ES2236710T3 - Nueva citoquina denominada lerk-5. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN POLIPEPTIDOS LERK-5, JUNTO CON SECUENCIAS DE ADN, VECTORES Y CELULAS TRANSFORMADAS, UTILIZADOS EN LA PRODUCCION DE LERK-5. LOS POLIPEPTIDOS LERK-5, SE UNEN A ELK Y HEK, MIEMBROS DE LA FAMILIA EPH/ELK DE RECEPTORES DE TIROSINA QUIMASAS.

Description

Nueva citoquina designada LERK-5.

Antecedentes de la invención

Las proteínas conocidas como receptores tirosin quinasa tienen una actividad quinasa intrínseca que se activa sobre la unión de ligandos. Esta clase de proteínas se caracteriza por motivos estructurales conservados en los dominios catalíticos (Hanks et al., Science 242:42, 1988) y pueden ser subdivididas en familias basadas en características estructurales de las regiones N-terminal de los dominios catalíticos.

Boyd et al. (J. Biol. Chem. 267:3262, 1992) purificaron una glicoproteína de la superficie celular, que exhibía actividad tirosin quinasa. La secuencia de aminoácidos del N-terminal identificó a esta proteína como un miembro de la familia eph/elk, y la proteína fue por tanto designada hek (quinasa humana de tipo eph/elk). Se usó un anticuerpo monoclonal inmunorreactivo con hek, para estudiar la expresión de hek en varios tipos celulares humanos (Boyd et al., supra). Se detectó antígeno hek en la línea celular LK63, de células pre-B de la leucemia (la línea celular empleada como el inmunógeno contra el que el anticuerpo aumentó), y en la línea celular JM de células-T de la leucemia, humanas. La línea celular del linfoma Raji B mostró una expresión débil del antígeno hek, y las demás líneas celulares analizadas (tanto líneas celulares normales como tumorales, entre las que estaban las líneas celulares hemopoyéticas que incluían las líneas pre-B y células-T) fueron consistentemente negativas. De las biopsias de tejidos normales y tumorales que fueron analizadas para ver la expresión del antígeno hek, ninguno de los tejidos normales fue positivo, y solo una muy baja proporción de los tumores hemopoyéticos fue positiva.

La expresión de transcripciones de hek en las líneas celulares LK63 y JM anteriormente descritas, además de en la línea celular HSB-2 de las células-T de la leucemia, ha sido demostrada mediante análisis northern blot (Wicks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1611, 1992). Los nucleótidos y las secuencias de aminoácidos para un clon de ADNc de hek, aislado, son presentados en Wicks et al., supra.

La proteína de la superficie celular, designada elk, es otro miembro de la familia de proteínas de los receptores tirosin quinasa. Un clon parcial de elk se descubrió primero en un archivo de expresión de ADNc de cerebro de rata, que fue monitorizada para encontrar proteínas que expresaran actividad tirosin quinasa (Lerwin et al., Oncogene 3:621, 1988). Más tarde, una secuencia compuesta que abarcaba toda la región de codificación de elk, se derivó a partir de clones parciales aislados a partir de archivos de ADNc de cerebro de rata, y de un archivo de cerebro cerebelar de rata, usando el clon parcial como una sonda (Lhotak et al., Mol. Cell. Biol. 11:2496, 1991).

Las proteínas hek y elk están estrechamente relacionadas con varios otros receptores tirosin quinasa, incluyendo los homólogos de hek, mek4 y cek4 (Sajjadi et al., New Biol. 3:769, 1991); eek (Chan et al., Oncogene 6:1057, 1991); erk (Chan et al. supra.); eck (Lindberg et al., Mol. Cell. Biol. 10:6316, 1990); cek5 (Pasquale, E.B. Cell Regulation 2:523, 1991); y eph (Hirai et al., Science 238:1717, 1987). Las proteínas de esta subfamilia están relacionadas no solo por sus dominios citoplásmicos, si no también por sus dominios extracelulares, que son idénticos en entre un 41% y un 68%. Interesantemente, la distribución tisular de estos distintos receptores es diversa. Por ejemplo, se ha dado a conocer que la expresión del ARNm de elk está limitada a los testículos y al cerebro (Lhotak et al. supra), mientras que encontramos a eck no solo en esos mismos tejidos, sino también en pulmón, intestino, riñón, bazo, ovario, y piel también.

Esos ligandos que han sido identificados para los receptores tirosin quinasa, son un diverso grupo de proteínas que afectan al crecimiento, diferenciación y supervivencia de las células que expresan los receptores. Se han aislado los ligandos para hek y elk, tal como se discute con mayor detalle más abajo.

La identificación de cualquiera ligandos adicionales para hek y elk que pudieran existir, resultaría ser muy útil en la investigación de la naturaleza de los procesos celulares regulados por la señalización a través esos receptores. Si se desea el refuerzo o la inhibición de una señal biológica particular mediada a través de esos receptores, es ventajoso el identificar cada una de las proteínas que pueden jugar un rol en la transducción de dichas señales. Es más, se conocen proteínas que se unen a determinados receptores sin transducción de la señal de inicio, incluyendo la proteína antagonista del receptor de interleuquina-1 (Eisenberg et al., Nature 343:341, 1990; Hannum et al., Nature 343:336, 1990; y Carter et al., Nature 344:633, 1990). La identificación de cualquier proteína adicional que se una a hek o elk, es deseable para determinar si esas proteínas funcionan como antagonistas.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona una nueva citoquina designada LERK-5 que se una a elk y a hek, que son miembros de la familia eph/elk, de receptores tirosin quinasa. La presente invención también proporciona ADN codificante de la proteína LERK-5, aislado, y vectores de expresión que comprenden al ADN aislado. Un método para producir LERK-5 incluye el cultivo de células hospedadoras que contienen a los vectores de expresión bajo condiciones apropiadas para la expresión de la proteína LERK-5, y la recuperación de la LERK-5. También se desvelan los anticuerpos dirigidos contra la LERK-5.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 presenta una alineación de las secuencias de aminoácidos de la LERK-5 humana y de la LERK-5 murina. Para cada proteína, se recuadra la región transmembrana, y se señala con un círculo al primer aminoácido de la proteína madura. Las identidades de los aminoácidos se indican con líneas verticales.

Descripción detallada de la invención

De acuerdo con la presente invención, se ha aislado un ADNc codificante de una nueva proteína designada LERK-5, que se une a los receptores de la superficie celular conocidos como elk y hek. También se proporcionan vectores de expresión que comprenden el ADN de la LERK-5. Los métodos para producir polipéptidos recombinantes LERK-5, incluyen el cultivo de células hospedadoras transformadas con los vectores de expresión, bajo condiciones apropiadas para la expresión de LERK-5, y la recuperación de la LERK-5 expresada. La presente invención también abarca a la proteína LERK-5 purificada, incluyendo formas solubles de la proteína que comprende al dominio extracelular.

La presente invención también proporciona LERK-5 o fragmentos de la misma, que pueden actuar como inmunógenos para generar anticuerpos reactivos a esto. En una forma de realización, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales específicos para la LERK-5.

El ADNc de la LERK-5 humana fue aislada con éxito tal como se describe en el ejemplo 1. La secuencia de ADN de la región codificante de un clon de ADNc de la LERK-5 humana, y la secuencia de aminoácidos codificada de ese modo, se disponen en SEQ ID NO:1 y SE ID NO:2. La proteína codificada comprende un péptido señal N-terminal (aminoácidos -25 al -1 de la SEQ ID NO:2), un dominio extracelular (aminoácidos 1 al 199), una región transmembrana (aminoácidos 200 al 225), y un dominio citoplásmico (aminoácidos 226 al 308). La unión de la LERK-5 a los dos receptores de la superficie celular conocidos como elk y hek, se demuestra en el ejemplo 4.

Un lisado celular que contenía un vector fago recombinante \lambdagt10, que comprendía al ADNc de la LERK-5, fue depositado con la American Type Culture Collection, el 16 de junio de 1994, y se le asignó el número de acceso ATCC 75815. El depósito se realizó bajo los términos del Tratado de Budapest. El vector recombinante \lambdagt10 era el aislado en el ejemplo 1, e identificado como clon \lambda6.

La nueva citoquina desvelada aquí es un ligando para elk, un receptor de la superficie de célula de rata, que es miembro de la familia eph/elk de receptores tirosin quinasa. La expresión del ARNm de elk ha sido detectada en el cerebro y en los testículos de ratas (Lhotok et al., supra), y se ha sugerido la posibilidad de que elk sea capaz de activación oncogénica (Letwin et al., supra). La citoquina es adicionalmente un ligando para hek, que es otro miembro de la familia eph/elk de receptores tirosin quinasa (Boyd et al., J. Biol. Chem. 267:3262, 1992; Wicks et al., PNAS USA 89:1611, 1992). Entre los tipos celulares en los cuales se expresa hek, hay ciertas líneas celulares de la leucemia humana.

El término "LERK-5" tal como se usa aquí se refiere a un género de polipéptidos que son capaces de unirse a elk y a hek, y de exhibir homología sustancial con la secuencia de aminoácidos de la LERK-5 desvelada aquí. La LERK-5 humana está en el ámbito de la presente invención, tal como lo están las proteínas LERK-5 derivadas de otras especies de mamíferos, incluyendo (aunque no quedando limitadas a) los murinos, ganado bovino, porcino, o varias especies de primates. Tal como se usa aquí, el término "LERK-5" incluye proteínas unidas a la membrana (comprendiendo un domino extracelular, una región de transmembrana, y un dominio citoplásmico) así como proteínas truncadas que retienen la propiedad de unión con elk o con hek. Estas proteínas truncadas incluyen, por ejemplo, LERK-5 soluble que comprende solo el dominio extracelular (la zona de unión al receptor).

Se han identificado otras proteínas que se unen a elk y hek. La LERK-5 de la presente invención es una nueva proteína, distinta de las otras proteínas de unión a elk y a hek.

Se describe un ligando elk en la solicitud PCT WO 94/11384. La secuencia de nucleótidos del ADNc clonado (designado clon tele7) que codifica a este ligando elk, además de la secuencia de aminoácidos codificada de ese modo, son presentadas en WO 94/11384. La proteína es una proteína transmembrana de tipo I, que comprende 346 aminoácidos, incluyendo un péptido señal N-terminal, un dominio extracelular, un dominio transmembrana, y un dominio citoplásmico.

Se describen en la solicitud PCT WO 95/06065 dos proteínas ligandos hek (codificadas por clones designados A2 y C6), las cuales son idénticas en un 38% a nivel de aminoácidos. El ADN y las secuencias de aminoácidos para el ADNc clonado codificante de las dos proteínas ligando hek, son presentados en la solicitud WO 95/06065. Cada una de las proteínas codificadas contienen un péptido señal N-terminal, un dominio extracelular, y una región hidrofóbica C-terminal que contiene señales para el anclaje del glicosil-fosfatidilinositol (GPI). Después del procesamiento de post-traducción, ambas proteínas son ancladas a la superficie celular vía unión GPI.

Otra proteína que ha resultado que se une a elk y a hek, se ha designado B61. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos codificados para el ADNc de B61, están presentes en Holzman et al. (Mol. Cell. Biol. 10:5830, 1990). Subsecuentemente, se vio que B61 se unía a elk y hek, tal como se demostró en los análisis de unión descritos en WO 95/06065.

De esas cuatro proteínas (B61 y las proteínas codificadas por los clones tele7, A2 y C6), la LERK-5 de la presente invención, está más estrechamente relacionada (estructuralmente) al ligando elk codificado por tele7 (designado de aquí en adelante como elk-L tele7). Las secuencias de aminoácidos de las proteínas LERK-5 y elk-L tele7 en toda su extensión, son idénticas en un 58,5%, y las secuencias de ADN son idénticas en un 61,4%. Las secuencias que comprenden al péptido señal y al dominio extracelular de elk-L y de LERK-5 son idénticas en un 51,6% al nivel de los aminoácidos, y son idénticas en un 53,6% a nivel del ADN. Los dominios citoplásmicos son idénticos en un 74,7% a nivel de los aminoácidos, y son idénticos en un 75,5% a nivel del ADN.

Otro miembro de la familia de los receptores tirosin quinasa es hek2 (Böhme et al., Oncogene 8:2857, 1993). LERK-5 se une a hek2.

La secuencia de nucleótidos de una secuencia etiqueta expresada (EST) de humanos, para el cromosoma 13, se encuentra en GenBank®, bajo el acceso número L13819. La fuente del EST es identificada como ADNc derivado del ARNm del cerebro de una hembra humana de 3 meses de edad. Cuando la secuencia de 337 pb desvelada para el EST está alineada con las secuencias de nucleótidos de elk-L tele7, la secuencia etiqueta es idéntica a la correspondiente región del ADN del elk-L tele7 en un 59,3%. A la vista de este grado de homología entre las secuencias, los presentes inventores buscaron determinar si la secuencia etiqueta era o no parte de un gen que codificaba un proteína activa biológicamente, específicamente, una proteína que se uniera a elk o a hek.

El registro del GenBank no desvela ningún polipéptido codificado por el EST (p.e., no indica cuál es el marco de lectura, si lo hubiera), y mucho menos sugiere que ningún polipéptido se uniera a elk o a hek. Incluso si la secuencia etiqueta de ADN hubiera sido expresada en el marco de lectura elucidado por la clonación del ADN de LERK-5 mencionado aquí, la secuencia de aminoácidos codificados carecería de tres de los cuatro residuos de cisteína que están conservados en los dominios extracelulares de las cuatro proteínas que se unen a hek y elk, descritas más arriba. En la proteína LERK-5 de la presente invención, esas cisteínas se encuentran en los aminoácidos 37, 64, 76, y 128, de la SEQ ID NO:2. Una traducción de la secuencia etiqueta correspondería a los aminoácidos 79 al 190 de la SEQ ID NO:2 (con un error, descrito en el ejemplo 1). Por tanto, no se cree que la secuencia etiqueta de 337 pb codifique un polipéptido capaz de unirse a elk o hek.

El ADNc de LERK-5 humana aislada en el ejemplo 1 descrito más abajo, puede ser radio etiquetado y usado como una sonda para aislar ADNs de LERK-5 de otros mamíferos mediante hibridación de especies cruzadas. Los ARNs aislados a partir de varias líneas celulares o tejidos derivados de distintas especies de mamíferos, pueden ser examinados mediante hibridación Northern para identificar una fuente apropiada de ARNm para su uso en la clonación de un gen de LERK-5.

El ADN codificante de la LERK-5 murina fue aislada de un archivo de ADNc preparado a partir de embriones de 11,5 días. La secuencia de aminoácidos de la LERK-5 murina se presenta y es alineada con la secuencia de aminoácidos de la LERK-5 humana, en la figura 1. Las LERK-5 murina y humana son idénticas en un 97%, a nivel de aminoácidos.

Los fragmentos de la proteína LERK-5 de la SEQ ID NO:2 que son capaces de unirse a elk o hek, son abarcados por la presente invención. Una forma de realización de la presente invención provee polipéptidos LERK-5 solubles. Los polipéptidos LERK-5 solubles comprenden todos, o parte de, los dominios extracelulares de una LERK-5 nativa, pero falta la región de transmembrana que causaría la retención del polipéptido en una membrana celular. Los polipéptidos LERK-5 solubles, comprenden ventajosamente al péptido señal natural (o a un heterólogo) cuando se sintetizan inicialmente para promover la secreción, pero el péptido señal se hiende sobre la secreción de la LERK-5 desde la célula. Los polipéptidos LERK-5 solubles que pueden ser empleados, retienen la capacidad de unirse a elk o hek. La LERK-5 soluble puede incluir también parte de la región transmembrana o parte del dominio citoplásmico, u otras secuencias, implicando que la proteína LERK-5 soluble es capaz de ser secretada.

La LERK-5 soluble puede ser identificada (y distinguida de sus homólogos no solubles de unión a membrana) mediante la separación de células intactas, que expresan la proteína esperada, a partir del medio de cultivo, por ejemplo, por centrifugación, y analizando el medio (sobrenadante) para encontrar la presencia de la proteína esperada. La presencia de LERK-5 en el medio, indica que la proteína fue secretada a partir de las células, así que es una forma soluble de la proteína esperada. La LERK-5 soluble puede ser una forma de ocurrencia natural de esta proteína.

El uso de formas solubles de LERK-5 es ventajoso para ciertas aplicaciones. Se facilita la purificación de las proteínas a partir de células hospedadoras recombinantes, puesto que las proteínas solubles son secretadas desde las células. Es más, las proteínas solubles son generalmente más apropiadas para la administración intravenosa.

Ejemplos de polipéptidos LERK-5 solubles incluyen a aquellos que comprenden los dominios extracelulares enteros de una proteína LERK-5 nativa. Una proteína LERK-5 soluble semejante, comprende los aminoácidos del 1 al 199 de la SEQ ID NO:2. Cuando es expresada inicialmente dentro de una célula hospedadora, la proteína soluble puede comprender adicionalmente uno de los péptidos señal heterólogos descritos más abajo, que es funcional dentro de las células hospedadoras empleadas. Alternativamente, la proteína puede comprender al péptido señal natural, de tal modo que la LERK-5 comprende aminoácidos del 25 al 199 de la SEQ ID NO:2. Las secuencias de ADN codificantes de proteínas LERK-5 solubles, son abarcadas por la presente invención.

LERK-5 truncadas, incluyendo polipéptidos solubles, pueden ser preparadas mediante varias técnicas convencionales. Una secuencia esperada de ADN puede ser sintetizada químicamente usando técnicas conocidas. Fragmentos de ADN también pueden ser producidos mediante digestión con endonucleasa de restricción, de una secuencia de ADN clonado de longitud completa, y aislados por electroforesis en geles de agarosa. Pueden ser sintetizados oligonucleótidos que reconstruyen los finales 5' o 3' de un fragmento de ADN, hasta un punto deseado. Los oligonucleótidos pueden contener un sitio de escisión para la endonucleasa de restricción más arriba de la secuencia codificante deseada, y posicionar un codón de iniciación (ATG) en el término 5' de la secuencia codificante. Los conectores que contienen los sitios de escisión para las endonucleasas de restricción, pueden ser empleados para insertar el fragmento de ADN deseado en un vector de expresión. El bien conocido método de la reacción en cadena de la polimerasa, también puede ser empleado para aislar una secuencia de ADN codificante de un fragmento de proteína deseado. Los oligonucleótidos que definen el término del fragmento deseado, son empleados como cebadores en el PCR. Como una alternativa más lejana, las técnicas conocidas de mutagénesis pueden ser empleadas para insertar un codón de parada en un punto deseado, por ejemplo, inmediatamente tras el codón para el último aminoácido del dominio extracelular.

En cuanto a la discusión anterior de los péptidos señal y los distintos dominios de la proteína LERK-5, los expertos reconocerán que los límites de esas regiones de la proteína, antes descritos, son aproximados. Por ejemplo, aunque están disponibles programas de ordenador que predicen el sitio de corte de un péptido señal, la escisión puede ocurrir en otros sitios distintos a los predichos. Es más, se reconoce que una preparación de proteína puede comprender una mezcla de moléculas de proteína que tienen distintos aminoácidos N-terminal, debido a la escisión del péptido señal en más de un sitio. Además, los límites exactos de una región transmembrana pueden diferir de aquellos predichos por el programa de ordenador. El procesamiento post-traducción, que puede variar de acuerdo con los sistemas de expresión particulares empleados, puede producir proteínas que tengan aminoácidos N- o C- terminales, que difieren de aquellos descritos anteriormente. Estas variantes que retienen la actividad biológica deseada, están incluidas entre los polipéptidos LERK-5 de la presente invención.

La presente invención proporciona polipéptidos LERK-5 purificados, tanto recombinantes como no-recombinantes. Las variantes y derivados de las proteínas LERK-5 nativas que retienen la actividad biológica deseada (por ejemplo, la capacidad de unirse a elk o hek), también entran dentro del rango de la presente invención. Las variantes de LERK-5 pueden ser obtenidas por mutaciones de las secuencias de nucleótidos codificantes para los polipéptidos LERK-5 naturales. Una variante de LERK-5, tal como se menciona aquí, es un polipéptido sustancialmente homólogo al LERK-5 natural, pero que tiene una secuencia de aminoácidos distinta de la del LERK-5 natural, debido a una o más supresiones, inserciones o sustituciones.

Un nucleótido o secuencia de aminoácidos variante, es preferiblemente idéntica en al menos un 80% al LERK-5 natural, mas preferiblemente idéntica en al menos un 90%. En una forma de realización de la presente invención, una proteína LERK-5 comprende un dominio extracelular, una región transmembrana, y un dominio citoplásmico, en donde la secuencia de aminoácidos de dicha proteína LERK-5 es idéntica en al menos el 90% respecto a la secuencia presentada como aminoácidos del 1 al 308 de la SEQ ID NO:2. En otra forma de realización, un polipéptido LERK-5 soluble capaz de unirse a elk y hek, comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 90% respecto a la secuencia presentada como aminoácidos del 1 al 199 de la SEQ ID NO:2.

El tanto por ciento de identidad puede ser determinado, por ejemplo, mediante comparación de la información de las secuencias, usando el programa de ordenador GAP versión 6.0, descrito por Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) y disponible desde la University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). El programa GAP utiliza el método de alineación de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), tal como revisaron Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482, 1981). Los parámetros por defecto preferidos para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación singular (conteniendo un valor de 1 para identidades, y de 0 para no-identidades) para nucleótidos, y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, tal como describieron Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979; (2) una penalización de 3,0 por cada hueco y una penalización adicional de 0,10 por cada símbolo en cada hueco; y (3) no penalizaciones para los huecos finales.

Las alteraciones de la secuencia natural pueden ser conseguidas mediante distintas técnicas conocidas. Las mutaciones pueden ser introducidas en loci particulares mediante la síntesis de oligonucleótidos que contengan una secuencia mutante, flanqueados por sitios de restricción, permitiendo la unión con fragmentos de la secuencia natural. Tras la unión, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución, o supresión de aminoácidos deseada.

Alternativamente, pueden empelarse procedimientos de mutagénesis en sitios específicos, dirigidas a oligonucleótidos, para proporcionar un gen alterado que tenga codones particulares alterados de acuerdo con la sustitución, supresión, o inserción requeridas. Métodos ejemplares de producir las alteraciones mencionadas antes, son desvelados por Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985); Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154:367, 1987); y U.S. Patent Nos. 4.518.584 y 4.737.462.

Las variantes pueden comprender secuencias sustituidas conservativamente, significando que un residuo de aminoácido dado es reemplazado por un residuo que tiene características fisioquímicas similares. Ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un residuo alifático por otro, tal como Ile, Val, Leu o Ala por otro, o sustituciones de un residuo polar por otro, tal como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn. Se conocen bien otras sustituciones conservativas, por ejemplo, sustituciones de regiones enteras que tienen similares características de hidrofobicidad.

LERK-5 también puede ser modificada para crear derivados de LERK-5 mediante la formación de conjugados covalentes o agregativos con otros motivos químicos, tales como grupos glicosil, lípidos, fosfato, grupos acetil, y similares. Los derivados covalentes de LERK-5 pueden ser preparados mediante la unión de los motivos químicos a grupos funcionales en cadenas laterales de aminoácidos de LERK-5, o en los términos N- o C- de un polipéptido LERK-5, o de su dominio extracelular. Otros derivados de LERK-5, dentro del rango de esta invención, incluyen conjugados covalentes o agregativos de LERK-5 o sus fragmentos, con otras proteínas y polipéptidos, tanto mediante síntesis en cultivos recombinantes, como mediante fusiones N-terminal o C-terminal. Por ejemplo, el conjugado puede comprender una secuencia señal o líder de polipéptidos (p.e. el \alpha-factor líder de Saccharomyces) en el término N- de un polipéptido LERK-5. El péptido señal o líder dirige co-translacionalmente o post-translacionalmente, la transferencia del conjugado desde su sitio de síntesis, a un sitio dentro o fuera de la membrana celular o pared celular.

Las fusiones de polipéptidos LERK-5 pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación e identificación de LERK-5. Estos péptidos incluyen, por ejemplo, a poli-His o los péptidos de identificación antigénica descritos en la U.S. Patent No. 5.011.912, y en Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988. Uno de estos péptidos es el péptido FLAG®, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (SEQ ID NO:3), el cual es altamente antigénico y proporciona un epítopo unido reversiblemente mediante un anticuerpo monoclonal específico, permitiendo un análisis rápido y una purificación fácil de la proteína recombinante expresada. Esta secuencia es también partida específicamente por la enteroquinasa de la mucosa bovina, en el residuo inmediatamente siguiente al par Asp-Lys.

La presente invención incluye incluso polipéptidos LERK-5 con o sin patrón natural de glicosilación asociado. LERK-5 expresada en sistemas de expresión de levaduras o de mamíferos (p.e., células COS-7) puede ser similar a, o significativamente distinto de, un polipéptido LERK-5 natural, en peso molecular y patrón de glicosilación, dependiendo de la elección del sistema de expresión. La expresión de polipéptidos LERK-5 en sistemas de expresión bacterianos, tal como E.coli, proporciona moléculas no-glicosiladas.

Los sitios de N-glicosilación en el dominio extracelular de LERK-5, pueden ser modificados para excluir la glicosilación. Estos sitios en polipéptidos eucarióticos, son caracterizados por un triplete de aminoácidos Asn-X-Y, en donde X es cualquier aminoácido excepto Pro, e Y es Ser o Thr. La proteína LERK-5 humana comprende dos de estos tripletes, en los aminoácidos 11-13 y 114-116 de la SEQ ID NO:2. Modificaciones apropiadas sobre la secuencia de nucleótidos que codifican este triplete, darán lugar a sustituciones, adiciones o supresiones que prevengan la unión de residuos de carbohidrato sobre la cadena lateral Asn. La alteración de un único nucleótido, elegido como que Asn sea reemplazado por un aminoácido distinto, por ejemplo, es suficiente para inactivar un sitio de N-glicosilación. Los procedimientos conocidos para inactivar los sitios de N-glicosilación en proteínas, incluyen aquellos descritos en la U.S. Patent 5.071.972 y EP 276.846.

En otro ejemplo, las secuencias que codifican los residuos Cys que no son esenciales para la actividad biológica, pueden ser alteradas para causar la supresión de los residuos Cys, o su reemplazo con otros aminoácidos, previniendo la formación de puentes disulfuro intramoleculares incorrectos durante la renaturalización. Otras variantes son preparadas mediante la modificación de residuos de aminoácidos dibásicos adyacentes, para conseguir la expresión en sistemas de levaduras en los cuales está presente la actividad de la proteasa KEX2. EP 212.914 desvela el uso de mutagénesis sobre sitios específicos, para inactivar los sitios de procesamiento de la proteasa KEX2 en una proteína. Los sitios de procesamiento de la proteasa KEX2 son inactivados mediante la supresión, la adición, o la sustitución de residuos, para alterar los pares Arg-Arg, Arg-Lys, y Lys-Arg, para eliminar la ocurrencia de esos residuos básicos adyacentes. Los pares Lys-Lys son considerablemente menos susceptibles a la escisión KEX2, y la conversión de Arg-Lys o Lys-Arg a Lys-Lys, representa una aproximación conservativa y preferida a los sitios KEX2. La LERK-5 humana contiene cuatro sitios de procesamiento de la proteasa KEX2, en los aminoácidos 228-229, 229-230, 232-233 y 251-252 de la SEQ ID NO:2.

Las variantes de LERK-5 con ocurrencia natural son también abarcadas por la presente invención. Ejemplos de estas variantes son las proteínas que resultan de eventos alternativos de corte y empalme de ARNm, o a partir de escisión proteolítica de la proteína LERK-5, en donde se retiene la propiedad de unión a elk o a hek. El corte y empalme alternativos de ARNm pueden producir una proteína LERK-5 truncada, aunque biológicamente activa, así como una forma soluble de la proteína, ocurrida naturalmente, por ejemplo. Las variaciones atribuibles a la proteólisis incluyen, por ejemplo, diferencias en los términos N- o C- sobre la expresión en distintos tipos de células hospedadoras, debido a la eliminación proteolítica de uno o más aminoácidos terminales, de la proteína LERK-5 (generalmente de los aminoácidos terminales 1-5).

Las variantes que poseen la habilidad requerida de unirse a elk o hek, pueden ser identificadas por cualquier análisis apropiado. La actividad biológica de la variante de LERK-5 puede ser determinada, por ejemplo, analizando la capacidad de la variante para competir con LERK-5 por la unión a elk o hek (p.e. mediante ensayos de unión por competición).

Los ensayo de unión por competición pueden ser realizados usando técnicas estándar. Por ejemplo, puede usarse LERK-5 radiomarcada para competir con una variante de LERK-5, para analizar mediante uniones a los elk o hek unidos a la superficie celular. Los resultados cualitativos pueden ser obtenidos mediante ensayos de unión competitiva de placa autorradiográfica, o se pueden utilizar puntos de Scatchard para generar resultados cuantitativos. En lugar de células intactas, uno podría sustituir elk o hek solubles unidos a una fase sólida (p.e. una proteína soluble de fusión elk/Fc o hek/Fc unida a una fase sólida que contiene Proteína A o Proteína G). Otro tipo de ensayos de unión competitiva utilizan elk o hek solubles radiomarcados, y células intactas que expresan LERK-5.

La LERK-5 de la presente invención también puede ser utilizada en un ensayo de unión para detectar células que expresen elk o hek. Por ejemplo, LERK-5, o el dominio extracelular de la misma, puede ser conjugada a un segmento detectable tal como un radionucleido, una enzima que puede catalizar una reacción colorimétrica o fluorométrica, biotina o avidina. Las células a ser analizadas para descubrir la expresión de elk o hek, son contactadas con LERK-5 marcada. Tras la incubación, la LERK-5 sin uniones, marcada, es separada de las células, y la unión es medida mediante el segmento detectable.

Un aspecto de la presente invención incluye el uso de la LERK-5 para unirse a proteínas elk o hek. Por ejemplo, LERK-5 puede ser empleada como un re-agente en los procedimientos de purificación de proteína. Las proteínas LERK-5 o LERK-5/Fc de fusión, están unidas a un material sólido de soporte mediante técnicas convencionales, y son usadas para purificar elk o hek mediante cromatografía de afinidad.

Las proteínas LERK-5 desveladas aquí, también pueden ser empleadas para medir la actividad biológica de las proteínas elk o hek en términos de su afinidad por la unión a LERK-5. Como ejemplo, LERK-5 puede ser usada en determinar si se retiene la actividad biológica tras la modificación de una proteína elk o hek (p.e., modificación química, truncación, mutación, etc.). La actividad biológica de una proteína elk o hek puede ser así comprobada antes de su uso en estudios de investigación, por ejemplo.

Las proteínas LERK-5 tienen uso como re-agentes que pueden ser empleados por aquellos estudios conducentes a la "aseguración de la calidad", p.e., monitorizar la vida y estabilidad de la proteína elk bajo distintas condiciones. Para ilustrar, LERK-5 puede ser empleada en un estudio de afinidad en la unión, para medir la actividad biológica de una proteína elk que había sido almacenada a distintas temperaturas, o producida en distintos tipos celulares. La afinidad en la unión de la proteína elk modificada, para la LERK-5, es comparada con aquella de una proteína elk sin modificar, para detectar cualquier impacto adverso de las modificaciones, sobre la actividad biológica de elk. Así mismo, la actividad biológica de una proteína hek puede ser determinada usando LERK-5.

Los polipéptidos LERK-5 también son usados como transportadores para liberar agentes unidos además a células que llevan los receptores de superficie celular elk o hek. La expresión de antígeno hek ha sido divulgada para ciertas líneas celulares leucémicas, incluyendo la línea celular de la célula-T de la leucemia humana, designada JM, y la línea celular de la célula pre-B de la leucemia, designada LK63 (Boyd et al., J. Biol. Chem. 267:3262, 1992, y Wicks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1611, 1992). Las proteínas LERK-5 pueden así ser usadas para liberar agentes diagnósticos o terapéuticos a aquellas células (o a otros tipos de células que expresen hek en su superficie celular), en procedimientos in vitro o in vivo.

Un ejemplo de este uso, es exponer una línea celular leucémica hek^{+} a un conjugado agente terapéutico/ LERK-5, para determinar si el agente exhibe citotoxicidad hacia las células de leucemia. Varios distintos agentes terapéuticos unidos a LERK-5 pueden ser incluidos en un análisis para detectar y comparar el efecto citotóxico de los agentes sobre las células de leucemia. Los conjugados LERK-5/agentes de diagnóstico pueden ser empleados para detectar la presencia de células hek^{+} in vitro o in vivo.

Los agentes terapéuticos y diagnósticos que pueden unirse a un polipéptido LERK-5 incluyen (aunque no quedan limitados a) fármacos, toxinas, radionucleidos, cromóforos, enzimas que catalizan una reacción colorimétrica o fluorométrica, y similares, siendo escogido el agente en particular, de acuerdo con la aplicación pretendida. Ejemplos de fármacos incluyen a aquellos usados en el tratamiento de varias formas de cáncer, p.e. mostazas nitrogenadas tales como la mostaza nitrogenada L-fenilalanina o ciclofosfamida, intercalando agentes tales como el cis-diaminodicloroplatino, antimetabolitos como el 5-fluorouracil, alcaloides de la vinca tales como la vincristina, y antibióticos como la bleomicina, doxorubicina, daunorubicina, y derivados de los mismos. Entre las toxinas están la ricina, la abrina, la toxina de la difteria, la exotoxina A de la Pseudomonas aeruginosa, proteínas desactivantes de los ribosomas, micotoxinas tales como tricotecenes, y derivados y fragmentos (p.e. cadenas individuales) de los mismos. Los radionucleidos apropiados para el uso diagnostico incluyen (aunque no están limitados a), ^{123}I, ^{131}I, ^{99m}Tc, ^{111}In, y ^{76}Br. Los radionucleidos apropiados para uso terapéutico incluyen (aunque no están limitados a), ^{131}I, ^{211}At, ^{77}Br, ^{186}Re, ^{188}Re, ^{212}Pb, ^{212}Bi, ^{109}Pd, ^{64}Cu y ^{67}Cu.

Estos agentes pueden unirse a LERK-5 mediante cualquier procedimiento convencional apropiado. La LERK-5, siendo una proteína, comprende grupos funcionales en las cadenas laterales de aminoácidos, que pueden ser reaccionados con grupos funcionales de un agente deseado para formar enlaces covalentes, por ejemplo. Alternativamente, la proteína o agente, pueden ser derivados a generar o a unir un grupo funcional reactivo deseado. La derivación puede incluir la unión de uno de los re-agentes emparejantes bifuncionales, disponibles para la unión de varias moléculas a las proteínas (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois). Se conocen varias técnicas para el radio etiquetado de proteínas. Los metales radionucleidos pueden ser unidos a la LERK-5 mediante un agente quelante bifuncional apropiado, por ejemplo.

Los conjugados que comprende a LERK-5 y un agente diagnóstico o terapéutico apropiado (preferiblemente unido covalentemente) son preparados de esa manera. Los conjugados son administrados o empleados de otro modo en una cantidad indicada para la aplicación particular.

Otro usa de la LERK-5 de la presente invención es como herramienta de investigación para estudiar el rol que LERK-5, en conjunción con elk o hek, puede jugar en el crecimiento o diferenciación de células que transportan al receptor elk o hek. Los polipéptidos LERK-5 de la presente invención también pueden ser empleados en análisis in vitro para la detección de elk o LERK-5 o las interacciones de los mismos. Así mismo, LERK-5 es usada en análisis para hek o la interacción de LERK-5 con hek.

Tal como se discute más arriba, cuando varios tejidos de rata fueron analizados para hallar ARNm de elk, los transcriptos fueron detectados solamente en cerebro y testículos (Lhotak et al., supra). Se cree que la unión de LERK-5 con elk en el tejido neuronal, ejerce un efecto neuroprotector o neurotrófico.

La LERK-5 es usada como re-agente de cultivo tisular. Una proteína LERK-5 puede ser añadida a neuronas cultivadas in vitro para reforzar su viabilidad, o prolongar la vida útil de las neuronas cultivadas, facilitando así los estudios de investigación del tejido neuronal. Se pueden determinar las concentraciones apropiadas de LERK-5 para su adición al medio de cultivo, mediante pruebas de rutina.

Una forma de realización de la presente invención es dirigida a un método de tratamiento de trastornos del tejido neuronal, implicando el contacto del tejido neuronal con la LERK-5. Estos trastornos incluyen daños o enfermedades neurológicas, tanto crónicas como agudas. Una proteína LERK-5 puede ser administrada a un mamífero para tratar un daño o enfermedad semejantes. En una forma de realización de la invención, LERK-5 es empleada en el tratamiento de condiciones neurodegenerativas caracterizadas o mediadas, al menos en parte, por el mecanismo de muerte neuronal conocido como excitotoxicidad. Además, LERK-5 puede ser administrada a un mamífero para ejercer un efecto trófico en el tejido neuronal. En un paciente que sufre pérdida de, o daño de, neuronas debido a lesiones o enfermedad, LERK-5 puede reforzar la viabilidad de aquellas neuronas que han sobrevivido.

La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad efectiva de un polipéptido LERK-5 purificado, y un diluyente, excipiente, o transportador apropiado. Estos transportadores serán no-tóxicos para los pacientes, a las dosis y concentraciones empleadas. Ordinariamente, la preparación de estos compuestos supone combinar un polipéptido LERK-5 de mamífero, o un derivado del mismo, con tampones, antioxidantes tales como el ácido ascórbico, péptidos de bajo peso molecular (menos de unos 10 residuos), proteínas, aminoácidos, carbohidratos incluyendo la glucosa, sucrosa, o dextranos, agentes quelantes como el EDTA, glutatión, u otros estabilizantes y excipientes. El tampón salino neutro es un diluyente apropiado.

Para uso terapéutico, las composiciones son administradas en forma y dosis apropiadas para la indicación y el paciente. Tal como comprenderá el experto en el campo pertinente, una dosis efectiva terapéuticamente variará de acuerdo a factores tales como la naturaleza y la severidad de la enfermedad a ser tratada, y la edad, tamaño, y condición del paciente. La administración puede ser realizada por cualquier ruta apropiada, incluyendo (aunque no quedando limitada a), infusión continua, infusión local durante la cirugía, infusión intraventricular (lo que puede implicar el uso de un catéter intraventricular), liberación sostenida desde implantes (geles, membranas, y similares), o inyección (p.e. inyección en el sitio de una herida, o inyección en el sistema nervioso central).

Las composiciones de la presente invención pueden contener una proteína LERK-5 en cualquiera de las formas descritas anteriormente, incluyendo variantes, derivados, y fragmentos de los mismos, biológicamente activos. En una forma de realización de la invención, la composición comprende una proteína LERK-5 soluble, humana. Esta proteína pueden comprender al dominio extracelular de la LERK-5 humana, fusionada a un polipéptido Fc, tal como se describe abajo.

Formas oligoméricas de la LERK-5

Polipéptidos LERK-5 en forma de oligómeros, como dímeros o trímeros, son abarcados por la presente invención. Estos oligómeros pueden ocurrir de manera natural, o pueden ser producidos por tecnología de ADN recombinante. Los oligómeros pueden comprender polipéptidos LERK-5 (preferiblemente el dominio extracelular, o un fragmento del mismo) conectados por enlaces disulfuro, o expresados como una proteína de fusión con o sin péptidos conectores espaciadores. Los oligómeros pueden estar formados por enlaces disulfuro entre los residuos de cisteína en distintos polipéptidos LERK-5, por ejemplo.

Los oligómeros LERK-5 pueden ser preparados usando polipéptidos derivados de inmunoglobulinas. La preparación de proteínas de fusión, comprendiendo polipéptidos heterólogos fusionados a varias porciones de polipéptidos derivados de anticuerpos (incluyendo el dominio Fc), ha sido descrita, p.e., por Ashkenazi et al. (PNAS USA 88:10535, 1991) y Byrn, et al., (Nature 344:677, 1990). En una forma de realización de la invención, un dímero LERK-5 es creado mediante la fusión de LERK-5 con una región Fc de un anticuerpo (IgG1). El polipéptido Fc es fusionado preferiblemente a el término C- de una LERK-5 soluble (comprendiendo solo el dominio extracelular). Un gen de fusión codificante de la proteína de fusión LERK-5/Fc, es insertado en un vector de expresión apropiado. La proteína de fusión LERK-5/Fc es expresada en células hospedadoras transformadas con el vector de expresión recombinante, y se le permite ensamblarse como moléculas de anticuerpo, con lo cual se forman enlaces disulfuro interrelacionados entre polipéptidos Fc, produciendo LERK-5 divalente. Si las proteínas de fusión se crean tanto con cadenas de un anticuerpo pesadas, como ligeras, es posible formar un oligómero LERK-5 con hasta cuatro regiones extracelulares LERK-5.

El término "polipéptido Fc" tal como se usa aquí, incluye formas naturales y mutein de polipéptidos derivados de la región Fc de un anticuerpo. Se incluyen las formas truncadas de esos polipéptidos que contienen la región bisagra que promueve la dimerización. Un polipéptido Fc apropiado, descrito en la solicitud PCT WO 93/10151, es un polipéptido de cadena única que se extiende desde el N-terminal de la región bisagra, hasta el término C- natural. Un mutein de este polipéptido Fc es descrito en el ejemplo 3, más abajo. El mutein exhibe afinidad reducida por los receptores Fc.

Alternativamente, uno puede unir polipéptidos LERK-5 (preferiblemente dos polipéptidos LERK-5 solubles) via un péptido conector. Los péptidos conectores apropiados para unir polipéptidos, son conocidos, y pueden ser empleados mediante técnicas convencionales. Las proteínas de fusión que comprenden polipéptidos LERK-5 unidos por péptidos conectores, pueden ser producidas por tecnología de ADN recombinante, por ejemplo.

La presente invención proporciona oligómeros de dominios extracelulares de LERK-5, o fragmentos de los mismos, unidos por interacciones disulfuro, o expresadas como polímeros de fusión con o sin grupos conectores de aminoácidos espaciadores. Por ejemplo, un dímero de dominio extracelular de LERK-5 puede ser conectado por un grupo conector de región IgG Fc.

Sistemas de expresión

La presente invención proporciona vectores de expresión recombinantes para la expresión de LERK-5, y células hospedadoras transformadas con los vectores de expresión. Cualquier sistema de expresión apropiado puede ser empleado. Los vectores incluyen una secuencia de ADN de LERK-5 operacionalmente unida a apropiadas secuencias de nucleótidos reguladoras de la transcripción o de la traducción, tales como aquellas derivadas de un gen de mamífero, o de microbios, o de virus, o de insecto. Ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores transcripcionales, operadores, o refuerzos, un sitio de unión a ARNm ribosomial, y secuencias apropiadas que controlan la iniciación y la finalización de la transcripción y la traducción. Las secuencias de nucleótidos se conectan operacionalmente cuando la secuencia reguladora se relaciona funcionalmente con la secuencia de ADN de la LERK-5. Así, una secuencia de nucleótidos promotora está operacionalmente unida a una secuencia de ADN de LERK-5, si la secuencia de nucleótidos promotora controla la transcripción de la secuencia de ADN de LERK-5. La capacidad de replicar en las células hospedadoras deseadas, usualmente conferida por un origen de replicación, y un gen de selección a partir del cual los transformantes son identificados, puede ser incorporada adicionalmente en el vector de expresión.

Además, las secuencias codificantes de los péptidos señal apropiados que no son naturales respecto al gen de LERK-5, pueden ser incorporados en los vectores de expresión. Por ejemplo, una secuencia de ADN para un péptido señal (líder secretorio) puede ser fusionada, dentro del marco, a la secuencia de LERK-5, de tal modo que la LERK-5 es traducida inicialmente como una proteína de fusión que comprende al péptido señal. Un péptido señal que es funcional en las células hospedadoras, refuerza la secreción extracelular del polipéptido de LERK-5. El péptido señal es separado del polipéptido durante la secreción de LERK-5 desde la célula.

Las células hospedadoras apropiadas para la expresión de polipéptidos LERK-5, incluyen procariotas, levaduras, o células eucarióticas más elevadas. Las clonaciones y los vectores de expresión apropiados para su uso con hospedadores celulares de bacterias, hongos, levaduras, y de mamíferos, son descritas, por ejemplo, en Pouwels et al. Cloning Vectors: A laboratory Manual, Elsevier, New York (1985). Los sistemas de traducción libres de células, también podrían ser empleados para producir polipéptidos LERK-5 usando ARNs derivados de las construcciones de ADN desveladas aquí.

Los procariotas incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, E.coli o Bacilli. Las células hospedadoras procarióticas apropiadas para la transformación, incluyen, por ejemplo, E.coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y varias otras especies con el género Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus. En una célula procariótica hospedadora, tal como E.coli, un polipéptido LERK-5 puede incluir un residuo de metionina N-terminal, para facilitar la expresión de los polipéptidos recombinantes dentro de la célula hospedadora procariótica. El Met N-terminal puede ser separado del polipéptido recombinante expresado LERK-5.

Los vectores de expresión para ser usados en células hospedadoras procarióticas, generalmente comprenden uno o más genes marcadores fenotípicamente seleccionables. Un gen marcador fenotípicamente seleccionable es, por ejemplo, un gen que codifica una proteína que confiere resistencia antibiótica, o que suministra un requerimiento autotrófico. Ejemplos de vectores de expresión muy útiles para células hospedadoras procarióticas, incluyen a aquellos derivados de plásmidos disponibles comercialmente, tales como el vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). pBR322 contiene genes para la resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina, y así proporciona medios simples para identificar células transformadas. Un promotor indicado, y una secuencia de ADN de LERK-5, son insertados en el vector pBR322. Otros vectores comercialmente disponibles, incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Promega Biotec. Madison, W1, USA).

Las secuencias promotoras comúnmente usadas para los vectores de expresión de células hospedadoras procarióticas, incluyen la \beta-lactamasa (penicilinasa), el sistema promotor de lactosa (Chang et al., Nature 275:615, 1978; y Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), el sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; y EP-A-36776) y el promotor tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982). Un sistema de expresión de célula hospedadora procariótica particularmente útil, emplea un promotor fago \lambda P_{L} y una secuencia represora termolábil c1857ts. Los vectores plásmidos disponibles de la American Type Culture Collection, que incorporan derivados del promotor \lambda P_{L}, incluyen el plásmido pHUB2 (residente en la cepa JMB9 de E.coli (ATCC 37092)) y el pPLc28 (residente en E.coli RR1 (ATCC 53082)).

LERK-5 puede ser expresado alternativamente en células de levadura hospedadoras, preferiblemente del género Saccharomyces (p.e. S.cerevisiae). Pueden emplearse también otros géneros de levaduras, tales como Pichia o Kluyveromyces. Los vectores de levaduras contendrán a menudo una secuencia de origen de replicación a partir de un plásmido de levadura 2\mu, una secuencia replicante autónomamente (ARS), una región promotora, secuencias para poliadenilación, secuencias para terminación de la transcripción, y un gen marcador seleccionable. Las secuencias promotoras apropiadas para vectores de levaduras incluyen, entre otras, promotores para metalotioneína, 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; y Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978), tales como la enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvatoquinasa, triosafosfato isomerasa, fosfosglucosa isomerasa, y glucoquinasa. Otros vectores y promotores disponibles para su uso en expresión de levaduras, son mayormente descritos en Hitzeman, EPA-73.657. Otra alternativa es el promotor represible de glucosa ADH2, descrito por Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) y Beier et al. (Nature 300:724, 1982). Los vectores lanzadera replicables tanto en levadura como en E.coli pueden ser construidos insertando en los vectores descritos arriba, secuencias de ADN a partir de pBR322 para la selección y replicación en E.coli (gen Amp^{r} y origen de la replicación).

La secuencia líder factor-\alpha de levadura, puede ser empleada para dirigir la secreción del polipéptido LERK-5. La secuencia líder factor-\alpha puede es a menudo insertada entre la secuencia promotora y la secuencia estructural del gen. Ver, p.e., Kurjan et al., Cell 30:933, 1982; Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :5330, 1984; U.S. Patent 4.546.082; y EP 324.274. Otras secuencias líder disponibles para facilitar la secreción polipéptidos recombinantes a partir de levaduras hospedadoras, son conocidas por los expertos en la materia. Una secuencia líder puede ser modificada cerca de su final 3', para contener uno o más sitios de restricción. Esto facilitará la fusión de la secuencia líder con el gen estructural.

Los protocolos de transformación de levaduras son conocidos por los expertos en la materia. Un protocolo de este tipo es descrito en Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978. El protocolo de Hinnen et al. selecciona para transformantes Trp^{+} en un medio selectivo, en donde el medio selectivo está constituido por 0,67% de base de levadura nitrogenada, 0,5% de ácidos casamino, 2% de glucosa, 10 \mug/ml de adenina y 20 \mug/ml de uracilo.

Las células de levadura hospedadoras transformadas por vectores que contienen la secuencia promotora ADH2, pueden crecer para inducir la expresión en un medio "rico". Un ejemplo de un medio rico está constituido por 1% de extracto de levadura, 2% de peptona, y 1% de glucosa suplementada con 80 \mug/ml de adenina y 80 \mug/ml de uracilo. La depresión del promotor ADH2 ocurre cuando la glucosa se ha agotado en el medio.

Los sistemas de cultivo de células hospedadoras de mamíferos o de insectos, podrían ser empleados también para expresar polipéptidos LERK-5 recombinantes. Los sistemas de bacilovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insecto, son revisados por Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). Líneas celulares establecidas, de origen mamífero, pueden ser empleadas también. Ejemplos de líneas celulares de mamíferos disponibles, incluyen la línea COS-7, de células de riñón de mono, (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23:175, 1981), células L, células 293, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hamster chino (CHO), células HeLa, y líneas celulares BHK (ATCC CRL 10), y la línea celular CV1/EBNA-1 derivada de la línea celular CV1 (ATCC CCL 70) de células de riñón del mono verde africano, tal como se describe en McMahan et al. (EMBO J. 10:2821, 1991).

Las secuencias de control transcripcional y translacional para vectores de expresión en células hospedadoras de mamíferos, pueden ser extraídos de genomas virales. Secuencias promotoras y secuencias reforzantes comúnmente usadas, son derivadas del virus Polioma, del Adenovirus 2, del Virus de Simio 40 (SV40), y del citomegalovirus humano. Las secuencias de ADN derivadas del genoma viral SV40, por ejemplo, los sitios de origen SV40, de promotor temprano y tardío, reforzador, de "corte y empalme", y de poliadenilación, pueden ser utilizados para proporcionar otros elementos genéticos para la expresión de una secuencia de gen estructural, en una célula hospedadora de mamífero. Los promotores virales tempranos y tardíos, son particularmente útiles porque ambos son obtenidos sencillamente a partir de genoma viral, como fragmentos que pueden contener también un origen viral de replicación (Fiers et al., Nature 273:113, 1978). Los fragmentos de SV40 más grandes o más pequeños, pueden ser usados también, proporcionada la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio Hind III hasta el sitio Bgl I localizado en el sitio de origen viral de la replicación de SV40.

Vectores de expresión ejemplares para su uso en células hospedadoras de mamíferos, pueden ser construidos tal como desvelan Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983). Un sistema muy útil para la expresión estable de alto nivel de ADNc de mamífero en células C127 del epitelio mamario de murinos, puede ser construido sustancialmente tal como describe Cosman et al. (Mol. Immunol. 23:935, 1986). Un vector muy útil de expresión elevada, PMLSV N1/N4, descrito por Cosman et al., Nature 312:768, 1984, ha sido depositado como ATCC 39890. Se describen vectores útiles adicionales de expresión en mamíferos, en EP-A-0367566. Otros vectores apropiados pueden ser derivados de retrovirus.

En lugar de la secuencia señal natural, una secuencia señal heteróloga puede ser añadida, tal como sucede con la secuencia señal para la interleuquina-7 (IL-7) descrita en United States Patent 4.965.195; la secuencia señal para el receptor de interleuquina-2 descrita en Cosman et al., Nature 312:768 (1984); el péptido señal de interleuquina-4 descrito en EP 367.566; el péptido señal del receptor de interleuquina-I de tipo I, descrito en U.S. Patent 4.968.607; y el péptido señal del receptor de interleuquina-i de tipo II, descrito en EP 460.846.

Proteína LERK-5

La presente invención proporciona proteína LERK-5 purificada, que puede ser producida por sistemas de expresión recombinantes tal como se describe más arriba, o purificadas a partir de células de ocurrencia natural. Ventajosamente, la LERK-5 es purificada de tal modo que no se detectan bandas de proteínas correspondientes a otras proteínas, en el análisis de electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Será apreciado por alguien experto en el campo pertinente, que se pueden visualizar múltiples bandas correspondientes a la proteína LERK-5, mediante SDS-PAGE, debido a glicosilación diferencial, procesamiento post-translacional diferencial, y similares, tal como se discute anteriormente. Se considera que la proteína LERK-5 está purificada, cuando ya no se pueden visualizar bandas correspondientes a proteínas diferentes (no-LERK-5). La LERK-5 es purificada más preferiblemente hasta homogeneidad sustancial, tal como indica una única banda de proteína en el análisis SDS-PAGE.

Un proceso para producir la proteína LERK-5, comprende cultivo de células hospedadoras transformadas con un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica LERK-5, bajo condiciones tales que LERK-5 sea expresada. La proteína LERK-5 es entonces recuperada del medio de cultivo o de los extractos celulares, dependiendo del sistema de expresión empleado. Tal como reconocerán los expertos en la materia, los procedimientos para purificar la LERK-5 recombinante variarán de acuerdo a factores tales como el tipo de células hospedadoras empeladas, y si la LERK-5 es secretada o no al medio de cultivo.

Por ejemplo, cuando se emplean los sistemas de expresión que secretan la proteína recombinante, el medio de cultivo primero puede ser concentrado usando un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Siguiendo al paso de concentración, el concentrado puede ser aplicado sobre una matriz de purificación tal como un medio de filtración en gel. Alternativamente, puede emplearse una resina de intercambio de aniones, por ejemplo, una matriz o substrato que tenga grupos dietilaminoetil (DEAE) colgantes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa, u otros tipos empleados comúnmente en la purificación de proteínas. Alternativamente, se puede emplear un paso de intercambio de cationes. Los intercambiadores de cationes apropiados incluyen varias matrices insolubles que comprenden los grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren los grupos sulfopropilo. Finalmente, para purificar más aún la LERK-5, pueden emplearse uno o más pasos consistentes en cromatografía líquida de alto rendimiento, de fase inversa (RP-HPLC), empleando medio hidrofóbico RP-HPLC (p.e. gel de sílice con metil u otros grupos alifáticos colgando). Algunos o todos los pasos de purificación anteriores, en varias combinaciones, pueden ser empleados para proporcionar una proteína recombinante sustancialmente homogénea.

También es posible utilizar una columna de afinidad que incluya a los dominios de unión a ligandos de elk o hek, para purificar por afinidad a los polipéptidos LERK-5 expresados. Los polipéptidos LERK-5 pueden ser recuperados de una columna de afinidad en una elución tampón altamente salina, y entonces son dializados en un tampón bajo en sal. Alternativamente, una columna de inmunoafinidad puede comprender un anticuerpo que se una a LERK-5. Las proteínas de fusión LERK-5/Fc solubles, pueden ser purificadas usando una matriz de cromatografía que tenga fijadas Proteína A y Proteína G.

La proteína recombinante producida en cultivo bacteriano, es usualmente aislada por ruptura inicial de las células hospedadoras, y los pasos de centrifugación, extracción a partir del pellet celular si se trata de un polipéptido insoluble, o a partir del fluido sobrenadante si se trata de un polipéptido soluble, seguido de una o más concentraciones, desalado, intercambio de iones, purificación por afinidad o cromatografía de exclusión por tamaño. Finalmente, puede emplearse RP-HPLC para los pasos finales de purificación. Las células microbianas pueden ser rotas por cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, ruptura mecánica, o el uso de agentes lisantes de células.

En células hospedadoras transformadas, de levaduras, LERK-5 es preferiblemente expresada como un polipéptido secretado para simplificar la purificación. Los polipéptidos recombinantes secretados pueden ser purificados por métodos análogos a los desvelados por Urdal et al. (J. Chromatog. 296:171, 1984). Urdal et al. describe un procedimiento que incluye dos pasos secuenciales, de HPLC de fase inversa, para la purificación de IL-2 recombinante, humana, en una columna HPLC preparatoria.

Ácidos nucleicos

La presente invención incluso proporciona secuencias de nucleótidos de LERK-5. Estas secuencias de nucleótidos incluyen (aunque no quedan limitadas a) el ADN de LERK-5 desvelado aquí, tanto en forma de cadena sencilla como de cadena doble, además de el complemento ARN del mismo. El ADN de LERK-5 de la presente invención incluye, por ejemplo, ADNc, ADN genómico, ADN sintetizado químicamente, ADN amplificado por PCR, y combinaciones de los mismos. El ADN genómico puede ser aislado por técnicas convencionales, usando el ADNc aislado en el ejemplo 1, o un fragmento apropiado del mismo, como sonda.

Ejemplos de ADNs de LERK-5 de la presente invención incluyen (aunque no quedan limitados a) DNA que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de un grupo constituido por nucleótidos del 1 al 1002 de la SEQ ID NO:1 (codificante de la LERK-5 en toda su longitud, de la SEQ ID NO:2); nucleótidos del 76 al 1002 de la SEQ ID NO:1 (codificantes de la LERK-5 madura de la SEQ ID NO:2); nucleótidos del 1 al 672 de la SEQ ID NO:1 (codificantes del péptido señal y del dominio extracelular); y nucleótidos del 76 al 672 de la SEQ ID NO:1 (codificantes del dominio extracelular). Debido a la degeneración conocida del código genético, mas de un codón puede codificar el mismo aminoácido. Así que una secuencia de ADN puede variar respecto a las descritas más arriba, y aún así codificar un polipéptido que tenga la misma secuencia de aminoácidos. Estas secuencias de ADN variante pueden ser fruto de mutaciones silenciosas, p.e., las que pueden ocurrir durante la amplificación PCR. Alternativamente, esas mutaciones silenciosas pueden ser el producto de mutagénesis deliberada de una secuencia natural. Las secuencias de ADN que son degeneradas como resultado del código genético aplicado sobre una secuencia de ADN codificante de LERK-5 desvelada aquí, son abarcadas por la presente invención.

Fragmentos útiles de los ácidos nucleicos de LERK-5 incluyen oligonucleótidos sentido o anti-sentido, comprendiendo una secuencia de ácidos nucleicos de cadena sencilla (ya sea ARN o ADN) capaz de unirse a secuencias-objetivo de ARNm de LERK-5 (sentido) o de ADN de LERK-5 (anti-sentido). Los oligonucleótidos de sentido o de anti-sentido, de acuerdo con la presente invención, comprenden un fragmento de la región codificante del ADNc de LERK-5. Este fragmento generalmente comprende al menos unos 14 nucleótidos, preferiblemente entre 14 y 30 nucleótidos. La capacidad de derivar un oligonucleótido sentido, o anti-sentido, basada en una secuencia de ADNc codificante de una proteína dada, es descrita en, por ejemplo, Stein y Cohen (Cancer Res. 48:2659, 1988) y en Van der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988).

La unión de oligonucleótidos sentido o anti-sentido a las secuencias-objetivo de ácidos nucleicos, da lugar a la formación de ácidos nucleicos bicatenarios que bloquean la transcripción o traducción de la secuencia-objetivo mediante uno de varios métodos, incluyendo degradación reforzada de los ácidos nucleicos bicatenarios, terminación prematura de la transcripción o traducción, o por otros medios. Los oligonucleótidos anti-sentido pueden ser usados de este modo, para bloquear la expresión de proteínas LERK-5. Los oligonucleótidos sentido o anti-sentido incluso comprenden oligonucleótidos que han modificado sus esqueletos de azúcar-fosfodiéster (u otros azúcares conectantes, tales como los descritos en WO91/06629), y en donde dichos azúcares conectantes son resistentes a las nucleasas endógenas. Estos oligonucleótidos con azúcares conectantes resistentes, son estables in vivo (p.e. capaces de resistir degradación enzimática), pero retienen especificidad de secuencia para poder unirse a las secuencias-objetivo de nucleótidos. Otros ejemplos de oligonucleótidos sentido o anti-sentido incluyen a aquellos oligonucleótidos que están unidos covalentemente a fragmentos orgánicos, tales como los descritos en WO 90/10448, y otros fragmentos que incrementan la afinidad del oligonucleótido por una secuencia-objetivo de ácidos nucleicos, tal como la poli-(L-lisina). Más aún, agentes intercalantes, como la elipticina, y agentes alquilantes, o complejos metálicos, pueden unirse a los oligonucleótidos sentido o anti-sentido, para modificar las especificidades de unión de los oligonucleótidos sentido o anti-sentido, por la secuencia-objetivo de nucleótidos.

Los oligonucleótidos sentido o anti-sentido pueden ser introducidos en una célula que contenga la secuencia-objetivo de ácido nucleico, mediante cualquier método de transferencia de genes, incluyendo, por ejemplo, transfección de ADN mediada por CaPO_{4}^{-}, electroporación, o usando vectores de transferencia de genes como los virus Epstein-Barr. Los oligonucleótidos sentido o anti-sentido son preferiblemente introducidos en una célula que contenga la secuencia-objetivo de ácido nucleico, mediante inserción del oligonucleótido sentido o anti-sentido en un vector retroviral apropiado, y por tanto contactando la célula con el vector retrovirus que contiene la secuencia insertada, tanto in vivo como ex vivo. Vectores retrovirales apropiados incluyen (aunque no quedan limitados a) aquellos derivados de los retrovirus murinos M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado del M-MuLV), o de los vectores de doble copia designados DCT5A, DCT5B y DCT5C (ver la solicitud PCT US 90/02656).

Los oligonucleótidos sentido o anti-sentido también pueden ser introducidos en una célula que contenga la secuencia-objetivo de nucleótidos, mediante la formación de un conjugado con una molécula de unión a ligando, tal como se describe en WO 91/04753. Moléculas de unión a ligando apropiadas, incluyen (aunque no quedan limitadas a) a receptores de la superficie celular, factores de crecimiento, otras citoquinas, u otros ligandos que se unan a los receptores de la superficie celular. Preferiblemente, la conjugación de la molécula de unión a ligando no interfiere sustancialmente con la capacidad de la molécula de unión a ligando de unirse a su correspondiente molécula o receptor, ni bloquea la entrada del oligonucleótido sentido o anti-sentido, o de su versión conjugada, a la célula.

Alternativamente, un oligonucleótido sentido o anti-sentido, puede ser introducido en una célula que contiene la secuencia-objetivo de ácido nucleico, mediante la formación de un complejo oligonucleótido-lípido, tal como se describe en WO 90/10448. El complejo lípido-oligonucleótido sentido o anti-sentido, es preferiblemente disociado en la célula, por una lipasa endógena.

Los siguientes ejemplos son proporcionados para ilustrar formas de realización particulares, y no para limitar el alcance de la invención.

Ejemplo I Aislamiento de ADNc de LERK-5 de humano

El ADNc codificante de la LERK-5 de humano, fue aislado como sigue. El procedimiento comenzó con la preparación de una sonda para usarla en la identificación de archivos de ADNc apropiados para su uso en los intentos de clonación, y para la examinación de esos archivos.

La primera cadena de ADNc fue sintetizada sobre ARN aislado de distintos tipos celulares. Las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) fueron entonces dirigidas mediante técnicas convencionales, usando los ADNcs como plantillas. Los cebadores 3' y 5' empleados en la PCR, fueron oligonucleótidos que definen el término de un fragmento de ADN de 337 pb designado ch13 seq tag (GenBank® acceso no. L13819). Este fragmento de ADN fue elegido en vista de su grado de homología con una porción de un ADN de ligando a elk, tal como se discutió antes con más detalle.

Una banda de ADN del tamaño esperado (337 pb) fue amplificada mediante PCR en una reacción en la cual la plantilla de ADNc era derivada de ARN aislado a partir de una célula-T de la leucemia humana, de la línea celular designada CCRF-HSB-2 (ATCC CCL 120.1). Este fragmento de ADN de cadena sencilla, de 337 pb, fue aislado y etiquetado con ^{32}P mediante técnicas estándar, para su uso como sonda.

Northern blots que contenían ARNm de varios tejidos, fueron sondados con el fragmento de ADN etiquetado con ^{32}P. Se detectó ARNm hibridante (de unas 5 kb) en tejidos que incluían al cerebro fetal humano, y al pulmón. Además, las bandas de ADN del tamaño esperado (337 pb) fueron amplificadas exitosamente mediante PCR, usando como plantilla los archivos de ADNc de pulmón, tanto de feto como de adulto humanos. Así, los archivos de ADNc derivados de cerebro fetal humano, y de fibroblastos de pulmón humano, fueron escogidos para el seguimiento con la sonda etiquetada con ^{32}P, en un esfuerzo para aislar un clon de longitud completa.

El archivo de ADNc de cerebro fetal humano, en el fago \lambda vector \lambdagt10, fue adquirido de Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California. El ADNc es insertado en el sitio EcoRI del vector. El segundo archivo de ADNc fue derivado del fibroblasto SV40-transformado, de pulmón de humano adulto, de la línea celular WI-26 VA4. Este archivo, en fago \lambda vector \lambdagt10, fue construido tal como se describe en el ejemplo 2 de la U.S. Patent 5.264.416, la cual es incorporada aquí como una referencia.

El seguimiento con la sonda de 337 pb, fue dirigido con procedimientos convencionales, y los clones hibridizantes fueron identificados en ambos archivos. Se determinó la secuencia de nucleótidos del ADNc insertado de uno de los clones individuales aislados a partir del archivo de cerebro fetal humano, designado clon \lambda6. La secuencia de ADN de la región codificante del ADNc del clon \lambda6, y la secuencia de aminoácidos codificada por ella, son presentados en SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2. Un clon aislado a partir del archivo WI26 VA4, comprendió ADN truncado en el final 5', pero solo 5 pb del codón de iniciación de la secuencia de SEQ ID NO:1.

La proteína codificada, designada LERK-5, comprende un péptido señal N-terminal (aminoácidos -25 a -1 de la SEQ ID NO:2), un dominio extracelular (aminoácidos del 1 al 199), una región transmembrana (aminoácidos 200 al 225), y un dominio citoplásmico (aminoácidos 226 a 308). La LERK-5 se une a los dos receptores de superficie celular conocidos como elk y hek, tal como se demuestra en el ejemplo 4. Los nucleótidos del 310 al 646 de la SEQ ID NO:1, corresponden a la secuencia de 337 pb descrita anteriormente como tag (GenBank® acceso no. L13819), con un desajuste. El nucleótido 568 del ADN de LERK-5 de la SEQ ID NO:1 es un A, mientras que en la secuencia tag, en esa posición aparece un G. Posibles explicaciones incluyen variación alélica, o artefactos clonantes. Si el A fuera cambiado a el G en la posición 568 de la SEQ ID NO:1, entonces el aminoácido en la posición 165 sería Asp en lugar de Asn.

Un lisado celular que contenía ADN de clon \lambda6 (el ADNc de LERK-5, en \lambdagt10) fue depositado en la American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA en junio 64, 1994, y se le asignó el número de acceso ATCC 75815. El depósito se hizo bajo los términos del Tratado de Budapest.

Ejemplo 2 Preparación de una proteína de fusión elk/Fc soluble

Este ejemplo describe la construcción de un vector de expresión codificante de una proteína de fusión elk/Fc soluble. Esta proteína de fusión fue empleada en el ensayo de unión del ejemplo 4, para determinar si LERK-5 es capaz de unirse a elk.

Una secuencia de ADN y de aminoácidos codificados para ADNc de elk de rata, es presentada en Lhotak et al. (Mol. Cell. Biol. 11:2496, 1991), e incorporada en la presente como referencia. La proteína elk de rata tiene un dominio extracelular de 538 aminoácidos, un dominio transmembrana de 25 aminoácidos, y un dominio citoplásmico de 419 aminoácidos.

\newpage

Un fragmento de ADNc de elk de rata fue fusionado al final 5' de ADNc codificante de la porción Fc de un anticuerpo IgG1 humano. El ADNc de elk de rata fue obtenido de T. Pawson (Samuel Lunenfeld Research Institute, Mt. Sinai Hospital, Toronto). Se introdujo un sitio Asp718, de escisión por endonucleasa de restricción, más arriba de la región codificante de elk. Se aisló un fragmento Asp718-BgIII de ADNc de elk de rata (comprendiendo todo el dominio extracelular, la región transmembrana, y una pequeña porción del dominio citoplásmico).

Se clonó el ADN codificante de un polipéptido de cadena sencilla que comprende la región Fc de un anticuerpo IgG1 humano, dentro del sitio SpeI del vector pBLUESCRIPT SK®, el cual está disponible comercialmente en Stratagene Cloning Systems, La Jolla, California. Este vector plásmido es replicable en E.coli, y contiene un segmento poli-conector que incluye 21 sitios de restricción única. La secuencia de nucleótidos del ADN clonado, junto con la secuencia de aminoácidos del polipéptido Fc codificado por el mismo, son descritos en la solicitud PCT WO 93/10151, incorporada en la presente como referencia. Un único sitio BglII ha sido introducido, y abarca los codones para los aminoácidos tres y cuatro del polipéptido Fc. El polipéptido Fc codificado, se extiende desde la región bisagra N-terminal, hasta el término C- natural, es decir, es una región esencialmente de longitud completa del anticuerpo
Fc.

El fragmento de ADNc de elk, Asp718-BglII, anteriormente descrito, fue clonado en el vector pBLUESCRIPT SK® que contenía el ADNc de Fc, de tal modo que el ADNc de elk se posiciona más arriba que el ADNc de Fc. El ADN de cadena sencilla derivado de la fusión de genes resultante, fue mutagenizado por el método descrito en Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985) y en Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154:367, 1987), para fusionar perfectamente todo el dominio extracelular de elk, a la secuencia Fc. El ADN mutagenizado fue secuenciado para confirmar que los nucleótidos apropiados habían sido eliminados (es decir, que el ADN de la región transmembrana y del dominio parcial citoplásmico, fueron borrados), y que las secuencias de elk y de Fc estuvieran en el mismo marco de lectura.

La proteína de fusión elk/Fc se sintetiza preferiblemente en células hospedadoras de mamífero, tales como las células CV1-EBNA o COS-7. El gen de fusión elk/Fc fue cortado e insertado en un vector de expresión de mamífero designado HAV-EO (Dower et al., J. Inmunol. 142:4314, 1989). Las células hospedadoras de mamífero fueron transfectadas con el vector de expresión recombinante resultante, y cultivadas para permitir la expresión transitoria de la proteína de fusión, la cual fue secretada al medio de cultivo via el péptido señal de elk. La proteína de fusión elk/Fc fue purificada por cromatografía de afinidad, usando una columna con proteína A-sefarosa.

Ejemplo 3 Preparación de una proteína de fusión hek/Fc soluble

Este ejemplo describe la construcción de un vector de expresión codificante de una proteína de fusión hek/Fc soluble. Esta proteína de fusión se empleó en los ensayos de unión del ejemplo 4 para determinar so la LERK-5 es capaz de unirse a hek.

Una secuencia de ADN y de aminoácidos codificados para ADNc de hek de humanos, es presentada en Wicks et al. (Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 89:1611, 1992), e incorporada en la presente como referencia. Esta proteína hek comprende (desde los términos N- a C-) un dominio extracelular, un dominio transmembrana, y un dominio citoplásmico.

Se aislaron dos fragmentos de ADN, uno codificante de un fragmento N-terminal del dominio extracelular de hek, y el otro codificante de un fragmento C-terminal del dominio extracelular de hek, mediante reacciones en cadena de la polimerasa (PCR), realizados bajo condiciones estándar, usando cebadores oligonucleótidos basados en la secuencia de nucleótidos de hek publicada por Wicks et al., supra. La plantilla para la PCR fue ADNc preparado a partir de ARNm aislado de una célula-T de la leucemia humana, de la línea celular designada CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1). Los productos de la PCR que contenían el final 5' del ADN de hek, fueron digeridos con SpeI y HindIII para aislar un fragmento de ADN que se extendía desde el final 5' de la secuencia madura de hek humana (p.e. faltando el ADN codificante de la secuencia señal), hasta el sitio HindIII situado en el gen hek. Los productos de la PCR que contenían el final 3' del ADN del dominio extracelular de hek, fueron digeridos con HindIII y ClaI para aislar un fragmento que se extendía desde el sitio HindIII interno, hasta el sitio ClaI justo por debajo del final 3' de la secuencia codificante para el dominio extracelular de hek. El sitio ClaI está en un sitio de clonación múltiple (mcs) introducido justo por debajo del dominio extracelular.

Se aisló el ADN codificante de un mutein de la región Fc de un anticuerpo IgG1 humano. Este ADN mutein de Fc, y el polipéptido codificado por el mismo, son descritos en la solicitud de U.S. Patent con número de serie 08/097.827, titulada "Novel Cytokine Wich is a Ligand for OX40", archivada el 23 de julio de 1993, e incorporada aquí como referencia. El ADN mutein se derivó de un ADN natural codificante del polipéptido Fc, mediante mutagénesis dirigida a un sitio, realizada esencialmente tal como se describe en Deng y Nickoloff, Anal. Biochem. 200:81 (1992). La secuencia de aminoácidos del polipéptido mutein de Fc, es idéntica a la del polipéptido natural de Fc descrita en la solicitud de PCT WO 93/10151, excepto en que el aminoácido 19 ha sido cambiado de Leu a Ala, el aminoácido 20 ha sido cambiado de Leu a Glu, y el aminoácido 22 ha sido cambiado de Gly a Ala. Este mutein Fc exhibe afinidad reducida por los receptores de inmunoglobulina.

Un vector recombinante que contiene el ADN mutein de Fc, fue cortado con ClaI y NotI, los cuales cortan al vector en una región poli-conectante inmediatamente por encima y por debajo de la misma, respectivamente, a partir del ADN mutein de Fc insertado. Se aisló el fragmento codificante del mutein de Fc deseado.

El polipéptido Fc mutein se extiende desde la región bisagra N-terminal, hasta el término C- natural, es decir, es una región esencialmente de longitud completa del anticuerpo Fc. También se pueden emplear fragmentos de regiones Fc, p.e. aquellos que están truncados en el final C-terminal. Los fragmentos contienen preferiblemente residuos múltiples de cisteína (al menos los residuos de cisteína de la reacción bisagra), para permitir enlaces disulfuro entre cadenas, entre las porciones de polipéptido Fc de dos proteínas de fusión hek/Fc separadas, creando dímeros.

Un vector de expresión de mamífero, designado SMAG4, fue cortado con SpeI y NotI. El vector SMAG4 comprende una secuencia codificante del péptido señal interleuquina-7 murina (descrito en la U.S. Patent 4.965.195), insertada en un vector de mamífero de alta expresión pDC201 (descrito en Sims et al., Science 241:585, 1988, y en la solicitud PCT WO 89/03884), el cual es capaz también de replicación en E.coli. SpeI corta al vector inmediatamente por debajo de la secuencia codificante del péptido señal IL-7. NotI corta aproximadamente 155 pb por debajo del sitio SpeI, en un sitio de clonación múltiple del vector. Se aisló el largo fragmento SpeI/NotI, conteniendo las secuencias del vector y el ADN codificante del péptido señal IL-7.

Una unión de cuatro vías fue realizada para insertar los dos fragmentos de ADN codificante de hek, y el fragmento de ADN codificante del mutein Fc, descritos más arriba, en el vector de expresión SMAG4 cortado por SpeI/NotI. Las células de E.coli fueron transfectadas con la mezcla resultante de la unión, y el vector recombinante deseado fue aislado a partir de ahí. El vector aislado codifica una proteína de fusión que comprende (del término N- al C-) al péptido señal IL-7 murino, al dominio extracelular de hek, cuatro aminoácidos codificados por los mcs introducidos, y el mutein Fc.

El vector de expresión fue entonces co-transfectado con el plásmido pSV3.NEO dentro de células CV1/EBNA. La línea celular CV1/EBNA (ATCC CRL 10478) era derivada de una línea celular de riñón de mono, tal como se describe en McMahan et al. (EMBO J. 10:2821, 1991). El vector pSV3.NEO expresa al antígeno-T SV40, el cual no es producido por las células hospedadoras. El vector pSV3.NEO es similar al pSV3 (Mulligan y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072, 1981), pero contiene adicionalmente un gen de resistencia a la neomicina. Las células transformadas fueron cultivadas para permitir la expresión transitoria de la proteína de fusión, la cual es secretada en el medio de cultivo via el péptido señal IL-7 murino. La proteína de fusión fue purificada en una columna de proteína A-sefarosa, enjuagada, y usada para monitorizar en células la capacidad de unión de la proteína hek/Fc, tal como se describe en los ejemplos 2 y 3.

Ejemplo 4 Estudio de los enlaces

Se investigó en el siguiente ensayo la capacidad de LERK-5 de unirse a los receptores conocidos como elk y hek. El procedimiento comenzó con la preparación de células expresantes de LERK-5 en su superficie celular.

El ADN de LERK-5 fue amplificado mediante PCR, usando como plantilla al clon \lambda6 de ADN, descrito en el ejemplo 1. Los cebadores empleados en la PCR definieron el término de la región codificante del ADN de LERK-5, y también añadieron un sitio de restricción Xho I en el final 5', y un sitio Not I en el final 3' del ADN amplificado. El cebador 5' añadió adicionalmente una secuencia consenso Kozak, más arriba del codón de iniciación.

Los productos de la reacción fueron digeridos con Xho I y Not I, y fueron insertados en un vector de expresión cortado con Sal I (el cual es compatible con Xho I) y Not I. El vector de expresión fue pDC410, el cual es un vector de expresión de mamífero que también se replica en E.coli. pDC410 es similar a pDC406 (McMahan et al., EMBO J. 10:2821, 1991). El sitio de clonación múltiple (mcs) de pDC410 difiere del de pDC406 en que este contiene sitios de restricción adicionales, y tres codones de finalización (uno en cada marco de lectura). Un promotor de polimerasa T7, más abajo de los mcs, facilita la secuenciación del ADN insertado en los mcs. Además, el origen EBV de la replicación es reemplazada por ADN codificante del antígeno T SV40 largo (impulsado a partir de un promotor SV40), en el pDC410.

Las células CV1-EBNA-1, en platos de 10 cm^{2}, fueron transfectadas con el vector de expresión recombinante que contenía el ADN de LERK-5. La línea celular CV-1/EBNA-1 (ATCC CRL 10478) expresa constitutivamente antígeno-1 EBV nuclear impulsado a partir del promotor/reforzador inmediato-temprano CMV. La CV1-EBNA-1 fue derivada de la línea celular CV-1 de riñón del mono verde africano (ATCC CCL 70), tal como describe McMahan et al. (EMBO J. 10:2821, 1991).

Las células transfectadas fueron cultivadas durante 24 horas, y las células en cada plato fueron repartidas entonces en una placa de 24 pozos. Tras cultivar durante 48 horas adicionales, un ensayo de unión fue realizado por el siguiente procedimiento. Las células transfectadas (sobre unas 4 x 10^{4} células/pozo) fueron lavadas con BM-NFDM, el cual es un medio enlazante (RPMI 1640, conteniendo 25 mg/ml de albúmina de suero bovino, 2 mg/ml de azida de sodio, Hepes 20 mM pH 7.2), al que se le habían añadido 50 mg/ml de leche desnatada en polvo. Las células fueron entonces incubadas durante 1 hora a temperatura ambiente, con varias concentraciones de la proteína de fusión elk/Fc preparada en el ejemplo 2, o de la proteína de fusión hek/Fc preparada en el ejemplo 3. Las células fueron lavadas a continuación, e incubadas con una concentración de saturación constante de un IgG^{125}I-ratón anti-humano, en medio enlazante, con agitación suave durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras un lavado extensivo, las células fueron liberadas via tripsinización.

El IgG de ratón anti-humano empleado arriba, es dirigido contra la región Fc del IgG humano, y se obtuvo de Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA. El anticuerpo fue radioyodinado usando el método estándar de la cloramina-T. El anticuerpo se unirá a la porción Fc de cualquier proteína de fusión elk/Fc o hek/Fc que se haya unido a las células. En todos los ensayos, la unión no-específica del anticuerpo-^{125}I, fue ensayada en ausencia de elk/Fc (o hek/Fc), además de en presencia de elk/Fc (o hek/Fc), y un exceso molar de 200 veces del anticuerpo IgG de ratón anti-humano sin etiquetar.

El anticuerpo-^{125}I unido a las células fue cuantificado con un contador Packard Autogamma. Los cálculos de afinidades (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949) se generaron usando un programa Delta graph.

En el ensayo para la unión a elk/Fc, las células expresantes de la LERK-5 recombinante exhibieron una clase de unión de afinidad sencilla, con aproximadamente 103.317 sitios de unión por célula. La constante de afinidad (K_{a}) fue de 1,05 x 10^{9} M^{-1}. Cuando los resultados de los cuatro ensayos de unión fueron promediados, la K_{a} de unión a elk/Fc fue de 1,2 \pm 0,3 x 10^{9} M^{-1}.

Se encontró que las células expresantes de LERK-5 recombinante también se unían a hek/Fc. La K_{a}de unión a hek/Fc fue de 4,3 \pm 3,3 x 10^{7} M^{-1} (la media de cuatro experimentos).

Ejemplo 5 Análisis Northern Blot

Para investigar la expresión de LERK-5 en varios tejidos, se sondearon Northern blots que contenían ARNm de distintos tejidos humanos (tanto fetales como adultos), con una ribosonda de LERK-5. La ribosonda era derivada del fragmento de ADN de 337 pb aislado en el ejemplo 1, tal como sigue.

Los oligonucleótidos que definen el término del fragmento de ADN de 337 pb, fueron empleados como cebadores en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El cebador 3' incluía adicionalmente al promotor T3 de la ARN polimerasa. El PCR se llevó a cabo mediante técnicas convencionales, usando el ADN de 337 pb como plantilla. El ADN amplificado resultante contenía de este modo al promotor T3 de la ARN polimerasa, en el final 3'. Se preparó una ribosonda mediante técnicas estándar, usando ARN polimerasa T3 y el ADN amplificado como plantilla.

Los blots fueron hibridados con la ribosonda a 36ºC, luego lavados, primero con 1X SSC/0,1% SDS durante 1 hora a 68ºC, y después con 0,1X SSC/0,1% SDS durante 30 minutos a 68ºC. El blot se expuso a film de rayos X a -70ºC durante 11 días, colocado entre dos pantallas intensificadoras.

En el blot que contenía ARN derivado de tejidos fetales, una banda mayor de ARNm de unas 5,0 kb fue visualizada en corazón, cerebro, pulmón, y riñón, pero no en hígado. En los blots que contenían ARN de tejidos adultos, se detectó una banda de 5 kb en pulmón y riñón, aunque los niveles de expresión parecieron menores que los de los tejidos fetales. Una banda de ARNm hibridizante fue indetectable, o muy tenue, en corazón adulto, cerebro, placenta, hígado, músculo esquelético, páncreas, bazo, timo, próstata, testículos, ovario, intestino delgado, colon y linfocitos de la sangre periférica.

Ejemplo 6 Anticuerpos monoclonales para LERK-5

Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales para LERK-5. LERK-5 es expresada en células hospedadoras de mamífero, tales como células COS-7 o CV-1/EBNA-1, y purificada usando cromatografía de afinidad por elk/Fc. La LERK-5 purificada (o un fragmento de la misma, tal como el dominio extracelular) puede ser utilizada para generar anticuerpos monoclonales contra LERK-5, usando técnicas convencionales, por ejemplo, aquellas técnicas descritas en la U.S. Patent 4.411.993. Brevemente, los ratones son inmunizados con LERK-5 como un inmunógeno emulsificado en adyuvante completo de Freund, e inyectados subcutánea o intraperitonealmente con cantidades con rangos de 10-100 \mug. Entre diez y doce días después, los animales inmunizados son reforzados con LERK-5 adicional emulsificada en adyuvante completo de Freund. Los ratones son periódicamente reforzados con una agenda de inmunización semanal a bi-semanal. Las muestras de suero son tomadas periódicamente mediante sangrado retro-orbital, o por escisión en la punta del rabo, para analizar mediante ensayo de punto mancha, o por ELISA (Ensayo de enzima unida a inmunoabsorbente), a los anticuerpos de LERK-5.

Tras la detección de un título apropiado del anticuerpo, a los animales positivos se les proporciona una última inyección intravenosa de LERK-5 en tampón salino. Entre tres y cuatro días después, los animales son sacrificados, las células del bazo cosechadas, y las células del bazo se fusionan con una línea celular de mieloma murino, p.e. NS1 o preferiblemente P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Las fusiones generan células hibridoma, que son sembradas en placas con múltiples microtítulos en medio selectivo HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina), para inhibir la proliferación de células no-fusionadas, híbridos de mieloma, e híbridos de células de bazo.

Las células hibridoma son monitorizadas mediante ELISA para ver la reactividad contra LERK-5 purificada, por adaptaciones de las técnicas desveladas en Engvall et al., Inmmunochem. 8:871, 1971 y en la U.S. Patent 4.703.004. Una técnica de monitorización preferida es la técnica de captura de anticuerpos descrita en Beckmann et al., (J.
Immunol. 144:4212, 1990). Las células hibridoma positivas pueden ser inyectadas intraperitonealmente en un ratón BALB/c singénico, para producir ascitas que contienen altas concentraciones de anticuerpos monoclonales anti-LERK-5. Alternativamente, las células de hibridoma pueden crecer in vitro en matraces o en botellas en rotación mediante varias técnicas. Los anticuerpos monoclonales producidos en ascitas de ratón, pueden ser purificados por precipitación de sulfato amónico, seguido de cromatografía en gel de exclusión. Alternativamente, también puede ser usada la cromatografía de afinidad basada en la unión de anticuerpos a la proteína A o a la proteína G, o la cromatografía de afinidad basada en la unión a LERK-5.

Ejemplo 7 Fosforilación del receptor

En el siguiente experimento, LERK-5 demostró la capacidad para inducir la fosforilación de elk. Se preparó una proteína LERK-5/Fc soluble por fusión, en el vector pDC303, del ADN codificante de los aminoácidos 25 al 198 de la secuencia de LERK-5 SEQ ID NO:2, con el ADN codificante del polipéptido Fc de IgG1 de humano, descrito anteriormente. Le vector de expresión de mamífero pDC303, también conocido como SF CAV, es descrito en la solicitud PCT WO 93/19777. La proteína LERK-5/Fc soluble fue expresada y purificada por procedimientos análogos a los descritos en Fanslow et al. (J. Immunol. 149:655, 1992).

El ADN de elk de rata fue insertado en el vector de expresión de mamífero pDC303, y transfectado en células CV1/EBNA. Las células fueron separadas de una placa de 10 cm a una placa de 6 pozos, tras 24 horas. Después de dos días adicionales, las células fueron privadas de metionina y cisteína, y entonces radiomarcadas durante 3 horas con una mezcla 1:1 de metionina [^{35}S] y cisteína [^{35}S] (Amersham) a una concentración total de 100 \muCi ml^{-1}.

Las estimulaciones fueron realizadas añadiendo LERK-5/Fc soluble o elk-L/Fc soluble (descrita en WO 94/11384) a 1 \mug ml^{-1} durante 10 minutos a 37ºC. Las células fueron entonces rápidamente lavadas 2X con PBS frío + ortovanadato 1 mM, y lisadas en tampón de lisis (Tris HCl 25 mM, pH 7.5; NaCl 150 mM; EDTA 1 mM; fluoruro de sodio 50 mM; NP-40 1%; DTT 1 mM; ortovanadato 1 mM; más inhibidores de las proteasas).

Los lisados celulares fueron inmunoprecipitados con un anticuerpo anti-elk de conejo, usando una Proteína G-sefarosa. El anticuerpo anti-elk fué generado por inmunización de los conejos con una proteína de fusión elk-Fc de humano. Tras lavarlo 3X con tampón RIPA (HEPES 50 mM, pH 8.0; NaCl 150 mM; deoxicolato sódico 0,5%; nonidet P-40 0,5%; y SDS 0,1%) y 1X con PBS, las muestras fueron colocadas en un tampón reductor, y analizadas con SDS-PAGE. Entonces se transfirieron las proteínas a nitrocelulosa, y las proteínas [^{35}S]-marcadas fueron detectadas en un PhophorImager (Molecular Dynamics). La membrana fue entonces inmunomanchada con anti-fosfotirosina 4G10 (Upstate Biotech Inc., Lake Placid, NY), seguido de biotina de cabra anti-ratón (Kirkegaard and Perry Research Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD), estreptavidin-peroxidasa (Kirkegaard and Perry), y entonces desarrollada usando reagentes desarrollantes ECL (Amersham). Los análisis Western de los inmunoprecipitados elk, con el anticuerpo anti-fosfotirosina, mostraron que LERK-5/Fc estimuló las fosforilación de elk, así como también hizo elk-L/Fc. Los ligandos dependientes de proteínas fosforiladas, no fueron detectados en células CV1/EBNA tratadas con el medio solo, o transfectadas con un plásmido control.

(1) INFORMACION GENERAL:

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(i)

SOLICITANTES: Immunex Corporation

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(ii)

TITULO DE LA INVENCION: Nueva citoquina designada Lerk-5

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(iii)

NUMERO DE SECUENCIAS: 3

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(iv)

DIRECCIONES DE CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: Immunex Corporation

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(B)

CALLE: 51 University street

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(C)

CIUDAD: Seattle

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(D)

ESTADO: Washington

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(E)

PAIS: Estados Unidos

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(F)

ZIP: 98101

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(v)

FORMA DE LECTURA PARA LA COMPUTADORA:

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(A)

TIPO DE MEDIO: disquette

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(B)

COMPUTADORA: Apple Macintosh

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: Apple 7.1

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(D)

SOFTWARE: Microsoft Word, Version 5.1ª

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(vi)

DATOS ACTUAL DE LA SOLICITUD:

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(A)

NUMERO DE SOLICITUD: -- a ser asignada --

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(B)

FECHA DE RELLENADO: 6 de julio de 1995

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(C)

CLASIFICACION:

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(vii)

DATOS PREVIOS DE LA SOLICITUD:

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(A)

NUMERO DE SOLICITUD: US 08/271.948

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(B)

FECHA DE RELLENADO: 8 de julio de 1994

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(C)

CLASIFICACION:

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(viii)

INFORMACION DEL AGENTE/ABOGADO:

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(A)

NOMBRE: Anderson, Kathryn A.

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(B)

NUMERO DE REGISTRO: 32.172

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(C)

NUMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 2823-WO

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(ix)

INFORMACION DE TELECOMUNICACION:

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(A)

TELEFONO: (206) 587-0430

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(B)

TELEFAX: (206) 233-0644

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(C)

TELEX: 756822

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(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:1:

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(i)

CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 1002 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

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(D)

TOPOLOGIA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLECULA: ADNc a ARNm

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(iii)

HIPOTETICA: NO

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(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

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(vii)

FUENTE INMEDIATA:

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(B)

CLON: huLERK-5

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(ix)

ATRIBUTO:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B)

UBICACIÓN: 1..1002

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(ix)

ATRIBUTO:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: péptido sig

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(B)

UBICACIÓN: 1..75

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(ix)

ATRIBUTO:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: péptido mat

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(B)

UBICACIÓN: 76..999

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(xi)

DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

1

2

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(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:2:

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(i)

CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 333 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGIA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLECULA: proteína

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(xi)

DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

3

\newpage

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(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:3:

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(i)

CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

ENCADENAMIENTO: sencillo

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(D)

TOPOLOGIA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLECULA: péptido

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(iii)

HIPOTETICA: NO

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(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

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(vii)

FUENTE INMEDIATA:

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(B)

CLON: péptido SEÑAL

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(xi)

DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

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\sa{Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys}

Claims (28)

1. Un ADN aislado que codifica un polipéptido LERK-5 capaz de unirse a elk o a hek, en el que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 90% a la secuencia de residuos 1 a 308 de la SEQ ID NO:2.

2. Un ADN de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido comprende un dominio extracelular, una región transmembrana, y un dominio citoplásmico, en el que dicho dominio extracelular comprende los aminoácidos 1 a 199 de la SEQ ID NO:2, dicha región transmembrana comprende los aminoácidos 200 a 225 de la SEQ ID NO:2, y dicho dominio citoplásmico comprende los aminoácidos 226 a 308 de la SEQ ID NO:2.

3. Un ADN de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho ADN codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada de los aminoácidos -25 a 308, o 1 a 308, de la SEQ ID NO:2.

4. Un ADN aislado que codifica un polipéptido LERK-5 soluble capaz de unirse a elk o a hek, en el que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de residuos 1 a 199 de la SEQ ID NO:2.

5. Un ADN de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho polipéptido comprende el dominio extracelular del polipéptido LERK-5 de la SEQ ID NO:2, el cual comprende los aminoácidos 1 a 199 de SEQ ID NO:2, o un fragmento de dicho dominio extracelular, en el que dicho fragmento es capaz de unirse a elk o a hek.

6. Un ADN de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho ADN codifica una secuencia de aminoácidos desde los aminoácidos -25 al 199, o 1 a 199, de la SEQ ID NO:2.

7. Un vector de expresión que comprende un ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6.

8. Una célula transformada con un vector de acuerdo con la reivindicación 7.

9. Un procedimiento para preparar un polipéptido LERK-5, comprendiendo el cultivo de una célula de acuerdo con la reivindicación 8 bajo condiciones que promuevan la expresión de LERK-5, y la recuperación del polipéptido LERK-5.

10. Un polipéptido LERK-5 purificado capaz de unirse a elk o a hek, en el que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 90% a la secuencia de residuos 1 a 308 de la SEQ ID NO:2.

11. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho polipéptido comprende un dominio extracelular, una región transmembrana, y un dominio citoplásmico, en el que dicho dominio extracelular comprende los aminoácidos 1 a 199 de la SEQ ID NO:2, dicha región transmembrana comprende los aminoácidos 200 a 225 de la SEQ ID NO:2, y dicho dominio citoplásmico comprende los aminoácidos 226 a 308 de la SEQ ID NO:2.

12. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de residuos 1 a 308 de SEQ ID NO:2.

13. Un polipéptido LERK-5 soluble purificado capaz de unirse a elk o a hek, en el que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 90% a la secuencia de residuos 1 a 199 de la SEQ ID NO:2.

14. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicho polipéptido comprende el dominio extracelular del polipéptido LERK-5 de la SEQ ID NO:2, el cual comprende los aminoácidos 1 a 199 de la SEQ ID NO:2, o un fragmento de dicho dominio extracelular, en el que dicho fragmento es capaz de unirse a elk o a hek.

15. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de residuos 1 a 199 de la SEQ ID NO:2.

16. Un polipéptido LERK-5 recombinante codificado por el ADNc de LERK-5 en el vector recombinante de la cepa depositada como ATCC 75815.

17. Un anticuerpo que es específico para el polipéptido LERK-5 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 10 a la 16.

18. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 17, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

19. Un oligómero que comprende de dos a cuatro polipéptidos LERK-5 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 10 a la 16.

20. Un oligómero de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dichos polipéptidos LERK-5 son polipéptidos LERK-5 solubles.

21. Una proteína de fusión que comprende un polipéptido LERK-5 soluble de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 13 a la 15, y un polipéptido derivado de una inmunoglobulina.

22. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 21, en el que dicho polipéptido derivado de una inmunoglobulina es un polipéptido Fc.

23. Un dímero que comprende dos proteínas de fusión de acuerdo con la reivindicación 22, en el que dichas proteínas de fusión están unidas por enlaces disulfuro.

24. Una composición que comprende un polipéptido LERK-5 o un oligómero de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 10 a la 16, 19, 20 o 23, y un diluyente, excipiente o vehículo farmacéutico apropiado.

25. Una composición que comprende un polipéptido LERK-5 o un oligómero de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 10 a la 16, 19, 20 o 23, y un diluyente, excipiente o vehículo.

26. Un polipéptido LERK-5, oligómero, o composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 10 a la 16, 19, 20, 23, 24 o 25, para su uso en medicina humana.

27. El uso de un polipéptido LERK-5, oligómero, o composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 10 a la 16, 19, 20, 23, 24 o 25, en la preparación de un medicamento para tratar trastornos del tejido neuronal.

28. Un polipéptido LERK-5 o un oligómero, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 10 a la 16, 19, 20 o 23, para su uso en la detección o unión de un receptor que se una a LERK-5.