JPH0767651A - タイプiiインターロイキン−1受容体 - Google Patents

タイプiiインターロイキン−1受容体

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JPH0767651A
JPH0767651A JP3134463A JP13446391A JPH0767651A JP H0767651 A JPH0767651 A JP H0767651A JP 3134463 A JP3134463 A JP 3134463A JP 13446391 A JP13446391 A JP 13446391A JP H0767651 A JPH0767651 A JP H0767651A
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ブルース・モスレイ
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Abstract

(57)【要約】 (修正有) 【目的】実質的に精製され、均質なタンパク質と、タイ
プII IL−1受容体(タイプII IL−1R)タ
ンパク質を含む、タンパク質組成物および療法、診断、
タイプII IL−1Rの分析又は、タイプII IL
−1Rに対する抗体の作製において使用するための、上
述の方法に従って調製された可溶性天然又は組換え受容
体タンパク質の有効量を含む組成物の提供。 【構成】タイプII IL−1R、タイプII IL−
1RをコードするDNAと発現ベクター、および組換え
細胞培養の生成物としてタイプII IL−1Rを生産
する方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は一般的にサイトカイン受
容体に関し、特にインターロイキン−1受容体に関す
る。
【0002】
【従来の技術】インターロイキン−1α(IL−1α)
及びインターロイキン−1β(IL−1β)は免疫制御
及び、炎症反応において中心的役割を果たす、遠い関係
にあるポリペプチド性ホルモンである。これら2つのタ
ンパク質は各種の細胞に働き、複数の生物学的活性を持
っている。IL−1α及びIL−1βに帰する生物学的
活性の相違は、IL−1α及びIL−1βの両方に結合
する、特異的原形質膜受容体による。IL−1α及びI
L−1βによる広範囲に及ぶ生物学的活性のために、I
L−1受容体は様々な種の間で高度に保存され、多様な
細胞で発現されているに違いないと元来信じられてき
た。
【0003】リガンド親和性クロス−リンキング技術に
よる構造評価の結果、配列上の顕著な相違にもかかわら
ず、IL−1α及びIL−1βは、T細胞と繊維芽細胞
の、同じ細胞表面受容体分子に結合することがわかった
(Dower et al.,Nature(Lond
on)324:266,1986;Bird eta
l.,Nature(London)324:263,
1986;Doweret al.,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 83:1060,19
86)。cDNA発現クローニング及び、IL−1α及
びIL−1βに結合し、80,00kDaの分子量を持
つ膜内在性糖タンパク質としてのN端側配列分析から、
ネズミとヒトのT細胞のIL−1受容体が同定された
(シムズら(Sims et al.)Science
241:581,1988;シムズら,Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA86;8946,19
89)。
【0004】しかしながら、現在では、この80kDa
IL−1受容体タンパク質がIL−1の種々の生物学
的効力のすべてを伝達しているわけではないことが明ら
かになっている。更なる親和クロス−リンキング解析
は、エプシュタインバーウイルス(Epstein B
arr virus)(EBV)−形質転換ヒトB細胞
系VDS−O及び3B6、EBV−陽性バーキット(B
urkitt’s)リンパ腫細胞系ラジ(Raji)、
そしてネズミ前B細胞系70Z/3におけるIL−1受
容体が60,000から68,000kDaの分子量で
あるこおを示唆している(マツシマら(Matsush
ima et al.,J.Immunol.136:
4996,1986;ベンシモンら(Bensimon
et al., J.Immunol.142:22
90,1989;ベンシモンら、J.Immunol.
143;1168,1989;ホルークら(Horuk
et al.,J.Biol.Chem.262:1
6275,1987;チゾニッテ(Chizzonit
e)ら.,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA86:8029,1989;ボムスツィックら(B
omsztyk etal., Proc.Natl.
Acad.Sci.USA86:8034,198
9)。さらに、ラジB細胞系と、EL−4ネズミTリン
パ腫細胞系のIL−1受容体の生物学的特性及び動的解
析を比較したところ、ラジ細胞は、EL−4T細胞のサ
ブクローンよりも、低い結合親和性を持つが、細胞あた
り、より高密度に受容体を持つことが分かった(ホール
ク(Horuk)ら.,J.Biol.Chem.26
2:16275,1987)。ラジ細胞はまた。IL−
1を吸収することができず、IL−1類似物に対して異
なった受容体結合親和力を示した(ホルクら.,J.B
iol.Chem.262:16275,1987)。
これらのデータはB細胞上で発現されたIL−1受容体
(ここではタイプIIIL−1受容体と呼ぶ)は、T細
胞及びその他の細胞種で発見されたIL−1受容体(こ
こではタイプIIL−1受容体と呼ぶ)と異なっている
ことを示唆している。
【0005】タイプII IL−1Rの構造的及び生物
学的特性、そしてIL−1刺激に対する様々な細胞母集
団の反応におけるタイプII IL−1Rの果たす役割
を解析するために、あるいは、治療、診断、分析におい
てタイプII IL−1Rを有効に用いるために、均質
な組成物が必要である。そのような組成物は、培養細胞
で発現している受容体の精製によって、あるいは、受容
体をコードしている遺伝子のクローニング及び発現によ
って理論的には得ることができる。しかしながら本発明
以前には、いくつかの障害があり、目的は達成されなか
った。
【0006】まず、タイプII IL−1Rを高いレベ
ルで構成的に、連続的に発現する細胞系が以前には知ら
れておらず、タイプII IL−1Rを発現するとして
知られていた細胞系は少ない数(500から2,000
受容体/細胞)しか発現しなかったために、アミノ酸の
配列情報を得たり、モノクローナル抗体を作製するのに
充分な量の受容体の精製への努力が妨げられた。受容体
の数が少ないために、また、実用的な転写分析に基づい
たクローニング法も不可能であった。
【0007】次に、タイプIIL−RとタイプII I
L−1RのDNA配列における顕著な相違のため、ネズ
ミタイプIL−1RcDNAを用いたクロス−ハイブリ
ダイゼーションも不可能であった(ボムスチック(Bo
msztyk)ら,Proc.Natl.Acad,S
ci.USA86:8034,1989,及びチゾニッ
テ(Chizzonite)ら.,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA86:8029,198
9)。
【0008】三番目として、仮に、N端側タンパク質配
列決定を行うことができるほど充分に精製されたタンパ
ク質組成物が得られたとしても、そこから得られる遺伝
コードの退歩(degeneracy)は、更にかなり
の実験をしなければ、適切なプローブを決定できないで
あろう。cDNAライブラリーにおいてハイブリダイズ
する配列を決定するのに必要な特異性を持つプローブを
決定するのに、多くの反復する試行が要求されるだろ
う。直接的発現クローニング技術は、未知の特異性を持
つ異なったプローブを用いた反復したスクリーニングの
必要を避けており、他の受容体(例えばタイプIIL−
1R)のクローニングにおいては有用であったが、少な
い数のタイプII IL−1Rを発現している細胞から
得られたcDNAライブラリーから、タイプII IL
−1Rクローンを固定するために用いるのにふさわしい
ほどに充分に感度が高くない。
【0009】したがって、タイプII IL−1Rを精
製したり、タイプII IL−1Rをコードする遺伝子
をクローニングしたり発現したりする努力は、精製した
受容体、受容体mRNAの適切な供給源が欠落している
こと、そして、充分に感度のあるクローニング技術の欠
落によって著しく妨げられた。
【0010】
【課題を解決するための手段】本発明は、精製した、均
質なタイプII IL−1Rタンパク質及び、タイプI
I IL−1Rタンパク質をコードする単離したDNA
配列、特に、ヒトタイプII IL−1R又はその類似
物(analogs)を提供する。そのようなDNA配
列は、好ましくは、(a)クロ−ン75のように、天然
タイプII IL−1R遺伝子のコード部分に由来する
ヌクレオチド配列を持つcDNAクローン;(b)ゆる
やかなストリンジェント条件下で(a)のcDNAクロ
ーンとハイブリダイズでき、生物学的活性のあるIL−
1R分子をコードするDNA配列;そして(c)(a)
及び(b)で定義されたDNA配列の遺伝コードの結果
として退歩し、かつ生物学的活性のあるIL−1R分子
をコードするDNA配列から成る群から選択される。本
発明はまた、上に定義されたDNA配列を含む組換え発
現ベクター、組換え発現ベクターを用いて産生された組
換えタイプII IL−1R分子、そして、発現ベクタ
ーを利用した組換えタイプII IL−1R分子の産生
方法を提供する。
【0011】本発明はまた、実質的に精製され、均質な
タンパク質と、タイプII IL−1Rを含む、タンパ
ク質組成物を提供する。
【0012】本発明はまた、療法、診断、タイプII
IL−1Rの分析又は、タイプIIIL−1Rに対する
抗体の作製において使用するための、上述の方法に従っ
て調製された可溶性天然又は組換え受容体タンパク質の
有効量を含む組成物を提供する。
【0013】本発明のこれらの、また他の側面は、以下
の詳細な説明を参照すると明白になるであろう。
【0014】定義 “IL−1”は、IL−1α及びIL−1βをあわせて
指す。
【0015】“タイプII インターロイキン−1受容
体”及び“タイプII IL−1R”はインターロイキ
ン−1(IL−1)分子を結合することができ、ホ乳類
原形質膜タンパク質のような本来の構造をとるとき、I
L−1から細胞への信号を伝達する役割を果たす分子を
指す。成熟した全長ヒトタイプII IL−1Rは、み
かけの分子量が約60−68kDaの糖タンパク質であ
る。タイプII IL−1Rタンパク質の具体例は、S
EQ ID NO:1及びSEQ ID NO:12に
示されている。ここで用いられているように、上述の用
語は、IL−1結合活性又は信号伝達活性を持つ天然タ
イプII IL−1Rタンパク質の類似物又はサブユニ
ットを含んでいる。特に、タイプII IL−1Rタン
パク質の先端を欠いた形や、可溶性の形状のものも、下
記で定義するように、含まれている。種の指定がない場
合は、タイプII IL−1Rは、ヒト、ネズミ、ウシ
タイプII IL−1Rを含むがそれらに限定されな
い、ホ乳類タイプII IL−1Rを総称する。同様
に、欠損変異に対する特別な指定がない場合、タイプI
I IL−1Rという用語は、タイプII IL−1R
の生物学的活性を持つ変異体又は類似物を含むすべての
形態のタイプII IL−1Rを意味する。“インター
ロイキン−1受容体”又は“IL−1R”とは、タイプ
IIL−1受容体及びタイプII IL−1受容体をあ
わせて指す。
【0016】本発明の文脈で用いられている“可溶性タ
イプII IL−1R”はタンパク質、又は、実質的に
同等な類似物で、天然タイプII IL−1Rの細胞外
部分の全て又は一部と実質的に類似しており、細胞から
分泌されるが、IL−1と結合する能力を持っている
か、又は細胞表面に結合したIL−1Rタンパク質を通
じたIL−1の信号伝達を阻害する能力のあるものを指
している。可溶性タイプII IL−1Rタンパク質
は、細胞から分泌されることができるのなら、膜貫通領
域の一部を含んでいるかもしれない。可溶性タイプII
IL−1Rタンパク質の具体例は、SEQ ID N
O:1の1−330又は1−333アミノ酸配列を持つ
タンパク質、そして、SEQ ID NO:12の1−
342及び1−345アミノ酸配列を持つタンパク質を
含んでいる。IL−1信号伝達活性の阻害は、初代細胞
又は、内在性IL−1Rを発現し、IL−1に生物学的
に反応するか、組換えIL−1RDNAを導入するとI
L−1に生物学的に反応するような細胞系を用いて決定
することができる。細胞は、IL−1と接触を受け、そ
れによって起きる代謝影響が解析される。もしリガンド
の働きによる影響が出れば、組換え受容体は信号伝達活
性を持つ。ポリペプチドが信号伝達活性を持つかどうか
を決定するための典型的な手法は、イゼルダ(Idze
rda)ら.,J.Exp.Med.171:861
(1990);カーチス(Curtis)ら.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA86:304
5(1989);プリウェス(Pryues)ら.,E
MBO J.5:2179(1986)及びコウ(Ch
ou)ら.,J.Biol.Chem.262:184
2(1987)によって明らかになった。
【0017】“単離された”又は“精製された”という
用語は、本明細書の文脈中でタイプII IL−1Rタ
ンパク質又はタンパク質組成物の純度を定義するために
用いられている場合、タンパク質又はタンパク質組成物
が、実質的に、他の、天然の、又は内在性由来のタンパ
ク質の混入を受けておらず、生産過程の混入タンパク質
残余が1%以下であることを意味する。このような組成
物はしかし、安定剤、担体賦形剤または共治療剤として
他のタンパク質を含むことがある。タイプIIIL−1
Rは、ポリアクリルアミドゲルを銀染色した時に、1本
のバンドとして検出可能ならば“単離されて”いる。
【0018】“実質的に類似”という用語が、アミノ酸
もしくは核酸配列を定義する時に用いられる場合、特有
の従属配列、例えば、変異型配列が、もとの配列から、
1つ又はそれ以上の置換、欠失、付加を受けて変化して
おり、それらの全影響が、例えば、タイプII IL−
1R結合分析において、実施例5で以下に記述したよう
に、決定された、タイプII IL−1Rタンパク質の
生物学的活性を保っていることを意味している。あるい
は、核酸サブユニットまたは類似物は、もし、(a)D
NA配列がSEQ ID NO:1又はSEQ ID
NO:12のコード領域から得られたものなら、(b)
DNA配列が、ゆるやかなストリジェントな条件下(2
5% ホルムアミド,42℃,2×SSC)で、もしく
はその代わりに、よりストリンジェントな条件下(50
%ホルムアミド,50℃,2×SSC,又は50%ホル
ムアミド42℃,2×SSC)で(a)のDNA配列と
ハイブリダイズすることができ、生物学的活性のあるI
L−1R分子をコードしているのなら、あるいは、
(a)又は(b)で定義されたDNA配列に対する遺伝
コードの結果生じたDNA配列で、生物学的活性のある
IL−1R分子をコードするものなら、ここで明らかに
した特定のDNA配列に“実質的に類似”している。
【0019】ここで用いられる“組換え”とは、タンパ
ク質が組換え(例えば微生物又はホ乳類の)発現系で得
られることを意味する。“微生物の”とは、細菌または
菌類(例えば酵母)の発現系で作製された組換えタンパ
ク質を指す。産生品として、“組換え微生物の”は、天
然の内在性物質を本質的に含まず、天然の糖鎖付加のな
いタンパク質を定義する。ほとんどの細菌培養、例えば
E.coliで発現されたタンパク質は、グリカンを含
まない。酵母で発現されたタンパク質は、ホ乳類細胞で
発現されたものとは異なるパターンの糖鎖付加を受ける
可能性がある。
【0020】タイプII IL−1Rの特性として本明
細書を通じて用いられている“生物学的活性”とは、測
定可能な量のIL−1、できれば少なくともタイプII
IL−1R1ナノモルあたり、0.01ナノモルのI
L−1を結合できるだけの充分なアミノ酸配列類似性を
SEQ ID NO:2又はSEQ ID NO:13
との間に共有する特定の分子、又は、そのかわりに、例
えば、雑種受容体構造の一部のように、IL−1刺激を
細胞へ伝達できるだけの充分なアミノ酸配列類似性を共
有する特定の分子を意味する。さらに、できれば、本発
明の範囲では生物学的に活性のあるタイプII IL−
1Rは、受容体1ナノモルあたり、0.1ナノモル以上
のIL−1を結合する能力があり、最も望ましくは、受
容体1ナノモルあたり0.5ナノモルのIL−1を結合
することができる。
【0021】“DNA配列”とは、DNA重合体を指
し、1つの分離した断片状又は、より大きなDNA構造
の一部分であり、少なくとも1度は、実質的に純粋な形
状として、すなわち、内在性物質の汚染がなく、そし
て、配列の同定、操作、回収が可能なだけの量を持った
形状で単離されたDNA由来で、例えばクローニングベ
クターを用いた標準生物化学的手法で得たヌクレオチド
配列の部分である。このような配列は、真核生物遺伝子
に特徴的に存在する内在非翻訳領域すなわちイントロン
に中断されないオープンリーディングフレームをもつ形
状で供給されることが望ましい。しかし、適切な配列を
含むゲノムDNAも使用され得ることは明らかである。
非翻訳DNAの配列は、オープンリーディングフレーム
の5′又は3′側に存在し、そこでは、操作又は、コー
ド領域の発現に干渉しない。
【0022】“ヌクレオチド配列”は、デオキシリボヌ
クレオチドのヘチロ重合体を指している。本発明で供給
されたタンパク質をコードするDNA配列は、cDNA
断片及び、短いオリゴヌクレオチドリンカー又は、組換
え転写単位で発現され得る合成遺伝子を供給するための
一連のオリゴヌクレオチドから集められた。
【0023】“組換え発現ベクター”は、(1)例えば
プロモーター又はエンハンサーのような、遺伝子発現制
御をになう単一又は複数の遺伝因子、(2)mRNAに
転写され、タンパク質に翻訳される、構造的あるいは、
コード配列、(3)適当な転写および翻訳開始及び終止
配列、の集まりを含む転写単位を含むプラスミドを指
す。酵母発現系で用いるための構造因子は、宿主細胞に
よって翻訳されたタンパク質が細胞外へ分泌されるよう
になるリーダー配列を含むことが望ましい。かわりに、
リーダー又は輸送配列を持たずに発現された組換えタン
パク質は、N端メチオニン残基を含むかもしれない。こ
の残基は、最終産物を供給するために、発現組換えタン
パク質から任意に、さらに切断されるかもしれない。
【0024】“組換え微生物発現系”とは、例えばE.
coliのような細菌や、S.cerevisiaeの
ような酵母といった、宿主微小有機体の実質的に均質な
単一培養を意味し、それら宿主は、染色体DNA中に組
換え転写単位を安定して組み込んでいるか、もしくは、
常在性プラスミドの構成物の1つとして組換え転写単位
を持っている。一般に、系を構成する細胞は、単独の祖
組換え体の子孫である。ここで定義される組換え発現系
は、DNA配列又は、発現される合成遺伝子に連結した
制御因子の誘導によってヘテロなタンパク質を発現す
る。
【0025】タイプII IL−1Rタンパク質と類似
本発明は単離された組換えホ乳類タイプII IL−1
Rポリペプチドを提供する。本発明におけるタイプII
IL−1Rタンパク質は、例として、霊長類、ヒト、
ネズミ、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ヤギ及びブ
タタイプIIIL−1Rを含んでいる。タイプII I
L−1Rは、ヒト又はマウスタイプII IL−1RD
NA配列から得られた一本鎖cDNAを用いた、種間ハ
イブリダイゼイションによって、例えば、ホ乳類のcD
NAライブラリーから、タイプII IL−1RcDN
Aを単離するために、ヒトクローン75を、ハイブリダ
イゼーションプローブとして用いて、得ることができ
る。多くのホ乳類遺伝子同様、ホ乳類タイプII IL
−1Rは、おそらく複数のエキソンにコードされてい
る。転写後の異なったmRNAスプライシングによって
生じ得る、本特許請求の範囲中にあるcDNAと同一又
は類似性のある広範囲を共有するオールタータティブm
RNA構成物は、本発明の範囲に含まれるとみなされて
いる。IL−IR−II をコードするDNA配列はお
そらく、別のスプライシング配置の形状にあるが、次の
細胞及び組織から単離され得る:Bリンホブラストイド
系(CB23、CB33,ラジ,RPMI1788,A
RH77のようなもの)、休止状態及び特に活性化状態
にある末梢血液T細胞、単球、単球細胞系THP1、好
中球、骨髄、胎盤、内皮細胞、角化細胞(特に活性化状
態)、及びHepG2細胞。
【0026】本発明の範囲内のタイプII IL−1R
の誘導物もまた、生物学的活性のある本来のタンパク質
の様々な構造物形状を含んでいる。例えば、イオン化可
能なアミノ及びカルボキシル基のためタイプII IL
−1Rタンパク質は、酸性又は塩基性の塩として、ある
いは中性の形状をとる可能性がある。個々のアミノ酸残
基も酸化あるいは還元によって修飾を受ける可能性があ
る。
【0027】アミノ酸の一次構造は糖鎖群、脂質、リン
酸、アセチル群、および同様のものといった他の化学的
部分と共有又は擬集結合を形成することで、あるいは変
異型アミノ酸配列を作成することで修飾される可能性が
ある。共有誘導物は特に機能的な群をタイプII IL
−1Rのアミノ酸側鎖又は、N端又はC端に結合するこ
とで調製される。本発明の範囲内でのタイプII IL
−1Rの他の誘導体は、N端又はC端の融合のような組
換え培養における合成によるような、タイプII IL
−1R又はその断片と、他のタンパク質又はポリペプチ
ドの共有又は擬集結合を含んでいる。例えば、結合した
ペプチドは、翻訳と同時に、あるいは翻訳後、タンパク
質を、その合成部位から機能部位へ、細胞膜又は壁の内
側あるいは外側へ輸送するような、タンパク質のN端部
分にあるシグナル(又はリーダー)ポリペプチド配列か
もしれない(例えば酵母のα−因子リーダー)。タイプ
II IL−1Rタンパク質融合は、タイプII IL
−1Rの精製と同定を促進するためのペプチド(例えば
ポリHis)を含むこともできる。タイプII IL−
1Rのアミノ酸配列はまた、ペプチドAsp−Tyr−
Lys−Asp−Asp−Asp−Asp−Lys(D
YKDDDDK)(ホップ(Hopp)ら.,Bio/
Technology 6:1204,1988)と結
合されることも可能である。後者の配列は、高い抗原性
があり、特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合す
る抗体認識部位を供給し、発現された組み換えタンパク
質の素速い分析と、容易な精製を可能にした。この配列
は、また、ウシムコサル エンテキロナーゼ(muco
sal enterokinase)によって、Asp
−Lys対の直後で特異的に切断される。この配列でキ
ャップされた融合タンパク質は、E.coli内で細胞
内消化に耐性になる可能性がある。
【0028】タイプII IL−1R誘導体は、また、
免疫原、受容体に基づいた免疫分析の試薬、あるいは、
IL−1又は他の結合リガンドの親和精製手法のための
結合試薬としても、使用することができる。タイプII
IL−1R誘導体はまた、M−マレイミドベンゾイル
サクシニドエステル及びN−ヒドロキシサクシニドとい
ったシステイン及びリジン残基に働くクロス−リンキン
グ試薬を用いて得られる可能性もある。タイプII I
L−1Rタンパク質は、また、シアノゲンブロマイド、
ビソキシレン、カルボニルジイミダゾール、又は、トシ
ルによって活性化されたアガロース構造といった、様々
な不溶性基質と、反応側基を通じて、あるいは、ポリオ
レフィン表面(グルタルアルデヒド クロスリンキング
の有無にかかわらず)に吸着することで、共有結合され
る可能性をもつ。いったん基質と結合するとタイプII
IL−1Rは(分析又は精製の目的で)抗−タイプI
IIL−1R抗体又はIL−1に選択的に結合するため
に用いることができるかもしれない。
【0029】本発明は、また、天然型糖鎖付加のある、
あるいはない、タイプII IL−1Rも含んでいる。
酵母あるいは、例えばCOS−7細胞といったホ乳類発
現系で発現されたタイプII IL−1Rは、その発現
系に依存して、天然の分子とは、分子量及び糖鎖付加の
型が類似するか、もしくはわずかに異なる可能性があ
る。E.coliのような細菌でタイプII IL−1
RDNAを発現すると、糖鎖付加されない分子が作られ
る。Nグリコシル化部位が不活性化された、ホ乳類タイ
プII IL−1Rの機能変異類似物は、オリゴヌクレ
オチド合成及びライゲーション又は、部位特異的変異導
入技術によって作製することができる。これらの類似タ
ンパク質は、酵母の発現系を用いて、よい収率で均質で
炭水化物還元型で作製されることが可能である。真核生
物タンパク質のN−グリコシル化部位は、3つのアミノ
酸、Asn−A−Zで特徴づけられており、ここでA
は、Proをのぞく任意のアミノ酸で、ZはSer又
はThrである。この配列中に、炭水化物の共有付加用
の側鎖アミノ酸を、アスパラギンが供給している。ヒト
タイプII IL−1RのN−グリコシル化部位の例で
は、SEQ ID NO:1のアミノ酸66−68、7
2−74、112−114、219−221及び277
−279である。このような部位は、Asn又はZ残基
を別のアミノ酸に置換したり、Asn又はZを削除した
り、AとZとの間にZでないアミノ酸を挿入したり、
AsnとAの間にAsn以外のものを挿入することで
減少されることができる。
【0030】タイプII IL−1R誘導体はタイプI
I IL−1R又はそのサブユニットを変異型にするこ
とで得られる。ここで示されているように、タイプII
IL−1R変異体は、タイプII IL−1Rとポリ
ペプチドは類似しているが、天然タイプII IL−1
Rとは欠失、挿入、置換のため、異なったアミノ酸配列
を持っている。
【0031】タイプII IL−1Rタンパク質の生物
学的に同等の類似物は、例えば、残基又は配列の様々な
置換、又は、末端又は内部の生物学的活性に不要な残基
又は配列の欠失、によって作成される可能性がある。例
えば、システイン残基は、再生にあたって、不必要もし
くは間違った分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぐた
め、欠失又は他のアミノ酸と置換されうる。変異導入の
他の手段は、KEX2プロテアーゼ活性が存在する酵母
の系での発現を強めるために、隣接した2価塩基性アミ
ノ酸残基の修飾も含んでいる。一般的に、置換は保存的
でなければならない。すなわち、最も好ましいアミノ酸
置換は、物理化学的性質の似かよった残基を置き換える
ものである。同様に欠失または挿入を行おうとすると
き、生物学的活性に対する欠失又は挿入の与え得る影響
を考慮しなければならない。実質的に類似したポリペプ
チド配列は、上で定義したように、一般に、同じくらい
の数のアミノ酸配列を含むが、可溶性タイプII IL
−1Rを作成するためにC端を切断したものは、より少
ないアミノ酸残基を含むことになる。タイプII IL
−1Rの生物学的活性を保存するために、欠失と置換は
類似した、あるいは保存した置換配列で行われること、
すなわち、当該の残基が生物学的に類似した残基と置換
されることが望ましい。保存した置換の例は、Ile,
Val,Leu,又はAlaを互換するといった、疎水
性残基どうしの置換や、LysとArg,GluとAs
n,GlnとAsnといった極性残基どうしの置換を含
んでいる。例えば類似した疎水性を持つ領域全体の置換
といった、その他の保存した置換もよく知られている。
さらに、ヒト、ネズミ、及びその他のホ乳類のタイプI
IIL−1Rの間で異なっている特定のアミノ酸は、タ
イプII IL−1Rの本質的な生物学的特性を変える
ことのない、更なる保存した置換を示唆している。
【0032】タイプII IL−1Rのサブユニット
は、末端あるいは内部の残基又は配列を欠失させて作製
できる。本発明は、例えば、タイプII IL−1Rの
細胞外領域の全部又は一部に相当する可溶性タイプII
IL−1Rを生じるC端欠失を意図している。生じる
タンパク質はIL−1に結合能があることが望ましい。
特に望ましい配列は、タイプII IL−1Rの膜貫通
領域と細胞内領域が欠失しているか、親水性残基に置換
しており、受容体の細胞培養液への分泌を促進する配列
である。可溶性タイプII IL−1Rタンパク質は、
細胞から可溶性タイプII IL−1Rタンパク質が分
泌可能であるならば、膜貫通領域を一部含んでいる可能
性がある。例えば、可溶性ヒトタイプII IL−1R
は、SEQID NO:1のアミノ酸配列1−333又
は1−330を含み、SEQ ID NO:12のアミ
ノ酸配列1−345及び1−342を含んでいるかもし
れない。かわりに可溶性タイプII IL−1Rタンパ
ク質はIL−1結合に必要でない細胞外領域中のタイプ
II IL−1RのC端領域の欠失から得られたかもし
れない。例えば、SEQ ID NO:1及びSEQ
ID NO:12の配列で、それぞれ313、及び32
5アミノ酸以降を持つようなタンパク質を作成するため
にC端欠失が行われたかもしれない。これらのアミノ酸
はシステインで、タイプII IL−1R分子の3次構
造を保つのに必要であると信じられており、タイプII
IL−1R分子がIL−1に結合するのを許してい
る。可溶性タイプII IL−1R構造は、タイプII
IL−1RをコードするDNAの3′領域を欠失さ
せ、適当な発現ベクターにDNAを挿入し、発現させ
た。このような可溶性タンパク質の構築の典型的な方法
は実施例2及び4に述べている。生じたタイプII I
L−1Rタンパク質は、実施例5で述べるように、IL
−1に結合する能力を測定される。このような、可溶性
タイプII IL−1RをコードするDNA配列及びこ
のような構造から生じる生物学的活性のある可溶性タイ
プII IL−1Rタンパク質は、どちらも本発明の範
囲内に含まれるよう意図されている。
【0033】タイプII IL−1R類似物の発現用に
作製されたヌクレオチド配列中の変異は、当然、コード
配列の読み枠の相を保存しており、受容体mRNAの翻
訳に負に影響するような、ループ、ヘアピンといったm
RNAの2次構造を生じるようにハイブリダイズ可能な
相補領域を生じないことが望ましい。変異を導入する部
位は前もって決定されるが、変異それ自体の性質が前も
って決定される必要はない。例えばある部位の変異の最
適の性質を選択するために、標的コドンに対するランダ
ムな変異導入が行われ、発現された変異型タイプII
IL−1Rは望ましい活性を持つものがスクリーニング
される。
【0034】タイプII IL−1Rをコードするヌク
レオチド配列中のすべての変異が、最終産物として発現
されるわけではない。例えば、ヌクレオチドの置換は、
発現を強め、基本的に、転写されたmRNA中のループ
等の2次構造を避けるように起きる(EPA75,44
4A参照、参考文献でここに含まれている)か、例えば
有名なE.coliの発現用のE.coliが好むコド
ンのような、選択された宿主によってより素早く翻訳さ
れるようなコドンを供給するように、起きる。
【0035】変異は、本来の配列の断片とライゲーショ
ンできるような制限酵素部位を横に持った、変異配列を
含む合成オリゴヌクレオチドによって、意図した位置へ
導入することができる。ライゲーション後、生じた再構
築された配列は、目的のアミノ酸の挿入、置換、欠失を
持った類似物をコードする。
【0036】そのかわりに、オリゴヌクレオチドを用い
た部位特異的変異導入法を用いて必要な置換、欠失、挿
入を持つように変化させた特別のコドンを持つ、改変遺
伝子を作製することもできる。上述した改変を作製する
典型的方法は、ワルダー(Walder)ら、(Gen
e42:133,(1986);ボイヤ−(Baue
r)ら,(Gene37:73,1985);クレイク
(Craik)(Biotechniques,Jan
uary1985,12−19);スミス(Smit
h)ら(Genetic Engineering:p
rinciplesand Methods,Plen
um Press,1981);によって明らかにさ
れ、そして米国特許4,518,584号及び4,73
7,462号は適切な技術を開示し、参考文献中に編入
されている。
【0037】タイプII IL−1Rの単価型及び多価
型のどちらも、本発明における組成物及び方法の点で有
用である。多価型はIL−1リガンドに対する複数のタ
イプII IL−1R結合部位を持っている。例えば2
価の可溶性タイプII IL−1Rは、リンカー領域で
分離された、タイプII IL−1Rの細胞外領域の2
つの縦方向くり返し構造をとっている。その他の多価型
も、例えば臨床用として使用可能な担体一般、フィコー
ル、ポリエチレングリコール、又はデキストランを含む
群から選択した重合体に、従来のカップリング技術を用
いて、タイプII IL−1Rを化学的に結合させたも
のも作製される可能性がある。かわりに、タイプII
IL−1Rは、ビオチン化学的に結合されると、ビオチ
ン−タイプII IL−1Rは次にアビジンと結合し、
アビジン/ビオチン/タイプIIIL−1R分子の4量
体が生じる。タイプII IL−1Rは、またジニトロ
フェノール(DNP)又は、トリニトロフェノール(T
NP)と共有結合し、生じる複合体は抗DNP又は抗T
NP−IgMで沈降され、タイプII IL−1R結合
サイトが10価ある10価複合体を形成する。
【0038】タイプII IL−1R配列を免疫ブロブ
リン分子の重鎖又は軽鎖のどちらか一方又は両方と置換
し、修飾を受けない不変領域を持つことで、組換えキメ
ラ抗体を作製可能である。例えば、タイプII IL−
1R/IgGキメラは、2つのキメラ遺伝子−タイプ
II IL−1R/ヒトκ軽鎖キメラ(タイプIIIL
−1R/Cκ)及びタイプII IL−1R/ヒトγ
重鎖キメラ(タイプII IL−1R/Cγ−1)−か
ら生じる。2つのキメラ遺伝子の転写及び翻訳の後、遺
伝子産物は、タイプII IL−1Rを持つ1つキメラ
抗体分子に集合し、2価を示す。このようなタイプII
IL−1Rの多価型はIL−1リガンドに対して強め
られた結合親和性を持つであろう。このようなキメラ抗
体分子の構築に関する更なる詳細は、WO89/096
22及びEP315062に開示されている。
【0039】組換えタイプII IL−1Rの発現 本発明はタイプII IL−1RをコードするDNAを
増幅、又は、発現させるための組換え発現ベクターを提
供する。組換え発現ベクターはホ乳類タイプII IL
−1R又はその生物学的類似物をコードする、合成又は
cDNA由来のDNA断片を持ち、ホ乳類、微生物、ウ
イルス又は昆虫由来の適切な転写又は翻訳調節因子と、
実行可能なように結合した、複製可能なDNA構造物で
ある。転写単位は一般に、(1)例えば転写プロモータ
ー又はエンハンサーのように、遺伝子発現制御をにな
う、単一又は複数の遺伝因子、(2)mRNAに転写さ
れ、タンパク質に翻訳される、構造的あるいは、コード
配列、(3)適当な転写および翻訳開始および終止配
列、の集まりを含むが、それについては以下で詳細に記
述する。そのような制御因子は、転写を制御するオペレ
ーター配列、すなわち、適切なmRNAリボソーム結合
部位をコードする配列を含むかもしれない。通常複製開
始点によって得られる宿主中での複製能、及び形質転換
体の認識を促進するための選択遺伝子も付加的に含まれ
ている。DNA領域は、機能的に互いに関連している場
合は、実行可能に結合されている。例えば、シグナルペ
プチド(分泌リーダー)DNAは、もしポリペプチドの
分泌を担う前駆体として発現されるなら、ポリペプチド
のDNAに実行可能に結合されている。プロモーター
は、もし、配列の転写を制御するなら、コード配列に、
実行可能に結合されている。あるいは、リボソーム結合
部位は、もし、翻訳を許すために加えられているなら、
コード配列に実行可能に結合されている。一般的に、実
行可能に結合されている、とは、連続的に、そして分泌
リーダーの場合は、連続的かつ読み枠に合って結合して
いることを意味する。酵母発現系において用いようとす
る構造因子は、宿主細胞によって翻訳されたタンパク質
が細胞外に分泌されることを可能にするリーダー配列を
含むことが望ましい。かわりに、組換えタンパク質がリ
ーダー又は輸送配列なしで発現した場合、N端メチオニ
ン部位を含むことになる。この残基は、最終産物を供給
するために発現された組換えタンパク質から続いて任意
に切断される。
【0040】微小有機体で発現されることになる、ホ乳
類タイプII IL−1RをコードするDNA配列は、
mRNAへのDNAの転写を未熟なうちに停止させ得
る。しかし、転写の未熟な停止は、望ましい。例えば、
細胞膜に結合しない可溶性受容体を得るために、例えば
膜貫通部分を欠失した有利切断されたC端を持つ変異体
が得られる場合などである。コードが縮重しているた
め、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に
はかなりの変化が起こり得る。他の態様はゆるやかなス
トリンジェントな条件(50°C,2×SSC)下でク
ローン75とハイブリダイズできる配列及び、生物学的
に活性のあるタイプII IL−1Rポリペプチドをコ
ードするものとハイブリダイズするか、あるいは、縮重
している配列を含んでいる。
【0041】組換えタイプII IL−1RDNAは、
染色体DNA中に組換え転写単位を(形質転換又は形質
導入によって)安定して組み込んでいるか、もしくは、
常在性プラスミドの構成物の1つとして組換え転写単位
を持っているような、例えば、E.coliのような細
菌や、S.cerevisiaeのような酵母といっ
た、宿主微小有機体の実質的に均質な単一培養を含む組
換え発現系の中で発現されるか、増幅される。一般に、
系を構成する細胞は、単一の祖形質転換体の子孫であ
る。ここで定義された組換え発現系は、発現されるべき
DNA配列または、合成遺伝子に結合した制御因子の誘
導によって異種タンパク質を発現するであろう。
【0042】形質転換された宿主細胞は、組換えDNA
技術を用いて構築されたタイプIIIL−1Rベクター
で形質転換または形質導入された細胞である。形質転換
された宿主細胞は通常、タイプII IL−1Rを発現
するが、タイプII IL−1RDNAをクローニング
又は増幅させるために形質転換された宿主細胞は、タイ
プII IL−1Rを発現する必要がない。発現された
タイプII IL−1Rは、選択されたタイプII I
L−1RDNAに依存して、細胞膜に置かれるが、培養
液上清に分泌される。ホ乳類タイプII IL−1Rの
発現用にふさわしい宿主細胞には、適切なプローモータ
ーの制御下にある原核生物、酵母あるいはより高等な真
核細胞が含まれる。原核生物は、例えばE.coli又
はバチルスといった、グラム陰性又はグラム陽性菌が含
まれる。高等真核細胞は、下に記述するような、ホ乳類
由来の確立された細胞系を含んでいる。本発明のDNA
構成物から得られたRNAを用いて、無細胞系によって
ホ乳類タイプII IL−1Rを産生することも可能で
ある。細菌、菌類、酵母及びホ乳類宿主細胞は、ポウウ
エルス(Pouwels)らによって記述されており
(CloningVectors:A Laborat
ory Manual,Elsevier,New Y
ork,1985)、それに関連する開示はこの中で参
考文献中に含まれている。
【0043】大規模なタンパク質分解及びジスルフィド
反応を必要としないタイプII IL−1Rの発現のた
めには、原核生物の発現宿主細胞が使用される。原核細
胞の発現ベクターは一般に、例えば、抗生物質耐性を賦
与するタンパク質をコードする遺伝子や、栄養要求性を
補う遺伝子、といった、1つまたはそれ以上の表現型を
持つ選択マーカーと、宿主内での増幅を保証する、宿主
が認識する複製開始点を含んでいる。形質転換にふさわ
しい原核宿主生物は、E.coli,Bacillus
subtilis,Salmonella typh
imurium及び、Pseudomonas,Str
eptomyces及びStaphyolococcu
s属に含まれる様々な種が含まれるが、その他のものも
選択の問題で用いられる。
【0044】細菌用の有用な発現ベクターは、よく知ら
れたクローニングベクターpBR322(ATCC37
017)の遺伝因子を含む市販の入手可能なプラスミド
由来の、選択マーカーと細菌の転写開始点を含みうる。
そのような市販されているベクターは例えば、pKK2
23−3(Pharmacia Fine Chemi
cals,Uppsala,Sweden)及びpGE
M1(PromegaBiotec,Madison,
WI,USA)を含んでいる。これらpBR322を
“背骨”とする種類は、適切なプロモーターと、発現さ
れるべき構造遺伝子が組合わさっている。E.coli
は、あるE.coli種から得られたプラスミドである
pBR322の誘導体を用いて典型的に形質転換される
(ボリバー(Bolivar)ら,Gene2:95,
1977)。pBR322はアンピシリン及びテトラサ
イクリン耐性遺伝子を含み、形質転換された細胞の同定
が容易になっている。
【0045】組換え微生物発現ベクターで一般に用いら
れているプロモーターは、β−ラクタマ−ゼ(ペニシリ
ナ−ゼ)及びラクロースプロモーター系(チャンら(C
hang),Nature275:615,1978及
びゴッデル(Goeddel)ら,Nature28
1:544,1979)トリプトファン(trp)プロ
モーター系(マニアティス(Maniatis),Mo
lecular Cloning:A Laborat
ory Manual,Cold SpringHar
bor Laboratory,p.412,198
2)を含んでいる。特に便利な細菌の発現系は、λファ
ージPプロモーター及びcI857ts温度依存リプ
レッサーを利用している。λPプロモーターの誘導体
を含む、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ンから入手可能なベクターは、E.coliJMB9
(ATCC37092)株に常在するpHUB2プラス
ミド、及びE.coliRR1株(ATCC5308
2)に常在するpPLc28プラスミドを含んでいる。
【0046】組換えタイプII IL−1Rタンパク質
は、酵母宿主細胞中、とりわけ、S.cerevisi
aeのような、Saccharomyces種において
も発現される。PichiaあるいはKluyvero
mycesといった他の属の酵母もまた、利用される。
酵母のベクターは一般に酵母2μプラスミド由来又は、
自律転写配列(ASR)由来の複製開始点、プロモータ
ー、タイプII IL−1RをコードするDNA、ポリ
アデニル化のための配列及び転写終結と、選択遺伝子を
含んでいる。好適には、酵母のベクターは複製開始点を
含み、酵母にも、E.coliにも、形質転写できるよ
うな、例えば、E.coliのアンピシリン耐性遺伝子
及び、S.cerevisiaeのトリプトファン中で
は生育できない酵母の変異株の選択マーカーになる、T
RP1あるいはURA3遺伝子、そして、下流の構造遺
伝子の転写を誘導するための、高発現の酵母の遺伝子由
来のプロモーターを含むことが望ましい。したがって、
酵母宿主細胞のゲノム中にTRP1又はURA3の損傷
が存在すると、トリプトファンまたはウラシルの欠落し
た中での生育によって、形質転換を検出する効果的な環
境を与えることになる。
【0047】酵母ベクター中の適切なプロモーター配列
は、メタロチオネイン、3−ホスフォグリセレートキナ
ーゼのプロモーター(ヒッツェマン(Hitzema
n)ら.,J.Biol.Chem.255:207
3,1980)又は、他のエノラーゼ、グリセルアルデ
ヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナ
ーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクト
キナーゼ、グルコース−6−ホスフェートイソメラー
ゼ、3−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナ
ーゼ、トリオセホスフェイトイソメラーゼ、ホスホグル
コースイソメラーゼ及びグルコキナーゼといった解糖系
酵素のプロモーター(ヘス(Hess)ら,J.Ad
v.Enzyme Reg.7:149,1968;及
びホランド(Holland)ら,Biochem.1
7:4900,1978)を含む。酵母発現系で用いる
のに適切なベクター及びプロモーターについて、R.ヒ
ッツェマン(R.Hitzeman)ら.,EPA7
3、657に更に述べられている。
【0048】望ましい酵母のベクターは、E.coli
における選択と複製のための(Ampγ遺伝子及び複製
開始点)pUC18由来のDNA配列と、グルコースで
抑制できるADH2プロモーターと、α−因子分泌リー
ダー配列を含む酵母DNAから組み立てることができ
る。ADH2プロモーターに関してはラッセル(Rus
sell)ら,(J.Biol.Chem.258:2
674,1982)及びベイヤー(Beier)ら,
(Nature300:724,1982)によって記
述されている。異種タンパク質の分泌を促す酵母α−因
子のリーダー配列は、プロモーターと発現するべき構造
遺伝子の間に挿入することができる。例えば、クルジャ
ン(Kurjan)ら,Cell30:933,198
2;及びビッテル(Bitter)ら.,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA81:5330,1
984を参照されたい。リーダー配列は、その3′端
に、リーダー配列と外来遺伝子の融合を促進する1つか
それ以上の制限酵素部位を持つように改変されるかもし
れない。 適切な酵母形質転換法は、当業者に知られて
いる;典型的な技法は、ハイネン(Heinnen)
ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA7
5:1929,1978に記述されており、Trp
質転換体の選択に、0.67%イーストナイトロジェン
ベース,0.5%カザミノ酸,2%グルコース,10μ
g/mlアデニン及び20μg/mlウラシルを含む選
択培地;又は、URA形質転換体用には、0.67%
YNBと、シェルマン(Sherman)ら,Labo
ratory Course Manual for
Methods in Yeast Genetic
s,Cold Spring Harbor Labo
ratory,Cold Spring Harbo
r,New York,1986に記述されているよう
にアミノ酸と塩基を加えた培地を用いている。
【0049】ADH2プロモーターから成るベクターに
より形質転換された宿主の株は、発現のために、80μ
g/mlアデニンと80μg/mlウラシルを補われ
た、1%酵母エキストラクト、2%ペプトンそして1%
または4%グルコースから成る富栄養培地で増殖される
こともあるだろう。粗酵母の上清を濾過より回収し、更
に精製するまで4℃に保持しておく。
【0050】組換えタンパク質を発現させるために、様
々な哺乳類あるいは昆虫の培養細胞系も有利に用いられ
る。哺乳類の細胞における組換えタンパク質の発現は、
作られたタンパク質が一般的に正しく折りたたまれ、適
切に修飾され完全に機能的であるということから、特に
好まれる。適した哺乳類の細胞系の実施例は、グルツマ
ン(Gluzman)により記述された(Cell2
3:175,1981)、サルの腎臓の細胞からのCO
S−7系統、及び例えばL細胞、C127,3T3,チ
ャイニーズ ハムスター オバリー(CHO),Hel
aそしてBHK細胞系を含めた適当なベクターを発現す
ることのできる他の細胞系を含んでいる。哺乳類の発現
ベクターは、複製開始点、発現される遺伝子につながっ
た適当なプロモーター及びエンハンサー、そして5′ま
たは3′に隣接した非転写配列のような非転写要素とリ
ボゾーム結合サイト、ポリアデニル化サイト、スプライ
シングドナー及びアクセプターサイト、そして転写終了
配列のような5′または3′非翻訳配列を含むこともあ
るだろう。昆虫の細胞でヘテロなタンパク質を生産する
ためのバキュロウイルス(Baculovirus)の
系についてはルカウ(Luckow)とサマーズ(Su
mmers)によるレビューがある、Bio/Tech
nology6:47(1988)。
【0051】セキツイ動物の細胞を形質転換するのに用
いられることになる発現ベクターでの転写及び翻訳制御
の配列は、ウイルスのソースから提供されることもある
だろう。例えば、最もよく用いられるプロモーター及び
エンハンサーは、ポリオーマ、アデノウイルス2、シミ
アンウイルス40(SV40)及びヒトサイトメガロウ
イルス由来である。SV40ウイルスゲノム由来のDN
A配列、例えばSV40オリジン、初期及び後期プロモ
ーター、エンハンサー、スプライシングそしてポリアデ
ニル化サイトは、ヘテロなDNA配列の発現に要求され
る他の遺伝子要素を供給するために用いられることもあ
るだろう。初期及び後期プロモーターは、共にSV40
ウイルス複製オリジンも含んだ断片としてウイルスから
容易に得られるので、特に有用である(フィアーズ(F
iers)ら.,Nature273:113,197
8)。ウイルス複製開始点に位置しているHind3サ
イトからBgllサイトへの約250bpの塩基配列を
含んでいるならば、より小さなあるいはより大きなSV
40断片も用いられることがあると思われる。更に、哺
乳類のジェノミックタイプII のIL−1Rプロモー
ター、コントロール、そして/またはシグナル配列が、
そうしたコントロール配列が、選択された宿主の細胞と
おりあうならば利用されることもあるだろう。組換えた
哺乳類タイプII IL−1Rを生産する哺乳類高発現
ベクターについての更なる詳細は、以下の実施例2で示
される。典型的なベクターは、オカヤマ及びバーグ(B
erg)により発表されたようにして構築することがで
きる(Mol.Cell.Biol.3:280,19
83)。
【0052】C127マウス乳腺上皮細胞において、哺
乳類のレセプターcDNAを安定に高レベルで発現させ
るのに有用な系は、実質的にコスマン(Cosman)
らにより記述されたようにして作製することができるだ
ろう(Mol.Immunol.23:935,198
6)。
【0053】本発明の利点においては、タイプII I
L−1RcDNAを含む組換え発現ベクターが安定に宿
主細胞のDNAにインテグレートされることである。発
現産物の上昇したレベルは、ベクターDNAの数が増幅
された細胞系を選択することにより、達成される。ベク
ターDNAの数が増幅された細胞系は、例えば、既知の
薬剤により阻害される酵素をコードしたDNA配列を含
むベクターで宿主の細胞を形質転換することにより選択
される。ベクターは、また、目的とするタンパク質をコ
ードしているDNA配列を含んでいてもよい。また、宿
主細胞を、目的とするタンパク質をコードしているDN
A配列を含む第2のベクターでコトランスフォーム(C
otransform)してもよい。トランスフォーム
あるいはコトランスフォームした宿主の細胞を、それか
ら、既知の薬剤の濃度を増やしながら培養し、それによ
り、薬剤耐性の細胞を選択する。そのような薬剤耐性の
細胞は、しばしば、酵素をコードしている遺伝子の増幅
の結果として、薬剤により阻害される酵素の過剰生産に
より毒性の薬剤の濃度が増加しても生き残る。阻害され
る酵素をコードしているベクターDNAのコピー数の増
加により薬剤耐性が生じている場合は、宿主細胞のDN
Aで目的とするタンパク質(例:タイプIIIL−1
R)をコードしているベクターDNAの随伴性の共増幅
が存在している。
【0054】そのような共増幅のためのより好ましい系
は、薬剤メトレキセート(MTX)により阻害されうる
ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)の遺伝子を用い
ている。共増幅を達成するため、DHFRをコードして
いる活性のある遺伝子を欠いている宿主細胞を、DHF
R及び目的とするタンパク質をコードするDNA配列を
含むベクターでトランスフォームするか、もしくは、D
HFRをコードしているDNA配列を含むベクターと目
的とするタンパク質をコードするDNA配列を含むベク
ターとでコトランスフォームする。トランスフォームま
たはコトランスフォームした宿主細胞を、増加したレベ
ルのMTXを含む培地で培養して、生き残った細胞系を
選択する。
【0055】特に好ましい共増幅の系は、グルタミン酸
とアンモニアから、ATPをADPとリン酸に加水分解
して反応を進ませてグルタミンを合成するのにあずかっ
ているグルタミン合成酵素(GS)の遺伝子を用いてい
る。GSは様々な阻害剤、例えばメチオニンスルフォキ
シイミン(MSX)により阻害を受ける。従って、タイ
プII IL−1Rは、GSと目的とするタンパク質の
DNA配列から成るベクターでトランスフォーム、ある
いはGSをコードしたDNA配列を含むベクターと目的
とするタンパク質をコードしたDNA配列を含むベクタ
ーとでコトランスフォームした細胞を共増幅させ、増加
したレベルのMSXを含む培地で宿主細胞を培養し、生
き残った細胞を選択することにより高濃度で発現される
ことができる。GS共増幅システム、適当な組換え発現
ベクター及び細胞系は以下のPCT出願に記述されてい
る:WO87/04462,WO89/01036,W
O89/10404及びWO86/05807。
【0056】組換えタンパク質は、チャイニーズハムス
ターオバリー(CHO)細胞のような哺乳類細胞系統、
あるいはまたSP2/O−Ag14がNSOのようなマ
ウスミエローマ細胞系もしくはYB2/3.0−Ag2
0のようなラットミエローマ細胞系(PCT出願WO/
89/10404及びWO86/05807にて開示さ
れている)でも、DHFRがGSの共増幅により好まし
く発現されている。
【0057】タイプII IL−1RDNAの発現のた
めのより好ましい真核細胞のベクターは以下の実施例2
で開示される。このベクターはpDC406と名づけら
れているが、哺乳類の高発現ベクターpDC201由来
で、SV40、HIV及びEBVからの制御配列を含ん
でいる。
【0058】組換え体タイプII IL−1Rの精製 本発明のDNAの翻訳産物を発現する適当な宿主/ベク
ター系を培養し、その培地又は細胞抽出液から精製を行
うことにより、精製哺乳類タイプII IL−1R又は
そのアナログが調製される。
【0059】例えば、組換え体可溶性タイプII IL
−1Rタンパク質を培地中に分泌する系での上澄は、初
めに商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例
えば、アミコン(Amicon)又はミリポア ペリコ
ン(Millipore Pellicon)限外濾過
ユニットを用いて濃縮され得る。濃縮に続き、濃縮液は
適当な精製担体にアプライされる。例えば、適当なアフ
ィニティー担体は、IL−1又はレクチンあるいは抗体
分子を適当な支持体にに結合させたものから成る。別法
として、例えば、ジエチルアミノエチル(DEAE)付
加を有する担体又は基質のような陰イオン交換樹脂も用
いられ得る。担体としては、アクリルアミド、アガロー
ス、デキストラン、セルロースあるいはタンパク質精製
に一般に用いられる他のタイプのものを使用できる。適
当な陽イオン交換体は、スルホプロピル基又はカルボキ
シメチル基を含む多様な不溶性担体を含む。スルホプロ
ピル基がより好ましい。
【0060】最終的に、疎水性逆相高速液体クロマトグ
ラフィー(RP−HPLC)担体、例えば、メチル基あ
るいは他の脂肪族基の付加を有するシリカゲル、を用い
た1回あるいはそれ以上のRP−HPLCを行って、さ
らに、タイプII IL−1R構成物を精製でき得る。
上述の精製操作のいくつか又はすべては、多様な組合わ
せにより、同種の組換えタンパク質の調製にも用いられ
得る。
【0061】バクテリアの培養で作られた組換えタンパ
ク質は通常、初めに細胞ペレットからの抽出により分離
され、1回又はそれ以上の濃縮、塩析、水相イオン交換
あるいはサイズ排除クロマトグラフィー操作が行われ
る。最後に高速液体クロマトグラフィー(HPLC)が
最終精製操作として行われ得る。組換え哺乳類タイプI
I IL−1Rの発現に用いた微生物の細胞は、凍結−
融解サイクリング、ソニケーション、機械的破壊、又は
細胞溶菌試薬の利用を含むいかなる簡便な方法によって
も破壊され得る。
【0062】分泌タンパク質として可溶性哺乳類タイプ
II IL−1Rを発現する酵母の発酵は精製を著しく
簡便化する。ラージスケールの発酵から生じた分泌組換
えタンパク質はアーダルら(Urdal et a
l.)(J.Chromatog.296:171,1
984)により開示されたのと類似の手法により精製さ
れ得る。この引用文献は、調製用HPLCカラムで、組
換えヒトGM−CSFの精製を行うための、連続した2
回の逆相HPLC操作を記述している。
【0063】組換え体培養中で合成されたヒトタイプI
I IL−1Rは、培養中からヒトタイプII IL−
1Rを回収するための精製操作に依存する、タンパク質
を含む非ヒト細胞成分の量や性質によって格付けされ
る。これらの成分は通常、酵母、原核生物又は非ヒト高
等真核生物起源のもので、重量にして約1%未満の程度
で、存在が無害な夾雑物質量であることが望ましい。さ
らに、組換え体細胞培養は、例えば細胞内、細胞滲出液
又は体液中のような天然起源では通常タイプIIIL−
1Rと結合しているタンパク質を含まない、タイプII
IL−1Rの製造を可能にする。
【0064】組換え体可溶性タイプII IL−1Rの
治療投与 本発明は、有効量の可溶性タイプII IL−1Rタン
パク質と適当な希釈液及びキャリアー(担体)から成る
治療用構成品を使用する方法、並びに有効量の可溶性タ
イプII IL−1Rタンパク質の投与によって、ヒト
のIL−1依存免疫反応で抑制する方法で提供する。
【0065】治療用には、患者、望ましくはヒトに、精
製可溶液タイプII IL−1Rタンパク質を徴候に応
じた適切な処理により投与する。従って、可溶性タイプ
IIIL−1Rタンパク質構成品は丸薬注入、連続的点
滴、インプラントからの持続的放出又は他の適切な技法
により投与され得る。典型的には、可溶性タイプII
IL−1R治療薬は生理的に受容可能なキャリアー、賦
形剤又は希釈液と結合させた精製タンパク質から成る構
成品の形で投与される。このようなキャリアーは使用量
及び濃度で受容者に対し毒性の無いものである。一般
に、このような構成品の調製は、タイプII IL−1
Rをバッファー、アスコルビン酸のような酸化防止剤、
低分子量(約10残基以下)のポリペプチド、タンパク
質、アミノ酸、ブドウ糖、ショ糖又はデキストリンを含
む炭水化物、EDTAのようなキレート剤、グルタチオ
ン並びに他の安定剤及び賦形剤との組み合わせを伴う。
中性の緩衝塩水又は同種の血清アルブミンを混合させた
塩水が典型的な、適当な希釈液である。好ましくは、製
品は希釈液として適当な賦形剤液(例えばショ糖)を用
いた凍結乾燥品として定型化されるのが良い。適切な投
与量は試験により決定され得る。一般に、shuIL−
1R投与量は約1mg/kg/日から約10mg/kg
/日で、好ましくは約500μg/kg/日から約5m
g/kg/日で生理作用を誘導することが期待される。
【0066】IL−1R−1とタイプII IL−1R
タンパク質は双方ともIL−1Rに結合するため、可溶
性タイプII IL−1Rタンパク質は同一ではないに
しても、同様の治療上の活性が期待される。例えば、可
溶性ヒトタイプII IL−1Rは例えばヒトの免疫反
応で抑制する目的に投与され得る。同種移植拒絶及び移
植片対被植者間の反応を含め、多様な病気及び症状がア
ロ抗原に対する免疫反応に起因する。アロ抗原で誘導さ
れる免疫反応では、shuIL−1RはT細胞活性化を
引き起こすリンパ球増殖及び炎症を抑制する。従ってs
huIL−1Rは、例えば同種移植(皮膚、腎臓、心臓
移植のようなもの)並びに骨髄移植を受けた患者の移植
片−被植者間の反応などの臨床処置において、アロ抗原
によって誘導される免疫反応を有効に抑制するのに用い
られる。
【0067】可溶性ヒトタイプII IL−1Rは、自
己固有のものとして認識されない抗原に対するT細胞の
活性化に依存するリウマチ様関節炎、糖尿病及び多発性
硬化症などの自己免疫機能不全の臨床処置にも用いられ
得る。
【0068】以下の実施例は例証として示され、制限的
なものではない。
【0069】
【実施例1】CV−1/EBNA−1細胞内での活性タンパク質の直
接的発現によるヒトタイプII IL−1Rをコードす
るcDNAの単離 A.rIL−1βのラジオラベル 組換えヒトIL−1
βを、クローンハイムら(Kronheim et a
l.)により記載されたように、大腸菌(E.col
i)で発現し同室になるように精製して、調製した。
(Bio/Technology4:1078,198
6)IL−1βをジ−ヨード(125I)ボルトン−ハ
ンター(Bolton−hunter)試薬(New
England Nuclear,Glenolde
n,PA)でラベルした。10ulのリン酸(0.01
5mol/L)緩衝塩溶液(PBS:0.15mol/
L),pH7.2に懸濁した10マイクログラム(0.
57nmol)のタンパク質をホウ酸ナトリウム(0.
1mol/L)−緩衝塩溶液(0.15mol/L)、
pH8.5,10uLと混合し、ボルトン−ハンター試
薬1mCi(0.23nmol)と製造業者の指示に従
い、8℃で12時間反応した。次に、2%ゼラチン30
uLと1mol/Lグリシン エチル エステルを加
え、タンパク質を1mL容量BiogelTMP6カラ
ム(Bio−Rad Laboratories,Ri
chmond,CA)にかけて未反応のボルトン−ハン
ター試薬から分離した。常に50%から60%のラベル
の結合がみられた。ヨードラベルは1×1015から5
×1015cpm/mmol−1(0.4から2原子I
タンパク質分子あたり)の範囲の比活性を生じ、ドデシ
ル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気永動
(SDS−PAGE)により、17.5kDの一種のラ
ベルされたポリペプチドが検出され、その分子量はIL
−1の既に報告されている値と一致した。ラベルしたタ
ンパク質は98%以上TCA沈殿可能であり、これによ
りI125はタンパク質に共有結合していることが示唆
された。
【0070】B.CB23cDNAライブラリーの作成
とスクリーニング SV40、ヒト免疫不全ウィルス
(HIV)及びエプシュタイン−バー(Epstein
−Barr)ウィルス(EBV)の調節配列を含む哺乳
類発現ベクター(pDC406)を使用して、集めてお
いたcDNAクローンのサル腎臓細胞系CV−1/EB
NA−1(以下に示すようにCV−1細胞系をEBNA
−1をコードする遺伝子で形質転換したものに由来す
る)での直接的発現により、CB23ライブラリーを作
成及びスクリーニングした。CV−1/EBNA−1細
胞系は、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)の直接初
期からきくエンハンサー/プロモーターによって制御を
うけてEBV核抗原−1を構造的に発現しており、従っ
てEBV複製起源を含むpDC406のような発現ベク
ターの自律複製を可能にする。使用した発現ベクターは
pDC406で、HAV−EO由来でドーワーら(Do
weret al.,J.Immunol,142:4
314,1989)に記載されており、それは今度はp
DC201由来で、CV−1/EBNA−1細胞系中で
高レベル発現が可能である。pDC406はHAV−E
O(ドーワーら、前出)とはHAV−EO中の2型アデ
ノウィルスの3部リーダー配列中のイントロンがないと
いう点が異なる。
【0071】CB23cDNAライブラリーは、大体
は、アウスベルら(Ausubelet al.),e
ds.,Current Protocols in
Molecular Biology,Vol.1,1
987に記載してあるようにして、B細胞リンパ胸腺系
CB23から抽出した全RNAより分離してポリ(A)
mRNAを逆転写して作成した(ベンジャミンとドー
ワー(Benjamin & Dower),Bloo
d75:2017,1990)。CB23細胞系はEB
V感染索状血球(CB)リンパ細胞系であり、ベンジャ
ミンら(Benjamin et al.)Proc.
Natl.Acad.Sci.USA81:3547,
1984記載の方法を用いて派生された。ポリ(A)
mRNAをオリゴdTセルロースクロマトグラフィーに
より分離し、大体、グブラーとホフマン(Gubler
and Hoffman),Gene25:263、
1983の記述に従い、二重鎖cDNAを作成した。簡
単に言うと、ポリ(A)mRNAを、ランダム 6ヌ
クレチドをプライマーとして利用して逆転写酵素によ
り、RNA−cDNAハイブリッドに変えた。その後D
NAポリメラーゼIと共同でRNAアーゼHを使用し、
RNA−cDNAハイブリッドを二重鎖cDNAに変え
た。その結果生じた二重鎖cDNAをT4DNAポリメ
ラーゼで平滑端にした。逆の2重のリン酸化していない
オリゴヌクレオチドをアニールし、生じた平滑端cDN
Aの末端とDNAリガーゼで平滑端ライゲーションをハ
イメルら(Haymerle et al.)Nucl
eic Acids Research,14:861
5,1986の記述に従い行った。
【0072】
【0073】この場合24マーのオリゴしかcDNAに
ライゲーションしないと予測される。ライゲーションし
ていないオリゴを68℃でゲル濾過クロマトグラフィー
により除去し、cDNA上に24ヌクレオチド非自己相
補的突出部分を残した。同様の方法を用いて、哺乳類発
現ベクターpDC406SalI切断5′端をcDNA
に付加したものと相補的な24ヌクレオチド突出部分に
変えた。アダプター付ベクターとcDNAをT4ポリヌ
クレオチドキナーゼ存在下で最適比率でライゲーション
した。ライゲーション混合物を透析しE.coli株D
H5αにエレクトロポレーションした。約3.9×10
クローンが生じ、約3000個ずつの集団プレートし
た。各集団のサンプルを凍結グリセロール保存用に使用
し、プラスミドDNAの集団を得るためにも使用した。
集められたDNAをその後、DEAE−デキストランを
使用したサルCV1/EBNA−1細胞擬集密的細胞層
にトランスフェクションし、ルースマンら(Luthm
an et al.,Nucl.Acids Res.
11:1295(1983)及びマックカッチャンら
(McCutchan et al.,J.Natl.
Cancer Inst,41:351(1986)に
記載されているものに類似した、クロロキン(Chlo
roquine)処理を行った。CV−1/EBNA−
1細胞は以下のようにして、派生した。CV−1/EB
NA−1細胞系は構造的に、CHVの即時初期のエンハ
ンサー/プロモーターにより制御されているEBV核抗
原−1を発現している。アフリカミドリザル腎臓細胞系
CV−1(ATCC CCL70)に、5μgのpSV
gpt[マリガンとバーグ(Mulligan & B
erg),Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA78:2072,1981]と25μgのpDC3
03/EBNA−1をリン酸カルシウム共沈技術(アウ
ス−ベルら.eds.,Current Protoc
ols in Molecular Biology,
Wiley,New York,1987)をコトラン
スフェクションした。pDC303/EBNA−1はp
DC302[モーズレイら(Mosley et a
l.),Cell59:335,1989]から2段落
で作成された。はじめにアテツウィルス3部リーダー配
列に存在するイントロンを、以下の合成オリゴヌクレオ
チドの一対で、イントロンをまたぐPvuII からS
caIの断片を入れかえることにより除去しプラスミド
pDC303をつくった。
【0074】
【0075】次に、エプシュタイン−バーウィルス核抗
原I(EBNA−1)をコードし、EBV地図の10
7,932から109,894から本来なるHindII
I−AhaII 制限断片(バウルら(Baer et
al.),Nature310:207,1984)
をその後pDC303のマルチプルクローニングサイト
に挿入し、プラスミドpDC303/EBNA−1をつ
くった。標準的方法(オースベルら.,前出;マリガン
とバーク前出)に従い、ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン、チミジン、キサンチン及びマイコフェノリン酸の存
在下でトランスフェクションした細胞を増殖し、トラン
スフェクトしたプラスミドを安定に混入した細胞を選択
した。得られた薬剤耐性コロニーを分離し、解析のため
各々細胞系に拡大した。細胞系を機能するEBNA−1
の発現によりスクリーニングした。1つの細胞系クロー
ン68がこのアッセイを用いて、EBNA−1を発現し
ていることがわかりCV−1/EBNA−1と選定され
た。
【0076】CV−1/EBNA−1細胞にcDNAラ
イブラリーをトランスフェクトするため、細胞を完全培
地(ダルベッコ(Dulbecoo)改良イーグル(E
agle)培地(DMEM)10%(v/v)胎盤ウシ
血清(FCS),50U/mlペニシリン、50U/m
lストレプトマイシン、2mML−グルタミンを含む)
で維持し、2×105細胞/ウェルの密度で6ウェル皿
(Falcon)又は1ウェルチェンバーつきスライド
(Lab−Tek)にプレートした。皿及びスライドと
も、1mlヒトフィブロネクチン(10μg/ml P
BS中)で30分前処理した後PBSで1回洗った。培
地を接着細胞層から除去し、66.6μMクロロキン硫
酸を含む1.5ml完全培地にかえた。0.2mlのD
NA溶液(クロロキン入り完全培地中2μgDNA,
0.5mg/mlDEAE−デキストラン)をその後細
胞に加え5時間インキュベートした。インキュベーショ
ン後、培地を除き、細胞を10%DMSOを含む完全培
地を2.5から20分加えてショックを与え、次に、新
たな完全培地により溶液をとりかえた。細胞は培養中一
時的に挿入した配列が発現できるように増殖するように
した。これらの条件では生き残るCV−1/EBNA−
1細胞の80%のトラスフェクション効率を得た。
【0077】48から72時間後、トランスフェクトし
たCV−1/EBNA細胞単層を、前述のように調製し
たラジオヨード化したIL−1βの結合を、スライドオ
ートラジオグラフィーによりみることでIL−1結合タ
ンパク質の発現についてアッセイした。トランスフェク
トされたCV−1/EBNA−1細胞を結合培地(RP
MI培地1640、25mg/mlウシ血清アルブミ
ン、2mg/mlアジ化ナトリウム、20mMHEPE
S,pH7.2と50mg/ml無脂肪ドライミルク
(NFDM)を含む)で1回洗い、3×10-9125
−IL−1βを含む1ml結合培地NFDMと4℃で
2時間インキュベートした。インキュベーション後チェ
ンバー付スライド中の細胞を結合バッファー+NFDM
で3回洗い次にPBS,pH7.3で2回洗い、非結合
125I−IL−1βを除いた。細胞をPBS,pH7.
3 10%グルタルアルデヒド中室温で30分インキュ
ベートして固定し、PBSで2回洗い、風乾した。スラ
イドをコダックGTNB−2写真用乳剤(水で6倍希
釈)にひたし、遮光箱中で48時間から7日暗所で露光
した。スライドをその後、コダックD19現像液(40
g/500ml水で約5分現像し、水でリンスし、Ag
faG433C定着液で固定した。スライドを各々顕微
鏡で25ー40×倍率で観察し、タイプII IL−1
Rを発現している陽性細胞を明るいバックグラウンドの
中のオートラジオグラフィー銀粒子の存在により固定し
た。
【0078】6ウェル皿中の細胞を1度結合バッファー
+NFDM中で洗い次にPBSpH7.3で3回洗い非
結合125I−IL−1βを除いた。結合した細胞をその
後トリプシン分解してプレートから除き、結合した125
I−IL−1βをベータ計数計により計数した。
【0079】スライドオートラジオグラフィー法を使用
したところ、約3000cDNAの集団ずつ250,0
00cDNAスクリーニングして初めてトランスフェク
タント集団のアッセイが明らかにIL−1β結合陽性の
多くの細胞を示した。この集団をその後500集団ずつ
に分け、再びスライドオートラジオグラフィによりスク
リーニングしたところ、陽性集団1つが同定された。こ
の集団をさらに75ずつの集団に分け、6ウェルプレー
トにプレートし、結合した125I−IL−1βの定量に
より解析するプレート結合アッセイによりスクリーニン
グした。細胞をプレートから削りとりどの75の集団が
陽性か決めるため計数した。この75の集団の個々のコ
ロニーをスクリーニングして、1つのクローン(クロー
ン75)が、IL−1β結合アッセイで検出可能なタン
パク質の合成を行っていることを同定した。このクロー
ンを単離し、その挿入部分をシークエンスしてヒトタイ
プII IL−1RcDNAクローン75の配列を決定
した。ヒトタイプII IL−1RcDNAクローン7
5をもつpDC406クローニングベクターはpHuI
L−1R−II 75と名付けられアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション(ATCC)(Rockv
ille MD,USA)に1990年6月5日寄託番
号CRL10478として寄託された。クローン75の
核酸(SEQID NO:1)及び予想アミノ酸配列
(SEQ ID NO:1及びSEQID NO:2)
及び関連情報を発表した配列表は本明細書の後半部に示
している。
【0080】
【実施例2】ヒト溶性タイプII IL−1RをコードするcDNA
の作成と発現 ベクターpDC406中の全長タイプIL−1RcDN
Aクローン75(SEQ ID NO:1)を鋳型とし
て使い、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)増幅により、溶
性ヒトタイプII IR−1RをコードするcDNA
(SEQ IDNO:1のアミノ酸13〜333の配列
をもつ)を作成した。次の5′オリゴヌクレチドプライ
マー(SEQ ID NO:7)及び3′オリゴヌクレ
オチドプライマー(SEQ ID NO:8)を最初に
作成した。
【0081】
【0082】5′プライマーはヒトタイプII IL−
1Rクローン75(SEQ IDNO:1)の非翻訳領
域の31−51ヌクレオチドに5′にSalI制限酵素
部位を付したものに相当しているので、このヌクレオチ
ド配列は、ヒトクローン75ヌクレオチド31−51に
相補的な(−)鎖にアニールすることができる。3′プ
ライマーはヌクレオチド1191−1172(ヒトタイ
プII IL−1Rクローン75(SEQ ID N
O:1)の3アミノ酸をコードするアンチ−センスヌク
レオチドからなる)に相補的で、NotI制限酵素部位
を5′に付加し終止コドンを持つ。
【0083】次のPCR試薬を1.5mlエッペンドル
フ微量遠心チューブに加えた:10×PCRバッファー
(500mMKCl,100mMTris−HCl,p
H8.3,25℃で15mM MgCl2及び1mg/
mlゼラチン)(パーキン−エルマーシータス;Per
kin−Elmer Cetus,Norwalk,C
N)10μl,各dNTPを含む2mM溶液(2mM
dATP,2mMdcTP,2mMdGTP及び2mM
dTTP)10μl,Taq DNAポリメラーゼ2.
5ユニット(500ユニット1ml溶液0.5μl)
(パーキン−エルマーシータス)、鋳型DNA50ng
及び各上記オリゴヌクレオチドプライマー20μM溶液
5μlに74.5μlの水を加え最終量100μlと
し、そして最終混合物に100μlのパラフィンオイル
を上からのせた。最初94℃90秒で鋳型を変性し、5
5°、75秒で再アニールし、72℃150秒でcDN
Aを伸長させて、DNA温度循環器(エリコンプ(Er
icomp)サン ディエゴCA)を使用し、PCRを
行った。ステッププログラム(94°、25秒変性、5
5°、45秒アニーリング、72°150秒伸長)を使
用した増幅をさらに20サイクルPCRを行い、次に7
2°、5分間伸長した。
【0084】試料を、フェノール−クロロホルム抽出及
びG−50(ベーリンガーマンハイム)でのスパンカラ
ムクロマトグラフィーによりパラフィンオイルを除きD
NAを抽出した。抽出DNA10μl画分を1%Sea
KemTMアガロース(FMC BioProduct
s,Rockland,ME)上で電気泳動で分離し、
臭化エチジウムで染色し、DNA断片サイズが予測され
た産物と同一であることを確認した。
【0085】そこで、20μlのPCR−増幅cDNA
産物を標準的方法を用いてSalI及びNotI制限酵素
で消化した。SalI/NotI制限酵素断片をその後
1.2% SeaplaqueTM低温溶解(LGT)
アガロース上で分離し、断片をあらわしているバンドを
単離した。断片を標準的なゲル内ライゲーション法によ
りpDC406にライゲーションし、ベクターをCV1
−EBNA細胞にトランスフェクトして実施例1に前述
したように発現させた。
【0086】
【実施例3】マウスタイプII IL−1RをコードするcDNAの
単離 マウスタイプII IL−1RcDNAsをマウス前駆
B細胞系統7OZ/3(ATCCTIB158)より作
成されたCDNAライブラリーから、ヒトタイプII
IL−1Rプローブを用いた種間ハイブリダイゼーショ
ンにより単離した。cDNAライブラリーは製造業者の
指示に従ってλgt10アームを使用して、試験管内パ
ッケージ(登録商標ギガパック、ストラタジーン、サン
ディエゴ)を行ってλファージベクタ中に作成した。2
本鎖ヒトタイプII IL−1Rプローブはヒトタイプ
II IL−1Rクローン75の約1.35kb Sa
lI制限酵素フラグメントを切りだして、ランダムプラ
イマー(ベーリンガーマンハイム)を使用してcDNA
32Pラベルして作成した。マウスcDNAライブラ
リーは1回増幅し、全部で5×105プラークをヒトプ
ローブで35%ホルムアミド(5×SSC,42℃)中
でスクリーニングした。いくつかのマウスタイプII
IL−1RcDNAクローン(クローンλ2を含む)を
単離したが、どのクローンも全長のものではないようで
あった。部分的クローンから得た又クレオチド配列情報
を用いて、以下のように全長のマウスタイプII IL
−1RcDNAをクローン化した。
【0087】マウスタイプII IL−1Rをコードす
る全長cDNAクローンを、フローマンら(Frohm
an et al.)Proc.Natl.Acad.
Sci.USA85:8998に記載されているcDN
A端の迅速増幅(RACE)法によりマウス前駆B細胞
系統70Z/3を用いて単離した。簡単にいうとRAC
E法はPCRを使用して、cDNA転写物の既知点(上
記で得られた核酸配列より決定)から3端の間の領域の
cDNAのコピーを増幅するものである。17dT塩基
対を含む配列と、3つのエンドヌクレアーゼ認識部位を
含むアダプター配列(便利な制限酵素部位をcDNAの
3端につける)をもつアダプタープライマーを、mRN
A集団の逆転写及び(−)鎖cDNAの生成に使用す
る。上記のマウスタイプII IL−1Rクローン2c
DNAの5′非翻訳領域の配列の既知のストレッチに相
補的で3′方向を向いているプライマーを(−)鎖cD
NAとアニールし、伸長して相補(+)鎖cDNAを生
成する。結果生じた二本鎖cDNAを本来のままの5′
端と合成3′端ポリ(A)尾部にアニールするプライマ
ーを使用してPCRにより増幅する。RACE法の詳細
は以下のとおりである。
【0088】下記のPCRオリゴヌクレオチドプライマ
ー(それぞれd(T)17アダプター・プライマー、5′
増幅プライマーと3′増幅プライマーである)を最初に
作成した。
【0089】
【0090】簡単に言うと、d(T)17アダプタープラ
イマー(SEQ ID NO:9)は集団のmRNA転
写物のポリ(A)領域にアニールする核酸配列を含
み、mRNAから(−)鎖cDNA逆転写物を生成する
ために使用される。またPCRにより増幅されたDNA
に導入されるPstI,NatI及びBamHIに対する
エンドヌクレアーゼ制限酵素部位を含む。5′増幅プラ
イマー(SEQ IDNO:10)はマウスタイプII
IL−1Rクローンλ2の5′非翻訳領域のヌクレオ
チド15ー34にSalI制限酵素部位を5′付加した
ものに相当し、この塩基配列はd(T)17アダプタープ
ライマーによる逆転写により生じた(−)鎖cDNAに
アニールし、伸長して(+)鎖cDNAを生成する。
3’プライマー(SEQ ID NO:11)は上記エ
ンドヌクレアーゼ制限部位をもつ(+)鎖DNAとアニ
ールし、伸長してマウスタイプII IL−1Rをコー
ドする二本鎖全長cDNAを生成し、それをそこで通常
のPCR反応で増幅することが可能である。PCR法の
詳細は以下のとおりである。
【0091】マニアティスら(Maniatis et
al.)Molecular Cloning:A
Laboratory Manual(Cold Sp
ring Harbor 1ab.,NY,1982)
に記載されている標準的方法を用いて70Z/3細胞か
ら抽出した全RNAからオリゴdTセルロース クロマ
トグラフィーによりポリ(A)mRNAを単離し、以
下のように逆転写した。16.5μl水中の約1μgの
ポリ(A)mRNAを68℃で3分間熱してのち氷上
で冷まし、2μlの10×RTCバッファー(500m
M Tris−HCl22℃で、pH8.7 60mM
MgCl 400mM KCl 10mMDTT,
各dNTP10mM)を10ユニットのRNasin
(プロメガバイオテック;Promega Biote
ch)0.5μgのd(T)17−アダプタ プライマー
及び、10ユニットのAMV逆転写酵素(ライフ サイ
エンス;Life Sciences)を全量20μl
に加え、2時間で42℃インキュベートしてmRNAを
逆転写し、cDNA集団を合成した。反応混合物はTE
バッファー(10mM Tris−HCl,pH7.
5,1mMEDTA)で希釈し、4℃で一晩置いた。
【0092】約1又は5μlのcDNA集団を5μlの
マウスタイプII IL−1Rクローンλ2のヌクレオ
チド15−34配列に相当する配列を含む5′増幅プラ
イマーの20μM溶液、3’増幅プライマー20μM溶
液の5μl;10μlの10×PCRバッファー(50
0mM KCl,100mM Tris−HCl (p
H8・4,20℃),14mM MgClと1mg/
mlゼラチン)、4μlの5mM各dNTP(5mMd
ATP,5mMdCTP,5mMdGTP 5mMdT
TPを含む)、2.5ユニット(標準の5000ユニッ
ト/ml溶液0.5μl)、TaqDNAポリメラーゼ
(パーキンーエルマーシータス インストルメント(I
nstrument)と100μlの容量になるように
希釈して混合した。最終混合物は100μlパラフィン
オイルを上からのせた。最初94℃90秒で鋳型を変性
し、64°、75秒で再アニールし、72°、150秒
でcDNAを伸長させてDNA温度循環器(パーキンー
エルマー/シータス)を使用しPCRを行った。ステッ
ププログラム(94°、25秒変性、55°、45秒ア
ニーリング、72°、150秒伸長)を使用した増幅を
さらに25サイクル分、PCRを行い、次に72°で7
分最終伸長をした。
【0093】試料をフェノールクロロホルム抽出及びG
−50(ベーリンガーマンハイム)でのスパンカラムク
ロマトグラフィーによりパラフィンオイルを除きDNA
を抽出した。抽出DNA10μl画分を1%SeaKe
TMアガロース(FMCバイオプロダクト ロックラ
ンド、ME)上で電気泳動により分離し、臭化エチジウ
ムで染色し、DNA断片サイズが予測された産物と同一
であることを確認した。ゲルをその後ブロットし、上記
のマウスタイプII IL−1Rクローンλ2の561
0bpEcoRI断片をプローブにしてみて、マウスタ
イプII IL−1RをコードするDNAをそのバンド
が含むことを確認した。
【0094】PCR増幅cDNA産物をその後エッペン
ドルフ微量遠心で最高速度で20分遠心して濃縮し、そ
の後1/10容酢酸ナトリウム(3M)と2.5容量エ
タノール中でエタノール沈澱を行った。30μlの濃縮
物をSalIとNotI制限酵素で標準的方法を使用して
消化した。SalI/NotI制限酵素断片をその後、
1.2%LGTアガロースゲルで分離し、断片にあたる
バンドを単離した。制限酵素断片はその後アガロースか
らGene CleanTM(Bio−101,La
Jolla,CA)から精製した。得られた精製制限酵
素断片を、pDC406ベクターにライゲーションしそ
れをCV−1EBNA細胞にトランスフェクトして、実
施例1中に前述されているように発現させた。拡散(S
EQ IDNO:12)及び予想アミノ酸配列(SEQ
ID NO:12及びSEQID NO:13)と関
連情報を発表した配列表は本明細書の後半部分に示して
ある。
【0095】
【実施例4】マウス溶性タイプII IL−1RをコードするcDN
Aの作成と発現 70Z/3ポリ(A)mRNAを鋳型としたPCR増
幅及びマウスタイプII IL−1Rをコードする全長
クローンに対して記述されている以下の方法により、溶
性マウスタイプII IL−1RをコードするcDNA
(SEQ IDNO.12のアミノ酸13ー345の配
列をもつ)を作成した。以下のPCRオリゴヌクレオチ
ドプライマー(各々d(T)17アダプタープライマー、
5′増幅プライマー及び3′増幅プライマー)を作成し
た。
【0096】
【0097】d(T)17アダプタープライマーと5′増
幅プライマーは実施例5に記述されていて、SEQ I
D NO:9とSEQ ID NO;10と同一であ
る。SEQ ID NO:12の3’端はSEQ ID
NO:12のヌクレオチド1145−1166と相補
的であり、NotI制限酵素部位の5’付加と終止コド
ンをもつ。
【0098】実施例3に記述したようにd(T)17アダ
プタープライマーを用いてポリ(A)mRNAからc
DNA集団を合成した。1.5mlのエッペンドルフ微
量遠心チューブに、約1μlのcDNA集団、5μlの
5′増幅プライマー20μM溶液、5μlの3′増幅プ
ライマー20μM溶液、10μlの10×PCRバッフ
ァー(500mMkCl,100mM Tris−HC
l(pH8.4 20℃で)、14mM MgCl
1mg/mlゼラチン)10μl 5mM各dNTP
(5mMdATP,5mMdCTP,5mMdGTP及
び5mMdTTPを含む)4μl2.5ユニット(標準
500ユニット/ml 溶液を0.5μl)のTaqD
NA ポリメラーゼ(パーキンーエルマーシータス イ
ンストルメント)を混ぜて水75.4μlで希釈して容
量100μlにした。最終混合物に100μlパラフィ
ンオイルを上からのせた。最初94℃90秒鋳型を変性
し、55°、75秒で再アニールし、72°、150秒
でcDNAを伸長させてDNA温度循環器(エリコッ
プ)を使用しPCRを行った。ステッププログラム(9
4°、25秒変性、55°、45秒アニーリング、72
°、150秒伸長)を使用した増幅をさらに25サイク
ル分PCRを行い、次に72°で7分最終伸長をした。
【0099】試料をフェノールークロロホルム抽出及び
G−50(べーリンガーマンハイム)でのスパンカラム
クロマトグラフィーによりパラフィンオイルを除きDN
Aを抽出した。抽出DNA10μl画分を1% Sea
KemTMアガロース(FMC バイオプロダクト ロ
ックランド、ME)上で電気泳動により分離し、臭化エ
チジウムで染色し、DNA断片サイズが予測された産物
と同一であることを確認した。
【0100】PCR増幅cDNA産物をその後エッペン
ドルフ微量遠心で、最高速度で20分遠心して濃縮し、
その後1/10容酢酸ナトリウム(3M)と2.5容量
エタノール中でエタノール沈澱を行った。50μlの濃
縮物をSalIとNotI制限酵素で標準的方法を使用し
て消化した。SalI/NotI制限酵素断片をその後、
1.2%LGTアガロースゲルで分離し、断片にあたる
バンドを単離した。制限酵素断片はその後単離したバン
ドから以下の凍結融解法を用いて精製した。ゲルからの
バンドを2つの175μlの断片に分けて1.5mlエ
ッペンドルフ微量遠心チューブにいれた。500μlの
分離バンド(0.15M NaCl 10mM Tri
s,pH8.0 1mM EDTA)を各チューブに加
え68℃でゲルが溶けるまでチューブを熱した。そして
ドライアイスで10分ゲルを凍結し、室温で融解し、4
℃で30分遠心した。次に上清をとって新しいチューブ
に移し、2mLエタノールに懸濁し、4℃でさらに30
分遠心してDNA沈澱を生じさせた。DNA沈澱を70
%エタノールで洗い5分遠心チューブからエタノールを
除き、20μlTEバッファーに再び懸濁した。
【0101】得られた精製済制限酵素断片をその後pD
C406ベクターにライゲーションした。ライゲーショ
ン試料をDH5αに形質転換し、コロニーを正しいプラ
スミドであるかチェックするために解析した。ベクター
はCOS−7細胞にトランスフェクトし、実施例1に前
述したように発現された。
【0102】
【実施例5】タイプII IL−1R結合研究 上の実施例1で述べたように発現、及び精製された組換
えヒトタイプII IL−1Rの結合阻害定数は、様々
な濃度の競合物質(IR−1β又はIL−1α)を一定
量のラジオラベルしたIL−1β又はIL−1αとタイ
プII IL−1Rを発現している細胞とインキュベー
トする阻害結合アッセイによって決定された。競合物質
は受容体に結合し、ラジオラベルしたリガンドが受容体
に結合するのを阻害する。結合アッセイは、大体ドーハ
ーら(Dower et al.),J.Immuno
l.132:751,1984とパークら(Park
et al.)J.Biol.Chem.261:41
77,1986に記載されているようにフタル酸油分離
法により行われた。簡単にいうと、CV1/EBNA細
胞を6ーウェル皿(コスター(Costar)ケンブリ
ッジ,MA)で4℃で2時間125I−ILー1βと1m
l・結合培地(ローズウェルパーク メモリアル イン
スティチュート(RPMI)1640培地で、2%BS
A,20mMHepes バッファー0.2%アジ化ナ
トリウムpH7.2を含む)中でインキュベートした。
アジ化ナトリウムは37℃で125I−IL−1が細胞に
より取り込まれて分解されることを阻害するために含ま
れる。プレートを回転振とう機で37℃で1時間インキ
ュベートした。そしてインキュベーションした混合物の
複数の画分をジブチルフタル酸1.5,ビス(S−エチ
ルヘキサル)フタル酸1の割合からなるフタル酸油性混
合物を含むポリエチレン遠心チューブに移した。100
×過剰モルの未ラベルIL−1βを含むコントロールチ
ューブも、非特異的結合を決めるために含めた。結合
125I−IL−1のある細胞をエッペンドルフ微量遠心
で15000×gで5分遠心し結合していない125I−
IL−1から分離した。細胞に結合した放射活性をガン
マ計数計で決定した。このアッセイ(タイプII IL
−1Rへの125I−IL−1βの結合をラベルしないヒ
トIL−1βを競合物として使用して阻害する)は、全
長ヒトタイプII IL−1RはKI1は約19±8×
109、KI2は約0.2±0.002×109という2
相的なIL−1βへの結合を示すことを示唆した。125
I−IL−1αのタイプII IL−1Rへの結合を阻
害するのにラベルしていないヒトIL−1βを使用する
と、全長ヒトタイプII IL−1RはKI1は約2.
0±1×109およびK12は約0.013±0.003
×109という2相的なIL−1βへの結合を示した。
【0103】上の実施例2で述べたように発現及び精製
された溶解性ヒトタイプII IL−1Rの結合阻害定
数は、様々な濃度のIL−1β競合物を一定量のラジオ
ラベルしたI−IL−1βとタイプII IL−1Rを
発現しているCB23細胞(エプシュタイン バーウィ
ルス トランスフォームド・コード・血球Bリンパ細胞
系統)とインキュベートする阻害結合アッセイによって
決定された。結合アッセイもまたドーワーら.,J.I
mmunol 132:751,1984及びパークら
J.Biol.Chem.261:4177に記載され
ているようにフタル酸油性分離法により行われた。簡単
にいうと、COS−7細胞を上記の溶解性ヒトタイプI
I IL−1RをコードするcDNAを含むpDC40
6発現ベクターでトランスフェクトした。COS細胞か
らの上清をトランスフェクション後3日培養し、続けて
結合培地 (ローズウェル パーク メモリアルインス
ティチュート(RPMI)1640培地で2%BSA,
20mM Hepes バッファーと0.2%アジ化ナ
トリウム pH7.2を含む)で、6ウェル皿内で50
μl/ウェルの容量になるように希釈した。上清を50
μlの9×10-10125I−IL−1βと2.5×10
6CB23細胞と共に、8℃で2時間振とうしながらイ
ンキュベートした。インキュベーション混合物の2つず
つとった60μl画分を、ジブチルフタル酸1.5,ビ
ス(S−エチルヘキサル)フタル酸1の割合からなるフ
タル酸油性混合物を含むポリエチレン遠心チューブに移
した。3×10-6Mの未ラベルIL−1βを含む陰性コ
ントロールチューブも非特異的結合を決めるために含み
(100%阻害)ラジオラベルしたIL−1βのみと共
に50ml結合培地を含む陽性コントロールチューブ
は、最大限の結合を決めるために含めた。結合125I−
IL−1のある細胞をエッペンドルフ微量遠心で15,
000Xgで5分遠心し結合していない125I−IL−
1から分離した。結合していない125I−IL−1βを
含む上清を捨て、細胞を注意深く、氷冷した結合培地で
リンスした。細胞をその後トリプシンーEDTA1ml
中で37℃15分インキュベートし、細胞を培養した。
細胞の放射活性はガンマ計数計で決定した。このアッセ
イ(125I−ILー1βの結合を溶解性ヒトタイプII
IL−1Rを使って阻害する)は、溶解性ヒトタイプ
II IL−1Rは約3.5×109-1のKをもつ
ことを示した。同様の方法を用いて溶解性ヒトタイプI
I IL−1RによるIL−1αの結合の阻害により、
溶解性ヒトタイプIIIL−1Rは1.4×108-1
のKをもつことが示された。
【0104】マウスタイプII IL−1RはK
I10.8×109およびKI20.01×109未満の2
相的IL−1βへの結合を示した。
【0105】
【実施例6】タイプII IL−1R アフィニィティークロスリン
キング研究 アフィニィティクロスリンキング研究を、パークら、P
roc.Natl.Acad.Sai.USA 84:
1669 1987に記載してあるように行った。この
アッセインに用いられている組換えヒトIL−1α及び
IL−1βは既に記載されているように発現精製し、ラ
ベルを行った。(ドーワーら,J.Exp.Med.1
62:501,1985;ドーワーら,Nature
324:266,1986),組換えヒトIL−1受容
体アンタゴニスト(IL−1ra)を、アイゼンバーグ
ら(Eisenberg et al.)Nature
343:341,1990)に公表されているcDNA
配列を用いてクローン化し、COS細胞に一時的にトラ
ンス・フェクションをして発現させ、ドーワーら,J.
Immunol.143:4314,1989に記載さ
れているように、親和ゲルに結合した溶解性ヒトタイプ
I IL−1Rのカラムでのアフィニィティークロマト
グラフィーにより精製し、低pHで溶出した。
【0106】簡単にいうと、組換えタイプII IL−
1Rを発現しているCV1/EBNA細胞(4×107
/ml)を125I−IL−1α又は125I−IL−1β
(1nM)と4℃で、特異性コントロールとして1μM
の過剰のラベルしていないIL−1存在及び非存在下
で、2時間インキュベートした。細胞をその後洗って、
ビス(スルフォサクシニミジル)スベラートを最終濃度
0.1mg/mlになるように加えた。30分25℃に
置いた後、細胞を洗い、2mMロイペプチン、2mM0
−フェナントロリン、及び2mMEGTAをタンパク分
解を防ぐために含む100μlのリン酸緩衝塩溶液(P
BS)/1%トライトンに再び懸濁した。等量(CP
M)の125I−IL−1と等容の特異性コントロールを
含む抽出上清画分を標準的技術を用いて10%ゲルでS
DS/PAGEにより解析した。
【0107】第4図は、ラジオラベルしたIL−1α及
びIL−1βを用いて、上記されているように行われ
た、天然の対照物に対する、天然及び組換え型マウス及
びヒトタイプIIL−1受容体と、組換えマウス及びヒ
トタイプII IL−1受容体タンパク質の大きさ比較
のためのアフィニィティ クロスリンキング研究の結果
を示している。通常、組換えタンパク質は恐らくCV1
/EBNA細胞で過剰発現したときの糖鎖型の違いの結
果として少し速く、少し広いバンドとして移動するが一
時的に発現した組換え受容体の大きさは天然の受容体に
類似している。この結果から、タイプII IL−1受
容体はタイプIIL−1受容体より小さいことも示され
た。特定の組合せ(ILー1βと天然ヒトタイプI受容
体)は特異的クロスリンキング産物を生じることがなか
った。約等量のラベルを各々の実験レーンにのせている
ので、ゲルの底部の未結合のリガンドバンドの強度によ
って示されているように、この組合せは比較的弱くクロ
スリンクしていると強く予想される。125I−IL−1
αとクロスリンクした天然型ヒトタイプII IL−1
受容体発現細胞を示しているレーンは、天然型と組換え
タイプI受容体との複合体のサイズ範囲(Mr=10
0,000)に構成成分があらわれている。このような
複合体は、組換えタイプII IL−1受容体を含むレ
ーンでは検出されないが、恐らく、CB23細胞は微量
のタイプIIL−1受容体mRNAを含んでいるので、
タイプIIL−1受容体がCB23細胞で低いレベルに
発現している結果であると思われる。
【0108】
【実施例7】タイプII IL−1Rのモノクローナル抗体の調製 精製した組換えタイプII IL−1R、例えばヒトタ
イプII IL−1Rあるいは、タイプII IL−1
Rを高レベル発現するトランスフェクトしたCOS細胞
の調製を行い、通例の技術、例えば米国特許4,41
1,993号明細書に開示されているような技術を用い
て、タイプII IL−1Rに対するモノクローナル抗
体を作成する。この抗体は、IL−1がタイプII I
L−1Rに結合するのを妨害する点、例えばIL−1の
毒性や他の望ましくない効果を改良するという点、IL
ー1又は溶解性タイプII IL−1Rの診断及び研究
用アッセイの成分として、有用であると予測される。
【0109】マウスを免疫するため、タイプII IL
−1R免疫源を完全フロイント(Fre,und’s)
アジュバント(adjuvant)に懸濁し、10〜1
00μgの幅の量を皮下に腹膜間にBalb/cマウス
に注射した。10〜12日後、免疫された動物に不完全
フロイントアドジュバントに懸濁した追加免疫源であと
押ししその後一週から2週の免疫化スケジュールで周期
的に、あと押しした。血清試料を周期的に、後方眼窩の
出血あるいは尾端切開によって採取し、ドットブロット
アッセイ(抗体サンドイッチ)又はELISA(酵素リ
ンクイムノソルベントアッセイ)又は受容体結合阻害に
より検査する。他のアッセイ法も適用できる。適当な抗
体価の検出に続き、陽性動物に塩水中の抗原の静脈注射
をする。3〜4日後、動物を犠牲にし、ヒ臓細胞を培養
し、マウスミエローマ細胞系統NS1又はAg8.65
3と融合する。この方法により得たハイブリドーマ細胞
系統をHAT選択培地(ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン、チミジン)の複数マイクロタイタープレートにプレ
ートし、非融合細胞、ミエローマ ハイブリッド、ヒ臓
細胞ハイブリッドの増殖を阻止する。
【0110】このように作られたハイブリドーマクロー
ンを、タイプII IL−1Rへの反応性を、例えばエ
ンバルら(Engvall et al.)Immun
ochem.8:871(1971)及び米国特許4,
703,004号明細書に開示されている技術の適用に
よりELISAでスクリーンすることが可能である。陽
性クローンをそして同系Balb/cマウスの腹腔に注
射して高濃度(>1mg/ml)の抗タイプII IL
−1Rモノクローナル抗体を含む腹水を作成したり、フ
ラスコや、回転ボトルで増殖させる。生じたモノクロー
ナル抗体は、硫安沈澱後ゲルろ過クロマトグラフィー、
及び/又は、スタフィロコッカスアウレウス(Stap
hylococuus aureus)のプロテインA
又はストレプトコッカス属のプロテインGへの抗体の結
合に基づくアフィニティークロマトグラフィーによって
精製することができる。
【0111】
【配列表の簡単な説明】SEQ ID NO:1とSE
Q ID NO:2はヒトタイプII IL−1Rのヌ
クレオチド配列と予想アミノ酸配列を示す。この配列に
コードされている成熟ペプチドはアミノ酸1ー385と
定められた。予想されるシグナルペプチドはアミノ酸−
13から−1と定められている。予想される膜貫通領域
はアミノ酸331から335と示されている。
【0112】SEQ ID NO:3−SEQ ID
NO:6は全長ヒトタイプII IL−1Rをクローン
化するのに用いた様々なオリゴヌクレオチドである。
【0113】SEQ ID NO:7からSEQ ID
NO:8は溶解性ヒトタイプIIIL−1Rをポリメ
ラーゼ鎖反応(PCR)により作成するのに用いたオリ
ゴヌクレオチドプライマーである。
【0114】SEQ ID NO:9−SEQ ID
NO:11は全長の及び溶解性マウスタイプII IL
−1Rsをクローン化するのに用いたオリゴヌクレオチ
ドプライマーである。
【0115】SEQ ID NO:12及びSEQ I
D NO:13は、全長マウスタイプII IL−1R
のヌクレオチド配列と予想アミノ酸配列を示す。この配
列にコードされている成熟ペプチドは、アミノ酸1ー3
97と定められた。予想されるシグナルペプチドはアミ
ノ酸−13から−1と定められた。予想される膜貫通領
域はアミノ酸343ー368と示されている。
【0116】SEQ ID NO:14は溶解性マウス
タイプII IL−1Rを作成するのに使用したオリゴ
ヌクレオチドプライマーである。
【0117】
【配列表】
(1)SEQ ID NO:1の情報 (i)配列の性質 (A)長さ:1357塩基対 (B)タイプ:核酸 (C)鎖:2本 (D)形態:線状 (ii)分子タイプ:mRNAに対するcDNA (iii)仮定:N (iv)アンチーセンス:N (vi)根源的起源 (A)生物:ホモ サピエンス (G)細胞タイプ:ヒトB細胞リンパ胸線 (H)細胞系統:CB23 (vii)直接的起源 (A)ライブラリー:CB23 cDNA (B)クローン:pHuIL−1RII75 (ix)特徴 (A)名前/キー:CDS (B)位置:154..1350 (D)他の情報: (ix)特徴: (A)名前/キー:mat ペプチド (B)位置:193..1347 (D)他の情報: (ix)特徴: (A)名前/キー:sig ペプチド (B)位置:154..192 (D)他の情報: (xi)配列の記載:SEQ ID NO:1: 配列
【0118】
【0119】
【0120】(1)SEQ ID NO:2の情報 (i)配列の性質: (A)長さ:398アミノ酸 (B)タイプ:アミノ酸 (D)形態:線状 (ii)分子タイプ:タンパク質 (xi)配列の記載:SEQ ID NO:2: 配列
【0121】
【0122】
【0123】(1)SEQ ID NO:3の情報 (i)配列の性質: (A)長さ:24塩基対 (B)タイプ:核酸 (C)鎖:1本 (D)形態:線状 (ii)分子タイプ:DNA(ゲノム) (iii)ハイポセティカル:N (iv)アンチーセンス:N (xi)配列の記載:SEQ ID NO:3: 配列 TCGACTGGAA CGAGACGACC TGCT 24 (1)SEQ ID NO:4の情報 (i)配列の性質: (A)長さ:20塩基対 (B)タイプ:核酸 (C)鎖:1本 (D)形態:線状 (ii)分子タイプ:DNA(ゲノム) (iii)ハイポセティカル:N (iv)アンチーセンス:Y (xi)配列の記載:SEQ ID NO:4: 配列 GACCTTGCTC TGCTGGACGA 20 (1)SEQ ID NO:5の情報 (i)配列の性質: (A)長さ:46塩基対 (B)タイプ:核酸 (C)鎖:1本 (D)形態:線状 (ii)分子タイプ:DNA(ゲノム) (iii)ハイポセティカル:N (iv)アンチーセンス:N (xi)配列の記載:SEQ ID NO:5: 配列 CTGTTGGGCT CGCGGTTGAG GACAAACTCT TCGCGGTCTT TCCAGT 46 (1)SEQ ID NO:6の情報 (i)配列の性質: (A)長さ:46塩基対 (B)タイプ:核酸 (C)鎖:1本 (D)形態:線状 (ii)分子タイプ:DNA(ゲノム) (iii)ハイポセティカル:N (iv)アンチーセンス:Y (xi)配列の記載:SEQ ID NO:6: 配列 GACAACCCGA GCGCCAACTC CTGTTTGAGA AGCGCCAGAA AGGTCA 46 (1)SEQ ID NO:7の情報 (i)配列の性質: (A)長さ:29塩基対 (B)タイプ:核酸 (C)鎖:1本 (D)形態:線状 (ii)分子タイプ:DNA(ゲノム) (iii)仮定:N (iv)アンチーセンス:N (xi)配列の記載:SEQ ID NO:7: 配列 GCGTCGACCT AGTGACGCTC ATACAAATC 29 (1)SEQ ID NO:8の情報 (i)配列の性質: (A)長さ:33塩基対 (B)タイプ:核酸 (C)鎖:1本 (D)形態:線状 (ii)分子タイプ:DNA(ゲノム) (iii)ハイポセティカル:N (iv)アンチーセンス:N (xi)配列の記載:SEQ ID NO:8: 配列 GCGCGGCCGC TCAGGAGGAG GCTTCCTTGA CTG 33 (1)SEQ ID NO:9の情報 (i)配列の性質: (A)長さ:37塩基対 (B)タイプ:核酸 (C)鎖:1本 (D)形態:線状 (ii)分子タイプ:DNA(ゲノム) (iii)ハイポセティカル:N (iv)アンチーセンス:N (xi)配列の記載:SEQ ID NO:9: 配列 CTGCAGGCGG CCGCGGATCC TTTTTTTTTT TTTTTTT 37 (1)SEQ ID NO:10の情報 (i)配列の性質: (A)長さ:28塩基対 (B)タイプ:核酸 (C)鎖:1本 (D)形態:線状 (ii)分子タイプ:DNA(ゲノム) (iii)ハイポセティカル:N (iv)アンチーセンス:N (xi)配列の記載:SEQ ID NO:10: 配列 GCGTCGACGG CAAGAAGCAG CAAGGTAC 28 (1)SEQ ID NO:11の情報 (i)配列の性質: (A)長さ:20塩基対 (B)タイプ:核酸 (C)鎖:1本(D)形態:線状 (ii)分子タイプ:DNA(ゲノム) (iii)ハイポセティカル:N (iv)アンチーセンス:N (xi)配列の記載:SEQ ID NO:11: 配列 CTGCAGGCGG CCGCGGATCC 20 (1)SEQ ID NO:12の情報 (i)配列の性質: (A)長さ:1366塩基対 (B)タイプ:核酸 (C)鎖:2本 (D)形態:線状 (ii)分子タイプ:mRNAに対するcDNA (iii)ハイポセティカル:N (iv)アンチーセンス:N (vi)根源的起源 (A)生物:マウス (H)細胞系統:70Z/3 (vii)直接的起源 (A)ライブラリー:70Z/3 (B)クローン:12 (ix)特徴: (A)名前/キー:CDS (B)位置:85..1317 (D)他の情報: (ix)特徴: (A)名前/キー:mat ペプチド (B)位置:124..1314 (D)他の情報: (ix)特徴: (A)名前/キー:sig ペプチド (B)位置:85..123 (D)他の情報: (xi)配列の記載:SEQ ID NO:12: 配列
【0124】
【0125】
【0126】(1)SEQ ID NO:13の情報 (i)配列の性質: (A)長さ:410アミノ酸 (B)タイプ:アミノ酸 (D)形態:線状 (ii)分子タイプ:タンパク質 (xi)配列の記載:SEQ ID NO:13: 配列
【0127】
【0128】
【0129】(1)SEQ ID NO:14の情報 (i)配列の性質: (A)長さ:39塩基対 (B)タイプ:核酸 (C)鎖:1本 (D)形態:線状 (ii)分子タイプ:DNA(ゲノム) (iii)ハイポセティカル:N (iv)アンチーセンス:N (xi)配列の記載:SEQ ID NO:14: 配列 GCGCGGCCGC CTAGGAAGAG ACTTCTTTGA CTGTGG 36
【図面の簡単な説明】
【図1】発現プラスミドpDC406の概要図である。
Sal部位に挿入されたcDNA分子は、HIV及びア
デノウイルスから得られた制御因子を用いて転写、翻訳
される。pDC406はSV40,エプシュタインーバ
ー(Epsteim−Barr)ウイルス及びpBR3
22由来の複製開始点を含む。
【図2】ヒト及びマウスタイプII IL−1受容体
と、配列決定に用いた様々なヒト及びマウスのクローン
の概要図である。細い線は、非翻訳領域を示し、コード
領域は四角で描かれている。シグナルペプチドをコード
する部分は塗りつぶしてある。膜貫通部分は交差斜線で
網かけしてある。そして、細胞内タンパク質は点描して
いる。N結合糖鎖付加サイトの可能性がある部分は、逆
向き三角形で示している。イムノグロブリン様のジスル
フィド結合は、2つのイオウ分子をつなぐ点線で示して
いる(S.....S)。
【図3】ヒト及びマウスタイプII IL−1受容体の
アミノ酸配列(cDNAクローンから得られたもの)
を、ヒト及びマウスタイプIIL−1受容体のアミノ酸
配列(シムス(Sims)ら.,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA86:8946,1989;
シムスら、Science 241:585、198
8)およびST2細胞遺伝子のアミノ酸配列(トミナ
ガ,FEBS Lett.258;301,1989)
及びヴァシニアウイルスのB15Rオープンリーディン
グフレーム(スミスとチャン(Smith and C
han),J.Gen.Virology 72:51
1,1991)と比較した図である。番号は開始メチオ
ニンからつけている。各配列中のシグナルペプチド切断
予想位置は、フォンハイネ(von Heijne),
Nucl.Acids.Res.14:4683,19
86)で述べられた方法に従って決定されており、シグ
ナルペプチドと予想される部分と、タンパク質の本体の
間の空白で示している。タイプII IL−1受容体の
予想される膜貫通領域と細胞内領域は、最下段に示して
おり、間に空白を入れて分離している。すべての4つの
IL−1受容体配列に保存されている残基は黒地に白ヌ
キで示している。互いのタイプII 受容体で保存され
ている残基は影がつけてあり、互いのタイプIIL−1
受容体で保存されている残基は四角でかこんでいる。イ
ムノグロブリン構造に特徴的なジスルフィド結合を形成
すシステイン残基には、黒丸で印をつけており、タイプ
IIL−1受容体における2つの余分のシステインの組
と、他の配列のいくつかのシステインは星印で示してい
る。ドメイン1、2及び3の適当な境界は各行の上に示
してある。タイプII IL−1受容体において予想さ
れるシグナルペプチド切断はAla13の後ろであり、
通常みられない短いシグナルペプチドを生じ、切断後の
ヒトあるいはマウスタイプIIL−1受容体のN端の相
当する位置よりも、12(ヒト)又は23(マウス)ア
ミノ酸だけ長いN端が生じる。マウスタイプII IL
−1受容体の、他の、より好ましくないが起こりうる切
断部位は、Thr15又はPro17の後ろである。こ
の配列のならびは手で行っており、配列の客観的に最適
のならびは示していない。ヒト及びマウスタイプII
IL−1受容体cDNAの全長と可溶性のヌクレオチド
とアミノ酸配列もまた、この中で、配列表に示してい
る。
【図4】クロスリンクしたIL−1受容体のSDS/P
AGEゲルのオートラジオグラフである。IL−1受容
体を発現している細胞は、同種のラベルされていないI
L−1競合物の非存在下、又は存在下で125I−IL−
1とクロスリンクされ、抽出、電気泳動され、実施例6
で述べたようにオートラジオグラフが行われた。組換え
受容体はCV1/EBNA細胞で一時的に発現された。
天然の受容体とのクロスリンキングのために用いた細胞
系は、KB(ATCCCCL1717)(ヒトタイプI
IL−1R用)、CB23(ヒトタイプII IL−1
R用)、EL4(ATCC TIB39)(ネズミタイ
プIIL−1R用)及び70Z/3(ATCC TIB
158)(ネズミタイプII IL−1R用)である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12N 5/10 C12P 21/02 C 9282−4B G01N 33/53 P // C12Q 1/68 A 9453−4B (C12P 21/02 C12R 1:91) 8412−4B C12N 5/00 B (72)発明者 デービッド・ジョン・コスマン アメリカ合衆国ワシントン州98110,バイ ンブリッジ・アイランド,ノース・イース ト・エウィング・ストリート 10129 (72)発明者 スティーブン・ディー・ラプトン アメリカ合衆国ワシントン州98115,シア トル,サンドポイント・ウェイ・ノース・ イースト 7323,ナンバー 211 (72)発明者 ブルース・モスレイ アメリカ合衆国ワシントン州98125,シア トル,サーティシックスス・アベニュー・ ノース・イースト 11311 (72)発明者 スティーブン・ケイ・ドゥワー アメリカ合衆国ワシントン州98052,レッ ドモント,イースト・レイク・サマミッシ ュ・パークウェイウ・ノース・イースト 2620

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 生物学的に活性のあるタイプII IL
    −1受容体(タイプII IL−1R)タンパク質をコ
    ードする単離されたDNA配列。
  2. 【請求項2】 (a)天然型タイプII IL−1R遺
    伝子をコードする領域に由来するヌクレオチド配列をも
    つcDNAクローン; (b)そのクローンにおだやかなストリンジェントの条
    件下(50℃,2×SSC)でハイブリダイゼーション
    することが可能で、かつ生物学的に活性のあるタイプI
    I IL−1Rタンパク質をコードするDNA配列;お
    よび (C)(a)、(b)で定義されたDNA配列への遺伝
    コードの結果として退歩し、かつ生物学的に活性のある
    タイプII IL−1Rタンパク質をコードするDNA
    配列;から成る群から選択される、請求項1記載の単離
    されたDNA配列。
  3. 【請求項3】 溶解性タイプII IL−1Rタンパク
    質をコードする、請求項1記載の単離されたDNA配
    列。
  4. 【請求項4】 溶解性タイプII IL−1Rタンパク
    質がSEQ IDNO:1の1−133アミノ酸残基の
    配列およびSEQ ID NO:12の1−345アミ
    ノ酸残基の配列から成る群から選択される、請求項3記
    載の単離されたDNA配列。
  5. 【請求項5】 請求項1−4のいずれか1項に記載のD
    NA配列を含む組換え発現ベクター。
  6. 【請求項6】 発現を促進する条件下で請求項5記載の
    ベクターを含む適当な宿主細胞の培養を含む、生物学的
    に活性のある哺乳類タイプII IL−1受容体の調製
    方法。
  7. 【請求項7】 同質的な生物学的活性のあるタイプII
    IL−1受容体(タイプII IL−1R)タンパク
    質。
  8. 【請求項8】 同質的な生物学的活性のある溶解性ヒト
    タイプII IL−1Rタンパク質。
  9. 【請求項9】 SEQ ID NO:1の1−333ア
    ミノ酸残基の配列およびSEQ ID NO:12の1
    −345アミノ酸残基の配列から成る群から選択され
    る、請求項7記載の同質的な生物学的活性のあるタイプ
    II IL−1Rタンパク質。
  10. 【請求項10】 請求項7記載の有効量のタイプII
    IL−1Rタンパク質と適切な希釈剤または担体とを含
    む、免疫反応制御のためのヒト患者への非経口投与に適
    した薬剤組成物。
  11. 【請求項11】 哺乳類での免疫反応を制御するため、
    薬剤の調製におけるタイプII IL−1Rタンパク質
    の使用。
  12. 【請求項12】 タイプII IL−1Rタンパク質が
    ヒトタイプII IL−1Rであり、治療される哺乳類
    がヒトである、請求項11の使用。
  13. 【請求項13】 免疫反応の制御のため、ヒト患者への
    非経口投与に適した医療組成物の調製におけるタイプI
    I IL−1Rタンパク質の使用。
  14. 【請求項14】 (a)IL−1分子へ哺乳類タイプI
    I IL−1受容体タンパク質を結合し;および(b)
    非結合IL−1またはタイプII IL−1受容体の量
    を検出または測定する工程を含む、タイプII IL−
    1またはタイプII IL−1R分子あるいはそれらの
    相互作用を検出する方法。
  15. 【請求項15】 哺乳類タイプII IL−1受容体と
    免疫反応し、かつそれに特異性をもつ抗体。
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