGTG CCCAGGTAAG 1020 CCAGCCCAGG CCTCGCCCTC CAGCTCAAGG CGGGACAGGT GCCCTAGAGT AGCCTGCATC 1080 CAGGGACAGG CCCCAGCCGG GTGCTGACAC GTCCACCTCC ATCTCTTCCT CAGCACCTGA 1140 ACTCCTGGGG GGACCGTCAG TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT 1200 CTCCCGGACC CCTGAGGTCA CATGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCTGAGGT 1260 CAAGTTCAAC TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCGCGGGA 1320 GGAGCAGTAC AACAGCACGT ACCGGGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC ACCAGGACTG 1380 GCTGAATGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA GCCCTCCCAG CCCCCATCGA 1440 GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGTGGGAC CCGTGGGGTG CGAGGGCCAC ATGGACAGAG 1500 GCCGGCTCGG CCCACCCTCT GCCCTGAGAG TGACCGCTGT ACCAACCTCT GTCCTACAGG 1560 GCAGCCCCGA GAACCACAGG TGTACACCCT GCCCCCATCC CGGGATGAGC TGACCAAGAA 1620 CCAGGTCAGC CTGACCTGCC TGGTCAAAGG CTTCTATCCC AGCGACATCG CCGTGGAGTG 1680 GGAGAGCAAT GGGCAGCCGG AGAACAACTA CAAGACCACG CCTCCCGTGC TGGACTCCGA 1740 CGGCTCCTTC TTCCTCTACA GCAAGCTCAC CGTGGACAAG AGCAGGTGGC AGCAGGGGAA 1800 CGTCTTCTCA TGCTCCGTGA TGCATGAGGC TCTGCACAAC CACTACACGC AGAAGAGCCT 1860 CTCCCTGTCT CCGGGTAAAT GAGTGCGACG GCCG 1894 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 437 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: no relevante (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11: Met Ala Leu Ser Trp Val Leu Thr Val Leu Ser Leu Leu Pro Leu Leu 1 5 10 15 Glu Ala Gln He Pro Leu Cys Ala Asn Leu Val Pro Val Pro He Thr 20 25 30 Asn Ala Thr Leu Asp Gln He Thr Gly Lys Trp Phe Tyr He Ala Ser 35 40 45 Ala Phe Arg Asn Glu Glu Tyr Asn Lys Ser Val Gln Glu He Gln Ala 50 55 60 Thr Phe Phe Tyr Phe Thr Pro Asn Lys Thr Glu Asp Thr He Phe Leu 65 70 75 80 Arg Glu Tyr Gln Thr Arg Gln Asp Gln Cys He Tyr Asn Thr Thr Tyr 85 90 95 Leu Asn Val Gln Arg Glu Asn Gly Thr He Ser Arg Tyr Val Gly Gly 100 105 110 Gln Glu His Phe Ala His Leu Leu He Leu Arg Asp Thr Lys Thr Tyr 115 120 125 Met Leu Ala Phe Asp Val Asn Asp Glu Lys Asn Trp Gly Leu Ser Val 130 135 140 Tyr Ala Asp Lys Pro Glu Thr Thr Lys Glu Gln Leu Gly Glu Phe Tyr 145 150 155 160 Glu Ala Leu Asp Cys Leu Arg He Pro Lys Ser Asp Val Val Tyr Thr 165 170 175 Asp Trp Lys Lys Asp Lys Cys Glu Pro Leu Glu Lys Gln His Glu Lys 180 185 190 Glu Arg Lys Gln Glu Glu Gly Glu Ser Asp Pro Glu Gly Glu Pro Lys 195 200 205 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 210 215 220 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 225 230 235 240 Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 245 250 255 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 260 265 270 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 275 280 285 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 290 295 300 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 305 310 315 320 Pro He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 325 330 335 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 340 345 350 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala 355 360 365 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 370 375 380 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 385 390 395 400 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 405 410 415 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 420 425 430 Leu Ser Pro Gly Lys 435 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 442 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: no relevante (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12: Lys Leu Thr Thr Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe Phe Val Val 1 5 10 15 Ala Ala Ala Thr Gly Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly 20 25 30 Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala 35 40 45 Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala He Ser Trp Val Arg Gln Ala 50 55 60 Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly He He Pro He Phe Gly 65 70 75 80 Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr He Thr Ala 85 90 95 Asp Glu Ser Thr Ala Arg Asp Asn Gly Ala Tyr Cys Ser Gly Gly Ser 100 105 110 Cys Tyr Ser Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 115 120 125 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 130 135 140 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 145 150 155 160 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 165 170 175 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 180 185 190 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Asp Lys 195 200 205 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Asn Phe Ser Trp 260 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Asn Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Asn Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Asn Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Asn He Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 340 345 350 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 42 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: no relevante (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13: Pro Glu Met Leu Arg Asn Ser Thr Asp Thr Thr Pro Leu Thr Gly 1 5 10 15 Pro Gly Thr Pro Glu Ser Thr Thr Val Glu Pro Ala Ala Arg Arg Ser 20 25 30 Thr Gly Leu Asp Ala Gly Gly Ala Val Thr Glu 35 40 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 14 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: no relevante (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14: Leu Thr Thr Glu Leu Ala Asn Met Gly Asn Leu Ser Thr Asp Ser Ala 1 5 10 15

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES 1. Una molécula orgánica a la cual está enlazado covalentemente un determinante sialilo-Lex y un determinante sulfatado, al menos uno de estos determinantes estando colocado en un sitio que no ocurre naturalmente en dicha molécula.
2. 2. La molécula orgánica de la reivindicación 1, donde dicha molécula contiene múltiples determinantes sialilo-Lex o múltiples determinantes sulfatados.
3. 3. La molécula orgánica de la reivindicación 1, donde dicha molécula es soluble.
4. 4. La molécula orgánica de la reivindicación 1, donde dicha molécula comprende un ligando de P-selectina que consiste esencialmente en los aminoácidos 21-57 de la figura 8A, o una porción de éste que sea capaz de mediar una interacción con el receptor de P-selectina.
5. 5. La molécula orgánica de la reivindicación 4, donde dicha molécula comprende un ligando de P-selectina que consiste esencialmente en los aminoácidos 38-57 de la figura 8A.
6. 6. La molécula orgánica de las reivindicaciones 1 o 4, donde dicha molécula comprende alfa1-ácido glicoproteína (AGP) .
7. 7. La molécula orgánica de las reivindicaciones 1 o 4, donde dicha molécula comprende una molécula de anti-cuerpo.
8. 8. Un ácido nucleico purificado que codifica cualquiera de las moléculas orgánicas de las reivindicaciones 4-7.
9. 9. El ácido nucleico purificado de la reivindicación 8, donde dicho ácido nucleico codifica ya sea (a) la alfai-ácido glicoproteína (AGP) o (b) una molécula de anticuerpo.
10. 10. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 8.
11. 11. Una célula que comprende el ácido nucleico purificado de la reivindicación 8.
12. 12. Un método de inhibir la ligadura de una célula portadora de una proteína P-selectina a una molécula o célula portadora de un determinante de sialilo-Lex y un determinante sulfatado, dicho método comprendiendo poner en contacto dicha célula portadora de la proteína P-selectina con una molécula orgánica de la reivindicación 1.
13. 13. El método de la reivindicación 12, donde dicha molécula orgánica también inhibe la ligadura de una célula portadora de una proteína E-selectina a una molécula o célula portadora de un determinante de sialilo-Lex.
14. 14. Un método de reducir la inflamación en un mamífero, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de una molécula orgánica de la reivindicación 1.
15. 15. Un método para reducir o proteger un mamífero contra una reacción adversa dependiente de la extravasación, dicho método comprendiendo administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de una molécula orgánica de la reivindicación 1.
16. 16. El método de la reivindicación 15, donde dicha reacción adversa dependiente de la extravasación es daño a un órgano o coagulación dependiente de la extravasación asociado con el síndrome de la enfermedad respiratoria de adultos, nefritis glomerular, o lesión isquémica del miocardio.
17. 17. Un método para reducir o proteger un mamífero contra una reacción inmune adversa, dicho método comprendiendo administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de una molécula orgánica de la reivindicación 1.
18. 18. El método de la reivindicación 17, donde dicha reacción inmune adversa es inducida por un factor microbiano o un factor del anfitrión.
19. 19. El método de la reivindicación 17, donde dicha reacción inmune adversa es choque séptico o septicemia.