ES2216000T3 - Citoquinas que unen el receptor hek de la superficie celular. - Google Patents
Citoquinas que unen el receptor hek de la superficie celular.Info
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Abstract
POLIPEPTIDOS DE UN LIGANDO HEK (HEK IAS DE ADN, VECTORES Y CELULAS HUESPEDES TRANSFORMADAS UTILES PARA LA FORMACION DE HEK EPTIDOS SE ENLAZAN A UN RECEPTOR EXPRESADO EN LA SUPERFICIE CELULAR (HEK) QUE ES UN MIEMBRO DE LA FAMILIA DE RECEPTORES DE CINASA DE TIROSINA. EL HEK SE EXPRESA EN CELULAS QUE INCLUYEN CIERTAS LINEAS CELULARES TUMORALES. LOS HEK TAMBIEN SE ENLAZAN A UN ELK CONOCIDO DE RECEPTORES DISTINTO DE CINASA DE TIROSINA.
Description
Citoquinas que unen el receptor Hek de la
superficie celular.
Las proteínas conocidas como receptores tirosina
quinasas tienen una actividad quinasa intrínseca que se activa
después de la unión del ligando. Esta clase de proteínas se
caracteriza por unos motivos estructurales conservados dentro de los
dominios catalíticos (Hanks y col., Science, 242:42,1988) y puede
subdividirse en familias en base a las características estructurales
de las regiones 5' del dominio catalítico.
Boyd y col. (J. Biol. Chem., 267:3262, 1992)
purificaron una glucoproteína de la superficie celular que muestra
actividad tirosina quinasa. La secuencia de aminoácidos
N-terminal identificó esta proteína como miembro de
la familia eph/elk, y de este modo la proteína se designó hek
(quinasa humana semejante a eph/elk). Se usó un anticuerpo
monoclonal inmunorreactivo frente a hek para estudiar la expresión
de hek en diversos tipos celulares humanos (Boyd y col.,
supra). El antígeno hek se detectó en la línea celular humana
de células pre-B de leucemia LK63 (la línea celular
se empleo como inmunógeno frente al cual se produjo el anticuerpo)
y en la línea celular humana de células T de leucemia JM. La línea
celular del linfoma B Raji muestra una expresión débil del antígeno
hek, y las líneas celulares remanentes analizadas (tanto líneas
normales como tumorales, entre las cuales había líneas celulares
hematopoyéticas que incluyen líneas de células T y de células
pre-B) fueron consistentemente negativas. De las
muestras de biopsia de tejido normal y tumoral que también se
analizaron para la expresión del antígeno hek, ninguno de los
tejidos normales fue positivo y únicamente una proporción muy baja
de tumores hematopoyéticos fue positiva.
Se ha demostrado mediante análisis de
transferencia de ARN la expresión de los transcritos de hek en las
líneas celulares JM y LK63 anteriormente descritas, así como en la
línea celular humana de leucemia de células T HSB-2
(Wicks y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1611, 1992). Se
muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de un clon
aislado de ADNc de hek se muestra en Wicks y col., supra.
La proteína hek está estrechamente relacionada
con otros diversos receptores tirosina quinasas, incluyendo elk
(Letwin y col., Oncogen 3:621, 1998 y Lhotak y col., Mol. Cell.
Biol. 11.2496, 1991); los homólogos de hek mek4 y cek4 (Sajjadi y
col. New Biol. 3:769, 1991), eck (Chan y col. Oncogene 6:1057,
1991); erk (Chan y col., supra), eck (Lindberg y col. Mol.
Cell. Biol. 10:6316, 1990); cek5 (Pasquale, E. B. Cell Regulation
2:523, 1991); y eph (Hirai y col. Science 238:1717, 1987). Las
proteínas de esta subfamilia están relacionadas no sólo respecto a
sus dominios citoplásmicos, sino también en sus dominios
extracelulares, que son idénticos en el 41% al 68%. De modo
interesante, la distribución en los tejidos de estos diversos
receptores es variada. Por ejemplo, se ha publicado que la expresión
del ARNm de elk estaba limitada a los testículos y el cerebro
(Lhotak y col., supra), mientras que eck no se encuentra sólo
en estos mismos dos tejidos sino también en el pulmón, intestino,
riñón, bazo, ovario y piel.
Los ligandos de las tirosina quinasas receptoras
son un grupo diverso de proteínas que afectan al crecimiento,
diferenciación y supervivencia de las células que expresan los
receptores. Hasta la fecha, no se ha descubierto ningún ligando para
hek. La identificación de un ligando o ligandos putativos de hek
sería útil en la investigación de la naturaleza de los procesos
celulares regulados por la proteína hek.
La presente invención proporciona citoquinas
novedosas designadas ligandos de hek (hek-L) que se
unen al receptor de la superficie celular conocido como hek. La
presente invención también proporciona ADN aislado que codifica las
proteínas hek-L, vectores de expresión que
comprenden el ADN aislado, y un método para la producción de
hek-L mediante el cultivo de células hospedadoras
que contienen los vectores de expresión en condiciones apropiadas
para la expresión de la proteína hek-L. Se describen
también anticuerpos dirigidos contra las proteínas
hek-L o contra fragmentos inmunogénicos de las
mismas.
Se han aislado los ADNc que codifican los
ligandos proteínicos novedosos que se unen a la proteína de
superficie celular conocida como hek de acuerdo con la presente
invención. También se proporcionan vectores de expresión que
comprenden el ADNc del ligando de hek (hek-L) y
métodos para la producción de polipéptidos recombinantes de
hek-L mediante el cultivo de células hospedadoras
que contienen los vectores de expresión en condiciones apropiadas
para la expresión de hek-L y la recuperación del
hek-L expresado. La presente invención también
abarca la proteína hek-L purificada, incluyendo
formas solubles en la proteína.
La presente invención también proporciona
hek-L o fragmentos antigénicos del mismo que pueden
actuar como inmunógenos para generar anticuerpos específicos frente
a los inmunógenos hek-L. De este modo se pueden
preparar anticuerpos monoclonales específicos frente a
hek-L o frente a fragmentos antigénicos del
mismo.
Las citoquinas novedosas descritas en el presente
documento son ligandos de hek, un receptor de la superficie celular
que es miembro de la familia de receptores tirosina quinasa. Una
aplicación de los ligandos de hek de la presente intención es como
herramientas de investigación para el estudio del papel que
hek-L, junto con hek, puede jugar en el crecimiento
o diferenciación de las células que llevan el receptor hek. Se
pueden investigar las señales biológicas que pueden iniciarse tras
la unión del hek-L a hek en la célula. Se ha
sugerido la posibilidad de que hek juegue un papel en la
tumorogénesis (Boyd y col., supra). Los ligados de hek
proporcionados en el presente documento son útiles para el estudio
del efecto de la unión de hek-L al receptor afín
puede tener en la tumorogénesis.
Los polipéptidos hek-L de la
presente invención también pueden ser empleados en ensayos in
vitro para la detección de hek o hek-L o las
interacciones de los mismos. Ya que se ha detectado el antígeno hek
en ciertas líneas celulares de leucemias, hek-L
puede emplearse como vehículo para administrar agentes diagnósticos
o citotóxicos a tales células. Estos y otros usos de los ligandos de
hek se discuten adicionalmente más adelante.
Se ha encontrado que las proteínas
hek-L de la presente invención se unen al receptor
tirosina quinasa conocido como elk. Elk ha sido descrito por Letwin
y col., Oncogene 3:621, 1998 y por Lhotak y col., Mol. Cell. Biol.
11:2496, 1991. El análisis de Scatchard revela un patrón bifásico de
la unión de elk por ambas proteínas hek-L, como se
describe en el ejemplo 5. De este modo, las proteínas
hek-L descritas en el presente documento también
pueden emplearse para unir elk, por ejemplo, en diversos
procedimientos de ensayos. Sin embargo, de un modo general la
proteína ligando de elk (elk-L) descrita en el
ejemplo 5 sería preferible para tales usos en vista de la mayor
afinidad de elk-L por elk.
Los estudios de unión descritos en el ejemplo 5
también revelan que el ligando de elk (elk-L) se une
a hek (patrón de unión bifásico). Se encontró que la proteína
relacionada conocida como B61 (Holzman y col., Mol. Cell. Biol.
10:5830, 1990) se une tanto a hek (patrón lineal) como a elk (patrón
bifásico). Las afinidades relativas se muestran en las tablas I y II
del ejemplo 5.
Para identificar las células adecuadas para el
uso como fuentes de ácidos nucleicos en la tentativa de clonar el
ADN de hek-L, se analizó en diferentes tipos de
células la capacidad de unión a hek (en la forma de proteína de
fusión que comprende hek humano y un polipéptido Fc de anticuerpo).
Una línea celular humana de células T de leucemia fue positiva en la
unión de hek/Fc, y se derivó de ellas una genoteca de ADNc. Se
aislaron satisfactoriamente dos clones de ADNc distintos que
codifican hek-L humano por selección de clones que
expresan la proteína de unión hek/Fc, como se describe en el ejemplo
3. Se indican la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos
codificada de un clon de ADNc humano de hek-L en SEQ
ID NO:1 y SEQ ID NO:2. Se presentan las secuencias de ADN y de
aminoácidos codificada de un segundo clon de hek-L
humano en SEQ ID:3 y SEQ ID NO:4. La comparación de las secuencias
de nucleótidos y de aminoácidos codificadas de los clones de ADNc de
hek-L humano con las bases de datos Genbank y
Swisspro muestra que las secuencias de los ligandos de hek fueron
únicas. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de unión a
hek codificadas por los dos clones son idénticas en el 38%.
El ADNc de hek-L humano se aisló
a partir del primer clon positivo y se insertó en el sitio Bam HI
(en la región de múltiple clonación) del vector de clonación
pBLUESCRIPT® SK (-), suministrado por Stratagene Cloning Systems, La
Jolla, CA. El vector recombinante resultante, designado A2/pBS, en
células DH5\alpha de E. coli, se depositó en la American
Type Culture Collection el 11 de agosto de 1993, y se le asignó el
número de acceso ATCC 69384. El ADNc de hek-L humano
se aisló a partir de un segundo clon positivo y se insertó en el
sitio Bam HI de pBLUESCRIPT® SK (-). El vector recombinante
resultante, designado C6/pBS, en células DH5\alpha de E.
coli, se depositó en la American Type Culture Collection el 25
de agosto de 1993, y se le asignó el número de acceso ATCC 69395.
Ambos depósitos se hicieron en los términos del tratado de
Budapest.
El hek-L de SEQ ID NO:2
(codificado por el ADNc del clon A2) comprende un péptido señal
N-terminal (aminoácidos -19 a -1), un dominio
extracelular (aminoácidos 1 a 202), y una región hidrófoba
C-terminal que comienza en el aminoácido 203. El
hek-L de SEQ ID NO:4 (codificado por el ADNc del
clon C6) comprende un péptido señal N-terminal
(aminoácidos -22 a -1), un dominio extracelular (aminoácidos 1 a
160), y una región hidrófoba en C-terminal que
comienza con el aminoácido 161.
Se demostró que las proteínas
hek-L expresadas por los clones A2 y C6 están
ancladas en la superficie celular a través de un enlace con
glucosil-fosfatidilinositol (GPI). Los anclajes de
membrana a GPI, incluyendo la estructura química y el procesamiento
de los mismos, se describen por Ferguson, M. y A. Williams, Ann.
Rev. Biochem., 57:285, 1988 (incorporado al presente documento por
referencia). Cuando se expresan inicialmente, ciertas proteínas
comprenden un dominio hidrófobo C-terminal que
contiene señales para el anclaje a GPI. Se localiza un sitio de
corte cadena arriba, a menudo alrededor de los aminoácidos
10-12 cadena arriba del extremo
N-terminal del dominio hidrófobo. El procesamiento
postraduccional incluye la ruptura de la proteína en este sitio de
corte. El anclaje a GPI se acopla a los nuevos aminoácidos
C-terminales expuestos de proteína madura procesada.
Así, cuando las proteínas hek-L se expresan en
células que reconocen las señales de anclaje a GPI en el dominio
hidrófobo, las secuencias de aminoácidos completas de SEQ ID NO:2 y
4 representan formas de precursores de las proteínas.
En base a las secuencias consenso derivadas de
otras proteínas que se anclan a GPI, sitios de corte probables en
las proteínas hek-L de la presente invención están
entre los aminoácidos 194 y 195 de la SEQ ID NO:2 y entre los 148 y
149 de SEQ ID NO:4. Después de la ruptura de la proteína, se acopla
un resto del GPI al resto de serina que está ahora en el extremo
C-terminal de la proteína procesada (aminoácido 194
de SEQ ID NO:2 y aminoácido 148 de SEQ ID NO:4). Es posible que la
ruptura suceda en otra parte cadena arriba de la región hidrófoba en
las proteínas hek-L.
El término "hek-L" como se
usa en el presente documento se refiere al género de polipéptidos
que son capaces de unir hek y mostrar homología (preferiblemente
siendo, al menos, 80% homólogos) con la proteína
hek-L de la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4. El
hek-L humano está dentro del alcance de la presente
invención, ya que son proteínas hek-L derivadas de
otras especies de mamíferos incluyendo pero no limitadas a ratón,
rata, bovino, porcino o diversas especies de primates. Tal como se
usa en el presente documento, el término
"hek-L" incluye tanto las formas unidas a la
membrana como las formas solubles (secretadas) de la proteína. Las
proteínas truncadas que retienen la propiedad de unión a hek están
incluidas en la presente invención. Tales proteínas truncadas
incluyen, por ejemplo, hek-L soluble que comprende
sólo el dominio extracelular (de unión al receptor) pero le falta el
dominio hidrófobo.
El ADNc humano de hek-L se puede
marcar radiactivamente y usarse como sonda para aislar otros ADNc de
hek-L de mamíferos mediante hibridación entre
especies. Por ejemplo, se pueden rastrear una genoteca de ADNc
preparada a partir de líneas de células T leucémicas de otras
especies de mamíferos con ADNc humano de hek-L
marcado radiactivamente para aislar un clon positivo.
Alternativamente, los ARNm aislados a partir de diversas líneas
celulares se pueden analizar mediante hibridación por transferencia
de ARN para determinar una fuente adecuada de ARNm de
hek-L de mamífero para usar en la clonación del gen
de hek-L.
Aunque se empleó una proteína de fusión hek/Fc en
los procedimientos de relación descritos más adelante en los
ejemplos 2 y 3, hek se puede usar para seleccionar clones y líneas
celulares candidatas para la expresión de las proteínas
hek-L. La proteína de fusión hek/Fc, sin embargo,
ofrece la ventaja de ser fácilmente purificada. Además, los puentes
disulfuro entre las regiones Fc de dos cadenas de proteínas de
fusión de fusión separadas, crean dímeros.
Se puede sustituir la región Fc de IgG1 humana
mutada descrita en el ejemplo 1 por otras regiones Fc de
anticuerpos. Las otras regiones Fc adecuadas son aquellas que pueden
unirse con elevada afinidad a la proteína A o a la proteína G, e
incluyen la región Fc de IgG1 murina o fragmentos de la región Fc de
IgG1 humana, por ejemplo, fragmentos que comprenden al menos la
región visagra para que se formen fuentes disulfuro
intercatenarios.
Una realización de la presente invención
proporciona polipéptidos hek-L solubles. Los
polipéptidos hek-L solubles comprenden todo o parte
del dominio extracelular del hek-L natural pero les
falta la región hidrófoba que contiene señales que provocarían la
retención del polipéptido en la membrana celular. Ventajosamente,
los polipéptidos hek-L solubles comprenden el
péptido señal natural (o un heterólogo) cuando se sintetizan
inicialmente para promover la secreción, pero el péptido señal se
corta después de la secreción de hek-L de la célula.
Los polipéptidos hek-L solubles que pueden ser
empleados retienen la capacidad de unión al receptor hek. El
hek-L soluble podría incluir parte de la región
hidrófoba con la condición de que la proteína hek-L
soluble sea capaz de ser secretada.
El hek-L soluble puede
identificarse (y distinguirse de su equivalente unido a la membrana
no soluble) mediante la separación de células intactas que expresan
la proteína deseada del medio de cultivo, por ejemplo, mediante
centrifugación, y analizando en el medio (sobrenadante) en la
presencia de la proteína deseada. La presencia de
hek-L en el medio indica que la proteína se secretó
de las células y de esta forma es la forma soluble de la proteína
deseada. El hek-L soluble puede ser una forma
natural de esta proteína, por ejemplo, el que surge por
procesamiento natural. Además, el hek-L unido a GPI
puede ser liberado o mudado de la superficie celular al medio de
cultivo, por ejemplo, mediante la acción de una proteasa u otra
enzima.
El uso de las formas solubles de
hek-L es ventajoso para ciertas aplicaciones. Se
facilita la purificación de las proteínas a partir de las células
hospedadoras recombinantes, ya que las proteínas solubles se
secretan a partir de las células. Además, las proteínas solubles son
generalmente más adecuadas para la administración intravenosa.
Los ejemplos de polipéptidos de
hek-L solubles incluyen aquellos que comprenden el
dominio extracelular entero de una proteína hek-L
natural. Una de tales proteínas hek-L solubles
comprende del aminoácido 1 al 202 de la SEQ ID NO:2, y otra
comprende del aminoácido 1 al 160 de la SEQ ID NO:4. Cuando se
expresa inicialmente dentro de la célula hospedadora, la proteína
soluble puede comprender adicionalmente uno de los péptidos señal
heterólogos descritos más adelante que son funcionales dentro de las
células hospedadoras empleadas. Alternativamente, la proteína puede
comprender inicialmente contener el péptido señal, de tal forma que
hek-L comprende del aminoácido-19 al
202 de la SEQ ID NO:2 o del aminoácido -22 al 160 de la SEQ ID NO:4.
Las proteínas hek-L solubles pueden estar truncadas
al suprimir el extremo C-terminal hasta e incluyendo
el aminoácido que sirve como sitio de anclaje a GPI. Los ejemplos
incluyen proteínas que comprenden los aminoácidos
1-193 de la SEQ ID NO:2 o los aminoácidos
1-147 de la SEQ ID NO:4, como se discute
anteriormente. Aunque el sitio de anclaje a GPI puede ser suprimido,
la supresión del dominio hidrófobo se cree que es suficiente para
impedir el anclaje a GPI de la proteína en la membrana celular. En
realizaciones adicionales, las proteínas pueden estar truncadas en
el extremo C-terminal de tal forma que el aminoácido
C-terminal es cualquier aminoácido entre los
aminoácidos 193 y 202 de la SEQ ID NO:2, o entre los aminoácidos 147
y 160 de la SEQ ID NO:4. Las secuencias de ADN que codifican las
proteínas hek-L solubles se incluyen en la presente
invención.
El hek-L truncado, incluyendo
polipéptidos solubles, se podría preparar mediante cualquiera de las
diversas técnicas ordinarias. Se puede sintetizar químicamente una
secuencia de ADN deseada usando técnicas conocidas. También se
pueden producir fragmentos de ADN mediante digestión con
endonucleasas de restricción de una secuencia completa de ADN
clonado, y aislando mediante electroforesis en geles de agarosa. Se
pueden sintetizar oligonucleótidos que reconstruyen los extremos 5'
y 3' de un fragmento de ADN en un punto deseado. El oligonucleótido
puede contener un sitio de corte por endonucleasas de restricción
cadena arriba de la secuencia codificante deseada y posicionar un
codón de iniciación (ATG) en el extremo 5' de la secuencia
codificante. El procedimiento bien conocido de la reacción en cadena
de la polimerasa también se puede emplear para aislar una secuencia
de ADN que codifique un fragmento de proteína deseado. Como
alternativa adicional, se pueden emplear técnicas conocidas de
mutagénesis para insertar un codón de parada en un punto deseado,
por ejemplo, inmediatamente cadena abajo del codón para el último
aminoácido del dominio extracelular.
Ciertas realizaciones de la presente invención
proporcionan ADN aislado que comprende una secuencia de nucleótidos
seleccionada del grupo constituido por los nucleótidos
83-796 (región codificante entera),
83-745 (que codifica el péptido señal y el dominio
extracelular), 140-796 (que codifica la proteína sin
el péptido señal) y 140-745 (que codifica el dominio
extracelular) de la SEQ ID NO:1. También se proporciona el ADN
aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del
grupo constituido por los nucleótidos 28-630 (región
codificante entera), 28-573 (que codifica el péptido
señal y el dominio extracelular), 94-630 (que
codifica la proteína sin el péptido señal), y 94-573
(que codifica el dominio a extracelular) de la SEQ ID NO:3. También
se proporciona ADN que codifica fragmentos biológicamente activos de
las proteínas SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4, incluyendo pero no
limitándose al ADN que codifica las proteínas hek-L
truncadas en el extremo C-terminal descritas
anteriormente.
El ADN de hek-L de la presente
invención incluye ADNc, ADN sintetizado químicamente, ADN aislado
mediante PCR, ADN genómico y combinaciones de los mismos. El ADN
genómico de hek-L se puede aislar mediante
hibridación con el ADNc de los clones A2 o C6, utilizando técnicas
estándar.
La presente invención proporciona polipéptidos de
hek-L purificados, tanto recombinantes como no
recombinantes. Variantes y derivados de las proteínas
hek-L naturales que retienen la actividad biológica
deseada (por ejemplo, la capacidad de unirse a hek) están también
dentro del alcance de la presente invención. En una realización de
la presente invención, la proteína hek-L madura se
caracteriza por la secuencia de aminoácidos
N-terminal es
Leu-Leu-Ala-Gln-Gly-Pro-Gly-Gly-Ala-Leu-Gly-Asn.
En otra realización, la proteína hek-L madura se
caracteriza por la secuencia de aminoácidos
N-terminal es
Gly-Ser-Ser-Leu-Arg-His-Val-Val-Tyr-Trp-Asn-Ser.
Por ejemplo se pueden obtener variantes de
hek-L mediante mutaciones de las secuencias de
nucleótidos que codifican los polipéptidos de hek-L
naturales. Una variante de hek-L, como se refiere en
lo sucesivo, es un polipéptido sustancialmente homólogo al
hek-L natural, pero que tiene una secuencia de
aminoácidos diferente a la del hek-L natural
(humano, murino o de otras especies de mamíferos) debido a una o más
deleciones, inserciones o sustituciones. Tales variantes que se unen
a hek son equivalentes a las proteínas naturales que se une a hek
que tienen las secuencias de aminoácidos presentes en SEQ ID NO:2 o
SEQ ID NO:4.
La variante de ADN y las secuencias de
aminoácidos de la presente invención son preferiblemente, al menos,
idénticas en el 80%, más preferiblemente, al menos, idénticas en el
90%, a una secuencia de hek-L natural tal es como
las secuencias naturales de las SEQ ID NO:1-4. Para
los fragmentos, el porcentaje de identidad se calcula para la
porción de una secuencia natural que está presente en el fragmento.
Ciertas realizaciones de la presente invención proporcionan
polipéptidos de hek-L que comprenden una secuencia
de aminoácidos que es al menos idéntica en el 80% a una secuencia
seleccionada del grupo constituido por los aminoácidos
1-194, 1-202 y 1-219
de SEQ ID NO:2 y los aminoácidos 1-148,
1-160 y 1-179 de SEQ ID NO:4.
Se pueden llevar a cabo alteraciones de la
secuencia de aminoácidos natural mediante cualquiera de las diversas
técnicas conocidas. Las mutaciones se pueden introducir en loci
particulares mediante la síntesis de oligonucleótidos que contienen
una secuencia mutada, flanqueada por sitios de restricción que
permiten la ligación a fragmentos de la secuencia natural. Después
de la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un
análogo que tiene la inserción, sustitución o deleción del
aminoácido deseado.
Alternativamente, pueden emplearse procedimientos
de mutagénesis específica de sitio y dirigida con oligonucleótidos
para proporcionar un gen alterado que tiene codones particulares
alterados de acuerdo con la sustitución, deleción o inserción
requerida. Métodos de ejemplo para hacer las alteraciones indicadas
anteriormente se describen en Walder y col.(Gene 42:133, 1986);
Bauer y col.(Gene 37:73, 1985); Craik (Biotechniques, Enero 1985,
12-19); Smith y col. (Genetic Engineering:
Principles and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 82:488, 1985); Kunkel y col. (Methods in Enzymol.
154:367, 1987); y en las patente de Estados Unidos Nº 4.518.584 y
4.737.462, que se incorporan aquí por referencia.
Las variantes pueden comprender secuencias
sustituidas conservativamente, lo que significa que un resto de
aminoácido dado se sustituye por un resto que tiene características
fisicoquímicas similares. Los ejemplos de sustituciones
conservativas incluyen la sustitución de un resto alifático por
otro, tal como Ile Val, Leu o Ala por otro, o sustituciones de un
resto polar por otro, tal como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y
Asn. Otras sustituciones conservativas, por ejemplo, las
sustituciones de regiones enteras que tienen características de
hidrofobicidad similar, son bien conocidas.
El hek-L también puede
modificarse para crear derivados de hek-L mediante
la formación de conjugados covalentes o agregados con otros grupos
químicos, tal como grupos glucosilo, lípidos, fosfato, acetilo y
similares. Los derivados covalentes de hek-L se
pueden preparar mediante la unión de grupos químicos a grupos
funcionales de las cadenas de aminoácidos laterales de
hek-L o a los extremos N-terminal o
C-terminal de un polipéptido de
hek-L o al dominio extracelular del mismo. Otros
derivados de hek-L dentro del alcance de esta
invención incluyen conjugados covalentes o agregados de
hek-L o sus fragmentos con otras proteínas o
polipéptidos, tal como mediante síntesis en cultivos recombinantes
en forma de fusiones N-terminales o
C-terminales.
Cuando se expresa inicialmente el ligando de hek
en un sistema recombinante puede comprender una secuencia señal o
líder (natural o heteróloga) en el extremo
N-terminal de un polipéptido de
hek-L. El péptido señal o líder dirige
cotraduccionalmente o postraduccionalmente la transferencia de la
proteína desde su sitio de síntesis a un sitio fuera de la membrana
celular o de la pared celular, y separa mediante corte de la
proteína madura durante el proceso de secreción. Los ejemplos de
péptidos señal heterólogos adecuados, que se eligen generalmente de
acuerdo al sistema de expresión que se empleará, se describe más
adelante.
Los polipéptidos de fusión de
hek-L pueden comprender péptidos añadidos para
facilitar la purificación e identificación de hek-L.
Tales péptidos incluyen, por ejemplo, poli-His o los
péptidos de identificación antigénicos descritos en la patente de
Estados Unidos Nº 5.011.912 y por Hopp y col., BioTechnology 6:1204,
1988. Uno de tales péptidos es el péptido FLAG® ,
Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
(DYKDDDDK), que es altamente antigénico y proporciona un epítopo
unido reversiblemente por un anticuerpo monoclonal específico, que
permite un ensayo rápido y una purificación fácil de la proteína
recombinante expresada. Las proteínas de fusión que terminan con
este péptido también son resistentes a la degradación intracelular
en E. coli. Un hibridoma murino designado 4E11 produce un
anticuerpo monoclonal que se une al péptido DYKDDDDK en presencia de
ciertos cationes divalentes de metal (como se describe en la patente
de Estados Unidos 5.011.912, que se incorpora en el presente
documento como referencia) y ha sido depositado en la American Types
Culture Collection con el número de acceso HB 9259.
La presente invención incluye adicionalmente
polipéptidos de hek-L con o sin patrones naturales
de glicosilación asociados. El hek-L expresado en
los sistemas de expresión de levadura o mamífero (por ejemplo,
células COS-7) pueden ser similar o
significativamente diferente del polipéptido hek-L
natural tanto en peso molecular como en el patrón de glucosilación,
dependiendo del sistema de expresión elegido. La expresión de los
polipéptidos de hek-L en los sistemas de expresión
bacterianos, tales como E. coli, proporcionan moléculas sin
glucosilar.
Se pueden preparar construcciones de ADN que
codifican diversas adiciones o sustituciones de restos o secuencias
de aminoácidos, o deleciones de restos o secuencias internos o
terminales no necesarios para la actividad biológica o para la
unión. Por ejemplo, se pueden modificar los sitios de
N-glucosilación en el dominio extracelular de
hek-L para excluir la glucosilación, permitiendo la
expresión de un análogo más homogéneo, con contenido de
carbohidratos reducido en sistemas de expresión de mamífero y
levadura. Los sitios de N-glucosilación en
polipéptidos eucarióticos se caracterizan por el triplete de
aminoácidos Asn-X-Y, en el que X es
cualquier aminoácido excepto Pro e Y es Ser o Thr. Las
modificaciones apropiadas de la secuencia de nucleótidos que
codifica este triplete darán como resultado sustituciones, adiciones
o deleciones que impiden la unión de restos de carbohidratos a la
cadena de Asn. La alteración de un único nucleótido elegida para que
la Asn se sustituya por un aminoácido diferente, por ejemplo, es
suficiente para inactivar un sitio de
N-glucosilación. Los procedimientos conocidos para
la inactivación de sitios de N-glucosilación en
proteínas incluyen los descritos en la patente Estados Unidos
5.071.972 y en el documento EP 276.846, que se incorpora en el
presente documento por referencia.
Se encuentran tres sitios de
N-glucosilación en el hek-L
codificado por el clon A2, en los aminoácidos 19-21,
48-50 y 81-83 de la SEQ ID NO:2. Se
encuentra un sitio de N-glucosilación en el
hek-L codificado por el clon C6, en los aminoácidos
11-13 de la SEQ ID NO:4.
En otro ejemplo, se pueden alterar las secuencias
que codifican restos de Cys que no son esenciales para la actividad
biológica provocando que los restos de Cys sean eliminados o
sustituidos por otros aminoácidos, lo que previene la formación de
puentes disulfuro intramoleculares incorrectos después de la
renaturalización. Otras variantes se preparan mediante modificación
de restos de aminoácidos dibásicos adyacentes para aumentar la
expresión en los sistemas de levadura en los que está presente la
actividad de la proteasa KEX2. El documento EP 212.914 describe el
uso de mutagénesis específica de sitio para inactivar el
procesamiento de sitios en la proteína por la proteasa KEX2. El
procesamiento de sitios por la proteasa KEX2 se inactiva por
eliminación, adición o sustitución de restos para alterar los pares
Arg-Arg, Arg-Lys y
Lys-Arg para eliminar la existencia de estos restos
básicos adyacentes. El apareamiento Lys-Lys es
considerablemente menos susceptible de ser cortado por KEX2, y la
conversión de Arg-Lys o Lys-Arg a
Lys-Lys representa una táctica conservativa y
preferida para inactivar los sitios KEX2. Los sitios de
procesamiento por la proteasa KEX2 se encuentran en el
hek-L de la SEQ ID NO:2 en los aminoácidos
26-27, 87-88 y
199-200. El hek-L de la SEQ ID NO:4
comprende los sitios de procesamiento por la proteasa KEX2 en los
aminoácidos 73-74 y 134-135.
Las variantes de hek-L que
aparecen de forma natural también se incluyen en la presente
invención. Los ejemplos de tales variantes son proteínas que surgen
como resultado de sucesos de procesamiento alternativo del ARNm o de
la ruptura proteolítica de la proteína hek-L, en la
se mantiene la propiedad de unión de hek. El procesamiento
alternativo del ARNm puede proporcionar una proteína
hek-L truncada pero biológicamente activa, tal como
sucede en la forma soluble natural de la proteína, por ejemplo. Las
variaciones atribuibles a la proteólisis incluyen, por ejemplo,
diferencias en el extremo N- o C-terminal después de
la expresión en diferentes tipos de células hospedadoras, debido a
la eliminación proteolítica de uno o más aminoácidos terminales de
la proteína hek-L (generalmente de los aminoácidos
terminales 1-5). Los péptidos señal pueden cortarse
en diferentes posiciones en una proteína determinada, dando como
resultado variaciones del aminoácido N-terminal de
la proteína madura.
En un sistema de expresión, el aminoácido
N-terminal de una proteína hek-L
codificada por el clon C6 fue el aminoácido 4 (Leu) de la SEQ ID
NO:4. Una preparación de la proteína de fusión hek-L
soluble/Fc derivada del clon A2 comprende una mezcla de proteínas de
fusión que tienen el aminoácido 12 (Asn) de la SEQ ID NO:2 como
aminoácido N-terminal (aproximadamente el 60%) y
proteínas de fusión en las cuales el aminoácido 1 (Leu) de la SEQ ID
NO:2 fue el aminoácido N-terminal. De este modo
ciertas realizaciones de la presente invención se dirigen a
proteínas (solubles o unidas a membrana) en las cuales el aminoácido
N-terminal es cualquiera de los aminoácidos
1-4 de SEQ ID NO: 4, o cualquiera de los aminoácidos
1-12 de la SEQ ID NO:2.
Debido a la degeneración conocida del código
genético en el que más de un codón puede codificar el mismo
aminoácido, una secuencia de ADN puede variar entre las presentes en
la SEQ ID NO:1 ó 3, y todavía codificar una proteína que tenga la
secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 ó 4. Tales secuencias de
ADN variantes, pueden dar como resultado mutaciones silenciosas (por
ejemplo, las que suceden durante la amplificación por PCR), y pueden
ser el producto de mutagénesis deliberada de una secuencia
natural.
De este modo la presente invención proporciona
secuencias aisladas de ADN que codifican hek-L
biológicamente activo, seleccionado entre: (a) ADN derivado de la
región codificante del gen natural de mamífero de
hek-L (por ejemplo, ADNc que comprende la región
codificante de la secuencia de nucleótidos presente en la SEQ ID
NO:1 o la SEQ ID NO:3); y (b) ADN que está degenerado como resultado
del código genético en forma de un ADN definido en (a) y que
codifica hek-L biológicamente activo. Las proteínas
hek-L codificadas por tales secuencias de ADN están
incluidas en la presente invención.
El ADN de hek-L de la presente
invención incluye ADNc, ADN sintetizado químicamente, ADN aislado
mediante PCR, ADN genómico, y combinaciones de los mismos. El ADN
genómico de hek-L puede aislarse mediante
hibridación con el ADNc de los clones A2 o C6, usando técnicas
estándar.
Las variantes que poseen la capacidad de unión a
hek pueden identificarse mediante cualquier ensayo adecuado. Las
técnicas ordinarias de ensayo también son útiles para analizar la
actividad de unión a hek de la proteína natural
hek-L. La actividad biológica de
hek-L puede determinarse, por ejemplo, mediante
competición de la unión por el dominio de unión al ligando de hek
(es decir, ensayos de unión competitiva).
Un tipo de ensayo de unión competitiva para el
polipéptido hek-L utiliza un marcaje radiactivo,
hek-L humano soluble y células intactas que expresan
hek en la superficie celular. En lugar de las células intactas, se
podría sustituir hek soluble (tal como una proteína de fusión
hek/Fc) unido a una fase sólida a través de la interacción de la
Proteína A o Proteína G con la región Fc de la proteína de fusión.
Otro tipo de ensayo de unión competitiva utiliza hek soluble marcado
radiactivamente tal como la proteína de fusión hek/Fc, y células
intactas que expresan hek-L. Alternativamente,
hek-L soluble podrían unirse a una fase sólida.
Los ensayos de unión competitiva pueden llevarse
a cabo utilizando una metodología estándar. Por ejemplo,
hek-L marcado radiactivamente puede usarse para
competir con un homólogo de hek-L putativo para
ensayar la actividad de unión frente a hek unido a la superficie. Se
pueden obtener resultados cualitativos mediante ensayos de unión
competitiva en placas de autorradiografía, o pueden utilizar
representaciones de Scatchard para generar resultados
cuantitativos.
Alternativamente, hek soluble puede unirse a la
fase sólida tal como una matriz de una columna de cromatografía o un
sustrato similar adecuado para analizar la presencia de un resto
detectable tal como un hek-L marcado con I^{125}.
La unión a una fase sólida se puede realizar, por ejemplo, mediante
la unión de la proteína de fusión hek/Fc a una matriz que contiene
proteína A o proteína G.
Las características de la unión de
hek-L (incluyendo las variantes) también pueden
determinarse utilizando hek soluble marcado (por ejemplo,
^{125}I-hek/Fc) en ensayos de competición
similares a los descritos anteriormente. En este caso, sin embargo,
se usan las células intactas que expresan hek-L, o
hek-L soluble unido a un sustrato sólido, para medir
la extensión con la que una muestra que contiene una variante de hek
putativa compite por la unión a hek-L de un hek
soluble marcado.
Un ensayo preferido para la detección de la
actividad de unión a hek de un hek-L unido a la
membrana es como sigue. Se ideó un ensayo de unión indirecto
modificado, usando la proteína de fusión hek/Fc preparada en el
ejemplo 1 y el anticuerpo de ratón anti-Fc de la
IgG humana marcado con ^{125}I descrito en el ejemplo 3 para
evitar la detección radiactiva directa de hek/Fc. Las células que
expresan hek-L endógeno (por ejemplo, la línea
celular CCRF-HSB-2 descrita en el
ejemplo 2) se exponen a varias concentraciones de hek/Fc, seguido de
una concentración saturante constante de anticuerpo marcado con
^{125}I como sigue.
Las células
CCRF-HSB-2 se cultivan en cultivos
en suspensión en placas de cultivo de 96 pocillos. Las células
(2x10^{6} células/pocillo) se incuban en presencia o ausencia de
diversas concentraciones de hek/Fc en medio de unión (medio RPMI
1640, seroalbúmina bovina 1%, azida sódica 0.2% y Hepes 20 mM, pH
7.2) durante una hora a 37ºC. Seguidamente las células se lavan una
vez con PBS y se incuban con el anticuerpo de ratón
anti-Fc de IgG humana marcado con ^{125}I (40
ng/ml) en medio de unión con agitación suave durante una hora a
37ºC. Las células y el anticuerpo marcado con ^{125}I sin unir se
separan por el método de separación del aceite de ftalato,
esencialmente como se describe por Dower y col., J. Immunol. 132:751
(1984).
Puede utilizarse un ensayo para la unión de
hek/Fc a células que expresan hek-L recombinante
unido a la membrana como se describe en el ejemplo 5. Se empleó un
ensayo de unión indirecto.
Un ensayo preferido para el análisis de la
actividad de unión a hek de hek-L soluble es como
sigue. El ensayo detecta la capacidad de hek-L
soluble de inhibir la unión de la proteína de fusión hek/Fc a la
línea celular CCRF-HBS-2 que expresa
hek-L endógeno, como se describe en el ejemplo
2.
El sobrenadante condicionado (medio de cultivo)
de las células CV-1/EBNA transfectadas con un vector
de expresión que expresa un hek-L soluble se valora
en placas de 96 pocillos. Se añade una cantidad constante de hek/Fc
(1 \mug/ml) a cada pocillo, seguido por
1-2x10^{6} células
CCRF-HSB-2 por pocillo, en medio de
unión. Se incuba la placa a 37ºC durante una hora. Las células se
lavan dos veces con PBS, y seguidamente se precipitan por
centrifugación. Se añade el anticuerpo de ratón
anti-Fc de IgG humana marcado con ^{125}I a cada
pocillo a una concentración constante, y la placa se incuba durante
otra hora a 37ºC. El anticuerpo de ratón anti-Fc de
IgG humana marcado con ^{125}I se une a hek/Fc que se une a las
células CCRF-HSB-2. Después de la
incubación final, las células se recogen en tubos que contienen
aceite de ftalato para separar el anticuerpo de ratón
anti-Fc de IgG humana marcado con ^{125}I unido y
libre. La radiactividad se cuantifica utilizando un contador
gamma.
El hek-L de la presente invención
se puede usar en un ensayo de unión para detectar células que
expresan hek. Por ejemplo, hek-L o el dominio
extracelular o un fragmento de los mismos se pueden conjugar a un
grupo detectable como el ^{125}I. En marcaje radiactivo con
^{125}I se puede llevar a cabo mediante cualquiera de los diversos
métodos estándar que proporcionan una molécula
hek-L-^{125}I funcional marcada
con una elevada actividad específica. Alternativamente, se puede
usar otro grupo detectable tal como una enzima que puede catalizar
una reacción colorimétrica o fluorométrica, biotina o avidina. Las
células que se analizan para la expresión de hek se pueden poner en
contacto con hek-L marcado. Después de la
incubación, el hek-L marcado sin unir se retira y la
unión se mide usando el grupo detectable.
Las proteínas ligando de hek descritas en el
presente documento también se pueden emplear para medir la actividad
biológica de la proteína hek en términos de afinidad de unión por
hek-L. Como ilustración, hek-L se
puede emplear en un estudio de afinidad de unión para medir la
actividad biológica de la proteína hek que se ha almacenado a
diferentes temperaturas, o se ha producido en diferentes tipos
celulares. De este modo la actividad biológica de la proteína hek
puede determinarse antes de ser usada en un estudio de
investigación, por ejemplo.
Las proteínas hek-L encuentran
uso como reactivos que pueden emplearse por los que realizan
estudios de "garantía de calidad", por ejemplo, para comprobar
la semivida y la estabilidad de la proteína hek en diferentes
condiciones. Los ligandos de hek se pueden usar para determinar si
la actividad biológica se mantiene después de la modificación de una
proteína hek (por ejemplo, modificación química, truncamiento,
mutación, etc). La afinidad de unión por un hek-L de
la proteína hek modificada se compara con la de una proteína hek sin
modificar para detectar cualquier impacto adverso de la modificación
sobre la actividad biológica de hek.
Un uso diferente del ligando de hek es como
reactivo en procedimientos de purificación de proteínas. El
hek-L o las proteínas de fusión hek/Fc se pueden
unir a un material de soporte sólido mediante técnicas ordinarias y
usarse para purificar hek mediante cromatografía de afinidad.
Los polipéptidos hek-L también
encuentran uso como vehículos para administrar agentes unidos a
ellos en células que llevan el antígeno hek de superficie celular.
La expresión del antígeno hek se ha descrito en ciertas líneas
celulares leucémicas, incluyendo la línea celular humana de leucemia
de células T llamada JM y HSB-2 y la línea celular
humana de células pre-B de leucemia llamada LK63
(Boyd y col., J. Biol. Chem. 267:3262, 1992, y Wicks y col., Proc.
Nat. Acad. Sci. USA, 89:1611, 1992). Las proteínas hek se pueden
usar para administrar agentes terapéuticos o diagnósticos a estas
células (o a otros tipos celulares que expresen hek sobre la
superficie celular) en procedimientos in vitro o in
vivo.
Un ejemplo de tal uso es la exposición de una
línea celular leucémica hek^{+} al conjugado de agente
terapéutico/hek-L para valorar si el agente muestra
citotoxicidad hacia las células de leucemia. Se pueden incluir
diversos agentes terapéuticos diferentes unidos a
hek-L en un ensayo para detectar y comparar el
efecto citotóxico de los agentes sobre las células de leucemia. Los
conjugados de hek-L/agente diagnóstico se pueden
emplear para detectar la presencia de células hek^{+} in
vitro e in vivo.
Los agentes diagnósticos y terapéuticos que
pueden unirse a un polipéptido hek-L incluyen, pero
no se limitan a, fármacos, toxinas, radionúclidos, cromóforos,
componentes fluorescentes, enzimas que catalizan una reacción
colorimétrica o fluorométrica, y similares, con el agente particular
elegido de acuerdo con la aplicación deseada. Los ejemplos de
fármacos incluyen los usados en el tratamiento de diversas formas de
cáncer, por ejemplo, mecloretaminas tal como melfalán o
ciclofosfamida, agentes intercalantes tales como
cis-diaminodicloroplatino, antimetabolitos tales
como 5-fluorouracilo, alcaloides de la dominica
tales como vincristina, y antibióticos tales como bleomicina,
doxorubicina, daunorubicina, y derivados de los mismos. Entre las
toxinas están la ricina, abrina, toxina diptérica, exotoxina A de
Pseudomonas aeruginosa, proteínas inactivadoras ribosómicas,
micotoxinas tales como tricotecenos, y derivados y fragmentos (por
ejemplo, cadenas únicas) de los mismos. Los radionúclidos adecuados
para el uso diagnóstico incluyen, pero no se limitan a, ^{123}I,
^{131}I, ^{99m}Tc, ^{111}In y ^{76}Br. Los radionúclidos
adecuados para el uso terapéutico incluyen, pero no se limitan a,
^{131}I, ^{211}At, ^{77}Br, ^{186}Re, ^{188}Re,
^{212}Pb, ^{212}Bi, ^{109}Pd, ^{64}Cu y ^{67}Cu.
Tales agentes se pueden unir a
hek-L mediante cualquier procedimiento ordinario
adecuado. El hek-L, siendo una proteína, comprende
grupos funcionales sobre las cadenas de aminoácidos que pueden
reaccionar con grupos funcionales de un agente deseado para formar
uniones covalentes, por ejemplo. Alternativamente, se pueden
constituir derivados de la proteína o agente para generar o unir un
grupo funcional reactivo deseado. La constitución de derivados puede
implicar la unión de uno de los reactivos de acoplamiento
bifuncionales disponibles para la unión de diversas moléculas a
proteínas (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois). Se conocen
diversas técnicas para el marcaje radiactivo de las proteínas. Por
ejemplo, los radionúclidos de metales se pueden unir a
hek-L mediante la utilización de agentes quelantes
bifuncionales adecuados.
De este modo se preparan los conjugados que
comprenden hek-L y un agente diagnóstico o
terapéutico adecuado (preferiblemente, unido covalentemente). Los
conjugados se administran o se emplean de otro modo en una cantidad
apropiada para una aplicación particular.
Como se describe en el ejemplo 5, las proteínas
hek-L proporcionadas en el presente documento
también son capaces de unirse a un receptor conocido como elk. De
este modo, hek tiene usos adicionales derivados de las propiedades
de unión a elk, análogos a aquellos usos descritos anteriormente que
derivan de las propiedades de unión a hek. El hek-L
se puede usar para detectar elk en diversos ensayos. Se puede
emplear un anticuerpo que se une a hek en un ensayo, si conviene,
para bloquear la unión de hek a hek-L mientras que
se permite la unión de elk a hek-L. Los ligandos de
hek se pueden emplear en la valoración de la actividad biológica de
las proteínas elk en términos de afinidad de unión por un
hek-L de una proteína elk o variante de la misma.
Las proteínas hek-L también encuentran uso en la
purificación de proteínas elk mediante cromatografía de
afinidad.
La presente invención abarca polipéptidos
hek-L en la forma de oligómeros, tales como dímeros
o trímeros. Los oligómeros se pueden formar mediante puentes
disulfuro entre restos de cisteína de diferentes polipéptidos de
hek-L. En una realización de la invención, se crea
un dímero hek-L mediante la fusión de
hek-L a la región Fc de un anticuerpo (IgG1) de
manera que no interfiera con la unión de hek-L al
dominio de unión del ligando de hek. El término "polipéptido
Fc" incluye formas naturales y mutadas, al igual que polipéptidos
Fc truncados que contienen la región bisagra que promueve la
dimerización. Preferiblemente el polipéptido Fc se fusiona al
extremo C-terminal de un hek-L
soluble (que comprende sólo el dominio extracelular). Se ha descrito
la preparación de proteínas de fusión que comprenden polipéptidos
heterólogos fusionados a diversas porciones de polipéptidos
derivados de anticuerpos (incluyendo el dominio Fc), por ejemplo,
por Ashkenazi y col. (PNAS USA 88:10535, 1991) y Byrn y col. (Nature
344:677, 1990), incorporados en el presente documento como
referencia.
Se puede preparar una fusión de un
hek-L a un Fc o a un polipéptido mutado de Fc
mediante procedimientos análogos a los descritos en el ejemplo 1
para la preparación de una fusión hek/Fc mutado. Se inserta un gen
de fusión que codifica la proteína de fusión
hek-L/Fc en un vector de expresión apropiado y
transfectan a células hospedadoras. Se permite que las proteínas de
fusión hek-L/Fc expresadas se ensamblen virtualmente
como moléculas de anticuerpo, después de lo cual se forman puentes
disulfuro intercatenarios entre los polipéptidos Fc,
proporcionándose hek-L divalentes. Alternativamente,
se puede emplear el polipéptido Fc natural del cual se derivó el
mutado.
Si las proteínas de fusión se hacen tanto con
cadenas pesadas y como con ligeras de un anticuerpo, es posible
formar un oligómero hek-L con tantas como las cuatro
regiones extracelulares de hek-L. Alternativamente,
se pueden unir dos dominios solubles de hek-L con un
péptido de unión tal como aquellos descritos en la patente de
Estados Unidos 5.073.627.
En realizaciones particulares de la presente
invención, el ADN de hek-L que codifica los
aminoácidos del -19 al 202 de la SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos del
-22 al 157 de la SEQ ID NO: 3 se fusionaron al extremo 5' del ADN
que codifica el Fc mutado descrito en el ejemplo 1, y se insertó en
el vector de expresión pDC410 (descrito en el ejemplo 3). Las
células CV1-EBNA-1 transfectadas con
el vector de expresión recombinante resultante se cultivaron para
expresar la proteína de fusión soluble hek/Fc.
La presente invención proporciona oligómeros de
los dominios extracelulares de hek-L o fragmentos de
los mismos, unidos mediante interacciones disulfuro, o expresados
como polímeros de fusión con o sin grupos de unión de aminoácidos
espaciadores. Por ejemplo, un dímero del dominio extracelular de
hek-L se puede unir a través de un grupo de unión de
la región Fc de IgG.
La presente invención proporciona vectores de
expresión recombinantes para la expresión de hek-L,
y células hospedadoras transformadas con los vectores de expresión.
Se puede emplear cualquier sistema de expresión adecuado. Los
vectores incluyen una secuencia de ADN de hek-L
operativamente unida a secuencias de nucleótidos de regulación
transcripcional o traduccional adecuadas, tales como las derivadas
de genes de mamífero, microbianos, víricos o de insecto. Los
ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores
transcripcionales, operadores o intensificadores, sitios de unión a
ribosomas de ARNm, y secuencias apropiadas que controlan la
iniciación y terminación de la transcripción y traducción. Las
secuencias de nucleótidos están operativamente unidas cuando la
secuencia reguladora se relaciona funcionalmente con la secuencia de
ADN de hek-L. De este modo, una secuencia de
nucleótidos del promotor esta operativamente unida a la secuencia de
ADN de hek-L si la secuencia de nucleótidos del
promotor controla la transcripción de la secuencia de ADN de
hek-L. La capacidad de replicarse en las células
hospedadoras deseadas, generalmente se confiere por un origen de
replicación, y se puede incorporar adicionalmente un gen de
selección por el cual se identifican los transformantes, en el
vector de expresión.
Además, las secuencias que codifican péptidos
señal apropiados que no son naturales del gen de
hek-L se pueden incorporar en los vectores de
expresión. Por ejemplo, se puede fusionar una secuencia de ADN para
un péptido señal (líder secretora) en fase respecto a la secuencia
de hek-L de tal forma que hek-L se
traduce inicialmente como una proteína de fusión que comprende el
péptido señal. Un péptido señal que es funcional en las células
hospedadoras destinadas a intensificar la secreción extracelular del
polipéptido de hek-L. El péptido señal se separa
mediante corte del polipéptido de hek-L después de
la secreción de hek-L desde la célula.
Las células hospedadoras adecuadas para la
expresión de los polipéptidos de hek-L incluyen
células procariotas, levaduras o eucariotas superiores. Los vectores
de clonación y expresión apropiados para usar con células
hospedadoras bacterianas, fúngicas, de levaduras y de mamífero se
describen, por ejemplo, en Pouwels y col. Cloning Vectors: A
Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985). También se pueden
emplear sistemas de traducción libres de células para producir
polipéptidos de hek-L utilizando ARN derivado de las
construcciones de ADN descritas en el presente documento.
Los procariotas incluyen organismos grampositivos
o gramnegativos, por ejemplo, E. coli o Bacilli. Las
células procariotas hospedadoras adecuadas para la transformación
incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis,
Salmonella typhimurium y otras diversas especies dentro los
géneros Pseudomonas, Streptomyces y
Staphylococcus. En una célula hospedadora procariotas, tal
como E. coli, el polipéptido de hek-L puede
incluir un resto de metionina N-terminal para
facilitar la expresión del polipéptido recombinante en la célula
hospedadora procariota. La Met N-terminal se puede
separar por corte del polipéptido recombinante de
hek-L expresado.
Los vectores de expresión para uso en las células
hospedadoras procariotas comprenden, generalmente, uno o más genes
marcadores seleccionables por fenotipo. Un gen marcador
seleccionable por fenotipo es, por ejemplo, un gen que codifica una
proteína que confiere resistencia a antibióticos o que proporciona
un requerimiento autotrófico. Los ejemplos de vectores de expresión
útiles para las células hospedadoras procariotas incluyen aquellos
derivados de las plásmidos suministrados comercialmente tales como
el vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). El pBR322 contiene genes
de resistencia frente a la ampicilina y tetraciclina y de este modo
proporciona una manera simple de identificar células transformadas.
Se inserta un promotor apropiado y la secuencia de ADN de
hek-L en el vector pBR322. Otros vectores
suministrados comercialmente incluyen, por ejemplo,
pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)
y pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA).
Las secuencias de promotores utilizadas
comúnmente en los vectores de expresión recombinantes de células
hospedadoras procariotas incluyen la
\beta-lactamasa (penicilinasa), sistema del
promotor de lactosa (Chang y col., Nature 275:615, 1978; y Goedel y
col., Nature 281:544, 1979), sistema del promotor de triptófano
(trp) (Goedel y col., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; y
EP-A-36776) y el promotor tac
(Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, pág. 412, 1982). Un sistema de expresión de
células hospedadoras procariotas particularmente útil emplea un
promotor P_{L} del fago \lambda y una secuencia represora
termolábil cI857ts. Los vectores plasmídicos suministrados por la
American Type Culture Collection que incorporan derivados del
promotor P_{L} del fago \lambda incluyen el plásmido pHUB2
(residente en la cepa de E. coli JMB9 (ATCC 37092) y pPLc28
(residente en E. coli RR1 (ATCC 53082)).
Alternativamente, hek-L se puede
expresar en células hospedadoras de levadura, preferiblemente, del
genero Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae).
También se puede emplear otro género de levadura, tal como
Pichia o Kluyveromyces. Frecuentemente los vectores de
levadura contienen una secuencia de origen de replicación de un
plásmido de levadura 2\mu, una secuencia de replicación autónoma
(ARS), una región promotora, secuencias para la poliadenilación,
secuencias para la determinación de la transcripción, y un gen
marcador seleccionable. Las secuencias de promotores adecuadas para
los vectores de levadura incluyen, entre otras, promotores para
metalotioneína, 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y
col., J. Biol. Chem. 255:2073,1980) y otras enzimas glucolíticas
(Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; y Holland y col.,
Biochem. 17:4900, 1978), tal como enolasa, gliceraldehído
3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato
descarboxilasa, fosfofructoquinasa,
glucosa-6-fosfato isomerasa,
3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa,
triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.
Otros vectores y promotores adecuados para uso en la expresión en
levaduras se describen adicionalmente en Hitzeman, documento
EPA-73.657. Otra alternativa es el promotor ADH2 que
se reprime por glucosa descrito por Russell y col. (J. Biol. Chem.
258:2674, 1982) y por Beier y col. (Nature 300:724, 1982). Los
vectores de transferencia que se pueden replicar tanto en levaduras
como en E. coli se pueden construir mediante la inserción de
secuencias de ADN del pBR322 para la selección y replicación en
E. coli (el gen Amp^{r} y el origen de replicación) en los
vectores de levadura escritos anteriormente.
La secuencia líder del
factor-\alpha de levadura se emplea para dirigir
la secreción del polipéptido de hek-L. La secuencia
líder del factor-\alpha se inserta, a menudo,
entre la secuencia del promotor y la secuencia del gen estructural.
véase, por ejemplo, Kurjan y col., Cell 30:933, 1982; Bitter y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984; patente de Estados Unidos
4.546.082; y documento EP 324.274. Otras secuencias líder adecuadas
para facilitar la secreción de polipéptidos recombinantes de las
levaduras hospedadoras se conocen por los expertos en la técnica.
Una secuencia líder puede ser modificada cerca de su extremo 3' para
contener uno o más sitios de restricción. Esto facilitará la fusión
de la secuencia líder con el gen estructural.
Los protocolos de transformación de levaduras se
conocen por los expertos en la técnica. Uno de tales protocolos se
describe por Hinnen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929,
1978. El protocolo de Hinnen y col. selecciona transformantes Trp+
en un medio selectivo, en el que el medio selectivo está constituido
por nitrógeno base de levadura 0.67%, ácidos casamino 0,5%, glucosa
2%, adenina 10 \mug/ml y uracilo 20 \mug/ml.
Las células hospedadoras de levadura
transformadas con vectores que contienen la secuencia del promotor
ADH2 se pueden dejar crecer mediante la inducción de la expresión en
un medio "rico". Un ejemplo de medio rico es uno que está
constituido por extracto de levadura 1%, peptona 2% y glucosa 1%
complementado con adenina 80 \mug/ml y uracilo 80 \mug/ml. La
desrepresión del promotor ADH2 sucede cuando se agota la glucosa del
medio.
Los sistemas de cultivo de células hospedadoras
de insectos o de mamíferos también se pueden emplear para expresar
polipéptidos recombinantes de hek-L. Los sistemas de
baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células
de insecto se revisaron por Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47
(1988). Las líneas celulares establecidas de origen mamífero también
se pueden emplear. Los ejemplos de líneas celulares hospedadoras de
mamífero adecuadas incluyen la línea COS-7 de
células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman y col., Cell
23:175, 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163),
células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa y BHK (ATCC
CRL 10) y línea celular CV-1/EBNA-1
derivada de la línea celular de riñón de mono verde africano
CV-1 (ATCC CCL 70) como se describe por McMahan y
col. (EMBO J. 10:2821, 1991).
Las secuencias de control transcripcional y
traduccional para los vectores de expresión de células hospedadoras
de mamífero se pueden extraer de genomas virales. Las secuencias de
promotores y de intensificadores utilizadas comúnmente derivan del
virus polioma, adenovirus 2, virus de simio 40 (SV40), y
citomegalovirus humano. Las secuencias de ADN que derivan del genoma
vírico del SV40, por ejemplo, origen promotores tempranos y tardíos,
intensificadores, sitios de procesamiento y sitios de
poliadenilación del SV40 se pueden usar para proporcionar otros
elementos genéticos para la expresión de la secuencia del gen
estructural en la célula hospedadora de mamífero. Los promotores
víricos tempranos y tardíos son particularmente útiles ya que ambos
se obtienen fácilmente del genoma vírico en forma de un fragmento
que también puede contener un origen de replicación vírico (Fiers y
col., Nature 273:113, 1978). Los fragmentos de SV40 más pequeños o
mayores también se pueden usar, con la condición de que se incluya
la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el
sitio HindIII hacia el sitio BgII localizado en el sitio del origen
de replicación vírica de SV40.
Los vectores de expresión de ejemplo para usar en
células hospedadoras de mamífero se pueden construir como se
describe en Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983). Un
sistema útil para la expresión estable a elevados niveles de ADNc de
mamífero en células epiteliales de mama de ratón C127 se puede
construir sustancialmente como se describe en Cosman y col. (Mol.
Immunol. 23:935, 1986). Se ha depositado un vector de elevada
expresión útil, PMLSV N1/N4, descrito por Cosman y col., Nature
312:768, 1984 como ATCC 39890. Los vectores de expresión de mamífero
útiles y adicionales se describen en el documento
EP-A-0367566 y en la solicitud de
patente de Estados Unidos Nº 07/701.415, presentada el 16 de mayo de
1991, incorporados en el presente documento por referencia. Los
vectores pueden derivar de retrovirus.
En lugar del ADN que codifica de la secuencia
señal natural, el vector puede contener el ADN que codifica una
secuencia señal heteróloga. Los ejemplos incluyen la secuencia señal
de la interleuquina 7 (IL-7) descrita en la patente
de Estados Unidos 4.965.195; la secuencia señal del receptor de la
interleuquina 2 descrita por Cosman y col., Nature 312:768 (1984);
el péptido señal de la interleuquina 4 descrito en el documento EP
367.566; el péptido señal del receptor de tipo I de la interleuquina
1 descrito en la patente de Estados Unidos 4.968.607; y el péptido
señal del receptor de tipo II de la interleuquina 1 descrito en el
documento EP 460.846.
La presente invención proporciona proteína
hek-l sustancialmente homogénea, que puede
producirse mediante sistemas de expresión recombinantes como se
describe anteriormente o purificarse a partir de células que se
presentan de forma natural. El hek-L se purifica
hasta una homogeneidad sustancial, como se indica por una única
banda después del análisis por electroforesis en geles de
SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE).
Un procedimiento para la producción de proteína
hek-L comprende el cultivo de células hospedadoras
transformadas con un vector de expresión que comprende una secuencia
de ADN que codifica hek-L en condiciones en las que
hek-L se expresa. Seguidamente la proteína
hek-L se recupera del medio de cultivo o de los
extractos celulares, dependiendo del sistema de expresión empleado.
Como reconocerán los expertos en la técnica, los procedimientos para
la purificación del hek-L recombinante variarán de
acuerdo con factores tales como el tipo de células hospedadoras
empleadas y si hek-L se secreta o no al medio de
cultivo.
Por ejemplo, cuando se emplean los sistemas de
expresión que secretan la proteína recombinante, el medio de cultivo
puede concentrarse primero usando un filtro de concentración de
proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, un Amicon o una
unidad de ultrafiltración Millipore Pellicon. Después de la etapa de
concentración, el concentrado se puede aplicar a una matriz de
purificación tal como un medio de filtración en gel.
Alternativamente, se puede emplear una resina de intercambio
aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos
dietilaminoetilo (DEAE) pendientes. Las matrices pueden ser de
acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos empleados
comúnmente en la purificación de proteínas. Alternativamente, se
puede emplear una etapa de intercambio catiónico. Los
intercambiadores catiónicos adecuados incluyen diversas matrices
insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se
prefieren los grupos sulfopropilo. Finalmente, se pueden emplear uno
o más pasos de cromatografía líquida de alta resolución de fase
inversa (RP-HPLC) empleando medio hidrófobo de
RP-HPLC, (por ejemplo, gel de sílice que tiene
grupos metilo u otros grupos alifáticos pendientes) para purificar
hek-L adicionalmente. Se pueden emplear algunas o
todas las etapas de purificación anteriores, en diversas
combinaciones, para proporcionar una proteína recombinante
sustancialmente homogénea.
Es también posible utilizar una columna de
afinidad que comprende el dominio de unión al ligando de hek para
purificar por afinidad polipéptidos de hek-L
expresados. Los polipéptidos de hek-L se pueden
recuperar de la columna de afinidad en un tampón de elución muy
salino y, seguidamente, dializar en un tampón poco salino.
Alternativamente, la columna de afinidad puede comprender un
anticuerpo que se une a hek-L. En alternativa
adicional, la columna de afinidad comprender una proteína de fusión
hek/Fc unida a una columna de proteína A.
La proteína recombinante producida en cultivos
bacterianos se aísla generalmente, rompiendo inicialmente las
células hospedadoras, centrifugando, extrayendo los sedimentos
celulares si el polipéptido es insoluble, o el sobrenadante líquido
si el polipéptido es soluble, seguido de una o más etapas de
concentración, precipitación con adición de sal, intercambio iónico,
purificación por afinidad o cromatografía de exclusión de tamaño.
Finalmente, se puede emplear RP-HPLC en las etapas
de purificación final. Las células microbianas se pueden romper
mediante cualquier método que convenga, incluyendo ciclos de
congelación-descongelación, sonicación, ruptura
mecánica o el uso de agentes de lisis de células.
Las células hospedadoras recombinantes de
levadura se pueden emplear para expresar hek-L como
un polipéptido secretado. El polipéptido recombinante secretado de
la fermentación de células hospedadoras de levadura se puede
purificar mediante métodos análogos a los descritos por Urdal y col.
(J. Chromatog. 296:171, 1984). Urdal y col. describen dos etapas
secuenciales de HPLC de fase inversa para la purificación de
IL-2 recombinante humana en una columna preparativa
de HPLC.
La presente invención proporciona composiciones
farmacéuticas que comprenden un polipéptido de hek-L
y un vehículo, diluyente o excipiente aceptables fisiológicamente.
Tales composiciones pueden comprender tampones, antioxidantes tales
como el ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (menos
de, aproximadamente 10 restos), proteínas, aminoácidos,
carbohidratos que incluyen glucosa, sacarosa, o dextrinas, agentes
quelantes tales como el EDTA, glutatión y otros estabilizantes y
excipientes. La solución salina neutra o la solución salina mezclada
con seroalbúmina de la misma especie son ejemplos de diluyentes
apropiados.
La presente invención proporciona adicionalmente
fragmentos de secuencias de nucleótidos de hek-L
presentadas en el presente documento. Deseablemente, tales
fragmentos comprenden, al menos, aproximadamente 30 nucleótidos de
la secuencia presentada en la SEQ ID NO:1 ó 3. Se proporcionan el
ADN y ARN complementarios de dichos fragmentos, junto con las formas
de cadena simple y doble cadena del ADN de
hek-L.
Entre los usos de tales fragmentos de ácidos
nucleicos de hek-L está el uso como sonda. Tales
sondas se pueden emplear en procedimientos de hibridación entre
especies para aislar ADN de hek-L de especies de
mamífero adicionales. Como ejemplo, se puede emplear una sonda
correspondiente al dominio extracelular de hek-L.
Las sondas también encuentran su uso en la detección de la presencia
de ácidos nucleicos de hek-L en ensayos in
vitro y en los procedimientos como Transferencia de ARN o ADN.
Se pueden identificar tipos celulares que expresan
hek-L. Tales procedimientos son bien conocidos, y
los expertos en la técnica pueden elegir una sonda de longitud
adecuada, dependiendo de la aplicación particular deseada.
Otros fragmentos útiles de los ácidos nucleicos
de hek-L son los oligonucleótidos sentido y
antisentido que comprenden una secuencia de aminoácidos de cadena
simple (o bien ARN o ADN) capaz de unirse a las secuencias de ARNm
diana de hek-L (sentido) o las de ADN de
hek-L (antisentido). Los oligonucleótidos
antisentido y sentido, de acuerdo con la presente invención, pueden
comprender un fragmento de la región codificante del ADNc de
hek-L mostrado en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3
o el ADN o ARN complementario de los mismos. Tales fragmentos
comprenden generalmente al menos aproximadamente 14 nucleótidos,
preferiblemente aproximadamente de 14 a aproximadamente 30
nucleótidos. La capacidad para crear un oligonucleótidos antisentido
o sentido, basado en la secuencia de ADNc para de proteína dada se
describe en, por ejemplo, Stein y Cohen, Cancer Res. 48:2659, 1988 y
van der Krol y col., BioTechniques 6:958, 1988.
La unión de los oligonucleótidos antisentido o
sentido a las secuencias de ácidos nucleicos diana da como resultado
la formación de dúplices que bloquean la traducción (ARN) o
transcripción (ADN) por varios motivos, incluyendo la
intensificación de la degradación de los dúplices, la prematura
terminación de la transcripción o la traducción, o por otros
motivos. De este modo los oligonucleótidos antisentido se pueden
usar para bloquear la expresión de las proteínas
hek-L. Los oligonucleótidos antisentido o sentido
comprenden adicionalmente oligonucleótidos que tienen una cadena
principal de azúcares-fosfodiéster modificados (u
otros enlaces de azúcares, tales como los descritos en el documento
WO 91/06629) y en los que tales enlaces de azúcares son resistentes
a las nucleasas endógenas. Tales oligonucleótidos con enlaces de
azúcares resistentes son estables in vivo (es decir, capaces
de resistir la degradación enzimática) pero retienen la
especificidad de secuencia para ser capaces de unirse a la
secuencias de nucleótidos diana. Otros ejemplos de oligonucleótidos
sentido o antisentido incluyen los oligonucleótidos que están unidos
covalentemente a grupos orgánicos, tales como los descritos en el
documento WO 90/10448, y otros restos que aumentan la afinidad de
los oligonucleótidos por la secuencia de aminoácidos diana, tales
como poli-(L-lisina). Adicionalmente aún pueden
unirse, agentes intercalantes, tales como elipticina, y agentes de
alquilación o complejos de metal a los oligonucleótidos sentido o
antisentido para modificar la especificidad de unión de los
oligonucleótidos antisentido o sentido a una secuencia de
nucleótidos diana.
Los oligonucleótidos antisentido o sentido se
pueden introducir en las células que contienen las secuencias de
aminoácidos diana mediante cualquier método de transferencia génica,
incluyendo, por ejemplo, transfección de ADN mediada por CaPO_{4},
electroporación, o mediante el uso de vectores de transferencia
génica tales como el virus Epstein-Barr. Los
oligonucleótidos antisentido o sentido se introducen,
preferiblemente, en una célula que contenga la secuencia de ácidos
nucleicos diana mediante inserción del oligonucleótido antisentido o
sentido en un vector retrovírico adecuado, seguidamente poniéndose
en contacto célula con el vector de retrovírico que contiene la
secuencia insertada, o bien in vivo o bien ex vivo.
Los vectores retrovíricos adecuados incluyen, pero no se limitan a,
el retrovirus bovino M-MuLV, N2 (un retrovirus
derivado del M-MuLV), o los vectores de doble copia
llamados DCT5A, DCT5B y DCT5C (ver la solicitación PCT de Estados
Unidos 90/02656).
Los oligonucleótidos sentido o antisentido
también se pueden introducir en una célula que contenga la secuencia
de nucleótidos diana mediante la formación de un conjugado con una
molécula de unión al ligando, como se describe en WO 91/04753. Las
moléculas de unión al ligando adecuadas incluyen, pero no se limitan
a, receptores de la superficie celular, factores de crecimiento,
otras citoquinas, y otros ligandos que se unen a receptores de la
superficie celular. Preferiblemente, la conjugación de la molécula
de unión al ligando no interfiere sustancialmente, con la capacidad
de la molécula de unión al ligando para unirse a su correspondiente
molécula o receptor, o bloquear la entrada del oligonucleótido
sentido o antisentido o su versión conjugada a la célula.
Alternativamente, un oligonucleótido sentido o
antisentido se puede introducir en una célula que contiene la
secuencia de ácidos nucleicos diana mediante la formación de un
complejo oligonucleótido-lípido, como se describe en
el documento WO 90/10448. El complejo oligonucleótido sentido o
antisentido con el líquido se disocia, preferiblemente, dentro de la
célula mediante una lipasa endógena.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
ilustrar realizaciones particulares y no para limitar el alcance de
la invención.
Este ejemplo describe la construcción de un
vector de expresión que codifica una proteína de fusión soluble
hek/Fc, para uso en el aislamiento de clones de ADNc que codifican
un ligando de hek (hek-L). Se presenta un ADN y la
secuencia de aminoácidos que codifica de un ADNc de hek humano en
Wicks y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89.1611, 1992),
incorporado en el presente documento como referencia. Esta proteína
hek comprende (desde el extremo N- al extremo
C-terminal) un dominio extracelular, un dominio
transmembrana, y un dominio citoplas-
mático.
mático.
Se aislaron dos fragmentos de ADN, uno que
codifica un fragmento N-terminal del dominio
extracelular de hek y el otro que codifica un fragmento
C-terminal del dominio extracelular de hek mediante
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) llevada a cabo en
condiciones estándar, usando oligonucleótidos cebadores basados en
la secuencia de nucleótidos de hek publicada por Wicks y col.,
supra. El molde para la PCR fue un ADNc preparado a partir de
ARNm aislado de una línea celular humana de células T leucémicas
llamada CCRF-HSB-2 (ATCC
CCL-120.1). Los productos de PCR que contienen el
extremo 5' del ADN de hek se digirieron con SpeI y HindIII para
aislar un fragmento de ADN que se extiende desde el extremo 5' de la
secuencia de hek humano maduro (es decir, le falta el ADN que
codifica la secuencia señal) hasta el sitio HindIII que se encuentra
en el gen de hek. Los productos de PCR que contienen el extremo 3'
del ADN del dominio extracelular se digirieron con HindIII y ClaI
para aislar un fragmento que se extiende desde el sitio interno
HindIII al sitio ClaI exactamente cadena abajo del extremo 3' de la
secuencia que codifica el dominio extracelular de hek. El sitio ClaI
está en un sitio de clonación múltiple (mcs) introducido exactamente
cadena abajo del dominio extracelular.
Se aisló el ADN que codifica un mutante de la
región Fc de un anticuerpo IgG1 humano. Este ADN mutado de Fc y el
polipéptido codificado de este modo se describen en la solicitud de
patente de EE.UU. Nº de serie 08/097.827, titulada "Novel cytokine
which is a ligand for OX40" presentada el 23 de julio de 1993,
cuya solicitud está incorporada en el presente documento como
referencia. El ADN mutado se hizo derivar del ADN que codifica el
polipéptido Fc natural por mutagénesis específica de sitio
esencialmente como se describe en Deng y Nickoloff, Anal. Biochem.
200:81 (1992). La secuencia de aminoácidos del polipéptido Fc mutado
es idéntica a la del polipéptido Fc natural descrita en la solicitud
PCT WO 93/10151, excepto en que el aminoácido 19 se cambió de Leu a
Ala, el aminoácido 20 se cambió de Leu a Glu y el aminoácido 22 se
cambió de Gly a Ala. Este Fc mutado presenta una afinidad reducida
por los receptores de inmunoglobulinas.
Se cortó un vector recombinante que contiene el
ADN del Fc mutado con ClaI y NotI, las cuales cortan el vector en
una región de multiclonado inmediatamente cadena arriba y cadena
abajo, respectivamente, del inserto de ADN del Fc mutado. Se aisló
el fragmento que codifica el Fc mutado deseado.
El polipéptido de Fc mutado se extiende desde la
región bisagra N-terminal al
C-terminal natural, es decir, es una región Fc del
anticuerpo esencialmente de longitud completa. Los fragmentos de las
regiones Fc, por ejemplo, los que están truncados en el extremo
C-terminal, también se pueden emplear. Los
fragmentos que, preferiblemente, contienen restos de cisteína
múltiple (al menos los restos de cisteína en la reacción bisagra)
permiten que se formen puentes disulfuro intercatenarios entre las
porciones del polipéptido de Fc de dos proteínas de fusión hek/Fc
separadas, creando dímeros.
Los vectores de expresión de mamífero llamados
SMAG4 se cortaron con SpeI y NotI. El vector SMAG4 comprende una
secuencia que codifica el péptido señal de la interleuquina 7 murina
(descrita en la patente de Estados Unidos 4.965.195) insertada en el
vector de alta expresión de mamíferos pDC201 (descrito en Sims y
col., Science 241:585, 1988, y en la solicitud PCT WO 89/03884), que
es capaz de replicarse en E. coli. SpeI corta el vector
inmediatamente cadena abajo de la secuencia que codifica el péptido
señal de IL-7. NotI corta aproximadamente 155pb
cadena abajo del sitio SpeI en un sitio de multiclonado del vector.
Se aisló el fragmento mayor SpeI/NotI que contiene las secuencias
del vector y el ADN que codifica el péptido señal de la
IL-7.
Se realizó una ligación de cuatro etapas para
insertar los dos fragmentos de ADN que codifican hek y el fragmento
de ADN que codifica el Fc mutado descritos anteriormente en el
vector de expresión SMAG4 cortado con SpeI/NotI. Las células de
E. coli se transfectaron con la mezcla de ligación y el
vector recombinante deseado se aisló de ellas. El vector aislado
codifica una proteína de fusión que comprende (desde el extremo
N-terminal al C-terminal) el péptido
seña de IL-7 murina, el dominio extracelular de hek,
cuatro aminoácidos que codifican para el mcs introducido, y el Fc
mutado.
Seguidamente, se cotransfectaron células CV1/EBNA
con el vector de expresión y el plásmido pSV3.NEO. La línea celular
CV1/EBNA (ATCC CRL 10478) se derivó de una línea celular de riñón de
mono como se describe en McMahan y co. (EMBO J., 10:2821, 1991). El
vector pSV3.NEO expresa el antígeno T de SV40, que no se produce por
las células hospedadoras. El vector pSV3.NEO es similar al pSV3
(Mulligan y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072, 1981), pero,
adicionalmente, contiene un gen de resistencia a neomicina. Las
células transformadas se cultivaron para permitir la expresión
transitoria de la proteína de fusión, que se secreta en el medio de
cultivo por medio del péptido señal murino de IL-7.
La proteína de fusión se purificó sobre una columna de proteína
A-Sepharosa, se eluyó y se utilizó para seleccionar
las células según su capacidad de unión a la proteína hek/Fc, como
se describe en los ejemplos 2 y 3.
Se seleccionaron diversos tipos celulares en su
capacidad de unión a hek/Fc, para identificar tipos celulares
candidatos útiles como fuentes de ácidos nucleicos en una tentativa
de clonar un ligando de hek. Las células se incubaron con la
proteína hek/Fc preparada en el ejemplo 1, seguido de un anticuerpo
de ratón anti-Fc humano biotinilado y seguido de
estreptavidina-ficoeritrina (Becton Dickinson). Las
células se lavaron entre las etapas para retirar los reactivos sin
unir. El anticuerpo biotinilado fue suministrado por Jackson
Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA. Este anticuerpo muestra
una unión mínima a las proteínas Fc unidas al receptor Fc\gamma.
La estreptavidina se une a la molécula de biotina unida al
anticuerpo anti-Fc humano que, a su vez, se une a la
porción Fc de la proteína de fusión hek/Fc. La ficoeritrina es una
ficobiliproteína fluorescente que sirve como marca detectable. El
nivel de la señal de fluorescencia se midió para cada tipo celular
usando un citómetro de flujo FACScan® (Becton Dickinson).
La línea celular humana de células T de leucemia
llamada CCRF-HSB-2 (ATCC CCL 120.1)
fue positiva para la unión de hek/Fc. Las células
CCRF-HSB-2 se clasificaron cuatro
veces mediante FACS (clasificación de células activadas con
fluorescencia) para derivar células que expresen niveles elevados de
proteína de unión a hek/
Fc.
Fc.
Se aisló ARNm de las células
CCRF-HSB-2 clasificadas cuatro veces
y se sintetizó ADNc de doble cadena sobre el molde de ARNm mediante
técnicas estándar. Se preparó una genoteca de ADNc mediante ligación
del ADNc en el sitio BgIII de pDC410 mediante un método adaptado
similar al que se describe por Haymerle y col. (Nucl. Acids Res.
14:8615, 1986). El pDC410 es un plásmido de expresión similar a
pDC406 (McMahan y col., EMBO J. 10:2821, 1991). En pDC410, el origen
de replicación de EBV de pDC406 se sustituye por ADN que codifica el
antígeno T mayor de SV40 (controlado por un promotor de SV40). El
sitio de multiclonado (mcs) de pDC410 difiere del pDC406 en que
contiene sitios de restricción adicionales y tres codones de parada
(uno en cada fase de lectura). Un promotor de la polimerasa T7
cadena arriba facilita del mcs la secuenciación de ADN
insertado.
Se sembraron células de una cepa de E.
coli DH5\alpha con una genoteca de ADNc en pDC410 para
proporcionar, aproximadamente, 2000 colonias por placa. Las colonias
se rasparon de cada placa, se juntaron y se preparó el ADN
plasmídico de cada grupo. El ADN juntado que representa,
aproximadamente, 2000 colonias se utilizó seguidamente para
transfectar una capa de células subconfluentes
CV1/EBNA-1 (descritas en el ejemplo 1). Antes de la
transfección, las células CV1/EBNA-1 se mantuvieron
en medio completo (medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que
contiene suero fetal de ternera 10% (volumen/volumen) (FCS),
penicilina 50 U/ml, 5 estreptomicina 50 U/ml, glutamina 2mM) y se
sembraron a una densidad de 2 x 10^{5} células/pocillo sobre
portaobjetos de único pocillo (Lab-Tek). La
transfección implica DEAE-dextrano seguido de un
tratamiento con cloroquina, similar al procedimiento descrito por
Luthman y col., Hucl. Acids. Res. 11:1295, 1983 y McCutchan y col.,
J. Natl. Cancer Inst. 41:351, 1986). Brevemente, los portaobjetos se
trataron previamente con 1 ml de fibronectina humana (10 \mug/ml
en PBS) durante 30 minutos seguido de un lavado con PBS. El medio se
retiró de la capa de células adherentes y se sustituyó por 1,5 ml de
medio completo que contiene sulfato de cloroquina 66,6 \muM.
Seguidamente se añadieron 0,2 ml de solución de ADN (2 \mug de
ADN, DEAE-dextrano 0,5 mg/ml en medio completo que
contiene cloroquina) a las células y se incubaron durante 5 horas.
Después de la incubación, el medio se retiró y las células se
impactaron mediante la adición de medio completo que contiene DMSO
10% durante 2,5 a 20 minutos seguido de sustitución de la solución
por medio completo recién preparado. Las células se cultivaron
durante 2 a 3 días para permitir la expresión transitoria de las
secuencias insertadas.
Las monocapas transfectadas de células
CV1/EBNA-1 se analizaron para la expresión de
hek-L mediante el procedimiento de autorradiografía
en el porta de Gearing y col. (EMBO J. 8:3667, 1989), como sigue. El
anticuerpo de ratón anti-Fc humano (Jackson
Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) se marcó
radiactivamente con yodo mediante el método de la
cloramina-T para usar en el ensayo. Brevemente, se
preparó una columna P6 de acuerdo a las instrucciones del
fabricante. En un tubo de microcentrífuga, se disolvieron 10 \mug
del anticuerpo en 10 \mul de PBS. Se añadieron 2000 \muCi de
Na^{125}I sin vehículo y la solución se mezcló bien. Se añadieron
15 \mul de solución de cloramina-T recién
preparada (32 \mug/ml en 0,05 M de tampón de fosfato sódico (pH
7,2) y, seguidamente, la mezcla se incubó durante 30 minutos a
temperatura ambiente. La mezcla se aplicó inmediatamente a la
columna P6. Seguidamente, se eluyó el anticuerpo marcado
radiactivamente de la columna recogiendo fracciones de
100-150 \mul de eluido. El medio de unión (RPMI
1640 que contiene de seroalbúmina bovina 25 \mug/ml, azida sódica
2 \mug/ml, Hepes 20 mM, pH 7,2) se añadió a las fracciones del
pico para llevar el volumen total de cada fracción hasta 2 ml. El
marcaje radiactivo con yodo proporcionó actividades específicas en
el intervalo de 5-10 x 10^{5} cpm/mmol por
proteína.
La autorradiografía de los portaobjetos se
realizó como sigue. Las células transfectadas
CV1/EBNA-1 (adheridas a las cámaras de los
portaobjetos) se lavaron una vez con medio de unión con leche en
polvo desnatada (BM-NFDM) (medio RPMI 1640 que
contiene seroalbúmina bovina 25 \mug/ml (BSA), azida sódica 2
\mug/ml, Hepes 20 mM, pH 7,2 y leche en polvo desnatada 50 mg/ml).
Seguidamente las células se incubaron con hek/Fc (preparado en el
ejemplo 1) en BM-NFDM (1 \mug/ml) durante 1 hora a
temperatura ambiente. Después de la incubación, las monocapas de
células en los portaobjetos con cámara se lavaron tres veces con
BM-NFDM para retirar la proteína de fusión hek/Fc
sin unir y seguidamente, se incubaron con 40 ng/ml de anticuerpo de
ratón anti-Fc humano marcado con ^{125}I (una
dilución 1:50) durante una hora a temperatura ambiente. Las células
se lavaron tres veces con BM-NFDM, seguido de dos
lavados con tampón fosfato salino (PBS) para retirar el anticuerpo
de ratón anti-Fc humano marcado con ^{125}I sin
unir. Las células se fijaron mediante la incubación durante 30
minutos a temperatura ambiente en glutaraldehído 2.5% en PBS, pH
7,3, se lavaron dos veces en PBS y se secaron al aire. Los
portaobjetos que contienen células en la cámara se expusieron en un
Phosphorimager (Molecular Dynamics) toda la noche, seguidamente se
sumergieron en una emulsión fotográfica de Kodak
GTNB-2 (dilución 6X en agua) y se expusieron en
oscuridad durante 3-5 días a 4ºC en una caja a
prueba de luz. Seguidamente los portaobjetos se revelaron durante
aproximadamente 4 minutos en un revelador de Kodak D19 (40 g/500 ml
de agua), se enjuagaron en agua y se fijaron en el fijador de AGFA
G433C. Los portaobjetos se examinaron individualmente con un
microscopio a un aumento de 25-40x y las células
positivas que expresan hek-L se identificaron por la
presencia en la autorradiografía de granos de plata frente al fondo
de luz.
Se seleccionaron aproximadamente 300.000 ADNc en
grupos de aproximadamente 2.000 ADNc para identificar grupos de
transfectantes que muestran múltiples células positivas para la
unión de hek/Fc. Seguidamente, un grupo positivo se fraccionó en
grupos de 500 y de nuevo seleccionados mediante autorradiografía en
los portaobjetos. Se identificó un grupo positivo, se sometió a
partición en grupos de 100, y se seleccionó mediante el mismo
procedimiento. Se seleccionaron las colonias individuales de un
grupo positivo y hasta que se identificó una única colonia (clon
#A2) que dirige la síntesis de una proteína de superficie con
actividad de unión detectable a hek/Fc. Se aisló un segundo clon,
llamado C6, de un grupo positivo diferente. Los insertos de ADNc de
ambos clones se secuenciaron.
Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la
región codificante del ADNc del clon A2 del ligando de hek humano se
presentan en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2. La proteína
comprende un péptido señal en el extremo N-terminal
(aminoácidos -19 a -1), un dominio extracelular (aminoácidos
1-202) y un dominio C-terminal que
contiene una región hidrófoba (aminoácidos
203-219).
El ADNc del hek-L humano se
escindió del clon A2 mediante la digestión con Bgl II. El ADNc
separado se clonó en el sitio BamHI (en el sitio de clonación
múltiple) de pBLUESCRIPT® SK (-) (Stratagene Cloning Systems, La
Jolla, CA). El vector resultante (designado A2/pBS) en células
DH5\alpha de E. coli se depositó en la American Type
Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC) el 11 de agosto de
1993 y se le asignó el número de acceso ATCC 69384. El depósito de
hizo en los términos del tratado de Budapest.
Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de
la región codificante del ADNc del ligando humano de hek del clon C6
se presenta en la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4. La proteína
comprende un péptido señal en N-terminal
(aminoácidos-22 a -1), un dominio extracelular
(aminoácidos 1-160) y un dominio
C-terminal que contiene una región hidrófoba
(aminoácidos 161-179).
El ADNc del hek-L humano se
escindió del clon C6 mediante digestión con BglI y se insertó en el
sitio BamHI de pBLUESCRIPT® SK(-). El vector resultante (designado
C6/pBS) en células DH5\alpha de E. coli se depositó en la
American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC) el 25 de
agosto de 1993 y se le asignó el número de acceso ATCC 69395. El
depósito se hizo en los términos del tratado de Budapest.
Los límites descritos anteriormente de los
dominios de las proteínas hek-L son aproximados,
cómo apreciarán los expertos en la técnica. Por ejemplo, en lo
referente al hek-L codificado por el clon A2, lo más
probable es que el péptido señal comprenda los aminoácidos -19 a -1,
pero es posible que los aminoácidos -19 a 3 constituyan el péptido
señal. De este modo, la ruptura del péptido señal puede ocurrir
entre los aminoácidos -1 y 1 o entre los aminoácidos 3 y 4, o en
ambas posiciones. Los términos "péptido señal" y "proteína
madura" como se usan aquí en referencia al hek-L
codificado por el clon A2 se entiende que incluyen ambas
alternativas, al igual que otras alternativas descritas en el
presente documento para polipéptidos de hek-L
codificados por el clon A2 o C6.
Se ha encontrado que las proteínas
hek-L codificadas por los clones A2 y C6 se unen a
la membrana celular a través de grupos
glucosil-fosfatidilinositol (GPI). Así se cree que
los dominios hidrófobos contienen señales para el anclaje a GPI. El
procesamiento de las proteínas para efectuar el anclaje a GPI, que
incluye la ruptura de secuencias C-terminales se
describe anteriormente.
Este ejemplo ilustra la preparación de
anticuerpos monoclonales frente a hek-L.
Hek-L se expresa en células hospedadoras de mamífero
tales como COS-7 o
CV-1/EBNA-1 y se purifica usando
cromatografía de afinidad a hek/Fc. El hek-L
purificado (o un fragmento del mismo tal como fragmentos del dominio
extracelular o de péptidos inmunógenos del mismos) se puede usar
para generar anticuerpos monoclonales frente a hek-L
utilizando técnicas ordinarias, por ejemplo, las técnicas descritas
en la patente de Estados Unidos 4.411.993. Brevemente, se inmunizan
ratones con hek-L como un inmunógeno emulsionado en
adyuvante completo de Freund, y se inyecta en cantidades que varían
de 10-100 \mug subcutáneamente o
intraperitonealmente. Diez o veinte días más tarde, los animales
inmunizados son estimulados con hek-L adicional
emulsionado en adyuvante incompleto de Freund. Subsecuentemente, los
ratones son periódicamente estimulados según un protocolo de
inmunización semanal o bi-semanalmente. Las
muestras de sueros son periódicamente recogidas mediante sangrado
retro-orbital o mediante escisión en la punta del
rabo para analizar mediante un ensayo de transferencia de manchas o
ELISA (Ensayo de Inmunoabsorción Ligado a Enzimas), en busca de
anticuerpos frente a hek-L.
Después de la detección de una valoración de
anticuerpo apropiada, a los animales positivos se les proporciona
una última inyección intravenosa de hek-L en
solución salina. Tres o cuatro días más tarde, los animales se
sacrifican, se recogen las células del bazo, y las células del bazo
se fusionan a una línea celular de mieloma murino, por ejemplo, NS1
o, preferiblemente, P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Las células de
hibridoma generadas por fusión, se siembran en placas de
microvaloración múltiple en un medio selectivo HAT (hipoxantina,
aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no
fusionadas, híbridos de mieloma y células híbridas de bazo.
Las células de hibridoma se seleccionan mediante
ELISA en busca de reactividad frente a hek-L
purificado mediante adaptaciones de las técnicas descritas en
Engvall y col., Immunochem. 8:871, 1971 y en la patente de Estados
Unidos 4.703.004. Una técnica de selección preferida es la técnica
de captura del anticuerpo descrita en Beckmann y col., (J. Immunol.
144:4212, 1990). Las células de hibridoma positivas se pueden
inyectar intraperitonealmente en ratones singénicos BALB/c para
producir ascitis que contengan elevadas concentraciones de
anticuerpos monoclonales anti-hek-L.
Alternativamente, las células de hibridoma se pueden dejar crecer
in vitro en frascos o botellas de agitación por rodillo
mediante diversas técnicas. Los anticuerpos monoclonales producidos
en la ascitis de ratones se pueden purificar mediante precipitación
en sulfato amónico, seguido de cromatografía de exclusión en gel.
Alternativamente, también se puede usar la cromatografía de afinidad
basada en la unión del anticuerpo a una proteína A o proteína G, así
como la cromatografía de afinidad basada en la unión a
hek-L.
Se determinó la afinidad de los ligados de hek de
la presente invención hek. Se encontró que los ligandos de hek
también se unen a un receptor tirosina quinasa conocido como elk, el
cual es distinto de hek. También se investigó la capacidad de otras
proteínas para unirse a hek o elk. Estos estudios se desarrollaron
como sigue.
Se transfectaron células CV-1
EBNA-1 (descritas en el ejemplo 1) en placas de
12 pocillos (2,5 x 10^{5} células/pocillo) con el clon A2 o C6
(ADNc del clon A2 o ADNc del clon C6 en el vector de expresión
pDC410, como se describe en el ejemplo 3). Las células transfectadas
se cultivaron durante dos días para permitir la expresión de las
proteínas hek-L, que se retienen en la membrana
celular. Seguidamente, las células se lavan con
BM-NFDM (véase el ejemplo 3) y se incuban con varias
concentraciones de la proteína de fusión humana hek/Fc preparada en
el ejemplo 1, durante una hora a temperatura ambiente.
Posteriormente, las células se lavan y se incuban con el anticuerpo
de ratón anti-IgG humano marcado con ^{125}I
preparado en el ejemplo 3 (40 ng/ml) en medio de unión con agitación
suave durante una hora a 37ºC. Seguidamente, las células se recogen
mediante tripsinización. En todos los ensayos, la unión no
específica del anticuerpo marcado con ^{125}I se ensayó en
ausencia de hek/Fc al igual que en presencia de hek/Fc y un exceso
molar de 200 veces del anticuerpo de ratón anti-IgG
humano sin marcar. El anticuerpo marcado con ^{125}I unido a la
membrana y libre se cuantificó en un contador Autogamma Packard. Los
cálculos de afinidad (Scatchard, Ann. N. Y. Acad. Sci 51:660, 1949)
se generaron en un desarrollo RS/1 (BBN Software, Boston, MA) en una
computadora Microwax. Las células
CV1-EBNA-1 transfectadas con un
vector pDC410 "vacío" se incluyeron en el mismo estudio de
unión como control.
La unión de hek/Fc a las células
CV1-EBNA-1 que expresan dos
proteínas recombinantes diferentes, elk-L humana y
B61 humana, también se analizó en el experimento descrito
anteriormente. Las células se transfectaron con el ligando de elk
(elk-L) o el ADNc de B61 en el vector pDC410. Las
proteínas expresadas se unen a la membrana celular.
El elk-L se une al receptor
conocido como elk, que, como hek, es un miembro de la familia
eph/elk de receptores tirosina quinasas (véase "Antecedentes de la
invención", sección anterior). El elk-L se
incluye en este estudio para investigar si se podría o no unir a un
receptor diferente de la misma familia (es decir, hek). Se ha
identificado a la proteína conocida como B61 como el producto de un
nuevo gen de respuesta inmediata-temprana inducible
por TNF en células humanas endoteliales de cordón umbilical (Holzman
y col., Mol. Cell. Biol. 10:5830, 1990). B61 se incluyó en este
estudio por su grado de homología con elk-L (33% de
identidad al nivel de aminoácidos).
La secuencia de nucleótidos del ADNc aislado de
B61 y la secuencia de aminoácidos codificados se presenta en Holzman
y col., supra, que se incorpora en su totalidad en este
documento como referencia. También se describen los métodos para la
producción y recuperación de B61, junto con ciertas características
estructurales y propiedades de la proteína. Las secuencias de
nucleótidos y aminoácidos que codifican el ADNc de
elk-L se describen en la solicitud de patente de
Estados Unidos en tramitación junto con la presente US nº
07/977.693, presentada el 13 de noviembre de 1992 y se incorpora en
su totalidad en el presente documento por referencia. También se
describen la producción y purificación de elk-L, y
se identifican ciertos dominios funcionales de la proteína. Las
células DH5\alpha de E. coli transformadas con ADNc humano
de elk-L insertado en el sitio SmaI (en el mcs) del
vector de clonación pBLUESCRIPT® SK(-) (Stratagene, La Jolla, CA) se
depositaron como ATCC 69085 el 9 de octubre de 1992.
Los resultados del estudio fueron los
siguientes:
Afinidad de unión por hek/Fc (K_{a}) | |
PDC410 | - - - |
B61 | 5,5 x 10^{7} M^{-1} |
elk-L | 2,3 x 10^{7} M^{-1}; 2,9 x 10^{6} M^{-1} |
hek-L A2 | 2,0 x 10^{8} M^{-1} |
hek-L C6 | 2,0 x 10^{8} M^{-1} |
El vector vacío se mostró una unión detectable a
hek/Fc. Hek/Fc se unió a B61 con una afinidad relativamente
moderada, mostrando una clase de afinidad de unión simple. La unión
de hek/Fc a elk-L dio como resultado un patrón
bifásico, indicando dos componentes de unión con afinidad más baja
(constantes de afinidad 2,3 x 10^{7} M^{-1} y 2,9 x 10^{6}
M^{-1}). Las afinidades de las dos proteínas de
hek-L por hek/Fc fueron equivalentes y relativamente
altas.
El ensayo de unión descrito anteriormente se
repitió, sustituyendo una proteína de fusión soluble elk/Fc de rata
por la proteína de fusión hek/Fc. Las secuencias de nucleótidos y
aminoácidos que codifican el elk de rata se presentan en Lhotak y
col. (Mol. Cell. Biol. 11:2496, 1991). La proteína de fusión elk/Fc
comprende el dominio extracelular de elk fusionado a la región
polipeptídica del Fc natural derivado de un anticuerpo IgG1 humano.
El ensayo indirecto (usando elk/Fc sin marcar y anticuerpo de ratón
anti-IgG humano marcado radiactivamente con yodo) se
empleó ya que el marcaje radiactivo directo de elk/Fc inactiva la
especificidad de unión de los mismos.
Los resultados del estudio fueron los
siguientes:
Afinidad de unión por elk/Fc (K_{a}) | |
B61 | 2,3 x 10^{8} M^{-1}; 7,0 x 10^{7} M^{-1} |
elk-L | 1,08 x 10^{9} M^{-1} |
hek-L A2 | 2,7 x 10^{8} M^{-1}; 3,5 x 10^{7} M^{-1} |
hek-L C6 | 1,3 x 10^{8} M^{-1}; 5,4 x 10^{7} M^{-1} |
Se observó un patrón de unión bifásico de elk/Fc
para B61 con Ka de 2,3 x 10^{8} M^{-1} y 7,0 x 10^{7}
M^{-1}. La constante de afinidad (Ka) mostrada para la unión de
elk/Fc a las células transfectadas que expresan
elk-L se ajustan bien con las observadas para la
unión de elk/Fc al ligando natural expresado en diversas líneas
celulares neuronales de rata. Se ve un patrón de unión de elk/Fc
bifásico para ambos ligandos de hek.
Se presenta la homología de las proteínas humanas
de longitud completa elk-L, B61, ligando de hek A2 y
ligando de hek C6 (descritas en el ejemplo 5) entre cada una de
ellas al nivel de aminoácido en la tabla III:
% de identidad de aminoácidos | |||||
% de similitud | elk-L | B61 | A2 | C6 | |
de aminoácidos | elk-L | - - | 33 | 28 | 32 |
B61 | 51 | - - | 40 | 37 | |
A2 | 48 | 63 | - - | 38 | |
C6 | 50 | 55 | 57 | - - |
El porcentaje de identidad de las secuencias de
ADN se muestra en la tabla IV.
% de identidad del ADN | ||||
elk-L | B61 | A2 | C6 | |
elk-L | 44,0 | 40,7 | 43,7 | |
B61 | 48,9 | 51,5 | ||
A2 | 47,3 | |||
C6 |
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (I)
- SOLICITANTE: BECKMAN, M.P.; CERRETTI, DOUGLAS P.
\vskip0.666000\baselineskip
- (II)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: CITOQUINA QUE UNE EL RECEPTOR HEK A LA SUPERFICIE DE LA CELULA
\vskip0.666000\baselineskip
- (III)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.666000\baselineskip
- (IV)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
- A.
- DESTINATARIO: IMMUNEX CORPORATION
- B.
- CALLE: 51 UNIVERSITY STREET
- C.
- CIUDAD: SEATTLE
- D.
- ESTADO: WASHINGTON
- E.
- PAÍS: ESTADOS UNIDOS
- F.
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 98101
\vskip0.666000\baselineskip
- (V)
- FORMA INFORMÁTICA LEGIBLE:
- A.
- SOPORTE INFORMÁTICO: disquete
- B.
- ORDENADOR: Apple Macintosh
- C.
- SISTEMA OPERATIVO: apple system 7.1
- D.
- PROGRAMA: Microsoft word for apple, version 5.1a
\vskip0.666000\baselineskip
- (VI)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
- A.
- NÚMERO DE SOLICITUD:
- B.
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 17 DE AGOSTO DE 1994
- C.
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
- (VII)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
- A.
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/240.124
- B.
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 9 DE MAYO DE 1994
\vskip0.666000\baselineskip
- (VII)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
- A.
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/161.132
- B.
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 3 DE DICIEMBRE DE 1993
\vskip0.666000\baselineskip
- (VII)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
- A.
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/114.426
- B.
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 30 DE AGOSTO DE 1993
\vskip0.666000\baselineskip
- (VII)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
- A.
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/109.745
- B.
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 20 DE AGOSTO DE 1993
\vskip0.666000\baselineskip
- (VIII)
- INFORMACIÓN DEL EXPEDIENTE DEL AGENTE:
- A.
- NOMBRE: SEESE, KATHRYN A.
- B.
- NÚMERO DE REGISTRO: 32.172
- C.
- NÚMERO DE EXPEDIENTE DE REFERENCIA: 2814-WO
\vskip0.666000\baselineskip
- (IX)
- INFORMACIÓN PARA LA TELECOMUNICACIÓN:
- A.
- TELÉFONO: (206) 587-0430
- B.
- TELEFAX: (206) 233-0644
- C.
- TELEX: 756.822
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1.
\vskip0.666000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- A.
- LONGITUD: 1037 pares de bases
- B.
- TIPO: ácido nucleico
- C.
- CADENA: simple
- D.
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (II)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.666000\baselineskip
- (III)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (IV)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (VII)
- FUENTE INMEDIATA:
- B.
- CLON: hek-L A2
\vskip0.666000\baselineskip
- (IX)
- CARACTERÍSTICA:
- A.
- NOMBRE / CLAVE: CDS
- B.
- LOCALIZACIÓN: 83...799
\vskip0.666000\baselineskip
- (IX)
- CARACTERÍSTICA:
- A.
- NOMBRE / CLAVE: sig_péptido
- B.
- LOCALIZACIÓN: 83...139
\vskip0.666000\baselineskip
- (IX)
- CARACTERÍSTICA:
- A.
- NOMBRE / CLAVE: mat_péptido
- B.
- LOCALIZACIÓN: 140...796
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2.
\vskip0.666000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- A.
- LONGITUD: 238 aminoácidos
- B.
- TIPO: aminoacídica
- C.
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (III)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2.
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3.
\vskip0.666000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- A.
- LONGITUD: 636 pares de bases
- B.
- TIPO: ácido nucleico
- C.
- CADENA: única
- D.
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (IV)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.666000\baselineskip
- (III)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (IV)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (VII)
- FUENTE INMEDIATA:
- B.
- CLON: hek-L C6
\vskip0.666000\baselineskip
- (IX)
- CARACTERÍSTICA:
- A.
- NOMBRE / CLAVE: mat_péptido
- B.
- LOCALIZACIÓN: 94...630
\vskip0.666000\baselineskip
- (IX)
- CARACTERÍSTICA:
- A.
- NOMBRE / CLAVE: CDS
- B.
- LOCALIZACIÓN: 28...633
\vskip0.666000\baselineskip
- (IX)
- CARACTERÍSTICA:
- A.
- NOMBRE PARA CLAVE: sig_péptido
- B.
- LOCALIZACIÓN: 28...93
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4.
\vskip0.666000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- C.
- LONGITUD: 201 aminoácidos
- D.
- TIPO: aminoacídica
- E.
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (V)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4.
Claims (24)
1. Un ADN aislado que codifica un polipéptido de
ligando de hek (hek-L) capaz de unirse a hek, en el
dicho hek-L comprende una secuencia de aminoácidos
que es, al menos, idéntica en el 80% a la secuencia de restos
1-129 de la SEQ ID NO: 2.
2. Un ADN aislado de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dicho polipéptido de
hek-L comprende la secuencia de aminoácidos de o
bien restos 1-202 o bien restos
1-219 de la SEQ ID NO: 2.
3. Un ADN aislado que codifica el polipéptido de
hek-L capaz de unirse hek, en el que dicho
hek-L comprende una secuencia de aminoácidos que es,
al menos, idéntica en el 80% a la secuencia de restos
1-179 de la SEQ ID
NO:4.
NO:4.
4. Un ADN aislado de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que dicho polipéptido de
hek-L comprende la secuencia de aminoácidos de o
bien los restos 1-160 o bien los restos
1-179 de la SEQ ID NO: 4.
5. Un ADN aislado que codifica un polipéptido de
hek-L, en el que dicho polipéptido de
hek-L comprende una secuencia de aminoácidos que son
los:
- a)
- aminoácidos z hasta x de la SEQ ID NO:2, en los que z es un aminoácido en las posiciones 1 a 12 de la SEQ ID NO:2 y x es un aminoácido en las posiciones 193 a 219 de la SEQ ID NO:2; o
- b)
- aminoácidos z' hasta y de la SEQ ID NO: 4, en los que z' es un aminoácido en las posiciones 1 a 4 de la SEQ ID NO: 4 e y es un aminoácido en las posiciones 147 a 179 de la SEQ ID NO: 4.
6. Un ADN aislado que es:
- a)
- un ADN que codifica un fragmento del polipéptido de hek-L de la SEQ ID NO:2, o
- b)
- un ADN que codifica un fragmento del polipéptido de hek-L de la SEQ ID NO:4,
- en
- el que dicho fragmento es capaz de unirse a hek.
7. Un vector de expresión que comprende un ADN de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Un procedimiento para la preparación de un
polipéptido de hek-L, que comprende cultivar células
hospedadoras transformadas con un vector de acuerdo con la
reivindicación 7, en condiciones que promueven la expresión del
polipéptido de hek-L y recuperar el polipéptido de
hek-L del cultivo.
9. Un ADN aislado que codifica una proteína de
fusión que comprende un hek-L soluble capaz de
unirse a hek y un polipéptido Fc, en el que dicho
hek-L comprende una secuencia de aminoácidos que es,
al menos, idéntica en el 80% a una secuencia que o bien son los
aminoácidos 1-202 de la SEQ ID NO: 2 o bien los
aminoácidos 1-160 de la SEQ ID NO: 4.
10. Un vector de expresión que comprende un ADN
de acuerdo con la reivindicación 9.
11. Un procedimiento para la preparación de una
proteína de fusión hek-L/Fc, que comprende cultivar
células hospedadoras transformadas con un vector de acuerdo con la
reivindicación 10, en condiciones que promueven la expresión de la
proteína de fusión hek-L/Fc y recuperar la proteína
de fusión hek-L/Fc del cultivo.
12. Un polipéptido de hek-L
purificado capaz de unirse a hek, en el que dicho
hek-L comprende una secuencia de aminoácidos que es,
al menos, idéntica en el 80% a la secuencia de restos
1-219 de la SEQ ID NO: 2.
13. Un hek-L de acuerdo con la
reivindicación 12, en el que dicho hek-L comprende
la secuencia de aminoácidos o bien de los restos
1-202 o bien de los restos 1-219 de
la SEQ ID NO: 2.
14. Un polipéptido de hek-L
purificado capaz de unirse a hek, en el que dicho
hek-L comprende una secuencia de aminoácidos que es,
al menos, idéntica en el 80% a la secuencia de restos
1-179 de la SEQ ID NO:4.
15. Un hek-L de acuerdo con la
reivindicación 14, en el que dicho hek-L comprende
la secuencia de aminoácidos o bien los restos 1-160
o bien los restos 1-179 de la SEQ ID NO: 4.
16. Un polipéptido de hek-L
purificado, en el que dicho polipéptido hek-L
comprende una secuencia de aminoácidos que son los:
- a)
- aminoácidos z hasta x de la SEQ ID NO:2, en los que z es un aminoácido en las posiciones 1 a 12 de la SEQ ID NO:2 y x es un aminoácido en las posiciones 193 a 219 de la SEQ ID NO:2; o
- b)
- aminoácidos z' hasta y de la SEQ ID NO: 4, en los que z' es un aminoácido en las posiciones 1 a 4 de la SEQ ID NO: 4 e y es un aminoácido en las posiciones 147 a 179 de la SEQ ID NO: 4.
17. Un polipéptido de hek-L
purificado que es:
- a)
- un polipéptido de hek-L que comprende los restos 1-219 de la SEQ ID NO:2;
- b)
- un polipéptido de hek-L que comprende los restos 1-179 de la SEQ ID NO:4, o
- c)
- un fragmento de un polipéptido hek-L de (a) o (b), en el que dicho fragmento es capaz de unirse a hek.
18. Una proteína hek-L codificada
por el inserto de ADNc de hek-L del vector
recombinante contenido en las células transformadas que o bien son
células transformadas depositadas como ATCC 69384 o bien células
transformadas depositadas como ATCC 69395.
19. Una proteína de fusión codificada por un ADN
de acuerdo con la reivindicación 9.
20. Un anticuerpo que es inmunorreactivo con un
polipéptido de hek-L de acuerdo con la
reivindicación 13 ó 15, o con un fragmento inmunogénico de dicho
hek-L.
21. Un anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 20, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal.
22. Una molécula de ácido nucleico aislada que
comprende una secuencia de, al menos, 30 nucleótidos de la región
codificante de la secuencia de ADN o bien la SEQ ID NO: 1, o el ADN
o ARN complementarios de la misma o bien la SEQ ID NO: 3, o el ADN o
ARN complementarios de la misma.
23. Un oligómero que comprende de dos a cuatro
polipéptidos solubles de hek-L capaces de unirse a
hek, en el que dichos polipéptidos solubles de hek-L
comprenden cada uno de ellos una secuencia de aminoácidos que es, al
menos, idéntica en el 80% a una secuencia que o bien son los
aminoácidos 1-202 de la SEQ ID NO: 2 o bien los
aminoácidos 1-160 de la SEQ ID NO: 4.
24. Un oligómero que comprende de dos a cuatro
polipéptidos solubles de hek-L capaces de unirse a
hek, en el que dichos polipéptidos solubles de hek-L
comprenden cada una de ellos una secuencia de aminoácidos que son
los:
- a)
- aminoácidos z hasta x' de la SEQ ID NO: 2, en los que z es un aminoácido en las posiciones 1 a 12 de la SEQ ID NO: 2 y x' es un aminoácido en las posiciones 193 a 202 de la SEQ ID NO: 2, o
- b)
- aminoácidos z' hasta y' de la SEQ ID NO: 4, en los que z' es un aminoácido en las posiciones 1 a 4 de la SEQ ID NO: 4 e y' es un aminoácido en las posiciones 147 a 160 de la SEQ ID NO: 4.
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