JP4722048B2 - Ｎ−デアセチラーゼ／ｎ−スルホトランスフェラーゼ２を発現するベクター - Google Patents
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Description
本発明は、Ｎ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２を安定的に大量に発現することができる発現ベクターに関する。より詳細には、本発明は、バキュロウイルスの系を用いてＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２を安定的に大量に発現するための発現ベクターに関する。
Ｎ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２（Ｎ−ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ／Ｎ−ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２）は、脱Ｎ−アセチル化（Ｎ−ｄｅａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）とＮ−硫酸基転移（Ｎ−ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）の両方を触媒する酵素である（Ｗｅｉ Ｚ，Ｓｗｉｅｄｌｅｒ ＳＪ，Ｉｓｈｉｈａｒａ Ｍ，Ｏｒｅｌｌａｎａ Ａ，Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ ＣＢ．Ａ ｓｉｎｇｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｔａｌｙｚｅｓ ｂｏｔｈ Ｎ−ｄｅａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎ−ｓｕｌｆａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０，３８８５−３８８８．（１９９３）、及び米国特許第５，５４１，０９５号）。Ｎ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼの生産に関しては、ヒト・Ｎ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ３をサルＣＯＳ−７細胞を用いて一過的に発現する系が従来用いられていたが（Ａｉｋａｗａ Ｊ，Ｅｓｋｏ．ＪＤ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｈｉｒｄ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ／ｈｅｐａｒｉｎ ＧｌｃＮＡｃ Ｎ−ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ／Ｎ−ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆａｍｉｌｙ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２６９０−２６９５．（１９９９））、品質の安定した酵素の大量取得には不向きであった。
一方、バキュロウイルスの系を用いて細胞外にタンパク質を産生させる方法が知られている。例えば、Ｍａｒｃｈａｌ Ｉ，Ｃｅｒｕｔｔｉ Ｍ，Ｍｉｒ ＡＭ，Ｊｕｌｉａｎｔ Ｓ，Ｄｅｖａｕｃｈｅｌｌｅ Ｇ，Ｃａｃａｎ Ｒ，Ｖｅｒｂｅｒｔ Ａ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ ｆｏｒｍ ｏｆ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ ｔｒａｎｓ−ｓｉａｌｉｄａｓｅ ｉｎ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ：ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ−ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｓｙｓｔｅｍ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．１１，５９３−６０３（２００１）には、バキュロウイルスの系においてｇｐ６７シグナル配列を用いてＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉのｔｒａｎｓ−ｓｉａｌｉｄａｓｅを発現させることが記載されている。Ｖｌａｓｅ Ｈ，Ｍａｔｓｕｏｋａ Ｎ，Ｇｒａｖｅｓ ＰＮ，Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ ＲＰ，Ｄａｖｉｅｓ ＴＦ．Ｆｏｌｄｉｎｇ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ（ＴＳＨ）ａｎｄ ＴＳＨ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ＴＳＨ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１３８，１６５８−１６６６（１９９７）には、バキュロウイルスの系においてｇｐ６７シグナル配列を用いてマウスのＴＳＨレセプターを発現させることが記載されている。Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ Ｔ，Ａｏｕｓｔｉｎ Ｌ，Ｚｉｎｇｅｌ Ｏ，Ｍａｒａｎｇｉ Ｍ，Ｖｏｎａｃｈ Ｂ，Ｔｏｗｂｉｎ Ｈ，Ｇｅｉｓｅｒ Ｍ．Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９５，９３−１０１（１９９６）には、バキュロウイルスの系においてｇｐ６７シグナル配列を用いて一本鎖抗体を発現させることが記載されている。Ｒｕｐｐ Ｂ，Ｒｏｓｓｌｅｒ Ｕ，Ｌｏｗｅｌ Ｍ，Ｗｅｒｅｎｓｋｉｏｌｄ ＡＫ．Ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＩＬ−１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｌａｔｅｄ Ｔ１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１６，５９５−６０１（１９９５）には、バキュロウイルスの系においてｇｐ６７シグナル配列を用いてインターロイキン１関連Ｔ１レセプターを発現させることが記載されている。また、Ｍｕｒｐｈｙ ＣＩ，ＭｃＩｎｔｉｒｅ ＪＲ，Ｄａｖｉｓ ＤＲ，Ｈｏｄｇｄｏｎ Ｈ，Ｓｅａｌｓ ＪＲ，Ｙｏｕｎｇ Ｅ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，ａｎｄ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｇｔ ａｎｄ ｐ６７ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．４，３４９−３５７．（１９９３）．Ｅｒｒａｔｕｍｉｎ：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．５，１０３（１９９４）には、バキュロウイルスの系においてｇｐ６７シグナル配列を用いてヒトＡＩＤＳウイルスの外皮タンパク質ｇｐ１２０を発現させることが記載されている。
また、特開２００２−３２５５７９号、及び平成１３年度 理研研究年報、６８１−６８７、構造生物化学研究室 ４．昆虫細胞を用いた高効率タンパク質発現系の構築、（１）発現増強因子（佐野，前田（雄）；前田（佳）（細胞情報伝達研））には、バキュロウイルス・昆虫培養細胞系を用いてポリペプチドを発現させる際に、ポリペプチドのコーディング配列の上流に、ロブスター由来の非翻訳リーダー配列Ｌ２１を挿入すると、ポリペプチドの発現量の大幅な上昇が見られることが記載されている。
さらに、最近、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２のアミノ酸をＨｉｓタグとの融合タンパク質としてバキュロ系で発現した例が紹介されている（Ｂａｌａｇｕｒｕｎａｔｈａｎ Ｋｕｂｅｒａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ０１ Ｎｏｖ ２００３；２１，１３４３−１３４６）。
一方、バキュロウイルスの系を用いて細胞外にタンパク質を産生させる方法が知られている。例えば、Ｍａｒｃｈａｌ Ｉ，Ｃｅｒｕｔｔｉ Ｍ，Ｍｉｒ ＡＭ，Ｊｕｌｉａｎｔ Ｓ，Ｄｅｖａｕｃｈｅｌｌｅ Ｇ，Ｃａｃａｎ Ｒ，Ｖｅｒｂｅｒｔ Ａ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ ｆｏｒｍ ｏｆ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ ｔｒａｎｓ−ｓｉａｌｉｄａｓｅ ｉｎ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ：ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ−ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｓｙｓｔｅｍ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．１１，５９３−６０３（２００１）には、バキュロウイルスの系においてｇｐ６７シグナル配列を用いてＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉのｔｒａｎｓ−ｓｉａｌｉｄａｓｅを発現させることが記載されている。Ｖｌａｓｅ Ｈ，Ｍａｔｓｕｏｋａ Ｎ，Ｇｒａｖｅｓ ＰＮ，Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ ＲＰ，Ｄａｖｉｅｓ ＴＦ．Ｆｏｌｄｉｎｇ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ（ＴＳＨ）ａｎｄ ＴＳＨ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ＴＳＨ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１３８，１６５８−１６６６（１９９７）には、バキュロウイルスの系においてｇｐ６７シグナル配列を用いてマウスのＴＳＨレセプターを発現させることが記載されている。Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ Ｔ，Ａｏｕｓｔｉｎ Ｌ，Ｚｉｎｇｅｌ Ｏ，Ｍａｒａｎｇｉ Ｍ，Ｖｏｎａｃｈ Ｂ，Ｔｏｗｂｉｎ Ｈ，Ｇｅｉｓｅｒ Ｍ．Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９５，９３−１０１（１９９６）には、バキュロウイルスの系においてｇｐ６７シグナル配列を用いて一本鎖抗体を発現させることが記載されている。Ｒｕｐｐ Ｂ，Ｒｏｓｓｌｅｒ Ｕ，Ｌｏｗｅｌ Ｍ，Ｗｅｒｅｎｓｋｉｏｌｄ ＡＫ．Ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＩＬ−１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｌａｔｅｄ Ｔ１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１６，５９５−６０１（１９９５）には、バキュロウイルスの系においてｇｐ６７シグナル配列を用いてインターロイキン１関連Ｔ１レセプターを発現させることが記載されている。また、Ｍｕｒｐｈｙ ＣＩ，ＭｃＩｎｔｉｒｅ ＪＲ，Ｄａｖｉｓ ＤＲ，Ｈｏｄｇｄｏｎ Ｈ，Ｓｅａｌｓ ＪＲ，Ｙｏｕｎｇ Ｅ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，ａｎｄ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｇｔ ａｎｄ ｐ６７ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．４，３４９−３５７．（１９９３）．Ｅｒｒａｔｕｍｉｎ：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．５，１０３（１９９４）には、バキュロウイルスの系においてｇｐ６７シグナル配列を用いてヒトＡＩＤＳウイルスの外皮タンパク質ｇｐ１２０を発現させることが記載されている。
また、特開２００２−３２５５７９号、及び平成１３年度 理研研究年報、６８１−６８７、構造生物化学研究室 ４．昆虫細胞を用いた高効率タンパク質発現系の構築、（１）発現増強因子（佐野，前田（雄）；前田（佳）（細胞情報伝達研））には、バキュロウイルス・昆虫培養細胞系を用いてポリペプチドを発現させる際に、ポリペプチドのコーディング配列の上流に、ロブスター由来の非翻訳リーダー配列Ｌ２１を挿入すると、ポリペプチドの発現量の大幅な上昇が見られることが記載されている。
さらに、最近、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２のアミノ酸をＨｉｓタグとの融合タンパク質としてバキュロ系で発現した例が紹介されている（Ｂａｌａｇｕｒｕｎａｔｈａｎ Ｋｕｂｅｒａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ０１ Ｎｏｖ ２００３；２１，１３４３−１３４６）。
上記した通り、ＣＯＳ−７細胞を用いて一過的に発現させる公知の発現系ではＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼを安定的に大量に製造することができず、実用的ではなかった。本発明は、Ｎ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２を安定的に大量生産することを可能とする発現ベクター及びそれを用いたＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の製造方法を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２（ヒトＮＤＳＴ２とも称する）をバキュロウイルスの系を用いることにより大量生産することを目的として鋭意検討した結果、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の７９番目以降のアミノ酸をコードするＤＮＡ断片に、バキュロウイルスｇｐ６７、メリチン、ボンビキシン等のシグナル配列を直接連結することにより、脱Ｎ−アセチル化酵素活性とＮ−硫酸転移酵素活性の両方を所持するタンパク質を培地中に安定的に大量に分泌することが可能になることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明によれば、（１）以下の（ａ）または（ｂ）の膜貫通領域のＮ末側配列を除去したヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２が提供される。
（ａ）配列番号２記載の７９番から８８３番までのアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）のタンパク質において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または転位したアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ−デアセチラーゼ活性とＮ−スルホトランスフェラーゼ活性とを有するタンパク質。
本発明の別の側面によれば、（２）少なくともバキュロウイルス発現ベクター内で機能しうる、シグナルペプチドをコードするＤＮＡと、その下流に連結された上記（１）記載のタンパク質をコードするＤＮＡとを含むトランスファーベクターが提供される。上記バキュロウイルス発現ベクター内で機能しうる、シグナルペプチドをコードするＤＮＡとしては、バキュロウイルス由来、カイコ由来またはミツバチ由来のシグナルペプチドをコードするＤＮＡであることが好ましい。また、該トランスファーベクターは、さらにコーディング配列の発現を促進させる機能を有する非翻訳リーダー配列を含むことが好ましく、バキュロウイルス由来のシグナルペプチドはｇｐ６７であり、カイコ由来のシグナルペプチドはボンビキシン・シグナルペプチドであり、ミツバチ由来のシグナルペプチドはメリチン・シグナルペプチドであり、非翻訳リーダー配列はロブスターＬ２１ＤＮＡであることが、より好ましい。また、上記（１）記載のタンパク質をコードするＤＮＡの下流に、さらにヒスチジン・タグに対応するＤＮＡを有することが好ましい。
本発明のさらに別の側面によれば、（３）少なくともバキュロウイルス由来のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ、及びヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の７９番から８８３番までのアミノ酸をコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡにおいて１若しくは数個のヌクレオチドの欠失、挿入若しくは置換を有するＤＮＡであって、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２と同等の酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡを、この順で５’から３’方向に有するＤＮＡ断片をバキュロウイルスＤＮＡへ組み込んで得られる、組換えバキュロウイルス発現ベクターが提供される。ＤＮＡ断片のバキュロウイルスＤＮＡへの組み込みが、該ＤＮＡ断片とバキュロウイルスＤＮＡの多核体遺伝子との相同組換えによって行なわれることが好ましい。
本発明のさらに別の側面によれば、（４）上記した本発明の組換えバキュロウイルス発現ベクターを有する昆虫細胞が提供される。昆虫細胞は、好ましくは、ヨトウガ細胞である。
本発明のさらに別の側面によれば、（５）上記した本発明の組換えバキュロウイルス発現ベクターを有する昆虫細胞を培養し、膜貫通領域のＮ末側配列を除去したヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２を分泌発現させることを含む、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の製造方法が提供される。好ましくは、昆虫細胞は血清含有培地で培養される。
本発明のさらに別の側面によれば、（６）上記した製造方法により製造される、７９番から８８３番までのアミノ酸から成るヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、（７）上記（１）に記載のヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２と、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２と免疫学的に反応しうる抗体とを反応させる工程を含む、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の検出方法が提供される。好ましくは、抗体は、配列番号２の任意の連続した１１〜１３個のアミノ酸を含む抗原ペプチドを哺乳動物または鳥類に免疫して得られたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。
本発明者らは、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２（ヒトＮＤＳＴ２とも称する）をバキュロウイルスの系を用いることにより大量生産することを目的として鋭意検討した結果、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の７９番目以降のアミノ酸をコードするＤＮＡ断片に、バキュロウイルスｇｐ６７、メリチン、ボンビキシン等のシグナル配列を直接連結することにより、脱Ｎ−アセチル化酵素活性とＮ−硫酸転移酵素活性の両方を所持するタンパク質を培地中に安定的に大量に分泌することが可能になることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明によれば、（１）以下の（ａ）または（ｂ）の膜貫通領域のＮ末側配列を除去したヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２が提供される。
（ａ）配列番号２記載の７９番から８８３番までのアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）のタンパク質において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または転位したアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ−デアセチラーゼ活性とＮ−スルホトランスフェラーゼ活性とを有するタンパク質。
本発明の別の側面によれば、（２）少なくともバキュロウイルス発現ベクター内で機能しうる、シグナルペプチドをコードするＤＮＡと、その下流に連結された上記（１）記載のタンパク質をコードするＤＮＡとを含むトランスファーベクターが提供される。上記バキュロウイルス発現ベクター内で機能しうる、シグナルペプチドをコードするＤＮＡとしては、バキュロウイルス由来、カイコ由来またはミツバチ由来のシグナルペプチドをコードするＤＮＡであることが好ましい。また、該トランスファーベクターは、さらにコーディング配列の発現を促進させる機能を有する非翻訳リーダー配列を含むことが好ましく、バキュロウイルス由来のシグナルペプチドはｇｐ６７であり、カイコ由来のシグナルペプチドはボンビキシン・シグナルペプチドであり、ミツバチ由来のシグナルペプチドはメリチン・シグナルペプチドであり、非翻訳リーダー配列はロブスターＬ２１ＤＮＡであることが、より好ましい。また、上記（１）記載のタンパク質をコードするＤＮＡの下流に、さらにヒスチジン・タグに対応するＤＮＡを有することが好ましい。
本発明のさらに別の側面によれば、（３）少なくともバキュロウイルス由来のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ、及びヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の７９番から８８３番までのアミノ酸をコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡにおいて１若しくは数個のヌクレオチドの欠失、挿入若しくは置換を有するＤＮＡであって、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２と同等の酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡを、この順で５’から３’方向に有するＤＮＡ断片をバキュロウイルスＤＮＡへ組み込んで得られる、組換えバキュロウイルス発現ベクターが提供される。ＤＮＡ断片のバキュロウイルスＤＮＡへの組み込みが、該ＤＮＡ断片とバキュロウイルスＤＮＡの多核体遺伝子との相同組換えによって行なわれることが好ましい。
本発明のさらに別の側面によれば、（４）上記した本発明の組換えバキュロウイルス発現ベクターを有する昆虫細胞が提供される。昆虫細胞は、好ましくは、ヨトウガ細胞である。
本発明のさらに別の側面によれば、（５）上記した本発明の組換えバキュロウイルス発現ベクターを有する昆虫細胞を培養し、膜貫通領域のＮ末側配列を除去したヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２を分泌発現させることを含む、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の製造方法が提供される。好ましくは、昆虫細胞は血清含有培地で培養される。
本発明のさらに別の側面によれば、（６）上記した製造方法により製造される、７９番から８８３番までのアミノ酸から成るヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、（７）上記（１）に記載のヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２と、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２と免疫学的に反応しうる抗体とを反応させる工程を含む、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の検出方法が提供される。好ましくは、抗体は、配列番号２の任意の連続した１１〜１３個のアミノ酸を含む抗原ペプチドを哺乳動物または鳥類に免疫して得られたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。
図１は、精製抗ヒトＮＤＳＴ２抗体を用いてヨトウガ細胞中のヒトＮＤＳＴ２を検出した結果を示す。
図２は、精製抗ヒトＮＤＳＴ２抗体を用いてヨトウガ細胞中のヒトＮＤＳＴ２を検出した結果を示す。
図２は、精製抗ヒトＮＤＳＴ２抗体を用いてヨトウガ細胞中のヒトＮＤＳＴ２を検出した結果を示す。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明のＮ末側配列を除去したヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２は、配列番号２記載のアミノ酸配列において、膜貫通領域のＮ末側配列である１番から７８番までのアミノ酸を除去し、７９番から８８３番までのアミノ酸配列からなるタンパク質であることを特徴とする。本発明によって得られる、７９番から８８３番までのアミノ酸配列からなる短縮型ヒトＮＤＳＴ２は、現在までに知られている最も短い、活性を有するヒトＮＤＳＴ２ポリペプチドであり、可溶性であり、高活性であるという優れた効果を有する。なお、上記短縮型ヒトＮＤＳＴ２において、１もしくは数個（好ましくは１個から３個、より好ましくは１個から２個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入または転位した配列を有するタンパク質（このようなタンパク質を「変異型タンパク質」または「変異体」ともいう。）であって、Ｎ−デアセチラーゼ活性とＮ−スルホトランスフェラーゼ活性とを有するものは、配列番号２に記載のアミノ酸配列及び配列番号１記載の塩基配列の情報に基づいて当業者であれば本明細書の記載に基づいて適宜調製することができるので、本発明に包含される。また、「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または転位した配列を有するタンパク質」とは、換言すれば配列番号２記載の７９番から８８３番までのアミノ酸配列と高い相同性を有し、Ｎ−デアセチラーゼ活性とＮ−スルホトランスフェラーゼ活性とを有するものと言うこともできる。ここで、「高い相同性」とは、例えば７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上であり、以下順次、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％に例示されるより高いパーセンテージがより好ましい。例えば、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。
遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７，１９８２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２，９４４１，１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１，１９８５、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，８７４９，１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９，１９８２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８，１９８５、Ｇｅｎｅ，３４，３１５，１９８５、Ｇｅｎｅ，１０２，６７，１９９１等に記載の方法に準じて行うことができる。上記した方法により、配列番号１に記載の塩基配列において変異を有する塩基配列を有するＤＮＡを入手し、このＤＮＡを発現させることにより、目的タンパク質を製造することができる。
本発明のトランスファーベクターは、少なくともバキュロウイルス発現ベクター内で機能しうる、シグナルペプチド、好ましくはバキュロウイルス由来のシグナルペプチド、カイコ由来のシグナルペプチド、ミツバチ由来のシグナルペプチドをコードするＤＮＡと、その下流に連結された上記のヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２をコードするＤＮＡとを含む。また、シグナルペプチドをコードするＤＮＡの上流には、翻訳効率を上昇させ、目的タンパク質の発現効率を上昇させるために、コーディング配列の発現を促進させる機能を有する非翻訳リーダー配列を挿入することが好ましい。バキュロウイルス由来のシグナルペプチドとしてはｇｐ６７が、カイコ由来のシグナルペプチドとしてはボンビキシン・シグナルペプチドが、ミツバチ由来のシグナルペプチドとしてはメリチン・シグナルペプチドがそれぞれ例示され、該非翻訳リーダー配列としてはロブスターＬ２１ＤＮＡが例示され、かつ好ましい。なお、シグナルペプチドとしては、バキュロウイルスｇｐ６７が最も好ましい。このようなトランスファーベクターの製造方法の詳細については後述する。
本発明の組み換えバキュロウイルス発現ベクターは、少なくともバキュロウイルス由来のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ、及びヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の７９番から８８３番までのアミノ酸をコードするＤＮＡまたは該ＤＮＡにおいて１又は数個のヌクレオチドの欠失、挿入または置換を有するＤＮＡであって、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２と同等の酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡを、この順で５’から３’方向に有するＤＮＡ断片をバキュロウイルスＤＮＡへ組み込んで得られる。
本発明の組み換えバキュロウイルス発現ベクターにおいては、最大限の活性を得ることを目的として、ロブスターＬ２１配列（翻訳効率の上昇）、ｇｐ６７シグナルペプチド（分泌効率の上昇）、及びヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の７９番から８８３番までのアミノ酸配列（現在知られている酵素活性に必要な最小領域）をそれぞれ連結してバキュロウイルス発現ベクターに組み込んだものであることが最も好ましい。
本発明では、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の７９番から８８３番までのアミノ酸をコードするＤＮＡを使用する。ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２としては野生型のみならず、遺伝子操作によって作製した変異体を使用してもよい。このような変異体としては、当業者に周知の遺伝子組み換え技術によって野生型のＤＮＡ配列において１又は数個（好ましくは１から１０個、より好ましくは１から６個、さらに好ましくは１〜３個程度）のヌクレオチドの欠失、挿入または置換を有するＤＮＡあるいは野生型のＤＮＡ配列と相同性（例えば７５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性）を有するＤＮＡであって、天然に存在する野生型のヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２と同等またはそれ以上の生物学的活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の７９番から８８３番までのアミノ酸としては、具体的には、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の７９番目から８８３番目が挙げられる。また、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列をコードする塩基配列の具体例としては、配列番号：１で表わされる塩基配列が挙げられる。これらのＤＮＡは、それ自体公知の遺伝子工学的手法を用いてクローニングすることができ、あるいは市販の核酸合成装置を用いて製造することもできる。
本発明では、ロブスターＬ２１ＤＮＡは、翻訳効率を上昇させるために用いられる。ロブスターＬ２１ＤＮＡとしては、ＡＡＣＴＣＣＴＡＡＡＡＡＡＣＣＧＣＣＡＣＣ（配列番号７）を使用することができる。
本発明のトランスファーベクター及び組換えバキュロウイルス発現ベクターでは、シグナルペプチドをコードするＤＮＡを使用する。シグナル配列とは、細胞外タンパク質が細胞内より細胞外へ分泌する時に必要とするアミノ酸配列である。本発明で用いるシグナルペプチドをコードするＤＮＡは、分泌タンパク質のＮ末端に連結しており、細胞外へのタンパク質の分泌に伴い切断除去される。このようなシグナルペプチドをコードするＤＮＡとしては、バキュロウイルス発現ベクター内で機能しうるＤＮＡであれば、特に限定されるものではない。例えば、バキュロウイルス由来のシグナルペプチドであるｇｐ６７シグナルペプチド、カイコ３０Ｋタンパク質のシグナルペプチド（Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９４９，２２４−２３２、特開２００２−３００８８６号参照）、Ｂｏｍｂｙｘｉｎ（ボンビキシン）、Ｍｅｌｉｔｔｉｎ（メリチン）等をコードする公知のＤＮＡ（特表平１１−５０５４１０号、米国特許第６，５８２，６９１号、米国特許第６，９１１，２０４号）が挙げられるが、ｇｐ６７シグナルペプチドをコードするＤＮＡが好ましい。
昆虫に感染して病気を起こすウイルスであるバキュロウイルスは、環状の二本鎖ＤＮＡを遺伝子としてもつエンベロープウイルスで、鱗翅目、膜翅目および双翅目などの昆虫に感受性を示す。バキュロウイルスの中で、感染細胞の核内に多角体（ポリヒドラ）と呼ばれる封入体を大量につくる一群のウイルスが核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）である。多角体は、分子量３１ｋＤａのポリヘドリンタンパクより構成され、感染後期に大量につくられその中に多数のウイルス粒子を埋め込んでいる。多角体はウイルスが自然界で生存するためには必須であるが、ウイルスの増殖そのものには必要ないので、多角体遺伝子の代わりに発現させたい外来遺伝子を挿入してもウイルスは全く支障なく感染し増殖する。
ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の７９番から８８３番までのアミノ酸をコードするＤＮＡを昆虫細胞に導入し、それらを効率よく発現させるためには、該ＤＮＡを昆虫細胞を宿主とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ；ＮＰＶ）などのポリヘドリンプロモーターの下流に組み込むのが好ましい。ベクターとしては、キンウワバ亜科のＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＮＰＶ（ＡｃＮＰＶ）とカイコのＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＮＰＶ（ＢｍＮＰＶ）などのウイルスが用いられる。
上記の通り、昆虫細胞を宿主細胞とするバキュロウイルスとしては、例えば、核多角体病ウイルス（ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ；ＮＰＶ）などが挙げられる。昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、ヨトウガの幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞、Ｅｓｔｉｇｍｅｎａ ａｃｒｅａ由来の細胞、またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来の細胞（例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ細胞）などが挙げられる。上記の中でも、特に、Ｓｆ９細胞やＳｆ２１細胞〔Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィトロ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ），１３，２１３−２１７，（１９７７）〕は静置培養と浮遊培養ができる。また、ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ；ＢｍＮ細胞）などの他、カイコ幼虫個体などが挙げられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞〔以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィトロ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ），１３，２１３−２１７，（１９７７）〕などが挙げられる。
バキュロウイルスの昆虫細胞への感染方法としては、ｍ．ｏ．ｉ．（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）が約０．１〜１００、望ましくは約１〜１０になるようにバキュロウィルスを昆虫細胞の培養液に添加する方法が用いられる。
本発明の組換え発現バキュロウイルスベクターの構築は、常法に従って行えばよく、例えば次の手順で行うことができる。先ず、発現させたい遺伝子であるヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の７９番から８８３番のアミノ酸をコードするＤＮＡ（なお、このＤＮＡには、好ましくはロブスターＬ２１ＤＮＡ及びｇｐ６７シグナルペプチド、ボンビキシン・シグナルペプチドもしくはメリチン・シグナルペプチドをコードするＤＮＡが連結している）をトランスファーベクターに挿入して組換えトランスファーベクターを構築する。トランスファーベクターの全体の大きさは一般的には数ｋｂ〜１０ｋｂ程度である。例えば、トランスファーベクターのうちの約３ｋｂはプラスミド由来の骨格であり、アンピシリン等の抗生物質耐性遺伝子と細菌のＤＮＡ複製開始のシグナルを含んでいてもよい。通常のトランスファーベクターではこの骨格以外に、多角体遺伝子の５’領域と３’領域をそれぞれ数ｋｂずつ含み、以下に述べるようなトランスフェクションを行った際に、この配列間で目的遺伝子と多角体遺伝子との間で相同組換えが引き起こる。また、トランスファーベクターにはタンパク質遺伝子を発現させるためのプロモーターを含むことが好ましい。プロモーターとしては、多角体遺伝子のプロモーター、ｐ１０遺伝子のプロモーター、キャプシド遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。
トランスファーベクターの種類は特に限定されないが、具体例としては、ＡｃＮＰＶ系トランスファーベクターとしては、ｐＥＶｍＸＩＶ２、ｐＡｃＳＧ１、ｐＶＬ１３９２／１３９３、ｐＡｃＭＰ２／３、ｐＡｃＪＰ１、ｐＡｃＵＷ２１、ｐＡｃＤＺ１、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＡｃＵＷ５１、ｐＡｃＡＢ３、ｐＡｃ３６０、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ、ｐＶＴ−Ｂａｃ３３、ｐＡｃＵＷ１、ｐＡｃＵＷ４２／４３、ｐＡｃＣ４などが挙げられ、ＢｍＮＰＶ系トランスファーベクターとしては、ｐＢＫ２８３、ｐＢＫ５、ｐＢＢ３０、ｐＢＥ１、ｐＢＥ２、ｐＢＫ３、ｐＢＫ５２、ｐＢＫｂｌｕｅ、ｐＢＫｂｌｕｅ２、ｐＢＦシリーズ（以上、フナコシ株式会社、藤沢薬品工業株式会社等から入手可能）などが挙げられる。
次に、組換えウイルスを作製するために、上記の組換えトランスファーベクターをウイルスと混合した後、宿主として用いる培養細胞に移入するか、あるいは予めウイルスで感染させた宿主として用いる培養細胞に上記のトランスファーベクターを移入し、組換えトランスファーベクターとウイルスゲノムＤＮＡとの間に相同組み換えを起こさせ、組み換えウイルスを構築することができる。
また、バキュロウイルスを用いたタンパク質の発現を目的として、様々なキットが市販されており、本発明においてはそれらを用いることができる。多くの系ではウイルスのゲノムＤＮＡと発現させる遺伝子をサブクローニングしたトランスファーベクターを昆虫細胞にコトランスフェクションした後、β−ｇａｌによるｂｌｕｅ／ｗｈｉｔｅ選択を行うことによりクローニングを行うものである。また、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社から市販されているＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣは、バキュロウイルスのＤＮＡへの目的タンパク質のｃＤＮＡの組換えを大腸菌の中で行わせ、昆虫細胞レベルでのクローニングを行う必要のないシステムである。１３０ｋｂのウイルスＤＮＡはＤＨ１０ＢＡＣというホストの大腸菌の中に入っており、これにトランスファーベクターであるｐＦＡＳＴＢＡＣに目的のｃＤＮＡを挿入したものを通常の大腸菌の形質転換と同様に導入し、大腸菌のｂｌｕｅ／ｗｈｉｔｅ選択により組換え体を選別できる。組換えウイルスＤＮＡは通常のアルカリミニプレップにより抽出し、細胞にトランスフェクションすることができる。トランスファーベクターであるｐＦＡＳＴＢＡＣとしては、タグなしのｐＦＡＳＴＢＡＣ１、６ｘＨＩＳタグ付きのｐＦＡＳＴＢＡＣ−ＨＴａ，ｂ，ｃ、２つのタンパクを共発現するためのｐＦＡＳＴＢＡＣ−ＤＵＡＬなどがあり、本発明においてもその目的に応じて適宜選択して使用することができる。
本発明のヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の７９番から８８３番までのアミノ酸から成るタンパク質は、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の７９番から８８３番までのアミノ酸をコードするＤＮＡを導入したバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞を、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の７９番から８８３番までのアミノ酸をコードするＤＮＡの発現が可能な条件下で培養することにより製造することができる。すなわち、上記ＤＮＡを導入したバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞を静地培養または浮遊培養することにより、該細胞にヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の７９番から８８３番までのアミノ酸配列から成るタンパク質を大量発現させることができる。
昆虫細胞を培養するための培地としては、グレース昆虫細胞用培地サプリメント入り、ＩＰＬ−４１昆虫細胞用培地、Ｓｆ−９００昆虫細胞用無血清培地、ＴＣ−１００昆虫細胞用培地（いずれもＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）などが挙げられる。またこれらの培地に約５％〜２０％の牛胎児血清、ペニシリンＧ、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンなどの抗生物質、約０．１％のプルロニックＦ−６８（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）などを添加してもよい。
培養は約２０℃から３０℃、望ましくは約２６℃から２８℃で、約１２時間から１４４時間、望ましくは約２４時間から９６時間行うことができる。シャーレやフラスコの中で静置してもよいし、スピナーフラスコを用いて約５０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍで撹拌してもよい。
上記の通り、本発明の組換えバキュロウイルス発現ベクターを、適当な宿主（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞系統Ｓｆ９およびＳｆ２１などの培養細胞、又は昆虫幼虫など）に感染させ、宿主を好適な条件下で培養してヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２を分泌発現させ、一定時間後（例えば、７２時間後等）に培養物を遠心分離等に付して培養上清を回収することにより、目的とするＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２を入手することができる。
組換えＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の培養上清からの回収及び精製は、必要に応じて、公知の分離・精製法を適宜組み合わせて行うことができる。分離、精製法の具体例としては、硫安等による塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
さらに、本発明によれば、本発明のヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２と、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２と免疫学的に反応しうる抗体とを反応させる工程によって、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２を検出することができる。好ましくは、抗体としては、配列番号２の任意の連続した１１〜１３個のアミノ酸を含む抗原ペプチドを哺乳動物または鳥類に免疫して得られたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用することができる。
本発明で用いる抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の何れでもよく、これらの抗体の作製は定法により行なうことができる。
抗体は、例えば、配列番号２の任意の連続した１１〜１３個のアミノ酸を含む抗原ペプチドまたはＫｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ等と抗原ペプチドとの複合体を用いて哺乳動物を免疫感作し、該哺乳動物から血液を採取し、採取した血液から抗体を分離・精製することにより得ることができる。本発明では、例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ラット、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ等の哺乳動物または鳥類を免疫することができる。免疫感作の方法としては、当業者に公知の通常の免疫感作の方法を用いて、例えば抗原を１回以上投与することにより行うことができる。
抗原投与は、例えば、７から３０日、特に１２から１６日間隔で２または３回投与することができる。投与量は１回につき、例えば抗原約０．０５から２ｍｇ程度を目安とすることができる。投与経路も特に限定されず、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等を適宜選択することができるが、静脈内、腹腔内もしくは皮下に注射することにより投与することが好ましい。また、抗原は適当な緩衝液、例えば完全フロイントアジュバント、ＲＡＳ〔ＭＰＬ（Ｍｏｎｏ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ Ｌｉｐｉｄ Ａ）＋ＴＤＭ（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ Ｄｉｃｏｒｙｎｏｍｙｃｏｌａｔｅ）＋ＣＷＳ（Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ Ｓｋｅｌｅｔｏｎ）アジュバントシステム〕、水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントを含有する適当な緩衝液に溶解して用いることができるが、投与経路や条件等によっては、上記したアジュバントは使用しない場合もある。ここでアジュバントとは抗原とともに投与したとき、非特異的にその抗原に対する免疫反応を増強する物質を意味する。
免疫感作した哺乳動物等を０．５から４ケ月間飼育した後、該哺乳動物等の血清を耳静脈等から少量サンプリングし、抗体価を測定することができる。抗体価が上昇してきたら、状況に応じて抗原の投与を適当回数実施する。例えば１０μｇ〜１０００μｇの抗原を用いて追加免疫を行なうことができる。最後の投与から１〜２ケ月後に免疫感作した哺乳動物から通常の方法により血液を採取して、該血液を、例えば遠心分離、硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコールを用いた沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等の通常の方法によって分離・精製することにより、ポリクローナル抗血清として、ポリクローナル抗体を得ることができる。なお抗血清は、たとえば、５６℃で３０分間処理することによって補体系を不活性化してもよい。
モノクローナル抗体の作製は、当業者に既知の方法により行うことができ、例えば、ハイブリドーマを用いた方法により行うことができる。モノクローナル抗体を産生する細胞株は特に制限されないが、例えば、抗体産生細胞とミエローマ細胞株との細胞融合によりハイブリドーマとして得ることができる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、以下のような細胞融合法によって得ることができる。
抗体産生細胞としては、免疫された動物からの脾細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球等を使用する。抗原としては、ポリクローナル抗体の場合と同様に配列番号２の任意の連続した１１〜１３個のアミノ酸を含む抗原ペプチドを使用することができる。免疫される動物としてはマウス、ラット等が使用され、これらの動物への抗原の投与は常法に従って行う。例えば完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバントなどのアジュバントと抗原（配列番号２の任意の連続した１１〜１３個のアミノ酸を含む抗原ペプチド）との懸濁液もしくは乳化液を調製し、これを動物の静脈、皮下、皮内、腹腔内等に数回投与することによって動物を免疫化する。免疫化した動物から抗体産生細胞として例えば脾細胞を取得し、これとミエローマ細胞とをそれ自体公知の方法（Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６ ４９５（１９７５））により融合することにより、ハイブリドーマを作製することができる。
細胞融合に使用するミエローマ細胞株としては、例えばマウスではＰ３Ｘ６３Ａｇ８、Ｐ３Ｕ１株、Ｓｐ２／０株などが挙げられる。細胞融合を行なうに際しては、ポリエチレングリコール、センダイウイルスなどの融合促進剤を用い、細胞融合後のハイブリドーマの選抜にはヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地を常法に従って使用することができる。細胞融合により得られたハイブリドーマは限界希釈法等によりクローニングすることができる。更に、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等によりスクリーニングを行なうことにより、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２と免疫学的に反応しうるモノクローナル抗体を産生する細胞株を得ることができる。
このようにして得られたハイブリドーマから目的とするモノクローナル抗体を製造するには、通常の細胞培養法や腹水形成法により該ハイブリドーマを培養し、培養上清あるいは腹水から該モノクローナル抗体を精製すればよい。培養上清もしくは腹水からのモノクローナル抗体の精製は、常法により行なうことができる。例えば、硫安分画、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて使用できる。
また、抗体がモノクローナル抗体の場合、該モノクローナル抗体のグロブリンタイプは特に限定されず、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ等が挙げられる。また、上記したような各種抗体の断片を使用することもできる。抗体の断片としては、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント等が挙げられる。
本発明においては、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２と、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２と免疫学的に反応しうる抗体とを反応させることによって、酵素抗体法、免疫組織染色法、免疫ブロット法、直接蛍光抗体法又は間接蛍光抗体法等の分析を行い、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２を検出することができる。これらの分析は、当業者に周知の方法で行なうことができ、その実験条件も当業者ならば適宜選択することができる。
本明細書に引用された文献中の記載は、引用によって本明細書を構成するものとする。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
本発明のＮ末側配列を除去したヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２は、配列番号２記載のアミノ酸配列において、膜貫通領域のＮ末側配列である１番から７８番までのアミノ酸を除去し、７９番から８８３番までのアミノ酸配列からなるタンパク質であることを特徴とする。本発明によって得られる、７９番から８８３番までのアミノ酸配列からなる短縮型ヒトＮＤＳＴ２は、現在までに知られている最も短い、活性を有するヒトＮＤＳＴ２ポリペプチドであり、可溶性であり、高活性であるという優れた効果を有する。なお、上記短縮型ヒトＮＤＳＴ２において、１もしくは数個（好ましくは１個から３個、より好ましくは１個から２個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入または転位した配列を有するタンパク質（このようなタンパク質を「変異型タンパク質」または「変異体」ともいう。）であって、Ｎ−デアセチラーゼ活性とＮ−スルホトランスフェラーゼ活性とを有するものは、配列番号２に記載のアミノ酸配列及び配列番号１記載の塩基配列の情報に基づいて当業者であれば本明細書の記載に基づいて適宜調製することができるので、本発明に包含される。また、「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または転位した配列を有するタンパク質」とは、換言すれば配列番号２記載の７９番から８８３番までのアミノ酸配列と高い相同性を有し、Ｎ−デアセチラーゼ活性とＮ−スルホトランスフェラーゼ活性とを有するものと言うこともできる。ここで、「高い相同性」とは、例えば７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上であり、以下順次、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％に例示されるより高いパーセンテージがより好ましい。例えば、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。
遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７，１９８２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２，９４４１，１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１，１９８５、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，８７４９，１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９，１９８２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８，１９８５、Ｇｅｎｅ，３４，３１５，１９８５、Ｇｅｎｅ，１０２，６７，１９９１等に記載の方法に準じて行うことができる。上記した方法により、配列番号１に記載の塩基配列において変異を有する塩基配列を有するＤＮＡを入手し、このＤＮＡを発現させることにより、目的タンパク質を製造することができる。
本発明のトランスファーベクターは、少なくともバキュロウイルス発現ベクター内で機能しうる、シグナルペプチド、好ましくはバキュロウイルス由来のシグナルペプチド、カイコ由来のシグナルペプチド、ミツバチ由来のシグナルペプチドをコードするＤＮＡと、その下流に連結された上記のヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２をコードするＤＮＡとを含む。また、シグナルペプチドをコードするＤＮＡの上流には、翻訳効率を上昇させ、目的タンパク質の発現効率を上昇させるために、コーディング配列の発現を促進させる機能を有する非翻訳リーダー配列を挿入することが好ましい。バキュロウイルス由来のシグナルペプチドとしてはｇｐ６７が、カイコ由来のシグナルペプチドとしてはボンビキシン・シグナルペプチドが、ミツバチ由来のシグナルペプチドとしてはメリチン・シグナルペプチドがそれぞれ例示され、該非翻訳リーダー配列としてはロブスターＬ２１ＤＮＡが例示され、かつ好ましい。なお、シグナルペプチドとしては、バキュロウイルスｇｐ６７が最も好ましい。このようなトランスファーベクターの製造方法の詳細については後述する。
本発明の組み換えバキュロウイルス発現ベクターは、少なくともバキュロウイルス由来のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ、及びヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の７９番から８８３番までのアミノ酸をコードするＤＮＡまたは該ＤＮＡにおいて１又は数個のヌクレオチドの欠失、挿入または置換を有するＤＮＡであって、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２と同等の酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡを、この順で５’から３’方向に有するＤＮＡ断片をバキュロウイルスＤＮＡへ組み込んで得られる。
本発明の組み換えバキュロウイルス発現ベクターにおいては、最大限の活性を得ることを目的として、ロブスターＬ２１配列（翻訳効率の上昇）、ｇｐ６７シグナルペプチド（分泌効率の上昇）、及びヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の７９番から８８３番までのアミノ酸配列（現在知られている酵素活性に必要な最小領域）をそれぞれ連結してバキュロウイルス発現ベクターに組み込んだものであることが最も好ましい。
本発明では、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の７９番から８８３番までのアミノ酸をコードするＤＮＡを使用する。ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２としては野生型のみならず、遺伝子操作によって作製した変異体を使用してもよい。このような変異体としては、当業者に周知の遺伝子組み換え技術によって野生型のＤＮＡ配列において１又は数個（好ましくは１から１０個、より好ましくは１から６個、さらに好ましくは１〜３個程度）のヌクレオチドの欠失、挿入または置換を有するＤＮＡあるいは野生型のＤＮＡ配列と相同性（例えば７５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性）を有するＤＮＡであって、天然に存在する野生型のヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２と同等またはそれ以上の生物学的活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の７９番から８８３番までのアミノ酸としては、具体的には、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の７９番目から８８３番目が挙げられる。また、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列をコードする塩基配列の具体例としては、配列番号：１で表わされる塩基配列が挙げられる。これらのＤＮＡは、それ自体公知の遺伝子工学的手法を用いてクローニングすることができ、あるいは市販の核酸合成装置を用いて製造することもできる。
本発明では、ロブスターＬ２１ＤＮＡは、翻訳効率を上昇させるために用いられる。ロブスターＬ２１ＤＮＡとしては、ＡＡＣＴＣＣＴＡＡＡＡＡＡＣＣＧＣＣＡＣＣ（配列番号７）を使用することができる。
本発明のトランスファーベクター及び組換えバキュロウイルス発現ベクターでは、シグナルペプチドをコードするＤＮＡを使用する。シグナル配列とは、細胞外タンパク質が細胞内より細胞外へ分泌する時に必要とするアミノ酸配列である。本発明で用いるシグナルペプチドをコードするＤＮＡは、分泌タンパク質のＮ末端に連結しており、細胞外へのタンパク質の分泌に伴い切断除去される。このようなシグナルペプチドをコードするＤＮＡとしては、バキュロウイルス発現ベクター内で機能しうるＤＮＡであれば、特に限定されるものではない。例えば、バキュロウイルス由来のシグナルペプチドであるｇｐ６７シグナルペプチド、カイコ３０Ｋタンパク質のシグナルペプチド（Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９４９，２２４−２３２、特開２００２−３００８８６号参照）、Ｂｏｍｂｙｘｉｎ（ボンビキシン）、Ｍｅｌｉｔｔｉｎ（メリチン）等をコードする公知のＤＮＡ（特表平１１−５０５４１０号、米国特許第６，５８２，６９１号、米国特許第６，９１１，２０４号）が挙げられるが、ｇｐ６７シグナルペプチドをコードするＤＮＡが好ましい。
昆虫に感染して病気を起こすウイルスであるバキュロウイルスは、環状の二本鎖ＤＮＡを遺伝子としてもつエンベロープウイルスで、鱗翅目、膜翅目および双翅目などの昆虫に感受性を示す。バキュロウイルスの中で、感染細胞の核内に多角体（ポリヒドラ）と呼ばれる封入体を大量につくる一群のウイルスが核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）である。多角体は、分子量３１ｋＤａのポリヘドリンタンパクより構成され、感染後期に大量につくられその中に多数のウイルス粒子を埋め込んでいる。多角体はウイルスが自然界で生存するためには必須であるが、ウイルスの増殖そのものには必要ないので、多角体遺伝子の代わりに発現させたい外来遺伝子を挿入してもウイルスは全く支障なく感染し増殖する。
ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の７９番から８８３番までのアミノ酸をコードするＤＮＡを昆虫細胞に導入し、それらを効率よく発現させるためには、該ＤＮＡを昆虫細胞を宿主とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ；ＮＰＶ）などのポリヘドリンプロモーターの下流に組み込むのが好ましい。ベクターとしては、キンウワバ亜科のＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＮＰＶ（ＡｃＮＰＶ）とカイコのＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＮＰＶ（ＢｍＮＰＶ）などのウイルスが用いられる。
上記の通り、昆虫細胞を宿主細胞とするバキュロウイルスとしては、例えば、核多角体病ウイルス（ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ；ＮＰＶ）などが挙げられる。昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、ヨトウガの幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞、Ｅｓｔｉｇｍｅｎａ ａｃｒｅａ由来の細胞、またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来の細胞（例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ細胞）などが挙げられる。上記の中でも、特に、Ｓｆ９細胞やＳｆ２１細胞〔Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィトロ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ），１３，２１３−２１７，（１９７７）〕は静置培養と浮遊培養ができる。また、ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ；ＢｍＮ細胞）などの他、カイコ幼虫個体などが挙げられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞〔以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィトロ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ），１３，２１３−２１７，（１９７７）〕などが挙げられる。
バキュロウイルスの昆虫細胞への感染方法としては、ｍ．ｏ．ｉ．（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）が約０．１〜１００、望ましくは約１〜１０になるようにバキュロウィルスを昆虫細胞の培養液に添加する方法が用いられる。
本発明の組換え発現バキュロウイルスベクターの構築は、常法に従って行えばよく、例えば次の手順で行うことができる。先ず、発現させたい遺伝子であるヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の７９番から８８３番のアミノ酸をコードするＤＮＡ（なお、このＤＮＡには、好ましくはロブスターＬ２１ＤＮＡ及びｇｐ６７シグナルペプチド、ボンビキシン・シグナルペプチドもしくはメリチン・シグナルペプチドをコードするＤＮＡが連結している）をトランスファーベクターに挿入して組換えトランスファーベクターを構築する。トランスファーベクターの全体の大きさは一般的には数ｋｂ〜１０ｋｂ程度である。例えば、トランスファーベクターのうちの約３ｋｂはプラスミド由来の骨格であり、アンピシリン等の抗生物質耐性遺伝子と細菌のＤＮＡ複製開始のシグナルを含んでいてもよい。通常のトランスファーベクターではこの骨格以外に、多角体遺伝子の５’領域と３’領域をそれぞれ数ｋｂずつ含み、以下に述べるようなトランスフェクションを行った際に、この配列間で目的遺伝子と多角体遺伝子との間で相同組換えが引き起こる。また、トランスファーベクターにはタンパク質遺伝子を発現させるためのプロモーターを含むことが好ましい。プロモーターとしては、多角体遺伝子のプロモーター、ｐ１０遺伝子のプロモーター、キャプシド遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。
トランスファーベクターの種類は特に限定されないが、具体例としては、ＡｃＮＰＶ系トランスファーベクターとしては、ｐＥＶｍＸＩＶ２、ｐＡｃＳＧ１、ｐＶＬ１３９２／１３９３、ｐＡｃＭＰ２／３、ｐＡｃＪＰ１、ｐＡｃＵＷ２１、ｐＡｃＤＺ１、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＡｃＵＷ５１、ｐＡｃＡＢ３、ｐＡｃ３６０、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ、ｐＶＴ−Ｂａｃ３３、ｐＡｃＵＷ１、ｐＡｃＵＷ４２／４３、ｐＡｃＣ４などが挙げられ、ＢｍＮＰＶ系トランスファーベクターとしては、ｐＢＫ２８３、ｐＢＫ５、ｐＢＢ３０、ｐＢＥ１、ｐＢＥ２、ｐＢＫ３、ｐＢＫ５２、ｐＢＫｂｌｕｅ、ｐＢＫｂｌｕｅ２、ｐＢＦシリーズ（以上、フナコシ株式会社、藤沢薬品工業株式会社等から入手可能）などが挙げられる。
次に、組換えウイルスを作製するために、上記の組換えトランスファーベクターをウイルスと混合した後、宿主として用いる培養細胞に移入するか、あるいは予めウイルスで感染させた宿主として用いる培養細胞に上記のトランスファーベクターを移入し、組換えトランスファーベクターとウイルスゲノムＤＮＡとの間に相同組み換えを起こさせ、組み換えウイルスを構築することができる。
また、バキュロウイルスを用いたタンパク質の発現を目的として、様々なキットが市販されており、本発明においてはそれらを用いることができる。多くの系ではウイルスのゲノムＤＮＡと発現させる遺伝子をサブクローニングしたトランスファーベクターを昆虫細胞にコトランスフェクションした後、β−ｇａｌによるｂｌｕｅ／ｗｈｉｔｅ選択を行うことによりクローニングを行うものである。また、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社から市販されているＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣは、バキュロウイルスのＤＮＡへの目的タンパク質のｃＤＮＡの組換えを大腸菌の中で行わせ、昆虫細胞レベルでのクローニングを行う必要のないシステムである。１３０ｋｂのウイルスＤＮＡはＤＨ１０ＢＡＣというホストの大腸菌の中に入っており、これにトランスファーベクターであるｐＦＡＳＴＢＡＣに目的のｃＤＮＡを挿入したものを通常の大腸菌の形質転換と同様に導入し、大腸菌のｂｌｕｅ／ｗｈｉｔｅ選択により組換え体を選別できる。組換えウイルスＤＮＡは通常のアルカリミニプレップにより抽出し、細胞にトランスフェクションすることができる。トランスファーベクターであるｐＦＡＳＴＢＡＣとしては、タグなしのｐＦＡＳＴＢＡＣ１、６ｘＨＩＳタグ付きのｐＦＡＳＴＢＡＣ−ＨＴａ，ｂ，ｃ、２つのタンパクを共発現するためのｐＦＡＳＴＢＡＣ−ＤＵＡＬなどがあり、本発明においてもその目的に応じて適宜選択して使用することができる。
本発明のヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の７９番から８８３番までのアミノ酸から成るタンパク質は、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の７９番から８８３番までのアミノ酸をコードするＤＮＡを導入したバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞を、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の７９番から８８３番までのアミノ酸をコードするＤＮＡの発現が可能な条件下で培養することにより製造することができる。すなわち、上記ＤＮＡを導入したバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞を静地培養または浮遊培養することにより、該細胞にヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の７９番から８８３番までのアミノ酸配列から成るタンパク質を大量発現させることができる。
昆虫細胞を培養するための培地としては、グレース昆虫細胞用培地サプリメント入り、ＩＰＬ−４１昆虫細胞用培地、Ｓｆ−９００昆虫細胞用無血清培地、ＴＣ−１００昆虫細胞用培地（いずれもＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）などが挙げられる。またこれらの培地に約５％〜２０％の牛胎児血清、ペニシリンＧ、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンなどの抗生物質、約０．１％のプルロニックＦ−６８（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）などを添加してもよい。
培養は約２０℃から３０℃、望ましくは約２６℃から２８℃で、約１２時間から１４４時間、望ましくは約２４時間から９６時間行うことができる。シャーレやフラスコの中で静置してもよいし、スピナーフラスコを用いて約５０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍで撹拌してもよい。
上記の通り、本発明の組換えバキュロウイルス発現ベクターを、適当な宿主（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞系統Ｓｆ９およびＳｆ２１などの培養細胞、又は昆虫幼虫など）に感染させ、宿主を好適な条件下で培養してヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２を分泌発現させ、一定時間後（例えば、７２時間後等）に培養物を遠心分離等に付して培養上清を回収することにより、目的とするＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２を入手することができる。
組換えＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の培養上清からの回収及び精製は、必要に応じて、公知の分離・精製法を適宜組み合わせて行うことができる。分離、精製法の具体例としては、硫安等による塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
さらに、本発明によれば、本発明のヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２と、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２と免疫学的に反応しうる抗体とを反応させる工程によって、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２を検出することができる。好ましくは、抗体としては、配列番号２の任意の連続した１１〜１３個のアミノ酸を含む抗原ペプチドを哺乳動物または鳥類に免疫して得られたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用することができる。
本発明で用いる抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の何れでもよく、これらの抗体の作製は定法により行なうことができる。
抗体は、例えば、配列番号２の任意の連続した１１〜１３個のアミノ酸を含む抗原ペプチドまたはＫｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ等と抗原ペプチドとの複合体を用いて哺乳動物を免疫感作し、該哺乳動物から血液を採取し、採取した血液から抗体を分離・精製することにより得ることができる。本発明では、例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ラット、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ等の哺乳動物または鳥類を免疫することができる。免疫感作の方法としては、当業者に公知の通常の免疫感作の方法を用いて、例えば抗原を１回以上投与することにより行うことができる。
抗原投与は、例えば、７から３０日、特に１２から１６日間隔で２または３回投与することができる。投与量は１回につき、例えば抗原約０．０５から２ｍｇ程度を目安とすることができる。投与経路も特に限定されず、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等を適宜選択することができるが、静脈内、腹腔内もしくは皮下に注射することにより投与することが好ましい。また、抗原は適当な緩衝液、例えば完全フロイントアジュバント、ＲＡＳ〔ＭＰＬ（Ｍｏｎｏ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ Ｌｉｐｉｄ Ａ）＋ＴＤＭ（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ Ｄｉｃｏｒｙｎｏｍｙｃｏｌａｔｅ）＋ＣＷＳ（Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ Ｓｋｅｌｅｔｏｎ）アジュバントシステム〕、水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントを含有する適当な緩衝液に溶解して用いることができるが、投与経路や条件等によっては、上記したアジュバントは使用しない場合もある。ここでアジュバントとは抗原とともに投与したとき、非特異的にその抗原に対する免疫反応を増強する物質を意味する。
免疫感作した哺乳動物等を０．５から４ケ月間飼育した後、該哺乳動物等の血清を耳静脈等から少量サンプリングし、抗体価を測定することができる。抗体価が上昇してきたら、状況に応じて抗原の投与を適当回数実施する。例えば１０μｇ〜１０００μｇの抗原を用いて追加免疫を行なうことができる。最後の投与から１〜２ケ月後に免疫感作した哺乳動物から通常の方法により血液を採取して、該血液を、例えば遠心分離、硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコールを用いた沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等の通常の方法によって分離・精製することにより、ポリクローナル抗血清として、ポリクローナル抗体を得ることができる。なお抗血清は、たとえば、５６℃で３０分間処理することによって補体系を不活性化してもよい。
モノクローナル抗体の作製は、当業者に既知の方法により行うことができ、例えば、ハイブリドーマを用いた方法により行うことができる。モノクローナル抗体を産生する細胞株は特に制限されないが、例えば、抗体産生細胞とミエローマ細胞株との細胞融合によりハイブリドーマとして得ることができる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、以下のような細胞融合法によって得ることができる。
抗体産生細胞としては、免疫された動物からの脾細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球等を使用する。抗原としては、ポリクローナル抗体の場合と同様に配列番号２の任意の連続した１１〜１３個のアミノ酸を含む抗原ペプチドを使用することができる。免疫される動物としてはマウス、ラット等が使用され、これらの動物への抗原の投与は常法に従って行う。例えば完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバントなどのアジュバントと抗原（配列番号２の任意の連続した１１〜１３個のアミノ酸を含む抗原ペプチド）との懸濁液もしくは乳化液を調製し、これを動物の静脈、皮下、皮内、腹腔内等に数回投与することによって動物を免疫化する。免疫化した動物から抗体産生細胞として例えば脾細胞を取得し、これとミエローマ細胞とをそれ自体公知の方法（Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６ ４９５（１９７５））により融合することにより、ハイブリドーマを作製することができる。
細胞融合に使用するミエローマ細胞株としては、例えばマウスではＰ３Ｘ６３Ａｇ８、Ｐ３Ｕ１株、Ｓｐ２／０株などが挙げられる。細胞融合を行なうに際しては、ポリエチレングリコール、センダイウイルスなどの融合促進剤を用い、細胞融合後のハイブリドーマの選抜にはヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地を常法に従って使用することができる。細胞融合により得られたハイブリドーマは限界希釈法等によりクローニングすることができる。更に、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等によりスクリーニングを行なうことにより、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２と免疫学的に反応しうるモノクローナル抗体を産生する細胞株を得ることができる。
このようにして得られたハイブリドーマから目的とするモノクローナル抗体を製造するには、通常の細胞培養法や腹水形成法により該ハイブリドーマを培養し、培養上清あるいは腹水から該モノクローナル抗体を精製すればよい。培養上清もしくは腹水からのモノクローナル抗体の精製は、常法により行なうことができる。例えば、硫安分画、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて使用できる。
また、抗体がモノクローナル抗体の場合、該モノクローナル抗体のグロブリンタイプは特に限定されず、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ等が挙げられる。また、上記したような各種抗体の断片を使用することもできる。抗体の断片としては、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント等が挙げられる。
本発明においては、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２と、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２と免疫学的に反応しうる抗体とを反応させることによって、酵素抗体法、免疫組織染色法、免疫ブロット法、直接蛍光抗体法又は間接蛍光抗体法等の分析を行い、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２を検出することができる。これらの分析は、当業者に周知の方法で行なうことができ、その実験条件も当業者ならば適宜選択することができる。
本明細書に引用された文献中の記載は、引用によって本明細書を構成するものとする。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例１：ヒトＮＤＳＴ２のクローニング
（方法）
反応系５０μｌ中に、ヒト成人胎盤ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）５μ１、５’−ＣＣＡＴＧＣＴＣＣＡＧＴＴＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＴＡＣ−３’（配列番号３）の配列を有する短鎖ＤＮＡ５ｐｍｏｌと５’−ＧＣＡＴＴＴＴＧＣＴＧＧＴＡＴＧＧＧＡＧＧＣＴＧＧ−３’（配列番号４）の配列を有する短鎖ＤＮＡ５ｐｍｏｌ、ＰｆｕＴｕｒｂｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）２．５ｕｎｉｔｓによるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（登録商標）、０．１ｍｇ／ｍｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、２００μＭ ｄＮＴＰ（２’−デオキシリボヌクレオシド ５’−トリリン酸／ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの等モル混合）存在下、サーマルサイクラーを用いて、９４℃１分を１サイクル、９４℃１分−５５℃１分−７２℃６分を３０サイクル、７２℃１０分を１サイクル行わせ、ヒトＮＤＳＴ２（ＮＣＢＩ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＯ登録番号＃３６００１）のヌクレオチド番号２６から２７０８までの領域の特異的増幅を行った。反応産物をＴｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）アガロース電気泳動に供し、目的の２６８３ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を切り出し、ＧｅｎｅｃｌｅａｎＩＩｋｉｔ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて精製し、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）（ＴＥ緩衝液）１０μｌ中に回収した。１０μｌの反応系を用いて、回収したＤＮＡ４μｌをプラスミドＤＮＡ、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）１０ｎｇにＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のプロトコールに従い、ライゲーションした。反応液２μｌを用いて、常法により大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ Ｋａｎコンピテントセル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）４０μｌを形質転換し、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む１．５％寒天含有ＬＢ培地上で、形質転換体のコロニーを選択した。得られた大腸菌のコロニーを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地１．５ｍｌに接種し、３７℃２０時間の振盪培養を行った。得られた培養液を遠心後、大腸菌菌体より、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて、大腸菌が保持するプラスミドＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）１００μｌに回収した。ベクターＤＮＡに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を常法によりヒトＮＤＳＴ２に特異的な短鎖ＤＮＡを用いて確認した。
（結果）
上記の通り、ヒトＮＤＳＴ２のヌクレオチド番号２６から２７０８までの領域の特異的増幅の結果得られた２６８３ｂｐの大きさのＤＮＡ断片をｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）にライゲーション後、大腸菌を形質転換させ、薬剤耐性コロニーの選択を行った。得られた大腸菌のコロニー１２個からプラスミドＤＮＡを回収し、目的の２６８３ｂｐを保持するクローン、ｐＣＲｈＮＤＳＴ２＃５及びｐＣＲｈＮＤＳＴ２＃７を同定した。ベクターＤＮＡに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の解析を常法によりヒトＮＤＳＴ２に特異的な短鎖ＤＮＡを用いて行い、登録されているヒトＮＤＳＴ２（ＮＣＢＩ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＯ登録番号＃３６００１）の塩基配列と完全に一致していることを確認した。
実施例２：ロブスターＬ２１配列とｇｐ６７シグナルペプチドのＤＮＡの調製
２５μｌの反応系で、バキュロウイルスｇｐ６７シグナルペプチドを保持するベクターＤＮＡ、ｐＡｃＳｅｃＧ２Ｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）２５０ｎｇを鋳型に５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＣＴＣＣＴＡＡＡＡＡＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴＡＧＴＡＡＡＴＣＡＧ−３’（配列番号５）の配列を有する短鎖ＤＮＡ５ｐｍｏｌと５’−ＣＡＣＧＧＧＴＴＣＡＧＴＴＣＧＡＧＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣＡＡＡＧＧＣＡＧＡＡＴＧＣＧＣＣＧＣ−３’（配列番号６）の配列を有する短鎖ＤＮＡ５ｐｍｏｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（Ｔａｋａｒａ社、日本）１．２５ｕｎｉｔｓによるＰＣＲを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．００１％ＢＳＡ、２００μＭ ｄＮＴＰ存在下、サーマルサイクラーを用いて、９５℃２分を１サイクル、９５℃３０秒−５２．５℃３０秒−７２℃１分を１０サイクル、７２℃１０分を１サイクル行わせ、ロブスターＬ２１配列（ＡＡＣＴＣＣＴＡＡＡＡＡＡＣＣＧＣＣＡＣＣ）（配列番号７）とｇｐ６７シグナルペプチド３８アミノ酸をコードするＤＮＡの特異的増幅を行った。
実施例３：ヒトＮＤＳＴ２の７９番から８８３番までをコードするＤＮＡの調製
２５μｌの反応系で、ベクター中にヒトＮＤＳＴ２を保持するプラスミドＤＮＡ ｐＣＲｈＮＤＳＴ２＃５ ２５０ｎｇを鋳型に５’−ＧＡＧＡＣＡＧＣＴＣＧＡＡＣＴＧＡＡＣＣＣＧＴＧＧ−３’（配列番号８）の配列を有する短鎖ＤＮＡ ５ｐｍｏｌと５’−ＣＴＧＧＴＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＴＧＴＣＡＧＣＣＣＡＧＡＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣ−３’（配列番号９）の配列を有する短鎖ＤＮＡ ５ｐｍｏｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（Ｔａｋａｒａ社、日本）１．２５ｕｎｉｔｓによるＰＣＲを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ ＫＣｌ，６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．００１％ＢＳＡ、２００μＭ ｄＮＴＰ存在下、サーマルサイクラーを用いて、９５℃２分を１サイクル、９５℃３０秒−５２．５℃３０秒−７２℃５分を２０サイクル、７２℃１０分を１サイクル行わせ、ヒトＮＤＳＴ２の８０５アミノ酸（７９番から８８３番まで）をコードするＤＮＡの特異的増幅を行った。
実施例４：ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡの調製
２５μｌの反応系で、実施例２で得られた反応液２μｌと実施例３で得られた反応液０．５μｌ中のＤＮＡを鋳型に５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＣＴＣＣＴＡＡＡＡＡＡＣＣＧＣＣＡＣ−３’（配列番号１０）の配列を有する短鎖ＤＮＡ５ｐｍｏｌと５’−ＣＴＧＧＴＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＴＧＴＣＡＧＣＣＣＡＧＡＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣ−３’（配列番号１１）の配列を有する短鎖ＤＮＡ５ｐｍｏｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（Ｔａｋａｒａ社、日本）１．２５ｕｎｉｔｓによるＰＣＲを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．００１％ＢＳＡ、２００μＭ ｄＮＴＰ存在下、サーマルサイクラーを用いて、９５℃２分を１サイクル、９５℃３０秒−５２．５℃３０秒−７２℃６分を３０サイクル、７２℃１０分を１サイクル行わせ、ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチド３８アミノ酸とヒトＮＤＳＴ２ ８０５アミノ酸をコードする融合ＤＮＡの特異的増幅を行った。
実施例５：ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡのベクターＤＮＡへの組み込み
（方法）
実施例４で得られた融合ＤＮＡを含む反応液１０μｌ及びベクターＤＮＡ、ｐＦａｓｔＢａｃ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）１μｇに制限酵素ＢａｍＨＩとＮｏｔＩを１０ｕｎｉｔｓずつ加え、３７℃で２時間反応させた。反応産物を実施例１に示した方法に従い、ＴＡＥアガロース電気泳動に供し、目的の大きさのＤＮＡ断片をＧｅｎｅｃｌｅａｎ ＩＩ ｋｉｔを用いて精製し、ＴＥ緩衝液１０μｌ中に回収した。得られたＤＮＡ１μｌずつを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ社、日本）を用いた４℃、２０時間、１０μｌの反応系で、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで同時に消化したｐＦａｓｔＢａｃ−１に、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで同時に消化したロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチド３８アミノ酸とヒトＮＤＳＴ２ ８０５アミノ酸をコードする融合ＤＮＡをライゲーションした。反応液２μｌを用いて、常法により大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）４０μｌを形質転換し、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む１．５％寒天含有ＬＢ培地上で、形質転換体のコロニーを選択した。得られた大腸菌のコロニーから実施例１に示した方法に従い、大腸菌が保持するプラスミドＤＮＡを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）１００μｌに回収した。ベクターＤＮＡに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の解析を常法によりヒトＮＤＳＴ２に特異的な短鎖ＤＮＡを用いて行った。
（結果）
ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチド３８アミノ酸とヒトＮＤＳＴ２ ８０５アミノ酸をコードする融合ＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化した断片２５７７ｂｐとＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化したｐＦａｓｔＢａｃ−１のライゲーション産物で形質転換した大腸菌１２８クローンより目的のＤＮＡ断片を保持すると考えられる２クローン（ｐＦＢ１−ＧＰ６７ｈＮＤＳＴ２ＳＯＬ（７９Ｅ）＃５及びｐＦＢ１−ＧＰ６７ｈＮＤＳＴ２ＳＯＬ（７９Ｅ）＃１２３）を同定した。ＤＮＡの塩基配列解析を行い、前記２クローンが予想されるＤＮＡの塩基配列と完全に一致することを確認した。
実施例６：ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡのバキュロウイルスゲノムＤＮＡへの組み込み
（方法）
実施例５で得られたＤＮＡを大腸菌ＤＨ１０ＢＡＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）に導入し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のプロトコールに従い、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、７μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む１．５％寒天含有ＬＢ培地上で、形質転換体のコロニーを選択した。
得られた大腸菌のコロニーを５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＴｅｒｉｆｉｃ−Ｂｒｏｔｈ培地（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）１．５ｍｌに接種し、３７℃で２０時間の振盪培養を行った。得られた培養液を容量１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した後、冷却遠心機を用いて、４℃にて８０００回転で、２分間遠心して大腸菌菌体を沈澱として回収した。この菌体を１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１５０μｌに懸濁したのち、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む２００ｍＭ ＮａＯＨ１５０μｌを加え、緩やかに混和し室温で５分間静置した。次に、３．０Ｍ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ５．５）１５０μｌを加え、良く混和した後、冷却遠心機を用いて、４℃にて１５０００回転で、１０分間遠心して上清画分を回収した。上清４５０μｌにあらかじめＴＥ緩衝液で飽和されているフェノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）４５０μｌを加えて、ボルテックスミキサーにより激しく混和した後、冷却遠心機を用いて、４℃にて、１５０００回転で、５分間遠心して上層画分を回収した。上層画分４００μｌにエタノール１ｍｌを加え混和した後、室温で１０分間静置した。その後、冷却遠心機を用いて、４℃にて、１５０００回転で、５分間遠心して上清を除去した後、沈澱に７０％（ｖ／ｖ）エタノール１ｍｌを加え混和した後、冷却遠心機を用いて、４℃にて１５０００回転で、５分間遠心して上清を除去した。残った沈澱に、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１５０μｌを加え、懸濁したのち、３７℃で２０分間反応させた。次に、あらかじめＴＥ緩衝液で飽和されているフェノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）１００μｌを加えて、ボルテックスミキサーにより激しく混和した後、冷却遠心機を用いて、４℃にて１５０００回転で、５分間遠心して上層画分を回収した。上層画分１００μｌにエタノール２５０μｌと３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）１０μｌを加え混和した後、冷却遠心機を用いて、４℃にて、１５０００回転で、５分間遠心して上清を除去した。次に、沈澱に７０％（ｖ／ｖ）エタノール１ｍｌを加え混和した後、冷却遠心機を用いて、４℃にて１５０００回転で、５分間遠心して上清を除去した。残った沈澱に、ＴＥ緩衝液１００μｌを加え、懸濁した。
（結果）
実施例５で得られたＤＮＡ ｐＦＢ１−ＧＰ６７ｈＮＤＳＴ２ＳＯＬ（７９Ｅ）＃１２３を大腸菌ＤＨ１０ＢＡＣに導入し、薬剤耐性及びＰＣＲ法を指標に目的のクローン（ｐＦＢ１−ＧＰ６７ｈＮＤＳＴ２ＳＯＬ（７９Ｅ）＃１２３−４）を得た。
実施例７：ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡを組み込んだバキュロウイルスゲノムＤＮＡのヨトウガ細胞への導入
まず、ヨトウガＳｆ９細胞１００万個をＳＦ−９００ＩＩ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）２ｍｌに懸濁した後、６ｗｅｌｌのプレートに移し、２８℃で１時間静置し、細胞をプレートに接着させた。次に、実施例６で得られたＤＮＡ（バキュロウイルスゲノムＤＮＡに組み込まれたロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとヒトＮＤＳＴ２）１０μｇをＳｆ−９００ＩＩ無血清培地１００μｌに希釈したものと、ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）６μｌをＳｆ−９００ＩＩ無血清培地１００μｌに希釈したものを混和し、室温で３０分間静置した。あらかじめプレートに接着させたＳｆ９細胞をＳｆ−９００ＩＩ無血清培地２ｍｌで洗浄した後、ＤＮＡとｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎの混和液２００μｌにＳｆ−９００ＩＩ無血清培地８００μｌを混ぜたものを加えた。２８℃で５時間静置した後、培地を吸引除去して、新しいＳｆ−９００ＩＩ無血清培地２ｍｌを加えて、さらに２８℃で３日間培養したのち、培養上清を回収し、バキュロウイルスのストック液とした。
実施例８：ウイルスの増幅
１０００万個のＳｆ９細胞をＳＦ−９００ＩＩ無血清培地１０ｍｌに懸濁した後、Ｔ−７５フラスコにまき、１時間静置した。培地２ｍｌを残して吸引除去し、実施例７で得られたバキュロウイルスのストック液１ｍｌを添加、１時間ゆるやかに震盪させた。その後、ＳＦ−９００ＩＩ無血清培地８ｍｌを加え、２８℃で３日間培養した。回収した培地を遠心して、細胞を除いた画分をウイルス増幅液とした。
実施例９：ヒトＮＤＳＴ２のヨトウガ細胞における分泌発現
１０００万個のＳｆ９またはＳｆ２１細胞をＳＦ−９００ＩＩ無血清培地あるいは１０％血清含有Ｇｒａｃｅ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０ｍｌに懸濁した後、Ｔ−７５フラスコにまき、１時間静置した。培地２ｍｌを残して（あるいは全て）吸引除去し、実施例７で得られたバキュロウイルスのストック液あるいは実施例８で得られたウイルス増幅液１ｍｌ（あるいは３ｍｌ）を添加、１時間ゆるやかに震盪させた。その後、ＳＦ−９００ＩＩ無血清培地あるいは１０％血清添加 Ｇｒａｃｅ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）８ｍｌを加え、２８℃で３日間培養した。
実施例１０：培養上清の濃縮
回収した培地を遠心して、細胞を除いた画分を培養上清とした。培養上清をアミコンＵｌｔｒａ−１５ ３００００ＭＷＣＯ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）にかけ、冷却遠心機を用いた遠心により分子量３万以上の画分を回収し、濃縮培養上清とした。
より詳細には、ウイルスストック液をＳｆ９（無血清培地）、Ｓｆ９（血清含有培地）、Ｓｆ２１（血清含有培地）に感染させ、感染後得られた培養上清を、アミコンＵｌｔｒａ−１５ ３００００ＭＷＣＯにより、２０．４倍、２０．０倍、１６．４倍に濃縮した。また、コントロールとして挿入ＤＮＡ断片を保持しないｐＦａｓｔＢａｃ−１に由来するウイルスストック液をそれぞれの細胞に感染させ、１５．２倍、２１．７倍、１６．７倍に濃縮した培養上清を得た。
比較例１：ヒトＮＤＳＴ２のプロテインＡ含有ベクターへの組み込み
２５μｌの反応系で、ベクター中にヒトＮＤＳＴ２を保持するプラスミドＤＮＡ ｐＣＲｈＮＤＳＴ２＃５ ２５０ｎｇを鋳型に５’−ＣＡＣＧＡＡＴＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＴＧＣＣ−３’（配列番号１２）の配列を有する短鎖ＤＮＡ５ｐｍｏｌと５’−ＣＴＧＧＴＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＴＧＴＣＡＧＣＣＣＡＧＡＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣ−３’（配列番号１３）の配列を有する短鎖ＤＮＡ５ｐｍｏｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（Ｔａｋａｒａ社、日本）１．２５ｕｎｉｔｓによるＰＣＲを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．００１％ＢＳＡ、２００μＭ ｄＮＴＰ存在下、サーマルサイクラーを用いて、９５℃２分を１サイクル、９５℃３０秒−５２．５℃３０秒−７２℃５分を２５サイクル、７２℃１０分を１サイクル行わせ、ヒトＮＤＳＴ２の（４３番から８８３番までの）８４１アミノ酸をコードするＤＮＡの調製を行った。得られたＤＮＡを含む反応液１０μｌに制限酵素ＥｃｏＲＩとＭｕｎＩを１０ｕｎｉｔｓずつ加え、３７℃で２時間反応させた。またベクターＤＮＡ、ｐＲＫ５Ｆ１０ＰＲＯＴＡ１μｇに制限酵素ＥｃｏＲＩを１０ｕｎｉｔｓ加え、３７℃で２時間反応させたのちに、牛腸由来のＡｌｋａｌｉｎｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを１．４ｕｎｉｔｓを加え、３７℃で３０分間脱リン酸化反応を行った。反応産物を実施例１に示した方法に従い、ＴＡＥアガロース電気泳動に供し、目的の大きさのＤＮＡ断片をＧｅｎｅｃｌｅａｎＩＩ ｋｉｔを用いて精製し、ＴＥ緩衝液１０μｌ中に回収した。得られたＤＮＡ１μｌずつを用いて、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（ＴＡＫＡＲＡ社、日本）を用いて、４℃２０時間でＥｃｏＲＩ消化後、脱リン酸化されたｐＲＫ５Ｆ１０ＰＲＯＴＡに、ＥｃｏＲＩとＭｕｎＩで同時に消化したヒトＮＤＳＴ２の（４３番から８８３番までの）８４１アミノ酸をコードするＤＮＡを挿入した。反応産物を常法に従い、大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）に形質転換し、アンピシリン耐性コロニーを選択したのち、振盪培養で得られた大腸菌菌体より、プラスミド溶液を回収した。ベクターＤＮＡに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の解析を常法によりヒトＮＤＳＴ２に特異的な短鎖ＤＮＡを用いて行った。
比較例２：ヒトＮＤＳＴ２のサル細胞ＣＯＳ−７における分泌発現
１００万個のサルＣＯＳ−７細胞を１０％非働化牛胎児血清、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンを含むＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ）培地（血清含有ＤＭＥＭ培地）１２ｍｌに懸濁した後、１０ｃｍの培養ディッシュに移し、５％ＣＯ２存在下３７℃で２４時間培養した。
次に、比較例１で得られたＤＮＡ４μｇをＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ）培地３００μｌに希釈したものに、Ｐｏｌｙｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）２５μｌを混和し、室温で１０分間静置した。ＣＯＳ−７細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）（日水製薬株式会社、日本）１２ｍｌで洗浄し、除去した後、ＤＮＡとＰｏｌｙｆｅｃｔの混和液３２５μｌに血清含有ＤＭＥＭ培地１１ｍｌを混ぜたものを加え、５％ＣＯ２存在下３７℃で７２時間培養した。培養終了後、培養液を１５ｍｌのポリプロピレン製コニカル・チューブ３５−２１９６（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）に移したのち、冷却遠心機を用いて、９５００回転で１０分間遠心した後、培養上清１０ｍｌを新しい１５ｍｌのコニカル・チューブに移した。そこへ、ＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｓｗｅｄｅｎ）１００μｌを加え、小型回転攪拌機ＲＴ−５（タイテック社、日本）により、４℃で１６時間の回転攪拌を行った。攪拌終了後、冷却遠心機を用いて、２４００回転で５分間の遠心をした後、上清をピペットにより除去した。沈澱しているＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに、２０％グリセロールを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）１０ｍｌを加え、小型回転攪拌機により、４℃で５分間の回転攪拌を行った。攪拌終了後、冷却遠心機を用いて、２４００回転で５分間の遠心をした後、上清をピペットにより除去した。そこへ、２０％グリセロールを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）１０ｍｌを加え、小型回転攪拌機により、４℃で５分間の回転攪拌を行った。
攪拌終了後、冷却遠心機を用いて、２４００回転で５分間の遠心をした後、上清をピペットにより除去し、最終的にＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを２０％グリセロールを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）１００μｌに懸濁した。
実施例１０：酵素活性の測定
実施例９で得られた濃縮培養上清と比較例２で得られたＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ懸濁液の酵素活性を以下の方法で検出した。
脱Ｎ−アセチル化酵素活性：濃縮培養上清１０μｌあるいはＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ懸濁液１０μｌをあらかじめ準備してあるトリチウム化Ｎ−アセチルヘパロザン（２６００００ｃｐｍ）と５０ｍＭ ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）（ｐＨ６．５）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００存在下、５０μｌの反応系で３７℃で１時間反応させた。０．２Ｎ塩酸２５μｌ、０．１Ｎ酢酸５０μｌ、水５０μｌの混合液を加えて反応を停止させた後、酢酸エチル２５０μｌを使った抽出を３回行い、反応産物である「トリチウム」酢酸を回収した。
Ｎ−硫酸転移酵素活性：濃縮培養上清１０μｌあるいはＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ懸濁液１０μｌを脱Ｎ−硫酸化ヘパリン（Ｓｉｇｍａ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）２５μｇと２．５ｎｍｏｌ ３５Ｓ−ＰＡＰＳ（３’−ｐｈｏｓｐｈｏａｄｅｎｙｌｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）（１１００００ｃｐｍ）を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ‘−２−エタンスルホン酸）（ｐＨ７．２）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００存在下、５０μｌの反応系で３７℃１時間反応させた。１００ｍＭ ＥＤＴＡ９５０μｌを加えて反応を停止させた。次に、カラムに充填後、あらかじめ２５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）２．５ｍｌで平衡化してあるＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｓｗｅｄｅｎ）０．５ｍｌ（ベッドボリューム）に前記サンプルを供し、同カラムを２５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）１４ｍｌで洗浄後、１Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）２ｍｌで３５Ｓ−硫酸が転移したヘパリンを溶出した。
上記の方法により酵素活性の検出を行った。コントロールとしてｐＦａｓｔＢａｃ−１に由来するウイルス由来の培養上清の活性を差分し、培養上清１ｍｌ当たりの活性を算出した。結果を以下の表１に示す。表１に示す結果より本発明の発現系を用いることにより目的の酵素を大量に製造できることが分かる。
実施例１１：ヒトＮＤＳＴ２の７９番から８８３番までをコードし、Ｃ末端に６ｘＨＩＳタグがついたＤＮＡの調製
２５μｌの反応系で、ベクター中にヒトＮＤＳＴ２を保持するプラスミドＤＮＡ ｐＣＲｈＮＤＳＴ２＃５ ２５０ｎｇを鋳型に５’−ＧＡＧＡＣＡＧＣＴＣＧＡＡＣＴＧＡＡＣＣＣＧＴＧＧ−３’（配列番号８）の配列を有する短鎖ＤＮＡ ５ｐｍｏｌと５’−ＧＡＡＧＣＡＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＴＧＣＴＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＣＣＡＧＡＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣＴＴＣ−３’（配列番号１４）の配列を有する短鎖ＤＮＡ ５ｐｍｏｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（Ｔａｋａｒａ社、日本）１．２５ｕｎｉｔｓによるＰＣＲを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ ＫＣｌ，６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．００１％ＢＳＡ、２００μＭ ｄＮＴＰ存在下、サーマルサイクラーを用いて、９５℃２分を１サイクル、９５℃３０秒−５２．５℃３０秒−７２℃５分を２０サイクル、７２℃１０分を１サイクル行わせ、ヒトＮＤＳＴ２の８０５アミノ酸（７９番から８８３番まで）をコードするＤＮＡの特異的増幅を行った。
実施例１２：ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとＣ末端に６ｘＨＩＳタグがついたヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡの調製
２５μｌの反応系で、実施例３で得られた反応液２ｕｌと実施例１１で得られた反応液０．５μｌ中のＤＮＡを鋳型に５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＣＴＣＣＴＡＡＡＡＡＡＣＣＧＣＣＡＣ−３’（配列番号１０）の配列を有する短鎖ＤＮＡ５ｐｍｏｌと
５’−ＧＡＡＧＣＡＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＴＧＣＴＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＣＣＡＧＡＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣＴＴＣ−３’（配列番号１４）の配列を有する短鎖ＤＮＡ５ｐｍｏｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（Ｔａｋａｒａ社、日本）１．２５ｕｎｉｔｓによるＰＣＲを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．００１％ＢＳＡ、２００μＭ ｄＮＴＰ存在下、サーマルサイクラーを用いて、９５℃２分を１サイクル、９５℃３０秒−５２．５℃３０秒−７２℃６分を３０サイクル、７２℃１０分を１サイクル行わせ、ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチド３８アミノ酸とＣ末端に６ｘＨＩＳタグがついたヒトＮＤＳＴ２ ８０５アミノ酸をコードする融合ＤＮＡの特異的増幅を行った。
実施例１３：ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとＣ末端に６ｘＨＩＳタグがついたヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡのベクターＤＮＡへの組み込み
（方法）
実施例１２で得られた融合ＤＮＡを含む反応液１０μｌ及びベクターＤＮＡ、ｐＦａｓｔＢａｃ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）１μｇに制限酵素ＢａｍＨＩとＮｏｔＩを１０ｕｎｉｔｓずつ加え、３７℃で２時間反応させた。反応産物を実施例１に示した方法に従い、ＴＡＥアガロース電気泳動に供し、目的の大きさのＤＮＡ断片をＧｅｎｅｃｌｅａｎ ＩＩ ｋｉｔを用いて精製し、ＴＥ緩衝液１０μｌ中に回収した。得られたＤＮＡ１μｌずつを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ社、日本）を用いた４℃、２０時間、１０μｌの反応系で、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで同時に消化したｐＦａｓｔＢａｃ−１に、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで同時に消化したロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチド３８アミノ酸とＣ末に６ｘＨＩＳタグがついたヒトＮＤＳＴ２ ８０５アミノ酸をコードする融合ＤＮＡをライゲーションした。反応液２μｌを用いて、常法により大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）４０μｌを形質転換し、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む１．５％寒天含有ＬＢ培地上で、形質転換体のコロニーを選択した。得られた大腸菌のコロニーから実施例１に示した方法に従い、大腸菌が保持するプラスミドＤＮＡを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）１００μｌに回収した。ベクターＤＮＡに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の解析を常法によりヒトＮＤＳＴ２に特異的な短鎖ＤＮＡを用いて行った。
（結果）
ライゲーション産物で形質転換した大腸菌のうち、目的のＤＮＡ断片を保持すると考えられるクローンを同定し、そのＤＮＡの塩基配列の確認を行った。
実施例１４：ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとＣ末端に６ｘＨＩＳタグがついたヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡのバキュロウイルスゲノムＤＮＡへの組み込み
（方法）
実施例１３で得られたＤＮＡを大腸菌ＤＨ１０ＢＡＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）に導入し、実施例６に示した方法によりＤＮＡを回収した。
（結果）
実施例１３で得られたＤＮＡより目的のクローン（ｐＧＰ６７ｓｐ−ｈＮＤＳＴ２（７９Ｅ）１２３ＨＩＳ−ＦＢ１／１０Ｂ＃２）を得た。
実施例１５：ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとＣ末に６ｘＨＩＳタグがついたヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡを組み込んだバキュロウイルスゲノムＤＮＡのヨトウガ細胞への導入
実施例１４で得られたＤＮＡ（バキュロウイルスゲノムＤＮＡに組み込まれたロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとＣ末に６ｘＨＩＳタグがついたヒトＮＤＳＴ２）を用いて、実施例７に示した方法に従い、バキュロウイルスのストック液とした。
実施例１６：ロブスターＬ２１配列とミツバチメリチンシグナルペプチドのＤＮＡの調製
２５μｌの反応系で、ミツバチメリチンシグナルペプチドを保持するベクターＤＮＡ、ｐＭｅｌＢａｃ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）２５０ｎｇを鋳型に５’−ＡＡＣＴＣＣＴＡＡＡＡＡＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＣＡＡＣＧＴＴＧ−３’（配列番号１５）の配列を有する短鎖ＤＮＡ ５ｐｍｏｌと５’−ＣＡＣＧＧＧＴＴＣＡＧＴＴＣＧＡＧＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣＡＴＡＧＡＴＧＴＡＡＧＡＡＡＴＧＴＡＴＡＣ−３’（配列番号１６）の配列を有する短鎖ＤＮＡ ５ｐｍｏｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（Ｔａｋａｒａ社、日本）１．２５ｕｎｉｔｓによるＰＣＲを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．００１％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、２００μＭ ｄＮＴＰ存在下、サーマルサイクラーを用いて、９５℃、２分を１サイクル、９５℃、３０秒→５２．５℃、３０秒→７２℃、１分を１０サイクル、７２℃、１０分を１サイクル行わせ、ロブスターＬ２１配列（ＡＡＣＴＣＣＴＡＡＡＡＡＡＣＣＧＣＣＡＣＣ）（配列番号７）とメリチンシグナルペプチド２１アミノ酸をコードするＤＮＡの特異的増幅を行った。
実施例１７：ロブスターＬ２１配列、メリチンシグナルペプチドとヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡの調製
２５μｌの反応系で、実施例１６で得られた反応液２ｕｌと実施例３で得られた反応液０．５ｕｌ中のＤＮＡを鋳型に実施例４に示した方法により、ロブスターＬ２１配列、メリチンシグナルペプチド２１アミノ酸とヒトＮＤＳＴ２ ８０５アミノ酸をコードする融合ＤＮＡの特異的増幅を行った。
実施例１８：ロブスターＬ２１配列、メリチンシグナルペプチドとヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡのベクターＤＮＡへの組み込み
（方法）
実施例１７で得られた融合ＤＮＡを用いて、実施例５に示した方法によりプラスミドＤＮＡを回収した。
（結果）
ライゲーション産物で形質転換した大腸菌のうち、目的のＤＮＡ断片を保持すると考えられるクローンを同定し、そのＤＮＡの塩基配列の確認を行った。
実施例１９：ロブスターＬ２１配列、メリチンシグナルペプチドとヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡのバキュロウイルスゲノムＤＮＡへの組み込み
（方法）
実施例１８で得られたＤＮＡを大腸菌ＤＨ１０ＢＡＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）に導入し、実施例６に示した方法によりＤＮＡを回収した。
実施例２０：ロブスターＬ２１配列、メリチンシグナルペブチドとヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡを組み込んだバキュロウイルスゲノムＤＮＡのヨトウガ細胞への導入
実施例１９で得られたＤＮＡ（バキュロウイルスゲノムＤＮＡに組み込まれたロブスターＬ２１配列、メリチンシグナルペプチドとヒトＮＤＳＴ２）を用いて、実施例７に示した方法に従い、バキュロウイルスのストック液とした。
実施例２１：抗ヒトＮＤＳＴ２抗体を含む血清の取得
ヒトＮＤＳＴ２のアミノ酸８２８番から８４０番までの配列（ＬＧＲＳＫＧＲＲＹＰＤＭＤ）（配列番号１７）及び８７３番から８８３番までの配列（ＬＲＥＥＬＱＨＳＳＬＧ）（配列番号１８）のアミノ末端にそれぞれシステイン残基を付加したペプチド１（ＣＬＧＲＳＫＧＲＲＹＰＤＭＤ）（配列番号１９）及びペプチド２（ＣＬＲＥＥＬＱＨＳＳＬＧ）（配列番号２０）をＦｍｏｃ法により市販のペプチド合成機を用いて合成した。得られたペプチドそれぞれ５ｍｇを１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）４．５ｍｌに懸濁した後、ｍ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒを使用して、ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）０．５ｍｌと４℃一晩回転攪拌により、共有結合させた。公知の方法により、得られたＫＬＨ−ペプチド複合体をウサギに免疫後、血清画分を得た。
実施例２２：ヒトＮＤＳＴ２のペプチド固定化カラムの作成とそれを用いた抗ヒトＮＤＳＴ２精製抗体の取得
（方法）
ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解したペプチド１及び２をそれぞれ、Ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に同製品の実験手順に従って固定化し、ペプチド固定化樹脂とする。ペプチド固定化樹脂０．４ｍｌをＴＢＳで平衡化した後、クロマトカラム容器に充填し、それぞれのペプチドで免疫したウサギより得られた血清１０ｍｌと混和し、４℃で一晩回転攪拌した。クロマトカラム容器を垂直に固定後、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍｌ、１Ｍ ＮａＣｌ及び１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）２０ｍｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）２０ｍｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ １０ｍｌで順次洗浄後、０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）１ｍｌで溶出させた。溶出された画分に１Ｍ Ｔｒｉｓ ５０μｌを加え中和し、抗ヒトＮＤＳＴ２精製抗体の溶液とした。
（結果）
ＫＬＨ−ペプチド１複合体で免疫したウサギ血清画分を、ペプチド１固定化カラムにかけ、溶出画分として、抗ｈＮＤＳＴ２＃１を得た。同様にＫＬＨ−ペプチド２複合体で免疫したウサギ血清画分より、抗ｈＮＤＳＴ２＃２を得た。
実施例２３：精製抗ヒトＮＤＳＴ２抗体を用いたヨトウガ細胞中のヒトＮＤＳＴ２の検出
培養上清とその１／４容の５ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを混ぜ、１００℃５分処理後、５％ポリアクリルアミド電気泳動に供した。泳動後、公知の方法により、ポリアクリルアミドゲル中の蛋白質をＰＶＤＦ膜に転写した。転写された膜は膜洗浄液（１％スキムミルク及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝液）１００ｍｌ中で１時間振盪した。膜を抗ヒトＮＤＳＴ２精製抗体＃１ １２．６μｇあるいは＃２ １６．６μｇが溶解した膜洗浄液５ｍｌ中で１時間振盪した。膜は膜洗浄液１００ｍｌにて１０分間３回洗浄した。膜をＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ結合型ヒツジ抗ウサギ抗体０．４μｇが溶解した膜洗浄液５ｍｌ中で１時間振盪した。膜は膜洗浄液１００ｍｌにて１０分間３回洗浄した。膜を蛍光発色試薬（例えば、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｐｉｅｒｃｅ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）とインキュベーション後、蛍光をＸ線フィルムにて検出した。
上記の方法により、ウイルスのストック液を含む培養上清中でのｈＮＤＳＴ２の検出を行った。まず、ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡのベクターに由来するウイルス増幅液約３ｍｌを感染させたＳｆ２１細胞（血清含有培地）の培養上清１μｌ（レーン２）中でのｈＮＤＳＴ２の検出を行った。コントロールとして、ｐＦａｓｔＢａｃ−１に由来する培養上清１μｌ（レーン１）を用いた。抗ｈＮＤＳＴ２＃１を用いた結果を以下の図１（Ａ）に、抗ｈＮＤＳＴ２＃２を用いた結果を以下の図１（Ｂ）に示す。図１に示す結果により、抗ｈＮＤＳＴ２＃１を用いても抗ｈＮＤＳＴ２＃２を用いても、培養上清中の目的の酵素が検出できることが分かった。次に、ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとＣ末に６ｘＨＩＳタグがついたヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡのベクターに由来するウイルスストック液１４μｌ（レーン２）中及びロブスターＬ２１配列、メリチンシグナルペプチドとヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡのベクターに由来するウイルスストック液１４μｌ（レーン１）中でのｈＮＤＳＴ２の検出を行った。コントロールとして、ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡのベクターに由来するウイルスストック液１４μｌ（レーン３）及びベクターＤＮＡを導入していない細胞に由来するウイルスストック液１４μｌ（レーン４）を用いた。抗ｈＮＤＳＴ２＃１を用いた結果を図２に示す。図２に示す結果により、ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとＣ末に６ｘＨＩＳタグがついたヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡのベクターに由来するウイルスストック液中及びロブスターＬ２１配列、メリチンシグナルペプチドとヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡのベクターに由来するウイルスストック液中に、ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡのベクターに由来するウイルスストック液中と同様に目的の酵素が検出できることが分かった。
（方法）
反応系５０μｌ中に、ヒト成人胎盤ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）５μ１、５’−ＣＣＡＴＧＣＴＣＣＡＧＴＴＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＴＡＣ−３’（配列番号３）の配列を有する短鎖ＤＮＡ５ｐｍｏｌと５’−ＧＣＡＴＴＴＴＧＣＴＧＧＴＡＴＧＧＧＡＧＧＣＴＧＧ−３’（配列番号４）の配列を有する短鎖ＤＮＡ５ｐｍｏｌ、ＰｆｕＴｕｒｂｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）２．５ｕｎｉｔｓによるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（登録商標）、０．１ｍｇ／ｍｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、２００μＭ ｄＮＴＰ（２’−デオキシリボヌクレオシド ５’−トリリン酸／ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの等モル混合）存在下、サーマルサイクラーを用いて、９４℃１分を１サイクル、９４℃１分−５５℃１分−７２℃６分を３０サイクル、７２℃１０分を１サイクル行わせ、ヒトＮＤＳＴ２（ＮＣＢＩ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＯ登録番号＃３６００１）のヌクレオチド番号２６から２７０８までの領域の特異的増幅を行った。反応産物をＴｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）アガロース電気泳動に供し、目的の２６８３ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を切り出し、ＧｅｎｅｃｌｅａｎＩＩｋｉｔ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて精製し、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）（ＴＥ緩衝液）１０μｌ中に回収した。１０μｌの反応系を用いて、回収したＤＮＡ４μｌをプラスミドＤＮＡ、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）１０ｎｇにＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のプロトコールに従い、ライゲーションした。反応液２μｌを用いて、常法により大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ Ｋａｎコンピテントセル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）４０μｌを形質転換し、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む１．５％寒天含有ＬＢ培地上で、形質転換体のコロニーを選択した。得られた大腸菌のコロニーを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地１．５ｍｌに接種し、３７℃２０時間の振盪培養を行った。得られた培養液を遠心後、大腸菌菌体より、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて、大腸菌が保持するプラスミドＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）１００μｌに回収した。ベクターＤＮＡに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を常法によりヒトＮＤＳＴ２に特異的な短鎖ＤＮＡを用いて確認した。
（結果）
上記の通り、ヒトＮＤＳＴ２のヌクレオチド番号２６から２７０８までの領域の特異的増幅の結果得られた２６８３ｂｐの大きさのＤＮＡ断片をｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）にライゲーション後、大腸菌を形質転換させ、薬剤耐性コロニーの選択を行った。得られた大腸菌のコロニー１２個からプラスミドＤＮＡを回収し、目的の２６８３ｂｐを保持するクローン、ｐＣＲｈＮＤＳＴ２＃５及びｐＣＲｈＮＤＳＴ２＃７を同定した。ベクターＤＮＡに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の解析を常法によりヒトＮＤＳＴ２に特異的な短鎖ＤＮＡを用いて行い、登録されているヒトＮＤＳＴ２（ＮＣＢＩ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＯ登録番号＃３６００１）の塩基配列と完全に一致していることを確認した。
実施例２：ロブスターＬ２１配列とｇｐ６７シグナルペプチドのＤＮＡの調製
２５μｌの反応系で、バキュロウイルスｇｐ６７シグナルペプチドを保持するベクターＤＮＡ、ｐＡｃＳｅｃＧ２Ｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）２５０ｎｇを鋳型に５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＣＴＣＣＴＡＡＡＡＡＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴＡＧＴＡＡＡＴＣＡＧ−３’（配列番号５）の配列を有する短鎖ＤＮＡ５ｐｍｏｌと５’−ＣＡＣＧＧＧＴＴＣＡＧＴＴＣＧＡＧＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣＡＡＡＧＧＣＡＧＡＡＴＧＣＧＣＣＧＣ−３’（配列番号６）の配列を有する短鎖ＤＮＡ５ｐｍｏｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（Ｔａｋａｒａ社、日本）１．２５ｕｎｉｔｓによるＰＣＲを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．００１％ＢＳＡ、２００μＭ ｄＮＴＰ存在下、サーマルサイクラーを用いて、９５℃２分を１サイクル、９５℃３０秒−５２．５℃３０秒−７２℃１分を１０サイクル、７２℃１０分を１サイクル行わせ、ロブスターＬ２１配列（ＡＡＣＴＣＣＴＡＡＡＡＡＡＣＣＧＣＣＡＣＣ）（配列番号７）とｇｐ６７シグナルペプチド３８アミノ酸をコードするＤＮＡの特異的増幅を行った。
実施例３：ヒトＮＤＳＴ２の７９番から８８３番までをコードするＤＮＡの調製
２５μｌの反応系で、ベクター中にヒトＮＤＳＴ２を保持するプラスミドＤＮＡ ｐＣＲｈＮＤＳＴ２＃５ ２５０ｎｇを鋳型に５’−ＧＡＧＡＣＡＧＣＴＣＧＡＡＣＴＧＡＡＣＣＣＧＴＧＧ−３’（配列番号８）の配列を有する短鎖ＤＮＡ ５ｐｍｏｌと５’−ＣＴＧＧＴＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＴＧＴＣＡＧＣＣＣＡＧＡＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣ−３’（配列番号９）の配列を有する短鎖ＤＮＡ ５ｐｍｏｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（Ｔａｋａｒａ社、日本）１．２５ｕｎｉｔｓによるＰＣＲを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ ＫＣｌ，６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．００１％ＢＳＡ、２００μＭ ｄＮＴＰ存在下、サーマルサイクラーを用いて、９５℃２分を１サイクル、９５℃３０秒−５２．５℃３０秒−７２℃５分を２０サイクル、７２℃１０分を１サイクル行わせ、ヒトＮＤＳＴ２の８０５アミノ酸（７９番から８８３番まで）をコードするＤＮＡの特異的増幅を行った。
実施例４：ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡの調製
２５μｌの反応系で、実施例２で得られた反応液２μｌと実施例３で得られた反応液０．５μｌ中のＤＮＡを鋳型に５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＣＴＣＣＴＡＡＡＡＡＡＣＣＧＣＣＡＣ−３’（配列番号１０）の配列を有する短鎖ＤＮＡ５ｐｍｏｌと５’−ＣＴＧＧＴＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＴＧＴＣＡＧＣＣＣＡＧＡＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣ−３’（配列番号１１）の配列を有する短鎖ＤＮＡ５ｐｍｏｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（Ｔａｋａｒａ社、日本）１．２５ｕｎｉｔｓによるＰＣＲを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．００１％ＢＳＡ、２００μＭ ｄＮＴＰ存在下、サーマルサイクラーを用いて、９５℃２分を１サイクル、９５℃３０秒−５２．５℃３０秒−７２℃６分を３０サイクル、７２℃１０分を１サイクル行わせ、ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチド３８アミノ酸とヒトＮＤＳＴ２ ８０５アミノ酸をコードする融合ＤＮＡの特異的増幅を行った。
実施例５：ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡのベクターＤＮＡへの組み込み
（方法）
実施例４で得られた融合ＤＮＡを含む反応液１０μｌ及びベクターＤＮＡ、ｐＦａｓｔＢａｃ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）１μｇに制限酵素ＢａｍＨＩとＮｏｔＩを１０ｕｎｉｔｓずつ加え、３７℃で２時間反応させた。反応産物を実施例１に示した方法に従い、ＴＡＥアガロース電気泳動に供し、目的の大きさのＤＮＡ断片をＧｅｎｅｃｌｅａｎ ＩＩ ｋｉｔを用いて精製し、ＴＥ緩衝液１０μｌ中に回収した。得られたＤＮＡ１μｌずつを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ社、日本）を用いた４℃、２０時間、１０μｌの反応系で、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで同時に消化したｐＦａｓｔＢａｃ−１に、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで同時に消化したロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチド３８アミノ酸とヒトＮＤＳＴ２ ８０５アミノ酸をコードする融合ＤＮＡをライゲーションした。反応液２μｌを用いて、常法により大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）４０μｌを形質転換し、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む１．５％寒天含有ＬＢ培地上で、形質転換体のコロニーを選択した。得られた大腸菌のコロニーから実施例１に示した方法に従い、大腸菌が保持するプラスミドＤＮＡを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）１００μｌに回収した。ベクターＤＮＡに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の解析を常法によりヒトＮＤＳＴ２に特異的な短鎖ＤＮＡを用いて行った。
（結果）
ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチド３８アミノ酸とヒトＮＤＳＴ２ ８０５アミノ酸をコードする融合ＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化した断片２５７７ｂｐとＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化したｐＦａｓｔＢａｃ−１のライゲーション産物で形質転換した大腸菌１２８クローンより目的のＤＮＡ断片を保持すると考えられる２クローン（ｐＦＢ１−ＧＰ６７ｈＮＤＳＴ２ＳＯＬ（７９Ｅ）＃５及びｐＦＢ１−ＧＰ６７ｈＮＤＳＴ２ＳＯＬ（７９Ｅ）＃１２３）を同定した。ＤＮＡの塩基配列解析を行い、前記２クローンが予想されるＤＮＡの塩基配列と完全に一致することを確認した。
実施例６：ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡのバキュロウイルスゲノムＤＮＡへの組み込み
（方法）
実施例５で得られたＤＮＡを大腸菌ＤＨ１０ＢＡＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）に導入し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のプロトコールに従い、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、７μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む１．５％寒天含有ＬＢ培地上で、形質転換体のコロニーを選択した。
得られた大腸菌のコロニーを５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＴｅｒｉｆｉｃ−Ｂｒｏｔｈ培地（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）１．５ｍｌに接種し、３７℃で２０時間の振盪培養を行った。得られた培養液を容量１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した後、冷却遠心機を用いて、４℃にて８０００回転で、２分間遠心して大腸菌菌体を沈澱として回収した。この菌体を１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１５０μｌに懸濁したのち、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む２００ｍＭ ＮａＯＨ１５０μｌを加え、緩やかに混和し室温で５分間静置した。次に、３．０Ｍ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ５．５）１５０μｌを加え、良く混和した後、冷却遠心機を用いて、４℃にて１５０００回転で、１０分間遠心して上清画分を回収した。上清４５０μｌにあらかじめＴＥ緩衝液で飽和されているフェノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）４５０μｌを加えて、ボルテックスミキサーにより激しく混和した後、冷却遠心機を用いて、４℃にて、１５０００回転で、５分間遠心して上層画分を回収した。上層画分４００μｌにエタノール１ｍｌを加え混和した後、室温で１０分間静置した。その後、冷却遠心機を用いて、４℃にて、１５０００回転で、５分間遠心して上清を除去した後、沈澱に７０％（ｖ／ｖ）エタノール１ｍｌを加え混和した後、冷却遠心機を用いて、４℃にて１５０００回転で、５分間遠心して上清を除去した。残った沈澱に、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１５０μｌを加え、懸濁したのち、３７℃で２０分間反応させた。次に、あらかじめＴＥ緩衝液で飽和されているフェノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）１００μｌを加えて、ボルテックスミキサーにより激しく混和した後、冷却遠心機を用いて、４℃にて１５０００回転で、５分間遠心して上層画分を回収した。上層画分１００μｌにエタノール２５０μｌと３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）１０μｌを加え混和した後、冷却遠心機を用いて、４℃にて、１５０００回転で、５分間遠心して上清を除去した。次に、沈澱に７０％（ｖ／ｖ）エタノール１ｍｌを加え混和した後、冷却遠心機を用いて、４℃にて１５０００回転で、５分間遠心して上清を除去した。残った沈澱に、ＴＥ緩衝液１００μｌを加え、懸濁した。
（結果）
実施例５で得られたＤＮＡ ｐＦＢ１−ＧＰ６７ｈＮＤＳＴ２ＳＯＬ（７９Ｅ）＃１２３を大腸菌ＤＨ１０ＢＡＣに導入し、薬剤耐性及びＰＣＲ法を指標に目的のクローン（ｐＦＢ１−ＧＰ６７ｈＮＤＳＴ２ＳＯＬ（７９Ｅ）＃１２３−４）を得た。
実施例７：ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡを組み込んだバキュロウイルスゲノムＤＮＡのヨトウガ細胞への導入
まず、ヨトウガＳｆ９細胞１００万個をＳＦ−９００ＩＩ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）２ｍｌに懸濁した後、６ｗｅｌｌのプレートに移し、２８℃で１時間静置し、細胞をプレートに接着させた。次に、実施例６で得られたＤＮＡ（バキュロウイルスゲノムＤＮＡに組み込まれたロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとヒトＮＤＳＴ２）１０μｇをＳｆ−９００ＩＩ無血清培地１００μｌに希釈したものと、ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）６μｌをＳｆ−９００ＩＩ無血清培地１００μｌに希釈したものを混和し、室温で３０分間静置した。あらかじめプレートに接着させたＳｆ９細胞をＳｆ−９００ＩＩ無血清培地２ｍｌで洗浄した後、ＤＮＡとｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎの混和液２００μｌにＳｆ−９００ＩＩ無血清培地８００μｌを混ぜたものを加えた。２８℃で５時間静置した後、培地を吸引除去して、新しいＳｆ−９００ＩＩ無血清培地２ｍｌを加えて、さらに２８℃で３日間培養したのち、培養上清を回収し、バキュロウイルスのストック液とした。
実施例８：ウイルスの増幅
１０００万個のＳｆ９細胞をＳＦ−９００ＩＩ無血清培地１０ｍｌに懸濁した後、Ｔ−７５フラスコにまき、１時間静置した。培地２ｍｌを残して吸引除去し、実施例７で得られたバキュロウイルスのストック液１ｍｌを添加、１時間ゆるやかに震盪させた。その後、ＳＦ−９００ＩＩ無血清培地８ｍｌを加え、２８℃で３日間培養した。回収した培地を遠心して、細胞を除いた画分をウイルス増幅液とした。
実施例９：ヒトＮＤＳＴ２のヨトウガ細胞における分泌発現
１０００万個のＳｆ９またはＳｆ２１細胞をＳＦ−９００ＩＩ無血清培地あるいは１０％血清含有Ｇｒａｃｅ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０ｍｌに懸濁した後、Ｔ−７５フラスコにまき、１時間静置した。培地２ｍｌを残して（あるいは全て）吸引除去し、実施例７で得られたバキュロウイルスのストック液あるいは実施例８で得られたウイルス増幅液１ｍｌ（あるいは３ｍｌ）を添加、１時間ゆるやかに震盪させた。その後、ＳＦ−９００ＩＩ無血清培地あるいは１０％血清添加 Ｇｒａｃｅ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）８ｍｌを加え、２８℃で３日間培養した。
実施例１０：培養上清の濃縮
回収した培地を遠心して、細胞を除いた画分を培養上清とした。培養上清をアミコンＵｌｔｒａ−１５ ３００００ＭＷＣＯ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）にかけ、冷却遠心機を用いた遠心により分子量３万以上の画分を回収し、濃縮培養上清とした。
より詳細には、ウイルスストック液をＳｆ９（無血清培地）、Ｓｆ９（血清含有培地）、Ｓｆ２１（血清含有培地）に感染させ、感染後得られた培養上清を、アミコンＵｌｔｒａ−１５ ３００００ＭＷＣＯにより、２０．４倍、２０．０倍、１６．４倍に濃縮した。また、コントロールとして挿入ＤＮＡ断片を保持しないｐＦａｓｔＢａｃ−１に由来するウイルスストック液をそれぞれの細胞に感染させ、１５．２倍、２１．７倍、１６．７倍に濃縮した培養上清を得た。
比較例１：ヒトＮＤＳＴ２のプロテインＡ含有ベクターへの組み込み
２５μｌの反応系で、ベクター中にヒトＮＤＳＴ２を保持するプラスミドＤＮＡ ｐＣＲｈＮＤＳＴ２＃５ ２５０ｎｇを鋳型に５’−ＣＡＣＧＡＡＴＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＴＧＣＣ−３’（配列番号１２）の配列を有する短鎖ＤＮＡ５ｐｍｏｌと５’−ＣＴＧＧＴＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＴＧＴＣＡＧＣＣＣＡＧＡＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣ−３’（配列番号１３）の配列を有する短鎖ＤＮＡ５ｐｍｏｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（Ｔａｋａｒａ社、日本）１．２５ｕｎｉｔｓによるＰＣＲを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．００１％ＢＳＡ、２００μＭ ｄＮＴＰ存在下、サーマルサイクラーを用いて、９５℃２分を１サイクル、９５℃３０秒−５２．５℃３０秒−７２℃５分を２５サイクル、７２℃１０分を１サイクル行わせ、ヒトＮＤＳＴ２の（４３番から８８３番までの）８４１アミノ酸をコードするＤＮＡの調製を行った。得られたＤＮＡを含む反応液１０μｌに制限酵素ＥｃｏＲＩとＭｕｎＩを１０ｕｎｉｔｓずつ加え、３７℃で２時間反応させた。またベクターＤＮＡ、ｐＲＫ５Ｆ１０ＰＲＯＴＡ１μｇに制限酵素ＥｃｏＲＩを１０ｕｎｉｔｓ加え、３７℃で２時間反応させたのちに、牛腸由来のＡｌｋａｌｉｎｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを１．４ｕｎｉｔｓを加え、３７℃で３０分間脱リン酸化反応を行った。反応産物を実施例１に示した方法に従い、ＴＡＥアガロース電気泳動に供し、目的の大きさのＤＮＡ断片をＧｅｎｅｃｌｅａｎＩＩ ｋｉｔを用いて精製し、ＴＥ緩衝液１０μｌ中に回収した。得られたＤＮＡ１μｌずつを用いて、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（ＴＡＫＡＲＡ社、日本）を用いて、４℃２０時間でＥｃｏＲＩ消化後、脱リン酸化されたｐＲＫ５Ｆ１０ＰＲＯＴＡに、ＥｃｏＲＩとＭｕｎＩで同時に消化したヒトＮＤＳＴ２の（４３番から８８３番までの）８４１アミノ酸をコードするＤＮＡを挿入した。反応産物を常法に従い、大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）に形質転換し、アンピシリン耐性コロニーを選択したのち、振盪培養で得られた大腸菌菌体より、プラスミド溶液を回収した。ベクターＤＮＡに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の解析を常法によりヒトＮＤＳＴ２に特異的な短鎖ＤＮＡを用いて行った。
比較例２：ヒトＮＤＳＴ２のサル細胞ＣＯＳ−７における分泌発現
１００万個のサルＣＯＳ−７細胞を１０％非働化牛胎児血清、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンを含むＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ）培地（血清含有ＤＭＥＭ培地）１２ｍｌに懸濁した後、１０ｃｍの培養ディッシュに移し、５％ＣＯ２存在下３７℃で２４時間培養した。
次に、比較例１で得られたＤＮＡ４μｇをＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ）培地３００μｌに希釈したものに、Ｐｏｌｙｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）２５μｌを混和し、室温で１０分間静置した。ＣＯＳ−７細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）（日水製薬株式会社、日本）１２ｍｌで洗浄し、除去した後、ＤＮＡとＰｏｌｙｆｅｃｔの混和液３２５μｌに血清含有ＤＭＥＭ培地１１ｍｌを混ぜたものを加え、５％ＣＯ２存在下３７℃で７２時間培養した。培養終了後、培養液を１５ｍｌのポリプロピレン製コニカル・チューブ３５−２１９６（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）に移したのち、冷却遠心機を用いて、９５００回転で１０分間遠心した後、培養上清１０ｍｌを新しい１５ｍｌのコニカル・チューブに移した。そこへ、ＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｓｗｅｄｅｎ）１００μｌを加え、小型回転攪拌機ＲＴ−５（タイテック社、日本）により、４℃で１６時間の回転攪拌を行った。攪拌終了後、冷却遠心機を用いて、２４００回転で５分間の遠心をした後、上清をピペットにより除去した。沈澱しているＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに、２０％グリセロールを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）１０ｍｌを加え、小型回転攪拌機により、４℃で５分間の回転攪拌を行った。攪拌終了後、冷却遠心機を用いて、２４００回転で５分間の遠心をした後、上清をピペットにより除去した。そこへ、２０％グリセロールを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）１０ｍｌを加え、小型回転攪拌機により、４℃で５分間の回転攪拌を行った。
攪拌終了後、冷却遠心機を用いて、２４００回転で５分間の遠心をした後、上清をピペットにより除去し、最終的にＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを２０％グリセロールを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）１００μｌに懸濁した。
実施例１０：酵素活性の測定
実施例９で得られた濃縮培養上清と比較例２で得られたＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ懸濁液の酵素活性を以下の方法で検出した。
脱Ｎ−アセチル化酵素活性：濃縮培養上清１０μｌあるいはＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ懸濁液１０μｌをあらかじめ準備してあるトリチウム化Ｎ−アセチルヘパロザン（２６００００ｃｐｍ）と５０ｍＭ ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）（ｐＨ６．５）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００存在下、５０μｌの反応系で３７℃で１時間反応させた。０．２Ｎ塩酸２５μｌ、０．１Ｎ酢酸５０μｌ、水５０μｌの混合液を加えて反応を停止させた後、酢酸エチル２５０μｌを使った抽出を３回行い、反応産物である「トリチウム」酢酸を回収した。
Ｎ−硫酸転移酵素活性：濃縮培養上清１０μｌあるいはＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ懸濁液１０μｌを脱Ｎ−硫酸化ヘパリン（Ｓｉｇｍａ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）２５μｇと２．５ｎｍｏｌ ３５Ｓ−ＰＡＰＳ（３’−ｐｈｏｓｐｈｏａｄｅｎｙｌｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）（１１００００ｃｐｍ）を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ‘−２−エタンスルホン酸）（ｐＨ７．２）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００存在下、５０μｌの反応系で３７℃１時間反応させた。１００ｍＭ ＥＤＴＡ９５０μｌを加えて反応を停止させた。次に、カラムに充填後、あらかじめ２５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）２．５ｍｌで平衡化してあるＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｓｗｅｄｅｎ）０．５ｍｌ（ベッドボリューム）に前記サンプルを供し、同カラムを２５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）１４ｍｌで洗浄後、１Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）２ｍｌで３５Ｓ−硫酸が転移したヘパリンを溶出した。
上記の方法により酵素活性の検出を行った。コントロールとしてｐＦａｓｔＢａｃ−１に由来するウイルス由来の培養上清の活性を差分し、培養上清１ｍｌ当たりの活性を算出した。結果を以下の表１に示す。表１に示す結果より本発明の発現系を用いることにより目的の酵素を大量に製造できることが分かる。
２５μｌの反応系で、ベクター中にヒトＮＤＳＴ２を保持するプラスミドＤＮＡ ｐＣＲｈＮＤＳＴ２＃５ ２５０ｎｇを鋳型に５’−ＧＡＧＡＣＡＧＣＴＣＧＡＡＣＴＧＡＡＣＣＣＧＴＧＧ−３’（配列番号８）の配列を有する短鎖ＤＮＡ ５ｐｍｏｌと５’−ＧＡＡＧＣＡＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＴＧＣＴＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＣＣＡＧＡＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣＴＴＣ−３’（配列番号１４）の配列を有する短鎖ＤＮＡ ５ｐｍｏｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（Ｔａｋａｒａ社、日本）１．２５ｕｎｉｔｓによるＰＣＲを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ ＫＣｌ，６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．００１％ＢＳＡ、２００μＭ ｄＮＴＰ存在下、サーマルサイクラーを用いて、９５℃２分を１サイクル、９５℃３０秒−５２．５℃３０秒−７２℃５分を２０サイクル、７２℃１０分を１サイクル行わせ、ヒトＮＤＳＴ２の８０５アミノ酸（７９番から８８３番まで）をコードするＤＮＡの特異的増幅を行った。
実施例１２：ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとＣ末端に６ｘＨＩＳタグがついたヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡの調製
２５μｌの反応系で、実施例３で得られた反応液２ｕｌと実施例１１で得られた反応液０．５μｌ中のＤＮＡを鋳型に５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＣＴＣＣＴＡＡＡＡＡＡＣＣＧＣＣＡＣ−３’（配列番号１０）の配列を有する短鎖ＤＮＡ５ｐｍｏｌと
５’−ＧＡＡＧＣＡＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＴＧＣＴＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＣＣＡＧＡＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣＴＴＣ−３’（配列番号１４）の配列を有する短鎖ＤＮＡ５ｐｍｏｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（Ｔａｋａｒａ社、日本）１．２５ｕｎｉｔｓによるＰＣＲを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．００１％ＢＳＡ、２００μＭ ｄＮＴＰ存在下、サーマルサイクラーを用いて、９５℃２分を１サイクル、９５℃３０秒−５２．５℃３０秒−７２℃６分を３０サイクル、７２℃１０分を１サイクル行わせ、ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチド３８アミノ酸とＣ末端に６ｘＨＩＳタグがついたヒトＮＤＳＴ２ ８０５アミノ酸をコードする融合ＤＮＡの特異的増幅を行った。
実施例１３：ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとＣ末端に６ｘＨＩＳタグがついたヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡのベクターＤＮＡへの組み込み
（方法）
実施例１２で得られた融合ＤＮＡを含む反応液１０μｌ及びベクターＤＮＡ、ｐＦａｓｔＢａｃ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）１μｇに制限酵素ＢａｍＨＩとＮｏｔＩを１０ｕｎｉｔｓずつ加え、３７℃で２時間反応させた。反応産物を実施例１に示した方法に従い、ＴＡＥアガロース電気泳動に供し、目的の大きさのＤＮＡ断片をＧｅｎｅｃｌｅａｎ ＩＩ ｋｉｔを用いて精製し、ＴＥ緩衝液１０μｌ中に回収した。得られたＤＮＡ１μｌずつを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ社、日本）を用いた４℃、２０時間、１０μｌの反応系で、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで同時に消化したｐＦａｓｔＢａｃ−１に、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで同時に消化したロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチド３８アミノ酸とＣ末に６ｘＨＩＳタグがついたヒトＮＤＳＴ２ ８０５アミノ酸をコードする融合ＤＮＡをライゲーションした。反応液２μｌを用いて、常法により大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）４０μｌを形質転換し、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む１．５％寒天含有ＬＢ培地上で、形質転換体のコロニーを選択した。得られた大腸菌のコロニーから実施例１に示した方法に従い、大腸菌が保持するプラスミドＤＮＡを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）１００μｌに回収した。ベクターＤＮＡに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の解析を常法によりヒトＮＤＳＴ２に特異的な短鎖ＤＮＡを用いて行った。
（結果）
ライゲーション産物で形質転換した大腸菌のうち、目的のＤＮＡ断片を保持すると考えられるクローンを同定し、そのＤＮＡの塩基配列の確認を行った。
実施例１４：ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとＣ末端に６ｘＨＩＳタグがついたヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡのバキュロウイルスゲノムＤＮＡへの組み込み
（方法）
実施例１３で得られたＤＮＡを大腸菌ＤＨ１０ＢＡＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）に導入し、実施例６に示した方法によりＤＮＡを回収した。
（結果）
実施例１３で得られたＤＮＡより目的のクローン（ｐＧＰ６７ｓｐ−ｈＮＤＳＴ２（７９Ｅ）１２３ＨＩＳ−ＦＢ１／１０Ｂ＃２）を得た。
実施例１５：ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとＣ末に６ｘＨＩＳタグがついたヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡを組み込んだバキュロウイルスゲノムＤＮＡのヨトウガ細胞への導入
実施例１４で得られたＤＮＡ（バキュロウイルスゲノムＤＮＡに組み込まれたロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとＣ末に６ｘＨＩＳタグがついたヒトＮＤＳＴ２）を用いて、実施例７に示した方法に従い、バキュロウイルスのストック液とした。
実施例１６：ロブスターＬ２１配列とミツバチメリチンシグナルペプチドのＤＮＡの調製
２５μｌの反応系で、ミツバチメリチンシグナルペプチドを保持するベクターＤＮＡ、ｐＭｅｌＢａｃ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）２５０ｎｇを鋳型に５’−ＡＡＣＴＣＣＴＡＡＡＡＡＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＣＡＡＣＧＴＴＧ−３’（配列番号１５）の配列を有する短鎖ＤＮＡ ５ｐｍｏｌと５’−ＣＡＣＧＧＧＴＴＣＡＧＴＴＣＧＡＧＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣＡＴＡＧＡＴＧＴＡＡＧＡＡＡＴＧＴＡＴＡＣ−３’（配列番号１６）の配列を有する短鎖ＤＮＡ ５ｐｍｏｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（Ｔａｋａｒａ社、日本）１．２５ｕｎｉｔｓによるＰＣＲを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．００１％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、２００μＭ ｄＮＴＰ存在下、サーマルサイクラーを用いて、９５℃、２分を１サイクル、９５℃、３０秒→５２．５℃、３０秒→７２℃、１分を１０サイクル、７２℃、１０分を１サイクル行わせ、ロブスターＬ２１配列（ＡＡＣＴＣＣＴＡＡＡＡＡＡＣＣＧＣＣＡＣＣ）（配列番号７）とメリチンシグナルペプチド２１アミノ酸をコードするＤＮＡの特異的増幅を行った。
実施例１７：ロブスターＬ２１配列、メリチンシグナルペプチドとヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡの調製
２５μｌの反応系で、実施例１６で得られた反応液２ｕｌと実施例３で得られた反応液０．５ｕｌ中のＤＮＡを鋳型に実施例４に示した方法により、ロブスターＬ２１配列、メリチンシグナルペプチド２１アミノ酸とヒトＮＤＳＴ２ ８０５アミノ酸をコードする融合ＤＮＡの特異的増幅を行った。
実施例１８：ロブスターＬ２１配列、メリチンシグナルペプチドとヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡのベクターＤＮＡへの組み込み
（方法）
実施例１７で得られた融合ＤＮＡを用いて、実施例５に示した方法によりプラスミドＤＮＡを回収した。
（結果）
ライゲーション産物で形質転換した大腸菌のうち、目的のＤＮＡ断片を保持すると考えられるクローンを同定し、そのＤＮＡの塩基配列の確認を行った。
実施例１９：ロブスターＬ２１配列、メリチンシグナルペプチドとヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡのバキュロウイルスゲノムＤＮＡへの組み込み
（方法）
実施例１８で得られたＤＮＡを大腸菌ＤＨ１０ＢＡＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）に導入し、実施例６に示した方法によりＤＮＡを回収した。
実施例２０：ロブスターＬ２１配列、メリチンシグナルペブチドとヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡを組み込んだバキュロウイルスゲノムＤＮＡのヨトウガ細胞への導入
実施例１９で得られたＤＮＡ（バキュロウイルスゲノムＤＮＡに組み込まれたロブスターＬ２１配列、メリチンシグナルペプチドとヒトＮＤＳＴ２）を用いて、実施例７に示した方法に従い、バキュロウイルスのストック液とした。
実施例２１：抗ヒトＮＤＳＴ２抗体を含む血清の取得
ヒトＮＤＳＴ２のアミノ酸８２８番から８４０番までの配列（ＬＧＲＳＫＧＲＲＹＰＤＭＤ）（配列番号１７）及び８７３番から８８３番までの配列（ＬＲＥＥＬＱＨＳＳＬＧ）（配列番号１８）のアミノ末端にそれぞれシステイン残基を付加したペプチド１（ＣＬＧＲＳＫＧＲＲＹＰＤＭＤ）（配列番号１９）及びペプチド２（ＣＬＲＥＥＬＱＨＳＳＬＧ）（配列番号２０）をＦｍｏｃ法により市販のペプチド合成機を用いて合成した。得られたペプチドそれぞれ５ｍｇを１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）４．５ｍｌに懸濁した後、ｍ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒを使用して、ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）０．５ｍｌと４℃一晩回転攪拌により、共有結合させた。公知の方法により、得られたＫＬＨ−ペプチド複合体をウサギに免疫後、血清画分を得た。
実施例２２：ヒトＮＤＳＴ２のペプチド固定化カラムの作成とそれを用いた抗ヒトＮＤＳＴ２精製抗体の取得
（方法）
ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解したペプチド１及び２をそれぞれ、Ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に同製品の実験手順に従って固定化し、ペプチド固定化樹脂とする。ペプチド固定化樹脂０．４ｍｌをＴＢＳで平衡化した後、クロマトカラム容器に充填し、それぞれのペプチドで免疫したウサギより得られた血清１０ｍｌと混和し、４℃で一晩回転攪拌した。クロマトカラム容器を垂直に固定後、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍｌ、１Ｍ ＮａＣｌ及び１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）２０ｍｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）２０ｍｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ １０ｍｌで順次洗浄後、０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）１ｍｌで溶出させた。溶出された画分に１Ｍ Ｔｒｉｓ ５０μｌを加え中和し、抗ヒトＮＤＳＴ２精製抗体の溶液とした。
（結果）
ＫＬＨ−ペプチド１複合体で免疫したウサギ血清画分を、ペプチド１固定化カラムにかけ、溶出画分として、抗ｈＮＤＳＴ２＃１を得た。同様にＫＬＨ−ペプチド２複合体で免疫したウサギ血清画分より、抗ｈＮＤＳＴ２＃２を得た。
実施例２３：精製抗ヒトＮＤＳＴ２抗体を用いたヨトウガ細胞中のヒトＮＤＳＴ２の検出
培養上清とその１／４容の５ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを混ぜ、１００℃５分処理後、５％ポリアクリルアミド電気泳動に供した。泳動後、公知の方法により、ポリアクリルアミドゲル中の蛋白質をＰＶＤＦ膜に転写した。転写された膜は膜洗浄液（１％スキムミルク及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝液）１００ｍｌ中で１時間振盪した。膜を抗ヒトＮＤＳＴ２精製抗体＃１ １２．６μｇあるいは＃２ １６．６μｇが溶解した膜洗浄液５ｍｌ中で１時間振盪した。膜は膜洗浄液１００ｍｌにて１０分間３回洗浄した。膜をＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ結合型ヒツジ抗ウサギ抗体０．４μｇが溶解した膜洗浄液５ｍｌ中で１時間振盪した。膜は膜洗浄液１００ｍｌにて１０分間３回洗浄した。膜を蛍光発色試薬（例えば、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｐｉｅｒｃｅ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）とインキュベーション後、蛍光をＸ線フィルムにて検出した。
上記の方法により、ウイルスのストック液を含む培養上清中でのｈＮＤＳＴ２の検出を行った。まず、ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡのベクターに由来するウイルス増幅液約３ｍｌを感染させたＳｆ２１細胞（血清含有培地）の培養上清１μｌ（レーン２）中でのｈＮＤＳＴ２の検出を行った。コントロールとして、ｐＦａｓｔＢａｃ−１に由来する培養上清１μｌ（レーン１）を用いた。抗ｈＮＤＳＴ２＃１を用いた結果を以下の図１（Ａ）に、抗ｈＮＤＳＴ２＃２を用いた結果を以下の図１（Ｂ）に示す。図１に示す結果により、抗ｈＮＤＳＴ２＃１を用いても抗ｈＮＤＳＴ２＃２を用いても、培養上清中の目的の酵素が検出できることが分かった。次に、ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとＣ末に６ｘＨＩＳタグがついたヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡのベクターに由来するウイルスストック液１４μｌ（レーン２）中及びロブスターＬ２１配列、メリチンシグナルペプチドとヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡのベクターに由来するウイルスストック液１４μｌ（レーン１）中でのｈＮＤＳＴ２の検出を行った。コントロールとして、ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡのベクターに由来するウイルスストック液１４μｌ（レーン３）及びベクターＤＮＡを導入していない細胞に由来するウイルスストック液１４μｌ（レーン４）を用いた。抗ｈＮＤＳＴ２＃１を用いた結果を図２に示す。図２に示す結果により、ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとＣ末に６ｘＨＩＳタグがついたヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡのベクターに由来するウイルスストック液中及びロブスターＬ２１配列、メリチンシグナルペプチドとヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡのベクターに由来するウイルスストック液中に、ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチドとヒトＮＤＳＴ２の融合ＤＮＡのベクターに由来するウイルスストック液中と同様に目的の酵素が検出できることが分かった。
本発明によれば、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の７９番から８８３番までのアミノ酸をコードするＤＮＡを含有する組み換えバキュロウイルス発現ベクターを構築し、該発現ベクターで昆虫細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養して培養液中に分泌された発現生成物を回収することにより、膜貫通領域のＮ末側配列を除去した組換えヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２を製造する方法が確立された。本発明のヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２の７９番から８８３番までのアミノ酸をコードするＤＮＡを含有する組み換えバキュロウイルス発現ベクターを感染させた昆虫細胞は、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２を高発現することができる。本発明の組み換えバキュロウイルス発現ベクターは、ヒトＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２を高発現するように構築された発現ベクターである。
本発明により製造される膜貫通領域のＮ末側配列を除去したＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２（ＮＤＳＴ２）は可溶性タンパク質であり、脱Ｎ−アセチル化酵素活性とＮ−硫酸転移酵素活性の両方の活性を併せ持つため、種々の用途に使用しうる。
すなわち、ＮＤＳＴ２は、生体内でＮ−アセチルヘパロザンからヘパリン／ヘパラン硫酸が生合成される修飾反応における最初のステップであるアセチル基を硫酸基に変換する反応を触媒するので、可溶性ＮＤＳＴ２が本発明により容易かつ大量に得られれば、大腸菌を用いて製造できるＮ−アセチルヘパロザンを原料としてヘパリン／ヘパラン硫酸及びその類縁糖鎖（ヘパリン様糖鎖）を大量合成する際に利用することができる。例えば、Ｎ−アセチルヘパロザンにＮＤＳＴ２を作用させて、それ自身抗プロテアーゼ活性や抗凝固活性を有することが知られているＮ−サルファミノヘパロザンを合成することができ、さらにエピメラーゼ、０−スルフォトランスフェラーゼ等を用いてＣ５−エピメリ化、２−０−硫酸化、６−０−硫酸化、３−０−硫酸化を行なうことによってヘパリン／ヘパラン硫酸及びその類縁糖鎖を合成することができる。ヘパリン様糖鎖は、その抗凝固活性を利用してヘパリン／ヘパラン硫酸と同様に医薬品、医療機器・用具への抗血栓処理に利用できるばかりでなく、ヘパリン／ヘパラン硫酸結合タンパク質（例えば細胞増殖因子、細胞接着因子、血液凝固関連タンパク質など）の機能解明や、これらのタンパク質が関連した疾病の診断にも利用可能である。
本発明により製造される膜貫通領域のＮ末側配列を除去したＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２（ＮＤＳＴ２）は可溶性タンパク質であり、脱Ｎ−アセチル化酵素活性とＮ−硫酸転移酵素活性の両方の活性を併せ持つため、種々の用途に使用しうる。
すなわち、ＮＤＳＴ２は、生体内でＮ−アセチルヘパロザンからヘパリン／ヘパラン硫酸が生合成される修飾反応における最初のステップであるアセチル基を硫酸基に変換する反応を触媒するので、可溶性ＮＤＳＴ２が本発明により容易かつ大量に得られれば、大腸菌を用いて製造できるＮ−アセチルヘパロザンを原料としてヘパリン／ヘパラン硫酸及びその類縁糖鎖（ヘパリン様糖鎖）を大量合成する際に利用することができる。例えば、Ｎ−アセチルヘパロザンにＮＤＳＴ２を作用させて、それ自身抗プロテアーゼ活性や抗凝固活性を有することが知られているＮ−サルファミノヘパロザンを合成することができ、さらにエピメラーゼ、０−スルフォトランスフェラーゼ等を用いてＣ５−エピメリ化、２−０−硫酸化、６−０−硫酸化、３−０−硫酸化を行なうことによってヘパリン／ヘパラン硫酸及びその類縁糖鎖を合成することができる。ヘパリン様糖鎖は、その抗凝固活性を利用してヘパリン／ヘパラン硫酸と同様に医薬品、医療機器・用具への抗血栓処理に利用できるばかりでなく、ヘパリン／ヘパラン硫酸結合タンパク質（例えば細胞増殖因子、細胞接着因子、血液凝固関連タンパク質など）の機能解明や、これらのタンパク質が関連した疾病の診断にも利用可能である。
Claims (10)
- 少なくともバキュロウイルス発現ベクター内で機能しうるシグナルペプチドをコードするＤＮＡと、その下流に連結された以下の（ａ）または（ｂ）の膜貫通領域のＮ末側配列を除去したヒトN-デアセチラーゼ／N-スルホトランスフェラーゼ２をコードするＤＮＡとを含み、さらにコーディング配列の発現を促進させる機能を有する非翻訳リーダー配列を含むトランスファーベクターであって、
上記シグナルペプチドが、バキュロウイルス由来のシグナルペプチドであるgp67、カイコ由来のシグナルペプチドであるボンビキシン・シグナルペプチド、又はミツバチ由来のシグナルペプチドであるメリチン・シグナルペプチドであり、上記非翻訳リーダー配列がロブスターL21ＤＮＡである、上記のトランスファーベクター。
（ａ）配列番号２記載の79番から883番までのアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）のタンパク質において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または転位したアミノ酸配列からなり、かつ、N-デアセチラーゼ活性とN-スルホトランスフェラーゼ活性とを有するタンパク質： - ヒトN-デアセチラーゼ／N-スルホトランスフェラーゼ２をコードするＤＮＡの下流に、さらにヒスチジン・タグに対応するＤＮＡを有する、請求項１に記載のトランスファーベクター。
- コーディング配列の発現を促進させる機能を有する非翻訳リーダー配列、少なくともバキュロウイルス発現ベクター内で機能しうるシグナルペプチドをコードするＤＮＡ、並びにヒトN-デアセチラーゼ／N-スルホトランスフェラーゼ２の79番から883番までのアミノ酸をコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡにおいて１若しくは数個のヌクレオチドの欠失、挿入若しくは置換を有するＤＮＡであって、ヒトN-デアセチラーゼ／N-スルホトランスフェラーゼ２と同等の酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡを、この順で５’から３’方向に有するＤＮＡ断片をバキュロウイルスDNAへ組み込んで得られる、組換えバキュロウイルス発現ベクターであって、
上記非翻訳リーダー配列がロブスターL21ＤＮＡであって、上記シグナルペプチドが、バキュロウイルス由来のシグナルペプチドであるgp67、カイコ由来のシグナルペプチドであるボンビキシン・シグナルペプチド、又はミツバチ由来のシグナルペプチドであるメリチン・シグナルペプチドである、上記の組換えバキュロウイルス発現ベクター。 - ＤＮＡ断片のバキュロウイルスDNAへの組み込みが、該ＤＮＡ断片とバキュロウイルスDNAの多核体遺伝子との相同組換えによって行なわれる、請求項３記載の組換えバキュロウイルス発現ベクター。
- 請求項３又は４のいずれかに記載の組換えバキュロウイルス発現ベクターを有する昆虫細胞。
- ヨトウガ細胞である、請求項５に記載の細胞。
- 請求項３に記載の組換えバキュロウイルス発現ベクターを有する昆虫細胞を培養し、膜貫通領域のＮ末側配列を除去したヒトN-デアセチラーゼ／N-スルホトランスフェラーゼ２を分泌発現させることを含む、ヒトN-デアセチラーゼ／N-スルホトランスフェラーゼ２の製造方法。
- 昆虫細胞を血清含有培地で培養する、請求項７に記載の方法。
- 以下の（ａ）または（ｂ）の膜貫通領域のＮ末側配列を除去したヒトN-デアセチラーゼ／N-スルホトランスフェラーゼ２と、配列番号１７又は配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む抗原ペプチドを哺乳動物または鳥類に免疫して得られたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体とを反応させる工程を含む、ヒトN-デアセチラーゼ／N-スルホトランスフェラーゼ２の検出方法。
（ａ）配列番号２記載の79番から883番までのアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）のタンパク質において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または転位したアミノ酸配列からなり、かつ、N-デアセチラーゼ活性とN-スルホトランスフェラーゼ活性とを有するタンパク質： - 配列番号１７又は配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む抗原ペプチドが、配列番号１９又は配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなる抗原ペプチドである、請求項９に記載にヒトN-デアセチラーゼ／N-スルホトランスフェラーゼ２の検出方法。
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