ES2362695T3

ES2362695T3 - Nueva proteína del ligando de la p-selectina.

Info

Publication number: ES2362695T3
Application number: ES03025430T
Authority: ES
Inventors: Glenn R. Larsen; Dianne S. Sako; Xiao-Jia Chang; Geertruida M. Veldman
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 1992-10-23
Filing date: 1993-10-22
Publication date: 2011-07-11
Anticipated expiration: 2013-10-22

Abstract

Un fragmento de proteína ligando de P-selectina que tiene actividad de ligando de P-selectina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: a) del aminoácido 21 al aminoácido 54 de la SEC ID Nº: 1 b) del aminoácido 55 al aminoácido 127 de la SEC ID Nº: 1 c) del aminoácido 128 al aminoácido 267 de la SEC ID Nº: 1 d) del aminoácido 268 al aminoácido 308 de la SEC ID Nº: 1 e) del aminoácido 309 al aminoácido 333 de la SEC ID Nº: 1 f) del aminoácido 334 al aminoácido 402 de la SEC ID Nº: 1 g) del aminoácido 43 al aminoácido 56 de la SEC ID Nº: 1 h) del aminoácido 1 al aminoácido 310 de la SEC ID Nº: 1

Description

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ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo de sustancias antiinflamatorias que actúan inhibiendo la adhesión de leucocitos a células endoteliales. Más particularmente, la presente invención se refiere a un nuevo ligando para la proteína de adhesión de mamíferos conocida como “P-selectina”.

Durante la inflamación, los leucocitos se adhieren al endotelio vascular y entran en el tejido subendotelial, una interacción que está mediada por una unión específica de la selectina o de la clase LEC-CAM de proteínas a ligandos en células diana. Dicha adhesión celular mediada por selectina también se produce en trastornos trombóticos y enfermedades parasitarias, y puede estar implicada en la propagación metastásica de células tumorales.

Las proteínas selectinas se caracterizan por un dominio tipo lectina N-terminal, un dominio tipo factor de crecimiento epidérmico y regiones de homología con proteínas de unión complementarias. Hasta ahora se han identificado tres proteínas selectina humanas, E-selectina (antiguamente ELAM-1), L-selectina (antiguamente LAM-1) y P-selectina (antiguamente PADGEM o GMP-140). La E-selectina se induce en células endoteliales varias horas después de la activación por citocinas, mediando la interacción dependiente de calcio entre neutrófilos y el endotelio. La L-selectina es el receptor de direccionamiento (homing) de linfocitos y la P-selectina aparece rápidamente en la superficie celular de las plaquetas cuando se activan, mediando la adhesión dependiente de calcio de neutrófilos o monocitos a plaquetas. La P-selectina también se encuentra en los cuerpos de Weibel-Palade de células endoteliales; tras su liberación de estas vesículas la P-selectina media la unión tempana de neutrófilos al endotelio estimulado con histamina o trombina.

Se cree que las selectinas median la adhesión a través de interacciones específicas con ligandos presentes en la superficie de células diana. Generalmente, los ligandos de selectinas están compuestos al menos en parte por un resto carbohidrato. Por ejemplo, la E-selectina se une a carbohidratos que tienen la estructura terminal

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y también a carbohidratos que tienen la estructura terminal

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donde R es el resto de la cadena de carbohidrato. Estos carbohidratos son antígenos de grupo sanguíneo conocidos y se denominan comúnmente Lewisx sialilado y Lewisa sialilado, respectivamente. La presencia del antígeno Lewisx sialilado solo en la superficie de una célula endotelial puede ser suficiente para promover la unión a una célula que exprese E-selectina. La E-selectina también se une a carbohidratos que tienen las estructuras terminales

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Como con la E-selectina, cada selectina parece unirse a una variedad de carbohidratos con afinidades variables. La intensidad del acontecimiento adhesivo mediado por selectina (afinidad de unión) también puede depender de la densidad del carbohidrato y de la densidad de la selectina en la superficie celular.

La P-selectina se une a carbohidratos que contienen la forma no sialilada del antígeno de grupo sanguíneo Lewisx y con mayor afinidad a Lewisx sialilado. La P-selectina también puede reconocer sulfatidas, que son galactosil ceramidas 3sulfatadas heterogéneas, aisladas de células mieloides y tumorales por extracción de lípidos. Sin embargo, la unión de células que llevan P-selectina a células que llevan ligandos de P-selectina se suprime cuando las células que llevan ligandos se tratan con proteasas, indicando que el ligando de P-selectina puede ser una glicoproteína.

Se han identificado recientemente dos supuestos ligandos de glicoproteína para la P-selectina, uno de los cuales se ha purificado parcialmente, (Moore et al., J. Cell Biol. 118, 445-456 (1992)). Sin embargo, no se describe la composición de aminoácidos ni la secuencia aminoácidos de estas glicoproteínas.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una proteína ligando de P-selectina que es un fragmento de la proteína ligando de P-selectina que tiene actividad de ligando de P-selectina, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

a) del aminoácido 21 al aminoácido 54 de la SEC ID Nº: 1; b) del aminoácido 55 al aminoácido 127 de la SEC ID Nº: 1;

c) del aminoácido 128 al aminoácido 267 de la SEC ID Nº: 1;

d) del aminoácido 268 al aminoácido 308 de la SEC ID Nº: 1;

e) del aminoácido 309 al aminoácido 333 de la SEC ID Nº: 1;

f) del aminoácido 334 al aminoácido 402 de la SEC ID Nº: 1;

g) del aminoácido 43 al aminoácido 56 de la SEC ID Nº: 1;

h) del aminoácido 1 al aminoácido 310 de la SEC ID Nº: 1.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica uno de los fragmentos de ligando de P-selectina de la invención.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo que reacciona específicamente con un ligando de P-selectina, en el que la secuencia de la proteína ligando de P-selectina consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

a) del aminoácido 42 al aminoácido 56 de la SEC ID Nº: 1; y

b) del aminoácido 127 al aminoácido 138 de la SEC ID Nº: 1.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un plásmido que codifica un ligando de P-selectina que comprende una secuencia de acuerdo con la SEC ID Nº: 1.

En un quinto aspecto, la presente invención se refiere al uso de un anticuerpo de la invención que reacciona específicamente con la proteína ligando de P-selectina para la preparación de una composición farmacéutica para tratar una afección caracterizada por una adhesión mediada por P-selectina.

Asimismo, la presente invención se refiere a un anticuerpo de la invención que reacciona específicamente con una proteína ligando de P-selectina para su uso para el tratamiento o diagnóstico de enfermedades inflamatorias o cáncer.

En un sexto aspecto, la presente invención se refiere al uso de un anticuerpo de la invención que reacciona específicamente con una proteína ligando de P-selectina para la preparación de una composición farmacéutica para tratar o diagnosticar enfermedades inflamatorias o cáncer.

En un séptimo aspecto, la presente invención se refiere a una proteína de fusión que comprende:

a) una primera secuencia de aminoácidos seleccionada de: del aminoácido 21 al aminoácido 54 de la SEC ID Nº: 1; del aminoácido 55 al aminoácido 127 de la SEC ID Nº: 1; del aminoácido 128 al aminoácido 267 de la SEC ID Nº: 1; del aminoácido 268 al aminoácido 308 de la SEC ID Nº: 1; del aminoácido 309 al aminoácido 333 de la SEC ID Nº: 1; del aminoácido 334 al aminoácido 402 de la SEC ID Nº: 1; del aminoácido 43 al aminoácido 56 de la SEC ID Nº: 1; y del aminoácido 42 al aminoácido 295 de la SEC ID Nº: 1; y

b) una segunda secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de una porción Fc de una inmunoglobulina.

En un octavo aspecto, la presente invención se refiere a un ADN que codifica la proteína de fusión de la invención.

En un noveno aspecto, la presente invención se refiere al plásmido que comprende un ADN que codifica una proteína de fusión soluble del ligando de P-selectina-Fc.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los presentes inventores han identificado y aislado por primera vez un nuevo ácido nucleico y que comprende una secuencia que codifica una proteína que actúa como ligando para P-selectina en células endoteliales humanas y plaquetas. La secuencia de aminoácidos completa de la proteína ligando de P-selectina (es decir, el péptido maduro más la secuencia líder) se caracteriza por la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 1 del aminoácido 1 al aminoácido 402. El análisis de hidrofobicidad y la comparación con patrones de escisión conocidos predicen una secuencia señal de 20 a 22 aminoácidos, es decir, aminoácidos 1 a 20 o aminoácidos 1 a 22 de la SEC ID Nº: 1. La proteína ligando de P-selectina contiene un sitio de escisión PACE (enzima conversora de aminoácidos básicos emparejados) (-Arg-Asp-Arg-Arg-) en los aminoácidos 38-41 de la SEC ID Nº: 1. La proteína ligando de P-selectina madura está caracterizada por la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 1 del aminoácido 42 al aminoácido 402. Una forma soluble de la proteína ligando de P-selectina se caracteriza por contener los aminoácidos 21 a 310 de la SEC ID Nº: 1. Otra forma soluble de la proteína ligando de P-selectina madura está caracterizada por la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 1 del aminoácido 42 al aminoácido 310. La forma soluble de la proteína ligando de P-selectina se caracteriza adicionalmente por ser soluble en solución acuosa a temperatura ambiente. Por supuesto, las secuencias de ADN correspondientes como se expone en la SEC ID Nº: 1 que codifican estas proteínas se incluyen también en la presente invención.

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El ligando de P-selectina de la invención es una glicoproteína que puede contener uno o más de los carbohidratos terminales siguientes:

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donde R= el resto de la cadena de carbohidrato, que está unida covalentemente directamente a la proteína ligando de P-selectina o a un resto lipídico que está unido covalentemente a la proteína ligando de P-selectina. La glicoproteína ligando de P-selectina de la invención puede estar además sulfatada o modificada postraduccionalmente de otro modo. Como se expresa en células COS y CHO, la proteína ligando de P-selectina de longitud completa (aminoácidos 1 a 402 de la SEC ID Nº: 1 o aminoácidos 42 a 402 de la SEC ID Nº: 1) es una proteína homodimérica que tiene un peso molecular aparente de 222 kD, como se muestra por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS no reductor.

Son tres regiones de la proteína ligando de P-selectina de la SEC ID Nº: 1: un dominio extracelular (de aproximadamente el aminoácido 21 al 310 de la SEC ID Nº: 1), un dominio transmembrana (de aproximadamente el aminoácido 311 a 332 de la SEC ID Nº: 1) y un dominio citoplasmático intracelular (de aproximadamente el aminoácido 333 a 402 de la SEC ID Nº: 1). El dominio extracelular contiene tres sitios tripeptídicos de consenso (Asn-X-Ser/Thr) de glicosilación ligada a N potencial que comienza en los restos Asn 65, 111 y 292. El dominio extracelular contiene además tres sitios potenciales de sulfatación de tirosina en los restos 46, 48 y 51. La región comprendida por los restos 55-267 contiene un alto porcentaje de prolina, serina y treonina, incluyendo un subdominio de 15 repeticiones decaméricas de la secuencia de consenso de diez aminoácidos Ala-Thr/Met-Glu-Ala-Gln-Thr-Thr-X-Pro/Leu-Ala/Thr, en la que X puede ser Pro, Ala, Gln, Glu o Arg. Regiones tales como estas son características de proteínas altamente Oglicosiladas.

Las células COS o CHO cotransfectadas con un gen que codifica la proteína ligando de P-selectina y un gen que codifica una (1,3/1,4)fucosiltransferasa (en lo sucesivo 3/4FT) son capaces de unirse a células CHO que expresan Pselectina en su superficie, pero no son capaces de unirse a células CHO que no expresan P-selectina en su superficie. Para unirse a P-selectina, en forma purificada o expresada en la superficie de células CHO, el gen que codifica la proteína ligando de P-selectina debe de cotransfectarse con el gen que codifica una 3/4FT, puesto que la transfección de cualquier gen en ausencia del otro suprime o reduce sustancialmente la actividad de unión de la P-selectina. La unión de la proteína ligando de P-selectina de la invención a P-selectina puede inhibirse por EDTA o por un anticuerpo monoclonal neutralizante específico para P-selectina. La unión de la proteína ligando de P-selectina de la invención a Pselectina no se inhibe por un anticuerpo monoclonal no neutralizante específico para P-selectina o por un control de isotipo. Estos resultados caracterizan la especificidad de unión de la proteína ligando de P-selectina de la invención.

Para los fines de la presente invención, se define que una proteína tiene “actividad de proteína ligando de P-selectina”, es decir, se denomina de forma variable en la presente memoria “proteína ligando de P-selectina” o como “glicoproteína ligando de P-selectina” o simplemente como “ligando de P-selectina” cuando se une de una forma dependiente de calcio a P-selectina que está presente en la superficie de células como en el ensayo de unión de CHO-P-selectina del Ejemplo 4, o a P-selectina que está fijada a otra superficie, por ejemplo, como la proteína quimérica P-selectina-IgG1 del Ejemplo 4 está fijada a placas de Petri.

El estado de glicosilación de la proteína ligando de P-selectina de la invención se estudió usando una forma quimérica soluble de la proteína ligando de P-selectina descrita en detalle en el Ejemplo 5(C) y denominada sPSL.T7. La proteína sPSL.T7 producida a partir de células COS cotransfectadas con 3/4FT está modificada considerablemente por glicosilación postraduccional, como se describe en detalle en el Ejemplo 6(C). Por lo tanto, se cree que las cadenas de oligosacáridos tanto ligadas a N como ligadas a O, al menos algunas de las cuales están sialiladas, están presentes en la proteína ligando de P-selectina de la invención.

La proteína ligando de P-selectina de la invención también puede unirse a E-selectina. El medio acondicionado de células COS que se han cotransfectado con el ADN que codifica sPSL.T7 y con el ADN que codifica la 3/4FT, cuando se usa para recubrir pocillos de placas de microtitulación de plástico, causa que las células CHO que expresan E-selectina se unan a las placas; sin embargo, las células CHO que no expresan E-selectina no se unen a dichas placas. La unión de células CHO que expresan E-selectina a placas de microtitulación recubiertas con medio acondicionado de células COS que se han cotransfectado con el ADN que codifica sPSL.T7 y con el ADN que codifica 3/4FT se suprime en presencia de EDTA o de un anticuerpo neutralizante específico para E-selectina. El medio acondicionado de células COS transfectadas solamente con el ADN de sPSL.T7 no causa la unión de células COS que expresan E-selectina cuando se recubre sobre pocillos de placas de microtitulación. Por estas razones, se cree que la proteína ligando de Pselectina de la invención es útil como inhibidor de la adhesión intercelular mediada por E-selectina además de la adhesión intercelular mediada por P-selectina.

Los fragmentos de la proteína ligando de P-selectina que son capaces de interaccionar con P-selectina o que son capaces de inhibir la adhesión intercelular mediada por P-selectina son el objeto de la presente invención. Dichos fragmentos comprenden los aminoácidos 21 a 54 de la SEC ID Nº: 1, una región de la proteína ligando de P-selectina que tiene una baja frecuencia de restos serina y treonina; los aminoácidos 55 a 127 de la SEC ID Nº: 1, que tienen una alta frecuencia de prolina, serina y treonina además de las dos secuencias de consenso para glicosilación ligada a asparagina (Asn-X-Ser/Thr); otro fragmento de mayor tamaño, los aminoácidos 128 a 267 de la SEC ID Nº: 1, que tanto tienen una alta frecuencia de prolina, serina y treonina como contienen quince repeticiones de la secuencia de consenso de diez aminoácidos siguiente: Ala-(Thr/Met)-Glu-Ala-GIn-Thr-Thr-(Pro/Arg/Gln/Ala/Glu)-(Leu/Pro)-(Ala/Thr) (fragmentos de menor tamaño dentro de este fragmento de gran tamaño también pueden conservar la capacidad de interaccionar con P-selectina o actuar como inhibidores de la adhesión intercelular mediada por P-selectina); la región que contiene una secuencia de consenso para glicosilación ligada a asparagina y que comprende los aminoácidos 268 a 308 de la SEC ID Nº: 1; la región hidrófoba de la proteína representada por los aminoácidos 309 a 333 de la SEC ID Nº: 1; la región anfífila de la proteína ligando de P-selectina de los aminoácidos 334 a 402. Los fragmentos adicionales pueden comprender del aminoácido 43 al aminoácido 56 de la SEC ID Nº: 1, con una o más tirosinas sulfatadas en el aminoácido 46, aminoácido 48 y/o aminoácido 51. Los fragmentos de la proteína ligando de P-selectina pueden estar en forma lineal o pueden ciclarse usando métodos conocidos, por ejemplo, como se describe en H. U. Saragovi, et al., Bio/Technology 10, 773-778 (1992) y en R. S. McDowell, et al., J. Amer. Chem. Soc. 114. 9245-9253 (1992). Para los fines de la presente invención, todas las referencias a “proteína ligando de P-selectina” en la presente memoria incluyen fragmentos capaces de unirse a P-selectina. Estos fragmentos son el objeto de la invención.

Dichos fragmentos pueden fusionarse con moléculas transportadoras tales como inmunoglobulinas, para aumentar la valencia de ligando de P-selectina de sitios de unión. Por ejemplo, formas solubles de la proteína ligando de P-selectina tales como el fragmento del aminoácido 42 al aminoácido 295 de la SEC ID Nº: 1 pueden fusionarse a través de secuencias “enlazadoras” con la porción Fc de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la proteína ligando de P-selectina, una fusión de este tipo podría ser con la porción Fc de una molécula de IgG como en el Ejemplo 5(D) y en la SEC ID Nº: 6. También pueden usarse otros isotipos de inmunoglobulina para generar dichas fusiones. Por ejemplo, una fusión de proteína ligando de P-selectina-IgM generaría una forma decavalente de la proteína ligando de Pselectina de la invención.

Como se detalla en los Ejemplos a continuación, la proteína ligando de P-selectina se obtuvo inicialmente usando una estrategia de clonación y expresión (Clark et al. U.S. 4.675.285). Se construyó una genoteca de ADNc a partir de la línea celular promielocítica humana HL60 (S. J. Collins, et al., Nature 270, 347-349 (1977), ATCC Nº CCL 240). Esta genoteca se cotransfectó en células COS con un ADN que codifica una 3/4FT y los cotransfectantes se exploraron para determinar su unión a una molécula quimérica que consistía en la porción extracelular de P-selectina y la porción Fc de un anticuerpo monoclonal IgG1 humano. Los cotransfectantes que se unían a la P-selectina quimérica se enriquecieron para ADNc que codifican la proteína ligando de P-selectina. Este procedimiento de exploración se repitió varias veces para enriquecer la población de plásmidos adicionalmente para ADNc que codifican la proteína ligando de P-selectina. En una segunda fase de clonación, la población de plásmidos enriquecida se cotransfectó de nuevo en células COS con el gen de 3/4FT y se exploró para determinar su unión a una línea celular CHO marcada fluorescentemente que expresaba P-selectina en la superficie celular. Se obtuvo un solo clon de ADNc a partir de esta estrategia y se denominó pMT21:PL85. El plásmido pMT21:PL85 se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipo el 16 de octubre de 1992 y se le dio el número de acceso ATCC 69096.

Se expone un nuevo ADN en la SEC ID Nº: 1. Este ADN puede codificar una diversidad de formas de la proteína ligando de P-selectina. Por ejemplo, codifica la proteína ligando de P-selectina completa, que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 1 del aminoácido 1 al aminoácido 402. En otra realización, codifica una forma de la proteína ligando de P-selectina que carece de la secuencia señal que está caracterizada por la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 1 del aminoácido 21 al aminoácido 402. También codifica la proteína ligando de P-selectina madura caracterizada por la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 1 del aminoácido 42 al aminoácido

402. Este ADN también se incorpora en una secuencia de ADN que codifica una forma soluble de la proteína ligando de P-selectina madura, estando dicha proteína caracterizada por la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 1 del aminoácido 42 al aminoácido 310. Este ADN se incorpora además en una secuencia de ADN que codifica una forma soluble de la proteína ligando de P-selectina que carece de la secuencia señal, estando dicha proteína caracterizada por la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 1 del aminoácido 21 al aminoácido 310. En una realización, la presente invención codifica una forma soluble de la proteína ligando de P-selectina caracterizada por la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 1 del aminoácido 1 al aminoácido 310. El ADN de la presente invención está libre de asociaciones con otros ADN humanos y, por lo tanto, se caracteriza como un ADN aislado. Como se ha detallado anteriormente, los ADN que codifican fragmentos de ligando de P-selectina que interacción con P-selectina son el objeto de la presente invención.

La expresión de los transcritos de ARNm de proteína ligando de P-selectina se ha observado en una diversidad de líneas celulares humanas (HL-60, THP-1, U937) y en monocitos y leucocitos polimorfonucleares humanos por análisis de Northern usando una sonda de ADNc de proteína ligando de P-selectina. En todas estas líneas celulares, se observó un transcrito principal de 2,5 kb. Se observó una especie minoritaria de aproximadamente 4 kb en las líneas celulares HL60 y U937 y en leucocitos polimorfonucleares. Por el contrario, no se detectó expresión de ARNm de ligando de Pselectina en la línea celular de hepatoblastoma humano HepG2.

La proteína ligando de P-selectina mencionada en la presente memoria está codificada por un gen de una sola copia y no es parte de una familia de múltiples genes, según se determinó por análisis de transferencia de Southern. La forma genómica de la proteína ligando de P-selectina contiene un intrón grande de aproximadamente 9 kb localizado en el nucleótido 54 en la región no traducida 5’. En monocitos y leucocitos polimorfonucleares, la proteína ligando de Pselectina está codificada por la secuencia de ADN expuesta en la SEC ID Nº: 3 y contiene dieciséis regiones de repetición.

Para los fines de la presente invención, todas las referencias en la presente memoria al “ADN de SEC ID Nº: 1” incluyen, además de la secuencia de ADN específica expuesta en la SEC ID Nº: 1, secuencias de ADN que codifican la proteína ligando de P-selectina madura de la SEC ID Nº: 1; secuencias de ADN que codifican fragmentos de la proteína ligando de P-selectina de la SEC ID Nº: 1 que son capaces de unirse a P-selectina; secuencias de ADN que codifican formas solubles de la proteína ligando de P-selectina de SEC ID Nº: 1; variaciones alélicas de la secuencia de ADN de SEC ID Nº: 1; ADN que hibridan con la secuencia de ADN de SEC ID Nº: 1 y que codifican proteínas que tienen actividad de proteína ligando de P-selectina; ADN que difieren del ADN de la SEC ID Nº: 1 en virtud de la degeneración del código genético; y las variaciones de la secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 1 expuestas anteriormente. De forma similar, todas las referencias al “ADN de SEC ID Nº: 3” incluyen además de la secuencia de ADN específica expuesta en la SEC ID Nº: 3 secuencias de ADN que codifican la proteína ligando de P-selectina madura de la SEC ID Nº: 3; secuencias de ADN que codifican fragmentos de la proteína ligando de P-selectina de SEC ID Nº: 3 que son capaces de unirse a Pselectina; secuencias de ADN que codifican formas solubles de la proteína ligando de P-selectina de SEC ID Nº: 3; variaciones alélicas de la secuencia de ADN de SEC ID Nº: 3; ADN que hibridan con la secuencia de ADN de SEC ID Nº: 3 y que codifican proteínas que tienen actividad de proteína ligando de P-selectina; ADN que difieren del ADN de la SEC ID Nº: 3 en virtud de la degeneración del código genético; y las variaciones de la secuencia de ADN de SEC ID Nº: 3 expuestas anteriormente.

Un ADN que codifica una forma soluble de la proteína ligando de P-selectina puede prepararse por expresión de un ADN modificado en el que se delecionan las regiones que codifican los dominios citoplasmáticos y transmembrana de la proteína ligando de P-selectina y/o se introduce un codón de terminación 3’ al codón para el aminoácido en el extremo carboxi-terminal del dominio extracelular. Por ejemplo, el análisis de hidrofobicidad predice que la proteína ligando de Pselectina expuesta en la SEC ID Nº: 1 tiene un dominio transmembrana compuesto por los aminoácidos 311 a 332 de la SEC ID Nº: 1 y un dominio citoplasmático compuesto por los aminoácidos 333 a 402 de la SEC ID Nº: 1. Puede generarse un ADN modificado como se ha descrito anteriormente por técnicas de biología molecular convencionales, incluyendo métodos de mutagénesis dirigida que se conocen en la técnica o por la reacción en cadena de la polimerasa, usando cebadores oligonucleotídicos apropiados. Los métodos para producir varios ADN que codifican diversas proteínas ligando de P-selectina solubles se exponen en el Ejemplo 5.

El ADN aislado descrito en la presente memoria puede unirse operativamente a una secuencia de control de la expresión, tal como los vectores de expresión pMT2 o pED descritos en Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19, 44854490 (1991), para producir el ligando de P-selectina de forma recombinante. Se conocen en la técnica muchas secuencias de control de la expresión adecuadas. También se conocen métodos generales de expresión de proteínas recombinantes y se ejemplifican en R. Kaufman, Methods in Enzymology 185, 537-566 (1990). Como se define en la presente memoria, la expresión “unido operativamente” significa enzimáticamente o químicamente ligado para formar un enlace covalente entre el ADN aislado de la invención y la secuencia de control de la expresión, de tal modo que la proteína ligando de P-selectina se expresa por una célula hospedadora que se ha transformado (transfectado) con el ADN/secuencia de control de la expresión ligados.

Se conocen varias enzimas endoproteolíticas que escinden péptidos precursores en el lado carboxilo de secuencias de aminoácidos emparejados (por ejemplo, -Lys-Arg- y -Arg-Arg-) para dar proteínas maduras. Dichas enzimas se conocen generalmente como enzimas conversoras de aminoácidos básicos emparejados o PACE, y su uso en la producción recombinante de péptidos maduros se describe ampliamente en el documento WO 92/09698 y en la solicitud U.S. de Nº de Serie 07/885.972. Se sabe que la familia de enzimas PACE aumenta la eficacia del procesamiento proteolítico de polipéptidos precursores en células hospedadoras recombinantes. Como se ha mencionado anteriormente, los fragmentos de la proteína ligando de P-selectina de la invención contienen dicho sitio de escisión de PACE.

La proteína ligando de P-selectina madura de la presente invención puede generarse por una célula hospedadora que contiene una secuencia de ADN que codifica cualquier proteína ligando de P-selectina soluble como se describe en la presente memoria y una secuencia de ADN que codifica PACE, como se describe en el documento WO 92/09698 y en la solicitud U.S. de Nº Serie 07/885.972, o usando la secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 5. Dicha célula hospedadora puede contener los ADN como resultado de la cotransformación o transformación secuencial de vectores de expresión separados que contienen el ADN de proteína ligando de P-selectina soluble y el ADN de PACE, respectivamente. Un tercer ADN que codifica una 3/4FT también puede cotransformarse con los ADN que codifican la proteína ligando de Pselectina y PACE. Como alternativa, la célula hospedadora puede contener los ADN como resultado de la transformación de un solo vector de expresión que contiene tanto ADN de proteína ligando de P-selectina soluble como ADN de PACE. La construcción de dichos vectores de expresión se incluye en el nivel de especialidad en biología molecular. También se conocen métodos para cotransformación y transformación.

Se conocen muchas secuencias de ADN que codifican PACE. Por ejemplo, se describe un ADN que codifica una forma de PACE, conocida como furina, en A. M. W. van den Ouweland et al., Nucl. Acids Res. 18, 664 (1990). Se expone un ADNc que codifica una forma soluble de PACE, conocida como PACESOL en la SEC ID Nº: 5. También existen ADN que codifican otras formas de PACE y cualquiera de dichos ADN que codifican PACE puede usarse para producir la proteína ligando de P-selectina madura soluble de la invención, siempre que el PACE sea capaz de escindir la proteína ligando de P-selectina en los aminoácidos 38-41. Preferentemente, se usa un ADN que codifica una forma soluble de PACE para producir la proteína ligando de P-selectina madura soluble de la presente invención.

Los ADN que codifican una forma soluble de la proteína ligando de P-selectina y PACE, por separado o en conjunto, pueden unirse operativamente a una secuencia de control de la expresión tal como las contenidas en los vectores de expresión pMT2 o pED analizados anteriormente, para producir el ligando de P-selectina soluble escindido por PACE de forma recombinante. Se conocen en la técnica secuencias de control de la expresión adecuadas adicionales. Los ejemplos 3(C) y 3(D) a continuación exponen métodos para producir la proteína ligando de P-selectina madura soluble de la invención.

Varios tipos de células pueden actuar como células hospedadoras adecuadas para la expresión de la proteína ligando de P-selectina. Las células hospedadoras adecuadas son capaces de unirse a cadenas laterales de carbohidratos características de proteína ligando de P-selectina funcional. Dicha capacidad puede surgir en virtud de la presencia de una enzima de glicosilación adecuada dentro de la célula hospedadora, ya sea de origen natural, inducida por mutagénesis química o por transfección de la célula hospedadora con un plásmido de expresión adecuado que contiene una secuencia de ADN que codifica la enzima de glicosilación. Las células hospedadoras incluyen, por ejemplo, células COS de mono, células de ovario de hámster chino (CHO), células 293 de riñón humano, células A431 epidérmicas humanas, células Colo205 humanas, células 3T3, células CV-1, otras líneas celulares de primate transformadas, células diploides normales, cepas de células obtenidas de cultivo in vitro de tejido primario, explantes primarios, células HELA, células L de ratón, BHK, HL-60, U937 o Hak.

La proteína ligando de P-selectina también puede producirse uniendo operativamente el ADN aislado de la invención y uno o más ADN que codifican enzimas de glicosilación adecuadas a secuencias de control adecuadas en uno o más vectores de expresión de insecto y empleando un sistema de expresión de insecto. Están disponibles en el mercado materiales y métodos para sistemas de expresión de baculovirus/células de insecto en forma de kit en, por ejemplo, Invitrogen, San Diego, California, Estados Unidos (el kit MaxBace) y dichos métodos son bien conocidos en la técnica, como se describe en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Nº 1555 (1987). También pueden producirse formas solubles de la proteína ligando de P-selectina en células de insecto usando ADN aislados apropiados como se ha descrito anteriormente. Un ADN que codifica una forma de PACE puede coexpresarse adicionalmente en una célula hospedadora de insecto para producir una forma escindida por PACE de la proteína ligando de P-selectina.

Como alternativa, puede ser posible producir la proteína ligando de P-selectina en eucariotas inferiores tales como levaduras o en procariotas tales como bacterias. Las cepas de levadura potencialmente adecuadas incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, cepas de Kluyveromyces, Candida o cualquier cepa de levadura capaz de expresar proteínas heterólogas. Las cepas bacterianas potencialmente adecuadas incluyen Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, o cualquier cepa bacteriana capaz de expresar proteínas heterólogas. Si la proteína ligando de P-selectina se genera en levaduras o bacterias, es necesario unir los carbohidratos apropiados a los sitios apropiados en el resto proteico covalentemente para obtener la proteína ligando de P-selectina glicosilada. Dichas uniones covalentes pueden lograrse usando métodos químicos o enzimáticos conocidos.

Los fragmentos de la proteína ligando de P-selectina de la invención también pueden expresarse como un producto de animales transgénicos, por ejemplo, como un componente de la leche de vacas, cabras, cerdos u ovejas transgénicas que se caracteriza por células germinales o somáticas que contienen una secuencia de ADN que codifica la proteína ligando de P-selectina.

Los fragmentos de la proteína ligando de P-selectina de la invención pueden prepararse cultivando células hospedadoras transformadas en condiciones de cultivo necesarias para expresar una glicoproteína de unión a Pselectina. La glicoproteína expresada resultante puede purificarse entonces a partir del medio de cultivo o de extractos celulares. Las formas solubles de la proteína ligando de P-selectina de la invención pueden purificarse por cromatografía de afinidad sobre Lentil lectin-Sepharose y posterior elución con -metil-manósido 0,5 M. La proteína ligando de P-selectina soluble eluida puede purificarse después adicionalmente y concentrarse mediante una etapa de precipitación con sulfato de amonio al 0,70%. Después, la proteína se recupera, se resuspende y se purifica adicionalmente por cromatografía de exclusión por tamaño sobre un TSK G4000SWXL. Como alternativa, pueden purificarse formas de longitud completa de la proteína ligando de P-selectina de la invención por preparación de una fracción de membrana total a partir de la célula de expresión y extracción de las membranas con un detergente no iónico tal como Triton X-100. El extracto de detergente puede pasarse después sobre una columna de afinidad compuesta por P-selectina inmovilizada y la proteína ligando de P-selectina puede eluirse de la columna con EDTA 10 mM en un tampón que contiene detergente al 0,1%. El material eluido de la columna de afinidad puede dializarse después para eliminar EDTA y purificarse adicionalmente sobre una columna de afinidad de Lentil lectin-Sepharose, eluyendo de nuevo con -metil-manósido 0,5 M.

Como alternativa, los fragmentos de la proteína ligando de P-selectina de la invención se concentran usando un filtro de concentración de proteína disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después de la etapa de concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación tal como un medio de filtración en gel. Como alternativa, puede emplearse una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o substrato que tiene grupos dietilaminoetilo (DEAE) colgantes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente empleados en la purificación de proteínas. Como alternativa, puede emplearse una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores de cationes adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren grupos sulfopropilo (por ejemplo, columnas de S-Sepharose). La purificación de la proteína ligando de P-selectina a partir de sobrenadante de cultivo también puede incluir una o más etapas de columna sobre dichas resinas de afinidad como concanavalina A-agarosa, heparinatoyopearl o Cibacrom blue 3GA Sepharose; o por cromatografía de interacción hidrófoba usando resinas tales como éter fenílico, éter butílico o éter propílico; o por cromatografía de inmunoafinidad.

Por último, pueden emplearse una o más etapas de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RPHPLC) que emplean medios de RP-HPLC hidrófobos, por ejemplo, gel de sílice que tiene grupos metilo colgantes u otros grupos alifáticos, para purificar adicionalmente la proteína ligando de P-selectina. También pueden emplearse algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en diversas combinaciones, para proporcionar una proteína recombinante aislada sustancialmente homogénea. La proteína ligando de P-selectina purificada de este modo está sustancialmente libre de otras proteínas de mamífero y se define de acuerdo con la presente invención como “proteína ligando de P-selectina aislada”.

La proteína ligando de P-selectina aislada puede ser útil en el tratamiento de afecciones caracterizadas por una adhesión intercelular mediada por P-selectina. Dichas afecciones incluyen, sin limitación, infarto de miocardio, infección vírica o bacteriana, afecciones metastásicas, trastornos inflamatorios tales como artritis, síndrome de dificultad respiratoria aguda, asma, enfisema, reacción de hipersensibilidad de tipo retardado, lupus eritematoso sistémico, lesión térmica tal como quemaduras o congelaciones, tiroiditis autoinmune, encefalomielitis alérgica experimental, esclerosis múltiple, síndrome de lesión multiorgánica secundario a traumatismo, diabetes, síndrome de Reynaud, dermatosis neutrofílica (síndrome de Sweet), enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Grave, glomerulonefritis, gingivitis, periodontitis, síndrome urémico hemolítico, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enterocolitis necrotizante, síndrome asociado a transfusión de granulocitos, toxicidad inducida por citocinas y similares. La proteína ligando de Pselectina aislada también puede ser útil en el trasplante de órganos, tanto para preparar órganos para el trasplante como para sofocar el rechazo de un trasplante de órganos. La proteína ligando de P-selectina aislada puede usarse para tratar pacientes con hemodiálisis y leucoforesis. Además, la proteína ligando de P-selectina aislada puede usarse como agente antimetastásico. La proteína ligando de P-selectina aislada puede usarse por sí misma como un inhibidor de la adhesión intercelular mediada por P-selectina o para diseñar inhibidores de la adhesión intercelular mediada por P-selectina. La presente invención incluye tanto las composiciones farmacéuticas que contienen proteínas ligando de Pselectina aisladas como usos terapéuticos que emplean la proteína ligando de P-selectina aislada.

La proteína ligando de P-selectina aislada, purificada a partir de células o producida de forma recombinante, puede usarse como composición farmacéutica cuando se combina con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dicha composición puede contener, además de la proteína ligando de P-selectina y de vehículos, diluyentes, cargas, sales, tampones, estabilizantes, solubilizantes y otros materiales bien conocidos en la técnica. La expresión “farmacéuticamente aceptable” se refiere a un material no tóxico que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica del ingrediente o ingredientes activos. Las características del vehículo dependerán de la vía de administración. La composición farmacéutica de la invención también puede contener citocinas, linfocinas y otros factores hematopoyéticos tales como M-CSF, GM-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, GCSF, Meg-CSF, factor de células madre y eritropoyetina. La composición farmacéutica puede contener factores trombolíticos o antitrombóticos tales como activador de plasminógeno y Factor VIII. La composición farmacéutica puede contener además otros agentes antiinflamatorios. Dichos factores adicionales y/o agentes pueden incluirse en la composición farmacéutica para producir un efecto sinérgico con la proteína ligando de P-selectina aislada o minimizar los efectos secundarios causados por la proteína ligando de P-selectina aislada. Por el contrario, la proteína ligando de P-selectina aislada puede incluirse en formulaciones de la citocina, linfocina, otro factor hematopoyético, factor trombolítico o antitrombótico o agente antiinflamatorio particular para minimizar los efectos secundarios de la citocina, linfocina, otro factor hematopoyético, factor trombolítico o antitrombótico o agente antiinflamatorio.

La composición farmacéutica de la invención puede estar en forma de un liposoma en el que la proteína ligando de Pselectina aislada se combina, además de con otros vehículos farmacéuticamente aceptables, con agentes anfipáticos tales como lípidos, que existen en forma agregada como micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos o capas laminares que están en solución acuosa. Los lípidos adecuados para formulación liposomal incluyen, sin limitación, monoglicéridos, diglicéridos, sulfatidas, lisolecitina, fosfolípidos, saponina, ácidos biliares y similares. La preparación de dichas formulaciones liposomales está dentro del nivel de especialidad en la técnica, como se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 4.235.871; Patente de Estados Unidos Nº 4.501.728; Patente de Estados Unidos Nº 4.837.028; y Patente de Estados Unidos Nº 4.737.323.

Como se usa en la presente memoria, la expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a la cantidad total de cada componente activo de la composición farmacéutica o método que es suficiente para demostrar un beneficio significativo para el paciente, es decir, curación de afecciones crónicas caracterizadas por adhesión celular mediada por P-selectina o aumento en la velocidad de curación de dichas afecciones. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual administrado en solitario, la expresión se refiere a ese ingrediente solamente. Cuando se aplica a una combinación, la expresión se refiere a cantidades combinadas de los ingredientes activos que dan como resultado el efecto terapéutico, ya se administren en combinación, en serie o simultáneamente.

Al poner en práctica el uso de la presente invención, una cantidad terapéuticamente eficaz de proteína ligando de Pselectina aislada se administra a un mamífero que tiene una patología mediada por P-selectina. La proteína ligando de P-selectina aislada puede administrarse de acuerdo con el uso de la invención en solitario o en combinación con otras terapias, tales como tratamientos que emplean citocinas, linfocinas u otros factores hematopoyéticos. Cuando se coadministra con una o más citocinas, linfocinas u otros factores hematopoyéticos, la proteína ligando de P-selectina aislada puede administrarse simultáneamente con la citocina o citocinas, linfocina o linfocinas, otro factor o factores hematopoyéticos, factores trombolíticos o antitrombóticos, o de forma secuencial. Si se administra de forma secuencial, el médico adjunto decidirá la secuencia de administración apropiada de la proteína ligando de P-selectina aislada en combinación con la citocina o citocinas, linfocina o linfocinas, otro factor o factores hematopoyéticos, factores trombolíticos o antitrombóticos.

La administración de la proteína ligando de P-selectina aislada usada en la composición farmacéutica o para poner en práctica el uso de la presente invención puede llevarse a cabo en una diversidad de formas convencionales, tales como ingestión oral, inhalación o inyección cutánea, subcutánea o intravenosa. Se prefiere la administración intravenosa al paciente.

Cuando una cantidad terapéuticamente eficaz de proteína ligando de P-selectina aislada se administra por vía oral, la proteína ligando de P-selectina aislada estará en forma de un comprimido, cápsula, polvo, solución o elixir. Cuando se administra en forma de comprimido, la composición farmacéutica de la invención puede contener además un vehículo sólido tal como gelatina o un adyuvante. El comprimido, cápsula y polvo contienen de aproximadamente el 5% al 95% de proteína ligando de P-selectina aislada y, preferentemente, de aproximadamente el 25 al 90% de proteína ligando de P-selectina aislada. Cuando se administra en forma líquida, puede añadirse un vehículo líquido tal como agua, vaselina, aceites de origen animal o vegetal tales como aceite de cacahuete, aceite mineral, aceite de soja o aceite de sésamo, o aceites sintéticos. La forma líquida de la composición farmacéutica puede contener además solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacáridos, o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Cuando se administra en forma líquida, la composición farmacéutica contiene de aproximadamente el 0,5 al 90% en peso de la proteína ligando de P-selectina aislada y, preferentemente, de aproximadamente el 1 al 50% de proteína ligando de Pselectina aislada.

Cuando se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de proteína ligando de P-selectina aislada por inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, la proteína ligando de P-selectina aislada estará en forma de una solución acuosa apirógena parenteralmente aceptable. La preparación de dichas soluciones de proteínas parenteralmente aceptables, teniendo en cuenta el pH, la isotonicidad, la estabilidad y similares, está dentro de la especialidad en la técnica. Una composición farmacéutica preferida para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea debería contener, además de la proteína ligando de P-selectina aislada, un vehículo isotónico tal como inyección de cloruro sódico, inyección de Ringer, inyección de dextrosa, inyección de dextrosa y cloruro sódico, inyección de Ringer lactato u otro vehículo que se conoce en la técnica. La composición farmacéutica de la presente invención también puede contener estabilizantes, conservantes, tampones, antioxidantes u otros aditivos conocidos por los expertos en la materia.

La cantidad de proteína ligando de P-selectina aislada en la composición farmacéutica de la presente invención dependerá de la naturaleza y gravedad de la afección a tratar y de la naturaleza de tratamientos anteriores a los que se haya sometido el paciente. En última instancia, el médico adjunto decidirá la cantidad de proteína ligando de P-selectina aislada con la que tratar a cada paciente individual. Inicialmente, el médico adjunto administrará dosis reducidas de la proteína ligando de P-selectina aislada y observará la respuesta del paciente. Pueden administrarse dosis mayores de proteína ligando de P-selectina aislada hasta que se obtenga el efecto terapéutico óptimo para el paciente, y en ese punto la dosificación ya no se aumenta más. Se contempla que las diversas composiciones farmacéuticas usadas para la práctica del método de la presente invención deberían contener de aproximadamente 0,1 g a aproximadamente 100 mg de proteína ligando de P-selectina aislada por kg de peso corporal.

La duración de la terapia intravenosa usando la composición farmacéutica de la presente invención variará dependiendo de la gravedad de la enfermedad a tratar y de la afección y de la respuesta idiosincrásica potencial de cada paciente individual. Se contempla que la duración de cada aplicación de la proteína ligando de P-selectina aislada estará en el intervalo de 12 a 24 horas de administración intravenosa continua. En última instancia, el médico adjunto decidirá la duración apropiada de la terapia intravenosa usando la composición farmacéutica de la presente invención.

La proteína ligando de P-selectina aislada de la invención también puede usarse para inmunizar animales para obtener anticuerpos policlonales y monoclonales que reaccionen específicamente con la proteína ligando de P-selectina y que puedan inhibir la adhesión celular mediada por P-selectina. Dichos anticuerpos pueden obtenerse usando la proteína ligando de P-selectina completa como inmunógeno, o usando fragmentos de la proteína ligando de P-selectina tales como la proteína ligando de P-selectina madura soluble. También pueden usarse fragmentos más pequeños de la proteína ligando de P-selectina para inmunizar animales, tales como los fragmentos expuestos a continuación: del aminoácido 42 al aminoácido 56 de la SEC ID Nº: 1 y del aminoácido 127 al aminoácido 138 de la SEC ID Nº: 1. Un inmunógeno peptídico adicional comprende del aminoácido 238 al aminoácido 248 de la SEC ID Nº: 1, con un resto de alanina añadido al extremo amino-terminal del péptido. Otro inmunógeno peptídico comprende del aminoácido 43 al aminoácido 56 de la SEC ID Nº: 1, que tiene una tirosina sulfatada en cualquiera de o en todas las posiciones 46, 48 ó

51. Los inmunógenos peptídicos pueden contener además un resto de cisteína en el extremo carboxilo-terminal y están conjugados con un hapteno tal como hemocianina de lapa californiana (KLH). Pueden generarse inmunógenos peptídicos adicionales por sustitución de restos de tirosina con restos de tirosina sulfatada. Se conocen en la técnica métodos para sintetizar dichos péptidos, por ejemplo, como en R. P. Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963); J. L. Krstenansky, et al, FEBS Lett. 211, 10 (1987).

Los anticuerpos monoclonales que se unen a la glicoproteína ligando de P-selectina o a restos de carbohidratos complejos característicos de la glicoproteína ligando de P-selectina pueden ser agentes de diagnóstico útiles para la inmunodetección de enfermedades inflamatorias y de algunas formas de cáncer. Algunas células cancerosas, tales como carcinomas pulmonares microcíticos, pueden expresar niveles detectables de la proteína ligando de P-selectina. Esta expresión anormal de la proteína ligando de P-selectina por células cancerosas puede desempeñar un papel en la metástasis de estas células.

Los anticuerpos monoclonales neutralizantes que se unen a la glicoproteína ligando de P-selectina o a carbohidratos complejos característicos de la glicoproteína ligando de P-selectina también pueden ser agentes terapéuticos útiles para tanto enfermedades inflamatorias como también en el tratamiento de algunas formas de cáncer en las que esté implicada una expresión anormal de la proteína ligando de P-selectina. Estos anticuerpos monoclonales neutralizantes son capaces de bloquear la función de adherencia intercelular mediada por selectina de la proteína ligando de Pselectina. Al bloquear la unión de la proteína ligando de P-selectina, la adherencia de leucocitos a sitios de inflamación inapropiada se suprime o se reduce notablemente. En el caso de células cancerosas o células leucémicas, pueden ser útiles anticuerpos monoclonales neutralizantes contra la proteína ligando de P-selectina en la detección y prevención de la propagación metastásica de las células cancerosas que puede estar mediada por la proteína ligando de P-selectina. Además, los anticuerpos monoclonales unidos a estas células pueden dirigirse a las células cancerosas para una citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), contribuyendo de este modo a eliminar las células cancerosas. Los anticuerpos humanos que reaccionan con la proteína ligando de P-selectina pueden producirse en animales transgénicos que contienen inmunoglobulina humana que codifica genes en sus líneas germinales. El Ejemplo 7 a continuación expone la producción de un anticuerpo policlonal de conejo específico para fragmentos de proteína ligando de P-selectina.

La proteína ligando de P-selectina de la invención también puede usarse para explorar para agentes que sean capaces de unirse a la proteína ligando de P-selectina y por lo tanto puedan actuar como inhibidores de la adhesión intercelular mediada por P-selectina. Son bien conocidos en la técnica ensayos de unión que usan una proteína de unión deseada, inmovilizada o no, y pueden usarse con este fin usando la proteína ligando de P-selectina de la invención. Los ensayos de exploración apropiados pueden estar basados en células, como en el Ejemplo 3 a continuación. Como alternativa, pueden usarse ensayos de exploración basados en proteína purificada para identificar dichos agentes. Por ejemplo, puede inmovilizarse proteína ligando de P-selectina en forma purificada en un soporte y la unión a P-selectina purificada puede medirse en presencia y ausencia de agentes de inhibición potenciales. Un ensayo de unión adecuado puede emplear como alternativa P-selectina purificada inmovilizada en un soporte, con una forma soluble de la proteína ligando de P-selectina de la invención.

Puede usarse cualquier proteína ligando de P-selectina en los ensayos de exploración descritos anteriormente. Por ejemplo, la proteína ligando de P-selectina de longitud completa expuesta en la SEC ID Nº: 1 del aminoácido 1 al aminoácido 402 puede usarse para explorar para inhibidores; o la proteína ligando de P-selectina madura expuesta en la SEC ID Nº: 1 del aminoácido 42 al aminoácido 402 puede usarse para explorar para inhibidores, o la proteína ligando de P-selectina madura soluble expuesta en la SEC ID Nº: 1 del aminoácido 42 al aminoácido 310 puede usarse para explorar para inhibidores. Como alternativa, la proteína ligando de P-selectina de la SEC ID Nº: 3 del aminoácido 1 al aminoácido 412, o una forma madura de la proteína ligando de P-selectina como se expone en la SEC ID Nº: 3 del aminoácido 42 al aminoácido 412, o una forma madura soluble de la proteína ligando de P-selectina expuesta en la SEC ID Nº: 3 del aminoácido 42 al aminoácido 320 puede usarse para explorar para inhibidores de la adhesión intercelular de acuerdo con la presente invención.

En dicho ensayo de exploración, se forma una primera mezcla de unión por combinación de P-selectina y proteína ligando de P-selectina, y se mide la cantidad de unión en la primera mezcla de unión (Bo.). También se forma una segunda mezcla de unión por combinación de P-selectina, la proteína ligando de P-selectina y el compuesto o agente a explorar, y se mide la cantidad de unión en la segunda mezcla de unión (B). Las cantidades de unión en la primera y segunda mezclas de unión se comparan, por ejemplo, realizando un cálculo de B/Bo. Se considera que un compuesto o agente es capaz de inhibir la adhesión intercelular mediada por P-selectina si se observa una disminución en la unión en la segunda mezcla de unión en comparación con la primera mezcla de unión. La formulación y optimización de mezclas de unión está dentro del nivel de especialidad en la técnica, dichas mezclas de unión pueden contener también los tampones y sales necesarios para aumentar u optimizar la unión y pueden incluirse ensayos de control adicionales en el ensayo de exploración de la invención.

Por lo tanto, pueden identificarse compuestos que se descubra que reducen al menos aproximadamente el 10%, preferentemente más de aproximadamente el 50% o más la actividad de unión de la proteína ligando de P-selectina a Pselectina y después explorarse secundariamente en otros ensayos de unión a selectina, incluyendo ensayos de unión a E-selectina y a L-selectina y ensayos in vivo. Por estos medios pueden identificarse compuestos que tengan actividad inhibidora para la adhesión intercelular mediada por selectina que puedan ser adecuados como agentes antiinflamatorios.

EJEMPLO 1

CLONACIÓN DEL GEN DE LA PROTEÍNA LIGANDO DE P-SELECTINA

A. Construcción de la genoteca de ADNc de HL60

Se construyó una genoteca de ADNc de HL60 para clonación y expresión del ligando de P-selectina. Se aisló ARN PoliA+ a partir del ARN total de la línea celular promielocítica humana HL60 (S. J. Collins, et al., anteriormente) usando un kit de aislamiento de ARNm Fast Track (Invitrogen; San Diego, CA). Se sintetizó el ADNc bicatenario a partir de la fracción de ARN PoliA+ y se ligó con extremos romos con los adaptadores EcoRI (5’-AATTCCGTCGACTCTAGAG-3’, 5’CTCTAGAGTCGACGG-3’). El ADNc se ligó en el vector de expresión pMT21 (R. Kaufman et al, J. Mol. Cell. Biol. 9, 946-958 (1989)) que, de forma secuencial, se había incubado con endonucleasa EcoRI y fosfatasa alcalina intestinal de ternera y purificado en gel. El producto de ligación se usó en la electroporación de alícuotas de 2 l de células E. coli DH5 competentes y cultivadas en 1 ml de medio SOB (J. Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pl. 90 (1989)) que se había complementado con MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM y glicerol al 2% durante una hora a 37ºC. Para dividir la genoteca en subconjuntos más pequeños, se sembró en placas una alícuota de cada ml de suspensión bacteriana sobre placas de agar en presencia de ampicilina y se calculó el número de colonias por ml. Asumiendo que cada colonia representaba un clon de ADNc, se generaron

600.000 clones y se dividieron en subconjuntos de aproximadamente 16.000 clones por combinación. Cada una de las 38 combinaciones se cultivó durante una noche en caldo L en presencia de ampicilina, y los plásmidos se purificaron sobre un gradiente de CsCl.

B. Exploración para el gen de la proteína ligando de P-selectina

En la primera fase, se utilizó el ensayo de unión a LEC-1 del Ejemplo 4(A) para realizar una selección de la genoteca de ADNc de HL60 y, de este modo, enriquecer para el plásmido de interés. Se cotransfectaron seis g de cada combinación de genoteca de ADNc de HL60 con 2 g de gen  3/4FT (Ejemplo 2) en células COS. Aproximadamente 45 horas post-transfección, las células COS se levantaron de las placas por incubación de las células en EGTA 1 mM durante 15 min a 37ºC, seguida de raspado con raspadores de células. Las células se lavaron dos veces en solución salina tamponada de Hanks que contenía calcio 1 mM (HBSS). Las células se resuspendieron en 4 ml de HBSS. Las células COS transfectadas resuspendidas se exploraron usando el ensayo de unión a LEC-1 descrito en el Ejemplo 4(A).

Los plásmidos de células COS adherentes se recuperaron a partir de un extracto de Hirts [B. Hirts, J. Mol. Biol., 26, 365369 (1967)] y después se usaron en la electroporación de células E. coli DH5 para su amplificación. La población enriquecida de plásmidos se purificó sobre un gradiente de CsCl y volvió a transfectarse junto con el gen de 3/4FT (Ejemplo 2) en células COS. Los procedimientos de transfección, exploración y amplificación de plásmido se repitieron durante un total de tres veces antes de que se detectara visualmente una combinación que se unía a las placas revestidas con LEC-1. La combinación de plásmido positivo se descompuso posteriormente en subconjuntos. Esto implicaba la electroporación del extracto de Hirts de la combinación positiva en células E. coli DH5 y la cuantificación de las colonias por ml como se ha descrito anteriormente. Se produjeron diversos tamaños de combinaciones por siembra de un número predeterminado de colonias en placas de agar en presencia de ampicilina. Se prepararon placas por duplicado realizando transferencias a nitrocelulosa y almacenando los filtros en nuevas placas de agar. Las placas por duplicado servían como placas de referencia para seleccionar colonias individuales o grupos de colonias de cualquier combinación identificada como positiva.

En la segunda fase de clonación, las células COS se cotransfectaron con las combinaciones de subgenotecas y el gen de 3/4FT mediante el mismo procedimiento usado en las etapas iniciales de exploración. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células transfectadas se exploraron usando el ensayo de CHO:P-selectina fluorescente del Ejemplo 4(B). Las combinaciones positivas se subdividieron adicionalmente, como se ha descrito anteriormente, hasta que finalmente se exploraron colonias individuales y se identificaron los clones positivos. Usando este método, se descubrió que un solo clon positivo, pMT21:PL85, codificaba la proteína ligando de P-selectina. La secuencia de ADN del ligando de P-selectina contenida en pMT21:PL85 se expone en la SEC ID Nº: 1, y las características de unión de la proteína ligando de P-selectina codificada por pMT21:PL85 se exponen en el Ejemplo 4(C) a continuación.

EJEMPLO 2

CLONACIÓN DEL GEN DE LA  1,3/1,4 FUCOSILTRANSFERASΑ

El gen de la  1,3/1,4 fucosiltransferasa (3/4FT) se clonó a partir de ADN genómico humano total (Clontech Laboratories) por medio de PCR. El cebador oligonucleotídico con sentido contenía un sitio XbaI y el extremo terminal 5’ del gen (5’-TAGCATACGCTCTAGAGCATGGATCCCCTGGGTGCA GCCAAGC-3’), y el cebador oligonucleotídico antisentido contenía un sitio EcoRI y el extremo terminal 3’ del gen (5’-CCGGAATTCTCAGGTGAA CCAAGCCGC-3’). El producto de PCR se digirió secuencialmente con XbaI y EcoRI y se purificó por procedimientos de purificación en gel convencionales. Este gen se ligó después con el vector pMT3Sv2ADA (R. Kaufman, Methods in Enzymology, anteriormente) que también se había digerido secuencialmente con XbaI y EcoRI y purificado por métodos de purificación en gel convencionales. Se transformaron células HB101 competentes (Biorad) con este producto de ligación y después se sembraron en placas de agar en presencia de ampicilina. Se sondaron transferencias de filtro de nitrocelulosa de transformantes resistentes a ampicilina con un oligonucleótido radiomarcado (5’AAGTATCTGTCCAGGGCTTCCAGGT-3’) complementario a la región de nucleótidos 506-530 en la mitad del gen (J. Sambrook et al, anteriormente).

Se prepararon minipreparaciones de ADN plasmídico a partir de doce clones positivos. Después, el ADN purificado se digirió con EcoRI y XbaI para identificar el clon correcto con el inserto de tamaño apropiado. Este clon (pEA.3/4FT) se cultivó después a gran escala y el ADN se aisló por separación en bandas de gradiente de densidad de CsCl (J. Sambrook et al, anteriormente). La secuenciación de ADN confirmó la identidad del gen de 3/4FT. La funcionalidad del gen se evaluó en un ensayo de unión célula-célula de la forma siguiente. Se transfectaron células de mono COS-1 [(clon M6; M. Horwitz et al, Mol. Appl. Genet., 2: 147-149, (1983)] con 3/4FT usando DEAE dextrano seguido de tratamiento de choque con DMSO e incubación con cloroquina [L. Sompeyrac y K. Dana, Proc. Natl. Acad. Sci., 78: 7575-7578 (1981);

M. Lopata et al, Nucleic Acid Res, 12: 5707-5717, (1984); H. Luthman y G. Magnuson, Nucleic Acids Res., 11: 12951308, (1983)]. Las células COS transfectadas se suspendieron y cuantificaron por su unión a una línea de CHO que expresaba E-selectina [G. Larsen et al, J. Biol. Chem 267: 11104-11110, (1992)]. Este ensayo confirmó que las células COS transfectadas con 3/4FT pueden expresar el epítopo de Lewisx sialilado en la superficie celular.

EJEMPLO 3

EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA LIGANDO DE P-SELECTINA

A. Expresión del ligando de P-selectina en células LEC11

Se expresó ligando de P-selectina funcional en la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) positiva a SLex LEC11 (Campbell, C. y Stanley, P. Cell 35: 303-309 (1983)) de la forma siguiente: se transfectaron aproximadamente 8 g de plásmido que contenía el gen de ligando de P-selectina (pMT21:PL85, Ejemplo 1) en células LEC11. A las 68 horas post-transfección, las células se trataron con butirato sódico 2,5 mM durante 4 horas. Se observó que las células inducían la adhesión de P-selectina, según se determinó usando el ensayo de unión celular de CHO:P-selectina marcada con 6-CFD (descrito en el Ejemplo 4, sección B). Por el contrario, ni las células LEC11 en solitario ni las células LEC11 transfectadas con un plásmido de control inducían la adhesión de P-selectina.

B. Expresión de ligando de P-selectina soluble en células COS

Se transfectaron células COS con 8 g de pED.sPSL.T7 (véase el Ejemplo 5C) y 4 g de plásmido pEA.3/4FT del Ejemplo 2, 8 g de pED.sPSL.T7 en solitario u 8 g de vector plasmídico (pMT21) y 4 g de gen pEA.3/4FT. Cuarenta y cinco horas post-transfección, las células se aclararon dos veces en PBS y se incubaron durante una noche a 37ºC en DMEM sin suero sin rojo fenol (JRH Biosciences) complementado con L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 g/ml. Se añadió fluoruro de fenilmetilsulfonilo, aprotinina y NaN3 a concentraciones finales de 1 mM, 2 g/ml y 0,02%, respectivamente, y el medio acondicionado se centrifugó para eliminar todos los residuos.

Para los experimentos de inmunoprecipitación, la proteína ligando de P-selectina soluble marcada se produjo por cotransfección de células COS con pED.sPSL.T7 y pEA.3/4FT. A las cuarenta y cinco horas post-transfección, las células COS se marcaron con 35S-metionina (NEN) 250 Ci/ml durante 5 horas y se recogió el medio. Se confirmó la expresión de proteína sPSL.T7 por inmunoprecipitación con anticuerpos anti-T7.

C. Expresión de ligando de P-selectina escindido por PACE en células COS

Se cotransfectaron células COS con el plásmido pED.sPSL.T7 del Ejemplo 5(C), el ADNc de pEA.3/4FT del Ejemplo 2 y un plásmido que contenía el ADNc de PACE como se expone en la SEC ID Nº: 5. Se realizó una cotransfección de control paralela usando solamente el plásmido pED.sPSL.T7 y el plásmido pEA.3/4FT. Después de 45 horas, el medio acondicionado de estas células COS transfectadas se usó para recubrir placas de plástico y se determinó la unión a células CHO:P-selectina (Ejemplo 4). Se observó un aumento de aproximadamente dos veces en las células CHO:Pselectina unidas para placas recubiertas con medio que contenía el ligando de P-selectina coexpresado con PACE, en comparación con medio que contenía ligando de P-selectina que no se había coexpresado con PACE. La secuenciación de aminoácidos del extremo N-terminal de la proteína sPSL.T7 purificada de la cotransfección con PACE mostraba que todo el ligando se había escindido en el sitio consenso de PACE (aminoácidos 38-41 de la SEC ID Nº: 1). El radiomarcaje de células COS cotransfectadas con 35S-metionina y la posterior electroforesis en gel de poliacrilamidaSDS y autorradiografía mostró que se habían secretado cantidades comparables del ligando de P-selectina en ambas cotransfecciones.

D. Expresión de la proteína ligando de P-selectina en células CHO

Se expresó una forma de longitud completa (aminoácidos 1-402) de la proteína ligando de P-selectina en la línea celular CHO(DUKX) (Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220 (1980)) de la forma siguiente: se cotransfectaron aproximadamente 25 g del plásmido pMT21:PL85 y aproximadamente 8 g del pED.3/4FT (producido por restricción de pEA.3/4FT con EcoRI y XbaI e inserción del fragmento resultante en el plásmido pED) en células CHO(DUKX) usando el método de fosfato de calcio. Se seleccionaron los transfectantes por resistencia a metotrexato. Después de dos semanas, se exploraron las colonias individuales para determinar la expresión de SLex usando un conjugado de un anticuerpo anti-SLex (CSLEX-1, documento U.S. 4.752.569) y eritrocitos de oveja (sRBC) preparados por el método de cloruro de cromo (Goding, J. W. J. Immunol. Methods 10: 61-66 (1976) de la forma siguiente: se lavaron sRBC con NaCl 0,15 M hasta que el lavado se volvió transparente y después se preparó una suspensión al 50% de sRBC en NaCl 0,15 M. Se añadió un ml de solución de cloruro de cromo al 0,01% gota a gota mientras se agitaba vorticialmente a 0,2 ml de una suspensión de sRBC que contenía 50 g de CSLEX-1. Después de la incubación a 37ºC durante 30 minutos, se añadieron 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a la reacción. El conjugado se lavó una vez antes de resuspender en 10 ml de PBS. Las placas que contenían transfectantes se lavaron con PBS y después se añadieron 3 ml de PBS y un ml del conjugado de sRBC/CSLEX-1 a cada placa. Las colonias positivas eran rojas en un transiluminador y se escogieron en medio alfa con suero bovino fetal al 10%. Después de dos semanas, las colonias se sometieron a una amplificación por etapas usando metotrexato a concentraciones de 2, 10, 25, 100, 250 nM. La línea celular estable obtenida se denominó CD-PSGL-1 (R3.4). La expresión de la proteína ligando de P-selectina se confirmó por estudios de inmunoprecipitación usando el anticuerpo policlonal anti-proteína ligando de P-selectina del Ejemplo 7(A). La funcionalidad de la proteína ligando de P-selectina producida por la línea celular CD-PSGL-1 (R3.4) se ensayó ensayando los transfectantes para determinar su unión a LEC-1 como en el Ejemplo 4(A).

La proteína sPSL.T7 se expresó en una línea CHO-PACE estable que ya estaba expresando el ADNc que codifica PACE como se expone en la SEC ID Nº: 5 bajo selección con adenosina desaminasa (Kaufman, et al, PNAS (USA) 83: 3136-3140 (1986)). Los plásmidos psPSL.T7 (25 g) y pED.3/4FT (8 g) se cotransfectaron en células CHO-PACE usando el método de fosfato de calcio. Se seleccionaron los transfectantes por su resistencia a metotrexato y se escogieron colonias individuales que se unían al conjugado de sRBC/CSLEX-1. Después de dos semanas en cultivo, las colonias se sometieron a una amplificación por etapas como se ha descrito anteriormente. La línea celular estable obtenida se denominó PSL/CP-T7 (R4.1). La expresión de la proteína sPSL.T7 se confirmó por métodos de inmunoprecipitación convencionales usando un anticuerpo monoclonal específico de T7 o la quimera de LEC-1 del Ejemplo 4(A). De una forma similar, se obtuvo una línea celular estable que expresaba la forma de longitud completa madura (aminoácidos 42-402) de la proteína ligando de P-selectina por cotransfección de pMT21:PL85 y pED.3/4FT en la línea CHO-PACE.

Se construyeron líneas celulares estables que expresaban la proteína sPSL.Q del Ejemplo 5(B) y la proteína sPSL.Fc del Ejemplo 5(B) de la forma siguiente: los plásmidos pED.sPSL.Q (25 g) o pED.sPSL.Fc (25 g) se cotransfectaron con aproximadamente 25 g del plásmido pED.3/4FT descrito anteriormente y aproximadamente 20 g de un plásmido que contenía el ADNc de PACE como se expone en la SEC ID Nº: 5), así como el gen de resistencia a neomicina en las células CHO(DUKX) usando el método de fosfato de calcio. Se seleccionaron los transfectantes por su resistencia a metotrexato y al antibiótico G418. Aproximadamente dos semanas después, se exploraron colonias individuales para determinar la expresión de SLex usando la unión a conjugado de sRBC/CSLEX-1. Las colonias positivas se escogieron en medio con G418 a concentración de 1 mg/ml. Después de 2-3 semanas en cultivo, las células se amplificaron con metotrexato en una selección por etapas. Las líneas celulares estables obtenidas se denominaron CD-sPSL.Q (R8.2) y CD-sPSL.Fc (R8.1), respectivamente. La expresión de proteína sPSL.Q y sPSL.Fc se confirmó por un método de inmunoprecipitación convencional usando el anticuerpo policlonal anti-proteína ligando de P-selectina del Ejemplo 7(A).

EJEMPLO 4

ENSAYOS DE ADHESIÓN INTERCELULAR MEDIADA POR P-SELECTINA

A. Ensayo de unión a LEC-1

Se construyó un ADN que codifica una forma quimérica de P-selectina conjugada con la porción Fc de una IgG1 humana (LEC-1) usando métodos conocidos (Aruffo et al. Cell 67, 35-44 (1991)) y se transfectó de forma estable en células CHO dhfr- (CHO DUKX) para un alto nivel de producción de la proteína LEC-1 quimérica, que se purificó para usarse en el ensayo de unión expuesto a continuación.

Se recubrieron placas de Petri primero con un anticuerpo policlonal anti-Fc de IgG1 humana y después con LEC-1. Este método orienta la construcción de LEC-1 de modo que la porción de P-selectina de la molécula quimérica se presenta en la superficie de las placas. Se cuantificó la adhesión de células HL60 a la LEC-1 orientada en presencia y ausencia de calcio. Se demostró que la adhesión de HL60 era dependiente de calcio, confirmando que la molécula quimérica había conservado la unión funcional de P-selectina a su ligando en células HL60. También se demostró que la unión de células HL60 a LEC-1 orientada se bloqueaba por un anticuerpo monoclonal neutralizante contra Pselectina, demostrando la especificidad de la unión de P-selectina.

B. Ensayo de unión de CHO-P-selectina fluorescente

El ensayo empleaba una línea celular de CHO:P-selectina marcada fluorescentemente (Larsen et al., J. Biol. Chem. 267, 11104-11110 (1992)) que puede unirse a y formar grupos en la superficie de células COS que se cotransfectan con el gen de ligando de P-selectina y el gen de 3/4FT. Las células de CHO:P-selectina se resuspendieron a 1,5 x 106 células/ml en suero bovino fetal al 1% en medio DME y se marcaron por adición de diacetato de 6-carboxifluoresceína (6-CFD) hasta una concentración final de 100 g/ml. Después de la incubación a 37ºC durante 15 minutos, las células se lavaron en medio y se resuspendieron a 1 x 105 células/ml. Se añadieron 5 ml de las células marcadas a cada placa que contenía transfectantes de COS lavadas a ensayar y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se eliminaron las células no adherentes mediante cuatro lavados con medio. Después, las placas se exploraron por microscopía de fluorescencia para determinar rosetas de células CHO:P-selectina adherentes.

C. Ensayo de adhesión cuantitativa usando células CHO:P-selectina marcadas radiactivamente

Se cotransfectaron células COS con el plásmido pMT21:PL85 del Ejemplo 1 y el plásmido pEA.3/4FT del Ejemplo 2 mediante el mismo procedimiento usado en las fases iniciales de exploración. Como controles, se transfectaron células COS con pMT21:PL85 solamente o con pEA.3/4FT solamente, o con un plásmido similar que no contenía inserto (“transfección simulada”). 24 horas después de la transfección, las células transfectadas se trataron con tripsina y se distribuyeron en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos Costar. Se marcaron las células CHO:P-selectina durante 16 horas con 3H-timidina usando métodos conocidos y se preincubaron a 0,5 x 106 células/ml durante 30 minutos a 4ºC en un medio que contenía BSA al 1% (control); un medio que contenía BSA al 1%, EDTA 5 mM y EGTA 5 mM; medio  que contenía BSA al 1% y 10 g/ml de un anticuerpo monoclonal anti-P-selectina neutralizante; y un medio que contenía BSA al 1% y un anticuerpo monoclonal anti-P-selectina no neutralizante. Las células preincubadas se añadieron después a los pocillos que contenían las células COS transfectadas. Después de una incubación de 10 minutos, las células no unidas se eliminaron mediante 4 cambios de medio. Las células CHO:P-selectina unidas se liberaron por tratamiento con tripsina y se cuantificaron por recuento de centelleo.

Las células COS cotransfectadas con ligando de P-selectina y la 3/4FT inducían aproximadamente 5,4 veces más unión de células CHO:P-selectina respecto a células COS con transfección simulada; el ensayo en presencia de EGTA y EDTA reducía la unión a nivel de las células COS con transfección simulada. Asimismo, la incubación con anticuerpo neutralizante anti-P-selectina también eliminaba la unión específica, mientras que el anticuerpo no neutralizante no tenía efecto. Por el contrario, la unión de CHO:P-selectina a células COS transfectadas con ligando de P-selectina solamente no era estadísticamente diferente de la unión a las COS con transfección simulada tanto en presencia como en ausencia de EDTA y EGTA, o anticuerpos anti-P-selectina. La unión de células CHO:P-selectina a células COS transfectadas con 3/4FT solamente era aproximadamente 2 veces mayor que a las COS con transfección simulada, pero no se veía afectada por la presencia o ausencia de EDTA y EGTA.

EJEMPLO 5

CONSTRUCCIÓN DE LIGANDOS DE P-SELECTINA SOLUBLES

Los adaptadores de EcoRI usados para generar la genoteca de ADNc a partir de células HL60 en el Ejemplo I contienen un tipo de restricción XbaI (TCTAGA) justo 5’ del comienzo de la SEC ID Nº: 1 como se localiza en el plásmido pMT21:PL85. Para generar formas solubles del PSL, el plásmido pMT21:PL85 se digirió por restricción con XbaI y HincII (que escinde después del nucleótido 944 de la SEC ID Nº: 1). El fragmento de aproximadamente 950 pb generado de este modo, que contenía todo el segmento extracelular codificado del ligando hasta e incluyendo el codón para valina 295, se aisló y se usó para generar ADN que codifican formas solubles de la proteína del ligando de P-selectina como se expone en las secciones A a D a continuación.

A. Construcción de psPSL.OC

El fragmento se purificó y se ligó en un vector de expresión de mamífero pED entre los sitios XbaI y EcoRI, junto con el ADN oligonucleotídico sintético bicatenario que recreaba los codones de Asn 296 a Cys 310 e introducía un nuevo codón de terminación inmediatamente después de Cys 310. La secuencia de los oligonucleótidos era la siguiente:

5’-AACTACCCAGTGGGAGCACCAGACCACATCTCTGTGAAGCAGTGCTAG

5’-AATTCTAGCACTGCTTCACAGAGATGTGGTCTGGTGCTCCCACTGGGTA

GTT

El plásmido resultante se denominó pED.sPSL.QC, y la proteína expresada a partir del plásmido se denominó sPSL.QC.

B. Construcción de psPSL.O

El fragmento se purificó y se ligó en el plásmido pED (Kaufman et al., 1991) entre los sitios XbaI y EcoRI junto con el ADN oligonucleotídico sintético bicatenario que recreaba los codones de Asn 296 a Gln 309 e introducía un nuevo codón de terminación inmediatamente después de Gln 309. La secuencia de los oligonucleótidos es la siguiente:

5’-AACTACCCAGTGGGAGCACCAGACCACATCTGGTGAAGCAGTAG

5’-AATTCTACTGCTTCACAGAGATGTGGTCTGGTGCTCCCACTGGGTAGTT

El plásmido resultante se denominó pED.sPSL.Q y la proteína expresada a partir del plásmido se denominó sPSL.Q.

C. Construcción de psPSL.T7

Se sintetizaron oligonucleótidos que codifican 14 aminoácidos que incluyen un epítopo derivado de la proteína principal de la cápside de fago T7, creando una fusión C-terminal del “marcador” epitópico con 32 aminoácidos adicionales derivados de la secuencia de vector. Dos oligonucleótidos que tenían las secuencias

5’-CTAGACCCGGGATGGCATCCATGACAGGAGGACAACAAATGGTAGGCC

GTAG y

5’-AATTCTACGGCCTACCCATTTGTTGTCCTCCTGTCATGGATGCCATCCCG

GGT

formaron un dúplex y se ligaron con el fragmento de XbaI-EcoRI grande del plásmido de expresión de mamífero pED. El plásmido resultante, pED.T7, se digirió por restricción con XbaI y SmaI y se ligó con el fragmento de XbaI-HincII de 950 pb descrito anteriormente, dando como resultado el plásmido pED.sPSL.T7.

La proteína resultante de la expresión de pED.sPSL.T7 se denominó sPSL.T7.

D. Construcción de quimera de ligando de P-selectina soluble-IgGF

El ADN plasmídico que codifica una forma extracelular soluble de la proteína ligando de P-selectina fusionada a la porción Fc de la inmunoglobulina IgG1 humana se construyó de la forma siguiente: el vector de expresión de mamífero pED.Fc contiene secuencias que codifican la región Fc de una IgG1 humana con una nueva secuencia enlazadora que permite la fusión de secuencias codificantes aminoterminales con la región bisagra por medio de un sitio de restricción XbaI único. Se realizó una ligación de tres fragmentos: el pED.Fc se digirió por restricción con XbaI y se purificó en gel en forma lineal. El fragmento de 950 pb de pMT21:PL85 descrito anteriormente comprendía el segundo fragmento. El tercer fragmento consistía en ADN oligonucleotídicos sintéticos hibridados que tenían la secuencia siguiente:

5’-CTGCGGCCGCAGT

5’-CTAGACTGCGGCCGCAG

Los productos de ligación se cultivaron como ADN plasmídicos y se identificaron clones individuales que tenían la configuración correcta por secuenciación de ADN. El plásmido se denominó pED.PSL.Fc. La región codificante de ADN de la proteína de fusión de ligando de P-selectina soluble/Fc resultante se muestra en la SEC ID Nº: 6.

EJEMPLO 6

CARACTERIZACIÓN DE LIGANDOS DE P-SELECTINA EXPRESADOS

A. Caracterización de la unión de proteína ligando de P-selectina de longitud completa en células COS

La cotransfección de células COS con el plásmido pEA.3/4FT del Ejemplo 2 y el plásmido pMT21:PL85 del Ejemplo 1 produce células COS que se unen específicamente a células CHO:P-selectina. Esta unión se observa sólo tras la cotransfección de pEA.3/4FT y pMT21:PL85; el uso de cualquier plásmido en solitario genera células COS que no se unen a células CHO:P-selectina. No se observa unión entre la línea celular CHO(DUKX) parental que no expresa Pselectina y células COS cotransfectadas con pEA.3/4FT y pMT21:PL85. La unión entre las células COS cotransfectadas y células CHO:P-selectina es sensible a quelantes de iones divalentes tales como EDTA y EGTA, lo que concuerda con la dependencia de Ca++ de la adhesión celular mediada por P-selectina. Un anticuerpo monoclonal neutralizante anti-Pselectina bloqueaba la unión entre las células CHO:P-selectina y las células COS que se habían cotransfectado con pEA.3/4FT y pMT21:PL85, mientras que un anticuerpo monoclonal no neutralizante anti-P-selectina no tenía efectos sobre la unión. Los resultados de anticuerpo indican que el dominio o dominios funcionales de P-selectina son necesarios para unirse a la proteína ligando de P-selectina expresada en la superficie de células COS.

B. Caracterización electroforética de ligando de P-selectina de longitud completa expresado en células COS

Se prepararon extractos con detergente de células COS cotransfectadas de la forma siguiente: 45 horas después de la cotransfección, se suspendieron aproximadamente 1,5 x 107 células en 5 ml de tampón de lisis (ácido piperazin-N,Nbis[2-etanosulfónico] 10 mM (PIPES) pH 7,5, KCl 100 mM, MgCl2 3 mM, benzamidina 1 mM, leupeptina 0,5 g/ml, pepstatina 0,75 g/ml, etilmaleimida 1 mM y aprotinina 1 g/ml) y se lisaron por sonicación. Se eliminaron los residuos celulares por centrifugación a baja velocidad (500 x g, 10 minutos), y se recogió una fracción de membrana por ultracentrifugación (100.000 x g, 60 min). Se resuspendió el sedimento de membrana a alta velocidad en un tampón de extracción (ácido 3-[N-morfolino]propanosulfónico 10 mM) (MOPS) pH 7,5, NaCl 0,1M, NaN3 al 0,02%, Thesit al 1% (Sigma), benzamidina 1 mM, leupeptina 0,5 g/ml, pepstatina 0,75 g/ml, etilmaleimida 1 mM y aprotinina 1 g/ml). Después, las muestras se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida SDS y se transfirieron a transferencias de nitrocelulosa de la forma siguiente: una alícuota del extracto con detergente se suspendió en tampón de carga de SDS al 1% y se calentó durante 5 minutos a 100ºC antes de cargarla en un gel de poliacrilamida al 8-16% (reducido) o un gel al 6% (no reducido), y se sometió a electroforesis en el sistema de tampón de Laemmli. Se prepararon las transferencias usando membranas de transferencia Immobilon-P. Las transferencias se sumergieron en MOPS 10 mM pH 7,5, NaCl 0,1M, NaN3 al 0,02%, MgCl2 1 mM, CaCl2 1 mM y leche desnatada al 10% durante una noche a 4ºC. Las transferencias se aclararon una vez en el tampón anterior sin la leche y se incubaron en tampón de transferencia (MOPS 10 mM pH 7,5, NaCl 0,1M, albúmina de suero bovino al 1%, Thesit al 0,05%, MgCl2 1 mM, CaCl2 1 mM) durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Después, las transferencias se sondaron para el ligando de P-selectina de la forma siguiente: se preincubaron 50 ng de una quimera de P-selectina/Fc con 3 Ci de 125I-Proteína A en tampón de transferencia durante 30 minutos a temperatura ambiente. Podían añadirse excipientes adicionales (por ejemplo, EDTA, EGTA, anticuerpos monoclonales) a la mezcla de preincubación en este punto para evaluar sus efectos sobre la unión de la quimera al ligando de Pselectina. La mezcla preincubada se incubó después con las transferencias (preparadas como anteriormente) durante 60 minutos a temperatura ambiente, y las transferencias se lavaron posteriormente cuatro veces con el mismo tampón de transferencia (sin albúmina de suero bovino), se secaron al aire y sometieron a autorradiografía a -70ºC.

En condiciones no reductoras, se observaron dos bandas con esta técnica para extractos de membrana preparados a partir de células COS cotransfectadas. La banda principal migraba con un peso molecular estimado de aproximadamente 220 kD, mientras que la banda minoritaria migraba con un peso molecular de aproximadamente 110 kD. En condiciones reductoras, sólo se observaba una única banda con un peso molecular de aproximadamente 110 kD, indicando que, en condiciones no reductoras, el ligando de P-selectina existe como homodímero. El peso molecular aproximado del monómero reducido es superior al esperado a partir de la secuencia de aminoácidos deducida del clon de ADNc (45 kD), indicando que la proteína expresada experimenta una modificación postraduccional amplia (véase el Ejemplo 6(C)). La especificidad de la quimera de P-selectina/Fc se confirmó por la observación de que una sonda de IgG1 inespecífica no producía bandas en las transferencias. Además, la unión de la quimera de P-selectina/Fc a las transferencias se suprimía por EDTA, EGTA y un anticuerpo monoclonal neutralizante anti-P-selectina. Se observaron bandas específicas en las transferencias sólo a partir de extractos de membrana de células COS cotransfectadas con los plásmidos pEA.3/4FT y pMT21:PL85. Los extractos de membrana de transfecciones de control (pEA.3/4FT o pMT21:PL85 solamente) no producían bandas observables en las transferencias.

C. Glicosilación de proteína ligando de P-selectina

La presencia de carbohidrato unido covalentemente en ligando de P-selectina recombinante y su papel en la unión a Pselectina se determinó de la forma siguiente: se cotransfectaron células COS con pED.sPSL.T7 del Ejemplo 5(C) y el plásmido pEA.3/4FT del Ejemplo 2. Después de 48 horas, las células se estimularon con 35S-metionina. Se incubaron 200 l de medio acondicionado de sPSL.T7 marcado con 35S-metionina con 5 g de LEC-1 en presencia de CaCl2 2 mM y albúmina de suero bovino 1 mg/ml (BSA). Después de hacerse girar durante 2 horas a 4ºC, se añadieron perlas de Proteína A-Sepharose (Pharmacia) durante 1 hora a 4ºC, se sedimentaron por centrifugación y se lavaron dos veces en solución salina tamponada con Tris (Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,5, en lo sucesivo TBS) que contenía CaCl2 2 mM y BSA 1 mg/ml. Después, los sedimentos se resuspendieron y se trataron con neuraminidasa (Streptococcus pneumoniae), O-glicanasa y N-glicanasa (todas de Genzyme) de la forma siguiente. Todas las digestiones con glicosidasa se realizaron a 37ºC durante una noche. Para la digestión con neuraminidasa, el sedimento se resuspendió en 50 l de tampón de ácido 2-(N-morfolino)-etanosulfónico (MES), pH 6,5 (Calbiochem) y SDS al 0,1%, se calentó a 95ºC durante 5 minutos, después se sedimentó. El sobrenadante se modificó para que contuviera n-octil B-Dglucopiranósido (OGP) al 1,4%, acetato de calcio 10 mM, cacodilato sódico 20 mM y PMSF 2,5 mM, pH final 7,0. Se añadieron ocho l de neuraminidasa para una concentración final de 1 unidad/ml. Para la digestión con neuraminidasa/O-glicanasa, la muestra se preparó como anteriormente y junto con la neuraminidasa, también se añadió O-glicanasa a una concentración final de 0,1 unidades/ml. Para la digestión con N-glicanasa, el sedimento se resuspendió en 54 l de tampón MES y SDS al 1%, se calentó a 95ºC durante 5 minutos, después se sedimentó. El sobrenadante se modificó para que contuviera fosfato sódico 0,2 M, OGP al 3,5% y PMSF 2,5 mM, pH final 8,5. Se añadió N-glicanasa para una concentración final de 12 unidades/ml y se incubó como anteriormente.

El efecto del tratamiento con glicosidasa sobre sPSL.T7 se evaluó de dos formas. Para esto, cada muestra de proteína digerida se dividió en dos fracciones equivalentes. Una fracción se precipitó con el anticuerpo policlonal de P-selectina del Ejemplo 7(A), para mostrar el efecto de la digestión sobre la movilidad electroforética. La otra fracción se precipitó con la quimera de LEC-1 del Ejemplo 4(A) para evaluar la actividad de unión del ligando de P-selectina restante después de la digestión. Las muestras inmunoprecipitadas se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS en condiciones reductoras y autorradiografía.

En ausencia de tratamiento con glicosidasa, la autorradiografía puso de manifiesto bandas comparables (con pesos moleculares de 110 kD) para cada precipitación. Cuando la proteína ligando de P-selectina se trató con neuraminidasa, la precipitación con anticuerpo policlonal anti-ligando de P-selectina puso de manifiesto una ligera disminución en la movilidad, que concuerda con la eliminación de restos de ácido siálico. La cantidad de proteína ligando de P-selectina precipitada por LEC-1 se reducía significativamente después del tratamiento con neuraminidasa, lo que concuerda con el papel de los restos de ácido siálico en la interacción de P-selectina/ligando de P-selectina. Cuando la proteína ligando de P-selectina se trató tanto con neuraminidasa como con O-glicanasa, se observó un aumento sustancial en la movilidad electroforética después de la precipitación con el anticuerpo policlonal anti-ligando de P-selectina, indicando que se habían eliminado varias cadenas de oligosacáridos ligados a O. Sin embargo, la eliminación de oligosacáridos ligados a O de la proteína ligando de P-selectina puede no haber sido completa, puesto que la movilidad electroforética no correspondía a una proteína con un peso molecular de 38 kD, como se esperaría a partir de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 1. La proteína ligando de P-selectina digerida con neuraminidasa/O-glicanasa se unía a LEC-1 muy mal, indicando además el papel de los oligosacáridos en la interacción de P-selectina/ligando de P-selectina. El tratamiento del ligando de P-selectina purificado con N-glicanasa dio como resultado un ligero aumento en la movilidad electroforética, demostrando que algunos de los sitios de consenso para la glicosilación ligada a N están ocupados. La cantidad de proteína ligando de P-selectina precipitada por LEC-1 se reducía ligeramente, indicando que la glicosilación ligada a N también contribuye a la interacción de P-selectina/ligando de P-selectina, aunque no tan radicalmente como la sialilación y la glicosilación ligada a O.

EJEMPLO 7

ANTICUERPOS POLICLONALES ESPECÍFICOS PARA LIGANDOS DE P-SELECTINA

A. Policlonal de conejo anti-proteína de fusión de proteína ligando de P-selectina/proteína de unión a maltosa

Se generó el anticuerpo policlonal anti-ligando de P-selectina inmunizando conejos con una proteína de fusión generada en E. coli. La proteína de fusión consistía en el tercio amino-terminal del ligando de P-selectina (aminoácidos 1 a 110 de la SEC ID Nº: 1) fusionado en fase de lectura a la proteína de unión a maltosa (Maina, C. V. et al., Gene 74, 365-373 (1988); Riggs, P., en Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausebel et al., Eds., Greene Associates/Wiley Interscience (Nueva York, 1990) capitulo 16.6). En las condiciones empleadas en la presente memoria, el anticuerpo de proteína de fusión reconoce la proteína ligando de P-selectina.

B. Policlonal de conejo anti-proteína sPSL.T7

Se purificó una forma soluble de la invención (sPSL.T7; véase el Ejemplo 5(C)) hasta una homogeneidad aparente de acuerdo con el esquema siguiente: se transfectaron células COS con tres plásmidos, codificando uno cada uno de los siguientes: sPSL.T7 (Ejemplo 5(C)), 3/4FT (Ejemplo 2) y una forma soluble de PACE (como se expone en la SEC ID Nº: 5). Después de 72 horas, el medio acondicionado se recogió y se purificó sPSL.T7 recombinante de la forma siguiente.

El medio acondicionado se diluyó dos veces con MOPS 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 0,5 mM y MnCl2 0,5 mM, pH 7,2 y se aplicó a una columna de lentil lectin-Sepharose 4B equilibrada en el mismo tampón. Después de la carga, la columna se lavó con el mismo tampón hasta que la absorbancia óptica a 280 nm disminuía hasta un nivel basal estable. La columna se eluyó después con el mismo tampón que se había ajustado a -metil-manósido 0,5 M y NaCl 0,3 M. Se recogió la sPSL.T7 recombinante a lo largo de 5-15 volúmenes de columna de este tampón de elución. El eluido de lentil lectina se sometió después a una precipitación con sulfato de amonio al 0-70% añadiendo 472 g de sulfato de amonio por litro de eluido de columna a 4ºC. Después de agitar durante 30 minutos, el precipitado se resuspendió en un volumen mínimo de TBS (Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) y se aplicó a una columna de filtración en gel TSK G4000WXL equilibrada en TBS. El caudal en la columna era de 0,5 ml/min y se empleó una columna de protección. En alícuotas de <250 l, el sedimento de sulfato de amonio resuspendido se inyectó en la columna y las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE con análisis de Western. Las fracciones que contenían sPLS.T7 se combinaron y después se usaron para inmunizar conejos.

Se generaron anticuerpos contra sPLS.T7 de la forma convencional por sensibilización con antígeno y posterior refuerzo durante un periodo de 3 meses. En concreto, se realizó una inmunización primaria mezclando 50 g de sPLS.T7 (desnaturalizado por mezcla en SDS al 0,1% y calentamiento durante 10 minutos a 100ºC) con adyuvante completo de Freund y se inyectó en cinco sitios subcutáneamente. Los segundos refuerzos (y todos los posteriores) se realizaron mezclando 25 g de sPLS.T7 (desnaturalizado por mezcla en SDS al 0,1% y calentamiento durante 10 minutos a 100ºC) [12,4 g para el tercer refuerzo y refuerzos posteriores] con adyuvante incompleto de Freund e inyectando en dos sitios subcutáneamente (o posteriormente, por vía intramuscular) cada dos semanas. Se realizaron extracciones de sangre de ensayo cada dos semanas para controlar el título de anticuerpos. Cuando el título de anticuerpos alcanzaba un nivel adecuado, se realizaba una extracción de sangre a mayor escala y se preparaba una fracción de suero total. Esta preparación de anticuerpo policlonal se usaba para inhibir la unión específica de células HL60 a células CHO:Pselectina de una forma similar a la descrita en el Ejemplo 4.

Este ensayo empleaba células HL60 marcadas fluorescentemente (marcadas con BCECFAM; éster acetoximetílico de 2’,7’-bis-(2-carboximetil)-5-(y-6)-carboxifluoresceína) que se unían a células CHO sembradas en el fondo de placas de microtitulación. Las células HL60 marcadas se preincubaron con sueros que contenían anticuerpo policlonal o con sueros preinmunes ante 30 minutos a 4ºC. Después las células se lavaron y se incubaron con las células CHO:Pselectina durante 10 minutos. Después, las placas se lavaron y la fluorescencia se leyó con un lector de placas de microtitulación de fluorescencia. Usando este ensayo, una dilución 1:15 del suero policlonal anti-sPSL.T7 dio como resultado una inhibición esencialmente completa de la unión de células HL60 a CHO:P-selectina. Todavía se observaba una inhibición demostrable de la unión de HL60 a CHO:P-selectina a diluciones de antisuero de 1:150. El suero preinmune no tenía efecto sobre la unión de células HL60 a CHO:P-selectina.

LISTA DE SECUENCIAS

(1): INFORMACIÓN GENERAL:

(i): SOLICITANTE: GENETICS INSTITUTE, INC.

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NUEVA PROTEÍNA LIGANDO DE P-SELECTINA

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 6

(iv): DIRECCIÓN POSTAL:

(A): DESTINATARIO: Legal Affairs

(B): CALLE: 87 Cambridge Park Drive

(C): CIUDAD: Cambridge

(D): ESTADO: MA

(E): PAÍS: Estados Unidos

(F): CÓDIGO POSTAL: 02140

(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

(A): TIPO DE SOPORTE: Disquete

(B): ORDENADOR: Compatible con PC IBM

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D): SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN:

(C): CLASIFICACIÓN:

(vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 07/965.662

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 23-OCT-1992

(C): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/112.608

(D): FECHA DE PRESENTACIÓN: 26-AGO-1993

(viii) INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:

(A): NOMBRE: McDaniels, Patricia A.

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 33.194

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: GI 5123B-PCT

(ix) INFORMACIÓN POR TELECOMUNICACIONES:

(A): TELÉFONO: (617) 876-1210 Ext. 8405

(B): TELEFAX: (617) 876-5851

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1649 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: Homo sapiens 5 (G) TIPO DE CÉLULA: Promielocito

(H) LÍNEA CELULAR: HL60

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B) CLON: pMT21:PL85

(ix): CARACTERÍSTICA: 10 (A) NOMBRE/CLAVE: 5'UTR

(B) LOCALIZACIÓN: 1..59

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOMBRE/CLAVE: CDS

(B): LOCALIZACIÓN: 60..1268 15 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A): NOMBRE/CLAVE: 3'UTR

(B): LOCALIZACIÓN: 1269..1649

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 402 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 1239 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico 5 (C) TIPO DE CADENA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (sintético)

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: Homo sapiens 10 (G) TIPO DE CÉLULA: placenta

(ix): CARACTERÍSTICA:

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

(B): LOCALIZACIÓN: 1..1239

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 412 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 2151 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B) CLON: pacesol

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1591 pares de base 5 (B) TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(vi): FUENTE ORIGINAL: 10 (A) ORGANISMO: Homo sapiens

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imagen4

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(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B) CLON: sPSL.Fc

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:

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REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patentes citados en la descripción

 Patente de Estados Unidos Nº 4.675.285

 WO 92/09698

 U.S. de Nº de Serie 07/885.972.

 WO 92/09698

 U.S. de Nº Serie 07/885.972,

 Patente de Estados Unidos Nº 4.235.871

 Patente de Estados Unidos Nº 4.501.728

 Patente de Estados Unidos Nº 4.837.028

 Patente de Estados Unidos Nº 4.737.323.

 Patente de Estados Unidos Nº U.S. 4.752.569

Literatura diferente de patentes citadas en la descripción

 Moore et al., J. Cell Biol. 118, 445-456 (1992)  H. U. Saragovi, et al., Bio/Technology 10, 773-778 (1992)  R. S. McDowell, et al., J. Amer. Chem. Soc. 114. 9245-9253 (1992)  S. J. Collins, et al., Nature 270, 347-349 (1977)  Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991)  R. Kaufman, Methods in Enzymology 185, 537-566 (1990)  A. M. W. van den Ouweland et al., Nucl. Acids Res. 18, 664 (1990)  R. P. Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963)  J. L. Krstenansky, et al, FEBS Lett. 211, 10 (1987)  R. Kaufman et al, J. Mol. Cell. Biol. 9, 946-958 (1989)  J. Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York, Cold Spring Harbor Laboratory Press,

pl. 90 (1989)  B. Hirts, J. Mol. Biol., 26, 365-369 (1967)  M. Horwitz et al, Mol. Appl. Genet., 2: 147-149, (1983)  L. Sompeyrac y K. Dana, Proc. Natl. Acad. Sci., 78: 7575-7578 (1981)  M. Lopata et al, Nucleic Acid Res, 12: 5707-5717, (1984)  H. Luthman y G. Magnuson, Nucleic Acids Res., 11: 1295-1308, (1983)  G. Larsen et al, J. Biol. Chem 267: 11104-11110, (1992)  Campbell, C. y Stanley, P. Cell 35: 303-309 (1983)  Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220 (1980)  Goding, J. W. J. Immunol. Methods 10: 61-66 (1976)

 Kaufman, et al, PNAS (USA) 83: 3136-3140 (1986)  Aruffo et al. Cell 67, 35-44 (1991)  Larsen et al., J. Biol. Chem. 267, 11104-11110 (1992)  Maina, C. V. et al., Gene 74, 365-373 (1988)  Riggs, P., en Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausebel et al., Eds., Greene Associates/Wiley

Interscience (Nueva York, 1990) capitulo 16.6.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un fragmento de proteína ligando de P-selectina que tiene actividad de ligando de P-selectina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: a) del aminoácido 21 al aminoácido 54 de la SEC ID Nº: 1 b) del aminoácido 55 al aminoácido 127 de la SEC ID Nº: 1 c) del aminoácido 128 al aminoácido 267 de la SEC ID Nº: 1 d) del aminoácido 268 al aminoácido 308 de la SEC ID Nº: 1 e) del aminoácido 309 al aminoácido 333 de la SEC ID Nº: 1 f) del aminoácido 334 al aminoácido 402 de la SEC ID Nº: 1

g) del aminoácido 43 al aminoácido 56 de la SEC ID Nº: 1 h) del aminoácido 1 al aminoácido 310 de la SEC ID Nº: 1
2.

El fragmento de la proteína ligando de P-selectina que comprende del aminoácido 43 al aminoácido 56 de la SEC ID Nº: 1, en el que una o más de las tirosinas en el aminoácido 46, aminoácido 48 y/o aminoácido 51 está sulfatada.
3.

El ligando de P-selectina de la reivindicación 1, en el que el ligando de P-selectina está en forma lineal.
4.

El fragmento de ligando P-selectina de la reivindicación 1, en el que el ligando de P-selectina está en forma cíclica.
5.

Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica uno de los fragmentos de ligando de P-selectina de la reivindicación 1.
6.

Un anticuerpo que reacciona específicamente con el ligando de P-selectina, en el que la secuencia de la proteína ligando de P-selectina consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

a) del aminoácido 42 al aminoácido 56 de la SEC ID Nº: 1; y b) del aminoácido 127 al aminoácido 138 de la SEC ID Nº: 1.
7.

Un plásmido que codifica un ligando de P-selectina que comprende una secuencia de acuerdo con la SEC ID Nº: 1.
8.

El plásmido de la reivindicación 7, en el que dicho plásmido es pMT21:PL85.
9.

Un anticuerpo de la reivindicación 6 que reacciona específicamente con la proteína ligando de P-selectina, para usarse para el tratamiento de una afección caracterizada por la adhesión mediada por P-selectina.
10.

Uso de un anticuerpo de la reivindicación 6 que reacciona específicamente con la proteína ligando de Pselectina, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar una afección caracterizada por una adhesión mediada por P-selectina.
11.

Un anticuerpo de la reivindicación 6 que reacciona específicamente con proteína ligando de P-selectina para usar para el tratamiento o diagnóstico de enfermedades inflamatorias o cáncer.
12.

Uso de un anticuerpo de la reivindicación 6, que reacciona específicamente con proteína ligando de Pselectina, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar o diagnosticar enfermedades inflamatorias o cáncer.
13.

El anticuerpo de las reivindicaciones 9 u 11 para el uso especificado en la presente memoria, o el uso de las reivindicaciones 10 ó 12, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
14.

Una proteína de fusión que comprende:

a) una primera secuencia de aminoácidos seleccionada de: del aminoácido 21 al aminoácido 54 de la SEC ID Nº: 1; del aminoácido 55 al aminoácido 127 de la SEC ID Nº: 1; del aminoácido 128 al aminoácido 267 de la SEC ID Nº: 1; del aminoácido 268 al aminoácido 308 de la SEC ID Nº: 1; del aminoácido 309 al aminoácido 333 de la SEC ID Nº: 1; del aminoácido 334 al aminoácido 402 de la SEC ID Nº: 1; del aminoácido 43 al aminoácido 56 de la SEC ID Nº: 1; y del aminoácido 42 al aminoácido 295 de la SEC ID Nº: 1; y

b) una segunda secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de una porción Fc de una inmunoglobulina.
15.

La proteína de fusión de la reivindicación 14, en la que la primera secuencia de aminoácidos comprende del aminoácido 43 al aminoácido 56 de la SEC ID Nº: 1.
16.

La proteína de fusión de la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en la que la inmunoglobulina es una molécula de IgG.
17.

La proteína de fusión de la reivindicación 16, en la que la IgG es IgG1.
18.

La proteína de fusión de la reivindicación 1 o la reivindicación 15, en la que la inmunoglobulina es una molécula 5 de IgM.
19.

La proteína de fusión de la reivindicación 15, en la que una o más tirosinas en el aminoácido 46, aminoácido 48 y/o aminoácido 51 de la primera secuencia de aminoácidos están sulfatadas.
20.

Un ADN que codifica la proteína de fusión de la reivindicación 14 o la reivindicación 15.
21.

Un plásmido que comprende un ADN que codifica una proteína de fusión de ligando de P-selectina soluble-Fc. 10 22. El plásmido de la reivindicación 21, en el que el plásmido es pED.PSL.Fc.