ES2277335T3 - Citoquina designada lerk-6. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE DIRIGE A LA LERK-6 COMO UNA PROTEINA PURIFICADA Y AISLADA, AL ADN QUE CODIFICA LA LERK-6, A LAS CELULAS ANFITRIONAS TRANSFECTADAS CON CDNAS QUE CODIFICA LA LERK.6.
Description
Citoquina designada LERK-6.
La presente invención se relaciona con
polipéptidos de citoquina designados como LERK-6
que se unen al receptor hek o elk, los ácidos nucleicos que
codifican tales polipéptidos, procesos para la producción de
polipéptidos LERK-6 combinantes, y composiciones
farmacéuticas que contienen tales polipéptidos.
Las proteínas conocidas como las tirosinas
quinasas receptoras tienen una actividad de quinasa intrínseca que
se activa luego de la unión de ligando. Esta clase de proteína se
caracteriza por motivos estructurales conservados dentro de los
dominios catalíticos (Hanks et al., Science, 242:42, 1988) y
se pueden subdividir en familias basadas en características
estructurales de las regiones N-terminales al
dominio catalítico.
Boyd et al (J. Biol. Chem., 267:3262,
1992) purificó una glicoproteína de superficie celular que exhibe
actividad de tirosina quinasa. La secuencia de aminoácido identificó
esta proteína como un miembro de la familia eph/elk, y la proteína
fue designada así hek (quinasa similar a eph/elk humana). Un
anticuerpo monoclonal y inmunoreactivo con hek se utilizó para
estudiar la expresión del hek en un número de tipos de célula
humano (Body et al supra). El antígeno hek se detectó sobre
la línea de célula de leucemia de célula pre-B
humana LK63 (la línea celular empleada como el inmunógeno contra el
cual se generó el anticuerpo) la línea de célula de leucemia de
célula T humana, JM. La líneas de célula de linfoma Raji B mostró
una expresión de antígeno hek débil, y el resto de las lineas
celulares ensayadas tanto líneas celulares normales como tumorales,
entre las cuales estaban las lineas celulares hematopoyéticas que
incluyeron las líneas celulares pre-B y T ensayadas
(tanto las líneas celulares normales como tumorales., entre las
cuales estaban las líneas celulares hematopoyéticas que incluyeron
las líneas celulares pre-B y T) fueron
consistentemente negativas. De os especímenes de biopsia de tejido
normal y tumoral que también fueron ensayados para expresión de
antígeno hek, ninguno de los tejidos normales fue positivo y
solamente una proporción muy baja de tumores hematopoyéticos fue
positivo.
La expresión de los transcriptos hek en las
lineas celulares LK63 y JM anteriormente descritas, así como
también la línea celular de leucemia de célula T humana
HSB-2, ha sido demostrada mediante análisis northem
blot (Wicks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1611,
1992). Las secuencias de nucleótido y aminoácido para el clon de
cADN hek aislado están presentes en Wicks et al., Supra.
La proteína de superficie celular designada a
elk es otro miembro de la familia de proteínas del receptor de
tirosina quinasa relacionado con eph. Un clon parcial de elk fue
primero descubierto en una librería de expresión de cADN de cerebro
de rata que se seleccionó para proteínas que expresan actividad de
tirosina quinasa (Letwin et al., Oncogene 3:621, 1988.).
Posteriormente, una secuencia de compuesto que alcanza la región
codificante elk entera se derivó de los clones parciales aislados
de la librería cADN de cerebro de rata y una librería de cerebro de
cerebelo de rata utilizando el clon parcial como una sonda (Lhotak
et al., Mol, Cell. Biol. 11:2496. 1991).
Las proteínas hek y elk están cercanamente
relacionadas con un número de otras tirosina quinasas receptoras,
que incluyen los homólogos hek mek4 y cek4 (Sajjadi et al.,
New. Biol. 3:769, 1991); eek (Chan et al. Oncogene 6:1057,
1991); erk (Chan et al, supra.), eck (Lindberg et
al. Mol. Cell. Biol. 10:6316, 1990); cek5 (Pasquale, E.B. Cell
Regulation 2:253, 1991); y eph (Hirai et al. Science
238:1717, 1987). Las proteínas de estas subfamilias están
relacionadas no solamente en sus dominios citoplasmáticos sino
también en sus dominios extracelulares, los cuales son 41 a 68%
idénticos. De manera interesante, las distribuciones de tejido de
los varios receptores don diversas. Por ejemplo, la expresión del
mARN de elk se ha reportado por ser limitada a los testículos y el
cerebro (Lhotak et al. supra), mientras que el eck se
encuentra no solamente en estos mismos dos tejidos sino en el
pulmón, intestino, riñón, vaso, ovario, y piel también. Además, la
mayoría de los receptores relacionados con eph son primariamente
expresados en el cerebro. Debido a la homología de los receptores
en la familia eph, el ligando dado para un receptor específico
también se puede unir a otros receptores.
Aquellos ligandos que se han identificado para
las citoquina quinasas receptoras son un grupo diverso de proteínas
que afectan el crecimiento, diferenciación, y supervivencia de las
células que expresan los receptores. Los ligandos para el hek y elk
se han aislado, y discutido con más detalle adelante.
La identificación de los ligandos adicionales
para el hek y el elk que pueden existir probarían ser útiles para
investigar la naturaleza de los procesos celulares regulados por la
señalización a través de estos receptores. Si el mejoramiento o
inhibición de una señal biológica particular mediada a través de
estos receptores se desea, es ventajoso identificar cada una de las
proteínas que pueda jugar un papel en la transducción de tales
señales. Además, es conocido que ciertas proteínas se pueden unir a
los receptores sin una transducción de señal de iniciación que
incluyen la proteína antagonista del receptor de interleuquina -1
(Eisenberg et al., Nature 343:341, 1990; Hannum et
al., Nature 343; 336, 1990; y Carter et al., Nature
344:633, 1990), La identificación de las proteínas adicionales que
se unen al hek o elk es también redeseable con el fin de determinar
si tales proteínas funcionan como antagonistas.
La presente invención pertenece
LERK-6 de mamífero como una proteína aislada y
homogénea. Además, la invención está dirigida al ADN aislado que
codifica el LERK-6 de mamífero y a vectores de
expresión que comprenden un cADN que codifica el
LERK-6 de mamífero. Dentro del alcance de esta
invención están las células huéspedes que han sido transfectadas o
transformadas con vectores de expresión que comprenden un cADN que
codifican LERK-6, y procesos para producir el
LERK-6 al cultivar tales células huéspedes bajo
condiciones que conducen a la expresión del
LERK-6.
Además, el LERK-6 se puede
diluir a una matriz de fase sólida y utilizar para
afinidad-purificación o separar células que expresan
hek o elk en su superficie celular. La invención comprende células
separadoras que tienen el receptor hek o elk sobre la superficie de
ésta de una mezcla de células en solución, que comprenden poner en
contacto las células en la mezcla con una superficie de contacto
que tiene una molécula de LERK-6 sobre esta, y
separar la superficie de contacto en la solución.
Un cADN que codifica el LERK-6
se ha aislado y se describe en la SEQ ID NO:1. Para comparación un
exón del LERK-6 humano ha sido aislado y descrito en
la SEQ II) NO:7. Este descubrimiento del cADN que codifica el
LERK-6 posibilita la construcción de los vectores de
expresión que comprenden los cADN que codifican el
LERK-6; las células huéspedes afectadas o
transformadas con los vectores de expresión; el
LERK-6 biológicamente activo como proteínas
homogéneas; y los anticuerpos inmunoreactivos con
LERK-6.
El LERK-6 se puede utilizar en
el mejoramiento, estímulo, proliferación o crecimiento de células
que expresan el receptor hek o elk. En razón a que el receptor hek o
elk se encuentra en el tejido del cerebro y los testículos, el
tratamiento de una variedad de condiciones asociadas con el daño al
tejido de éste es posible. Más aún, el ligando y el complejo
receptor se pueden involucrar en el crecimiento neuronal,
desarrollo y/o mantenimiento. Aunque no está limitado a tal, los
usos particulares del LERK-6 se describen
infra.
Como se utiliza aquí, el término
"LERK-6" se refiere a un género de polipéptidos
que se une a un complejo independientemente con el receptor hek o
elk encontrado en las células T o en las células de cerebro. El
término "LERK-6" comprende polipéptidos que
tienen la secuencia de aminoácido 1-184 de la SEQ
ID:2. Las proteínas que son codificadas por los ácidos nucleicos que
contienen la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO:7 se
suministra para comparación. Además, aquellos polipéptidos
LERK-6 que tienen un alto grado de similitud o un
alto grado de identidad con las secuencias de aminoácido
1-184 de la SEQ ID NO:2, sobre la secuencia de
aminoácido de la SEQ ID NO:8 que es suministrada para comparación y
cuyos polipéptidos son biológicamente activos y se unen al receptor
hek o elk. Además, el término "LERK-6 de
murino" se refiere a productos de gen biológicamente activo del
ADN de la SEQ ID NO:1. Además comprendido por el término
"LERK-6" están las proteínas ligadas a GPI (las
cuales incluyen una región extracelular y una región hidrófoba
C-terminal), y proteínas solubles o truncadas que
comprenden primariamente la porción de unión del receptor de la
proteína, retienen la actividad biológica y son capaces de ser
secretadas. Ejemplos específicos de tales proteínas solubles son
aquellas que comprenden la secuencia de aminoácidos 1 (Ala) -145
(Asn) de la SEQ ID NO:2.
El término "hek/elk" significa hek o elk o
ambos hek y elk. Por ejemplo, el término "anticuerpos
anti-hekk/elk" se refieren a anticuerpos contra
hek o elk al termino "células que expresan hek/elk" se refiere
a células que expresan el receptor hek o elk o células que expresan
tanto los receptores hek como elk.
El termino "biológicamente activo" en la
medida en que este se refiere al LERK-6, significan
que el LERK-6 es capas de unirse al hek/elk.
"Aislado" significa que el
LERK-6 esta libre de asociación con otras proteínas
de polipéptidos, por ejemplo, como un producto de purificación de
cultivo de célula huésped recombinante o un extracto
purificado.
Una "variante LERK-6" como
se denomina aquí significa un polipéptido sustancialmente homólogo
al LERK-6 nativo, pero la cual tiene una secuencia
de aminoácido diferente de aquella del LERK-6
nativo (humano, murino u otras especies de mamífero) en razón de una
o más supresiones inserciones o sustituciones. La secuencia de
aminoácido variante preferiblemente es al menos 80% idéntica con la
secuencia de aminoácido LERK-6 nativa, más
preferiblemente al menos 90% idéntica. La identidad porcentual se
puede determinar, por ejemplo, al comparar la información de
secuencia que utiliza el programa de computadora GAP. Versión 6.0
descrita por Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984)
y disponible de la Universidad del Grupo de Computación Genética de
Wisconsin (UWGCG). Los parámetros por defecto preferidos para el
programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación unitaria (que
contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades)
para nucleótidos, y la matriz de comparación ponderada de Gribskov
y Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745. 1986. Es descrito por Schwartz
y Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence and Structure, National
Biomedical Research Foundation, pp. 353-358. 1979;
(2) una pena de 3.0 para cada espacio y una pena adicional de 0.10
para cada símbolo en cada espacio; y (3) ninguna pena para los
espacios finales. Las variantes pueden comprender secuencias
sustituidas de manera conservadora, significando que el residuo de
aminoácido dado es reemplazado por un residuo que tiene
características fisicoquímicas similares. Ejemplos de sustituciones
conservadoras incluyen la sustitución de un residuo alifático por
otro, tal como He, Val, Leu o Ala uno para el otro, o sustituciones
de un residuo por otro, tal como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln
y Asn. Otra de tales sustituciones conservadoras, por ejemplo, las
sustituciones de las regiones enteras que tienen características de
hidrofobicidad similares, son bien conocidas. Las variantes
LERK-6 de ocurrencia natural o los alelos también
están comprendidas por la invención. Ejemplos de tales variantes
son las proteínas que resultan de eventos de empalme de mARN
alterno o de clivaje proteolítico de la proteína
LERK-6, en donde la propiedad de unión del
LERK-6 se retiene. El empalme alternativo del mARN
puede producir una proteína LERK-6 truncada pero
biológicamente activa, tal como una forma soluble de ocurrencia
natural de la proteína, por ejemplo. Las variaciones atribuibles a
la proteolisis incluyen, por ejemplo, las diferencias en el
C-terminal luego de la expresión en diferentes tipos
de células huésped, debido a la remoción proteolítica de uno o más
aminoácidos terminales de la proteína LERK-6
(generalmente de los aminoácidos 1-5
terminales).
El LERK-6 se predice que se va
anclar a la superficie celular por vía del enlace
glicocil-fosfatidilinositol (GPI). Los anclajes de
membrana GPI, que incluyen la estructura química y el procesamiento
de estos, se describen en Ferguson, M. and Williams. A., Ann. Rev.
Biochem., 57:285, 1988 (incorporada aquí como referencia). Cuando
se expresa inicialmente, ciertas proteínas comprenden un dominio
hidrófobo C-terminal que contiene señales para el
anclaje GPI. Un sitio de clivaje esta localizado corriente arriba,
a menudo de aproximadamente 10-12 aminoácidos
corriente arriba del N-terminal del dominio
hidrófobo. El procesamiento post transduccional incluye el clivaje
de la proteína en este sitio de clivaje. Un anclaje GPI se une al
aminoácido C-terminal recientemente expuesto de la
proteína madura procesada. Así, cuando las proteínas
LERK-6 se expresan en las células que reconocen las
señales de anclaje GPI en el dominio hidrófobo, la secuencia de
aminoácido de longitud completa de la SEQ ID NO:2 representa formas
precursoras de las proteínas.
Con base en las secuencias de consenso derivadas
de otras proteínas de anclaje GPI, la región hidrófoba en el
LERK-6 de la presente invención probablemente esta
entre e incluye, los aminoácidos 170 (Leu) y 184 (Ser). Entre el
dominio hidrófobo y el dominio de unión de receptor, está una región
espaciadora de aproximadamente 22 a 25 aminoácidos de longitud. La
región espaciadora se extiende desde aproximadamente el aminoácido
145 (Asn), 146 (Glu) o 147 (Thr) a aproximadamente el aminoácido
169 (His).
El ejemplo 3 describe la construcción de una
proteína de fusión novedosa hek:Fc que se puede utilizar en la
selección de LERK-6. Otras regiones Fc de
anticuerpos se pueden sustituir por la región IgGI Fc humana
descrita en el ejemplo. Otras regiones FC adecuadas son aquellas que
se pueden unir con alta afinidad a la proteína A o proteína G, e
incluyen la región Fc del IgGI humano o los fragmentos de la región
IgGI Fc humana o de murino, por ejemplo, los fragmentos que
comprenden al menos la región de pivoteo de tal forma que se
formarán uniones de disulfuro intercadena. La proteína de fusión
hek:Fc ofrece la ventaja de ser fácilmente purificada. Además, las
uniones disulfuro se forman entre las regiones Fc de dos cadenas de
proteína de fusión separadas, creando dímeros.
Como se describió supra un aspecto de la
invención son los polipéptidos LERK-6 solubles.
Los polipéptidos LERK solubles comprenden todo o parte del dominio
extracelular del LERK-6 nativo pero falta la señal
GPI que originaria la retención del polipéptido sobre la membrana
celular. Los polipéptidos LERK-6 solubles
comprenden ventajosamente el péptido de señal nativo (o heterólogo)
cuando se sintetiza inicialmente para promover la secreción pero el
péptido de señal es clivado luego de la secreción del
LERK-6 de la célula. Los polipéptidos
LERK-6 solubles comprendidos por la invención
retiene la capacidad de unirse al receptor hek o elk. De hecho, el
LERK-6 soluble también puede incluir parte de la
señal GPI o parte del dominio citoplasmático u otras secuencias,
siempre y cuando la proteína LERK-6 soluble se pueda
secretar.
El LERK-6 soluble se puede
identificar (y distinguir de las contrapartes de unión de membrana
no soluble) al separar las células intactas que expresan la proteína
deseada del medio de cultivo, por ejemplo, mediante centrifugación,
y ensayando el medio (supernadante) para la presencia de la
proteína deseada. La presencia del LERK-6 en el
medio indica que la proteína se secreta de las células y es así una
forma soluble de la proteína deseada.
Las formas solubles del LERK-6
poseen muchas ventajas sobre la proteína LERK-6
unida nativa. La purificación de las proteínas provenientes de
células huéspedes recombinantes es factible, en razón a que las
proteínas solubles son secretadas de las células. Además, las
proteínas solubles son generalmente más adecuadas para
administración intravenosa.
Ejemplos de polipéptidos LERK-6
solubles incluyen aquellos que comprenden una porción sustancial
del dominio extracelular de una proteína LERK-6
nativa. Un ejemplo de una proteína LERK-6 de minino
soluble comprende los aminoácidos 1-145 de la SEQ
II) NO:2. Además, las proteínas LERK-6 solubles
truncadas que comprenden menos que el dominio extracelular completo
están incluidas en la invención. Cuando se expresa inicialmente
dentro de una célula huésped, el LERK-6 soluble
puede adicionalmente comprender uno de los péptidos de señal
heteróloga descritos adelante que es funcional dentro de la célula
huésped empleada. Alternativamente, la proteína puede comprender el
péptido de señal nativa. En una modalidad de la invención, el
LERK-6 soluble se puede expresar como una proteína
de fusión que comprende (desde el terminal N al C) el péptido de
señal del factor \alpha de levadura, un péptido FTAG® descrito
adelante en la patente U.S. No.5,011,912, y el
LERK-6 que consiste de los aminoácidos
1-134 de la SEQ ID NO:2. Esta proteína de fusión
recombinante se expresa en y se secreta de las células de levadura.
El péptido FLAG® facilita la purificación de la proteína, y
subsecuentemente se puede clivar del LERK-6 soluble
que utiliza enteroquinasa de mucosa de bovino. Las secuencias de
ADN aisladas que codifican las proteínas LERK-6
solubles están comprendidas por la invención.
El LERK-6 truncado, que incluye
los polipéptidos solubles, se puede preparar mediante cualquiera de
un número de técnicas convencionales. Una secuencia de ADN deseada
puede ser químicamente sintetizada utilizando técnicas conocidas
per se. Los fragmentos ADN también se pueden producir
mediante digestión de endonucleasa de restricción de una secuencia
de ADN clonada de longitud completa, y aislada mediante
electroforesis sobre geles de agarosa. Los ligadores que contienen
el o los sitios de clivaje de endonucleasa de restricción se pueden
emplear para insertar el fragmento de ADN deseado en un vector de
expresión, o el fragmento se puede digerir en los sitios de clivaje
naturalmente presentes allí. El procedimiento de reacción de cadena
de polimerasa bien conocido también se puede amplificar una
secuencia de ADN que codifica un fragmento de proteína deseado. Una
modalidad alternativa, en las técnicas de mutagénesis conocidas se
puede emplear para insertar un codón de parada en un punto deseado,
por ejemplo inmediatamente corriente abajo del codón para el último
aminoácido del dominio de unión de receptor.
Como se estableció anteriormente, la invención
suministra polipéptidos LERK-6 aislados u
homogéneos, tanto recombinantes como no recombianantes. Las
variantes y los derivados de las proteínas LERK-6
nativas que retienen la actividad biológica deseada (por ejemplo la
capacidad de unirse a hek/elk) se puede obtener mediante mutaciones
de secuencias de nucleótido que codifican para los polipéptidos
LERK-6 nativos. Las alteraciones de las secuencias
de aminoácidos nativas se pueden lograr mediante cualquiera de un
número de métodos convencionales. Las mutaciones se pueden
introducir en los locus particulares mediante oligonucleótido de
sinterización que contienen una secuencia mutante, flanqueada por
sitios de restricción que posibilitan la ligación a los fragmentos
de la secuencia nativa. Luego de la ligación la secuencia
reconstruida resultante que codifica un análogo que tiene la
inserción del aminoácido deseado inserción, sustitución o
supresión.
Alternativamente, los procedimientos de
mutagénesis específica de sitio dirigida a oligonucleótido se
pueden emplear para suministrar un gen alterado en donde los codones
predeterminados se pueden alterar mediante sustitución, supresión o
inserción. Los métodos de ejemplo para elaborar las alteraciones
establecidas anteriormente se describen por Walter et al.
(Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik
(Bio Techniques, January 1985,12-19); Smith et
al. (Genetic Engineering: Principies and Methods, Plenum Press,
1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985); Kunkel
et al. (Methods in Enzymol. 154:367, 1987); y las patentes
U.S. Nos. 4,518,584 y 4,737,462.
El LERK-6 se puede modificar
para crear los derivados de LERK-6 al formar
conjugados covalentes o agregativos con otras porciones químicas,
tales como los grupos glicosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y
similares. Los derivados covalentes del LERK-6 se
pueden preparar en las porciones químicas a grupos funcionales
sobre las cadenas laterales de aminoácido LERK-6 o
en el N-terminal o C-terminal de un
polipéptido LERK-6 o el dominio extracelular de
este. Otros derivados del LERK-6 dentro del alcance
de esta invención incluyen conjugados covalentes o agregativos de
LERK-6 o sus fragmentos con otras proteínas o
polipéptidos, tales como mediante síntesis en cultivo recombinante
como fusiones N-terminales o
C-terminales. Por ejemplo el conjugado puede
comprender una señal o secuencia de polipéptido líder (por ejemplo
el líder factor \alpha de Saccharomyces) en el
N-terminal de un polipéptido de
LERK-6. y la señal o el péptido líder dirige
co-transduccionalmente o post transduccionalmente la
transferencia del conjugado desde su sitio de síntesis a un sitio
dentro o fuera de la membrana celular o la pared celular.
Las fusiones de polipéptido
LERK-6 se pueden comprender péptidos agregados para
facilitar la purificación he identificación del
LERK-6, tales péptidos incluyen, por ejemplo,
poli-His o los péptidos de identificación
antigénica descritos en la patente U.S. No. 5,011,912 y en Hopp
et al., Biol Technology 6:1204, 1988.
La invención incluye además los polipéptidos
LERK- 6 con glicosilación de patrón nativo asociado. El
LERK-6 expresado en levadura o en sistemas de
expresión de mamífero (por ejemplo células COS-7)
puede ser similar a o significativamente diferente de un polipéptido
LERK-6 nativo en peso molecular y patrón de
glicosilación, dependiendo de la escogencia del sistema de
expresión. La expresión de los polipéptidos LERK-6
en sistemas de expresión bacterianos, tales como E. coli,
suministra moléculas no glicosiladas.
Las construcciones de ADN equivalente que
codifica en varias adiciones o sustituciones de residuos o
secuencias de aminoácido, o supresiones de residuos terminales o
internos o secuencias no necesarias para la actividad biológica o
que se unen están comprendidas por la invención. Por ejemplo, los
sitios de N-glicosilación en el dominio extracelular
de LERK-6 se pueden modificar para precluir la
glicosilación, permitiendo la expresión de un análogo de
carbohidratos reducido en sistemas de expresión de mamífero y
levadura, los sitios de N-glicosilación en
polipéptidos eucarióticos se caracterizan por un triplete de
aminoácido Asn-X-Y, en donde X es
cualquier aminoácido excepto Pro y Y es Ser o Thr. La proteína
LERK-6 de minino comprende tres de tales tripletes,
en los aminoácidos 13-15 145-147 y
159-161 de la SEQ ID NO:2. Las sustituciones,
adiciones a supresiones apropiadas a la secuencia de nucleótido que
codifica estos tripletes dará como resultado la prevención de la
unión del residuo de carbohidratos en la cadena lateral Asn. La
alteración de un nucleótido simple escogido de tal forma que el Asn
es reemplazado por un aminoácido diferente, por ejemplo, es
suficiente para inactivar un sitio de
N-glicosilación. En los procedimientos conocidos
para inactivar los sitios de N-glicosilación en
proteínas incluye aquellos descritos en la patente U.S. No.
5,071,972 y EP 276,846.
En otro ejemplo, los residuos Cys que codifican
secuencias que no son esenciales para la actividad biológica se
pueden alterar para originar que los residuos Cys sean suprimidos o
reemplazados con otros aminoácidos, evitando la formación de puentes
de disulfuro intramolecular incorrecto luego de la
renaturalización. Otros equivalentes se preparan mediante la
modificación de residuos de aminoácido dibásicos adyacentes para
mejorar la expresión en sistemas de levadura en los cuales está
presente la actividad de proteasa KEX2. La EP 212,914 describe el
uso de mutagénesis específica de sitio para inactivar los sitios de
procesamiento de la proteasa KEX2 en una proteína. Los sitios de
procesamiento de la proteasa KEX2 son inactivados al suprimir,
agregar o sustituir los residuos para alterar los pares
Arg-Arg, Arg-Lys, y
Lys-Arg para eliminar la ocurrencia de estos
residuos básicos adyacentes. Los pareados Lys-Lys
son considerablemente menos susceptibles al clivaje de KEX2, y la
conversión de Arg-Lys o Lys-Arg a
Lys-Lys representa una aproximación conservadora y
preferida para inactivar los sitios KEX2. El LERK-6
de murino contiene sitios de procesamiento de proteasa KEX2 en los
aminoácidos 81-82 de la SEQ ID NO:2.
Las secuencias de ácido nucleico dentro del
alcance de la invención incluyen secuencias de ADN y ARN aislado
que hibridizan las secuencias de nucleótido LERK-6
descritas aquí bajo condiciones de exigencia moderada o severa, y
que codifican el LERK-6 biológicamente activo. Las
condiciones de la exigencia moderada, como se define en Sambrook
et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1,
pp. 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
(1989), incluye el uso de una solución de prelavado de 5 x SSc,
0.5% de SDS, 1.0 mM de EDTA (pH 8.0) y las condiciones de
hibridización de aproximadamente 55°C, 5 x SSc, durante toda la
noche. Las condiciones de exigencia severas incluyen temperaturas
más altas de hibridización y lavado. El experto reconocerá que la
temperatura y la concentración de sal de solución de lavado se
pueden ajustar según sea necesario de acuerdo a factores tales como
la longitud de la molécula de ácido nucleico.
Debido a la degeneración conocida del código
genético en donde más de un codón puede codificar el mismo
aminoácido, una secuencia de ADN puede variar de aquella mostrada en
la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:7 que se suministra para comparación y
aun codificar una proteína LERK-6 que tiene la
secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:2 o la SEQ ID NO:8, que se
suministra para comparación respectivamente. Tales secuencias de
ADN variantes pueden resultar de mutaciones silentes (por ejemplo
que ocurren durante la amplificación PCR), o pueden ser el producto
de mutagénesis deliberada de una secuencia nativa.
La invención suministra secuencias de ADN
aislado equivalentes que codifican el LERK-6
biológicamente activo, seleccionado de:
(a) el cADN que comprende la secuencia de
nucleótido presentada en la SEQ ID NO:1; (b) el ADN capas de
hibridización a un ADN de (a) bajo condiciones moderadamente
exigentes y que codifiquen el LERK-6 biológicamente
activo; y (c) el ADN que se degenera como resultado del código
genético a un ADN definido en (a) o (b) y que codifica el
LERK-6 biológicamente activo. Las proteínas
LERK-6 codificadas por tales secuencias equivalentes
de ADN están comprendidas por la invención. Por comparación, se
suministra el cADN que comprende la secuencia de nucleótido
presentada en la SEQ ID NO:7.
Los ADN que son equivalentes a la secuencia de
ADN de la SEQ ID NO:1 y la SEQ ID NO:7, que se suministra para
comparación, hibridizará bajo condiciones moderada y severamente
exigentes a la secuencia de ADN que codifica los polipéptidos que
comprenden las secuencias de aminoácido de 1-184
SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:8, que se suministra para comparación.
Ejemplos de las proteínas LERK-6 codificadas por
tal ADN, incluyen opero no están limitadas a, los fragmentos de
LERK-6 (solubles de GPI-ligado) y
las proteína LERK-6 que comprenden el o los sitios
de N-glicosilación inactivado, el o los sitios de
procesamiento de proteasa de KEX2 inactivado, o el o las
sustituciones de aminoácido conservador, como se describió
anteriormente. Las proteínas LERK-6 codificadas por
el ADN derivado de otras especies de mamífero en donde el ADN
hibridizará el cADN de la SEQ ID NO:1 o el SEQ ID NO:7 están
también comprendidos por las proteínas LERK-6
codificadas por el ADN derivado de otras especies de mamífero, en
donde el ADN hibridizará el cADN de la SEQ ID NO:7 se suministran
para comparación.
Las variantes que poseen el requisito de
capacidad de unirse al receptor hek/elk se pueden identificar
mediante cualquier ensayo adecuado. La actividad biológica del
LERK-6 se puede determinar, por ejemplo, por la
competición para unir el dominio de unión de ligando del receptor
hek/elk (es decir ensayos de unión competitivos).
Un tipo de ensayo de unión competitivo para el
polipéptido LERK-6 utiliza un LERK-6
soluble radiomarcado y una proteína de fusión hck:Fc o elk:Fc unida
a una fase sólida a través de la interacción de una proteína A,
proteína G o un anticuerpo al hek, elk o porciones Fc de la
molécula, con la región Fc de la proteína de fusión. Otro tipo de
ensayo de unión competitivo utiliza receptores hek o elk solubles
radiomarcados tales como la proteína de fusión hek:Fc o elk:Fc, y
las células intactas que expresan el LERK-6.
Los ensayos de unión competitiva se pueden
desarrollar siguiendo metodología convencional. Por ejemplo, el
LERK-6 radiomarcado se puede utilizar para completar
con una homología LERK-6 putativa para ensayar para
la actividad de unión contra el hek/elk unido a superficie. Los
resultados cualitativos se pueden obtener mediante ensayos de unión
de placa autoradiográfica competitiva o se pueden utilizar gráficas
Scatchard para generar resultados cuantitativos.
Alternativamente, las proteínas de unión
hek/elk, tal como la LERK-6 y los anticuerpos
anti-hek/elk, se pueden unir a una fase sólida tal
como una matriz de cromatografia de columna o un sustrato similar
adecuado para identificar, separa o purificar las células que
expresan hek/elk sobre su superficie. La unión de una proteína de
unión hek/elk a una superficie de contacto de fase sólida se puede
lograr mediante cualquiera medios, por ejemplo, al construir una
proteína de fusión LERK-6:Fc y unir tal a la fase
sólida a través de la interacción de la proteína A o proteína G.
otros varios medios para fijar proteínas a una fase sólida son bien
conocidos en la técnica y son adecuados para el uso en la presente
invención. Por ejemplo, las microesferas magnéticas se pueden
recubrir con LERK-6 y mantener en un recipiente de
incubación a través de un campo magnético. Las suspensiones de
mezcla de células que contienen las células que expresan hek/elk son
puestas en contacto con la fase sólida que tiene en los
polipéptidos LERK-6 sobre estos. Las células que
tienen hek/elk sobre su superficie se unen al
LERK-6 fijo y 1 las células no unidas que luego son
lavadas. Este método de unión de afinidad es útil para purificar,
seleccionar y separar tales células que expresan hek/elk de la
solución. Los métodos para liberar las células positivamente
seleccionadas de la fase sólida son conocidos en la técnica y
comprenden, por ejemplo, el uso de enzimas. Tales enzimas son
preferiblemente no toxicas y no dañinas a las células y están
preferiblemente dirigidas a clivar el compañero de unión de
superficie celular. En el caso de las interacciones
hek/elk:LERK-6, la enzima preferiblemente se
clivaria del receptor hek/elk, liberando de esta manera la
suspensión de célula resultante del material LERK-6
"extraño". La población de célula purificada, especialmente si
se obtiene de tejido fetal, puede luego ser utilizada para
repopular (adulto). Por ejemplo, tales células neuronales
purificadas se pueden administrar a un paciente que tiene un
desorden neurodegenerativo tal como la enfermedad de Parkinson, la
enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Lou Gehrig, etc.
Alternativamente, las mezclas de células que se
sospechan que contienen células hek/elk+ pueden ser primero
incubadas con LERK-6 biotinilado. Los periodos de
incubación son típicamente de al menos una hora de duración para
asegurar la unión suficiente al hek/elk. La mezcla resultante es
entonces pasada a través de una columna empacada de glóbulos
recubiertos con avidina, por medio de los cuales la alta afinidad
de biotina para la avidina suministra la unión de las células a los
glóbulos. El uso de glóbulos recubiertos con avidina es conocido en
la técnica. Ver Berenson, et al. J. Cell. Biochem., 10D:239
(1986). El lavado de material no unido y la liberación de las
células unidas se desarrolla utilizando métodos convencionales.
Como se describió anteriormente el
LERK-6 se puede utilizar para separar células que
expresan hek/elk. En un método alternativo, el
LERK-6 o un dominio extracelular o un fragmento de
este se puede conjugar a una porción detectable tal como ^{125}I
para detectar lasa células que expresan hek/elk. El radiomarcado
con ^{125}I se puede desarrollar mediante varias metodologías
estándar que producen una molécula
^{125}I-LERK-6 funcional marcada
para alta actividad específica o un cuerpo yodinado o biotinilado
contra la región hek/elk o la región Fc de la molécula se puede
utilizar otra porción detectable tal como una enzima que puede
catalizar una reacción colorimétrica o fluorimétrica, biotina a
avidina. Las células pueden ser ensayadas para expresión hek/elk que
se pueden contactar con LERK-6 marcado. Después de
la incubación, el LERK-6 marcado no unido se
remueve y la unión se mide utilizando la porción detectable.
Las características de unión del
LERK-6 (que incluyen variantes) también se pueden
determinar utilizando el hek/elk soluble conjugado (por ejemplo,
^{125}I- hek/elk:Fc) en ensayos de competición similares a
aquellos descritos anteriormente. En este caso, sin embargo, las
células intactas que expresan hek/elk unidas a un sustrato sólido,
son utilizadas para medir la extensión en la cual una muestra que
contiene una variante LERK-6 compite por unión con
un hek/elk soluble conjugado a LERK-6.
Otros medios para ensayar el
LERK-6 incluyen el uso de anticuerpos
anti-LERK-6, líneas celulares que
proliferan en respuesta al LERK-6 o líneas de
células recombinantes que expresan hek/elk y proliferan en
presencia de LERK-6.
Las proteínas LERK-6 descritas
aquí también se pueden emplear para medir la actividad biológica de
las proteínas hek/elk en términos de su afinidad de unión para el
LERK-6. Como un ejemplo, el LERK-6
se puede utilizar para determinar si la actividad biológica se
retiene después de la modificación de una proteína hek o elk (por
ejemplo la modificación química, truncamiento, mutación, etc.). La
actividad biológica de una proteína hek o elk se puede así precisar
antes que esta sea utilizada en estudios de investigación, o
posiblemente en la clínica, por ejemplo.
Las proteínas LERK-6 encuentran
uso como reactivos que se pueden emplear por aquellos que conducen
estudios de "aseguramiento de calidad", por ejemplo monitorear
la vida de estante y la estabilidad de la proteína elk bajo
diferentes condiciones. Para ilustrar, el LERK-6 se
puede emplear en un estudio de afinidad de unión para medir la
actividad biológica de una proteína elk que ha sido almacenada a
diferentes temperaturas, o producida en diferentes tipos de célula.
La afinidad de unión de la proteína elk modificad para
LERK-6 se compara con aquella de una proteína elk no
modificada para detectar cualquier impacto adverso de las
modificaciones sobre la actividad biológica del elk. De manera
similar, la actividad biológica de la proteína hek se puede evaluar
utilizando LERK-6.
Los polipéptidos LERK-6 también
encuentran uso como vehículos para suministrar agentes unidos a
este a células que llevan el receptor de superficie de célula hek o
elk. La expresión del antígeno hek ha sido reportada para ciertas
líneas de célula leucémica, que incluyen la línea de célula de
leucemia de célula T humana designada JM y la línea de célula de
leucemia de célula pre-B humana designada LK63
(Boyd et al., J. Biol. Chem. 267:3262, 1992 and Wicks et
al., Proc Nati. Acad. Sci. USA, 89:1611, 1992). Las proteínas
LERK-6 se pueden así utilizar para suministrar
agentes de diagnóstico o terapéutico a estas células (o a otros
tipos de célula encontrados que expresan hek sobre la superficie de
la célula) o en procedimientos in vitro o in vivo.
Un ejemplo de tal uso es exponer un alinea de
célula leucémica hek+ o elk+ a un agente terapéutico/conjugado de
LERK-6 para evaluar si el agente exhibe
citotoxicidad hacia las células leucémicas. Un número de diferentes
agentes terapéuticos unidos al LERK-6 puede ser
incluido en un ensayo para detectar y comparar el efecto citotóxico
de los agentes sobre las células leucémicas. Los conjugados de
LERK-6 agente de diagnóstico se pueden emplear para
detectar la presencia de células hek+ in vitro o in
vivo.
Los agentes de diagnóstico y terapéuticos que se
pueden unir al polipéptido LERK-6 incluyen pero no
están limitados a, drogas, toxinas, radionúclidos, cromóforos,
enzimas que catolizan una reacción colorimétrica y fluorimétrica, y
similares, con el agente particular siendo escogido de acuerdo a la
aplicación pretendida. Ejemplos de drogas que incluyen aquellas
utilizadas para tratar varias formas de cáncer, por ejemplo,
mostazas de nitrógeno tales como mostaza de nitrógeno de
L-fenilalanina o ciclofosfamida, agentes
intercalantes tales como cis-diaminodicloroplatino,
antimetabolitos tales como 5-florouacit, alcaloides
vinca tales como vincristina y antibióticos tales como bleomicina,
doxorubicina, daunorubicina, y derivados de estos. Entre las toxinas
están la ricina, abrina y toxina de difteria, La exotoxina A de P
Pseudomonas aeruginosa, las proteínas de inactivación
ribosomal, las micotoxinas tales como trichotecenes y derivados y
fragmentos (por ejemplo cadenas simples) de estas. Los
radionúclidos adecuados para uso diagnóstico incluyen, pero no
están limitados a, ^{123}I, ^{131}I, ^{99m}Tc, ^{111}In, y
^{76}Br. Los radionúclidos adecuados para uso terapéutico
incluyen, pero no están limitados a, ^{131}I, ^{211}At,
^{77}Br, ^{186}Re, ^{188}Re, ^{212}Pb, ^{212}Bi,
^{109}Pd, ^{64}Cu, y ^{67}Cu.
Tales agentes se pueden unir al
LERK-6 mediante cualquier procedimiento convencional
adecuado. El LERK-6, que es una proteína, comprende
grupos funcionales sobre cadenas laterales de aminoácido que se
pueden hacer reaccionar con grupos funcionales sobre un agente
deseado para formar uniones covalentes, por ejemplo,
alternativamente, la proteína o el agente se puede derivar para
generar o unir un grupo funcional reactivo deseado. La
derivatisación puede involucrar la unión de uno de los reactivos
acoplantes bifuncionales disponible para unir varias moléculas a
proteínas (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois). Un número
de técnicas para proteínas de radiomercado son conocidas. Los
metales de radionúclidos se pueden unir a LERK-6 al
utilizar un agente bifuncional adecuado, por ejemplo.
Los conjugados que comprenden el
LERK-6 y un agente de diagnóstico o terapéutico
adecuado (preferiblemente ligado covalente mente) son así
preparados. Los conjugados se administran o se emplean de otra
forma en una cantidad apropiada para la aplicación particular.
Otro uso del LERK-6 de la
presente invención es como herramienta de investigación para
estudiar el papel del LERK-6, en conjunto con el hek
o elk puede jugar en el crecimiento o diferenciación de las células
que llevan el receptor a hek o elk. Los polipéptidos
LERK-6 de la presente invención también se pueden
emplear en ensayos in vitro para la detección de elk o
LERK-6 sobre las interacciones de este. De manera
similar, el LERK-6 encuentra uso en ensayos para hek
o la interacción de LERK-6 con hek.
Como se discutió anteriormente, cuando varios
tejidos de rata fueron analizados para los transcritos elk mARN se
detectaron solamente en cerebro y testículos (Lhotak et al.,
supra). La unión del LERK-6 a los receptores
relacionados con eph sobre tejido neuronal se cree que ejerce un
efecto neuroprotector o neurotrófico.
El LERK-6 encuentra uso como
reactivo de cultivo de tejido. En la proteína LERK-6
se puede agregar a neuronas cultivadas in vitro para mejorar
la viabilidad o prolongar el espectro de vida de neuronas
cultivadas, facilitando así los estudios de investigación, y el
posible tratamiento clínico del tejido neuronal.
Una modalidad de la presente invención esta
dirigida a un método para tratar desordenes del tejido neuronal,
que involucra poner en contacto el tejido neuronal con
LERK-6. Tales desordenes incluyen daño o
enfermedades neurológicas, crónicas o agudas. Una proteína
LERK-6 se puede administrar a un mamífero para
tratar tal daño o enfermedad. En una modalidad de la invención, el
LERK-6 se emplea para tratar condiciones
neurodegenerativas caracterizadas o mediadas, al menos en parte,
por el mecanismo de la enfermedad neuronal conocido como
excitotoxicidad. Además. El LERK-6 se puede
administrar a un mamífero para ejercer un efecto trópico sobre la
enfermedad neuronal. En un paciente que sufre perdida o daño de
neuronas debido al daño o enfermedad, el LERK-6
puede mejorar la viabilidad de aquellas neuronas que han
sobrevivido.
Los polipéptidos LERK-6 de la
invención se pueden formular de acuerdo a métodos conocidos
utilizados para preparar composiciones farmacéuticamente útiles. El
LERK-6 se puede combinar en mezcla, como el
material activo solo o con otros materiales activos conocidos, con
diluyentes farmacéuticamente adecuados (por ejemplo
Tris-Hcl, acetato, fosfato), preservativos (por
ejemplo timerosal, benzil alcohol, parabenos), emulsificadores,
solubilizadores, adyuvantes y/o vehículos. Los vehículos adecuados
y sus formulaciones se describen en Remington's Pharmaceutical
Sciences, 16th ed. 1980, Mack Publishing Co. Además, tales
composiciones pueden contener LERK-6 en complejo
con polietilenglicol (PEG), iones de metal, o incorporado en
compuestos poliméricos tales como ácido poliacético, ácido
poliglicólico, hidrogeles, etc., o incorporado en liposomas,
microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multi lamelares,
fantasmas de eritrocito o esferoblastos. Tales composiciones
influenciaran el estado físico, la solubilidad, estabilidad, tasa de
liberación in vivo, y la tasa de limpieza in vivo del
LERK-6. El LERK-6 también se puede
conjugar a anticuerpos contra receptores específicos de tejido,
ligandos o antígenos, o acoplado a ligandos de los receptores
específicos de tejido. Donde se encuentra el hek/elk sobre las
células neoplásicas, el LERK-6 se puede conjugar a
una toxina por medio de la cual el LERK-6 se utiliza
para suministrar la toxina al sitio especifico, o se puede utilizar
para sensibilizar tales células neoplásicas para subsecuentemente
administrar agentes antineoplásicos.
El LERK-6 se puede administrar
tópicamente, parenteralmente, o mediante inhalación. El término
"parenteral" incluye inyecciones subcutáneas, intravenosas,
intramusculares, inyección intracisternal o técnicas de infusión.
Estas Composiciones contendrán típicamente una cantidad efectiva
del LERK-6, sola o en combinación con una cantidad
efectiva de cualquier otro material activo. Tales dosis y
concentraciones de drogas deseadas contenidas en las composiciones
pueden variar dependiendo de muchos factores, que incluyen el uso
pretendido, el peso del cuerpo del paciente y la edad, y la ruta de
administración. Las dosis preliminares se pueden determinar de
acuerdo a ensayos en animales, y el escalamiento de las dosis para
administración en humanos se puede desarrollar a prácticas
aceptadas.
Los polipéptidos LERK-6 pueden
existir como oligómeros tales como dímeros o trímeros
covalentemente ligados o no covalentemente ligados. Los oligómeros
se pueden ligar mediante enlaces de disulfuro formados entre
residuos de cisteína sobre diferentes polipéptidos
LERK-6. en una modalidad de la invención, un dímero
LERK-6 se crea al fusionar el LERK-6
a la región Fc de un anticuerpo (por ejemplo IgGI) de manera que no
interfiera con la unión LERK-6 a 1 dominio de unión
de ligando hek/elk. Los polipéptidos Fc preferiblemente se fusionan
al C-terminal de un LERK-6 soluble
(que comprende solamente una unión de receptor). La preparación
general de las proteínas de fusión que comprenden los polipéptidos
heterólogos fusionados a varias porciones de los polipéptidos
derivados de anticuerpo (que incluye el dominio Fc), se incorporan
aquí como referencia Ashkenazi et al., (PNAS USA 88:10535,
1991) y Byrn et al. (Nature 344:677, 1990). Una fusión de gen
que codifica la proteína de fusión LERK-6:FC se
inserta en un vector de expresión apropiado. Las proteínas de
fusión LERK-6:Fc se les permite ensamblarse más como
moléculas de anticuerpo, por medio de la cual se forman las uniones
disulfuro intercadena entre los polipéptidos Fc, produciendo
LERK-6 divalente si las proteínas de fusiones hacen
tanto con cadenas pesadas como ligera de un anticuerpo, es posible
formar un oligómero LERK-6 con tanto como cuatro
regiones extracelulares LERK-6. Alternativamente,
uno puede enlazar dos dominios LERK-6 solubles con
un ligador de péptido.
Las células huéspedes adecuadas para la
expresión de los polipéptidos LERK-6 incluyen
procariotes, levaduras o células eucarióticas superiores. La
clonación apropiada y los factores de expresión para uso con
bacterias, hongos, levaduras y huéspedes celulares de mamífero son
descritos, por ejemplo, en Pouwels et al. Cloning Vectors: A
Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985). Los sistemas de
traducción de célula libre también se podrían emplear para producir
los polipéptidos LERK-6 utilizando los ARN
derivados de las construcciones de ADN descritas aquí.
Los procariotes incluyen organismos gram
negativos o gram positivos, por ejemplo, E. coli o Bacilli.
Las células huéspedes procarióticas adecuadas para la transformación
incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis. La
Psahnonella typhimurium, y varias otras especies dentro del
género Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus. En
una célula huésped procariótica tal como la E. coli, un
polipéptido LERK-6 puede incluir un residuo de
metionina N-terminal para facilitar la expresión
del polipéptido recombinante en la célula huésped procariótica. El
Met N-terminal se puede clivar desde el polipéptido
LERK-6 recombinante expresado.
Los polipéptidos LERK-6 se
pueden expresar en células huéspedes de levadura preferiblemente
del género Saccharomyces (por ejemplo S. cerevisiae). Otros
géneros de levadura, tal como Pichia, K. lactis o
Kluiberomyces, también se pueden emplear. Los vectores de
levadura contendrán a menudo un origen de secuencia de replicación
de un plásmido de levadura de 2 \mu, una secuencia autónomamente
replicante (ARS), una región promotora, secuencias para la
poliadenilación, secuencias para la poliadenilación, secuencias para
la terminación de transcripción, y un gen marcador seleccionable.
Las frecuencias promotoras adecuadas para los vectores de levadura
incluyen, entre otros, promotores para metalotioneina,
3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., J.
Biol. Chem. 255:2073, 1980), u otras enzimas glicolíticas (Hess
et al., J. Adv.Enzyme Red. 7:149, 1968); y Holland et
al., Biochem. 17:4900, 1978), tales como enolasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa,
fosfofructoquinasa, y glucosa-6 fosfato isomerasa,
3-fosfoglicerato mutara, piruvato quinasa,
triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.
Otros vectores y promotores adecuados para uso en la expresión de
levadura son adicionalmente descritos en Hitzeman,
EPA-73,657 O EN Fleer et al., Gene,
107:258-195 (1991); y van den Berg et al.,
Biol Technology, 8:135-139 (1990). Otra alternativa
es el promotor ADH2 expresable en glucosa descrito por Russsell
et al., (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) y Beber et
al., (Nature 300:724, 1992). Los vectores de lanzadera
replicables tanto en levaduras como en E. Coli se pueden
construir al insertar las secuencias de ADN de pBR322 para la
selección y replicación en E. Coli (el gen Amp^{r} y el
origen de replicación) en los vectores de levadura anteriormente
descritos.
Una secuencia líder factor \alpha de levadura
se puede emplear para dirigir la secreción del polipéptido
LERK-6. La secuencia líder del factor \alpha es a
menudo insertada entre la secuencia promotora y la secuencia del
gen estructural. Ver, por ejemplo, Kurjan et al., Cell
30:933, 1982; Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
81:5330, 1984; U. S. Patent 4, 546,082; y EP 324,274. Otras
secuencias líder adecuadas para facilitar la secreción de los
polipéptidos recombinantes de huéspedes de levadura son conocidas
por aquellos expertos en la técnica. Una secuencia líder se puede
modificar cerca de s extremo 3' para contener uno más sitios de
restricción. Esto facilitará la función de la secuencia líder al
gen estructural.
Los protocolos de transformación de levadura son
conocidos por aquellos expertos en la técnica. Uno de tales
protocolos se describe en Hinnen et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 75:1929, 1978. El protocolo Hinnen et al selecciona
para transformar Trp^{+} en un medio selectivo, en donde el medio
selectivo consiste de 0.67% de base de nitrógeno de levadura, 0.5%
de ácidos casamino, 2% de glucosa, 10 \mug/ml de adenina y 20
\mug/ml de uracilo.
Las células huésped de levadura transformadas
mediante vectores que contienen la secuencia promotora ADH2 se
puede hacer crecer para inducir la expresión en un medio
"rico". Un ejemplo de un medio rico es uno que consiste de 1%
de extracto de levadura, 2% de peptona y 1% de glucosa suplementada
con 80 \mug/ml de adenina y 80 \mug/ml de uracilo. La depresión
del promotor ADH2 ocurre cuando la glucosa se agota del medio.
Los sistemas de cultivo de célula huésped de
mamífero o insecto también se podrían emplear para expresar
polipéptidos LERK-6 recombinantes. Los sistemas de
baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células
de insectos son revisados por Luckow y Sunimers. Biol Technology
6:47 (1988). Las líneas celulares establecidas de origen mamífero
también se pueden emplear. Ejemplo de lineas cellares huéspedes de
mamífero adecuadas incluyen la línea COS-7 de callos
de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell
23:175, 1981), Las células L, las células C 127, las células 3T3
(ATCC CCL 163). Las células de ovario de conejillo de indias (CHO).
Las células HeLa, y las líneas celulares BHK (ATCC CRL 10), y la
línea celular CV-1/EBNA-1 derivadas
de la línea celular de riñón de mono verde Africano CVI (ATCC CCL
70) como se describió en McMahan et al (EMBO J. 10:2821,
1991).
Las secuencias de control transcripcionales y
transduccionales para los vectores de expresión de células huésped
de mamífero se pueden escindir de genomas virales. Las secuencias
promotoras comúnmente utilizadas y las secuencias mejoradoras se
derivan del virus Polioma. El adenovirus 2, el virus de Simio 40
(SV 40), y el citomegalovirus humano. Las secuencias de ADN
derivadas del genoma viral SD 40, por ejemplo, de origen SV 40, el
promotor temprano y tardío mejorador, empalme, y sitios de
poliadenilación se pueden utilizar para suministrar otros elementos
genéticos para la expresión de una secuencia de gen estructural en
una célula huésped de mamífero. Los promotores tempranos y tardíos
virales son particularmente útiles por que ambos son fácilmente
obtenidos del genoma viral como un fragmento el cual también puede
contener un origen viral de replicación (Fiers et al, Nature
273:113, 1978). Los fragmentos SV 40 más grandes o más pequeños
también se pueden utilizar, siempre y cuando la secuencia de
aproximadamente 250 Bp que se extiende desde el sitio Hind III hacia
el sitio Bgl 1 localizado en el origen viral SV 40 del sitio de
replicación se incluya.
Los vectores de expresión de ejemplo para uso en
células huésped de mamífero se pueden construir como se describió
por Okayama y Berg (Mol, Cell. Biol. 3:280, 1.983). Un sistema útil
para el alto nivel de expresión estable de cADN de mamífero en
células epiteliales de mamífero de murino C127 se pueden construir
sustancialmente como se describió en Cosman et al., (Mol
Immunol. 23:935, 1986). Un vector de expresión alto. PMLSV N1 /N4,
descrito por Cosman et al, Nature 312:768, 1984 ha sido
depositado como ATCC 39890. Los vectores de expresión de mamífero
útiles adicionales se describen en la
EP-A-0367566, y en la solicitud de
Patente U.S. Serie No. 07/701.415. Presentada en Mayo 16, 1991. Los
vectores se pueden derivar de retrovirus. En lugar de la secuencia
de señal nativa, y además de un iniciador metionina, una secuencia
de señal heteróloga se puede agregar, tal como la secuencia de
señal para el IL-7 descrito en la Patente de los
Estados Unidos 4,965,195; la secuencia de señal para el receptor
IL-2 descrita en Cosman et al; Nature 312:
768 (1984); El péptido de señal IL-4 descrito en la
EP367, 566; el péptido de señal de receptor IL-2
tipo 1 descrito en la Patente U.S. 4,968,607; y el péptido de señal
de receptor IL-1 tipo 2 descrita en la EP
460,846.
El LERK-6 como una proteína
aislada, purificada u homogénea de acuerdo con la invención se
puede producir mediante sistemas de expresión recombinantes como se
describieron anteriormente o se purificaron de las células de
ocurrencia natural. El LERK-6 se puede purificar
hasta homogeneidad sustancial, como se indica mediante una banda de
proteína simple luego de análisis mediante electroforesis de gel
SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE).
Un proceso para producir LERK-6
comprende cultivar una célula huésped transformada con un vector de
expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica el
LERK-6 bajo condiciones suficientes para promover
la expresión del LERK-6. El LERK-6
es luego recuperado del medio de cultivo por los extractos de
célula., dependiendo del sistema de expresión empleado. Como es
conocido para el experto, los procedimientos para purificar una
proteína recombinante variaran de acuerdo a tales factores como el
tipo de células huéspedes empleadas y si o no la proteína
recombínate se secreta en el medio de cultivo.
Por ejemplo, cuando los sistemas de expresión
que secretan la proteína recombinante se emplea, el medio de
cultivo primero se puede concentrar utilizando un filtro de
concentración de proteína comercialmente disponible, por ejemplo,
una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Luego de
la etapa de concentración, el concentrado se puede aplicar a una
matriz de purificación tal como un medio de filtración de gel.
Alternativamente, luego de la etapa de concentración, el
concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación tal como
un medio de filtración de gel. Alternativamente, una resina de
intercambio de anión se puede emplear, por ejemplo, una matriz o
sustrato que tiene grupos dietilaminoetil pendientes (DEAE). Las
matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros
tipos comúnmente moleados en purificación de proteína.
Alternativamente, la etapa de intercambio de catión puede ser
empleada. Los intercambiadores de catión adecuados incluyen varias
matrices insolubles que comprenden los grupos sulfopropilo o
carboximetilo. Los grupos sulfopropilo son los preferidos.
Finalmente, una o más etapas de cromatografia líquida de alto
desempeño de fase inversa (RP-HPLC) que emplean los
medios RP-HPLC hidrófobos, (por ejemplo gel de
sílice que tiene los grupos etilo u otros grupos alifáticos
pendientes) se pueden emplear para purificar adicionalmente el
LERK-6. Algunas o todas las etapas de purificación
anteriores, en varias combinaciones, son bien conocidas y se pueden
emplear para suministrar una proteína recombinante sustancialmente
homogénea.
Es posible utilizar una columna de afinidad que
comprende el dominio de unión de ligando de los receptores hek/elk
para purificar con afinidad los polipéptidos LERK-6
expresados. Los polipéptidos LERK-6 se pueden
remover de una columna de afinidad que utiliza técnicas
convencionales, por ejemplo, en un amortiguador de elusión alta en
sal y luego dializar en un amortiguador más bajo en sal o al
cambiar el pH u otros componentes dependiendo de la matriz de
afinidad utilizada. Alternativamente, la curva de afinidad puede
comprender un anticuerpo que se une al LERK-6. El
ejemplo 5 describe un procedimiento para emplear el
LERK-6 de la invención para generar anticuerpos
monoclonales dirigidos contra el LERK-6.
La proteína recombinante producida en cultivo
bacterial se puede aislar mediante disrupción inicial de las
células huéspedes, centrifugación, extracción de los lóbulos de
célula si el es un polipéptido insoluble o de el fluido
sobrenadante si es un polipéptido soluble, seguido por una o más
etapas de concentración, salteado, intercambio de ión, purificación
de afinidad o cromatografia de descripción de tamaño. Finamente, el
R y el HPLC se pueden emplear para las etapas de purificación
final. Las células microbianas pueden ser irrumpidas por un método
conveniente, que incluye el ciclo de congelado- descongelado,
sonicación, irrupción mecánica, o el uso de agentes lisantes de
célula.
Las células huésped de levadura transformada son
preferiblemente empleadas para expresar el LERK-6
como un polipéptido secretado con el fin de simplificar la
purificación. El polipéptido recombinante secretado de una
fermentación de célula huésped de levadura se puede purificar
mediante métodos análogos a aquellos descritos por Urdal et
al., (J. Choromatog. 296:171, 1984). Urdal et al,
describe dos etapas de HPLC de fase inversa secuencial para la
purificación del IL-2 humano recombinante sobre una
columna de HPLC preparativa.
De los ácidos nucleicos del
LERK-6 incluyen oligonucleótidos anti sentido o con
sentido que comprenden una secuencia de ácido nucleico de hebra
simple (ARN o ADN) capaz de unirse al mARn del
LERK-6 blanco) o con sentido las secuencias de
LERK-6 (anti sentido). Los oligonucleótidos con
sentido o anti sentido, de acuerdo con la presente invención,
comprenden un fragmento de la región codificante del cADN de
LERK-6. Tal fragmento comprende generalmente al
menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferiblemente desde
aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos. La capacidad
para derivar un oligonucleótido anti sentido o con sentido, con base
en la secuencia de ADN que codifica una proteína dada, se describe
en, por ejemplo, Stein and Cohen (Cáncer Res. 48:2659). Y van der
Krol et al (Bio Technique 6:958. 1988).
La unión de los oligonucleótidos anti sentido o
con sentido a las secuencias de ácido nucleico blanco dan como
resultado la formación de duplex que bloquean la trascripción o
traducción de la secuencia blanco mediante uno o varios medios que
incluyen la degradación mejorada de los duplex, la terminación
prematura de la trascripción o traducción o mediante otros medios.
Los oligonucleótidos anti sentido pueden ser así utilizados para
bloquear la expresión de las proteínas LERK-6. Los
oligonucleótidos anti sentido o con sentido comprenden además
oligonucleótidos que han modificado las estructuras de
azúcar-fosfodiéster (u otros enlaces de azúcar,
tales como aquellas descritas en la WO 91/06629) y en donde los
enlaces de azúcar son resistentes a nucleasas endógenas. Tales
oligonucleótidos con enlaces de azúcar resistente son estables in
vivo (es decir capaces de resistir la degradación enzimática)
pero retienen la especificidad de la secuencia para ser capaz de
unirse a secuencias de nucleótido blanco. Otros ejemplos de
oligonucleótidos con sentido o anti sentido incluyen aquellos
oligonucleótidos que están covalentemente ligados a cuestiones
orgánicas, tales como aquellas descritas en la WO 90/10448, y otras
porciones que incrementan la afinidad de los oligonucleótidos para
la secuencia de ácido nucleico blanco, tal como
poli-(L-lisina). Aún adicionalmente, los agentes
intercalantes, tales como la elipticina y los agentes alquilatantes
o los complejos de metal se pueden unir a oligonucleótidos con
sentido o anti sentido para modificar las especificidades de unión
del oligonucleótido anti sentido o con sentido para la secuencia de
nucleótido blanco.
Los oligonucleótidos anti sentido o con sentido
se pueden introducir en una célula que contiene una secuencia de
ácido nucleico o blanco mediante cualquier método de transferencia
de gen, que incluye, por ejemplo, transfección de ADN mediada por
CaPo_{4}, electroporación, o al utilizar vectores de
transferencia de gen tales como los virus de
Epstein-Barr. Los oligonucleótidos anti sentido o
con sentido son preferiblemente introducidos en una célula que
contiene la secuencia de ácido nucleico blanco mediante la
inserción del oligonucleótido anti sentido o con sentido en un
vector de retroviral adecuado, poniendo en contacto entonces la
célula con el vector retroviral que contiene la frecuencia
insertada, in vivo o ex vivo. Los vectores
retrovirales adecuados incluyen, pero no están limitados a,
aquellos derivados del retrovirus de murino M-MuLV,
N2 (un retrovirus derivado de M-MuLV), o los
vectores de copia doble designados DCT5, DCT5B, y DCT5C (ver
solicitud presente US 90/02656).
Los oligonucleótidos con sentido o anti sentido
también se pueden introducir en una célula que contiene la
secuencia de nucleótido blanco mediante la formación de un conjugado
con una molécula de unión de ligando, como se describe en la WO
91/04753. Las moléculas de unión de ligando adecuadas incluyen,
pero no están limitadas a, receptores de superficie celular,
receptores de crecimiento, otras citoquinas, u otros ligandos que
se unen a los receptores de superficie celular. Preferiblemente, la
conjugación de la molécula que se une al ligando no interfiere
sustancialmente con la capacidad de la molécula que se une al
ligando para unirse a su molécula o receptor correspondiente, o
bloquea la entrada del oligonucleótido con sentido o anti sentido a
su versión conjugada en las célula.
Alternativamente, un oligonucleótido con sentido
o contrasentido se puede introducir en una célula que contiene la
secuencia de ácido nucleico blanco mediante la formulación de un
complejo oligonucleótido-lípido, como se describió
en la WO 90/10448. El complejo
oligonucleótido-lípido con sentido o anti sentido
está preferiblemente asociado dentro de la célula por una lipasa
endógena.
Además de lo anterior, los siguientes ejemplos
se suministran para ilustrar las modalidades particulares y no
limitar el alcance de la invención.
Este ejemplo describe un procedimiento para
aislar la secuencia de ADN que codifica el LERK-6
de murino de la invención. Una librería de cADN embriónica de murino
de 11.5 días comercialmente disponible se obtuvo de Clonetech
Laboratories, Inc, Palo Alto. California. La librería se plateo de
acuerdo a los procedimientos detallados en el manual suministrado
por Clonetech, y se seleccionaron utilizando las sondas
radiomarcadas con ^{32}P. Cada una de las sondas fue generada
utilizando técnicas estándar. En general, las amplificaciones de la
reacción de cadena de polimerasa (PCR) (Mullis and Faloona, Meth.
Enzymol. 155:333-350, 1987) se desarrollaron
utilizando dos conjuntos de anunciadores.
El primer conjunto.
GATATTTACTGCCCGCACTACAACAGCT | SEQ ID NO:3 | |
AGAGAAGGCGCTGTAGCGCT GGAAC | SEQ ID NO:4 |
Se utilizaron para generar fragmentos de ADN de
hebra doble amplificados del ADN del LERK-3. El
LERK-3 es el sujeto de la solicitud de patente
copendiente series Serial Nos. 08/109, 745; 08/114,426; 08/161, 132
y 08/240,124 presentada en Mayo 9, 1994. La sonda del
LERK-3 comprendía los nucleótidos 260 a 481 de la
SEQ ID NO: de la solicitud copendiente Serie no. 08/240, 124
presentada en Mayo 9, 1994. El segundo conjunto de iniciadores,
ACGTAGTCTA CTGGAACTCC AGTAACCCCA G | SEQ ID NO:5 | |
AGCCTCAAGCACTGGCCAGAACTCTCTCTGGAGT | SEQ ID NO:6 |
Se utilizaron para generar fragmentos de ADN de
hebra doble amplificados del ADN del LERK-4. El
LERK-4 también es el sujeto de la solicitud de
patente copendiente Seriales No. 08/104,745; 08/114, 426 y
08/161,132 y 08/24, 124 presentada en Mayo 9, 1994. La sonda de
LERK-3 comprendida los nucleótidos 110 a 467 de la
SEQ ID NO:3 de la solicitud copendiente Serie NO. 08/240, 124
presentada en Mayo 9, 1994. Los fragmentos fueron radiomarcados con
^{32}P, y utilizados con sondas para seleccionar una librería
embriónica de murino.
La selección con las sondas fue conducida
mediante procedimientos convencionales, y fueron identificados los
clones hibridizantes. Las condiciones hibridizantes consistieron de
42°C Y 50% DE Starks lavado a 0.1 X SSC a 63°C. La secuencia de
nucleótido del inserto de cADN de un clon individual aislado de la
librería embriónica de murino, el clon designado \lambda 13, fue
determinada. Una secuencia de cADN sustancialmente completa de la
región codificante del clon \lambda 13 cADN, y la secuencia de
aminoácido codificada de esta manera, se presenta en la SEQ ID NO:1
en la SEQ ID NO:2, respectivamente. La estructura de lectura
abierta dentro de esta secuencia codifica una proteína de 184
aminoácidos. En razón a que el N-terminal de las
proteínas de la familia LERK son no homólogos, se cree que el
primer aminoácido de la SEQ ID NO:1 (Ala) se localiza en o muy cerca
al terminal N nativo. Además, en razón a que el
LERK-6 de esta invención es homólogo con otras
moléculas LERK biológicamente activas, existe una probabilidad
significativa de que el cADN de la SEQ ID NO:1 codifique una
proteína biológicamente activa. La secreción de tal proteína activa
es posible a través del procedimiento descrito anteriormente con
respecto a la adición de una metionina iniciadora y una secuencia
de señal adecuada tal como aquella para el murino
IL-7, la secuencia de aminoácido de
LERK-6 es 58% homóloga con aquella de la citoquina
denominada Lerk-3.
Un clon que contiene lisado de célula \lambda
13 ADN (El cADN LBRK-6 en \lambda gt10) se
depositó con el American Type Culture Colecction, Rockville. MD.
USA en Junio 15, 1994, y se le asignó el número de acceso aATCC
75829. El depósito fue hecho bajo los términos del tratado de
Budapest.
Ejemplo Comparativo
2
Este ejemplo describe la clonación de ácidos
nucleicos que codifican LERK-6 humano. La secuencia
de LERK-6 humano es de un clon genómico aislado al
sondear una librería genómica humana con una sonda de cADN de
LERK-6 DE murino que codifica los aminoácidos
30-173. La placa que contiene los filtros fue
hibridizada a una sonda marcada con ^{32}P a 55°C durante 24 h.
lavada a 0.5 x SSC a 55°C, y expuesta a una película de rayos X
(Kodak XAR-5). Una secuencia de ácidos nucleicos
contenidos en tal clon se muestra adelante. También en la SEQ ID
NO:7, y los aminoácidos codificados de esta manera se muestran en
la SEQ ID NO:8.
Comparado con el LERK-6 de
murino, el LERK-6 DE HUMANO POSEE 98.77 similitudes
porcentuales y 93.269 identidades porcentuales.
Este ejemplo describe la construcción de un
vector de expresión que codifica una proteína de fusión
elk-Fc soluble. Esta proteína de fusión se puede
emplear en los ensayos de unión del ejemplo 5, para determinar las
características de unión del LERK-6.
Un ADN y ka secuencia de aminoácido codificada
para el cADN elk de rata se presenta en Lhotak et al. (Mol.
Cell. Biol. 11:2496, 1991), incorporada aquí como referencia.
La proteína elk de rata tiene un dominio
extracelular de 538 aminoácidos, un dominio de transmembrana de 25
aminoácidos, y un dominio citoplasmático de 419 aminoácidos.
Un fragmento de cADN elk de rata se fusionó al
extremo 5 del cADN que codifica la porción Fc de un anticuerpo IgG1
humano. El cADN elk de rata puede ser obtenido de T. Pawson (Samuel
Lunenfeld Research Institute. Mt. Sinai. Hospital, Toronto). Un
sitio de clivaje de de endonucleasa de restricción Asp
718-se introdujo corriente arriba de la región
codificante elk. Se aisla un fragmento Asp
718-BgIII CADN elk de rata (que comprende el dominio
extracelular completo, la región de transmembrana y la porción
pequeña del dominio citoplasmático).
El ADN que codifica la cadena de polipéptido
simple que comprende la región Fc del anticuerpo IgG1 humano se
clona en el sitio SpeI del vector pBLUESCRIPT sk®, que está
comercialmente disponible de Stratagene Cloning System, La Jolla,
California. El vector de plásmido es replicable en E. Coli y
contiene un segmento poliligador que incluye 21 sitio de restricción
únicos. La secuencia de nucleótido del ADN clonado, junto con la
secuencia de aminoácido del polipéptido Fc codificado de ésta
manera, se describe en la solicitud PCT WO 93/10151, incorporado
aquí como referencia. Un sitio BglII ha sido introducido, y
comprende los codones para los aminoácidos 3 y 4 del polipéptido
Fc. El polipéptido Fc codificado se extiende desde la región de
pivoteo N-terminal al C-terminal
activo, es decir, en una región Fc de anticuerpo de longitud
esencialmente completa.
El fragmento de cADN Asp718- BglII elk descrito
anteriormente se clonó en un vector pBLUESCRIPT sk® que contiene el
Fc cADN, de tal forma que el cADN del elk se ubica corriente arriba
del cADN del Fc cADN. El ADN de hebra simple derivado de la fusión
de gen resultante se mutagenizó mediante el método descrito en
Kunkel (Proc. Natl. Sci. USA 82:488) y Kunkel et al (Methods
in Enzymol. 154:367, 1987) con el fin de fusionar perfectamente el
dominio extracelular completo de elk a la secuencia Fc. El ADN
mutagenizado se secuenció para confirmar que los propios
nucleótidos habían sido removidos (es decir que la región de
transmembrana y el dominio citoplasmático parcial fueron
suprimidos) y que la secuencia elk y Fc estuvieron en la misma
estructura de lectura.
La proteína de fusión elk:Fc preferiblemente se
sintetiza en células huésped de mamífero, tales como las células
CVI-EBNA o COS-7. La fusión de gen
elk:Fc se escindió e insertó en un vector de expresión de mamífero
designado HAV-EO (Dower et al., J. Immunol.
142:4314, 1989). Las células huésped de mamífero fueron
transfectadas con el vector de expresión recombinante resultante y
cultivadas ara permitir la expresión transitoria de la proteína de
fusión, que se secretó en el medio de cultivo por vía del péptido
de señal elk La proteína de fusión elk:Fc se purificó mediante
cromatografia de afinidad utilizando una columna de sefarosa de
proteína A.
Este ejemplo describe la construcción de un
vector de expresión que codifica una proteína de fusión
hek-Fc soluble. Esta proteína de fusión se puede
emplear en los ensayos de unión del Ejemplo 5 para determinar las
características de unión de LERK-6.
Un ADN y una secuencia de aminoácido codificada
para cADN de hek humano se presenta en Wicks et al. (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 89:1611 (1992), incorporada aquí como
referencia. Esta proteína hek comprende (desde el terminal N al c)
un dominio extracelular, un dominio de transmembrana, y un dominio
citoplasmático.
Dos fragmentos de ADN, uno que codifica un
fragmento n-terminal del dominio extracelular hek y
el otro que codifica un fragmento C-terminal del
dominio extracelular hek, fueron aislados mediante reacciones de
cadena de polimerasa (PCR) conocidas bajo condiciones estándar,
utilizando los iniciadores de oligonucleótido con base en la
secuencia de nucleótido hek publicada por Wicks et al, supra.
El molde para el PCR fue el cADN preparado del mARN aislado de una
línea celular leucémica de célula T humana designada
CCRF-HSB-2 (ATCC
CCL-120.1). Los productos PCR que contienen el
extremo 5' del ADN fueron digeridos con Sp1 y HindIII para aislar el
fragmento de ADN que se extiende desde el terminal 5' de la
secuencia hek humana madura (es decir a la que le faltan el ADN que
codifica la secuencia de señal) al sitio HindIII encontrado en el
gen hek. Los productos PCR que contienen el extremo 3' del ADN de
dominio extracelular hek fueron digeridos con HindIII y CalI para
aislar un fragmento que se extiende desde el sitio HindIII interno
al sitio ClaI justo corriente abajo del extremo 3' de la secuencia
que codifica el dominio extracelular. El sitio ClaI es un sitio de
clonación múltiple (mes) introducido justo corriente abajo del
dominio extracelular.
El ADN que codifica una muteina de la región Fc
de un anticuerpo IgG1 humano se aisló. Este ADN de muteina Fc y el
polipéptido codificado de esta manera se describen en la solicitud
de Patente U.S. Serie No. 08/09, 827, titulada "Novel Citoquin
Vich is ligand for OX 40" presentada en Julio 23, 1993, cuya
solicitud se incorpora aquí como referencia. El ADN de luteína se
derivó de un ADN que codifica el polipéptido Fc nativo mediante
mutagénesis dirigida de sitio conducida esencialmente como se
describió por Deng y Nickoloff, Anal, Biochem. 200:81 (1992). La
secuencia de aminoácido del polipéptido de muteina FC es idéntica a
aquella del polipéptido Fc nativo descrita en la solicitud PCT WO
93/10151, excepto que el aminoácido 19 ha sido cambiado de Leu a
Ala, el aminoácido 20 ha sido cambiado de Leu a Glu, y el
aminoácido 22 ha sido cambiado de Gly a Ala. Esta muteina FC exhibe
afinidad reducida por los receptores de inmunoglobulina.
Un vector recombinante que contiene el ADN de
muteina Fc fue clivado con ClaI y NotI, el cual clivó el vector en
una región poliligadora inmediatamente corriente arriba y corriente
abajo respectivamente, del inserto de ADN de muteina Fc. El
fragmento que codifica la muteina Fc deseada se aisló.
El polipéptido Fc de muteina se extiende desde
la región de pivoteo N-terminal al terminal C
nativo, es decir, es una región Fc de anticuerpo longitud
esencialmente completa. Los fragmentos de las Fc, por ejemplo,
aquellos que son truncados en el extremo C-terminal,
también se pueden emplear. Los fragmentos preferiblemente contienen
residuos de cisteína múltiple (al menos los residuos de cisteína en
la región de pivoteo) para permitir a los enlaces disulfuro de inter
cadena formarse entre las porciones de polipéptido Fc de las dos
proteínas de fusión hek:Fc, creando
dímeros.
dímeros.
Un vector de expresión de mamífero designado
SMAG4 se clivó con SpeI y NotI. El vector SMAG4 comprende una
secuencia que codifica al péptido de señal 7 de interleuquina de
murino (descrito en la patente U.S. 4,965,195) insertado en el
vector de expresión alto de mamífero pDC 201 (descrito en Sims
et al. Science 241:585, 1988, y la solicitud PCT WO
89/03884), que también es capaz de replicación de E. Coli.
El SpeI oliva el vector inmediatamente corriente abajo de las
secuencias que codifica el péptido de señal IL-7. El
NotI oliva aproximadamente 155 bp corriente abajo del sitio SpeI un
sitio de clonación múltiple del vector. El fragmentó SpeI/NotI largo
que contiene las secuencias del vector y el ADN que codifica el
péptido de señal IL-7 se aisló.
Una ligación de 4 días se condujo al insertar
los dos fragmentos de ADN que codifican el hek y el fragmento de
ADN que codifica la muteina Fc descrita anteriormente en el vector
de expresión SMAG4 clivado SpeI/NotI. Las células de E. Coli
fueron transfectadas con una mezcla de ligación y el vector
recombinante deseado s aisló de éste. El vector aislado codifica una
proteína de fusión que comprende (desde el Terminal N al C) del
péptido de señal IL-7 de murino, el dominio
extracelular hek, cuatro aminoácidos codificados por el mcs
introducidos, y la luteína Fc.
El vector de expresión fue luego cotransfectado
con el plásmido pSV3.NEO en células CV1/EBNA. La línea celular
CV1/EBNA (ARCC CRL 10478) se derivó de una línea celular de riñón
de mono como se describió en McMahan et al. (EMBO J.,
10:2821, 1991). El vector pSV3.NEO expresa el antígeno T SV40, el
cual no es producido por las células huéspedes. El vector pSV3.NEO
es similar al pSV3 (Mulligan and Berg, Proc. Nail. Acad. Sci. USA
78:2072, 1981), pero adicionalmente contiene un gen de resistencia
a la neomicina. Las células transformadas fueron cultivas para
permitir la expresión transitoria de la proteína de fusión, que se
secretó en el medio de cultivo por vía del péptido de señal
IL-7 de murino. La proteína de fusión se puede
purificar sobre una columna de proteína A sefarosa, eluida, y
utilizada para seleccionar células por la capacidad de unirse a la
proteína hek:Fc o la proteína elk:Fc.
La capacidad del LERK-6 a unirse
al elk o hek se puede determinar al utilizar el siguiente ensayo.
Las células que expresan el LERK-6 sobre la
superficie celular se preparan. El ADN del LERK-6
se amplifica mediante PCR. Los iniciadores empleados en el PCR son
seleccionados para definir el terminal de la región codificante del
ADN del LERK-6, y también incluyen el sitio de
restricción Xho I en el extremo 5' y el sitio Not I en el extremo 3'
del ADN amplificado. El iniciador 5' adicionalmente incluyó una
secuencia Kozak de consenso corriente arriba del codón de
iniciación.
Los productos de reacción son digeridos con Xho
I y Not I e insertados en un vector de expresión clivado con Sal I
(que es compatible con Xho 1) y el Not I. El vector de expresión
puede ser pDC410, que es un vector de expresión de mamífero que
también se replica en el E. Coli. El pDC410 es similar al
pDC406 (McMahan et al., EMBO J. 10:2821, 1991). El sitio de
clonación múltiple pDC410 (mcs) difiere de aquel del pDC406 en que
éste contiene unos sitios de restricción adicionales y tres codones
de parada (uno en cada estructura de lectura). El promotor de
polimerasa T7 corriente abajo del mcs facilita la secuenciación del
inserto de ADN en el mcs. Además, el origen EBV de la replicación
se reemplaza mediante el ADN que codifica el antígeno T largo de
SV40 (manejado desde un promotor SV40) en pDC410.
Las células
CV1-EBNA-1 en platos de 10 cm^{2}
se transfectan con un vector de expresión recombinante que contiene
el ADN del LERK-6. La línea celular
CV-1/EBNA-1 (ATCC CRL 10478)
expresa constitutivamente el antígeno-1 nuclear EBV
manejado desde el mejorador/promotor
inmediato-temprano CMV. El
CV1-EBNA-1 se deriva de la línea
celular de riñón de Mono Verde Africano CV-1 (ATCC
CCL 70), como se describió en McMahan et al. (EMBO J.
10:2821, 1991).
Las células transfectadas son cultivadas durante
24 horas, y las células en cada plato son entonces divididas en una
placa de 24 pozos. Después de cultivar 48 horas adicionales, se
condujo un ensayo de unión mediante el siguiente procedimiento. Las
células transfectadas (aproximadamente 4x10^{4} células/pozo) son
lavadas con BM-NFDM, que es un medio de unión (RPMI
1640 que contiene 25 mg/ml de albúmina de suero bovino, 2 mg/ml de
ácida de sodio, 20 mM de Hepes pH 7.2) al cual había sido agregados
50 mg/ml de leche seca sin grasa. Las células son entonces incubadas
durante 1 hora a 37°C con varias concentraciones de proteína de
fusión elk:Fc preparada en el Ejemplo 2 de la proteína de fusión
hek:Fc preparada en el Ejemplo 3. Las células son entonces lavadas e
incubadas con una concentración saturante constante de un medio de
unión IgG antihumano ^{125}I-ratón, con una
agitación suave durante 1 hora a 37°C. Después de un lavado
extensivo, las células son liberadas vía tripsinización.
El IgG antihumano de ratón empleado
anteriormente está dirigido contra la región Fc del IgG humano y se
puede obtener del Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West
Grove, PA. El anticuerpo es radioyodinado utilizando el método de
cloramina-T estándar. El anticuerpo se unirá a la
porción Fc de cualquier proteína de fusión elk:Fc o hek:Fc que se
haya unido a las células. En todos los ensayos, la unión no
específica del anticuerpo^{125}I se ensaya en ausencia del elk:Fc
(o el hek:Fc), así como también en la presencia del elk:Fc (o
hek:Fc) y un exceso molar de 200 veces de anticuerpo IgG antihumano
de ratón no marcado.
El anticuerpo ^{125}I unido a célula se
cuantifica sobre un contador Packard Autogarnma. Los cálculos de
afinidad (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949) son
generados sobre RS/1 (BBN Software, Boston, MA) corridos sobre un
computador Microvax.
Este ejemplo ilustra un método para preparar los
anticuerpos monoclonales LERK-6. El
LERK-6 purificado, un fragmento de éste tal como el
dominio extracelular, los péptidos sintéticos o células que
expresan LERK-6 se pueden utilizar para generar
anticuerpos monoclonales contra el LERK-6 que
utiliza técnicas convencionales, por ejemplo, aquellas técnicas
descritas en la Patente U.S. 4,411,993. En resumen, los ratones son
inmunizados con LERK-6 como un inmunógeno
emulsificado en un adyuvante de Freund completo, e inyectado en
cantidades que varían desde 10-100 \mug
subcutáneamente o intraperitonealmente. Diez a doce días más tarde,
los animales inmunizados son reforzados con LERK-6
adicional emulsificado en un adyuvante de Freund incompleto. Los
ratones son periódicamente reforzados posteriormente con un programa
de inmunización semanal o bisemanal. Las muestras de suero son
periódicamente tomadas en un sangrado retro-orbital
o una excisión de punta de cola para ensayar los anticuerpos
LERK-6 mediante ensayo dot blot, ELISA (Ensayo
Inmunoabsorbente Ligado a Enzima) o inhibición de unión de hek o
elk.
Luego de la detección de un título de anticuerpo
apropiado, a los animales positivos le es suministrada una
inyección intravenosa final del LERK-6 en solución
salina. Tres a cuatro días más tarde, los animales son
sacrificados, las células de bazo cosechadas, y las células de bazo
son fusión das a una línea celular de mieloma de murino, por
ejemplo, NS1 o preferiblemente P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Las
fusiones generan células de hibridoma, las cuales son puestas en
placa en placas de microtítulo múltiple en medio selectivo HAT
(hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la
proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma, e
híbridos de célula de bazo.
Las células de hibridoma son seleccionadas
mediante ELISA para reactividad contra LERK-6
purificado mediante las adaptaciones a las técnicas descritas en
Engvall et al., Immunochem. 8:871, 1971 y en la Patente U.S.
4,703,004. Una técnica de selección preferida es la técnica de
captura de anticuerpos descrita en Beckmann et al., (J.
Immunol. 144:4212, 1990). Las células de hibridoma positivas se
pueden inyectar intraperitonealmente en los ratones BALB/c
singeneicos para producir ascitos que contienen altas
concentraciones de anticuerpos monoclonales
anti-LERK-6-L.
Alternativamente, las células de hibridoma pueden crecer en
recipientes in vitro o en botellas de rodillo mediante
varias técnicas. Los anticuerpos monoclonales producidos en ascitos
de ratón se pueden purificar mediante precipitación de sulfato de
amonio, seguido por cromatografia de exclusión de gel.
Alternativamente, la cromatografia de afinidad basada en la unión
del anticuerpo a la proteína A o a la proteína G también se puede
utilizar, como lo puede la cromatografia de afinidad basada en la
unión al LERK-6.
Muestra
7
Este ejemplo describe un procedimiento para
generar ratones transgénicos que sobreexpresan
LERK-6. Los ratones transgénicos que sobreexpresan
LERK-6 se pueden estudiar para determinar los
efectos biológicos de la sobreexpresión. Los pronúcleos de ratón (B
16/J) son microinyectados con ADN de LERK-6 de
acuerdo al método descrito por Gordon et al., Science
214:1244-1246, (1981). En general, los huevos de
ratón fertilizados que tienen pronúcleos visibles son primero
colocados en una cámara de inyección y mantenidos en su lugar con
una pequeña pipeta. Se utiliza un pipeta de inyección para inyectar
el gen que codifica el LERK-6 (por ejemplo, el clon
#6C) en los pronucleos del huevo. Los huevos inyectados son (i)
transfectados en el oviducto de una hembra seudopreñada p.c. de 0.5
días; (ii) cultivada in vitro en la etapa de dos células
(durante toda la noche) y transfectadas en el oviducto una hembra
seudopreñada p.c. de 0.5 días; o (iii) cultivado in vitro la
etapa de blastocito y transferida al útero de una hembra
seudopreñada p.c. de 2.5 días. Preferiblemente, cualquiera de las
dos primeras opciones se puede utilizar en razón a que ellas evitan
el cultivo in vitro extendido, y preferiblemente,
aproximadamente 20-30 huevos microinyectados se
deben transferir para evitar las camadas pequeñas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Cerretti, Douglas P.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Citoquina Designada como LERK-6
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Immunex Corporation
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 51 University Street
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Seattle
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: WA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 98101
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEÍBLE POR COMPUTADORA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Floppy disk
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- COMPUTADORA: Apple Macintosh
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: System 7.1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE APLICACIÓN HABITUALES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US-a ser asignada-
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- INFORMACIÓN DE ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Malaska, Stephen L.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 32,655
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA: 2826
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (206)587-0430
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (206)233-0644
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 555 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- CONTRASENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: LERK-6
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 1.552
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 184 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Cadn
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATATTTACT GCCCGCACACTA CAACAGCT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN,
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI SENTIDO: Nno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGAGAAGGCG CTGTAGCGCT GGAAC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACGTAGTCTA CTGGAACTCC AGTAACCCA G
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCCTCAAGC ACTGGCCAGA ACTCTCTCTG GAGT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 314 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/LLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITIO: 2..313
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 104 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (17)
1. Una secuencia de ácido nucleico que codifica
un polipéptido que une hek/elk en donde el polipéptido es al menos
90% idéntico con una secuencia de aminoácidos seleccionada de:
(a) aminoácidos 1-134 de la SEQ
ID NO:2;
(b) aminoácidos 1-145 de la SEQ
ID NO:2; y
(c) aminoácidos 1-184 de la SEQ
ID NO.2.
2. Secuencia de ácido nucleico aislado que
codifica un Polipéptido que se une al hek/elk, seleccionado de:
(a) una secuencia de ácido nucleico que
comprende la secuencia de la SEQ ID NO:1;
(b) una secuencia de ácido nucleico que codifica
la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:2;
(c) una secuencia de ácido nucleico que
hibridiza bajo condiciones de alta exigencia al complemento de la
secuencia de ácido nucleico de (a) o (b); y
(d) una secuencia de ácido nucleico que, debido
a la degeneración del código genético, codifica un polipéptido que
tiene la secuencia de aminoácido de un polipéptido codificado por
una secuencia de ácido nucleico de (a) o (c).
3. Un polipéptido aislado que une hek/elk, en
donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido que es al
menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácido seleccionada de:
(a) aminoácidos 1-134 de la SEQ
ID NO:2;
(b) aminoácidos 1-145 de la SEQ
ID NO:2; y
(c) aminoácidos 1-184 de la SEQ
ID NO:2.
4. Un polipéptido codificado por la secuencia de
ácido nucleico aislada de acuerdo a la reivindicación 2.
5. Un vector de expresión que comprende una
secuencia de ácido nucleico de cuerdo a la reivindicación 1 o la
reivindicación 2.
6. Una célula huésped transfectada o
transformada con el vector de expresión de acuerdo a la
reivindicación 5.
7. Un proceso para producir un polipéptido que
se une al hek/elk que comprende cultivar una célula huésped de
acuerdo a la reivindicación 6 bajo condiciones que promueven la
expresión, y recuperar en el polipéptido el medio de cultivo.
8. Un anticuerpo aislado que se une
específicamente a un polipéptido de acuerdo a la reivindicación 3 o
a la reivindicación 4.
9. Un anticuerpo aislado de acuerdo a la
reivindicación 8 que es un anticuerpo monoclonal.
10. Un mamífero no humano transgénico todas
cuyas células germinales y somáticas contienen una secuencia de ADN
que codifica a la reivindicación 1 o la reivindicación 2 introducida
en dicho mamífero, o un ancestro de dicho mamífero, en una etapa
embrional.
11. Un método para separar células que tienen un
receptor hek/elk sobre la superficie de éste de una mezcla de
células en suspensión, que comprende poner en contacto las células
en la mezcla con una superficie de contacto que tiene un
polipéptido de acuerdo a la reivindicación 3 o reivindicación 4
sobre éste, y separar la superficie de contacto de la
suspensión.
12. Un método in vitro para suministrar
una molécula deseada a una célula que tiene hek/elk sobre su
superficie, que comprende poner en contacto la célula con una
proteína de fusión que comprende un polipéptido de acuerdo a la
reivindicación 3 o a la reivindicación 4 y la molécula deseada.
13. Una composición que comprende un polipéptido
de la reivindicación 3 o la reivindicación 4 y uno o más diluyentes
farmacéuticamente adecuados, emulsificadores, solubilizadores,
adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente adecuados.
14. El polipéptido de la reivindicación 3 o la
reivindicación 4 para uso como un medicamento.
15. El polipéptido de la reivindicación 3 o la
reivindicación 4 para la elaboración de un medicamento para uso en
terapia.
16. Una secuencia de ácido nucleico aislado de
acuerdo a la reivindicación 1 que codifica un polipéptido que se
une a hek/elk en donde el polipéptido comprende una secuencia de
aminoácido seleccionada de:
(a) los aminoácidos 1-134 de la
SEQ ID NO:2;
(b) los aminoácidos 1-145 de la
SEQ ID NO:2; y
(c) los aminoácidos 1-184 de la
SEQ ID NO:2.
17. Un polipéptido aislado de acuerdo a la
reivindicación 3 que une hek/elk, en donde el polipéptido comprende
una secuencia de aminoácido seleccionada de:
(a) los aminoácidos 1-134 de la
SEQ ID NO:2;
(b) los aminoácidos 1-145 de la
SEQ ID NO:2; y
(c) los aminoácidos 1-184 de la
SEQ ID NO:2.
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