KR19990022954A

KR19990022954A - Ｐ-셀렉틴 리간드 및 관련 분자 및 방법

Info

Publication number: KR19990022954A
Application number: KR1019970709424A
Authority: KR
Inventors: 브라이언 시드; 타라 포야니
Original assignee: 어니스트 엠. 해데드; 더 제너럴 하스피털 코포레이션
Priority date: 1995-06-14
Filing date: 1996-06-11
Publication date: 1999-03-25
Also published as: AR003436A1; CZ401497A3; IL122590A0; ZA965032B; NO975862L; CA2224625A1; AU6272996A; TR199701620T1; EP0833650A1; JPH11508131A; NO975862D0; BR9608918A; EP0833650A4; WO1997000079A1; HUP9901131A2

Abstract

본원에 개시된 것은 시알일-Le^x결정인자 및 황산화 결정인자가 공유결합되고, 이들 결정인자들 중 적어도 하나가 분자상의 보통으로 존재하지 않는 부위(non-naturallyl occurring site)에 위치되어 있는 유기분자(organic molecule)이다. 특수한 P-셀렉틴 리간드 및 P-셀렉틴 리간드-항체 융합도 개시되어 있다. 이러한 분자들, 리간드들, 및 융합 단백질들은 염증 및 기관 손상 및 응괴(예컨대, 성인 호흡곤란 증후군 또는 허혈성 심근 외상)와 같은 관외유출-의존성 부반응을 경감시키거나 이로부터 보호하는 방법에서 효용을 갖는다.

Description

Ｐ-셀렉틴 리간드 및 관련 분자 및 방법

[연방정부 후원 연구에 관한 성명]

본 발명은 NIH 인가 DK43031하에 연반정부의 후원에 의해 성안되었으므로, 정부는 본 발명에 대하여 일정한 권리를 갖는다.

본 발명은 P-셀렉틴 리간드(P-Selectin ligand) 분자들, DNA, 및 그들의 용도에 관계한다.

P-셀렉틴은 내피세포의 와이벨 팔라데체(Weibel-Palade bodies) 및 혈소판의 알파 과립(alpha granules)내에서 발견된 막내 C-타입 렉틴(integral membrane C-type lectin)이다 (McEver et al., J. Clin. Invest., 84:92-99, 1989; Bonfanti et al., Blood, 73:1109-1112, 1989; Hsu-Lin et al., J. Biol. Chem., 259:9121-9126, 1984; Stenberg et al., J. Cell Biol. 101:880-886, 1985). 그의 혈장막으로의 이동(translocation)은 비만세포(mast cell) 활성화, 보체(complement) C5b-9 복합체, 또는 C5a 단편, 과산화물, 및 산화된 저밀도 지단백질에 의해 방출된 트롬빈, 히스타민, 및 다른 전달물질(mediators)의 의해 유도될 수 있다 (Hsu-Lin et al., J. Biol. Chem., 259:9121-9126, 1984; Stenberg et al., J. Cell Biol. 101:880-886, 1985; Hattori et al., J. Biol. Chem., 264:9053-9060, 1989; Kubes and Kanwar, J. Immunol., 152:3570-3577, 1994; Thorlacius et al., Biochem. Biophys. Res. Communications, 203:1043-1049, 1994; Foreman et al., J. Clin. Invest., 94:1147-1155, 1994; Patel et al., J. Cell Biol., 112:749-759, 1991; Lehr et al., Laboratory Invest., 71:380-386, 1994; Gebuhrer et al., Biochem. J., 306:293-298, 1995). 일단 세포 표면상에 디스플레이되면, P-셀렉틴은 혈소판 또는 내피세포에 대한 골수단핵구(myelomonocyte)의 부착을 지원한다 (Larsen et al., Cell, 59:305-312, 1989; Hamburger and McEver, Blood, 75:550-554, 1990; Geng et al., Nature, 343:757-760, 1990; Gamble et al., Science, 249:414-417, 1990). 후자의 세팅에서, 그의 출현은 하부 조직 손상을 알리고 백혈구 관외유출(leukocyte extravasation)의 초기 단계인, 후모세관정맥 벽(postcapillary venule wall)을 따른 호중구의 롤링(rolling)을 지원한다 (Lawrence and Springer, Cell, 65:859-873, 1991). P-셀렉틴 구조 유전자에 동형접합 결함이 있는 마우스에서는 백혈구의 롤링이 감소되었고 실험적으로 유발된 염증 부위에 대한 과립구(granulocyte)의 모집이 지연되었다 (Mayadas et al., Cell, 74:541-554, 1993). 일반적으로, P-셀렉틴 발현을 유발하는 전달물질은 외상(trauma) 또는 부상(wounding)의 신호(signaling)에 관련된다. 조직 외상에 대해 최초로 인식된 반응들 중의 하나는 히스타민, 세로토닌, 및 기타의 확산가능한 전달물질(diffusible mediators)의 분비를 수반하는 비만 세포 활성화(mast cell activation)이다. 다른 일반적인 이벤트는 혈관 파열 부위의 혈전 생성(thrombus formation) 및 외래 소체(foreign bodies)에 의한 보체 선택 경로의 관여(complement alternative pathway engagement)를 포함한다. P-셀렉틴 발현은 이들 각각의 경우에 생성된 신호에 의해 유발된다. P-셀렉틴 매개 호중구 롤링의 유발이 외과적 개입(surgical intervention)의 불가피한 결과라고 생각되었지만, 비만세포 탈과립화를 차단하는 약제인, 크로몰린은 이러한 롤링을 방해하는 것으로 나타나, 외상 및 관외유출 사이의 링크로서의 비만세포의 역할이 훌륭하게 입증되었다 (Kubes and Kanwar, J. Immunol., 152:3570-3577, 1994).

[발명의 요약]

첫 번째 양상에서, 본 발명은 시알일-Le^x결정인자(sialyl-Le^xdeterminant), 및 황산화 결정인자(sulfated determinants)가 공유결합되어 있고, 이들 결정인자들 중 적어도 하나가 분자상의 보통으로 존재하지 않는 부위(non-naturallyl occurring site)에 위치되어 있는 유기분자(organic molecule)를 특징으로 한다.

두 번째 양상에 있어서, 본 발명은 (a) 도 8a의 아미노산 21-57 및 (b) 도 8a의 아미노산 38-57로 필수적으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 P-셀렉틴 리간드를 특징으로 한다.

세 번째 양상에 있어서, 본 발명은 항체 도메인(예컨대, 힌즈, CH2, 및 CH3 도메인들 중 하나 이상)에 연결된 P-셀렉틴 리간드를 포함하는 융합 단백질을 특징으로 한다.

관련 양상에 있어서, 본 발명은 시알일-Le^x결정인자(sialyl-Le^xdeterminant), 및 황산화 결정인자(sulfated determinants)에 대한 부착 부위를 포함하고, 이들 결정인자들 중 적어도 하나가 단백질상의 보통으로 존재하지 않는 부위(non-naturallyl occurring site)에 위치되어 있는 단백질을 코드화하는 정제된 핵산; 본 발명의 P-셀렉틴 리간드들 중의 임의의 것을 코드화하는 정제된 핵산; P-셀렉틴-항체 융합 단백질을 코드화하는 정제된 핵산; 및 이들 핵산들중 임의의 것을 포함하는 벡터 및 재조합 세포를 특징으로 한다. 또한 P-셀렉틴 리간드들 또는 이러한 리간드들(바람직한 경우, 항체 또는 α₁-산 당단백질(acid glycoprotein) 도메인과 같은 다른 단백질들과 함께)을 포함하는 유기분자들을 후술하는 이환상태들 중 임의의 것의 치료를 위한 약물의 제조에 이용하는 방법도 본 발명에 포함된다.

다른 관련 양상에 있어서, 본 발명은 시알일-Le^x결정인자 및 황산화 결정인자를 포함하는 분자 또는 세포에 대한 P-셀렉틴 단백질을 포함하는 세포의 결합을 억제하는 방법을 특징으로 한다. 본 발명은 P-셀렉틴 단백질-포함 세포를 시알일-Le^x결정인자 및 황산화 결정인자를 포함하고, 이들 결정인자들 중 적어도 하나가 분자상의 보통으로 존재하지 않는 부위에 위치되어 있는 유기분자들; P-셀렉틴-항체 융합 단백질; 또는 본 발명의 P-셀렉틴 리간드들 중 임의의 것과 접촉시키는 과정을 포함한다.

다른 관련 양상에 있어서, 본 발명은 환자에게 치료 유효량의 시알일-Le^x결정인자 및 황산화 결정인자를 포함하고, 이들 결정인자들 중 적어도 하나가 분자상의 보통으로 존재하지 않는 부위(non-naturallyl occurring site)에 위치되어 있는 유기분자들; P-셀렉틴-항체 융합 단백질; 또는 본 발명의 P-셀렉틴 리간드들 중 임의의 것을 투여하는 과정을 포함하는 포유동물의 염증을 경감시키는 방법을 특징으로 한다.

본 발명의 더욱 더 다른 관련 양상에 있어서, 본 발명은 포유동물의 관외유출-의존성 부반응(extravasation-dependent adverse reaction)[관외유출-의존성 기관 손상 및/또는 성인 호흡곤란증후군, 사구체신염, 및 허혈성 심근 외상과 관련된 응괴(clotting)를 포함하나, 반드시 이들로 국한되는 것은 아님)을 경감시키거나 이로부터 보호하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 포유동물에게 치료 유효량의 시알일-Le^x결정인자 및 황산화 결정인자가 공유결합되어 있고, 이들 결정인자들 중 적어도 하나가 분자상의 보통으로 존재하지 않는 부위에 위치되어 있는 유기분자들; P-셀렉틴-항체 융합 단백질; 또는 본 발명의 P-셀렉틴 리간드들 중 임의의 것을 투여하는 과정을 포함한다.

마지막 양상에 있어서, 본 발명은 포유동물에게 치료 유효량의 시알일-Le^x결정인자 및 황산화 결정인자가 공유결합되어 있고, 이들 결정인자들 중 적어도 하나가 분자상의 보통으로 존재하지 않는 부위에 위치되어 있는 유기분자들; P-셀렉틴-항체 융합 단백질; 또는 본 발명의 P-셀렉틴 리간드들 중 임의의 것을 투여하는 과정을 포함하는 포유동물의 부면역반응(adverse immune reaction)을 경감시키거나 이로부터 포유동물을 보호하는 방법을 특징으로 한다. 바람직하게, dl 방법은 미생물 인자(microbial factor)에 의해 유발된 포유동물의 부면역반응을 치료하는 과정을 포함한다. 이러한 미생물 인자들은 그람-음성 세균 지다당류(LPS), 그람-양성 유기체로부터의 펩티도글리칸, 진균류 세포벽으로 부터의 만난(mannan), 다당류, 세포외 효소(예컨대, 스트렙토키나제) 및 독소(예컨대, 포도상구균의 독성 쇼크 엔테로톡신)를 포함하나, 반드시 이들로 국한되는 것은 아니다. 다른 바람직한 실시양태에 있어서, 상기 방법은 숙주 인자(host factor)에 의해 유발된 포유동물의 부면역반응을 치료하는 과정을 포함한다. 이러한 숙주 인자들은 보체의 대사산물, 키닌, 및 응고 시스템(coagulation system), 자극된 세포로부터 방출된 인자들(예컨대, 인터루킨 1 (IL-1) 및 종양괴사인자-α(TNF)와 같은 싸이토카인), 다형핵 백혈구(PMNs; polymorphonuclear leukocyte)로부터의 효소 및 옥시던트, 바소펩타이드(예컨대, 히스타민) 및 아리키돈산의 대사산물을 포함하나 반드시 이들로 국한되는 것은 아니다. 다른 바람직한 실시양태에 있어서, 부면역반응은 재조합 TNF-α에 의해 유도되거나 재조합 IL-1에 의해 유도된다. 또 다른 바람직한 실시양태에 있어서, 부면역반응은 패혈증성 쇼크 또는 패혈증이다.

상술한 양상의 바람직한 실시양태에 있어서, 유기분자 또는 단백질은 시알일-Le^x결정인자를 포함하는 세포에 대한 E-셀렉틴(ELAM-1) 포함 세포의 결합도 억제하여, E-셀렉틴-매개 염증, 관외유출-의존성 부반응, 및 부면역반응을 억제한다; 시알일-Le^x결정인자 및 황산화 결정인자들은 도 8a의 아미노산 21-57(예컨대, 도 8a의 아미노산 38-57)로 필수적으로 구성되는 P-셀렉틴 리간드상에 존재한다; 시알일-Le^x결정인자는 N-링크 또는 O-링크되어 있다; 분자 또는 단백질은 다수의 시알일-Le^x결정인자 및/또는 다수의 황산화 인자들을 포함한다; 유기분자는 단백질(예컨대, 항체(예컨대, IgG 또는 IgM), α₁-산 당단백질(AGP) 또는 항체 융합 단백질(예컨대, AGP-항체 융합 단백질)이다; 단백질은 본원에 기술된 P-셀렉틴 리간드들중의 어느 하나(예컨대, 단백질의 아미노-말단)가 부가된 항체, AGP 또는 항체 융합 단백질(예컨대, AGP-항체 융합 단백질)이다; 항체 또는 항체 융합 단백질(예컨대, AGP-항체 융합 단백질)은 항체 부분으로 IgG1 CH2, CH3 및/또는 힌즈 도메인을 포함한다; 항체, AGP, 또는 항체 융합 단백질은 하나 이상의 α₁-산 당단백질의 N-링크 글리칸 부가 부위를 포함한다; 분자의 항체 부분은 하나 이상의 보통으로 존재하지 않는 시알일-Le^x결정인자들을 갖는다; 시알일-Le^x결정인자는 보체를 고정하거나 Fc 수용체에 결합하는 항체의 능력을 방해한다(예컨대, 도 10a-e에 도시된 서열의 하나 이상의 아미노산 274, 287 또는 322에 부착된 시알일-Le^x결정인자로 인해); 그리고 유기분자는 가용성이다.

본원에서 이용될 때 P-셀렉틴 리간드는 P-셀렉틴 수용체와의 상호작용을 매개할 수 있는 임의의 아미노산 서열을 의미하고 P-셀렉틴-카운터 수용체(P-selectin counter-receptors)로 불리우는 단백질들을 포함한다. 바람직한 P-셀렉틴 리간드들은 제한없이 도 8a의 아미노산 21-57을 포함하고, 더욱 바람직하게는 아미노산 38-57을 포함한다. 본 발명에 따른 P-셀렉틴 리간드들은 본 발명에 유용한 융합 단백질을 제조하기 위해 추가의 단백질 도메인들(예컨대, 항체 도메인)과 함께 이용될 수 있다.

본원에서 사용될 때, 보통으로 존재하지 않는(non-naturally occurring)다는 것은 시알일-Le^x결정인자 및 황산화 결정인자가 분자의 그 아미노산의 본래 위치에 보통으로 결합되어 있는 것이 아님을 의미한다.

본원에서 이용될 때, 염증(inflammation)이란 함은 외상 또는 물리적, 화학적 또는 생물학적 작용제에 의해 유발된 외적 자극에 반응하여 병에 걸린 혈관 및 인접 조직에서 일어나는 세포학적 및 조직학적 반응으로 구성되는 병적 과정(pathologic process)을 의미한다. 본원에서 이용될 때, 염증은 임의의 만성 염증 반응(예컨대, 류마티스성 관절염, 건선(psoriasis) 또는 심상성천포창(pamphigus vulgaris))은 물론 임의의 급성 염증 반응(예컨대, 성인 호흡곤란증후군 또는 허혈성 심근 외상중의 또는 그 이후의)을 포함한다.

본원에서 이용될 때, 정제된 핵산(purified nucleic acid)이란 본 발명의 DNA가 유래되는 유기체의 보통으로 존재하는 게놈내에서 그 유전자에 측접하는 유전자를 포함하지 않는 DNA를 의미한다. 따라서 이 용어는, 예를 들어, 벡터내; 자가복제 플라스미드 또는 바이러스내; 또는 진핵세포 또는 원핵세포의 게놈성 DNA내에 혼입되거나; 또는 다른 서열과는 독립되어 별도의 분자로 존재하는 (예컨대, PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 절단에 의해 만들어진 cDNA 또는 게놈 또는 cDNA 단편) 재조합 DNA를 포함한다. 그것은 또한 추가의 폴리펩타이드 서열을 코드화하는 잡종 유전자(hybrid gene)의 일부인 재조합 DNA도 포함한다.

N-링크된이란 단백질의 아스파라긴 잔기의 아미드 질소에 결합되어 있는 것을 의미한다.

O-링크된이란 단백질의 세린, 트레오닌, 또는 히드록시리신 잔기의 히드록시기 산소에 결합되어 있는 것을 의미한다.

관외유출-의존성 부반응(extravasation-dependent adverse reaction)이라 함은 숙주에게 해롭고 염증, 조직 손상, 또는 혈전 생성 부위 또는 그 부근의 내피에 대한 호중구의 부적절한 부착으로 부터 직접 또는 간접적으로 기인되며, 이러한 호중구의 부착된 혈관 또는 기관으로의 이동을 초래하는 임의의 반응을 의미한다. 이러한 손상에 의해 침범될 수 있는 기관은 심장, 폐 및 신장을 포함하지만, 반드시 이들로 국한되는 것은 아니다.

부면역반응(adverse immune reaction)이란 면역세포(예컨대, 임의의 B 세포, T 세포, 단핵구/대식세포, 자연살세포(natural killer cell), 비만세포, 호염기구, 또는 과립구)에 의해 매개되는 숙주에 해로운 임의의 반응을 의미한다.

도 1a는 PSGL-1 결실 돌연변이체의 구조의 개략도이다. PSGL-1의 엑토도메인의 조직적인 결실(systematic deletion)은 종래의 PCR 방법에 의해 이루어졌다. 대표적인 10-잔기 반복(점각된; 서열 1) 및 막간 도메인(교차된 평행선 무늬)을 도시하였다. 도 1b는 도 1a에 도시된 결실을 발현하는 트랜스펙션된 COS 세포의 P-셀렉틴 결합 활성을 나타낸 막대그래프이다.⁵¹Cr-표지된 세포들을 마이크로타이터 웰에 흡착된 가용성 P-셀렉틴에 부착하도록 방치하였다. 세포들을 세정하고나서 결합된 세포들을 용해시키고⁵¹Cr 레벨을 카운팅하였다. 결실 구조물들을 사람 FTVII 푸코실트랜스페라제의 부재(막대 2) 또는 존재(나머지 7 막대들)하에서 세포내로 도입시켰다.

도 2a는 PSGL-1 및 CD43의 키메라의 개략도이다. PSGL-1의 막 근위 세포외 도메인(membrane proximal extracellular domain), 막간 도메인 및 세포내 도메인들을 CD43의 동족 서열(cognate sequence)들로 대체하였다. 그 결과로서 수득되는 분자는 시스테인이 결여되어 이황화 결합된 이합체를 형성할 수 없다. 도 2b는 도 2a에 도시된 키메라를 발현하는 트랜스펙션된 COS 세포들의 P-셀렉틴 결합 활성을 나타낸 막대그래프이다. FTVIIh, 사람 FTVII 푸코실트랜스페라제와 함께 공동트랜스펙션(cotranfection).

도 3a는 완전하거나 절두된(truncated) 뮤신 C-말단에 부착된 PSGL-1 정상 도메인(apical domain)을 포함하는 키메라 뮤신의 개략도이다. PSGL-1 N-말단 (점각된; 서열 1) 및 막간(TM) 도메인 (교차된 평행선 무늬)이 예시된다. PSGL-1-NH₂/CD43 반복부위는 서열 2에 의해 묘사된다. PSGL-1은 추론된 성숙한 CD34 및 GlyCAM-1 분자들의 N-말단 및 CD43의 반복부위의 N-말단에 융합되었다. 도 3b는 도 3a에 도시된 구조물을 발현하는 트랜스펙션된 COS 세포의 P-셀렉틴 결합 활성을 나타낸 막대그래프이다. FTVIIh, 사람 FTVII 푸코실트랜스페라제.

도 4a는 PSGL 결실 돌연변이체들의 개략도이다. 아미노 말단 도메인은 다양한 수의 반복 요소를 갖는 PSGL 분자에 부착되었다. 도 4b는 도 4a에 도시된 키메라를 발현하는 트랜스펙션된 COS 세포들의 P-셀렉틴 결합 활성을 나타낸 막대그래프이다.

도 5는³⁵S-황산염에 의해 표지되고 환원조건하의 8% 변성 폴리아크릴아마이드 겔 상에서 전기영동된 뮤신:면역글로불린 융합 단백질의 방사능사진으이 사진이다. 레인 A는 CDM8 트랜스펙션된 세포들의 상청액이고; 레인 B는 Ig 발현 벡터(뮤신 삽입물 불포함)에 의해 트랜스펙션된 세포의 상청액; 레인 C는 PSGL-1:Ig를 발현하는 세포의 상청액; 레인 D는 CD43:Ig를 발현하는 세포의 상청액; 레인 E는 CD34:Ig를 발현하는 세포의 상청액; 레인 F는 GlyCAM-1:Ig를 발현하는 세포의 상청액이다.

도 6a 및 도 6b는 10 mM NaClO₃의 존재 또는 부재하에서의 푸코실트랜스페라제와 함께 또는 없이 PSGL-1을 발현하는 COS 세포들의 고정된 P-셀렉틴 및 E-셀렉틴에대한 결합을 나타낸 막대그래프이다. 도 6a는 P-셀렉틴에 대한 세포들의 결합을 나타낸 막대그래프이다. 도 6b는 E-셀렉틴에 대한 세포들의 결합을 나타낸 막대그래프이다.

도 7은 10 mM NaClO₃의 존재 또는 부재하에서³⁵S-황산염에 의해 표지되고 환원조건하의 8% 변성 폴리아크릴아마이드 겔 상에서 전기영동된 PSGL-1:면역글로불린 융합 단백질의 방사능사진의 사진이다. 사진은 염소산염이³⁵S-황산염의 가용성 뮤신 키메라내로의 혼입을 억제한다는 것을 보여준다. 레인 A는 염소산염이 존재하지 않는 상태에서 CDM8 트랜스펙션된 세포들의 상청액; 레인 B는 염소산염이 존재하지 않는 상태에서 PSGL-1:Ig를 발현하는 세포의 상청액; 레인 C는 염소산염이 존재하는 상태에서의 CDM8의 상청액; 레인 D는 염소산염이 존재하는 상태에서의 PSGL-1:Ig를 발현하는 세포의 상청액이다.

도 8a는 다양한 PSGL-1 결실 돌연변이체들의 서열 종점(endpoint)[화살표로 표시]의 리스트이다. 맨위의 서열은 서열 3이고; 중간 서열은 서열 13이며; 맨아래의 서열은 서열 14이다. 도 8b는 도 8a에 도시된 종점을 갖는 결실 돌연변이체들을 발현하는 트렌스펙션된 COS 세포의 P-셀렉틴 결합 활성을 나타낸 막대그래프이다.

도 9a는 결실된 PSGL-1 또는 CD43에 대한 PSGL-1 잔기 38-57의 야생형 또는 돌연변이 변이체들의 부착의 효과를 측정하기 위해 이용된 구조물의 개략도이다. 삽입된 서열은 좌측하단에 도시하였다. 도 9b는 도 9a에 도시된 키메라를 발현하는 트랜스펙션된 COS 세포의 P-셀렉틴 결합 활성을 나타낸 막대그래프이다.

도 10a-e도는 IgG1(서열 9)를 코드화하는 뉴클레오티드 서열(서열 8) 및 N-링크 글리칸 부가 부위(서열 12)를 만들기 위해 설계된 돌연변이의 리스트이다.

도 11a 및 도 11b는 AGP-IgG1 융합 단백질의 뉴클레오티드 서열(서열 10)이고, 도 11c는 아미노산 서열(서열 11)이다.

도 12a는 완전한 PSGL-1(서열 4) 또는 사람 IgG1의 힌즈, CH2, 및 CH3에 연결된 20 잔기 펩타이드로 구성되는 면역글로불린 융합 단백질의 개략도이다. 구조물 Y/F-hIgG1은 서열 5를 포함하고; 구조물 T/AhIgG는 서열 6을 포함하며; 구조물 Y/F-T/A-hIgG1은 서열 7을 포함한다. 도 12b는 COS 세포내로의 트랜스펙션 이후의 도 12a에 도시된 융합 단백질에 의한 [³⁵S]시스테인 및 메치오닌의 혼입을 평가하기 위해 이용된 8% 변성 폴리아크릴아마이드 겔의 사진이다. 레인 A는 CDM8 대조군에 의해 트랜스펙션된 세포들의 상청액이고; 레인 B는 PSGL-1:면역글로불린 융합 단백질에 의해 트랜스펙션된 세포의 상청액; 레인 C는 WT-hIgG에 의해 트랜스펙션된 세포의 상청액; 레인 D는 Y/F-hIgG에 의해 트랜스펙션된 세포의 상청액; 레인 E는 T/A-hIgG에 의해 트랜스펙션된 세포의 상청액; 레인 F는 Y/F-T/A-hIgG에 의해 트랜스펙션된 세포의 상청액이다. 도 12c는 COS 세포의 트랜스펙션 이후의 도 12a에 도시된 융합 단백질에 의한 [³⁵S]황산염의 혼입을 평가하기 위해 이용된 8% 변성 폴리아크릴아마이드 겔의 사진이다. 또한, 아미노-말단 부가물(amino-terminal addition)을 포함하지 않는 대조군 융합 단백질도 포함되었다(레인 B). 레인 C 내지 G는 도 12b의 레인 B 내지 F에 해당한다.

도 13은 상호작용 HL-60 세포/영상-포착 필드(video-captured field)의 막대 그래프이다. 세포들은 P-셀렉틴-면역글로불린 키메라 또는 CD4-면역글로불린 키메라 대조군에 의해 예비-코팅된 평행 플레이트 유량 쳄버(parallel plate flow chamber)내에 주입되었다. 세포들에 0.75dynes/㎠의 전단응력을 가하였다. 각각의 막대는 15초 간격으로 취한 8개의 프레임으로부터의 평균 세포수(±SEM)/필드를 나타낸다. 세포 롤링 또는 유동은 영상 이미지에 줄무늬로 보인다. 막대들은 좌측으로부터 우측으로 다음을 나타낸다: P-셀렉틴-면역글로불린 키메라 위를 롤링하거나 유동하는 HL-60 세포들, 10 mM 염소산나트륨을 포함하는 황산염이 없는 배지로 예비처리된 HL-60 세포들, 및 CD4-면역글로불린 위를 유동하는 HL-60 세포들.

먼저 도면에 관하여 간단히 설명한다.

시알일-루이스 X (시알일-Le^x) 및 황산화 결정인자들은 후술하는 실험에 의해 P-셀렉틴과 상호작용하여 결합을 촉진하는 것으로 입증되었다. 이러한 실시예들은 단지 설명의 목적을 위해 제공되는 것으로 본 발명을 제한하는 것은 아니다. 이하의 실험에서 이용된 방법들에 대해서 먼저 설명한다.

가용성 P-셀렉틴의 제조

P-셀렉틴 및 E-셀렉틴 Ig 키메라들은 사람 IgG1의 힌즈, CH2, 및 CH3 도메인들에 연결된 P-셀렉틴의 렉틴(lectin), EGF-관련, 및 처음 두 개의 짧은 공통 반복부위(first two short consensus repeat)를 코드화하는 발현 플라스미드의 COS 세포 내에서의 일시적인 발현에 의해 제조되었다 (Aruffo et al., EMBO. J., 6:3313-3316, 1991; Walz et al., Science, 250:1132-1135, 1990). PSGL-1 cDNA 코드화 서열은 HL-60 cDNA 도서관의 PCR 증폭에 의해 수득되었고 서열은 DNA 서열결정법에 의해 확인되었다. 성숙한 세포외, 막간, 및 세포내 도메인의 코드화 분절(coding segment)은 폴리오마 바이러스(polyoma virus)의 복제기점이 없고 인플루엔자 헤마글루티닌(flu) 펩타이드(Field et al., Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165, 1988) 에피톱 택(epitope tag)의 코드화 부위의 직상류에 위치된 CD5 항원에 대한 리더 서열(leader sequence)을 포함하는 CDM8에 기초한 발현 벡터내에 삽입되었다.

PSGL-1 결실의 구성

아미노 말단 PSGL-1 결실 구조물들은 프레임 2 (Leu 및 Asp 코드화)에 있는 XbaⅠ 부위의 하류에 위치된 결실 돌연변이체의 목적 종점을 코드화하는 프라이머를 이용하여 PCR 증폭에 의해 제조되었다. 그 결과로서 수득된 서열들은 후술하는 잔기들이 Xba 부위의 아스파르트산 (D) 바로 다음에 오는 폴리펩타이드를 코드화하였다: PSGL-1 전구체의 A118, A128, A138, A148, A158, A168, G178, A188, A198, A208, A218, A228, A238, A248, A258, 및 T268. 이어서 PCR 단편들은 완전한 PSGL-1의 발현을 위해 이용된 CD5 리더 flu 택 발현 벡터내에 삽입되었다. flu 택은 상술한 프레임내의 XbaⅠ 부위에서 끝난다. flu 택 접합부(flu tag junction)에 있는 서열들이 확인되었고 발현은 간접적인 면역형광 현미경검사법 및 유동세포분석법(flow cytometry)에 의해 COS 세포에서 확인되었다. 프레임 1(글루탐산 페닐알라닌 코드화)내의 결실부위의 EcoRⅠ 부위에서의 일군의 내부 결실들은 우선 아미노 말단의 결실 돌연변이체들을 제조함으로써 만들어졌다(전구체의 펩타이드 서열의 A118, A128, A138, A148, A158, A168, G178, A188, A198, A208, A218, A228, A238, A248, A258에 해당하는 EcoRⅠ 부위의 페닐알라닌[F] 바로 다음의 잔기들). 이러한 각각의 결실 돌연변이체들에 PSGL-1 전구체 A117의 직하류 글루탐산 페닐알라닌 프레임에 있는 EcoRⅠ 부위로 끝나는 flu-택이 부착된 아미노-말단 PSGL-1 도메인이 부착되었다. 그 결과로서 수득되는 구조물은 A117과 상술한 여러 종점 사이의 결실을 포함하였다.

뮤신 도메인 교환(Mucin Domain Interchange)

CD34, CD43 및 GlyCAM-1 뮤신들은 성숙한 아미노 말단(CD34 또는 GlyCAM-1)에 또는 트레오닌/프롤린-풍부 반복부위의 시작 부분(CD43)에의 EcoRⅠ 부위의 부착에 의한 PSGL-1 아미노-말단 도메인의 부가를 위해 제조되었다. 상술한 바와 같이, EcoRⅠ 부위는 프레임 글루탐산 페닐알라닌내에 존재하였다(프레임 1). CD34 서열은 전구체의 잔기 F30에서 시작하였고, Gly-CAM-1는 전구체 L19에서 시작하였으며, CD43은 전구체 I135에서 시작하였다. 이들 각각에 위와 같이 EcoRⅠ 부위에서 끝나는 flu-택이 부착된 PSGL-1 도메인이 부착되었다. PSGL-1의 아미노 말단 및 반복 요소는 CD43 전구체의 서열 S225의 직상류에 위치된 글루탐산 페닐알라닌 프레임에 있는 EcoRⅠ 부위를 통해서 CD43의 막 근위, 막간 및 막내 도메인에 부착되었다. PSGL-1으로부터의 상보성 단편은 T267 까지의 전구체의 아미노-말단 잔기들에 상당하였다.

아미노-말단 도메인의 미세 구조 지도작성(Fine Structure Mapping)

유사한 방법을 이용하여 아미노-말단 도메인에서의 결실을 만들었는데, 여기서 PCR 생성 결실은 류신 아스파르트산 프레임(프레임 2)에 있는 XbaⅠ 부위를 갖는 프라이머를 이용하여 수행되었다. 아스파르트산을 코드화하는 잔기의 직하류(immediately downstream)는 전구체 R38, E58, P78, 및 A98에 상당하는 PSGL-1 서열들이었다. 아미노-말단 도메인의 정의상, 트레오닌 또는 티로신 잔기들을 알라닌 또는 페닐알라닌으로 돌연변이시키기 위해 표시된 대로 서열이 변경된 38과 57 사이의 잔기들에 상당하는 2본쇄 올리고뉴클레오티드들이 합성되었다. 모든 구조물들은 디데옥시 서열결정법에 의해 확인되었다.

세포 접착 분석법 (Cell Adhesion Assays)

트랜스펙션한 후 48 내지 60 시간이 경과한 후에 0.5 mM EDTA/PBS에 의해 트랜스펙션된 세포들을 배양 접시로부터 떼어내었다. 이어서 세포들을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 0.9% NaCl+100 ㎖ 배지내에 100 ㎕⁵¹CrO₄(1 mCi/㎖; Dupont, Boston, MA)와 함께 로딩되었다. 로딩된 세포들은 PBS로 2회 세정되었고 0.2% BSA, 0.15 M NaCl, 3 mM CaCl₂에 재현탁되었다. 표지된 염소산염의 동일한 배치에 의해 동시에 제조된 세포들 사이의 표지 속도[labelling rate](혼입된 카운트/세포)상의 차이는 일반적으로 최소한이었다. 표지된 세포들은 습기조절 쳄버에서 친화성 정제된 염소 항-사람 IgG 항체(100 ㎕의 20 ㎍/㎖ 항-사람 IgG Fc(중쇄 특이적)/PBS)에 의해 코팅된 96-웰 마이크로컬처 플레이트의 각 웰에서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션되었다. 플레이트를 PBS로 2회 세정하고나서, 추가의 단백질-결합 부위들을 밤새 200㎕ 3% BSA/PBS로 인큐베이션하여 블로킹하였다. 플레이트를 PBS로 4회 세정하고 2시간 동안 200 ㎕의 융합 단백질 상청액과 함께 인큐베이션하였다. PBS로 3회 세정하고나서 추가 한 번 (0.2% BSA, 0.15 M NaCl, 3 mM CaCl₂로) 세정하고, 2×10⁵세포들/웰(200㎕의 0.2% BSA, 0.15 M NaCl, 3 mM CaCl₂)을 첨가하여 플레이트를 회전 플래트포옴상에서 회전시키면서(80 rpm) 실온에서 15분간 결합되도록 방치하였다. 웰들에 200㎕의 0.15 M NaCl/3 mM CaCl₂를 채우고 나서 플레이트를 거꾸로 뒤집어 3번 세정하였다. 접착 세포들을 200㎕의 2% SDS를 첨가하여 용해시키고, 표지된 염소산염을 감마선 분광계로 카운트하였다.

면역형광 분석법 (Immunofluorescence Analysis)

3% BSA를 포함하는 PBS내의 일차 단클론 항체들(복수(ascites)중의 1:200 희석물 또는 5 ㎍/㎖의 정제된 항체가 적합)과 함께 30 내지 45분간 인큐베이션함으로써 세포들을 세포혈구계산을 위해 준비하였다. 세포들을 PBS로 2회 세정하고 2㎍/㎖의 마우스 IgG(12CA5) 또는 마우스 IgM(CSLEX-1)에 대한 FITC-접합 친화성 정제된 항체들과 함께 PBS/3% BSA내에서 30분 내지 45분간 인큐베이션하였다. 이어서 세포들을 PBS로 2회 세정하여 분석하기 이전에 1 ㎖의 1% 새롭게 해중합된 파라포름알데히드/PBS에 재현탁시켰다. 면역형광 현미경분석을 위해, 트랜스펙션된 세포들을 4% 새롭게 해중합된 파라포름알데히드로 고정하고, 세정한 후 3% BSA/PBS에 30분간 노출시킨다음, 일차 항체(복수, 1:250)와 함께 30-45분간 인큐베이션하였다. 이어서 세포들을 PBS로 2회 세정하고 마우스 IgG(Cappell; 3% BSA를 함유하는 PBS내 2㎍/㎖)에 대한 FITC-접합 친화성-정제된 항체들과 함께 30-45분간 인큐베이션하였다. 끝으로, 세포들을 PBS로 2회 세정하여 분석하였다.

³⁵SO₄에 의한 대사적 표지(Metabolic Labeling)

트랜스펙션한 후 하루가 경과한 후에 뮤신:면역글로불린 키메라를 발현하는 발현 플라스미드에 의해 트랜스펙션된 COS 세포들을 트립신으로 처리하여 새로운 플레이트내의 완전 배지(10 우혈청을 포함하는 DMEM)로 옮겼다. 표지하기 이전에, 배지를 제거하고, 세포들을 PBS로 1회 세정하고나서 [³⁵S]시스테인 및 메치오닌(TransLabel, ICN)으로 표지하기 위해 시스테인 및 메치오닌이 없는 배지 또는³⁵SO₄로 표지하기 위해 황산염이 없는 CRCM-30 배지(Sigma, Chemical Co.)로 배지를 대체하였다. 혈청은 첨가되지 않았고 방사핵종은 일반적으로 200 μCi/㎖의 농도로 존재하였다. 12 내지 16 시간의 표지 간격후에, 상청액을 회수하고, 염소 항-사람 IgG 아가로오스(Cappel)에 대한 흡착에 의해 융합 단백질을 회수하였다. 흡착된 단백질을 환원 조건하에서 8% 폴리아크릴아마이드 겔 상에서 변성 전기영동하였다.

흡착의 염소산염 억제 (Chlorate Inhibition of Adhesion)

COS 세포들을 DEAE 덱스트란에 의해 트랜스펙션시켜 10% 우혈청 및 10 mM 염소산나트륨을 함유하는 DMEM내에서 즉시 인큐베이션하였다. 트랜스펙션 후 하루 경과한 후에 세포들을 트립신처리하고 새로운 접시의 동일한 배지내에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 배지를 제거하고 세포들을 PBS로 세정한 후, 10 mM 염소산나트륨의 존재하에서 황산염을 포함하지 않고 2%의 보통 농도의 시스테인 및 메치오닌을 포함하며 10% 투석된 우태아 혈청을 포함하는 주문 제작된 DMEM (Life Technologies) 배지내에서 추가 18시간 동안 인큐베이션하였다 (Baeuerle and Huttner, Biochem. Biophys. Res. Comm., 141:870-877, 1986). 그 다음으로 세포들을 흡착 및 면역형광 분석에 이용하기 위해 회수하였다. 대조군 세포들은 투석되지 않은 혈청을 포함하는 DMEM 배지에서 인큐베이션한 것을 제외하고는 유사하게 처리하였다.

HL-60 세포 롤링(HL-60 Cell Rolling)

37℃로 세팅된 온도조절 스테이지를 갖는 평행 플레이트 직사각형 유동 쳄버[parallel plate rectangular flow chamber](FCS2, Biotechs, Incorporated, Butler, PA)를 통한 HL-60 세포들 롤링의 영상 이미지를 2.5× 대물렌즈가 장착된 Zeiss ICM 405 도립 현미경에 탑재된 AIMS 테크날러지 (Bronx, NY) CCD 카메라에 의해 수득하였다. 쳄버 높이는 250㎛이었다. Harvard Apparatus(South Natick, MA) 모델 I/W 22 시린지 펌프에 의해 일정한 유량으로 세포들을 쳄버를 통해 빼내었다. 이미지들은 NIH Image를 이용하여 분석하였다. 황산화를 방지하기 위해서, HL-60 세포들을 PBS로 한 번 세정하여 상술한 바와 같은 2%의 보통 농도의 시스테인 및 메치오닌, 10 mM 염소산나트륨 및 투석된 혈청을 포함하는 황산염을 포함하지 않는 배지에서 18 시간 동안 생장시켰다. 각각의 실험을 위해, 10⁶세포들을 1 ㎖의 0.15 M NaCl, 3 mM CaCl₂에 현탁시켜 쳄버를 통과시켰다. 유리 커버슬립을 10 mM Tris-HCl (pH 9.0)내의 10㎍/㎖ 농도의 친화성-정제된 염소 항-사람 IgG 항체로 2시간 동안 코팅하고 PBS로 2회 세정한 후 0.2% BSA/PBS로 블로킹하였다. 이어서 처리된 커버슬립을 적당한 면역글로불린 키메라 발현 플라스미드에 의해 트랜스펙션된 COS 세포들의 상청액에 침지시킨 후, PBS로 2회 세정하고 유동 쳄버내에 모았다.

PSGL-1의 아미노 말단은 P-셀렉틴 결합에 필요하다

PSGL-1 뮤신의 아미노 말단의 결실들을 PCR 기술에 의해 만들었고, 그 결과로서 수득된 절두된 cDNA들을 인플루엔자 헤마굴루티닌(HA)으로 부터 유래된 짧은 올리고펩타이드에 융합된 분비성 펩타이드 서열의 하류에 삽입하였다. 절두된 분자들을 코드화하는 발현 플라스미드(도 1a)들을 sLe^x결정인자의 발현을 전적으로 지시하는 FTVII로 표기되는, 특이적인 골수양 푸코실트랜스페라제의 존재하에서 COS 세포내에 트랜스펙션시켰다 (Sasaki et al., J. Biol. Chem., 269:14730-14737, 1994; Natsuka et al., [J. Biol. Chem., 269:20806, 1994에서는 인쇄 오류가 보인다], J. Biol. Chem., 269:16789-16794, 1994). 세포 표면에서의 결실 돌연변이체들의 발현은 항-HA 단클론 항체들을 이용함으로써 간접적인 면역형광법에 의해 확인되었다. 세포 표면상의 sLe^x의 존재는 유사하게 단클론 항체 CSLEX-1을 이용하여 확인되었다. 방사능표지된 트랜스펙션된 세포들의 P-셀렉틴:면역글로불린 융합 단백질에 의해 예비코팅된 플라스틱 웰에 결합하는 능력을 측정하였다. 이러한 실험들에 의해 PSGL-1상의 아미노-말단 100 잔기들(본원에서 정상 도메인이라 한다)의 결실이 트랜스펙턴트의 고정된 P-셀렉틴에 대한 결합을 제거하기에 충분하다는 것이 밝혀졌다(도 1b). FTVII의 발현은 P-셀렉틴 결합에 요구되었기 때문에, 이러한 실험들은 sLe^x가 P-셀렉틴 결합을 매개한다는 사실도 증명한다 (도 1b; 막대 2와 막대 3 비교). 세포 표면에서의 결실 변이체들의 발현은 항-HA 단클론 항체들을 이용함으로써 간접적인 면역형광법에 의해 확인되었고, 세포 표면상의 sLe^x의 존재는 단클론 항체 CSLEX-1을 이용함으로써 확인되었다. 표 1은 사람 FTVIIh 및 결실 구조물들(도 1a에 도시된)에 의해 트랜스펙션되고, 아미노 말단 flu 펩타이드 또는 sLe^x에 대한 항체들에 의한 간접 면역형광분석된 COS 세포들의 평균형광강도(MFI)를 나타낸 것이다.

구조물	발현(MFI)
구조물	Flu	sLe^x
PSGL-1-flu	5.0	37
Xba1	17.0	26
Xba3	20.0	28
Xba6	21.0	28
Xba9	12.0	26
Xba12	6.0	30
Xba16	6.0	25

큰, 황산화된 뮤신(Large, Sulfated Mucins)의 경우에, PSGL-1의 아미노-말단은 P-셀렉틴 결합에 충분하다.

PSGL-1의 처음 100 N-말단 아미노산(즉, 정상 도메인)들에서 발견되는 것 이외의 PSGL-1 서열들이 P-셀렉틴의 결합에 요구되는지를 확인하기 위해서, PSGL-1의 막간 및 세포질 부위를 CD43 항원의 해당 부분들로 대체하였다 (Pallant et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86:2819-2813, 1989). 그 결과로서 수득한 시스테인 잔기를 포함하지 않는 분자들은 PSGL-1이 결합하는 것과 동일한 효율로 P-셀렉틴과 결합하였다(도 2a 및 도 2b). 따라서, 이황화 결합 형성 및 특이적인 막부착 분절(membrane anchoring segment) 모두 P-셀렉틴 결합 활성에 요구되지 않는다.

이어서 PSGL-1 정상 도메인이 P-셀렉틴 리간드(즉, 항수용체[counterreceptor]) 활성에 충분한지 아닌지를 확인하기 위하여, PSGL-1의 추론된 처음 100 아미노산들을 몇가지의 관련되지 않은 뮤신의 뮤신-유사 반복 요소들의 아미노-말단상에 유전적으로 그라프트시켰다(도 3a). 이러한 키메라 뮤신들 중의 특정한 것은 이러한 세팅에서 P-셀렉틴 결합을 지원하였다. 사람 조혈세포에서 주로 발견되는 두 가지의 비교적 큰 뮤신인, CD34 및 CD43은 모두 결합을 지원할 수 있었다. 이와 반대로, L-셀렉틴 리간드 활성을 갖는 (Lasky et al., Science, 258:964-969, 1992) 내피 세정맥에서 발현되는 뮤신인, GlyCAM-1의 인공적으로 부착된 변이체는 이러한 분석에서 불황성이었다 (도 3b). 이러한 실험에서 GlyCAM-1 뮤신 도메인은 CD7의 세포외 스톡(stalk), 막간 도메인, 및 세포질 부착 분절(cytoplasmic anchoring sements)을 통해서 세포 표면에 고정되었다 (Aruffo et al., EMBO. J., 6:3313-3316, 1987). 상이한 뮤신 및 뮤신 키메라들의 세포 표면 발현은 flu 택, sLe^x, 또는 각각의 뮤신에 대한 항체들을 이용하여 간접 면역형광분석법에 의해 확인하였다. 표 2는 도 3b에서 분석된 구조물들에 의해 트랜스펙션된 COS 세포에 의한 flu 택 또는 sLe^x의 발현의 평균형광강도(MFI) 측정을 나타낸 것이다. CD34 및 CD43 구조물들은 동족 항-CD 항체들을 이용한 간접 면역형광분석에서 발현에 대해 양성이었다.

구조물	발현 (MFI)
구조물	Flu	sLe^x
FTVIIh	---	52
PSGL-1-flu	9.8	43
CD43	---	60
PSGL-1-NH₂/CD43 rep.	12	67
CD34	---	50
PSGL-1-NH₂/CD34-COOH	8.0	33
Glycam-flu	12	32
PSGL-1-NH₂/Glycam-COOH	8.0	28

COS 세포에서 발현된 CD34 및 CD43의 겉보기 분자질량은 각각 100-130 kD (Shelley et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86:2819-2823, 1989) 및 100 kD (Simmons et al., J. Immunol., 148:267-271, 1992)인 것으로 보고되었고; PSGL-1 모노머는 110 kD(Sako et al., Cell, 75:1179-1186, 1993)의 효과적인 분자 질량을 시현한다. GlyCAM-1는 그의 천연 상태(고정되지 않은)에서 50 kD 단백질과 함께 이동하는데, 이것은 그것이 상당히 작다는 것을 가리킨다 (Lasky et al., Science, 258:964-969, 1992). 우리의 연구에서, 큰 뮤신들은 PSGL-1의 정상 도메인이 뮤신들의 아미노 말단에 부착될 때 P-셀렉틴 결합을 지원할 수 있었다. PSGL-1의 내부 반복 요소의 연속적인 결실(sequential deletion)들에 의해 우리는 전체적인 3차원 결합관계를 손상시키기 않으면서 조직적인 방법으로 분자를 단축할 수 있었다 (도 4a). 이러한 반복 요소들은 결실됨에 따라, PSGL-1의 결합 활성은 감소되었는데, 이것은 혈장막으로부터의 거리가 P-셀렉틴 결합 활성의 중요한 결정인자라는 결론과 일치하였다(도 4b).

우리의 데이터는 또한 황산화가 뮤신의 정상-도메인 결합을 지원하는 능력의 하나의 결정인자라는 것도 시사한다. 우리는 여러 가지 뮤신들이 COS 세포에서 황산화를 수행하는 능력을 평가하였다. PSGL-1, CD34, CD43 및 GlyCAM-1 가용성 뮤신 키메라들은 COS 세포에서 발현될 때 용이하게³⁵S-황산나트륨을 혼입시켰다 (도 5).

황산화의 억제는 P-셀렉틴에 대한 PSGL-1의 결합을 차단한다.

우리는 황산화의 억제가 P-셀렉틴에 대한 PSGL-1의 결합을 차단한다는 것을 발견하였다. COS 세포들을 PSGL-1 및 FTVII로 동시에 트랜스펙션시키거나 PSGL-1 또는 FTVII로 별개로 트랜스펙션시켰다. PSGL-1의 최대 합성이 예상되었던 기간중에, 세포들을 황산염은 포함하지 않고 비교적 선택적인 황산화의 억제제인, 10mM 염소산나트륨(NaClO₃)을 포함하는 변형된 DMEM 배지에서 인큐베이션하였다. 우리는 염소산염-처리된 동시트랜스펙션된 세포들의 고정된 P-셀렉틴에 대한 결합능력은 현저하게 감소(도 6a)된 반면에, 동일한 세포들은 고정된 E-셀렉틴에 대한 결합능력은 거의 감소하지 않았거나 전혀 감소하지 않았다(도 6b)는 것을 관찰하였다. sLe^x항원 및 PSGL-1 아미노 말단 택 서열의 세포 표면 발현은 NaClO₃처리에 의해 억제되지 않았다. 사실상, 표 3에 나타난 바와 같이, 염소산염의 처리후에 항-sLe^x및 항-flu 택을 나태내는, 트랜스펙션된 세포들의 평균형광강도상의 증가가 관찰되었는데, 이것은 염소산염이 내면화(internalization) 또는 세포표면 수출에 영향을 미칠 수 있다는 것을 가리킨다.

	발현 (MFI)
	NaClO₃불포함	10 mM NaClO₃포함
	sLe^x	Flu	sLe^x	Flu
FTVIIh	23	---	30	---
PSGL-1-flu	---	9	---	22
PSGL-1-flu+FTVIIh	15	10	35	34

대등한 조건하에서 합성된 가용성 PSGL-1 면역글로불린 키메라는 [³⁵S]시스테인 및 메치오닌 혼입에 의해 측정된 단백질 합성이 억제되지 않은 조건하에서,³⁵S-황산염 혼입의 완전한 억제를 나타내었다(도 7). 이러한 데이터들은 P-셀렉틴 리간드의 황산화가 P-셀렉틴 결합 활성에 요구된다는 것을 입증한다.

PSGL-1의 정상 도메인의 미세 구조 결실 분석(Fine Structure Deletion Analysis)

P-셀렉틴 결합 활성에 기여하는 100 아미노산 정상 도메인내의 요소들의 위치를 결정하기 위해, 우리는 정상 도메인의 여러 가지 부위들이 결실된 결실 돌연변이체들의 콜렉션을 만들었다 (도 8a). 이어서 각각의 아미노 말단 결실 돌연변이체를 세포 표면 발현을 모니터하기 위해 CD5 리더/flu 택 요소의 하류에 위치시켰다. 미세 구조 결실 돌연변이체들은 간접 면역형광법에 의해 평가할 때, 에피톱 택을 발현하는 능력에 약간의 변이를 시현하였다. 성숙한 PSGL-1의 N-말단의 처음 20 아미노산들의 제거는 P-셀렉틴 결합 활성에 영향을 미치지 않았다. 이와 반대로, N-말단의 처음 40 아미노산들의 제거는 결합을 파기하였다 (도 8b). PSGL의 추가의 결실은 P-셀렉틴 결합 활성에 영향을 미치지 않았다. 따라서, PSGL의 아미노산 잔기 20-40(즉, 신호 서열을 갖는 추론 전구체의 잔기 38 내지 57)이 P-셀렉틴 결합에 요구된다.

잔기 38 내지 57이 PSGL-1 정상 도메인-유도 활성에 충분하다는 것을 입증하기 위하여, 우리는 정상 도메인이 제거된 PSGL-1 및 CD43 뮤신 코어의 아미노 말단에 이 분절을 부착하였다(도 9a). 양자의 경우에, PSGL-1 펩타이드 요소의 아미노산 38 내지 57의 부가는 뮤신 코어에 P-셀렉틴 결합 활성을 부여하였다. 양자의 경우에, P-셀렉틴 결합 활성의 레벨은 천연 PSGL-1의 그것과 동등하였다 (도 9b).

아미노 말단 펩타이드내의 특수한 잔기들은 P-셀렉틴 결합 활성에 요구된다.

P-셀렉틴 결합에 요구되는 20 아미노산 지역은 3개의 잠재적인 티로신 황산화 부위 및 0-링크 포도당화를 위한 두 개의 트레오닌 잔기들을 포함한다. 이러한 잔기들의 중요성을 평가하기 위해서, 티로신을 페닐알라닌으로 바꾸었다(도 9a). 두 번째 펩타이드에서는, 트레오닌을 알라닌으로 교체하였다. 또한, 5배 돌연변이(quintuple mutation)를 포함하는 세 번째 펩타이드는 하나의 펩타이드에 두 가지 전환이 모두 일어나도록 제조하였다. 이어서 각각의 돌연변이된 펩타이드를 개별적으로, flu 택의 하류 및 (1) 정상 도메인이 결여된 절두 PSGL-1 또는 (2) CD43 반복 요소 및 막간 도메인중 어느 하나의 상류에 위치시켰다. 그 결과로서 수득한 키메라를 발현하는 세포들을 그들의 고정된 P-셀렉틴에 결합하는 능력에 대해 시험하였다(도 9a). 티로신의 페닐알라닌으로의 전환은 P-셀렉틴에 대한 결합능력의 상실을 초래하였다. 트레오닌 잔기의 알라닌으로의 교체는 결합을 감소시키기는 하였지만, 전적으로 제거하지는 않았다. flu 택 또는 sLe^x에피톱의 발현은 이러한 세포들에게 영향을 미치지 않았다. 정상(apical) 20 잔기들에 의해 매개되는 결합은, 천연 PSGL-1의 그것과 마찬가지로, 칼슘의 존재에 의존하였다. 이러한 데이타들은 위치 46, 48 및 51에서의 티로신의 황산화가 P-셀렉틴 결합 활성에 요구된다는 것을 가리킨다. E-셀렉틴 결합은 동일한 조건에서 영향을 받지 않았다. 또한, 이들 데이터들은 위치 44 및 57의 트레오닌이 필요하다는 것을 가리킨다. 이러한 트레오닌 잔기들은 0-링크 글리칸 부가를 위한 부위로 작용할 수 있다. 이들 실험들은, FTVII 발현이 P-셀렉틴 결합에 필요하다는 것을 증명한 실험과 함께, P-셀렉틴 결합이 트레오닌 잔기 44 및 57에서 sLe^x를 필요로 한다는 것을 입증한다. 요컨대, 상술한 실험들은 황산화를 위한 3 잔기들 및 sLe^x부가를 위한 2 잔기들을 포함하는 아미노산 38-57이 P-셀렉틴 결합 활성을 부여하기에 충분하다는 것을 증명한다.

아미노-말단 20 아미노산들내의 잔기들은 티로신에서 황산화된다.

아미노-말단 분절이 생체내(in vivo)에서 황산화될 수 있는지를 확인하기 위하여, 우리는 사람 면역글로불린 G1 (IgG1)에 연결된 천연 또는 돌연변이 펩타이드 서열들로 구성되는 융합 단백질을 만들었다 (도 12a). 그 결과로서 수득된 융합 단백질들을 COS 세포내에서 발현시켜, 무기 황산염을 동화하는 능력을 평가하였다(도 12b). 천연 펩타이드 서열을 포함하는 면역글로불린 키메라들은 황산염을 혼입시킬 수 있었는데 반하여, 티로신 대신에 교체된 페닐알라닌을 포함하는 것은 할 수 없었다(도 12c). 트레오닌의 알라닌으로의 대체는 황산염-혼입에는 영향을 미치지 않았다 (도 12c).

황산화의 억제는 P-셀렉틴-면역글로불린 키메라들상의 HL-60 롤링을 차단한다.

황산화의 억제가 생리적으로 관련된 부착을 손상시키는지를 밝히기 위해서, 우리는 HL-60 세포들을 염소산염을 포함하는 배지에서 생장시키고 그 결과로서 수득된 세포들을 일정한 유체 전단응력(fluid shear stress)의 조건하에서 P-셀렉틴-면역글로불린 키메라로 코팅된 커버슬립상에 부착하고 롤링하는 능력을 조사하였다 (Lawrence et al., Blood., 75:227-237, 1990). HL-60 세포들은 P-셀렉틴-면역글로불린 키메라로 예비코팅된 커버슬립상에 부착하고 그 위를 롤링할 수 있었지만, 이러한 상호작용이 CD43-면역글로불린 키메라로 코팅된 커버슬립에서는 관찰되지 않았다 (도 13). 염소산염에서의 HL-60 세포들의 생장은 기질과의 세포 상호작용의 빈도를 급격하게 감소시켰다 (도 13).

시알일-Le^x및 황산화 결정인자들을 포함하는 항체들 및 항체 융합 단백질

하나의 실시양태에 있어서, 본 발명은 시알일-Le^x및 황산화 결정인자들을포함하는 항체를 특징으로 한다. 이러한 항체는 기존의 항체 분자내에 도입되었거나 이미 존재하는 시알일-Le^x부가 부위(addition site)의 근방에 황산화 부위(즉, 산성 환경에서 티로신)를 도입(예를 들어, 표준 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해)함으로써 만들어질 수 있다. 그렇지 않으면, 임의의 P-셀렉틴 리간드 서열(예컨대, 본원에 기술된 P-셀렉틴 도메인)을 표준 재조합 DNA 기술에 의해 보통으로 존재하는 항체 서열 (예컨대, IgG 또는 IgM)에 부착하여 P-셀렉틴-항체 융합 단백질을 제조함으로써 적당한 시알일-Le^x및/또는 황산화 부위들을 부가할 수 있다. 바람직하게, P-셀렉틴 리간드 서열은 항체 분자의 아미노-말단에 부착된다. 이러한 항체들은 세포들 또는 단백질들 사이의 바람직하지 못한 상호작용을 붕괴시키거나, 또는 일반적으로 둘 중 하나는 항체에 의해 운반되는 결정인자를 포함하는 두 개의 분자들 사이의 임의의 상호작용을 붕괴시키는데 유용하다. 이러한 결정인자들은 보통 E-셀렉틴 및 P-셀렉틴(예컨대, 호중구와 혈관벽을 싸고 있는 내피 세포 사이의 상호작용)을 포함하는 상호작용을 촉진하는 기능을 하기 때문에, 이러한 상호작용을 파괴하는 능력은 예를 들어, 염증의 최소화 및 관외유출-의존성 기관 손상 및/또는 응괴의 감소와 같은 많은 치료적 효용을 제공한다.

또한, 바람직한 경우, 면역글로불린 분자의 CH2 부분을 차폐하여 보체 고정(complement fixation) 및 F_c수용체 결합을 억제하는 하나 이상의 시알릴-Le^x부분들이 항체 서열에 통합될 수 있다. 탄수화물 부분들은 보체 고정및 F_c수용체 결합을 개시시키는 면역글로불린 도메인을 블록하기 때문에, 이러한 항체들은 항체에 기초한 치료에서 자주 연관되는 바람직하지 못한 부작용(즉, 보체 고정 및 F_c수용체 결합으로 부터 결과되는 것들)을 일으키지 않는다. 바람직하게, 탄수화물 기들은 바람직하지 못한 보체 고정 및 F_c수용체 결합을 억제하는 기능을 수행할 뿐만 아니라, E-셀렉틴 및/또는 P-셀렉틴 매개 세포내 상호작용을 완벽하게 억제하는 기능을 수행한다.

보체 고정 및 F_c수용체 결합을 억제하기 위해서, 시알일-Le^x결정인자들이 항체 분자의 임의의 적당한 부위에 부가될 수 있다. N-링크 글리칸 부가 부위는: N X S/T (여기서, N은 아스파라긴이고, S는 세린이며, T는 트레오닌이고 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산)인 것으로 잘 알려져 있다. 따라서, 시알일-Le^x측쇄의 부착을 위한 몇 개의 이러한 부착부위들을 포함하는 보기 분자들이 설계될 수 있다. IgG1 서열 (서열 10a-e)의 조사결과 적어도 5개의 N-링크 글리칸 부가 부위들이 분자내의 유리한 위치에 도입될 수 있고, 거기서 보체 고정 및 F_c수용체 결합 능력이 상기 과정에 의해 손상될 것이라는 사실이 밝혀졌다. 이들 부위들은 아미노산 잔기 274, 287, 295, 322 및 335를 포함한다. 이들이 바람직한 N-링크 글리칸 부가 부위들이지만, 이들이 유일한 후보들은 아니고; 다른 유용한 부위들이 가이던스로서의 다음 기준을 이용함으로써 확인될 수 있고 IgG1 서열내에 도입될 수 있다: (1) 부위들은, 바람직하게, 면역글로불린 분자의 CH2 부위내, 즉, 보체 고정 및 F_c수용체 결합을 담당하는 분자들의 부분내에 위치된다; (2) 부위들은 그들의 친수성 특성에 의해 면역글로불린 분자의 외측에 존재하여 탄수화물 측쇄의 부착을 담당하는 효소에 접근할 수 있을 것으로 예상된 서열의 부위들내에 위치된다; (3) 부위들은 일차 아미노산 서열 및 추론 2차 아미노산 서열에 대해 최소로 파괴적인 부위내에 위치된다. 예를 들어, N-링크 글리칸 부가 부위와 하나의 아미노산만이 상이한 보통으로 존재하는 부위는 아미노산 서열상의 두 개의 변화를 필요로 하는 부위에 비해 유리할 것이다. 더욱이, 유사한 전하 또는 극성을 띄는 아미노산으로 대체함(예컨대, 하나의 비하전 아미노산을 다른 비하전 아미노산으로 대체)으로써 N-링크 글리칸 부가 부위를 만드는 것이 바람직하다. 하나 이상의 N- 링크 글리칸 부가 부위 치환들은 특정한 IgG1-코드화 서열내에 유전자조작될 수 있고; 이러한 서열(즉, 시알일-Le^x부분들이 부착된 항체 분자들을 코드화하는 것들)들을 IgG1-시알일-Le^x또는 IgG1-Le^x라 한다.

CH2 도메인내의 아미노산 #274, #287, 및 #322에 추가 포도당화 부위를 도입하는 것은 본 발명이 속하는 기술분야의 표준기술인 분석방법을 이용함으로써F_c수용체 또는 보체에 의해 인식되지 않는 분자들을 만들었다; 보체 고정 분석의 일례는 Weir et al., Handbook Of Experimental Immunology, Blackwell, Oxford; 및 Coligan et al., Current Protocols In Immunology, Wiley Interscience, 1995를 포함한다.

시알일-Le^x부분들을 포함하는 특정한 IgG1 분자들은 다음과 같이 제조된다. IgG1 유전자는 공중이 입수할 수 있으며, 그의 서열은 도 10에 도시되었다. 상기 유전자는 하나 이상의 N-링크 글리칸 부가 부위(예컨대, 상술한 것들 및 도 10a-e의 보통으로 존재하는 서열에 도시된 것들)를 도입하기 위해서, 생체외 부위특이적 돌연변이유발의 표준 방법에 의해 돌연변이화될 수 있다. 이어서 유전자는진핵세포에서 단백질을 발현하도록 설계된 벡터 (예컨대, 본원에 참고자료로 첨부된 길리스 등의 미국특허 제 4,663,281호에 기술된 벡터)내에 삽입된다. 진핵 숙주세포는 바람직하게 포유동물 세포(예컨대, CHO 또는 lec11 세포)이고, 돌연변이된 IgG1-Le^x-코드화 서열을 포함하는 발현 벡터는 표준 기술을 이용한 일시적인 또는 안정한 트랜스펙션에 의해 숙주세포내로 도입된다. 이러한 숙주 세포들은 또한 시알일-Le^x기를 항체 분자의 포도당화 부위에 부착할 수 있는 α(1,3) 푸코실트랜스페라제를 발현할 수 있는 벡터에 의해 트래스펙션(일시적 또는 안정적으로)된다. α(1,3) 푸코실트랜스페라제 유전자는 IgG1-Le^x를 코드화하는 것과 상이한 벡터로 부터 발현될 수 있거나 또는 양자의 유전자들은 공통의 벡터에 실리고 그로부터 발현될 수 있다. 포유동물 세포들은 시알일-Le^x생산에 필요한 모든 전구체들을 제공하기 때문에, IgG1-Le^x의 합성에 특히 유용한 숙주이다.

본 발명의 시알일-Le^x-변형된 및 황산화된 항체들의 생산을 위해, 항체 서열을 코드화하는 유전자는 바람직하게 전적으로 α(1,3) 푸코스 결합을 촉매하는 α(1,3) 푸코실트랜스페라제도 발현하는 세포에서 발현된다; 이러한 효소는 Walz et al., Science 250:1132-1135 (1990) 및 1995년 6월 7일에 푸코실트랜스페라제 유전자 및 그의 용도라는 명칭하에 출원된 시드의 미국특허출원 제 08/483,151호(본원에 참고자료로 첨부)에 기술된다. 덜 바람직하게, 로위 등에 의해 기술된(Lowe et al., Cell 63:475, 1990) α(1,3) 푸코실트랜스페라제 cDNA가 이용될 수 있다. 이러한 푸코실트랜스페라제는 시알일화된 전구체 분자들을 인식하여 N-아세틸글루코오스아민 측쇄에 α(1,3)- 또는 α(1,4)-링크 푸코스 부분을 붙인다. 시알일-Le^x결정인자는 α(1,3)-결합을 특징으로 하고, 그와 같은 것으로서, 로위(상술한 것과 동일한 문헌)의 α(1,3)-푸코실트랜스페라제 효소는 목적으로 하는 시알일-Le^x-변형된 분자들과 P-셀렉틴 및 E-셀렉틴에 대한 결합에 대해 비활성적이지만, 시알일-Le^x-변형된 분자들의 작용을 방해하지 않고 다른바람직하지 못한 부작용들도 일으키지 않는 α(1,4)-링크 푸코스를 포함하는 생성물을 만든다.

α(1,3)-푸코실트랜스페라제 및 변형될 항체를 발현하는 숙주 세포들을 표준방법에 따라 생장시키고, 항체는 그의 단백질 A 컬럼에 대한 친화성 또는 항체 분리 및 정제를 위한 기타의 표준 기술에 기초하여 세포 용해물로 부터 정제한다.

시알일-Le^x및 황산화 결정인자들을 포함하는 α1-산 당단백질-항체 융합 단백질

본원에 기술된 바와 같이, 황산화 및 시알일-Le^x부가에 의해 변형된 항체 융합 단백질들은 중요한 치료적 및 진단적 효용을 갖는다. 이전의 연구들은 대량의 항체 융합 단백질들이 트랜스펙션된 포유동물 세포들(예컨대, COS 세포)로 부터 생성되고 일시적으로 분비될 수 있다는 것을 입증하였다. 일반적으로, 본 발명에 따른 AGP 항체 융합 단백질을 생산하기 위해서, AGP를 코드화하는 DNA와 P-셀렉틴 리간드 도메인이 표준기술에 의해 인-프레임으로 사람 IgG 도메인(예컨대, 불변 도메인[constant domain])에 융합되고, 융합단백질은 역시 표준기술에 의해 발현된다. 분자의 항체 부분은 융합 단백질 정제를 용이하게 하고 그렇지 않으면 수명이 짧은 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 도메인들의 혈장 반감기를 연장한다. 바람직하게, 항체 융합 단백질들은 예컨대, IgG 또는 IgM 항체들 또는 이들의 부분들을 이용함으로써(IgM 융합 단백질에 대해 Zettlemeisl et al., DNA Cell Biol. 9:347 (1990) 참조), 1995년 6월 7일에 푸코실트랜스페라제 유전자 및 그의 용도라는 명칭하에 출원된 시드의 미국특허출원 제 08/483,151호(본원에 참고자료로 첨부)에 기술된 방법에 따라 발현된다.

특정한 AGP 항체 융합 단백질들(예컨대, AGP-힌즈-CH2-CH3 및 AGP-CH2-CH3 단백질들)을 발현하는 재조합 플라스미드들은 다음과 같이 제작되었다. 어큐트 페이스(acute phase) α₁-AGP 유전자를 코드화하는 cDNA를 표준기술에 따라 α₁-AGP (Board et al., Gene 44:127, 1986)의 5' 및 3' 코드화 부위에 해당하는 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 이용하여 폴리메라제 연쇄반응법(PCR)에 의해 사람 간 cDNA 도서관으로부터 클로닝하였다. 5' AGP 프라이머는 HindⅢ 제한부위를 포함하도록 설계되었고 3' 프라이머는 AGP 종결코돈 대신에 BamHⅠ 제한부위를 포함하도록 설계되었다. PCR-증폭된 생성물들을 HindⅢ/BamHⅠ으로 절단하여 사람 IgG1의 불변 도메인(즉, 힌즈-CH2-CH3 또는 CH2-CH3)을 포함하는 HindⅢ/BamHⅠ-절단된 플라스미드 발현 카세트(Aruffo et al., Cell, 61:1303, 1990)내에 클로닝하였다. 이러한 AGP-IgG 융합 단백질의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 도 11a-b 및 도 11c에 도시하였다.

P-셀렉틴-매개 상호작용을 블록하는 분자를 만들기 위해, 황산화 부위 및 필요한 경우 시알일-Le^x부가 부위를 항체 융합 단백질 서열(예컨대, 상술한 항체 융합 단백질)내에 도입한다. 이러한 부위들은 예를 들어, 하나 이상의 황산화 부위(즉, 산성 환경에서 티로신)를 도입된 또는 기존의 시알일-Le^x부가 부위의 근방에 도입함(예컨대, 부위-특이적 돌연변이유발에 의해)으로써 기존의 융합 분자에 통합될 수 있거나, P-셀렉틴 리간드 서열(예를 들어, 본원에 기술된 P-셀렉틴 리간드 서열들중 임의의 것)은 재조합 DNA 기술의 표준기술을 이용함으로써 항체 융합 단백질 서열에 부착될 수 있다.

이어서 P-셀렉틴-AGP-항체 융합 유전자들은 발현 플라스미드내에 도입되고, 플라스미드들은 가용성 항체 융합 단백질의 생산을 위해 적당한 푸코실트랜스페라제 발현 세포내에 트랜스펙션된다.

보체 고정 및 F_c수용체 결합을 억제할 수 있는 항체 융합 단백질을 제조하기 위해, 추가의 시알일-Le^x공통 포도당화 부위들(N-X-T/S)을 상술한 사람 IgG1의 CH2 도메인내에 도입할 수 있다.

이러한 구성 방법에 기초하여, 긴 혈장 반감기를 갖고 바람직하지 못한 세포-세포 상호작용(예를 들어, 백혈구와 셀렉틴-함유 세포 사이의 상호작용)을 억제하는, 임의의 수의 재조합 P-셀렉틴-AGP-항체 융합 단백질들이 설계될 수 있다. 높은 억제 효능을 갖는 분자들을 만들기 위해, 후보 분자들을 설계하여 상술한 방법을 이용하여 스크리닝한다. 하나의 구체적인 예에 있어서, 분자들은 시알일-Le^x및 황산화 결정인자들을 혼입시키는 능력 및 호중구의 활성화된 내피 세포들에 대한 결합을 억제하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다; 이러한 분자들은 셀렉틴-의존성 염증반응 및 침범하는 백혈구에 의해 입은 조직 손상의 억제에서 효용을 찾을 수 있다.

P-셀렉틴-매개 및 E-셀렉틴-매개 상호작용을 방해할 수 있는 분자들

P-셀렉틴- 및 E-셀렉틴-매개 세포내 상호작용이 모두 염증에 관련되기 때문에 그리고 이러한 상호작용에 관련된 중대한 결정인자들이 확인되었기 때문에, 양자의 유형의 해로운 상호작용을 모두 방해할 수 있는 단일 분자를 설계하는 것이 가능하다. 특히, P-셀렉틴 리간드 도메인(즉, 시알일-Le^x및 황산화 부분들을 포함하는 도메인) 및 E-셀렉틴 리간드 도메인(즉, 시알일-Le^x부분을 포함하는 도메인)을 모두 포함하는 분자들 (예컨대, 단백질들)을 구성할 수 있다. 이러한 분자는 예를 들어 P-셀렉틴 리간드 도메인을 시알일화 분자(예컨대, 본원에 기술된 시알일화 항체 또는 시알일화 융합 단백질)에 부착함으로써 도메인들을 결합시켜 제조될 수 있다. 그렇지 않으면, 적당한 시알일-Le^x및/또는 황산화 부위들은 기존의 서열에, 예를 들어 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있다.

유전자조작된 분자의 포도당화 또는 황산화는 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 및 Walz et al., Science, 250:1132-1135, 1990에 의해 시험될 수 있다. 시알일-Le^x-변형된 및/또는 황산화 분자의 세포내 상호작용을 방해하는 능력은 상술한 왈츠 등에 기술된 대로 또는 임의의 표준기술, 예를 들어, 증가하는 농도의 결정인자-함유 분자의 T-림프구 또는 골수양 세포들의 고정된 P-셀렉틴 및/또는 E-셀렉틴에 대한 결합을 방해하는 능력을 분석함에 의해 시험될 수 있다.

용법(Use)

본 발명의 단백질 또는 유기분자를 환자에게 투여하기 위해서, 약제학상-순수한 단백질 또는 분자는 허용가능한 담체, 예컨대, 생리식염수에 현탁되어 임의의 적당한 경로(예컨대, 정맥내)에 의해 단일 도스로 또는 복수의 도스로 환자에게 배송된다. 가장 바람직하게, 충분한 양의 치료제가 내피 세포상의 모든 P-셀렉틴 및 이중 기능 분자의 경우, 모든 E-셀렉틴 결합 부위들을 포화시키기 위해 제공된다. 전형적으로, 이것은 0.1㎎/㎏ 이상의 도스에 의해 달성될 수 있다. 바람직한 용량은 0.1-2.0 ㎎/㎏이다.

본 발명의 시알일-Le^x-변형된 및/또는 황산화 분자들 및 단백질들 (예컨대, 본원에 기술된 변형된 항체 또는 항체 융합 단백질)이 이용될 수 있는데, 하나의 예에 있어서는 관외유출-의존성 기관 손상 및/또는 응괴의 치료를 위해 이용될 수 있다. 특히, P-셀렉틴은 염증 또는 조직 손상 부위 또는 혈전 생성 부위 근방에 퍼져 있는 호중구의 부착을 매개하기 때문에, 본 발명의 분자들 및 단백질들은 이러한 상호작용을 블로킹하는 유용한 치료제를 제공한다. 예를 들어, P-셀렉틴은 성인 호흡곤란증후군에 이은 호중구의 폐내로의 이동을 매개할 것이고, 허혈성 심근 외상에 따라 심장내로의 이동을 매개하며, 특정한 이환상태하의 신장의 사구체 손상에 있어 일정한 역할을 담당할 것이다. 따라서, 본 발명의 시알일-Le^x-변형된 및/또는 황산화 분자 및 단백질들은 이러한 질병 또는 이환상태로 고통을 겪고 있는 환자들에게 투여될 수 있다. 이러한 치료는 침범하는 호중구와 혈관 또는 기관의 내피세포 사이의 상호작용의 경쟁적 억제에 의해 관외유출-의존성 손상을 경감시킬 수 있다. 본 발명의 화합물들은 특히, P-셀렉틴 리간드-AGP 융합 단백질 및 P-셀렉틴 리간드-AGP-항체 융합 단백질도 상술한 바와 같이 패혈증성 쇼크 또는 패혈증의 치료에 유용할 것이다.

또한, 본 발명의 항체 또는 항체 융합 단백질들은 표적 치료 또는 진단 부위에 대한 항체의 특이성을 이용하는, 항체-기초 치료 또는 생체내 진단의 종래기술에 이용될 수 있다. 하나의 구체적인 예에 있어서, 본 발명의 항체 융합 단백질의 P-셀렉틴 리간드 도메인은 염증부위의 단백질을 표적화하여 치료(해로운 P-셀렉틴-매개 세포내 상호작용의 블로킹에 유용) 및 진단(염증 부위의 태깅(tagging)에 유용)을 모두 제공한다. 게다가, 부착된 시알일-Le^x결정인자들은 항체의 CH2 도메인을 차폐하고 보체 고정 및 F_c수용체 결합의 바람직하지 못한 효과를 블록하는데 이용될 수 있다.

[기타의 실시양태]

다른 실시양태들도 본 청구범위에 포함된다. 예를 들어, 세포들 또는 단백질들 사이의 상호작용을 블로킹하기 위하여, 시알일-Le^x및 황산화 결정인자들이 부착될 수 있는 다른 적당한 담체 분자(carrier molecule)들이 본 발명에 이용될 수 있다. 일반적으로, 단백질들은 혈청내에서 비교적 긴 반감기를 갖기 때문에, 단백질이 바람직하다. 하나의 클래스의 담체 단백질들은 알부민(예컨대, 소 혈청 알부민, 또는 사람 혈청 알부민), 트랜스페린, 또는 α-2 마크로글로불린과 같은 혈청 단백질들이다. 담체 단백질은 예컨대, 부위특이적 돌연변이유발에 의해 담체 도메인(상술한 바와 같은)의 DNA 서열에 도입된 부위 이외에 내인성 황산화 및 글리칸 부가 부위들을 포함할 수 있다. 담체 분자는, 덜 바람직하게, 지질(lipid)일 수 있다. 하나의 예에 있어서, 하나 이상의 시알일-Le^x및 황산화 결정인자들을 갖는 지질이 리포좀(liposome)으로 표적 세포벽(예컨대, 내피 세포벽)에 배송된다. 리포좀은 세포 또는 단백질 상호작용을 블록할 수 있거나 또는 약물의 그의 적당한 작용부위로 배송하는데 이용될 수도 있다.

시알일-Le^x및 황산화 결정인자를 포함하는 담체 분자들의 생산은 세포, 바람직하게, 효모 이외의 진핵세포내에서 수행될 수 있다. 포유동물 세포, 예컨대, 포유동물 세포주들은 특히 바람직한 숙주를 제공한다. 이들 세포들은 일반적으로 필요한 전구체 분자들을 합성할 수 있고 황산화 및 탄수화물 부착을 담당하는 효소들을 생산하거나 생산하도록 유전자조작될 수 있다. 시알일-Le^x결정인자의 부착에는, CHO 및 lec11과 같은 포유동물 세포주들이 특히 적합하다. 대안으로, 시알일-Le^x및 황산화 결정인자들중 어느 하나 또는 양자 모두가 생체외, 즉, 세포외에서 담체 분자에 부착될 수 있다. 하나의 예에 있어서, α(1,3)푸코실트랜스페라제는 고체 지지체(예컨대, 칼럼)에 결합되고, 시알일-Le^x기의 담체 분자상의 그들의 적당한 부위(들)에 대한 결합을 촉진하는 조건하에서 황산화된 담체 분자들이 결합된 푸코실트랜스페라제 효소위로 통과한다.

본 발명은 황산화된 및 시알일-Le^x-변형된 AGP 항체 융합 단백질들의 미생물 요소(예컨대, 지다당류(LPS)), 미생물 독소(예컨대, 독성 쇼크 엔테로톡신), 숙주 전달물질(예컨대, 싸이토카인), 또는 항-종양 치료(예컨대, 종양괴사인자(TNF) 또는 인터루킨-1(IL-1)의 투여) 또는 전술한 것들의 임의의 조합에 의해 유발되는 쇼크-유도 이벤트, 쇼크의 임상적 징후, 또는 이들 양자로 부터 보호하고, 이들을 억제하고 또는 치료하기 위한 용도도 포함한다. 예를 들어, 이러한 항체 융합 단백질은 미생물 LPS에 의해 유발된 패혈증성 쇼크의 영향을 완화시키기 위해 사람 환자에게 투여될 수 있다. 항체 융합 단백질들의 쇼크(예컨대, 패혈증 또는 독성 쇼크 증후군)의 효과에 대해 보호하고, 그것을 치료하거나 억제하는 능력은 당업계에 공지된 표준방법(예컨대, Libert et al., (1994) J. Exp. Med. 180:1571-1575에 기술된 것)에 따라 평가된다.

본원 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허출원들은 각각의 간행물, 특허 및 특허출원들이 개별적으로 상세하게 참고로 첨부될 것으로 기술된 바와 같이 참고자료로 본원에 첨부된다.

[서열 목록]

(1) 일반 정보:

(ⅰ) 출원인: 더 제너럴 허스피탈 코퍼레이션

(ⅱ) 발명의 명칭: P-셀렉틴 리간드 및 관련 단백질 및 방법

(ⅲ) 서열의 수: 14

(ⅳ) 통신주소:

(A) 수신인: 피시 앤드 리차드슨 피. 씨.

(B) 거리: 프랭클린 스트리트 225

(C) 도시: 보스톤

(D) 주: 메사추세츠

(E) 나라: 미합중국

(F) 우편번호: 02110-2804

(ⅴ) 컴퓨터 판독 형태:

(A) 미디엄 타입: 플로피 디스크

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종

(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, 버전 #1.30

(ⅶ) 이전 출원 데이타

(A) 출원번호: US 60/000,213

(B) 출원일: 1995. 6. 14

(C) 분류

(ⅷ) 변호사/대리인 정보:

(A) 성명: 리치 카렌 에프.

(B) 등록번호:

(C): 참고/도킷 번호: 00786/28Wol

ⅸ) 전기통신 정보:

(A) 전화번호: (617) 542-5070

(B) 팩스번호: (617) 542-8906

(C) 테렉스 : 200154

(2) 서열 번호 1에 대한 정보:

(ⅰ) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 10 아미노산

(B) 서열의 형: 아미노산

(C) 쇄의 수: 무관

(D) 형태: 직쇄상

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

(2) 서열 번호 2에 대한 정보:

(ⅰ) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 18 아미노산

(B) 서열의 형: 아미노산

(C) 쇄의 수: 무관

(D) 형태: 직쇄상

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

(2) 서열 번호 3에 대한 정보:

(ⅰ) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 42 아미노산

(B) 서열의 형: 아미노산

(C) 쇄의 수: 무관

(D) 형태: 직쇄상

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

(2) 서열 번호 4에 대한 정보:

(ⅰ) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 20 아미노산

(B) 서열의 형: 아미노산

(C) 쇄의 수: 무관

(D) 형태: 직쇄상

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

(2) 서열 번호 5에 대한 정보:

(ⅰ) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 20 아미노산

(B) 서열의 형: 아미노산

(C) 쇄의 수: 무관

(D) 형태: 직쇄상

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

(2) 서열 번호 6에 대한 정보:

(ⅰ) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 20 아미노산

(B) 서열의 형: 아미노산

(C) 쇄의 수: 무관

(D) 형태: 직쇄상

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

(2) 서열 번호 7에 대한 정보:

(ⅰ) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 20 아미노산

(B) 서열의 형: 아미노산

(C) 쇄의 수: 무관

(D) 형태: 직쇄상

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

(2) 서열 번호 8에 대한 정보:

(ⅰ) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 2287 염기쌍

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1 본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ⅱ) 분자 유형: DNA (게놈성)

(2) 서열 번호 9에 대한 정보:

(ⅰ) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 442 아미노산

(B) 서열의 형: 아미노산

(C) 쇄의 수: 무관

(D) 형태: 직쇄상

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

(2) 서열 번호 10에 대한 정보:

(ⅰ) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 1894 염기쌍

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1 본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ⅱ) 분자 유형: DNA (게놈성)

(2) 서열 번호 11에 대한 정보:

(ⅰ) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 437 아미노산

(B) 서열의 형: 아미노산

(C) 쇄의 수: 무관

(D) 형태: 직쇄상

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

(2) 서열 번호 12에 대한 정보:

(ⅰ) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 442 아미노산

(B) 서열의 형: 아미노산

(C) 쇄의 수: 무관

(D) 형태: 직쇄상

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

(2) 서열 번호 13에 대한 정보:

(ⅰ) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 42 아미노산

(B) 서열의 형: 아미노산

(C) 쇄의 수: 무관

(D) 형태: 직쇄상

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

(2) 서열 번호 14에 대한 정보:

(ⅰ) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 16 아미노산

(B) 서열의 형: 아미노산

(C) 쇄의 수: 무관

(D) 형태: 직쇄상

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

Claims

시알일-Le^x결정인자 및 황산화 결정인자가 공유결합되어 있고, 이들 결정인자들 중 적어도 하나가 분자상의 보통으로 존재하지 않는 부위(non-naturallyl occurring site)에 위치되어 있는 유기분자(organic molecule).
제 1항에 있어서, 상기 분자가 다수의 시알일-Le^x결정인자 또는 다수의 황산화 결정인자들을 포함하는 유기분자.
제 1항에 있어서, 상기 분자가 가용성인 유기분자.
제 1항에 있어서, 상기 분자가 도 8a의 아미노산 21-57 로 필수적으로 구성된 P-셀렉틴 리간드를 포함하거나, P-셀렉틴 수용체와의 상호작용을 매개할 수 있는 그의 일부분을 포함하는 유기분자.
제 4항에 있어서, 상기 분자가 도 8a의 아미노산 38-57로 필수적으로 구성된 P-셀렉틴 리간드를 포함하는 유기분자.
제 1항 또는 제 4항에 있어서, 상기 분자가 α₁-산 당단백질(AGP)을 포함하는 유기분자.
제 1항 또는 제 4항에 있어서, 상기 분자가 항체 분자를 포함하는 유기분자.
제 4항 내지 제 7항 중 어느 하나의 항의 유기분자를 코드화하는 정제된 핵산.
제 8항에 있어서, 상기 핵산이 (a) α₁-산 당단백질(AGP) 또는 (b) 항체 분자중 임의의 것을 추가로 코드화하는 정제된 핵산 분자.
제 8항의 핵산을 포함하는 벡터.
제 8항의 정제된 핵산을 포함하는 세포.
시알일-Le^x결정인자 및 황산화 결정인자를 포함하는 분자 또는 세포에 대한 P-셀렉틴 단백질을 포함하는 세포의 결합을 억제하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 P-셀렉틴-포함 세포를 제 1항의 유기분자와 접촉시키는 과정을 포함하는 방법.
제 12항에 있어서, 상기 유기분자가 시알일-Le^x결정인자를 포함하는 분자 또는 세포에 대한 E-셀렉틴 단백질을 포함하는 세포의 결합도 억제하는 방법.
포유동물에 치료유효량의 제 1항의 유기분자를 투여하는 과정을 포함하는 포유동물의 염증 경감 방법.
포유동물에 치료유효량의 제 1항의 유기분자를 투여하는 과정을 포함하는 포유동물을 관외유출-의존성 부반응을 경감시키거나 그로부터 보호하는 방법.
제 15항에 있어서, 상기 관외유출-의존성 부반응이 관외유출-의존성 기관 손상 또는 성인 호흡곤란증후군, 사구체신염, 또는 허혈성 심근 외상과 관련된 응괴(clotting)인 방법.
포유동물에 치료유효량의 제 1항의 유기분자를 투여하는 과정을 포함하는 포유동물의 부 면역반응(adverse immune reaction)을 경감시키거나 이로부터 포유동물을 보호하는 방법.
제 17항에 있어서, 상기 부면역반응이 미생물 요소 또는 숙주 요소에 의해 유발되는 방법.
제 17항에 있어서, 상기 부면역반응이 패혈증성 쇼크 또는 패혈증인 방법.