MX2012011986A

MX2012011986A - RECEPTOR FGF HUMANO Y PROTEINAS ENLAZADAS A ß-KLOTHO.

Info

Publication number: MX2012011986A
Application number: MX2012011986A
Authority: MX
Inventors: Shaw-Fen Sylvia Hu; Ian Foltz; Yang Li; Chadwick Terence King; Jeonghoon Sun; Mark Leo Michaels; Roger Fachini; Ji Lu; Seog Joon Han; Susie Miki Harris
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2010-04-15
Filing date: 2011-04-13
Publication date: 2013-03-05
Also published as: CA2796055A1; WO2011130417A2; US20130129725A1; JP2013523184A; EP3670534A3; US9517264B2; EP2558497A2; WO2011130417A3; EP3670534A2; AU2011239689A1

Abstract

La presente invención proporciona composiciones y métodos relacionados a o derivados de proteínas enlazadas al antígeno y fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno que específicamente enlaza a ß-Klotho, o ß-Klotho y uno o más de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. En algunas modalidades las proteínas enlazadas al antígeno y fusión FGF21-proteína enlazada al antígenos induce señalización tipo FGF21. En algunas modalidades, una proteína enlazada al antígeno o componente que enlaza el antígeno de fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno es un anticuerpo completamente humano, humanizado, o quimérico, fragmento enlazados y derivados de tales anticuerpos, y polipéptidos que enlazan específicamente a ß-Klotho, o ß-Klotho y uno o más de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. Otras modalidades proporcionan ácidos nucleicos que codifican tales proteínas enlazadas al antígeno y fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno, y fragmentos y derivados de los mismos, y polipéptidos, células que comprenden tales polinucleótidos, métodos para hacer tales proteínas enlazadas al antígeno y fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno, y fragmentos y derivados de los mismos, y polipéptidos, y métodos de uso de tales proteínas enlazadas al antígeno y fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno, fragmentos y derivados de los mismos, y polipéptidos, incluyendo métodos de tratamiento o diagnóstico de sujetos que padecen de diabetes tipo 2, obesidad, NASH, síndrome metabólico y enfermedades o trastornos relacionados.

Description

RECEPTOR FGF HUMANO Y PROTEÍNAS ENLAZADAS A ß-KLOTHO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presen»: ·:· descripción ss cefiore a moléculas de ácido ) nucleico que c :· i ¡ f:.can proteínas enlazadas al ant. i geno que se enlazan a ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. La presente descripción también proporciona proteínas enlazadas al antígeno que se enlazan a ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 que 0 inducen señalización tipo FGF21, así como composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas enlazadas al antígeno que se enlazan a ß-Klotho' o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4, incluyendo proteínas enlazadas al antígeno que in:lucen señ li zac ??' n tipo FGF21, y métodos para ! tratar trastorri: ·. metabó...icos usando tales ácidos nucleicos, polipéptidos , o composiciones farmacéuticas. Los métodos de diagnóstico que usan las proteínas enlazadas al antígeno también se proporcionan. 0 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El Factor 21 de Crecimiento de Fibroblastos (FGF21) es un polipéptido secretado que pertenece a una subfamilia de Factores de Crecimiento de Fibroblastos (FGFs) que incluye FGF1 , FGF21, y FGF23 .(Itoh " al., (2004) Trend Genet. 20:563-69). FGF21 es un FGF atípico en que es independiente de la heparina y funciona como una hormona en la. regulación de la glucosa, lípidos, y metabolismo de energía.

Este es altamente expresado en el hígado y el páncreas y es el único tni.embro de la familia FGF que se expresa principalmente · i el hígado. tos cationes tran.s t;n;i eos que sobreexpresan. FGF21 exhiben fenotipos metabólicos de baja tasa de crecimiento, bajos niveles de glucosa y triglicéridos en plasma, y una ausencia de diabetes tipo 2 asociada con la edad, hiperplasia de isletas, y obesidad. La administración farmacológica de proteína recombinante FGF21 en modelos de roedores y de primates resulta ' en niveles normalizados de glucosa en plasma, niveles reducidos de colesterol y triglicéridos, y tolerancia a la glucosa y sensibilidad a la insulina mejorados. Además, el FGF 1 reduce el peso corporal y la grasa corp .·( a!, por el inorem n t o en el gasto de energía, actividad física, y . tasa metabólica. La investigación experimental proporciona soporte para la administración farmacológica de FGF21 para el tratamiento de diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, y otras afecciones o trastornos metabólicos en humanos.

FGF21 es una hormona endocrina derivada del hígado que estimula la absorción de la glucosa en los adipocitos y la homeostasis de lípidos a través de la activación de su receptor. De manera interesante, además del receptor canónico FGF, el receptor FGF21 también comprende la ß-Klotho asociada a membranas como un cofactor esencial. La activación del receptor FGF21 lleva a múltiples efectos en una variedad de parámetros metabólicos.

En los mamíferos, los FGFs median su acción por medio de un conjunto de < Jotro recepto] e ; FGF, FGFR1- , qu<; a su vez se expresan en i'új.tiples vari.int.es empalmadas, por. ejemplo, FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4. Cada receptor FGF contiene un dominio intracelular de tirosina cinasa que se activa con el enlace a ligandos, lo que conduce a trayectorias de señalización cadena' abajo que involucran MAPKs (Erkl/2) , RAF1, AKT1 y STATs . (Kharitonenkov et. al., (2008) BioDrugs 22:37-44) . Diversos reportes sugirieren que las variantes de empalme del reportero "c" de FGFR1-3 exhiben afinidad específica a ß-Klotho y puede actuar como receptor endógeno para FGF21 (KU.T. .JU et al-., (2)0/) J. Biol. Chem. 28.7:26687-26695); Ogawa < t: al., (2007) Proe. Nati. Acacl. Sci. EUA 104:7432-7437); Kharitonenkov et al., (2008) J. Cell Physiol. 215:1-7). En el hígado, que expresa abundantemente tanto ß-Klotho como FGFR4, FGF21 no induce la fosforilación de MAPK sí bien es cierto el fuerte enlace de FGF21 al complejo ß-Klotho-FGFR4. En las células 3T3-L1 y el tejido .adiposo blanco, FGFR1 es por mucho el receptor más abundante, y es por lo tanto más probable que los receptores funcionales principales de FGF21 en este tejido sean los complejos de ß-Klotho/FGFRlc .

La presente descripción proporciona una proteina enlazada al antigeno humana (o humanizada) , tal como un anticuerpo monoclonal, que induce señalización tipo FGF21, por ejemplo, una proteina enlazada al antigeno que imita la función de FGF21. Tal anticuerpo es una molécula con actividad y se 1 < < :t ividad tipc F'<.E'2L poro con características terapéuticamente deseables agregadas típicas para un anticuerpo tal como estabilidad de proteína, carencia de inmunogenicidad, facilidad de producción y vida media larga in vivo.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Una proteína enlazada al antígeno aislada se proporciona. En una modalidad la proteína enlazada al antígeno comprende una secuenci de aminoácido seleccionada del grupo qu<; <:: asiste d<;: (a) una CDR3 de caden.i ligera que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: (i) una secuencia de CDR3 de cadena ligera que difiere por no más de dos adiciones, sustituciones, eliminaciones, y combinaciones de aminoácidos de los mismos, a partir de una secuencia de CDR3 de Ll-Lll, S.EQ ID NOs: 17-27; (ii) MQAXTEFPWT (SEQ ID NO: 1/4); i j i i.) GTWDSS LSX2VX;t (:5EC ID NO: 175); (iv) QQYDNLFT (SEQ ID NO: 122); (v) QQYGSAPLT (SEQ ID NO: 123); (vi) VLYMGSGIWV (SEQ ID NO: 124); (vii) ETWDSSLSAGV (SEQ ID NO: 127) ; en donde Xi es L o I; X2 es V o A; y X3 es V o A; (b) una secuencia de CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: (i) una secuencia de CDR3 de cadena pesada .que difiere por no más de una adiciones, sustituciones, eliminaciones de aminoácido, y combinaciones de los mismos, a partir de una secuencia de CDR3 de Hl-Hll, SEQ ID NOs:2»-¾8; (i i) GWFDX6 (SEQ ID NO: 178); (iii) T.rW JY (SEQ ;:D NO: ''9); (iv) YGGSEDY (SEQ ID NO: 100); (v) MVYVLDY (SEQ . ID NO: 101); (vi) VAGPFDF (SEQ ID NO: 102); en donde X6 es Y, l o F; y (c) la secuencia CDR3 de cadena ligera de (a) y la secuencia CDR3 de cadena pesada de (b) y la secuencia Fe de (c) y en donde la proteína enlazada al antígeno específicamente se enlaza a ß-Klotho.

En una modalidad adicional la proteína enlazada al antígeno comprende (a) una secuencia CDR1 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: (i) una secuencia CDR1 de caden.i ligera que d i. fiere por no. más de dos adiciones, sus ituciones, elin i naciones , y combinaciones de aminoácidos de los mismos, de una secuencia CDR1 de Ll-Lll, SEQ ID NOs: 17-27;. (ii) RSSQSLVX22YX23DGNTYLS (SEQ ID NO: 177.); (iii) SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID, NO: 107); (iv) QASQDINNYLN (SEQ ID NO: 108); (v) RASQSVSGNYLA (SEQ ID NO: 109); (vi) GVSSGSVSTRYYPS ¦ ÜEQ ID NO: 1 Id); en donde X>:; es H o está ausente; y X23 e:, S o está ausente; (b) una secuencia CDR2 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: (i) una secuencia CDR2 de cadena ligera que difiere por no más de dos adiciones, sustituciones, eliminaciones, y combinaciones de aminoácidos de los mismos, de una secuencia CDR2 de Ll-Lll, SEQ ID NOs: 17-27;. (ii) KISNRFS (SEQ ID NO: 112); (iii) DNNX4RPX5 (SEQ ID NO: 176); (iv) DTSNLET (SEQ ID NO: 114); (v) GASSRAT (SEQ ID NO: 115); (vi) STNTRSS (SEQ ID NO: 1 16); en donde X4 es K, o R; y X5 es S o está ausente; y (c) una secuencia CDR1 -le cadena' pesad. i seleccionada del grupo que consiste de: (i) una secuencia CDR1 de cadena pesada que difiere por no más de tres adiciones, sustituciones, eliminaciones de aminoácido, y combinaciones de los mismos, de una secuencia CDR1 de Hl-Hll, SEQ ID NOs:28-38; (ii) X19YX2oMX2 i en donde X19 es A, G, R, S, T, o í; X20 es Y, G o A; y X2i es H o S; (d) una CDR2 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de: (i) una secuencia CDR2 de cadena pesada que difiere por no más de cinco adiciones, sustituciones, y/o eliminaciones de aminoácido de una secuencia CDK.! de Ht-Hl], SEQ ID NOs : 28-38 ; (ii) INPX7SGGTNSAQKt'QG (SEQ . ID NO: 179); (iii) VIX8X9DGXi0Xi iXi2YYADSVKG (SEQ ID . NO: 180); (iv) Xi3lSGXi4GXi5Xi6TYYADSVKG (SEQ ID NO: 181); (v) VIX17YDGRNKYX18ADSVKG (SEQ ID NO: 182); en donde X7 es N o Y; X8 es W o G; X9 es F o Y; X10 es R o S; Xn es N o Y; Xi2 es Q o K; Xl3 es A o I)-; X; 4 es S o R; X;.3 s V o G; Xi5 es S o Y; Xr; es W o S; y Xi8 es Y o H; (e) la CDRl de cadena ligera de (a) y la CDR2 de cadena ligera de (b) ; (f) la CDRl de cadena ligera de (a) y la CDRl de cadena pesada de (c) ; (g) la CDRl de cadena ligera de (a) y la cadena pesada CDR2 de (d) ; (h) la CDRl de cadena ligera (b) y la CDRl de cadena pesada de (c) ; (i) la CDRl de' cadena pesada de (c) y la cadena pesada CDR2 de (d) ; (j) la CDR2 de cadena ligera de (b) y la cadena pesada CDR2 de (d) ; (k) la CDRl de cadena ligera de (a) , la CDR2 de cadena ligera de (b) , y la CDRl de cadena pesada de (c) ; (1) la C . ae cadena ligera de (b) , la CDKl pesada de (c) , y la cadena pesada CDR2 de (d) ; (m) la CDRl de cadena ligera de (a) , la CDRl de cadena pesada de (c) , y la cadena pesada CDR2 de (d) ; o (n) la CDRl de cadena ligera de (a) , la CDR2 de cadena ligera de (b) , la cadena pesada CDR2 de (c) , y la cadena pesada CDR2 de (d) , en donde la proteina enlazada al antigeno específicamente se enlaza a ß-Klotho.

En una modalidad adicional, la proteina enlazada al antigeno comprende (a)' un dominio variable de cadena ligera que comprende; (i) una secuencia CDRl de cadena ligera seleccionada ?·\· SEO. ID Nüs : -C6-11L (ii) una secuencia CDR2 de cadena ligera seleccionada de SEQ ID NOs: 112-119; (iii) una secuencia de CDR3 de cadena ligera seleccionada de SEQ ID NOs: 120-127; y (b) un dominio variable de cadena pesada que comprende: (i) una secuencia CDR1 de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NOs: 83--8R; (ii) una secuencia CDR2 de cadena pesada .·; > .eccionada de SKQ ID NOs: 89-97 ; y (Jii) una secuencia de CDR3 de -cadena pesada seleccionada de SEQ ID NOs: 98-105; o (c) el dominio variable de cadena ligera de (a) y el dominio variable de cadena pesada de (b) , en donde la proteina enlazada al antigeno específicamente se enlaza a ß-Klotho.

Todavía en una modalidad adicional, la proteína enlazada al antígeno comprende: (a) una secuencia de dominio variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: (i) aminoácidos que tienen una secuencia al menos 80% idéntica a una secuencia de dominio variable de cadena ligera seleccionada de Ll-Lll ,· SEQ ID NOs: 17-27; (ii) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de polinucleótido que es al menos 80% idéntica a una secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia de dominio . variable de cadena ligera de Ll-Lll, SEQ ID NOs: 17-27; (b) una secuencia de dominio variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de: (i) una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a una secuencia de dominio variable de cadena pesada de Hl-Hll de SEQ ID NOs: 28-38; (ii) una secuencia de aminoácidos . codificada por una secuencia de polinucleótido que es al menos 80% idéntica a una secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia de dominio variable de cadena pesada de Hl-Hll, SEQ ID NOs: 28-38; o (c) el dominio variable de cadena ligera de (a) y el dominio variable de o^Lsna pesada- io (b) ; en donde la proteina enlazada al antigeno específicamente se enlaza a ß-Klotho.

En otra modalidad la proteína aislada enlazada al antígeno de la reivindicación 5, que comprende ya sea: (a) una secuencia de dominio variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: Ll-Lll de SEQ ID NOs: 17-27; (b) una secuencia de dominio variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de: Hl-Hll de SEQ ID NOs: 28-38; o (c) el dominio variable de cadena ligera de (a) y el dominio variable de cadena pesada de (b) , en donde la proteina enlaz al ant.Lgeno específicamente se enlaza a ß-Klotho.

El dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada pueden seleccionarse del grupo de combinaciones que consiste de: L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10 y L11H11, en donde la proteína enlazada al antígeno^ específicamente se enlaza a ß-Klotho.

En algunas modalidades la proteína enlazada al antígeno comprende además: (a) la secuencia constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 13; (b) la secuencia constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 15; (c) la secuencia constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 9; o (d) la secuencia constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 13 o SEQ- ID NO: 15 y la secuencia constante de cadena pesada, de SEQ ID NO: 9.

La proteina enlazada al antigeno puede seleccionarse del grupo que consiste de un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, anticuerpo quimérico, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un fragmento de anticuerpo enlazado al antigeno, un anticuerpo de cadena sencilla, un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo, un fragmento Fab, un fragmento F(fa')X/ un anticuerpo de dominio, un anticuerpo IgD, un anticuerpo IgE, y anticuerpo IgM, y anticuerpo 'IgGl, y anticuerpo IgG2, y anticuerpo IgG3, y. anticuerpo IgG4, y anticuerpo IgG4 que tiene al menos una mutación en la región de bisagra.

También se proporciona una proteina enlazada al antigeno que, cuando se · nlaza a ß-Klo ho: (a) enlaza a |J- lotho con sustancialmente el mismo Kd como un anticuerpo de referencia; (b) induce señalización tipo FGF21 de 10% o mayor que la señalización inducida por un estándar FGF21 de tipo natural que comprende la forma madura de SEQ ID NO: 2 como se mide en un ensayo reportero de ELK-luciferasa; (c) exhibe un EC50 de ?µ? o menos di; señalización tipo FGF21 en un ensayo seleccionado del grupo ' que consiste de: (i) un ensayo basado en célula recombinante in vitro mediado por FGFRlc/pKlotho; (d) exhibe un EC50 de menos de 10nM de actividad agonista en FGFRlc en presencia de ß?-Lotho en un ensayo reportero mediado por el receptor FGFRlc recombinante in vitro; y (e) un EC50 de mayor que ?µ? de actividad agonista en FGFRlc en ausencia de PKlotho en un ensayo reportero, mediado por el receptor FGFRlc recombinante in vitro; (f) compite para enlace con un anticuerpo de referencia para ß-Klotho, en donde el anticuerpo de referencia comprende una combinación de secuencias de dominio' variable de cadena pesada y cadena ligera seleccionadas del grupo que consiste de L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10 y LllHll.

También se proporciona un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: TRLWKY V ( SEQ ID NO: 184); RRLYIF E (SEQ ID NO: 185); YKAWGYYV (SEQ ID NO: 186); YQAWGYYV (SEQ ID NO: .187); YQAWGYLV (SEQ ID NO: 188); YQA GYFV (SEQ ID NO: 189); FTWVFWNV (SEQ ID NO: 190); YQVWGYFV (SEQ ::D NO: 191); Y KWLKWNL (SEQ ID NO: 192); RRLYIFEW (SEQ 10 NO: 193); WAERGG (SEQ ID NO: 194); GGWAVGRI (SEQ ID NO: 195); YKYLVFWV (SEQ ID NO: 196); YKYLSYWV (SEQ ID NO: 197); YKTAWY K (SEQ ID NO: 198); YVFHKWWV (SEQ ID NO: 199); YVFYL K (SEQ ID NO: 200); YRWLHWHV (SEQ ID NO: 201); YKFLF HA (SEQ ID NO: 202); RRQWGF V (SEQ ID NO: 203) YSAWSFWV (SEQ ID NO: 204); LAR GF V (SEQ ID NO: 205) YDA GYWV (SEQ ID NO: 206); WRKYYHFWVS (SEQ ID NO: 207) KRLYGLF YD (SEQ ID NO: 208); KKHWSSLFFE (SEQ ID NO: 209) KAWPYSWEAV (SEQ LD NO: 210)'; KWYCGVLFNCQQ (SEQ ID NO: 211) HFGCGVIFNCVSD (SEQ ID NO: 212); ELCASGYGWCYLH (SEQ ID NO 213); APSCKSYIGFGLYHCWDG (SEQ ID NO: 214); y HFKCGMGLFECADP (SEQ ID NO: 215) .

También se proporciona una cadena pesada de proteina enlazada al antigeno que comprende un péptido que específicamente enlaza a uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, FGFR . En una modalidad la cadena pesada de proteína enlazada al antígeno comprende una secuencia de péptido seleccionada del grupo que consiste de: TRLWKYWV (SEQ ID NO: 184) RRLYIF E (SEQ Í:D NO 185); YKAWGYYV (SEQ ID NO: 186) YQAWGYYV ( SEQ ID NO: 187); · YQAWGYLV (SEQ ID NO: 188) YQAWGYFV (SEQ ID NO: 189); FTWVFWNV (SEQ ID NO: 190) YQVWGYFV (SEQ ID NO: 191); YK LKWNL (SEQ ID NO: 192) RRLYIFEW (SEQ ID NO: 193); WAERGG (SEQ ID NO: 194); GGWAVGRI (SEQ ID NO: 195); YKYLVFWV (SEQ ID NO: 196); YKYLSYWV (SEQ ID NO: 197); YKTAWYWK (SEQ ID NO: 198); YVFHKWWV (SEQ ID NO 199); YVFYL WK (SEQ ID NO: 200); YRWLHWHV (SEQ ID NO: 201) YKFLFWHA (SEQ ID NO:. 202); RRQWGFWV (SEQ ID NO: 203) YSAWSFWV (SEQ ID NO: 204); LARWGFWV (SEQ ID NO: 205) YDAWGY V (SEQ ID NO: 206); RKYYHF VS (SEQ ID NO: 207); KRLYGLF YD (SEQ ID NO: 208)'; KKHWSSLFFE (SEQ ID NO: 209); KAWPYSWEAV (SEQ ID NO: 210); E YCGVLFNCQQ (SEQ ID NO: 211); HFGCGVIFNCVSD (SEQ NO:. 212); WELCASGYGWCYLH (SEQ ID NO: 213); APSCKSYIGFGLYHCWDG (SEQ ID. NO: 214); y HFKCGMGLFECADP (SEQ ID NO: 215) . La cadena pesada de proteina enlazada al antígeno puede :·: mprender un r;.zo CH2, un rizo CH3 o tanto un rizo CH2 y uno CH3. En varias modalidades la cadena pesada comprende un rizo CH3, y el rizo CH3 puede comprender el péptido. En otras modalidades la cadena pesada comprende un rizo CH2 y el rizo CH2 puede comprender el péptido.

Todavía en otra modalidad una proteína enlazada al antígeno puede comprender la cadena pesada que comprende el péptido y en una modalidad adicional la cadena pesada de proteína enlazada al antígeno comprende una secuencia de CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consi.-. e de: (i) una secuencia de CDR3 de cadena pesada que difiere . por no más de una adiciones, sustituciones, eliminaciones de aminoácido, y combinaciones de los mismos, a partir de una secuencia de CDR3 de Hl-Hll, SEQ ID NOs:28-38; (ii) GWFDX6 (SEQ ID NO: 178); (iii) GTSFDY (SEQ ID NO: 99); (iv) YGGSFDY (SEQ ID NO: 100); (v) MVYVLDY (SEQ ID NO: 101); (vi) VAGPFDF (SEQ ID NO: 102); en donde X6 es Y, l o F; y en donde la proteína enlazada al antígeno específicamente se enlaza a ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C, FGFR .

En una modalidad adicional la proteína enlazada al antígeno comprende además: (a) una secuencia CDR1 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de: (i) una secuencia CDR1 de cadena pesada que difiere por no más de tres adiciones, sustituciones, eliminaciones de aminoácido, y combinaciones d<? los mismos, do una secuencia CDR1 de Hl-Hll, SEQ ID NOs:28-3íí; (ii) XL9YX20 X2i en donde X19 es A, G, R, S, T, o I; X20 es Y, G o A; y X2i es H o S; (b) una CDR2 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de: (i) una secuencia CDR2 de cadena pesada que difiere por no más de cinco adiciones, sustituciones, y/o eliminaciones de aminoácido de una secuencia CDR2 de Hl-Hll, SEQ ID NOs: 28-38; (ii) WINPX7SGGTNSAQKFQG (SEQ ID NO: 179); (iii) VIXi8X9DGXi0XiiXi2YYADSVKG (SEQ ID NO: 180); (iv) Xi3ISGXi4GXi5Xi6TYYADSVKG (SEQ ID NO: 181); (v) VIXi7YDGRNKYX18An.cVKG (SEQ . ID NO: 182) en donde X7 es N o Y; X8 es W o G; Xg es F o Y; X L0 es R o S; Xu es N o Y; X12 es Q o K; X13 es A o D; Xi4 es' S o R; Xi5 es V o G; Xi6 es S o Y; X17 es o S; y Xie es Y o H; y en donde la proteína enlazada al antígeno específicamente se enlaza a ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, FGFR4. En otra modalidad la proteína enlazada al antígeno comprende (a) un dominio variable de cadena pesada que comprende: (i) una secuencia CDR1 de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NOs: 83-88; (ii) una secuencia CDR2 de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NOs: 89-97; y (iii) una secuencia de CDR3 de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NOs: 98-105; o en donde la proteina enlazada al antigeno específicamente se enlaza a ß-Klotho y uno o más de FGFRl'c, FGFR2c, FGFR3c, FGFR4. Todavía en otra modalidad la proteína enlazada al antígeno comprende (a) una secuencia de dominio variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de: (i) una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a una secuencia de dominio variable de cadena pesada de Hl-Hll de SEQ ID NOs:28-38; (ii) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de polinucleótido que es al menos 80% idéntica a una secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia de dominio variable de cadena pesada de Hl-Hll, SEQ ID NOs: 28-38; en donde la proteína enlazada al antígeno específicamente se enlaza a ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, FGFR4. La proteína aislada enlazada al antígeno puede comprender: (a) una secuencia de dominio variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de: Hl-Hll, SEQ ID NOs: 28-38; en donde la proteína enlazada al. antígeno específicamente se enlaza a ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2C, FGFR3C, FGFR4.

También se proporciona una proteina enlazada al antigeno aislada que eu\» :CJ ficamente enlaza a ß-Klotho o ß- lotho y uno o más de FGFRlc, ' FGFR2c, FGFR3c, y FGFR . En una modalidad la cadena pesada de la proteina enlazada al antigeno comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: TRL KYWV (SEQ ID NO: 184); RRLYIFWE (SEQ ID NO: 185); YKAWGYYV (SEQ ID NO: 186); YQA GYYV (SEQ ID NO: 187); YQAWGYLV (SEQ ID NO: 188); YQAWGYFV (SEQ ID NO: 189); FT VF NV (SEQ ID NO: 190); YQVWGYFV (SEQ ID NO: 191); YK LK NL (SEQ ID NO: 192); RRLYIFEW (SEQ ID NO: 193); WAERGG (SEQ ID NO: 194); GG AVGRI (SEQ ID NO: 195); YKYLVF V (SEQ ID NO: 196) ; YKYLli YWV (SEQ ID NO : 197); YKTAWYWK (SEQ ID NO: 198 ) ; YVFHKWWV (SEQ ID NO: 199 ) ; YVFYL K (SEQ ID NO: 200) ; YRWLHWHV (SEQ ID NO: 201) ; YKFLF HA (SEQ ID NO: 202) ; RRQWGFWV (SEQ ID NO: 203) ; YSAWSFWV (SEQ ID NO: 204) ; LARWGFWV (SEQ ID NO: 205) ; YDAWGYWV (SEQ ID NO: 206) ; WRKYYHF VS (SEQ ID NO: 207) ; KRLYGLFWYD (SEQ ID NO: 208) ; KKHWSSLFFE (SEQ ID NO: 209) ; AWPYSWEAV (SEQ ID NO: 210) ; E YCGVLFNCQQ (SEQ ID NO: 211); HFGCGVI FNCVSD (SEQ ID NO: 212); WELCASGYGWCYLH (SEQ ID NO: 213); APSCKSYIGFGLYHCWDG (SEQ ID NO: 214); y HFKCGMGLFECADP (SEQ ID NO: 215).

En una mctalidad adicional la proteina enlazada al antigeno comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de: (a) una CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: (i) una secuencia de CDR3 de cadena ligera que difiere por no más de dos adiciones, sustituciones, eliminaciones, y combinaciones d aminoácidos de los mismos, a partir de una secuencia de CDR3 de Ll-Lll, SEQ ID NOs: 17-27; (ii) MQAXiEFPWT ( SEQ ID NO: 174); (iii) GTWDSSLSX2VX3 (SEQ ID NO: 175); (iv) QQYDNLFT (SEQ ID NO: 122); (v) QQYGSAPLT (SEQ ID NO: 123); (vi) VLYMGSGIWV (SEQ ID NO: 124); (vii) ET DSSLSAGV (SEQ ID NO: 127); en donde ?? es L o I; X2 es V o A; y X3 es V o A; (b) una secuencia de CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: (i) una secuencia de CDR3 de cadena pesada que difiere por no más de una adiciones, sus ituciones, eliminaciones de aminoácido, y combinaciones de los mismos, a partir de una secuencia de CDR3 de Hl-Hll, SEQ ID NOs: 28-38; (ii) GWFDX6 (SEQ ID NO: 178); (iii) GTSFDY (SEQ ID NO: 99); (iv) YGGSFDY (SEQ ID NO: 100); (v) MVYVLDY (SEQ ID NO: 101); (vi) VAGPFDF (SEQ ID NO: 102); en donde X6 es Y, l o F; (c) la secuencia CDR3 de cadena ligera de (a) y la secuencia CDR3 de cadena pesada de (b) y la secuencia Fe de (c) y en donde la proteina enlazada al antigeno específicamente se enlaza a ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR .

En otra modalidad la proteína enlazada al antígeno comprende ya .so.i: (a) una secuencia CDR1 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: (i) una secuencia CDR1 de cadena ligera qué difiere por no más de dos adiciones, sustituciones, eliminaciones, y combinaciones de aminoácidos de los mismos, de una secuencia CDR1 de Ll-Lll, SEQ ID NOs: 27-37; (ii) RS SQSLVX22YX23 DGNTYLS (SEQ ID NO: 177) (iii) SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID NO: 107); (iv) QASQDINNYLN (SEQ ID NO: 108); (v) RASOSVSGNYLA ( SEQ ID NO: 109); (vi) GVSSGSVSTRYYPS (SEQ ID NO: 110); en donde X22 es H o está ausente; y X23 es S o está ausente; (b) una secuencia CDR2 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: (i) una secuencia CDR2 de cadena ligera que difiere por no más de dos adiciones, sustituciones, eliminaciones, y combinaciones de aminoácidos de los mismos, de una secuencia CDR2 de Ll-Lll, SEQ ID NOs: 17-27; (ii) . KISNRFS (SEQ ID NO: 112); (iii) DNNX4RPX5 ( SEQ ID NO: 176); (iv) DTSNLET (SEQ ID NO: 114); (v) GASSRAT (SEQ ID NO: 115); (vi) STNTRSS (SEQ ID NO: 116); en donde X4 es K, N o R; y X5 es S o está ausente; (c) una secuencia CDR1 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de: (i) una secuencia CDR1 de cadena pesada que difiere por no más de tres adiciones, sustituciones, eliminaciones de aminoácido, y combinaciones de los mismos, de una secuencia CDR1 de Hl-Hll, SEQ ID NOs: 28-38; (ii) Xi9YX20MX2i en donde Xi9 es A, G, R,- S, T, o í; X20 es Y, G o A; y X21 es H o S; (d) una CDR2 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de: (i) una secuencia CDR2 de cadena pesada que difiere por no más de cinco adiciones, sustituciones, y/o eliminaciones de aminoácido de una secuencia CDR2 de Hl-Hll, SEQ ID NOs : 28-38; (ii) INPX7SGGTNSAQKFQG (SEQ ID .. . NO: 179) (iii) VI X8X9 DGX10X11X12YYADSVKG ; ¦ (SEQ ID NO: 180); (iv) Xi3lSGXi„GXi5Xi6TYYADSVKG (SEQ ID NO: 181); (v) VIXIVYDGRNKYXIEJADSVKG ( SEQ ID NO: 182); en donde X7 es N o Y; X8 es W o G; X9 mi F o Y; X10 es R o S; Xn es N o Y; X12 es Q o K; 13 es A o D; XI4 es. S o R; X15 es V o G; i6 es S o Y; XI7 es W o S; y Xi8 es Y o H; (e) la CDRl de cadena ligera de (a) y la CDR2 de cadena ligera de (b) ; (f) la CDRl de cadena ligera de (a) y la CDRl de cadena pesada de (c) ; (g) la CDRl de cadena ligera de (a) y la cadena pesada CDR2 de (d) ; (h) la CDRl de cadena ligera (b) y la.. CDRl de cadena pesada de (c) ; (i) la CDRl de cadena pesada de (c) y la cadena pesada CDR2 de (d) ; (j) la CDR2 de cadena ligera de (b) y la cadena pesada CDR2 de (d) ; (k) la CDRl de cadena ligera de (a) , la CDR2 de cadena I Lgera de (b) , y la CDRl de cadena pesada de (c) ; (1) la CDR2 de cadena ligera de (b) , la CDRl pesada de (c) , y la cadena pesada CDR2 de (d) ; (m) la CDRl de cadena ligera de (a) , la CDRl de cadena pesada de (c) , y la cadena pesada CDR2 de (d) ; .0 (n) la CDRl de cadena ligera de (a) , la CDR2 de cadena ligera de (b) , la cadena pesada CDR2 de (c) , y la cadena pesada CDR2 de. (d) , en donde la proteína enlazada al antigeno específicamente se enlaza a ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, ' FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4.

En una modalidad adicional la proteína enlazada al antígeno comprende (a) un dominio variable de cadena ligera que comprende: (i) una secuencia CDR1 de cadena ligera seleccionada de SEQ ID NOs : 106-111; (ii) una secuencia CDR2 de cadena ligera seleccionada de SEQ ID NOs: 112-119; (iii) una secuencia de CDR3 de cadena ligera seleccionada de SEQ ID NOs: 120-127; y (b) un dominio variable de cadena pesada que comprende: (i) una secuencia CDR1 de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NOs: 83-88; (ii) una secuencia CDR2 de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NOs: 89-97; y (iii) una secuencia de CDR3 de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NOs: 98-105; o (c) el dominio variable de cadena ligera de (a) y el dominio variable de cadena pesada de (b) , en donde la proteína enlazada al antígeno específicamente se enlaza a ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. Aún en otra modalidad la proteína enlazada al antígeno comprende (a) una secuencia de dominio variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: (i) aminoácidos que tienen una secuencia al menos 80% idéntica a una secuencia de dominio variable de cadena ligera seleccionada de Ll-Lll, SEQ ID NOs: 17-27; (ii) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de polinucleótido que es al menos 80% idéntica a una ecuencia · de po L inucleót ido que codifica la secuencia de dominio variable de cadena ligera de Ll-Lll, SEQ ID NOs: 17-27; (b) una secuencia de dominio variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de: (i) una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a una secuencia de dominio variable de cadena pesada de Hl-Hll de SEQ ID NOs: 28-38; (ii) una. secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de polinucleótido que es al menos 80% idéntica a ¦ una secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia de dominio variable de cadena pesada de Hl-Hll, SEQ ID NOs: 28-38; o (c) el dominio variable de cadena ligera de (a) y el dominio variable de cadena pesada de (b) ; en donde la proteina enlazada al antigeno específicamente se enlaza a ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR .

En una modalidad adicional la proteína enlazada al antígeno comprende (a) una secuencia de dominio variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: Ll-Lll de SEQ ID NOs: 17- 27;' (b) una secuencia de dominio variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de: Hl-Hll de SEQ ID NO;; : 28-38 ; o (c) el dominio variable de cadena ligera de (a) y el dominio variable de cadena pesada de (b) , en donde la proteína enlazada al antígeno específicamente se enlaza a ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4.

Todavía en otra modalidad el dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada de la proteína enlazada al antígeno se seleccionan del grupo de combinaciones que consiste de: L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10 y L11H11 en donde la proteína enlazada al antígeno específicamente se enlaza a ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4.

En una modalidad adicional la proteína enlazada al antígeno comprende (a) la secuencia constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 13; (b) la secuencia constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 15; .(c) la secuencia constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 9; o (d) la secuencia constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15 y la secuencia constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 9.

En modalidades la proteína enlazada al antígeno puede seleccionarse del grupo que consiste de un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, anticuerpo quimérico, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un fragmento de . anticuerpo enlazado al antígeno, un anticuerpo de cadena sencilla, un diacuerpo, un triacuerpo, un t.etracuerpo, un fragmento Fab, un fragmento F(fa')x, un anticuerpo de dominio, un anticuerpo IgD, un anticuerpo IgE, y anticuerpo IgM, y anticuerpo IgGl, y anticuerpo IgG2, y anticuerpo IgG3, y anticuerpo IgG4, y anticuerpo IgG4 que tiene al menos una mutación en la región de bisagra.

También se proporciona una proteína enlazada al antígeno que, cuando se enlaza a ß-Klotho: (a) enlaza a ß- lotho con sustancialmente el mismo Kd como un anticuerpo de referencia; (b) induce señalización tipo FGF21 de 10% o mayor que la señalización inducida por un estándar FGF21 de tipo natural que comprende la forma madura de SEQ ID NO: 2 como se mide en un ensayo reportero de ELK-luciferasa; (c) exhibe un EC50 de lOnM o menos de señalización tipo FGF21 en un ensayo seleccionado del grupo que consiste de: (i) un ensayo basado en célula recombinante in vitro mediado por FGFRlc/pKlotho; (d) exhibe un ECSO de menos de lOnM de actividad agonista en FGFRlc en presencia de PKlotho. en un ensayo reportero mediado por el receptor FGFRlc recombinante in vitro; y (e) un EC50 de mayor que ?µ? de actividad agonista en FGFRlc en ausencia de. PKlotho en un ensayo reportero mediado por el receptor FGFRlc recombinante in vitro; (f) compite para enlace con un anticuerpo de referencia para ß-Klotho, en donde el anticuerpo de referencia comprende una combinación de secuencias de dominio, variable de cadena pesada y cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10 y L11H11. Las proteínas enlazadas al antígeno descritas pueden ser de uso terapéutico y en modalidades, las proteínas enlazadas al antígeno, cuando se enlazan a ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 (a) disminuye la glucosa en la sangre en un modelo animal; (b) disminuye los niveles de lípido en el sueco en un modelo animal; o (c) (a) y (b) .

Las composiciones farmacéuticas que comprenden la proteína enlazada al antígeno descrita en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable de la misma también se proporcionan. En una modalidad, la composición farmacéutica puede comprender un agente activo adicional que es seleccionado del grupo que consiste de un radioisótopo, radionúclido, una toxina, o un grupo terapéutico y uno quimioterapéutico .

Un método para producir una proteína enlazada al antígeno que específicamente enlaza a ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 se proporciona. En una modalidad el método comprende incubar la célula hospedera descrita bajo condiciones que permiten expresar la proteína enlazada al antígeno.

Un método para prevenir o tratar una afección en un sujeto que necesita de tal tratamiento también se proporciona. En una modalidad, el método comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica descrita al sujeto, en donde la afección es tratable al disminuir la glucosa en la sangre. La afección puede seleccionarse de, por ejemplo, diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, NASH, enfermedad cardiovascular, y síndrome metabólico.

Generalmente, un método para prevenir o tratar una afección en un sujeto qüe necesita de tal tratamiento, en donde la afección es tratable al disminuir la glucosa en la sangre. En una modalidad el método comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica descrita en la presente al sujeto. La afección puede seleccionarse de, por ejemplo, diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, NASH, enfermedad cardiovascular, y síndrome metabólico.

Una modalidad incluye sistemas' de expresión, incluyendo líneas celulares, para la producción de proteínas enlazadas al antígeno que e enlazan a ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, . y FGFR4, y métodos para diagnosticar y tratar enfermedades relacionadas con FGF21 humano .

Aún en otro aspecto, la proteína enlazada al antígeno aislada puede competir para enlazar a uno o más de las formas humanas o no humanas de ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR , por ejemplo, las porciones extracelulares de ß-Klotho, FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, o FGFR4, con una de las proteínas enlazadas al antígeno descritas.

En una modalidad, la proteína aislada enlazada al antígeno es efectiva para disminuir los niveles de glucosa en el plasma, disminuir los triglicéridos circulantes, niveles de colesterol, mejorar la anormalidad de lipoproteína y sustancialmente mejorar el perfil del factor de riesgo cardiovascular, cuando se administra a un paciente con diabetes tipo 2 u otras enfermedades metabólicas.

En otro aspecto la proteína aislada enlazada al antígeno específicamente o selectivamente enlaza a ß-Klotho, por ejemplo, ß-Klotho humano, y en otro aspecto la proteína aislada enlazada al antígeno enlaza a ß-Klotho, por ejemplo, ß-Klotho, e induce señalización tipo FGF21.

En otro aspecto la proteína aislada enlazada al antígeno específicamente o selectivamente enlaza a ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 e induce señalización tipo FGF21.

En otro aspecto, la proteína enlazada al antígeno aislada específicamente o selectivamente enlaza a ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4, y no se enlaza específicamente o selectivamente a a-Klotho, FGFR2c, FGFR3c, o FGFR .

En otro aspecto la proteína aislada enlazada al antígeno específicamente o selectivamente enlaza a un complejo que comprende ß-Klotho, por ejemplo, ß-Klotho humano, y FGFRlc, por ejemplo, FGFRlc humano, y en otro aspecto la proteína aislada enlazada al antígeno enlaza a tal complejo e induce señalización tipo FGF21.

En un aspecto adicional, también ¦ se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican las proteínas enlazadas al antígeno descritas en la presente. En algunos casos, las moléculas de ácido nucleico aisladas están operablemente liqadas a una secuencia de control.

En otro aspecto, también se proporcionan vectores de expresión y células hospederas transformadas o transíectadas con los vectores de expresión que comprenden las moléculas de ácido nucleico aisladas antes mencionadas que codifican las proteínas enlazadas al antígeno descritas en la presente.

En otro aspecto, también se proporcionan métodos para preparar proteínas enlazadas al antígeno que específicamente o selectivamente enlazan a ß-Klotho.o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, FGFR4 e incluye la etapa de preparar la proteína enlazada al antígeno de una célula hospedera que secreta secretes la proteína enlazada al antígeno.

Otras modalidades proporcionan además un método para tratar o prevenir una afección asociada con FGF21 en un paciente, que comprende administrar a un paciente una cantidad efectiva de al menos una proteina enlazada al antigeno aislada. En una modalidad, la afección es diabetes, en otra modalidad la afección es obesidad y en otra modalidad la afección es dislipidemia.

También se proporciona una. fusión FGF2.1-proteína enlazada al antigeno. En una modalidad la fusión FGF21-proteina enlazada al antigeno comprende (a) un componente enlazado al antigeno; y (b) un componente FGF21. La fusión FGF21-proteina enlazada al antigeno puede comprender cualquiera del componente enlazado al antigeno proporcionado en la presente. En algunas modalidades el componente FGF21 de la fusión FGF21 -proteina enlazada al antigeno comprende al menos 25 residuos consecutivos de SEQ ID NO: 341. En otras modalidades el componente FGF21 de la fusión FGF21-proteina enlazada al antigeno comprende uno de (a) SEQ ID NO: 342 y (b) SEQ ID NO: 343. La fusión FGF21-proteina enlazada al antigeno puede comprender además una ligadura. Aún en otra modalidad la fusión FGF21-proteína enlazada al antigeno (a) el componente enlazado al antigeno comprende 2G10; y (b) un componente FGF21 seleccionado del grupo que consiste de (i) SEQ ID NO: 342; y (ii) SEQ ID NO: 343. En una modalidad de la fusión FGF21-proteina enlazada al antigeno el componente enlazado al antigeno se une' al' componente FGF21 por una ligadura seleccionada del grupo que consiste de (G4S)3, (SEQ ID NO: 336) (G4S)6 (SEQ ID NO: 337), (G4S)9 (SEQ ID NO: 338), (G4S) i2 (SEQ ID NO: 339) y (G4S)i5 (SEQ ID NO: 340). Todavía en otra modalidad el componente FGF21 se une a la cadena pesada del componente enlazado al antigeno 2G10. En modalidades particulares la cadena pesada de la fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 316, 320, 322, 324, 326, 318, 328, 330, 332 y 334. Alternativamente el componente FGF21 puede unirse a la cadena ligera del componente enlazado al antígeno 2G10.

Las fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno proporcionadas pueden tener varias actividades biológicas. En algunas modalidades, una fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno puede, cuando se enlaza a ß-Klotho, o ß-Klotho y. uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 : (a) disminuir la glucosa en la sangre en un modelo animal; (b) disminuir los niveles de lípido en el suero en un modelo animal; o (c) tanto (a) como (b) . · También se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica la cadena ligera, la cadena pesada o ambos del componente enlazado al antígeno de una fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno, en donde la secuencia es seleccionada de Ll-Lll, SEQ ID NOs: 17-27; Hl-Hll, SEQ ID NOs: 28-38, y SEQ ID NOs: 316, 320, 322, 324, 326, 318, 328, 330, 332 y 334. Los vectores de expresión que comprenden los ácidos nucleicos descritos, asi como células aisladas que comprenden los ácidos nucleicos y vectores de expresión descritos que comprenden los ácidos nucleicos también se proporcionan.

También se proporciona una composición farmacéutica que comprende una fusión FGF21-proteina enlazada al antigeno descrita en la presente, que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable. Un método para prevenir o tratar una afección en un sujeto que necesita de tal tratamiento se proporciona, y en una modalidad comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende una fusión FGF21-proteína enlazada al antigeno al sujeto, en donde la afección es tratable al disminuir la glucosa en la sangre. En varias modalidades la afección es seleccionada de diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, NASH, enfermedad cardiovascular, y síndrome metabólico .

Estos y. otros aspectos se describirán en mayor detalle en la presente. Cada uno de los aspectos proporcionados puede abarcar varias modalidades proporcionadas en la presente. Por lo tanto se anticipa que cada una de las modalidades involucra un elemento o combinaciones de elementos pueden incluirse en cada aspecto descrito, y todas las combinaciones de los aspectos y modalidades de arriba se consideran expresamente. Otras características, objetivos, y ventajas de las proteínas enlazadas al 'antige.no descritas y métodos y composiciones asociadas son aparentes en la descripción detallada que sigue.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura la-lb es una alineación que muestra la homología de secuencia entre FGFRlc humano (No. de Acceso al GenBank PI 1362; SEQ ID NO: 305) y FGFRlc de murino (No. de Acceso al GenBank NP_034336; SEQ ID NO: 306); varias características son destacadas, incluyendo el péptido de señal, secuencia de transmembrana, región enlazada a heparina y un dominio de proteína cinasa, y se proporciona una secuencia de consenso (SEQ. ID NO: 307).

La Figura 2a-2c es una alineación que muestra la homología de secuencia entre ß-Klotho humano (No. de Acceso al GenBank NP_7P3864; SEQ ID NO: 308) y ß-Klotho de murino (No. de Acceso al GenBank NP_112457; SEQ ID NO: 309); varias características son destacables, incluyendo la secuencia de transmembrana y dos dominios de glicosil hidrolasa, y se proporciona una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 310).

La Figura 3 es un perfil de citometría de flujo de células teñidas con FGF21-Alexa- 647 que se usaron como un inmunógeno para generar proteínas enlazadas al antígeno; la Figura muestra el nivel de expresión de un FGF21R (un complejo que comprende FGFRlc y ß-Klotho) y se enlaza a FGF21.

La Figura 4 es una secuencia (SEQ ID NO: 311) que muestra un inmunógeno usado para generar proteínas enlazadas al antígeno que comprende el dominio extracelular (ECD) de FGFRlc humano fusionado a un IgGl Fe por medio de una ligadura Glys (SEQ ID NO: 304); el componente FGFRlc está en mayúsculas, la ligadura en cursiva y subrayado y el Fe está en letras minúsculas.

La Figura 5 es una secuencia (SEQ ID NO: 312) que muestra un inmunógeno usado para generar proteínas enlazadas al antígeno que comprende el dominio extracelular (ECD) de ß-Klotho humano fusionado a un IgGl Fe por medio de una ligadura Gly5 (SEQ ID NO: 304); el componente ß-Klotho está en mayúsculas, la ligadura en cursiva y subrayado y el Fe está en letras minúsculas.

La Figura 6 es un gel SDS PAGE que muestra el nivel de pureza alcanzado de preparaciones de un complejo del receptor FGF21 soluble que comprende FGFRlc ECD-Fc y ß-Klotho ECD-Fc, que se empleó como un inmunógeno para generar proteínas enlazadas al antígeno.

La Figura 7 es una tabla que muestra el pi calculado para proteínas enlazadas a ß-Klotho 10H3, 1A2, 1B5, 3B4, 9D10, 3F4, ICIO, 2G10 y 8F9.

La Figura 8 es una alineación que muestra algunas de las características estructurales identificadas en las cadenas ligeras y pesadas de algunas de las proteínas enlazadas a ß-Klotho descritas. Secuencias de cadena ligera descritas como residuos 1-112 de SEQ ID NO: 23, residuos 1-112 de SEQ ID NO: 24, residuos 1-112 de SEQ ID NO: 22, residuos 1-112 de SEQ ID NO: 17, residuos 1-110 de SEQ ID NO: 26, residuos 1-110 de SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 313, residuos 1-110 de SEQ ID NO: 25 y residuos 1-110 de SEQ ID NO: 18. Secuencias de cadena pesada descritas como residuos 1-118 de SEQ ID NO: 34, residuos 1-118 de SEQ ID NO: 35, residuos 1-118 de SEQ ID NO: 33, residuos 1-118 de SEQ. ID NO: 28, SEQ ID NO: 314, residuos 1-120 de SEQ ID NO: 38, residuos 1-120 de SEQ ID NO: 37, residuos 1-120 de SEQ 'ID NO: 36 y residuos 1-120 de SEQ ID NO: 29.

Las Figuras 9? y 9B representan los resultados de estudios de enlace realizados en las proteínas enlazadas al antígeno 1A2, 1B5, 2G10, 3B4, 3E10, 3F4, 8F9, 9D10 y 10H3; Figura 9A es una serie de trazas de ensayos de enlace que demuestran el enlace de las proteínas enlazadas a ß-Klotho para ß-Klotho; la Figura 9B es una tabla que muestra las constantes de enlace generadas en los ensayos de enlace.

La Figura 10 es una serie de trazas de ensayos de enlace competitivos realizados usando, alguna de las proteínas enlazadas a ß-Klotho descritas.

La Figura 11 es una tabla que resume las propiedades de enlace de las proteínas enlazadas al antígeno enlazadas a ß-Klotho 3B4, 1A2, 1B5, 10H3, 9D10, 2G10, 3F4 y 8F9.

La Figura 12 es una tabla que resume las secuencias y propiedades de péptidos Rm26 enlazados a FGFRlc (SEQ ID NO: 21 1), Rm27 (SEQ ID NO: 212), Rm33 (SEQ ID NO: 213), Rm37 (SEQ ID NO: 214), Rm40 (SEQ ID NO: 215) y SR4 (SEQ ID NO: 187) .

La Figura 13 es una serie .de gráficas que representan los resultados de una serie de ensayos de enlace que demuestran que las ¦ proteínas enlazadas al antígeno biespecíficas 1A2-Rm26, 1A2-SR4, 2G10-Rm26, 2G10-Rm40, 2G10-SR4 enlazan a tanto a ß-Klotho y FGFRlc de humano como murino, que las proteínas enlazadas al antígeno 1A2-Rm40 y 2G10-Rm40 enlazan a tanto ß-Klotho humano como murino y que los péptidos Rm26, Rm40 y SR4 enlazan a FGFRlc humano y murino.

La Figura 14 es una serie de. gráficas que representan los resultados de una serie . de ensayos de luciferasa realizados en proteínas enlazadas al antígeno 1A2-Rm26, 1A2-Rm40, 1A2-SR4, 2G10-Rm26, 2G10Rm40, 2G10SR4, las proteínas enlazadas al antigeno 1A2 y 2G10, y el péptidos Rm26, Rm40, SR4 y KRm2, demuestran que la proteina enlazada al antigeno biespecifica 2G10-SR4 muestran actividades agonistas en la linea células ß-Klotho/FGFRlc, pero no en una linea celular FGFRlc; el panel izquierdo muestra los resultados de un ensayo de luciferasa usando células reporteras AMID que expresan b-Klotho y FGFRlc muestra actividad agonista de 2G10-SR4, y el panel derecho muestra los resultados de un ensayo de luciferasa usando células reporteras AMID que expresan FGFRlc.

La Figura 15 es una serie de de gráficas que representan los resultados de una serie de ensayos de luciferasa que demuestran que la proteina enlazada al antigeno biespecifica 2G10-SR4 muestra actividad agonista (panel izquierdo) y antagónica (panel derecho) en una linea celular ß-Klotho/FGFRlc; el panel izquierdo muestra los resultados de un ensayo de luciferasa usando células reporteras AMID que expresan ß-Klotho y FGFRlc y demuestran que la actividad agonista de 2G10-SR4, y el panel derecho muestra que cuando se incuba junto con 3nM FGF21, 2G10-SR4 y SR4 demuestra actividad antagónica.

La Figura 16 es una gráfica que representa los resultados de una serie de ensayos de enlace que demuestran que las fusiones de proteina enlazada al antigeno que comprenden el anticuerpo anti-p-Klotho 2G10, unido por medio de una ligadura, a una forma truncada FGF21 que comprende ya sea residuos 1-169 (SEQ ID NO: 342), cuando la configuración de la fusión es FGF2 l-ligadura-2G10 (de terminal N hasta C) residuos o residuos 1-170 (SEQ ID NO: 343) cuando la configuración de la fusión es 2G10-ligadura-FGF21 (de la terminal N hasta C) , enlaza a ß-Klotho murino.

La Figura 17 es una gráfica que representa los resultados de una serie de ensayos de enlace que demuestran que las fusiones de proteina enlazada al antigeno que comprenden el anticuerpo anti^-Klotho 2G10, unido por medio de una ligadura, a una forma truncada de FGF21 que comprende ya sea residuos 1-169 (SEQ ID NO: 342), cuando la configuración de la fusión es FGF2 l-ligadura-2G10 (de terminal N hasta C) residuos o¦ residuos 1-170 (SEQ ID NO: 343) cuando la configuración de la fusión es 2G10-ligadura-FGF21 (de la terminal N hasta C) , enlaza a ß-Klotho humano.

La Figura 18 es una gráfica que representa los resultados de ensayos de luciferasa que demuestran que la actividad de las fusiones de proteina enlazada al antigeno que comprenden el anticuerpo anti- -Klotho 2G10, unido por medio de una ligadura, a una forma truncada de FGF21 que comprende ya sea residuos 1-169 (SEQ ID NO: 342), cuando la configuración de la fusión es FGF21-ligadura-2G10 (de la terminal N hasta C) residuos o residuos 1-170 (SEQ ID NO: 343) cuando la configuración de la fusión es 2G10-ligadura-FGF21 (de la terminal N hasta C) , es dependiente de la orientación para el componente FGF21 y es independiente de la longitud de la ligadura en un ensayo de luciferasa usando células reporteras AMID que expresan ß-Klotho y FGFRlc en ausencia de FGF21.

La Figura 19 es una gráfica que representa los resultados de una serie de ensayos de luciferasa que demuestran que las fusiones de proteina enlazada al antigeno que comprenden el anticuerpo anti- -Klotho 2G10, unido por medio de una ligadura, a una forma truncada de FGF21 que comprende ya sea residuos 1-169 (SEQ ID NO: 342), cuando la configuración de la fusión es FGF21-ligadura-2G10 (de terminal N hasta C) residuos o residuos 1-170 (SEQ ID NO: 343) cuando la configuración de la fusión es 2G10-ligadura-FGF21 (de la terminal N hasta C) , no muestra actividad antagónica detectable en un ensayo de luciferasa usando células reporteras AMID que expresan ß-Klotho y FGFRlc cuando se incuban con FGF21 3? .· La Figura 20 es , una gráfica que representa los resultados de una serie de ensayos de luciferasa que demuestran que las fusiones de proteina enlazada al antigeno que comprende el anticuerpo anti- -Klotho 2G10, unido por medio de una ligadura, a una forma truncada de FGF21 que comprende ya sea residuos 1-169 (SEQ ID NO: 342), cuando la configuración de la fusión- es FGF21-ligadura-2G10 (de terminal N hasta C) residuos o residuos 1-170 (SEQ ID NO: 343) cuando la configuración de la fusión es 2G10-ligadura-FGF21 (de la terminal N hasta C) , no muestra actividad detectable en un ensayo de luciferasa usando células reporteras AMID que expresan ß-Klotho y FGFRlc cuando se incuban con a-Klotho 3nM en ausencia de FGF21.

La Figura 21 es una gráfica que representa los resultados de una serie de ensayos de luciferasa que demuestra que las fusiones de proteína enlazada al antígeno que comprenden el anticuerpo anti- -Klotho 2G10, unido por medio de una ligadura, a una forma truncada de FGF21 que comprende ya sea residuos 1-169 (SEQ ID NO: 342) , . cuando la configuración de la fusión es FGF21-ligadura-2G10 (de terminal N hasta C) residuos o residuos 1-170 (SEQ ID NO: 343) cuando la configuración de la fusión es 2G10-ligadura-FGF21 (de la terminal N hasta C) , no muestra actividad detectable en un ensayo de luciferasa usando células reporteras AMID que expresan FGFRlc pero sin ß-Klotho en ausencia de FGF21.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La sección de encabezados usada en la presente es para propósitos de organización únicamente y no son para construirse como que limitan la materia objeto descrita.

A menos que se defina de otra manera en la presente, los términos científicos y técnicos usados en conexión con la solicitud actual tendrán los significados que se entienden comúnmente por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Además, a menos que se requiera de otra manera por el contexto, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán el singular.

Generalmente, las nomenclaturas usadas en conexión con, y técnicas de, cultivo celular y tejido, biología molecular, inmunología, microbiología, genéticos y química e hibridación de proteína y ácido nucleico descritas en la presente son aquellas bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Los métodos y técnicas de la solicitud actual generalmente se realizan de acuerdo a los métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y discuten a lo largo de la especificación actual a menos que se indique de otra manera. Ver, por ejemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), Ausubel et al, Current Protocole in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow y Lañe Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), que se incorporan en la presente como referencia. Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se realizan, de acuerdo a especificaciones del fabricante, como se realiza comúnmente en la técnica o como se describe en la presente. La terminología usada en conexión con, y los procedimientos de laboratorio y técnicas de, química analítica, química . orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica descrita en la presente son aquellos bien conocidos y comúnmente usados en la técnica. Las técnicas estándares pueden usarse para síntesis química, análisis químico, preparación farmacéutica, formulación, y suministro, y tratamiento' de pacientes.

Debe entenderse que la descripción actual no se limita a la metodología particular, protocolos, y reactivos, etc., descritos en la presente y como tales pueden variar. La terminología usada en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares únicamente, y no se pretende para limitar el alcance de la presente descripción.

Diferente a los ejemplos de operación, o donde se indique de otra manera, todos los números que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reacción usadas en la presente deben entenderse como modificados en todos los casos por el término "alrededor de." El término "alrededor de" cuando se usa en conexión con porcentajes puede significar +-5%, por ejemplo, 1%, 2%, 3%, 4% o 5%.

Definiciones Como se usa en la presente, los términos "un" y "uno" significa "uno o más" a menos que se establezca específicamente de otra manera.

Una "proteína enlazada al antígeno" es una proteína que comprende una porción que específicamente enlaza a un antígeno y, opcionalmente , una porción de estructura o andamiaje que permite que la porción enlazada al antígeno adopte una conformación que promueve el enlace de la proteína enlazada al antígeno al antígeno. Los ejemplos de proteínas enlazadas al antígeno incluyen un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado; un anticuerpo, quimérico; un anticuerpo recombinante ; un anticuerpo de cadena sencilla; un diacuerpo; un triacuerpo; un tetracuerpo; un fragmento Fab; un fragmento F(ab' )2; un anticuerpo IgD; un anticuerpo IgE; un anticuerpo Ig ; un anticuerpo . IgGl; un anticuerpo IgG2; un anticuerpo IgG3; o un anticuerpo IgG4, y fragmentos de los mismos. La proteína enlazada al antígeno puede comprender, por ejemplo, un andamiaje artificial o' andamiaje de proteína alternativo con CDRs injertados o derivados CDR. Tales andamiajes incluyen, pero no se limitan a, andamiajes derivados de anticuerpo que comprende mutaciones introducidas para, por ejemplo, estabilizar la estructura tridimensional de la proteína enlazada al antígeno así como andamiajes completamente sintéticos que comprenden, por ejemplo, un polímero biocompatible . Ver, por ejemplo, Korndorfer et al, 2003, Proteins: Structu're, Function, and Bioinformatics , 53(1): 121-129 (2003); Roque et al, Biotechnol. Prog. 20:639-654 (2004). Además, los miméticos de anticuerpo de péptido ("PAMs") pueden usarse, así como andamiajes basados en miméticos de anticuerpo que utilizan componentes de fibronectina como un andamiaje.

Una proteína enlazada al antígeno puede tener, por ejemplo, la estructura de una inmunoglobulina que se presenta naturalmente. Una "inmunoglobulina" es una molécula tetramérica. En una inmunoglobulina que se presenta naturalmente, cada tetrámero se compone de dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, cada par que tiene una cadena "ligera" (alrededor de 25 kDa) y una "pesada" (alrededor de 50-70 kDa) . La porción de terminal amino de cada cadena incluye una región variable de alrededor de 100 hasta 110 o más aminoácidos . principalmente responsable para reconocimiento de antígeno. La porción de terminal carboxi de cada cadena define una región constante principalmente responsable para función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa, o epsilon, y definen el isotipo de anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes se unen por una región "J" de alrededor de 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada también incluye una región "D" de alrededor de 10 más aminoácidos. Ver generalmente, Fundamental Immunology, Cap. 7 (Paul, ., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (incorporada como referencia en su totalidad para todos los propósitos) . Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forma el sitio enlazado al anticuerpo de manera que Una inmunoglobulina intacta tiene dos sitios de enlace.

Las cadenas de inmunoglobulina que se presentan naturalmente exhiben la misma estructura general de regiones de estructura relativamente conservadas (FR) unidas por tres regiones hipervariables, también nombradas regiones que determinan la complementariedad o CDRs. De la terminal N hasta la terminal C, tanto cadenas pesadas como ligeras comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos para cada dominio es de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. en secuencias de Proteins of I munological Interest, 5a Ed. , US Dept . of Health and Human Services, PHS, NIH, Publicación NIH No. 91-3242, 1991. Como se desea, las CDRs también pueden redefinirse de acuerdo a un esquema de nomenclatura alternativa, tal como aquella de Chothia (ver Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; o Chothia et al, 1989, Nature 342 : 878- 883) .

Una proteina enlazada al antigeno o fusión FGF21-proteina enlazada al antigeno se dice que "específicamente enlaza" su antigeno objetivo cuando la constante de disociación (KD) es <10~8 M. La proteína enlazada al antígeno o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno específicamente se enlaza al antígeno con "afinidad alta" cuando el KD es <5x 10"9 M, y con "afinidad muy alta" cuando el KD es <5x 10"10 M. En una modalidad, una proteína enlazada al antígeno o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno enlazará a ß-Klotho (por ejemplo ß-Klotho humano) o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4, (por ejemplo, ß-Klotho humano, FGFRlc humano, FGFR2c humano, FGFR3c humano, o FGFR4 humano) , con un KD de entre alrededor de 10"7 M y 10"12 M, y aún en otra modalidad las proteínas enlazadas al antígeno o fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno se enlazarán con un KD<5X 10~9 M.

Como se usa en la presente el término "fusión FGF21-proteina enlazada al antigeno" significa un polipéptido que comprende (a) un componente de proteina enlazada al antigeno que comprende un "proteina enlazada al antigeno, " como se define en la presente, que específicamente enlaza a ß-Klotho o a un ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; y (b) un componente FGF21 que comprende FGF21 o un fragmento del mismo. El polipéptido ß-Klotho puede derivarse de cualquier especie, por ejemplo humano, ratón o rata. De forma similar, el polipéptido FGF21 puede derivarse de cualquier especie, por ejemplo humano, ratón o rata. La proteína enlazada al antígeno puede comprender cualquier proteína enlazada al antígeno que específicamente enlaza a ß-Klotho, incluyendo las proteínas enlazadas al antígeno descritas en la presente en las Tablas 1-3 y 6.

El componente de polipéptido FGF21 puede comprender una forma truncada de la secuencia de polipéptido FGF21 de longitud completa (SEQ ID NO.: 2) o madura (SEQ ID NO: 341) . La secuencia de polipéptido FGF21 puede truncarse en la terminal C, la terminal N o tanto la terminal C y puede estar en el intervalo en longitud desde 180 o menos aminoácidos hasta 25 o más aminoácidos, por ejemplo 180, 179, 178, 177, 176, 175, 174, 173, 172, ' 171, 170, 169, 168, 167, 166, 165, 160, 155, 150, 145, 140, 135, . 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, '60, 55, 50, 45, 40, 35, 30 o 25 aminoácidos.

Una ligadura puede emplearse para unir el componente de proteina enlazada al antigeno al componente FGF21. Cualquier ligadura conveniente puede emplearse, por ejemplo una ligadura de la forma (GlyxSer)y (SEQ ID NO: 335), en donde x e y son independientemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más. Los ejemplos específicos de ligaduras incluyen (G4S)3 (SEQ ID NO: 336), (G4S)6 (SEQ ID NO: 337), (G4S)9 (SEQ ID NO: 338), (G4S)12 (SEQ ID NO: 339), y (G4S)15 (SEQ ID NO: 340) .

Los ejemplos específicos de fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno incluyen FGF21 humano (1-169) - (G4S) 3-2G10 (SEQ ID NO: 316), FGF21 humano (1-169) - (G4S) 6-2G10 (SEQ ID NO: 320), FGF21 humano ( 1-169 ) - (G4S ) 9-2G1.0 (SEQ ID NO: 322), FGF21 humano ( 1-169 )- (G4S ) 12-2G10 (SEQ ID NO: 324), FGF21 humano (1-169) - (G4S) 15-2G10 (SEQ ID NO: 326), 2G10- (G4S) 3-FGF21 humano (1-170) (SEQ ID NO: 318), 2G10- (G4S) 6-FGF21 humano (1-170) (SEQ ID NO: 328), 2G10- (G4S) 9-FGF21 humano (1-170) (SEQ ID NO: 330), 2G10- (G4S) 12-FGF21 humano (1-170) (SEQ ID NO: 332), y 2G10- (G4S) 15-FGF21 humano (1-170) (SEQ ID NO: 334).

El componente FGF21 ' de una fusión puede unirse al componente enlazado al antígeno de la fusión en cualquier terminal N de la cadena ligera o pesada del componente enlazado al antígeno o en la terminal C de la cadena pesada del componente enlazado al antígeno. Los dos componentes pueden unirse por medio de una secuencia de ligadura o pueden fusionarse directamente juntos. Una fusión puede opcionalmente comprender una metionina de terminal N, que puede introducirse como una consecuencia de expresión en un sistema de expresión no mamífero.

Un "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina intacta o a una porción enlazada al antígeno de la misma que compite con el anticuerpo intacto para enlace específico, a menos que se especifique de otra manera. Las porciones enlazadas al antígeno pueden producirse por técnicas de ADN recombinantes o por desdoblamiento enzimático o químico de anticuerpos intactos. Las porciones enlazadas al antígeno incluyen, ínter alia, Fab, Fab' , F(ab')2, Fv, anticuerpos de dominio (dAbs) , fragmentos incluyendo regiones que determinan la complementariedad (CDRs) , anticuerpos de cadena sencilla (scFv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, y polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir enlace al antígeno específico para el polipéptido.

Un fragmento Fab es un fragmento monovalente que tiene los dominios VL, VH, CL y CHI; un fragmento F(ab')2 es un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab ligados por un puente de disulfuro en la región de bisagra; un fragmento Fd tiene los dominios VH y CHI; un fragmento Fv tiene los dominios VL y VH de una extremidad sencilla de un anticuerpo; y un fragmento dAb tiene un dominio VH, un dominio VL, o un fragmento enlazado al antigeno de un dominio VH o VL (Patente de E.U.A. No. 6,846,634, 6,696,245, Publicación de Solicitud de E.U.A. No. 05/0202512, 04/0202995, 04/0038291, 04/0009507, 03/0039958, ard et al, Nature 341 :544-546 (1989)).

Un anticuerpo, de cadena sencilla (scFv) es un anticuerpo en el cual una región VL y una VH se unen por medio de una ligadura (por ejemplo, una secuencia sintética de residuos de aminoácido) para formar una cadena de proteina continua en donde la ligadura es suficientemente grande para permitir que la cadena de proteina se pliegue por si misma y formar un sitio enlazado al antigeno monovalente (ver, por ejemplo, Bird et al, Science 242:423-26 (1988) y Huston et al, 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85:5879-83 (1988)). Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes que comprenden dos cadenas de polipéptido, en donde cada cadena de polipéptido comprende dominios VH y VL unidos por una ligadura que es demasiado corta para permitir la coincidencia entre dos dominios en la misma cadena, de esta manera permite que cada dominio coincida con un dominio complementario en otra cadena de polipéptido (ver, por ejemplo, Holliger et al., 1993, Proc.

Nati. Acad. Sci. EUA ' 90 : 6444-48 (1993), y Poljak et al, Structure 2: 1121-23 (1994)). Si las dos cadenas de polipéptido de un diacuerpo son idénticas, entonces un diacuerpo que resulta de la coincidencia tendrá dos sitios enlazados al antigeno idénticos. Las cadenas de polipéptido que tienen diferentes secuencias pueden usarse para hacer un diacuerpo con dos sitios enlazados al antigeno diferentes. De forma similar, tricuerpos y tetracuerpos son anticuerpos que comprende tres y cuatro cadenas de polipéptido, respectivamente, y formando tres y cuatro sitios enlazados al antigeno, respectivamente, que pueden ser los mismos o diferentes .

Las regiones que determinan la complementariedad (CDRs) y regiones de estructura (FR) de un anticuerpo dado puede identificarse usando el sistema descrito por Kabat et al. en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, Publicación NIH No. 91-3242, 1991. Una o más CDRs pueden incorporarse en una molécula ya sea covalentemente o no covalentemente para hacer una proteina enlazada al antigeno. Una proteina enlazada al antigeno puede incorporar las CDR(s) como parte de una cadena de polipéptido más larga, puede ligarse covalentemente las CDR(s) a otra cadena de polipéptido, o puede incorporar las CDRs no covalentemente. Las CDRs permiten la proteina enlazada al antígeno para enlazar específicamente a un antígeno particular de interés.

Una proteína enlazada al antígeno puede tener uno o más sitios de enlace. Si existe más de un sitio de enlace, los sitios de enlace pueden ser idénticos uno con el otro o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina humana que se presenta naturalmente típicamente tiene dos sitios de enlace idénticos, mientras que un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" tiene dos sitios de enlace diferentes.

El término "anticuerpo humano" incluye todos los anticuerpos que tienen una o más regiones variables y constantes derivados de secuencia de inmunoglobulina humana. En una modalidad, todos de los dominios variables y constantes se derivan de secuencias de inmunoglobulina humana (un anticuerpo completamente humano) . Estos anticuerpos pueden prepararse en una variedad de formas, los ejemplos de los cuales se describen a continuación, incluyendo a través de la inmunización con un antígeno de interés de un ratón que se modifica genéticamente para expresar anticuerpos derivados de genes que codifican la cadena ligera y/o pesada humana.

Un anticuerpo humanizado tiene una secuencia que difiere de la secuencia de un anticuerpo derivado de una especie no humana por una o · más sustituciones, eliminaciones, y/o adiciones de aminoácido, de manera que el anticuerpo humanizado es menos probable para inducir una respuesta inmunitaria, y/o induce una respuesta inmunitaria menos severa, como se compara con el anticuerpo de especie no humana, cuando se administra a un sujeto humano. En una modalidad, cientos aminoácidos en los dominios de estructura y constantes de las cadenas pesada y/o ligera del anticuerpo de especie no humana se mutan para producir el anticuerpo humanizado. En otra modalidad, los dominios constantes de un anticuerpo humano se fusionan a los dominios variables de una especie no humana. En otra modalidad, uno o más residuos de aminoácido en una o más secuencias CDR de un anticuerpo no humano se cambian para reducir la probabilidad de inmunogenicidad del anticuerpo no humano cuando se administra a un sujeto humano, en donde los residuos de aminoácido cambiados no son ya sea críticos . para enlace inmunoespecífico del anticuerpo a su antigeno, o los cambios a la secuencia de aminoácidos que se hacen son cambios conservadores, de manera que el enlace del anticuerpo humanizado al antígeno no es significativamente peor que el enlace del anticuerpo no humano al antígeno. Los ejemplos de cómo hacer anticuerpos humanizados pueden encontrarse en la Patente de E.U.A. Nos. 6,054,297, 5,886,152 y 5,877,293.

El término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que contiene una o más regiones de un anticuerpo y una o más regiones de uno o más de otros anticuerpos, tal como la CDR o las regiones CH2, CH3, o Fe. En una modalidad, una o más de las CDRs se ' derivan de un anticuerpo humano que enlaza ß-Klotho humano o ratón o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c y FGFR . En otra modalidad, todas de las CDRs se derivan de un anticuerpo humano que enlace ß-Klotho humano o ratón o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4. En otra modalidad, las CDRs de más de un anticuerpo humano, que enlazan ß-Klotho humano o ratón o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 se mezclan y coinciden en un anticuerpo quimérico. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede comprender una CDR1 de la cadena ligera de un primer anticuerpo humano que enlaza ß-Klotho humano o ratón o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4, una CDR2 y una CDR3 de la cadena ligera de un segundo anticuerpo humano que enlaza ß-Klotho humano o ratón o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 , o las CDRs de la cadena pesada de un tercer anticuerpo humano que enlaza ß-Klotho humano o ratón o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4, que puede unirse a una región CH2, CH3 o Fe de aún otro anticuerpo u otra fuente. Además, las regiones de estructura pueden derivarse de uno de los mismos anticuerpos que enlazan ß-Klotho humano o ratón o ß—Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4, de uno o más anticuerpos diferentes, tal como un anticuerpo humano, o de un anticuerpo humanizado. En un ejemplo de un anticuerpo quimérico, una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con, homologa a, o derivada de un anticuerpo de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de las cadenas son idénticas con, homologas a, o derivadas de un anticuerpo o anticuerpos de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo. También se incluyen fragmentos de tales anticuerpos que exhiben la actividad biológica deseada (por ejemplo, la capacidad de enlazar específicamente ß-Klotho) .

El término "cadena ligera" incluye una cadena ligera de longitud completa y fragmentos de los mismos que tienen secuencia de región variable suficiente para conferir especificad de enlace. Una cadena ligera de longitud completa incluye una región variable dominio, VL, y una región constante dominio, CL. El dominio de región variable de la cadena ligera está en la terminal amino del polipéptido. Las cadenas ligeras incluyen cadenas kappa y cadenas lambda.

El término "cadena pesada" incluye una cadena pesada de longitud completa y fragmentos de los mismos que tienen secuencia de región variable suficiente para conferir especificidad de enlace. Una cadena pesada de longitud completa incluye una . región variable dominio, VH y tres dominios de región constante, CH1, CH2, y CH3. El dominio VH está en la terminal amino del polipéptido, y los dominios CH están en la terminal carboxilo, con el CH3 está más cerca a la terminal carboxi del polipéptido. Las cadenas pesadas pueden ser de cualquier isotipo, incluyendo IgG (incluyendo subtipos IgGl, IgG2, IgG3- y IgG4), IgA (incluyendo subtipos IgAl y IgA2) , IgM e IgE.

El término "fragmento inmunológicamente funcional" (o simplemente "fragmento") de una proteina enlazada al antigeno, por ejemplo, un anticuerpo o cadena de inmunoglobulina (cadena ligera o pesada) , como se usa en la presente, es una proteina enlazada al antigeno que comprende una porción (a pesar de cómo tal porción se obtiene o sintetiza) de un anticuerpo que carece de al menos alguno de los aminoácidos presentes en una cadena de longitud completa pero que es capaz de enlazar específicamente a un antígeno. Tales fragmentos son biológicamente activos en que enlazan específicamente a antígeno objetivo y puede competir con otras proteínas enlazadas al antígeno, incluyendo anticuerpos intactos, para enlace -específico a un epítopo dado. En un aspecto, tal fragmento mantendrá al menos una CDR presente en la cadena pesada o ligera de longitud completa, y en algunas modalidades comprenderá una cadena pesada y/o cadena ligera sencilla o porción de la misma. Estos fragmentos biológicamente activos pueden producirse por técnicas de ADN recombinantes , o pueden producirse por desdoblamiento enzimático o químico de proteínas enlazadas al antígeno, incluyendo anticuerpos intactos. Los fragmentos de inmunoglobulina inmunológicamente funcionales incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab' , F(ab' )2, Fv, anticuerpos de dominio y anticuerpos de cadena sencilla, y pueden derivarse de cualquier fuente mamífera, incluyendo pero no limitado a humano, ratón, rata, camélido o conejo. Se contempla además que una porción funcional de las proteínas enlazadas al antígeno descritas en la presente, por ejemplo, una o más CD s, pueden enlazarse covalentemente a una segunda proteína o a una molécula pequeña para crear un agente terapéutico dirigido, a un objetivo particular en el cuerpo, que posee propiedades terapéuticas bifuncionales, o que tiene una vida media de suero prolongada.

Una "Fe" o "región Fe" comprende uno o dos fragmentos de cadena pesada, y puede comprender los dominios CH2 y/o CH3 de un anticuerpo. Cuando dos fragmentos de cadena pesada se presentan, los dos fragmentos de cadena pesada se mantienen juntos por dos o más enlaces de disulfuro y por interacciones hidrofóbicas de los dominios CH3. Una región Fe puede presentarse naturalmente (por ejemplo, una región Fe derivada de un IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, etc.) o puede ser una secuencia preparada por ingeniería que comprende uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, etc.) mutaciones, eliminaciones o inserciones introducidas en un fragmento de cadena pesada que se presenta naturalmente o fragmentos que hacen una secuencia Fe.

Un "fragmento Fab'" contiene una cadena ligera y una porción de una cadena pesada que- contiene el dominio VH y el dominio CHI y también la región entre los dominios CH1 y CH2, de manera que un enlace de disulfuro de intercadena puede formarse entre las dos cadenas pesadas de dos fragmentos Fab' para formar una molécula F(ab')2.

Un "fragmento F(ab')2" contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que contienen una porción de la región constante entre los dominios CH1 y CH2, de manera que un enlace de disulfuro de intercadena se forma entre las dos cadenas pesadas. Un fragmento F(ab')2 de esta manera está compuestos de dos fragmentos Fab'- que se mantienen juntos por un enlace de disulfuro entre las dos cadenas pesadas.

La "región Fv" comprende las regiones variables de tanto cadenas ligeras como pesadas, pero carece de las regiones constantes .

Un "anticuerpo de dominio" es un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional que contiene únicamente la región variable de¦ una cadena pesada o la región variable de una cadena ligera. En algunos casos, dos o más regiones VH se unen covalentemente con una ligadura de péptido para crear un anticuerpo de dominio bivalente. Las dos regiones VH de un anticuerpo de dominio bivalente puede dirigir los mismos o diferentes antigenos.

Una "proteína enlazada al antígeno bivalente" o "anticuerpo bivalente" comprende dos sitios enlazados al antígeno. En algunos casos, los dos sitios de enlace tienen las mismas especificidades de antígeno. Las proteínas enlazadas al antigeno bivalentes y anticuerpos bivalentes pueden ser biespecífieos , ver, por ejemplo, infra.

Una "proteína enlazada al antígeno multiespecifica" o "anticuerpo multiespecifico" es uno que dirige más de un antígeno o epítopo.

Una proteína enlazada al antígeno o anticuerpo "biespecífico, " "específico doble" o "bifuncional" es una proteína enlazada al antígeno de híbrido o anticuerpo, respectivamente, que tiene dos sitios enlazados al antígeno diferentes. Las proteínas enlazadas al antígeno biespecíficas y anticuerpos son una especie de proteína enlazada al antígeno multiespecifica o anticuerpo multiespecifico y puede producirse por una variedad de métodos incluyendo, pero no limitado a, fusión de hibridomas, ligadas a un fragmento Fe hasta uno Fab' o ligadas de . fragmentos Fab' . Ver, por ejemplo, Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553. Los dos sitios de enlace de una proteina enlazada al antigeno biespecifica o anticuerpo enlazará a dos epitopos diferentes, que pueden residir en los mismos o diferentes objetivos de proteina .

Los términos "señalización tipo FGF21" e "induce señalización tipo FGF21," cuando se aplica a una proteina enlazada al antigeno de la presente descripción (incluyendo proteínas enlazadas al antígeno biespecíficas ) , significa que la proteína enlazada al antígeno imita, o modula, el efecto biológico in vivo inducido por el enlace de FGF21 a un receptor FGF (por ejemplo, FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 ) y ß-Klotho, e induce una respuesta , biológica que de otra manera debe resultar de enlace FGF21 a un receptor FGF (por ejemplo, FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4) y ß-Klotho in vivo. Al evaluar el enlace y especificad e inducción de una respuesta biológica de una proteína enlazada al antígeno, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional del mismo, un anticuerpo o fragmento se considera para inducir una respuesta biológica cuando la respuesta es igual a o mayor que 5%, y preferiblemente igual a o mayor que 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%,' 80%, 85%, 90% o 95%, de la actividad de un estándar FGF21 de tipo natural que comprende la forma madura de SEQ ID NO: 2 (esto es, la forma madura de la secuencia FGF21 humano) y tiene las siguientes propiedades: que muestra un nivel de eficacia de igual a o más de 5% de un estándar FGF21, con un EC50 de igual a o menos de ?????, por ejemplo, 90 nM, 80 nM, 70nM, 60nM, 50nM, 40nM, 30nM, 20nM o 10 nM en (1) el ensayo de célula reportera de luciferasa mediado por el receptor FGF21 recombinante de los Ejemplos 5 y 11 y (2) fosforilación ER en el ensayo celular mediado por el receptor FGF21 recombinante de los Ejemplos 5 y 11. La "potencia" de una proteina enlazada al antigeno se define como exhibe un EC50 de igual a o menos de ?????, por ejemplo, 90nM, 80nM, 70nM, 60nM, 50nM, 40nM, 30nM, 20nM, 10 nM y preferiblemente menos de 10 nM de la proteina enlazada al antigeno en los siguientes ensayos: (1) el ensayo de célula reportera de luciferasa mediado por el receptor FGF21 recombinante de los Ejemplos 5 y 11 (2) la fosforilación ERK en el ensayo celular mediado por el receptor FGF21 recombinante de los Ejemplos 5 y 11.

Se señala que algunas de las proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno de la presente descripción no puede inducir señalización mediada por FGF21 en niveles terapéuticamente aplicables, ni es esta propiedad necesariamente deseable en todas las circunstancias. Sin embargo, las proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno que no induce señalización mediada por FGF21 forma aspectos de la presente descripción y pueden ser útiles como reactivos de diagnóstico o en otras aplicaciones.

El término "polinucleótido" o "ácido nucleico" incluye tanto polímeros de nucleótido de hebra sencilla como hebra doble. Los nucleótidos que comprenden el polinucleótido pueden ser ribonucleótidos o desoxiribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. Las modificaciones incluyen modificaciones de base tal como derivados de bromouridina e inosina, modificaciones de ribosa tal como 2 ' , 3 ' -didesoxiribosa , y modificaciones de ligadura de internucleótido tal como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato y fosforoamidato .

El término "oligonucleótido" significa un polinucleótido que comprende 200 o menos nucleótidos. En algunas modalidades, los oligonucleótidos tienen de 10 hasta 60 bases de longitud. En otras modalidades, los oligonucleótidos tienen 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 hasta 40 nucleótidos de longitud. . Los oligonucleótidos pueden ser de hebra sencilla o hebra doble, por ejemplo, para uso en la construcción de un gen mutante. Los oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos de sentido o antisentido. Un oligonucleótido puede incluir una etiqueta, incluyendo una radioetiqueta , una etiqueta fluorescente, un hapteno o una etiqueta antigénica, para ensayos de detección. Los oligonucleótidos pueden usarse, por ejemplo, como cebadores PCR, cebadores de clonación o sondas de hibridación.

Una "molécula de ácido nucleico aislado" significa un ADN o ARN de origen genómico, mARN, cADN, o sintético o alguna combinación de los mismos que no se asociada con todo o una porción de un pólinucleótido en que el polinucleótido aislado ' se encuentra en la naturaleza, o se liga a un polinucleótido al cual no se liga en la naturaleza. Para propósitos de esta descripción, debe entenderse que "una molécula de ácido nucleico que comprende" una" secuencia de nucleótido particular no abarca cromosomas intactos. Las moléculas de ácido nucleico aisladas "que comprenden" secuencias de ácido nucleico especificas pueden incluir, además de las secuencias especificas, secuencias de codificación para hasta diez o incluso hasta veinte de otras proteínas o porciones de las mismas, o pueden incluir secuencias reguladoras operablemente ligadas que controlan la expresión de la región de codificación de las secuencias de ácido nucleico recitadas, y/o pueden incluir secuencias de vector.

A menos que se especifique de otra manera, el extremo del lado izquierdo de cualquier secuencia de polinucleótido de hebra sencilla discutida en la presente es el extremo 5' ; la dirección del lado izquierdo de las secuencias de polinucleótido de hebra doble se refiere como la dirección 5' . La dirección de adición 5' hasta 3' de transcriptos de ARN naciente se refiere como la dirección de transcripción; regiones de secuencia en la hebra de ADN que tiene la misma secuencia como el transcripto ARN que son 5' para el extremo 5' del transcripto de ARN se refieren como "secuencias corriente arriba;" regiones de secuencia en la hebra de ADN que tiene la misma secuencia como el transcripto de ARN que son 3' para el extremo 3' del transcripto de ARN se refieren como "secuencias corriente abajo." El término "secuencia de control" se refiere a una secuencia de polinucleótido que puede afectar la expresión y procesamiento de las secuencias se codificación a las cuales se liga. La naturaleza, de tales secuencias de control puede depender del organismo hospedero. En modalidades particulares, las secuencias de control para procariotas pueden incluir un promotor, un sitio enlazado ribosomico, y una secuencia de terminación de ' transcripción. Por ejemplo, las secuencias de control para eucariotas pueden incluir promotores que comprenden uno o una pluralidad de sitios de reconocimiento para factores de transcripción, secuencias potenciadoras de transcripción, y secuencia de terminación de transcripción. "Secuencias de control" pueden incluir secuencias líderes y/o secuencia precursoras de fusión.

El término "vector" significa cualquier molécula o entidad (por ejemplo, ácido nucleico, plásmido, bacteriófago o virus) usado para transferir información que codifica la proteína en una célula hospedera.

El término "vector de expresión" o "constructo de expresión" se refiere a un vector que es adecuado para transformación de una célula hospedera y contiene, secuencias de ácido nucleico que dirigen y/o controlan (en conjunto con la célula hospedera) la expresión de una o más regiones de codificación heteróloga operativamente ligadas a estas. Un constructo de expresión puede incluir, pero no se limita a, secuencias que afectan o controlan la transcripción, traducción, y, si se presentan intrones, afecta el empalme de ARN de una región de codificación operablemente ligada a esto.

Como se usa en la presente, "operablemente ligado" significa que los componentes a los cuales el término se aplica están en una relación que, permite llevar a cabo sus funciones inherentes bajo condiciones adecuadas. Por ejemplo, una secuencia de control en un vector que está "operablemente ligado" a una secuencia de codificación de proteina se liga a esto de manera que la expresión de la secuencia de codificación de proteina se alcanza bajo condiciones compatibles con la actividad transcripcional de las secuencias de control.

El término "célula hospedera" significa una célula que se ha transformado, o es capaz de transformarse, con una secuencia de ácido nucleico- y por ello expresa un gen de interés. El término incluye la progenie de la célula precursora, si o no la progenie es idéntica en morfología o en elaboración genética para la célula precursora original, de manera que el gen de interés esta presente.

El término "transducción" significa la transferencia de genes de una bacteria a otra-, usualmente por bacteriófago. "Transducción" también se refiere a la adquisición y transferencia de secuencias celulares eucarióticas por retrovirus defectivos de replicación.

El término "transfección" significa la absorción de ADN exterior o exógeno por una célula, y una célula se ha "transfectado" cuando el ARN exógeno se ha introducido dentro de la membrana celular.. Un número de técnicas de transfección son bien conocidas en la técnica y se describen en la presente. Ver, por . ej emplo, Graham et al, (1973) Virology 52:456; Sambrook et al, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al, (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al, (1981) Gene 13: 197. Tales técnicas pueden usarse para introducir una o más porciones de 7ADN exógenas en células hospederas adecuadas.

El término "transformación" se refiere a un cambio en las características genéticas de la célula, y una célula se ha transformado cuando se ha modificado para contener ADN o ARN nuevo. Por ejemplo, una célula se transforma donde se modifica genéticamente de su estado nativo al introducir nuevo material genético por medio de transfección, transducción, u otras técnicas. Después de la transfección o transducción, el ADN transformado puede recombinarse con aquel de la célula al integrarse físicamente en un cromosoma de la célula, o puede mantenerse transitoriamente como un elemento episomal sin replicarse, o puede replicarse independientemente como un plásmido. Una célula se considera que ha sido "establemente transformada" cuando el ADN transformante se replica con la división de la célula.

Los términos "polipéptido" o "proteína" se usan intercambiablemente en la presente para referir a un polímetro de residuos de aminoácido. Los términos también aplican para polímeros de aminoácido en los cuales uno o más residuos de aminoácido es un análogo o mimético de un aminoácido que se presenta naturalmente correspondiente, así como a polímeros de aminoácido que se presentan naturalmente. Los términos también pueden abarcar polímeros de aminoácido que se han modificado, por ejemplo, por la adición de residuos de carbohidrato para formar glicoproteínas , o fosforilados . Los polipéptidos y proteínas descritas pueden producirse por una célula que se presenta naturalmente o no recombinante ; o puede producirse por una célula recombinante o preparada por ingeniería genéticamente, y comprende moléculas que tienen la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa, o moléculas que tiene eliminaciones de, adiciones a, y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de la secuencia nativa. Los términos "polipéptido" y "proteína" abarcan proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno que específicamente o selectivamente enlazan ß-Klotho y proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno que enlazan (i) uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 y (ii) ß-Klotho, o secuencias que tienen eliminaciones de, adiciones a, y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de una proteína enlazada al antígeno o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno que específicamente o selectivamente enlaza a ß-Klotho o tanto FGFRlc como ß-Klotho. El término "fragmento de polipéptido" se refiere a un polipéptido que tiene una eliminación de terminal amino, una eliminación de terminal carboxilo, y/o una eliminación interna como se compara con la proteina de longitud completa. Tales fragmentos también pueden contener aminoácidos modificados como se compara con la proteina de longitud completa. En ciertas modalidades, los fragmentos son alrededor de cinco hasta 500 aminoácidos de longitud. Por ejemplo, los fragmentos pueden ser al menos 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, o 450 aminoácidos de longitud. Los fragmentos de' polipéptido útiles incluyen fragmentos inmunológicamente funcionales de anticuerpos, incluyendo dominios de enlace. En el caso de una proteina enlazada al antigeno o fusión FGF21-proteína enlazada al antigeno que específicamente' enlaza a ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4, los fragmentos útiles incluyen pero no . se limitan a una región CDR, un dominio variable de una cadena ligera o pesada, una porción de una cadena de anticuerpo o solo su región variable incluyendo dos CDRs, y similares.

El término "proteína aislada" significa que una proteína objeto (1) está libre de al menos algunas otras proteínas con las cuales debe normalmente encontrarse, (2) está esencialmente libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, de la misma especie, (3) se expresa por una célula de una especie diferente, (4) se ha separado de al menos alrededor de 50 por ciento de polinucleótidos , lípidos, carbohidratos, u otros materiales con los cuales se asocia en naturaleza, (5) se asocia operablemente (por interacción covalente o no covalente) con un polipéptido con el cual no se asocia en naturaleza, o (6) no ocurre en la naturaleza. Típicamente, una "proteína aislada" constituye al menos alrededor de 5%, al menos alrededor de 10%, al menos alrededor de 25%, o al menos alrededor de 50% de una muestra dad. El ADN genómico, cADN, mARN u otro ARN, de origen sintético, o cualquier combinación de los mismos pueden codifican tal proteína' aislada. Preferiblemente, la proteína aislada esta sustancialmente libre de proteínas o polipéptidos u otros contaminantes que se encuentran en su ambiente natural que debe interferir con su uso terapéutico, de diagnostico, profiláctico, de búsqueda u otro uso.

Una "variante" de un polipéptido (por ejemplo, una proteína enlazada al antígeno, fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno o un anticuerpo) comprende una secuencia de aminoácido en donde uno o más residuos de aminoácido se insertan en, eliminan de y/o sustituyen en la secuencia de aminoácidos relativa á otra secuencia de polipéptido. Las variantes incluyen proteínas de fusión.

Un "derivado" de un polipéptido es un polipéptido (por ejemplo, una proteína enlazada al antígeno, fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno o un anticuerpo) que se ha modificado químicamente de alguna manera distinta de variantes de inserción, eliminación, o substitución, por ejemplo, por medio de conjugación a otra porción química.

El término "que se presenta naturalmente" como se usa a lo largo de la especificación en conexión con material biológicos tal como polipéptidos, ácidos nucleicos, célula hospederas, y similares, se refiere a materiales que se encuentran en la naturaleza.

"Región enlazada al antígeno" significa una proteína, o una porción de una proteína, que específicamente enlaza a un antígeno específico, por ejemplo, ß-Klotho o tanto ß-Klotho como uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4. Por ejemplo, tal porción de una proteína enlazada al antígeno o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno que contiene los residuos de aminoácido que interactúan con un antígeno y confieren en la proteína enlazada al antígeno o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno su especificidad y afinidad para el antígeno se refiere como "región enlazada al antígeno." Una región enlazada al antígeno típicamente incluye una o más "regiones enlazadas a la complementariedad" ("CDRs") . Ciertas regiones enlazadas al antígeno también incluyen una o más regiones de "estructura". Una "CDR" es una secuencia de aminoácido que contribuye a especificidad y afinidad enlazada al antígeno. Regiones de "estructura" pueden ayudar a mantener la conformación apropiada de las CDRs para promover el enlace entre la región enlazada al antígeno y un antígeno.

En ciertos aspectos, se proporcionan las proteínas enlazadas al antígeno recombinantes y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno que se enlazan a ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4. en este contexto, una "proteína recombinante" es una proteína hecha usando técnicas recombinantes, esto es, a través de la expresión de un ácido nucleico recombinante como se describe en la presente. Los métodos y técnicas para la producción de proteínas recombinantes son bien conocidos en la técnica.

El término "competir" cuando se usa en el contexto de proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno (por ejemplo, proteínas enlazadas al antígeno neutralizantes, anticuerpos neutralizantes, proteína enlazada al antígeno agonista o anticuerpos agonista) que compite por el mismo epitomo significa competencia entre proteínas enlazadas al antígeno o fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno se determina por un ensayo en el cual la proteína enlazada al. antígeno o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno (por ejemplo, anticuerpo o fragmento inmunologicamente funcional del mismo) bajo prueba previene o inhibe enlace especifico de una proteina enlazada al antigeno de referencia o fusión FGF21-proteina enlazada al antigeno (por ejemplo, un ligando, o un anticuerpo de referencia) para un antigeno común (por ejemplo, FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, FGFR4 , ß-Klotho o un fragmento del mismo) . Numerosos tipos de ensayos de enlace competitivos pueden usarse, por ejemplo: radioinmunoensayo directo o indirecto de fase sólida (RIA) , inmunoensayo de enzima directa o indirecta de fase sólida (EIA) , ensayo de competencia intercalado (ver, por ejemplo, Stahli et ah, (1983) Methods' in Enzymology 9:242- 253); EIA de biotina-avidina directo de fase sólida (ver, por ejemplo, Kirkland et ah, (1986) J. Immunol. 137:3614-3619) ensayo etiquetado directo de' fase sólida, ensayo de intercalado etiquetado directo de fase sólida (ver, por ejemplo, Harlow y Lañe, (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press) ; RIA de etiqueta directo de fase sólida usando etiqueta 1-125 (ver, por ejemplo, Morel et al., (1988) Molec. Immunol. 25:7-15); EIA de biotina-avidina directo de fase sólida (ver, por ejemplo, Cheung, et ah, (1990) Virology 176:546-552); y RIA etiquetado directo (Moldenhauer et al, (1990) Scand. J. Immunol. 32:77-82). Típicamente, tal ensayo involucra el uso de antígeno purificado enlazado a una superficie sólida o células que portan cualquiera de estas, una proteina enlazada al antigeno de prueba no etiquetada o fusión FGF21-proteina enlazada al antigeno y una proteina enlazada al antigeno de referencia etiquetada o fusión FGF21-proteina enlazada al antigeno. La inhibición competitiva se mide al determinar la cantidad de etiqueta enlazada a la superficie sólida o células en presencia de la proteina enlazada al antigeno de prueba o fusión FGF21-proteina enlazada al antígeno. Usualmente la proteina enlazada al antigeno de prueba o fusión FGF21-proteina enlazada al antigeno esta presente en exceso. Las proteínas enlazadas al antígeno o fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno identificadas por ensayo de competencia (proteínas enlazadas al antígeno de competencia) incluyen proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno enlazadas al mismos epítopo como las proteínas enlazadas al antígeno de referencia o fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno y proteínas enlazadas al antígeno o fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno enlazadas a un epítopo adyacente suficientemente próximo al epítopo enlazado por la proteína enlazada al antígeno de referencia o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno para que ocurra impedimento esterito. Los detalles adicionales con respecto a métodos para determinar enlace competitivo se proporcionan en los ejemplos en la presente. Usualmente, cuando una proteína enlazada al antigeno de competencia se presenta en exceso, inhibirá el enlace específico de una proteína enlazada al antígeno de referencia o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno para un antígeno común por al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o 75%. En algunos casos, el enlace se inhibe por al menos 80%, 85%, 90%, 95%, o 97% o más.

El término "antígeno" se refiere a una molécula o una porción de una molécula capaz de enlazarse por un agente de enlace selectivo, tal como una proteína enlazada al antígeno o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno (incluyendo, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento funcional inmunológico del mismos) , y adicionalmente es capaz de usarse en un animal para producir anticuerpos capaces de enlazar a tal antígeno. Un antígeno puede poseer uno' o más epítopos que son capaces de interactuar con diferentes proteínas enlazadas al antígeno, por ejemplo, anticuerpos.

El término "epítopo" es la porción de una molécula que se .enlaza por una proteína enlazada al antígeno o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno (por ejemplo, un anticuerpo) . El término incluye cualquier determinante capaz de enlazar específicamente a una proteína enlazada al antígeno o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno, tal como un anticuerpo. Un epítopo puede ser contiguo o no contiguo (por ejemplo, (i) en un polipéptido de cadena sencilla, residuos de aminoácido que no son contiguos con otro en la secuencia¦ de polipéptido pero que dentro del contexto de la molécula se enlazan por la proteína enlazada al antígeno o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno, o (ii) en un receptor multimérico que comprende dos o más componentes individuales, por ejemplo, FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4, y ß-Klotho, residuos de aminoácido que se presentan en uno o más de los componentes individual, pero que todavía están enlazados por la proteína enlazada al antígeno o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno) . En ciertas modalidades, los epítopos pueden ser miméticos en que comprenden una estructura tridimensional que es similar a un epítopo usado para generar la proteína enlazada al antígeno o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno, aun comprende ninguno o solo alguno de los residuos de aminoácido encontrados en tal epítopo usado para generar la proteína enlazada al antígeno o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno. Mas a menudo, los epítopos residen en proteínas, pero en algunos casos pueden residir en otros tipos de moléculas, tal como ácidos nucleicos. Los determinantes de epítopo pueden incluir agrupaciones de superficie químicamente activas de moléculas tal como aminoácidos, ' cadenas laterales de azúcar, grupos fosforilo o sulfonilo, y pueden tener características estructurales tridimensionales especificas, y/o características de carga especificas. Generalmente, las proteínas enlazadas al antígeno o fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno especificas para un antígeno objetivo particular preferencialmente reconocerán un epítopo en el antígeno objetivo en una mezcla de complejo de proteínas y/o macromoléculas .

El término "identidad" se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más moléculas de polipéptido o dos o más moléculas de ácido nucleico, como se determina al alinear y comparar las secuencias. "Porcentaje de identidad" significa el porcentaje de residuos idénticos entre los aminoácidos o nucleótidos en las moléculas comparadas y se calcula con base en el tamaño de las mas pequeñas de las moléculas que se comparan. Para estos cálculos, los espacios en las alineaciones (si hubieran) deben dirigirse por un modelo matemático particular o programa de computadora (esto es, un "algoritmo"). Los métodos que pueden usarse para calcular la identidad de los ácidos nucleicos o polipéptidos alineados incluyen aquellos descritos en Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M . , ed.), (1988) New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smíth, D. W. , ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, (Griffin, A. M . , and Griffin, H. G., eds . ) , 1994, New Jersey: Human Press; von Heinje, G., (1987) Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. y Devereux, J. , eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; y Carillo. et al, (1988) SIAMJ. Applied Math. 48: 1073.

Al calcular el porcentaje de identidad, las secuencias que se comparan se alinean en una forma que da la coincidencia más grande entre las secuencias. El programa de computadora usado para determinar el porcentaje de identidad puede ser, por ejemplo, el paquete de programa GCG, que incluye GAP (Devereux et al, (1984) Nucí. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI) . El GAP de algoritmo de computadora se usa para alinear los dos polipéptidos o polinucleótidos para los cuales el porcentaje de identidad de secuencia es para determinarse. Las secuencias se alinean para coincidencia óptima de su aminoácido o nucleótido respectivo (el "espacio en coincidencia", como se determina por el algoritmo) . Una señalización de abertura de espacio (que se calcula como 3x la diagonal promedio, en donde la "diagonal promedio" es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que se usa; la "diagonal" es. el registro' o numero asignado a cada coincidencia de aminoácido perfecto por la matriz de comparación particular) y una señalización de extensión de espacio (que es usualmente 1/10 veces la señalización de abertura de espacio) , asi como una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62 se usan en conjunto con el algoritmo. En ciertas modalidades, una matriz de comparación estándar (ver, Dayhoff et al, (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff et al, (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 89: 10915-10919 para la matriz de comparación BLOSUM 62) también se usa. por el algoritmo.

Los parámetros recomendados para determinar el porcentaje de identidad para polipéptidos o secuencias de nucleótido usando el programa GAP son los siguientes: Algoritmo: Needleman et.al, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453; Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff et al, 1992, Sutra; señalización de espacio: 12 (pero sin señalización para espacios finales) señalización por longitud de espacio: 4 Umbral de similitud: 0 Ciertos esquemas de alineación para alinear dos secuencias de aminoácido pueden resultar en la coincidencia de solo una región corta de las dos secuencias, y esta región alineada pequeña puede tener identidad de secuencia muy alta aunque no existe relación importante entre las dos secuencias de longitud completa. En consecuencia, el método de alineación seleccionado (por ejemplo, el programa GAP) puede ajustarse si asi se desea para resultar en una alineación que abarcar al menos 50 aminoácidos contiguos del polipéptido objetivo.

Como se usa en la. presente, "sustancialmente puro" significa que la especie descrita de molécula es la especie predominante presente, que esta, en una base molar es mas abundante que cualquier otra especie individual en la misma mezcla. En 'Ciertas modalidades, una molécula sustancialmente pura es una composición en donde la especie objeto comprende al menos 50% (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. En otras modalidades, una composición sustancialmente pura comprenderá al menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. En otras' modalidades, la especie objeto se purifica para homogeneidad esencial en donde la especie contaminante no puede detectarse en la composición por métodos de detección convencionales y de esta manera la composición consiste de una especie macromolecular detectable sencilla .

Los términos "tratar" y "tratamiento" se refiere a cualquier indicios de éxito en el tratamiento o alivio de una lesión, patología o afección, incluyendo cualquier parámetro objetivo o subjetivo tal como alivio; remisión; disminución de síntomas o hace la lesión, patología o afección mas tolerable para el paciente; disminución en la tasa de degeneración o descenso; hace el punto final de degeneración menos debilitante; mejorar el bienestar mental o físico del paciente. El tratamiento o alivio de síntomas puede ser con base en parámetros objetivos o subjetivos; incluyendo los resultados de un examen físico, exámenes neuropsiquiátrico, y/o una evaluación psiquiatrita. Por ejemplo, ciertos métodos presentados en la presente exitosamente tratan diabetes, obesidad y dislipidemia, ya sea profilácticamente o como un tratamiento agudo, y/o disminuye los niveles de glucosa en el plasma y niveles de triglicérido y colesterol circulantes y/o alivia un síntoma asociado con diabetes tipo 2, obesidad o dislipidemia .

Una "cantidad efectiva" generalmente es una cantidad suficiente para reducir la severidad y/o frecuencia de síntomas, eliminar los síntomas y/o causa subyacente, prevenir la ocurrencia de síntomas y/o sus causas subyacentes, y/o mejorar o remediar el daño que resulta de o se asocia con diabetes, obesidad o dislipidemia. En algunas modalidades, la cantidad efectiva es una cantidad terapéuticamente efectiva o una cantidad profilácticamente efectiva. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" es una cantidad suficiente para remediar un estado de enfermedad (por ejemplo, diabetes, obesidad o dislipidemia ) o síntomas, particularmente un estado o síntomas asociadas con el estado de enfermedad, o de otra manera prevenir, dificultar, retardar o invertir el progreso del estado de enfermedad o cualquier otro síntoma indeseado asociado con la enfermedad en cualquier forma en absoluto. Una "cantidad profilácticamente efectiva" es una cantidad de una composición farmacéutica que, cuando se administra aun sujeto, tendrá el efecto profiláctico pretendido, por ejemplo, prevenir o retardar el comienzo (o recurrencia) de diabetes, obesidad o dislipidemia, o reducir la probabilidad del comienzo (o recurrencia) de diabetes, obesidad o dislipidemia o síntomas asociados. El efecto terapéutico o profiláctico completo no necesariamente ocurre por administración de una dosis, y puede ocurrir solo después de la administración de una serie de dosis. De esta manera, una cantidad terapéuticamente . o profilácticamente efectiva puede administrarse en una o más administraciones.

El término "aminoácido" se emplea por su significado normal en la técnica. Los veinte aminoácidos que se presentan naturalmente y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Ver, por ejemplo, Immunology-A Synthesis, 2a Edición, (E. S. Golub y D. R. Green, eds . ) , Sinauer Associates: Sunderland, Mass. (1991), incorporada en la presente como referencia para cualquier propósito. Los estéreo isómeros (por ejemplo, aminoácidos D) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales o que no se presentan naturalmente tal como aminoácidos a- -di substituidos, aminoácidos N-alquilo, y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para polipéptidos y se incluyen en el término "aminoácido." Los ejemplos de aminoácidos no naturalmente (que pueden sustituirse por cualquier aminoácido que se presenta naturalmente encontrados en cualquier secuencias descrita en la presente, como se desee) incluyen: 4-hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e-?, N, N-trimetilisina, e-acetilisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-?-metilarginina , y otros aminoácidos similares y ácidos imino (por ejemplo, 4-hidroxiprolina) . En la anotación de polipéptido usada en la presente, la dirección del lado izquierdo es la dirección de terminal amino (o "terminal N") y la dirección del lado derecho es la dirección de la terminal carboxilo (o "terminal C"), de acuerdo con uso estándar y convención. El término "aminoácido" también abarca aminoácidos que no se presentan naturalmente. Una lista no limitada de los ejemplos de aminoácidos que no se presentan naturalmente que pueden insertarse en una proteina enlazada al antigeno o secuencia de fusión FGF21-proteina enlazada al antigeno o sustituida para un residuo tipo natural en una secuencia enlazada al antigeno incluye aminoácidos ß, homoaminoácidos , aminoácidos cíclicos y aminoácidos con cadenas laterales derivatizadas . Los ejemplos incluyen (en la forma L o forma D; abreviado como en el paréntesis) : citrulina (Cit) , homocitrulina (hCit) , Na-metilcitrulina (MeCit) , Na-metilhomocitrulina (Na- eHoCit ) , ornitina (Orn) , Na-Metilornitina (Na-MeOrn ' o NMeOrn) , sarcosina (Sar) , hemolisina (hLys o hK) , homoarginina (hArg o hR) , homoglutamina (hQ) , Na-metilarginina (NMeR) , Na-metileucina (Na-MeL o NMeL) , · N-metilhomolisina (NMeHoK) , Na-metilglutamina (NMeQ) , norleucina (Nle) , norvalina (Nva) , 1, 2, 3, 4-tetrahidroisoquinolina (Tic), ácido Octahidroindol-2-carboxilico (Oic) , 3- ( 1-na'ftil) alanina (1-Nal), 3- (2-naftil ) alanina (2-Nal) , 1, 2, 3, 4-tetrahidroisoquinolina (Tic), 2-indanilglicina (Igl), para-yodofenilalanina (pl-Phe) , para-aminofenilalanina (4AmP o 4-Amino-Phe) , 4-guanidino fenilalanina (Guf) , glicilisina (abreviado "K (Ne-glicil ) " o "K(glicil)" o "K(gly)"), nitrofenilalanina (nitrophe) , aminofenilalanina (aminophe o Amino-Phe) , bencilfenilalanina (benzylphe) , ácido ?-carboxiglutamico ( ?-carboxiglu) , hidroxiprolina (hidroxipro) , p-carboxil-fenilalanina (Cpa) , ácido a-aminoadipico (Aad) , ?a-metil valina (NMeVal) , N- -metil leucina (NMeLeu) , ?a-metilnorleucina (NMeNle) , ciclopentilglicina (Cpg) , ciclohexilglicina · (Chg) , acetilarginina (acetylarg) , ácido, a, ß-diaminopropionoico (Dpr) , ácido a, ?-diaminobutí rico (Dab), ácido diaminopropionico (Dap), . ciclohexilalanina (Cha), 4-metil-fenilalanina (MePhe) , ß, ß-difenil-alanina (BiPhA) , ácido aminobutirico (Abu) , 4-fenil-fenilalanina (o bifenilalanina; 4Bip) , ácido oí-amino-isobutirico (Aib) , beta-alanina , ácido beta-aminopropionico, ácido piperidinico, ácido aminocaprioico, ácido aminoheptanoico, ácido aminopimelico, desmosina, ácido diaminopimelico, N-etilglicina, N-etilaspargina, hidroxilisina, alo-hidroxilisina, isodesmosina, alo-isoleucina , N-metilglicina, N-metilisoleucina , N-metilvalina , 4-hidroxiprolina (Hyp) , ?-carboxiglutamato, e-?, , -trimetillisina, e-?-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidr'oxilisina, ?-metilarginina, ácido 4-Amino-O-ftalico ( APA) , y otros aminoácidos similares, y formas derivatizadas de cualquiera de los específicamente enlistados.

Panorama General El FGF21 es un polipéptido secretado que es un miembro de una subfamililia de factores de crecimiento de fibroblasto (FGFs). Los ratones transgénicos sobreexpresan FGF21 exhiben fenotipos metabólicos de velocidad de crecimiento lenta, glucosa en el plasma baja así como niveles de triglicéridos , y una ausencia de diabetes tipo 2 asociada con la edad, hiperplasia de isletas, y obesidad. La administración farmacológica de proteína FGF21 recombinante en modelos de roedor diabéticos, resulta en niveles normalizados de glucosa en el plasma, niveles de triglicérido y colesterol reducidos, tolerancia a la glucosa y sensibilidad a la insulina mejorada. Además, FGF21 reduce el peso corporal y grasa corporal al incrementar el gasto de energía, actividad física, y tasa metabólica.

Se ha sugerido que un complejo que comprende ß-Klotho y receptor le del factor de crecimiento de fibroblasto (FGFRlc) que produce un efecto in vivo similar al efecto inducido por FGF21. Con base en esta observación los anticuerpos biespecífieos y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno se diseñaron con base en un andamiaje de inmunoglobulina (IgG). Las proteínas enlazadas al antígeno biespecíficas descritas enlazan específicamente a ß-Klotho por medio de las regiones Fab y también a FGFRlc por medio del rizo CH3 de la región Fe. Las fusiones FGF21-proteina enlazada al antigeno proporcionadas en la presente comprenden o el componente de proteina enlazada' al · antigeno y un componente FGF21; el componente de proteina enlazada al antigeno enlaza a ß-Klotho por medio de las regiones Fab del componente enlazado al antigeno y se asocia con FGFRlc , FGFR2c, FGFR3c y/o FGFR4 por medio del componente FGF21 de la fusión. En otra modalidad, el componente de proteina enlazada al antigeno de una fusión FGF21-proteina enlazada al antigeno puede asociarse con FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c y/o FGFR4 por medio de las regiones Fab del componente enlazado al antigeno y con ß-Klotho por el componente FGF21 de la fusión. La especificidad de una fusión FGF21-proteina enlazada al antigeno dependerá de si la terminal N o C del componente FGF21 se trunca y en la especificidad del componente enlazado al antigeno.

En las proteínas enlazadas al antígeno descritas en la presente los sitios enlazados a ß-Klotho se posicionan en los dominios Fab, que luego se unen a una región Fe que comprende péptidos enlazados a FGFRlc situados en el rizo CH3 de la región Fe.

Las proteínas enlazadas al antígeno que enlazan ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4, se proporcionan en la presente, así como fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno. Una propiedad única de las proteínas enlazadas al antigeno .y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno descritas ¿n la presente es la naturaleza agnóstica de estas proteínas, específicamente la capacidad de inducir señalización tipo FGF21, en el caso de proteínas enlazadas al antígeno al enlazar a ß-Klotho por medio de la región Fab y asociarse con FGFRlc por medio del péptido insertado en la región Fe nativa y en el caso de fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno al asociarse con ya sea (a) ß-Klotho por medio de la región Fab del componente de proteína enlazada al antígeno y con FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y/o FGFR4 por medio del componente FGF21 o. (b) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c y/o FGFR4 por medio de la región Fab del componente de proteína enlazada al antígeno y ß-Klotho por medio del componente FGF21.

Mas remarcadamente y específicamente, algunas de las proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno descritas en la presente inducen señalización tipo FGF21 en varios ensayos basados en célula in vitro, incluyendo el ensayo reportero de luciferasa ELK de los Ejemplos 5 y 11 bajo las siguientes condiciones (1) el enlace a y actividad del FGF21 es dependiente de ß-Klotho; (2) la actividad es selectiva para complejo FGFRlc^-Klotho; (3) el enlace al FGFRlc/p-Klotho dirige la señalización tipo trayectorias FGF21 y (4) la potencia (EC50) es comparable con un estándar FGF21 tipo natural que comprende la forma madura de SEQ ID NO: 2, como sé mide en los siguientes ensayos basados en célula: (1) el ensayo de célula reportera de luciferasa mediado por el receptor FGF21 recombinante de los Ejemplos 5 y 11; y (2) la fosforilación ERK en el ensayo celular mediado por el receptor FGF21 recombinante de los Ejemplos 5 y 11. Las proteínas enlazadas al antígeno descritas y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno, por lo tanto, se espera^ que exhiban actividades in vivo que son consistentes con la función biológica natural de FGF21. Esta propiedad hace las proteínas enlazadas al antígeno descritas y fusiones FGF21-proteína' enlazada al antígeno terapéuticos viables para el tratamiento de enfermedades metabólicas tal como diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, NASH, enfermedad cardiovascular, síndrome metabólico y ampliamente cualquier enfermedad o 'afección en la cual es deseable imitar o aumentar los efectos in vivo de FGF21.

Las proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno proporcionadas son polipéptidos en los cuales una o más regiones que determinan la complementariedad (CDRs), como se describe en la presente, se incrustan y/o unen. En algunas proteínas enlazadas al antígeno, las CDRs se incrustan en una región de "estructura", que orienta las CDRs de manera que las propiedades del antígeno apropiado de enlace de las CDRs se alcanzan. En general, las proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno que se proporcionan pueden facilitar o potenciar la interacción entre FGFRlc y ß-Klotho, y pueden sustancialmente inducir señalización tipo FGF21. Ciertas proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno descritas en la presente son anticuerpos o se derivan de anticuerpos. En ciertas modalidades, la estructura de polipéptido de las proteínas enlazadas al antígeno es con base en anticuerpos, incluyendo, pero no limitado a, anticuerpos monoclonales , anticuerpos biespecífieos , minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (algunas veces referido en la presente como "miméticos de anticuerpo") , anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, fusiones de anticuerpo (algunas veces referido en la presente como "conjugados de anticuerpo"), y fragmentos de los mismos. Las varias estructuras se describen además en la presente a continuación.

Las proteínas enlazadas- al antígeno y fusiones FGF21-proteina enlazada al antígeno proporcionadas en la presente se han demostrado para enlazar a ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4, y particularmente las formas humanas de FGFRlc y/o ß-Klotho a grados variados. Las proteínas enlazadas, al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno que se proporcionan imitan la actividad biológica natural in vivo de FGF21. Como una consecuencia, las proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno proporcionadas en la presente son capaces de activar actividad de señalización tipo FGF21 a varios grados. En particular, las proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno que enlazan a estos epítopos pueden tener una o más de las siguientes actividades in vivo: inducción de trayectorias de transducción de señal tipo FGF21, niveles de glucosa en la sangre disminuidos, niveles de lípido circulantes disminuidos, parámetros metabólicos- mejorados y otros efectos fisiológicos inducidos in'vivo por la formación del complejo ternario de FGFRlc, ß-Klotho y FGF21, por ejemplo en condiciones tal como diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, NASH, enfermedad cardiovascular, y síndrome metabólico.

Las proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno que se describen en la presente tienen una variedad de utilidades. Algunas de las proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno, por ejemplo, son útiles en ensayos enlazados específicos, en la purificación de afinidad de FGFRlc y/o ß- lotho, en particular FGFRlc humano y/o ß-Klotho, o ligandos de estas proteínas, y en ensayo de selección para identificar otros agonistas de actividad de señalización tipo FGF21.

Las proteínas enlazadas- al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno que específicamente enlazan ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 que se describen en la presente pueden usarse en una variedad de aplicaciones de tratamiento, como se explica en la presente. Por ejemplo, ciertas proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno son útiles para tratar afecciones asociadas con procesos de señalización tipo FGF21 en un paciente, tal como reducir, aliviar, o tratar diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, NASH, enfermedad cardiovascular, y síndrome metabólico. Otros usos para las proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno incluyen, por ejemplo, diagnostico de enfermedades o afecciones asociadas con ß-Klotho, FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, FGFR4 o FGF21, y ensayos de selección para determinar la presencia o ausencia de estas moléculas. Las proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno descritas en la presente pueden ser útiles para tratar afecciones, síntomas y/o la patología asociada con actividad de señalización tipo FGF21 disminuida. Las afecciones ejemplares incluyen, pero no se limitan a, diabetes, obesidad, NASH y dislipidemia .

FGF21 Las proteínas enlazadas al antigeno y fusiones FGF21-proteina enlazada al antigeno descritas en la presente pueden inducir señalización mediada por FGF21, como se define en la presente, a varios grados. In vivo, la forma madura de FGF21 es la forma activa de la molécula. La secuencia de nucleótido que codifica FGF21 de longitud completa se proporciona; los nucleótidos que codifican la secuencia de señal están subrayados .

ATG GAC TCG GAC GAG ACC GGG TTC GAG CAC TCA GGA CTG TGG GTT TCT GTG CTG GCT GGT CTT CTG CTG GGA GCC TGC CAG GCA CAC CCC ATC CCT GAC TCC AGT CCT CTC CTG CAA TTC GGG GGC CAA GTC CGG CAG CGG TAC CTC TAC ACA GAT GAT GCC CAG CAG ACA GAA GCC CAC CTG GAG ATC AGG GAG GAT GGG ACG GTG GGG GGC GCT GCT GAC CAG AGC CCC GAA AGT CTC CTG CAG CTG AAA GCC TTG AAG CCG GGA GTT ATT CAA ATC TTG GGA GTC AAG ACA TCC AGG TTC CTG TGC CAG CGG CCA GAT GGG GCC CTG TAT GGA TCG CTC CAC TTT GAC CCT GAG GCC TGC AGC TTC CGG GAG CTG CTT CTT GAG GAC GGA TAC AAT GTT TAC CAG TCC GAA GCC CAC GGC CTC CCG CTG CAC CTG CCA GGG AAC AAG TCC CCA CAC CGG GAC CCT GCA CCC CGA GGA CCA GCT CGC TTC CTG CCA CTA CCA GGC CTG CCC CCC GCA CCC CCG GAG CCA CCC GGA ATC CTG GCC CCC CAG CCC CCC GAT GTG GGC TCC TCG GAC CCT CTG AGC ATG GTG GGA CCT TCC CAG GGC CGA AGC CCC AGC TAC GCT TCC TGA (SEQ ID NO: 1 ) La secuencia de' aminoácidos de FGF21 de longitud completa se proporciona; los aminoácidos que hacen la secuencia de señal están subrayados : MDSDETGFEHSGLWVSVLAGLLLGACOAfíPTPDSS PLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLETREDGTV GGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQ R P D G A LY GSLHFDP£ACSFR£LLL£DGYNVY QS£A HGLPLHLPGNKSPHRDPAPRCPARFLPLPGLPPAPP EPPGTLAPQPP DVG SSDPL SMVGP SQGRSPSY A S (SEQ ID NO: 2) De esta manera, la forma madura de FGF21 comprende la secuencia de aminoácido: HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEI REDGTVGGAA DQSPESLLQLKALKPGVIQI LGV T SRFLCQRPDG A LY GSLHFDPEACSFRELLLEDGYN VYQSEAHGLPLHLPGNKSPH DPAPRGPARFLPLP GLPPAPPEPPGILÁPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRS PSYAS(SEQ ID NO: 341) Una forma truncada de FGF21 que comprende residuos 1-169 comprende la secuencia de aminoácidos: HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEffiEDGTVGGAADQS PESLLQLKAL PGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRE LLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPA PPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMV (SEQ ID NO: 342) Una forma truncada de FGF21 .que comprende residuos 1-170 comprende la secuencia de aminoácidos: HP1PDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLE1REDGTVGGAADQS PESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRE LLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPA PPEPPGTLAPQPPDVGSSDPLSMVG (SEQ TD NO: 343) FGF21 puede existir en al menos dos formas diferentes, que difieren una de la otra en la posición 146 (subrayado y en negritas en SEQ ID NO: 341 de arriba); en una forma el residuo en este posición es una prolina como en la SEQ ID NO: 341 y en otra forma es una leucina. A lo largo de la presente descripción, a menos 'que se indique de otra manera, el término FGF21 abarca estos y cualquier otros conocidos o isoformas descubiertas de SEQ ID NO: 341) .

Como se describe en la presente, un FGF21 también puede incluir fragmentos. Como se usa en la presente, los términos se usan intercambiablemente para significar una proteina, en particular y a menos que se especifique de otra manera, una proteina humana, que en asociación con ß-Klotho y FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c y/o FGFR4 induce actividad de señalización tipo FGF21.

FGFRlc Las proteínas enlazadas al antígeno y el componente de proteína enlazada al antígeno de la fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno descritas en la presente enlazan a o asocian con FGFRlc, en particular FGFRlc humano, cuando se asocia con ß-Klotho, a varios grados. La secuencia de nucleótido que codifica FGFRlc humano (Numero de Acceso al GenBank NM_023110) se proporciona: ATGTGGAGCTGGAAGTGCCTCCTCTTCTGGGCTGTGCTGGTCACAG CCACACTCTGCACCGCTAGGCCGTCCCCGACCT.TGCCTGAACAAGC CCAGCCCTGGGGAGCCCCTGTGGAAGTGGAGTCCTTCCTGGTCCAC CCCGGTGACCTGCTGCAGCTTCGCTGTCGGCTGCGGGACGATGTGC AGAGCATCAACTGGCTGCGGGACGGGGTGCAGCTGGCGGAAAGCA ACCGCACCCGCATCACAGGGGAGGAGGTGGAGGTGCAGGACTCCG TGCCCGCAGACTCCGGCCTCTATGCTTGCGTAACCAGCAGCCCCTC GGGCAGTGACACCACCTACTTCTCCGTCAATGTTTCAGATGCTCTCC CCTCCTCGGAGGATGATGATGATGATGATGACTCCTCTTCAGAGGA GAAAGAAACAGATAACACCAAACCAAACCGTATGCCCGTAGCTCC ATATTGGACATCACCAGAAAAGATGGAAAAGAAATTGCATGCAGT GCCGGCTGCCAAGACAGTGAAGTTCAAATGCCC.TTCCAGTGGGACA CCAAACCCAACACTGCGCTGGTTGAAAAATGGCAAAGAATTCAAA CCTGACCACAGAATTGGAGGCTACAAGGTCCGTTATGCCACCTGGA GCATCATAATGGACTCTGTGGTGCCCTCTGACAAGGGCAACTACAC CTGCATTGTGGAGAATGAGTACGGCAGCATCAACCACACATACCA GCTGGATGTCGTGGAGCGGTCCCCTCACCGGCCCATCCTGCAAGCA GGGTTGCCCGCCAACAAAACAGTGGCCCTGGGTAGCAACGTGGAG TTCATGTGTAAGGTGTACAGTGACCCGCAGCCGCACATCCAGTGGC TAAAGCACATCGAGGTGAATGGGAGCAAGATTGGCCCAGACAACC TGCCTTATGTCCAGATCTTGAAGACTGCTGGAGTTAATACCACCGA CAAAGAGATGGAGGTGCTTCACTTAAGAAATGTCTCCTTTGAGGAC GCAGGGGAGTATACGTGCTTGGCGGGTAACTCTATCGGACTCTCCC ATCACTCTGCATGGTTGACCGTTCTGGAAGCCCTGGAAGAGAGGCC GGCAGTGATGACCTCGCCCCTGTACCTGGAGATCATCATCTATTGC ACAGGGGCCTTCCTCATCTCCTGCATGGTGGGGTCGGTCATCGTCT ACAAGATGAAGAGTGGTACCAAGAAGAGTGACTTCCACAGCCAGA TGGCTGTGCACAAGCTGGCCAAGAGCATCCCTCTGCGCAGACAGGT AACAGTGTCTGCTGACTCCAGTGCATCCATGAACTCTGGGGTTCTT CTGGTTCGGCCATCACGGCTCTCCTCCAGTGGGACTCCCATGCTAG CAGGGGTCTCTGAGTATGAGCTTCCCGAAGACCCTCGCTGGGAGCT GCCTCGGGACAGACTGGTCTTAGGCAAACCCCTGGGAGAGGGCTG CTTTGGGCAGGTGGTGTTGGCAGAGGCTATCGGGCTGGACAAGGA CAAACCCAACCGTGTGACCAAAGTGGCTGTGAAGATGTTGAAGTC GGACGCAACAGAGAAAGACTTGTCAGACCTGATCTCAGAAATGGA GATGATGAAGATGATCGGGAAGCATAAGAATATCATCAACCTGCT GGGGGCCTGCACGCAGGATGGTCCCTTGTATGTCATCGTGGAGTAT GCCTCCAAGGGCAACCTGCGGGAGTACCTGCAGGCCCGGAGGCCC CCAGGGCTGGAATACTGCTACAACCCCAGCCACAAGCCAGAGGAG CAGCTCTCCTCCAAGGACCTGGTGTCCTGCGCCTACCAGGTGGCCC GAGGCATGGAGTATCTGGCCTCCAAGAAGTGCATACACCGAGACC TGGCAGCCAGGAATGTCCTGGTGACAGAGGACAATGTGATGAAGA TAGCAGACTTTGGCCTCGCACGGGACATTCACCACATCGACTACTA TAAAAAGACAACCAACGGCCGACTGCCTGTGAAGTGGATGGCACC CGAGGCATTATTTGACCGGATCTACACCCACCAGAGTGATGTGTGG TCTTTCGGGGTGCTCCTGTGGGAGATCTTCACTCTGGGCGGCTCCCC ATACCCCGGTGTGCCTGTGGAGGAACTTTTCAAGCTGCTGAAGGAG GGTCACCGCATGGACAAGCCCAGTAACTGCACCAACGAGCTGTAC ATGATGATGCGGGACTGCTGGCATGCAGTGCCCTCACAGAGACCCA CCTTCAAGCAGCTGGTGGAAGACCTGGACCGCATCGTGGCCTTGAC CTCCAACCAGGAGTACCTGGACCTGTCCATGCCCCTGGACCAGTAC TCCCCCAGCTTTCCCGACACCCGGAGCTCTACGTGCTCCTCAGGGG AGGATTCCGTCTTCTCTCATGAGCCGCTGCCCGAGGAGCCCTGCCT GCCCCGACACCCAGCCCAGCTTGCCAATGGCGGACTCAAACGCCG CTGA ( SEQ ID NO: 3) .

La secuencia de aminoácidos de FGFRlc humano (Numero de Acceso al GenBank NP_075598) se proporciona: MWS KCLLF AVLVTATLCTARPSPTLPEQAQPWGAPVEVESFLVHP GDLLQLRCRLRDDVQSINWLRDGVQLAESNRTRITGEEVEVQDSVPA DSGLYACVTSSPSGSDTTYFSVNVSDALPSSEDDDDDDDSSSEEKETD NTKPNRMPVAPY TSPEKMEKKLHAVPAAKTVKFKCPSSGTPNPTLR WLKNGKEFKPDHRIGGYKVRYATWSI IMDS VPSDKGNYTCIVENEY GSINHTYQLDVVERSPHRPILQAGLPANKTVALGSNVEFMCKVYSDPQ PHIQ LKHIEV GSKIGPDNLPYVQILKTAGV TTDKEMEVLHLRNVS FEDAGEYTCLAGNSIGLSHHSA LTVLEALEERPAVMTSPLYLEIIIYC TGAFLISC VGSVIVYK KSGTKKSDFHSQMAV.HKLAKSIPLRRQVT VSADSSASMNSGVLLVRPSRLSSSGTPMLAGVSEYELPEDPRWELPRD RLVLGKPLGEGCFGQ LAEAIGLDKDKPNRVTKVAVKMLKSDATE KDLSDLISEMEMMKMIGKHKNI INLLGACTQDGPLYVrVEYASKGNLR EYLQARRPPGLEYCY PSHNPEEQLSSKDLVSCAYQVARGMEYLASK KCIHRDLAARNVLVTEDNVMKIADFGLARDIHHIDYYKKTTNGRLPV K MAPEALFDRIYTHQSDV SFGVLL EIFTLGGSPYPGVPVEELFKL LKEGHR DKP SNCTNELYMMMRD C WHA VP SQRPTFKQLVEDLDRIV ALTSNQEYLDLSMPLDQYSPSFPDTRSSTCSSGEDSVFSHEPLPEEPCLP RHPAQLANGGLKRR (SEQ ID NO; 4) .

Las proteínas enlazadas al antígeno y el componente de proteina enlazada al antígeno de la fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno descritas en la presente se enlazan o asocian con la porción extracelular de FGFRlc a varios grados a los cuales, en algunas modalidades, pueden enlazarse a o asociarse con ß-Klotho. Un ejemplo de una región extracelular de FGFRlc es: MWSWKCLLF AVLVTATLCTARPSPTLPEQAQP GAPVEVESFLVHPGDLL QLRCRLRDDVQSINWLRDGVQLAESNRTRITGEEVEVQDSVPADSGLYACVT SSPSGSDTTYFSVNVSDALPSSEDDDDDDDSSSEEKETDNTKPNRMPVAPY TSPEKMEKKLHAVPAAKTVKFKCPSSGTPNPTLRWL NGKEFKPDHRIGGYK VRYATWSI IMDSWPSDKGNYTCrVENEYGSI HTYQLDVVERSPHRPILQAG LPANKTVALGSNVEFMCKVYSDPQPHIQ LKHIEVNGSKIGPDNLPYVQILKT AGVNTTDKEMEVLHLRNVSFEDAGEYTCLAGNSIGLSHHSAWLTVLEALEER PAVMTSPLY (SEQ ID NO': 5) .

Como se describe en la presente, las proteínas FGFRlc también pueden incluir fragmentos. Como se usa en la presente, los términos se usan intercambiablemente para significar un receptor, en particular y a menos que se especifique de otra manera, un receptor humano, que en asociación con ß-Klotho y FGF21 induce actividad de señalización tipo FGF21.

El término FGFRlc también incluye modificaciones post-tradicionales de la secuencia de aminoácido FGFRlc, por ejemplo, sitios de glicosilación ligados a N posibles. De esta manera, las proteínas enlazadas al antígeno pueden enlazarse a o generarse de proteínas glicosiladas en una o más de las posiciones. ß-Klotho Las proteínas enlazadas' al antígeno y el componente de proteína enlazada al antígeno de la fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno descritas en la presente enlazan al dominio extracelular de ß-Klotho a varios grados, en particular a ß-Klotho humano. La secuencia de nucleótido que codifica ß-Klotho humano de longitud completa (Numero de Acceso al GenBank NM_175737) se proporciona: ATGAAGCCAGGCTGTGCGGCAGGATCTCCAGGGAATGAATGGATT TTCTTCAGCACTGATGAAATAACCACACGCTATAGGAATACAATGT CCAACGGGGGATTGCAAAGATCTGTCATCCTGTCAGCACTTATTCT GCTACGAGCTGTTACTGGATTCTCTGGAGATGGAAGAGCTATATGG TCTAAAAATCCTAATTTTACTCCGGTAAATGAAAGTCAGCTGTTTCT CTATGACACTTTCCCTAAAAACTTTTTCTGGGGTATTGGGACTGGA GCATTGCAAGTGGAAGGGAGTTGGAAGAAGGATGGAAAAGGACCT TCTATATGGGATCATTTCATCCACACACACCTTAAAAATGTCAGCA GCACGAATGGTTCCAGTGACAGTTATATTTTTCTGGAAAAAGACTT ATCAGCCCTGGATTTTATAGGAGTTTCTTTTTATCAATTTTCAATTT CCTGGCCAAGGCTTTTCCCCGATGGAATAGTAACAGTTGCCAACGC AAAAGGTCTGCAGTACTACAGTACTCTTCTGGACGCTCTAGTGCTT AGAAACATTGAACCTATAGTTACTTTATACCACTGGGATTTGCCTTT GGCACTACAAGAAAAATATGGGGGGTGGAAAAATGATACCATAAT AGATATCTTCAATGACTATGCCACATACTGTTTCCAGATGTTTGGG GACCGTGTCAAATATTGGATTACAATTCACAACCCATATCTAGTGG CTTGGCATGGGTATGGGACAGGTATGCATGCCCCTGGAGAGAAGG GAAATTTAGCAGCTGTCTACACTGTGGGACACAACTTGATCAAGGC TCACTCGAAAGTTTGGCATAACTACAACACACATTTCCGCCCACAT CAGAAGGGTTGGTTATCGATCACGTTGGGATCTCATTGGATCGAGC CAAACCGGTCGGAAAACACGATGGATATATTCAAATGTCAACAAT CCATGGTTTCTGTGCTTGGATGGTTTGCCAACCCTATCCATGGGGAT GGCGACTATCCAGAGGGGATGAGAAAGAAGTTGTTCTCCGTTCTAC CCATTTTCTCTGAAGCAGAGAAGCATGAGATGAGAGGCACAGCTG ATTTCTTTGCCTTTTCTTTTGGACCCAACAACTTCAAGCCCCTAAAC ACCATGGCTAAAATGGGACAAAATGTTTCACTTAATTTAAGAGAAG CGCTGAACTGGATTAAACTGGAATACAACAACCCTCGAATCTTGAT TGCTGAGAATGGCTGGTTCACAGACAGTCGTGTGAAAACAGAAGA CACCACGGCCATCTACATGATGAAGAATTTCCTCAGCCAGGTGCTT CAAGCAATAAGGTTAGATGAAATACGAGTGTTTGGTTATACTGCCT GGTCTCTCCTGGATGGCTTTGAATGGCAGGATGCTTACACCATCCG CCGAGGATTATTTTATGTGGATTTTAACAGTAAACAGAAAGAGCGG AAACCTAAGTCTTCAGCACACTACTACAAACAGATCATACGAGAA AATGGTTTTTCTTTAAAAGAGTCCACGCCAGATGTGCAGGGCCAGT TTCCCTGTGACTTCTCCTGGGGTGTCACTGAATCTGTTCTTAAGCCC GAGTCTGTGGCTTCGTCCCCACAGTTCAGCGATCCTCATCTGTACGT GTGGAACGCCACTGGCAACAGACTGTTGCACCGAGTGGAAGGGGT GAGGCTGAAAACACGACCCGCTCAATGCACAGATTTTGTAAACATC AAAAAACAACTTGAGATGTTGGCAAGAATGAAAGTCACCCACTAC CGGTTTGCTCTGGATTGGGCCTCGGTCCTTCCCACTGGCAACCTGTC CGCGGTGAACCGACAGGCCCTGAGGTACTACAGGTGCGTGGTCAG TGAGGGGCTGAAGCTTGGCATCTCCGCGATGGTCACCCTGTATTAT CCGACCCACGCCCACCTAGGCCTCCCCGAGCCTCTGTTGCATGCCG ACGGGTGGCTGAACCCATCGACGGCCGAGGCCTTCCAGGCCTACG CTGGGCTGTGCTTCCAGGAGCTGGGGGACCTGGTGAAGCTCTGGAT CACCATCAACGAGCCTAACCGGCTAAGTGACAT.CTACAACCGCTCT GGCAACGACACCTACGGGGCGGCGCACAACCTGCTGGTGGCCCAC GCCCTGGCCTGGCGCCTCTACGACCGGCAGTTCAGGCCCTCACAGC GCGGGGCCGTGTCGCTGTCGCTGCACGCGGACTGGGCGGAACCCG CCAACCCCTATGCTGACTCGCACTGGAGGGCGGCCGAGCGCTTCCT GCAGTTCGAGATCGCCTGGTTCGCCGAGCCGCTCTTCAAGACCGGG GACTACCCCGCGGCCATGAGGGAATACATTGCCTCCAAGCACCGA CGGGGGCTTTCCAGCTCGGCCCTGCCGCGCCTCACCGAGGCCGAAA GGAGGCTGCTCAAGGGCACGGTCGACTTCTGCGCGCTCAACCACTT CACCACTAGGTTCGTGATGCACGAGCAGCTGGCCGGCAGCCGCTAC GACTCGGACAGGGACATCCAGTTTCTGCAGGACATCACCCGCCTGA GCTCCCCCACGCGCCTGGCTGTGATTCCCTGGGGGGTGCGCAAGCT GCTGCGGTGGGTCCGGAGGAACTACGGCGACATGGACATTTACATC ACCGCCAGTGGCATCGACGACCAGGCTCTGGAGGATGACCGGCTC CGGAAGTACTACCTAGGGAAGTACCTTCAGGAGGTGCTGAAAGCA TACCTGATTGATAAAGTCAGAATCAAAGGCTATTATGCATTCAAAC TGGCTGAAGAGAAATCTAAACCCAGATTTGGATTCTTCACATCTGA TTTTAAAGCTAAATCCTCAATACAATTTTACAACAAAGTGATCAGC AGCAGGGGCTTCCCTTTTGAGAACAGTAGTTCTAGATGCAGTCAGA CCCAAGAAAATACAGAGTGCACTGTCTGCTTATTCCTTGTGCAGAA GAAACCACTGATATTCCTGGGTTGTTGCTTCTTCTCCACCCTGGTTC TACTCTTATCAATTGCCATTTTTCAAAGGCAGAAGAGAAGAAAGTT TTGGAAAGCAAAAAACT ACAACACATACCATTAAAGAAAGGCAA GAGAGTTGTTAGCTAA (SEQ ID NO: 6) .

La secuencia de aminoácidos de ß-Klotho humano de longitud completa (Numero de Acceso al GenBank NP_783864) se proporciona: MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDEITTRYRNTMSNGGLQRSVILSALILLRA VTGFSGDGRAIWSKNPNFTPVNESQLFLYDTFP NFFWGIGTGALQVE GSWKKDGKGPSIWDHFIHTHLKNVSSTNGSSDSYIFLEKDLSALDFIGV SFYQFSIS PRLFPDGIVTVANAKGLQYYSTLLDALVLRNIEPIVTLYH DLPLALQEKYGGWKNDTI IDIFNDYATYCFQMFGDRVKY ITIHNP YLVA HGYGTG HAPGEKGNLAAVYTVGHNLI AHSKV HNYNTH FRPHQKGWLSITLGSHWIEPNRSENTMDI FKCQQSMVSVLGWFANPIH GDGDYPEGMRKKLFSVLPIFSEAEKHEMRGTADFFAFSFGPNNFKPLN TMAK GQNVSLNLREALNWIKLEYNNPRILIAENGWFTDSRVKTEDT TAIYMMKNFLSQVLQAIRLDEIRVFGYTAWSLLDGFEWQDAY IRRGL FYVDFNSKQKERKPKSSAHYYKQI IRENGFSLKESTPDVQGQFPCDFS WGVTESVLKPESVASSPQFSDPHLYVWNATGNRLLHRVEGVRLKTRP AQCTDFVNIKKQLEMLARMKVTHYRFALDWASVLPTGNLSAVNRQA LRYYRCVVSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHLGLPEPLLHADGWLNPST AEAFQAYAGLCFQELGDLVKLWITRNEPNRLSDRYNRSGNDTYGAAHN LLVAHALAWRLYDRQFRPSQRGAVSLSLHAD AEPANPYADSHWRA AERFLQFEIA FAEPLFKTGDYPAA REYIASKHRRGLSSSALPRLTEA ERRLLKGTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFLQDITRLS SPTRLAVI PWGVRKLLRWVRRYGDMDIYITASGIDDQALEDDRLRK YYLGKYLQEVLKAYLIDKVRIKGYYAFKLAEEKSKPRFGFFTSDFKAK SSIQFYKVISSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQKKPLIFLGC CFFSTLVLLLSIAIFQRQ RRKFWKAKNLQHI PLKKGKRWS (SEQ ID NO: 7) .

Un ejemplo de una región extracelular de ß-Klotho es: MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDEITTRYRNTMSNGGLQRSVILSALILLRAVTGFS GDGRAIWSKNPNFTPVNESQ'LFLYDTFPKNFFWGIGTGALQVEGSW KDGK GPSIWDHFIHTHLKNVSSTNGSSDSYIFLEKDLSALDFIGVSFYQFSISWPRLFP DGIVTVANAKGLQYYSTLLDALVLRNIEPIVTLYHWDLPLALQEKYGGWKN DTIIDIFNDYATYCFQMFGDRVKYWITIHNPYLVAWHGYGTGMHAPGEKGN LAAVYTVGHNLIKAHSKV HNYNTHFRPHQKGWLSITLGSHWIEPNRSENT MDIFKCQQSMVSVLGWFANPIHGDGDYPEGMRKKLFSVLPIFSEAEKHEMRG TADFFAFSFGPNNFKPLNTMA MGQNVSLNLREALNWIKLEYNNPRILIAEN G FTDSRVKTEDTTAIYMMKNFLSQVLQAIRLDEIRVFGYTAWSLLDGFE Q DAYTIRRGLFYVDFNSKQKERKPKSSAHYYKQI IRENGFSLKES PDVQGQFP CDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPHLYVWNATGNRLLHRVEGVRLKTRPA QCTDFVNIKKQLEMLARM VTHYRFALD ASVLPTGNLSAVNRQALRYYR CVVSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHLGLPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGL CFQELGDLVKLWITINEPNRLSDIYNRSGNDTYGAAHNLLVAHALAWRLYDR QFRPSQRGAVSLSLHAD AEPANPYADSHWRAAERFLQFEIAWFAEPLFKTG DYPAAMREYIASKHRRGLSSSALPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFTTRFVM HEQLAGSRYDSDRDIQFLQDITRLSSPTRLAVIPWGVRKLLR VRRNYGDMD IYITASGIDDQALEDDRLRKYYLGKYLQEVLKAYLIDKVRIKGYYAFKLAEEK SKPRFGFFTSDFKAKSSIQFYNKVISSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLV QKKP (SEQ ID NO: 8) .

Como se describe en la presente, las proteínas ß-Klotho también pueden incluir fragmentos. Como se usa en la presente, estos términos se usan intercambiablemente para significar un co-receptor, en particular y a menos que se especifique de otra manera, un co-receptor humano, que en asociación con FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 y FGF21 induce actividad de señalización tipo FGF21.

El término ß-Klotho también incluye formas modificadas post-traduccionalmente de la secuencia de aminoácido ß-Klotho, por ejemplo, glicosilación en sitios de glicosilación ligados a N. De esta, manera, las proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno pueden enlazarse a o generarse de proteínas glicosiladas en una o más de estas posiciones.

Proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno que específicamente enlazan ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, FGFR4c .

Una variedad de proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno útiles para modular señalización 'tipo FGF21 se proporcionan. Estos agentes incluyen, por ejemplo, proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno que contienen un dominio enlazado al antígeno (por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos de dominio, inmunoadhesiones, y polipéptidos con una región enlazada al antígeno) y específicamente enlazan a ß-Klotho o, cuando un péptidos enlazado a FGFR esta presente, tanto ß-Klotho como uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 , en particular FGFRlc humano, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 y ß-Klotho humano. Algunos de los agentes son útiles, por ejemplo, al imitar el efecto de señalización generado in vivo por la asociación de un receptor FGF (por ejemplo, FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4) con ß-Klotho y con FGF21, y de esta manera puede usarse para aumentar o modular una o más actividades asociadas con señalización tipo FGF21.

En general, las proteínas enlazadas al antígeno y el componente de proteína enlazada al antígeno de las fusiones FGF21-proteína enlazada ¦ al antígeno que se proporcionan típicamente comprenden una o más CDRs como se describe en la presente (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6) y también puede comprender un péptidos enlazado a FGFR. En algunos casos, la proteina enlazada al antigeno o el componente de proteína enlazada al antígeno de una fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno comprende (a) una estructura de polipéptido y (b) una o más CDRs que se insertan- en y/o unen a la estructura de polipéptido. La estructura de polipéptido puede tener una variedad de formas diferentes. Por ejemplo, la estructura de polipéptido puede ser, o comprender, la estructura de un anticuerpo que se presenta naturalmente, o fragmento o variante de la misma, o puede ser completamente sintético en naturaleza. Los ejemplos de varias estructuras de proteína enlazada al antígeno y- el componente de proteína enlazada al antígeno de fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno se describen además en la presente. En modalidades particulares, la estructura de polipéptido de una proteína enlazada al antígeno o el componente de proteína enlazada al antígeno de una fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno comprende un péptidos enlazado a FGFR, que puede integrarse en cualquier punto en la cadena pesada, tal como, en los rizos CH2 y CH3.

En ciertas modalidades, la estructura de polipéptido de las proteínas enlazadas al antígeno y el componente de proteína enlazada al antígeno de fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno es un anticuerpo o se deriva de un anticuerpo, incluyendo, pero no limitado a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecificos, minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (algunas . veces referidos en la presente como "miméticos de anticuerpo") , anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, fusiones de anticuerpo (algunas veces referidas como "conjugados de anticuerpo") , y porciones o fragmentos de cada uno, respectivamente. En algunos casos, la proteina enlazada al antigeno es un fragmento inmunológico de un anticuerpo (por ejemplo, un Fab, un Fab' , un F(ab')2, o un scFv) . La estructura de polipéptido de una proteina enlazada al antigeno puede comprender una región CH3, que se ha procesado por ingeniería adicional para comprender un componente de péptido que no se encuentra normalmente en la secuencia CH3 de tipo natural, tal como un péptido enlazado a FGFR. Alternativamente, una fusión FGF21-proteina enlazada al antígeno puede comprender una forma truncada de FGF21 fusionado a una proteina enlazada al antígeno. Estas varias estructuras se describen además y definen en la presente.

Ciertas de las proteínas enlazadas al antígeno y el componente de proteina enlazada al antígeno de fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno proporcionadas en la presente específicamente enlazan a ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. En una modalidad, una proteína enlazada al antígeno o el componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno específicamente se enlaza a tanto FGFRlc humano que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 (la región extracelular de FGFRlc) como ß-Klotho humano que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 (la región extracelular de ß-Klotho) , y en otra modalidad una proteína enlazada al antígeno o el componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno específicamente se enlaza a tanto FGFRlc humano que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 como ß-Klotho humano que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y la proteína enlazada al antígeno o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno . induces señalización tipo FGF21. Se señala que, una proteína enlazada al antígeno o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno de la presente descripción puede, pero no necesariamente, inducir señalización tipo FGF21 y todavía forma un aspecto de la invención descrita.

Proteína Enlazada al Antígeno y Estructura de Fusión FGF21-Proteína Enlazada al Antígeno Algunas de las proteínas enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno que específicamente enlazan ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 que se proporcionan en la presente comprenden una estructura típicamente asociada con anticuerpos que se presentan naturalmente. Las unidades estructurales de estos anticuerpos típicamente comprenden uno o más tetrámeros, cada uno compuesto de dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, aunque algunas especies de mamíferos también producen anticuerpos que tiene solo una cadena pesada sencilla. En un anticuerpo típico, cada par o pareja incluyen una cadena "ligera" de longitud completa (en ciertas modalidades, alrededor de 25 kDa) y una cadena "pesada" de longitud completa (en ciertas modalidades, alrededor de 50-70 kDa) . Cada cadena de inmunoglobulina individual esta compuesta de varios "dominios de inmunoglobulina", cada uno consiste de aproximadamente 90 hasta 110 aminoácidos y que expresan un patrón de pliegue característico.¦ Estos dominios son las unidades básicas de los cuales los polipéptidos de anticuerpo están compuestos. La porción de terminal amino de cada cadena típicamente incluye un dominio variable que es responsable para reconocimiento de antígeno. La porción de terminal carboxi es mas conservada de forma evolucionada que el otro extremo de la cadena y se refiere como la "región constante" o "región C". Las cadenas ligeras humanas generalmente se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda, y cada una de estas contiene un dominio variable y un dominio constante. Las cadenas pesadas típicamente se clasifican como cadenas mu, delta, gamma, alpha, o epsilon, y estas definen el isotipo de anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. IgG tiene varios subtipos, incluyendo, pero no limitado a, IgGl, IgG2, IgG3, e IgG4. Los subtipos IgM incluyen IgM, e Igm2. Los subtipos IgA incluyen IgAl e IgA2. En humanos, los isotipos IgA e IgD contienen cuatro cadenas pesadas y cuatro cadenas ligeras; los isotipos IgG e IgE contienen dos cadenas pesadas y dos cadena ligeras; y el isotipo IgM contiene cinco cadenas pesadas y cinco, cadenas ligeras. La región C de cadena pesada típicamente comprende uno o más dominios que pueden ser responsables para la función efectora. El número de dominios de región constante de cadena pesada dependerá del isotipo. Cada cadena pesada IgG, por ejemplo, contiene tres dominios de región C conocidos como CHl, CH2 y CH3. Los anticuerpos que se proporcionan pueden tener cualquiera de estos isotipos y subtipos. En ciertas modalidades, una proteína enlazada al antígeno o componente proteína enlazada al antígeno de una fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno que específicamente enlaza a ß-Klotho¦ o ß-.Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 es un anticuerpo del subtipo IgGl, IgG2, o IgG4, y que puede comprender un péptidos enlazado a FGFR integrado en la región constante de las cadenas pesadas.

En cadenas ligeras y pesadas de longitud completa, las regiones variables y constantes se unen por una región "J" de alrededor de doce o más aminoácidos, con la cadena pesada también incluyen una región "D" de alrededor de más de diez aminoácidos. Ver, por ejemplo, Fundamental Immunology, 2a ed., Capitulo. 7 (Paul, ., ed.) 1989, New York: Raven Press (por ello incorporada como referencia en su totalidad para todos los propósitos) . Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada típicamente forman el sitio enlazado al antígeno .

Un ejemplo de un dominio constante de cadena pesada IgG2 de un anticuerpo monoclonal ejemplar, que comprende rizos CH2 y CH3 de tipo natural, que específicamente enlaza ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 tiene la secuencia de aminoácido: ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVHKPSNTKVDK KVEP SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTV LHQD LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSR QQG VFSCSVMHEALH HYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 9) . que se codifica por la secuencia de. nucleótidos: gcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagcggcc ctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcg gcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcetcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctcca gcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaca gttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttc cccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagc cacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagcca cgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacg gcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaacca aagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggt cagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagcc ggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccg tggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccacta cacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ I D NO: 10) En otro aspecto, una cadena pesada de cualquier isotipo puede pero no necesariamente comprende un péptido enlazado a FGFR, que puede integrarse en la región constante de la cadena pesada. Cualquier péptido enlazado a FGFR puede insertarse en una cadena pesada, incluyendo aquellos péptidos ¦ enlazados a FGFR descritos en la presente, por ejemplo en la Tabla 4A. El péptido enlazado a FGFR puede integrarse en cualquier región de la región constante de cadena pesada, incluyendo las regiones de rizo CH2 o CH3 de la cadena pesada. Los ejemplos de cadenas pesadas que comprenden un péptido .enlazado a FGFR se enlistan en la Tabla 5A.

Un ejemplo particular de una cadena pesada IgG2 que comprende un péptido enlazado a FGFR tiene la secuencia de aminoácido: QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASRFSFSRYGMHWVRQAPGKGLE VAVI FDGR QYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRVEDTAV YYCARDHPVVGTSFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSW SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSSSLGTQTYICNVHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VFTNAKTKPREEQYQSTYR VSVLTVLHQD LNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELGGCYQA GYYVCGGTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSR QQGNVFSCSVMHEALHHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 11); que se codifica por la secuencia de nucleótidos: caggtgcagttggtggagtrtgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgt ctagattctccttcagtagatatggcatgcactgggtccgccdggctccaggcaaggggctggügtgggtggc agttatatggtttgatggaagaaatcaatactatgcagactccgtgaaggggcgancaccatctccagagacaat tccaagaatacgctgtttctgcaaatgaacagcctgagagtcgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagat cacccagtagttggtacgagctttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctctagtgcctccaccaa gggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcct ggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacac cttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttggg cacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaa atcngtgacaaaactc acac atgcccacc gtgccc agcacctgaactcctggggggaccglcagtcttcctctt ccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgag ccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagcc gcgggaggagcagtaccagagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaa tggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagc caaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgggtggttgctacca ggcctggggctactacgtgtgcggtggtaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatc ccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgt gctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaac gtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggt aaa (SEQ ID NO: 12) Un ejemplo de un dominio constante ligero kappa de un anticuerpo monoclonal ejemplar que enlaza ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 tiene la secuencia de aminoácido': RTVAAPSVFI PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 13) . que se codifica por la secuencia de nucleótidos: cgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgt gtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggta actcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctg agcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtc acaaagagcttcaacaggggagagtgt (SEQ ID O: 14) •Un ejemplo de un dominio constante ligero lambda de un anticuerpo monoclonal ejemplar que enlaza ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c , y FGFR4 tiene la secuencia de aminoácido: GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSP VKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGST VEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 15) que se codifica por la secuencia de nucleótidos: ggtcagcccaaggccaaccccactgtcactctgttcccgccctcctctgaggagctccaagccaacaaggcca cactagtgtgtctgatcagtga ttctacccgggagctgtgacagtggcctggaaggcagatggcagccccgtc aaggcgggagtggagaccaccaaacc ccaaacagagcaacaacaagtacgcggccagcagctacctga gcctgacgcccgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtg gagaagacagtggcccctacagaatgttca (SEQ ID NO: 16) Las regiones variables de cadenas de inmunoglobulina generalmente exhiben la misma estructura general, que comprende regiones de estructura relativamente conservadas (FR) unidas por tres regiones hipervariables , mas a menudo llamadas "regiones que determinan la complementariedad" o CDRs. Las CDRs de las dos cadenas de cada par de cadena pesada/cadena ligera típicamente se alinean por las regiones de estructura para formar una estructura que se enlaza específicamente con un epítopo específico en la proteína objetivo (por ejemplo, ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR ) . Desde la terminal N hasta la terminal C, las regiones variables de cadena pesada y ligera que se presentan naturalmente típicamente ambas se confirman con el siguiente orden de estos elementos: FR1, CDR1, FR2, CDR2 , FR3, CDR3 y FR . Un sistema de enumeración se ha inventado para asignar números a aminoácidos que ocupan posiciones en cada uno de estos dominios. Este sistema de enumeración se define en Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 y 1991, NIH, Bethesda, D) , o Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; o Chothia et ah, 1989, Nature 342:878-883, o AHo cualquier del cual puede emplearse para describir las regiones de las proteínas enlazadas al antígeno descritas.

Las varias regiones variables de cadena pesada y cadena ligera proporcionadas en la presente se representan en las Tablas 2A y 2B. Cada una de estas regiones variable pueden unirse a las regiones constantes de cadena ligera y pesada descritas para formar un anticuerpo de cadena ligera y pesada completo, respectivamente, además, cada una de las secuencias de cadena ligera y pesada puede combinarse para formar una estructura de anticuerpo completo. Debe entenderse que las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera proporcionadas en la presente · también pueden unirse a otros dominios constantes que tienen diferentes secuencias que las secuencias ejemplares enlistadas arriba.

Los ejemplos específicos de algunas cadenas pesadas y ligeras de longitud completa de los anticuerpos que se proporcionan y sus secuencias de. aminoácido correspondientes se resumen en las Tablas 1A y IB. La Tabla 1A muestra secuencias de cadena ligera ejemplares, y la Tabla IB muestra secuencias de cadena pesada ejemplares. Las cadenas pesadas presentadas en la Tabla IB no comprenden un péptido enlazado a FGFR; cadenas pesadas que comprende un péptido enlazado a FGFR se presentan en la Tabla 5A.

Tabla 1A - Secuencias de Anticuerpo de Cadena Ligera Ej emplares Tabla IB - Secuencias de Cadena Pesada de Anticuerpo E j emplares De nuevo, cada una de las cadenas pesadas ejemplares (Hl, H2, H3 etc.) enlistadas en la Tabla IB, o alternativamente cada una de las cadenas pesadas ejemplares que comprenden una proteina enlazada a FGFR enlistada en la Tabla 5A pueden combinarse con cualquiera de las cadenas ligeras ejemplares mostradas- en la Tabla 1A para formar un anticuerpo. Los ejemplos de tales combinaciones incluyen Hl combinado con cualquiera de Ll hasta Lll; H2 combinado con cualquiera de Ll hasta.Lll; H3 combinado con cualquiera de Ll hasta Lll, cualquier cadena pesada que comprende un péptido enlazado a FGFR (por ejemplo, aquellos mostrados en la Tabla 5) combinados con cualquiera de Ll hasta Lll, cualquier cadena pesada que comprende un péptido enlazado a FGFR (por ejemplo, aquellos mostrados en la Tabla 5) combinados con cualquiera de Ll hasta Lll, y etc. En algunos casos, los anticuerpos incluyen al menos una cadena pesada y una cadena ligera de aquellos enlistados en. las Tablas 1A, IB y 5A. En algunos casos, los anticuerpos comprenden dos diferentes cadenas pesadas y dos . diferentes cadenas, ligeras enlistadas en las Tablas 1A, IB y 5A. En otros casos, los anticuerpos contienen dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Como un ejemplo,' un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional del mismo puede incluir dos cadenas pesadas Hl y dos cadena ligeras Ll, o dos cadenas pesadas H2 y dos cadena ligeras L2, o dos cadenas pesadas H3 y dos cadena ligeras L3 y Otras combinaciones similares de pares de cadenas ligeras y pares, de cadenas pesadas como se enlista en las Tablas 1A, IB y 5A.

Otras proteínas enlazadas al antígeno y el componente de proteína enlazada al antígeno de la fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno que se proporcionan en la presente comprenden variantes de anticuerpos formados por combinación de las cadenas pesadas y ligeras mostradas en las Tablas 1A, IB y 5A y comprenden cadenas pesadas y/o ligeras que cada una tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad a las . secuencias de aminoácido de estas cadenas. En algunos casos, tales anticuerpos incluyen al menos una cadena pesada y una cadena ligera, mientras que en otros casos las formas variantes contienen dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas.

Dominios Variable de Proteínas Enlazadas al Antígeno y el Componente de Proteína Enlazada al Antígeno de Fusiones FGF21-Proteína Enlazada al Antígeno También se proporcionan proteínas enlazadas al antígeno y los componentes de proteína enlazada al antígeno de fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno que contienen una región variable ' de cadena pesada de anticuerpo seleccionada del grupo que consiste de VHI-VHH como se muestra en la Tabla 2B y/o una región variable de cadena ligera de anticuerpo seleccionada del grupo que consiste de VL1-VL11 como se muestra en la Tabla 2A, y fragmentos inmunológicamente funcionales, derivados, muteinas y variantes de estas regiones variables de de cadena ligera y cadena pesada.

Las proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno de este tipo pueden generalmente designarse por la fórmula "VHx/VLy, " donde "x" corresponde al numero de regiones variables de cadena pesada e "y" corresponde al .numero de las regiones variables de cadena ligera.

Tabla 2A - Cadenas Ligeras Variables (VL) de Anticuerpo Ej emplares Tabla 2B - Cadenas Pesadas Variables (VH) de Anticuerpo Ejemplares Tabla 2C - Secuencia de Codificación para Cadenas Ligeras Variables (VL) de Anticuerpo Tabla 2D - Secuencia de Codificación para Cadenas Pesadas Variables (VH) de Anticuerpo Cada una de las regiones variables de cadena pesada enlistadas en la Tabla 2B pueden combinarse con cualquiera de las regiones variables de cadena ligera mostradas en la Tabla 2A para formar una próteina enlazada al antigeno o el componente de proteína enlazada al antigeno de una fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno. Los ejemplos de tales combinaciones incluyen VHI combinado con cualquiera de VL1-VL11; VH2 combinado con cualquiera de VL1-VL11; VH3 combinado con cualquiera de VL1-VL11; y. etc.

En algunos casos, la proteina enlazada al antigeno o el componente de proteína enlazada al antígeno de una fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno incluye al menos una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera de aquellos enlistados en las Tablas 2A y 2B. En algunos casos, la proteína enlazada al antígeno o el componente de proteína enlazada' al antígeno de una fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno incluye al menos dos diferentes regiones variable de cadena pesada y/o regiones variables de cadena ligera de aquellos enlistados en la Tabla 2B. Un ejemplo de tal proteína enlazada al antígeno o el componente de proteína enlazada al antígeno de una fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno comprende (a) una VHI, y (b) uno de VH2-VH11. Otro ejemplo comprende (a) un VH2, y (b) una de VH1 o VH3-VH11. De nuevo otro ejemplo comprende (a) una VH3, y (b) una de VH1, VH2, o VH5 ó VH11, etc. De nuevo otro ejemplo de tal proteína enlazada' al antígeno o el componente de proteína enlazada al antígeno de una fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno comprende (a) una VL1, y (b) una de VL2-VL11. De nuevo otro ejemplo de tal proteína enlazada al antígeno o el componente de proteína enlazada al antígeno de una fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno comprende (a) una VL2, y (b) una de VL1, o VL3-VL11, etc.

De nuevo, otro ejemplo de tal proteína enlazada al antígeno o el componente de la proteína enlazada al antígeno de una fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno comprende (a) un VL1, y (b) uno de VL2-VL11. De nuevo, otro ejemplo de tal proteína enlazada al antígeno o el componente de la proteina enlazada al antigeno de una fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno comprende (a) un VL2, y (b) uno de VL1, o VL3-VL11, etc. De nuevo,, otro ejemplo de tal proteína enlazada al antígeno o el componente de la proteína enlazada al antígeno de una fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno comprende (a) un VL3 , y (b) uno de VL1, VL2, o VL4-VL11, etc.

Las diversas combinaciones de regiones variables de cadena pesada pueden combinarse con cualquiera de las diversas combinaciones de regiones variables de cadena ligera .

En otros casos, la proteína enlazada al antígeno o el componente de la proteína enlazada al antígeno de una fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno contiene dos regiones variables de cadena ligera idénticas y/o dos regiones variables de cadena pesada idénticas. Como un ejemplo, la proteína enlazada al antígeno o el componente de la proteína enlazada al antígeno de una fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno puede ser un anticuerpo o fragmento inmunológicamente . funcional que incluye dos regiones variables de cadena ligera y dos regiones variables de cadena pesada en combinaciones de pares de regiones variables de cadena ligera y pares de regiones variables de cadena pesada como se enlista en las Tablas- 2A y 2B.

Algunas proteínas enlazadas al antigeno y componentes de la proteína enlazada al antígeno de una fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno que se proporcionan comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de un dominio variable de cadena pesada seleccionado de VH1-VH11 en solo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 residuos de aminoácido, en donde cada ' una de tal diferencia de secuencia es independientemente ya sea una eliminación, inserción o sustitución de un aminoácido, con las eliminaciones, inserciones y/o sustituciones que resultan en no más de 15 aminoácidos cambiados · con relación a las secuencias de dominio variable anteriores. La región variable de cadena pesada en algunas proteínas enlazada al antígeno y algunos componentes de proteína enlazada al antígeno de fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácido de la región variable de cadena pesada de VH1-VH11.

Ciertas proteínas enlazadas al antígeno y los componentes de la proteína enlazada al antígeno de una fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno comprenden un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que diferente de la secuencia de un dominio variable de cadena ligera seleccionado de VL1-VL11 en sólo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 residuos de aminoácido, en donde cada una de tales diferentes en secuencia es independientemente ya sea una eliminación, inserción o sustitución de un aminoácido, con las eliminaciones, inserciones y/o sustituciones que resultan en no más de 15 aminoácidos que cambian con relación a las secuencias de dominio variable anteriores. La región variable de cadena ligera en algunas proteínas enlazadas al antígeno y componentes de la proteína enlazada al antígeno de una fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene' al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácido de la región variable de cadena ligera de VL1-VL11.

En instancias adicionales, las proteínas enlazadas al antígeno y componentes de la proteína enlazada al antígeno de una fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno comprenden los siguientes pares de dominios variables de cadena ligera y cadena pesada:VLl con VH1, VL2 con VH2, VL3 con VH3, VL4 con VH4, VL5 con VH5, VL6 con CH6, VL7 con VH7, VL8 con VH8, VL9 con VH9, VL10 con VH10, VL11 cón VH11. En algunas instancias, las proteínas enlazadas al antígeno y componentes de la proteína enlazada al antígeno de una fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno en los emparejados anteriores pueden comprender secuencias de aminoácido que tienen 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con los dominios variables 'especificados.

Todavía otras proteínas enlazadas al antígeno y componentes de la proteína enlazada al antígeno de una fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos inmunológicamente funcionales, incluyen formas variantes de una cadena pesada variante y una cadena ligera variante como se describe.

Proteína Enlazada al Antígeno y Componente de la Proteína Enlazada al Antígeno de una Fusión FGF21-Proteína Enlazada Al Antigeno CDRs Las proteínas enlazadas al antígeno y los componentes de la proteína enlazada al antígeno de una fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno descritos en la presente son polipéptidos en los cuales uno o más CDRs se insertan, insertan y/o unen. Una proteína enlazada al antígeno o componente de la proteína enlazada al antígeno de una fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno puede tener 1, 2, 3, 4, 5 o 6 CDRs. Una proteína enlazada al antígeno o componente de la proteína enlazada al antígeno de una fusión FGF21-proteína enlazada al antigeno de esta manera puede tener, por ejemplo, un CDR1 de cadena pesada ( "CDRH1" ) , y/o un CDR2 de cadena pesada ("CDRH2") , y/o un CDR3 de cadena pesada ( "CDRH3" ) y un CDR1 de cadena ligera ( "CDRLl" ) , y/o un CDR2 de cadena ligera ("CDRL2"), y/o un CDR3 de cadena ligera ("CDRL3") . Algunas proteínas enlazadas al antígeno y componentes de la proteína enlazada al antígeno de una fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno incluyen tanto CDRH3 como un CDRL3. Los CDRs de cadena pesada y ligera específicos se identifican en las Tablas 3A y 3B, respectivamente.

Las regiones determinantes de la complementaridad (CDRs) y las regiones de armazón. (FR) de un anticuerpo dado pueden identificarse usando cualquiera de los números numéricos conocidos para aquellos expertos en la técnica, tal como el sistema descrito por Kabat et al., en secuencias de Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., US Dept . of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publicación no. 91 -3242, 1991, ver también Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901 -917; Chothia et al, 1989, Nature 342: 877-883. Ciertas proteínas enlazadas al antígeno y antígeno de fusión FGF21 proteína enlazada al antígeno enlazan componentes de proteínas que se describen en la presente que comprenden una o más secuencias de aminoácidos que son idénticas o tienen identidad de secuencia sustancial a las secuencias de aminoácidos de una o más de las CDRs presentadas en la Tabla 3 A (CDRHs) y Tabla 3B (CDRLs) .

Tabla 3A - Secuencias CDRH- de ej emplificación Tabla 3B- secuencias DRLL de ej emplificación Tabla 3C-Secuencias de codificación para CDRHs Tabla 3D- Secuencias de codificación para CDRLs La estructura y · las propiedades de CDRs dentro de proteínas enlazadas al antígeno que ocurren de manera natural y componentes de proteína enlazada al antígeno fusión FGF21 (por ejemplo, anticuerpos) se han descrito, supra. Brevemente, en un anticuerpo tradicional, las CDRs se incrustan dentro de un armazón en la región variable de cadena ligera y pesada donde constituyen las regiones responsables para enlazar y su reconocimiento. Una región variable comprende al menos tres CDRs de cadena pesada o ligera, (ver, por ejemplo Kabat et al, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD; ver también Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al, 1989, Nature 342: 877-883), dentro de una región de armazón (designadas regiones de armazón 1-4, FR1, FR2, FR3, and FR , by Kabat et al, 1991, supra; ver también Chothia and Lesk, 1987, supra) . Sin embargo, las CDRs proporcionadas en la presente, no sólo pueden usarse para definir el dominio de enlace al antigeno de una proteina enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno, pero pueden incrustarse en una variedad de otras estructuras de polipéptido.s , como se describe en la presente. En un aspecto, las CDRs proporcionadas son (a) una CDRH seleccionada del grupo que consiste de (i) a CDRH1 seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 83 -88; (ii) una CDRH2 seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 89-97; (iii) una CDRH3 seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 98-105; y (iv) una CDRH de (i), (ii) y (iii) que contiene una o más sustituciones de aminoácidos, eliminaciones o inserciones de no más de cinco, cuatro, tres, dos, o un aminoácidos; (B) una CDRL seleccionada del grupo que consiste de (i) una. CDRL1 seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 106-1 11; (ii) una CDRL2 seleccionada del grupo gue consiste de SEQ ID NO: 112-1 19; (iii) una CDRL3 seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 120-127; y (iv) una CDRL de (i), (ii) y (iii) que contenga una o más sustituciones de aminoácidos, eliminaciones o inserciones de no más de cinco, cuatro, tres, dos, o un aminoácidos.

En otro aspecto, una proteina enlazada al antigeno o componente de proteina enlazada al antigeno de fusión FGF21 de proteina enlazada al antigeno incluye 1, 2, 3, 4, 5, o 6 formas variantes de las CDRs enlistadas en las Tablas 3A y 3B, cada una teniendo al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia para una secuencia CDR enlistada en las Tablas 3A y 3B. Algunas proteínas enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno incluyen 1, 2, 3, 4, 5, o 6 de las CDRs enlistadas en las Tablas 3A y 3B, cada una diferenciando por no más que 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos de las CDRs enlistadas en estas Tablas.

Aún en otro aspecto, una proteína enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno incluye las siguientes asociaciones de CDRL1 , CDRL2 y CDRL3 : SEQ ID NOs: 106, 112 y 120; SEQ ID NOs: 107, 113, 121; SEQ ID NO: 108, 114, 122; SEQ ID NOs: 110, 116, 124; SEQ ID NOs: 111, 112, 125; SEQ ID NOs: 111, 112, 127; SEQ ID NOs: 111, 112, 125; SEQ ID NOs: 107, 117, 126; SEQ ID NOs: 107, 118, 127 y SEQ ID NOs: 107, 119, 126.

En un aspecto adicional, una proteina enlazada al antigeno o componente de proteina enlazada al antigeno fusión FGF21 de proteina enlazada al antigeno incluye las siguientes asociaciones de CDRH1, CDRH2 y CDRH3: SEQ ID NOs: 83, 89, y 98; SEQ ID NOs 84, 90, 99; SEQ ID NOs: 85, 91, 100; SEQ ID NOs: 87, 93, 102; SEQ ID NOs:88, 89, 103; SEQ ID NOs: 88, 89, 104; SEQ ID NOs: 88, 94, 104; SEQ ID NOs: 85, 95, 105; SEQ ID NOs: 85, 96, 105; y SEQ ID NOs: 85, 97, 105.

En otro aspecto, una proteina enlazada al antigeno o componente de proteina enlazada al antigeno de fusión FGF21 de proteina enlazada al antigeno incluye las siguientes asociaciones de CDRL1, CDRL2 y GDRL3 con CDRH1, CDRH2 y CDRH3: SEQ ID NOs: 106, 112 y 120 y SEQ ID NOs:83, 89, y 98; SEQ ID NOs: 107, 113, 121 y SEQ ID NOs 84, 90, 99; SEQ ID NO: 108, 114, 122 y SEQ ID NOs: 85, 91, 100; SEQ ID NOs: 110, 116, 124 y SEQ ID NOs: 87, 93, 102; SEQ ID NOs: 111, 112, 125 y SEQ ID NOs:88, 89, 103; SEQ ID NOs: 111, 112, 127 y SEQ ID NOs: 88, 89, 104; SEQ ID NOs: 111, 112, 125 y SEQ ID NOs: 88, 94, 104; SEQ ID NOs: 107, 117, 126 y SEQ ID NOs: 85, 95, 105; SEQ ID NOs: 107, 118, 127 y SEQ ID NOs: 85, 96, 105; y SEQ ID NOs: 107, 119, 126 y SEQ ID NOs: 85, 97, 105.

Secuencias de consenso Aún en otro aspecto> las. CDRs descritas en la presente incluyen secuencias de consenso derivadas de los grupos relacionados con proteínas enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno, particularmente anticuerpos monoclonales . Como se describe en la presente, una "secuencia de consenso" se refiere a secuencias de aminoácidos que tienen aminoácidos conservados comunes entre un número de secuencias y aminoácidos variables que varían dentro de unas secuencias de aminoácidos dadas. Las CDR de secuencias de consenso proporcionadas incluyen CDRs que corresponden a cada una de CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3.

Las secuencias de consenso se determinaron usando análisis filogénico estándar de las CDRs que corresponden a VH y VL de los anticuerpos descritos, algunos de los cuales específicamente enlazan ß-Klotho un orof FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR . Las secuencias de consenso se determinaron manteniendo las CDRs contiguas dentro de la misma secuencia correspondiente a VH o VL.

CDR3 cadena ligera Grupo 1 MQA I EFPWT (SEQ ID NO: 120) MQA L EFPWT (SEQ ID NO: 125) MQA X EFPWT (SEQ ID NO:' 174) en donde ?? es L o I Grupo 2 GTWDSSLS V V A (SEQ ID -NO: 121) GTWDSSLS A V V (SEQ ID NO: 126) GTWDSSLS X2 V X3 (SEQ ID NO: 175) en donde X2 Es V o A. Y X; , Es V o A Grupo 3 QQYDNLFT (SEQ ID NO: 122) Grupo 4 QQYGSAPLT (SEQ ID NO: 123) Grupo 5 VLYMGSGIWV (SEQ ID NO: 124) Grupo 6 ETWDSSLSAGV (SEQ ID NO: 127) CDR2 cadena ligera Grupo 1 KISNRFS (SEQ ID NO: 112) Grupo 2 DNN K RP (SEQ ID NO: 113) ' DNN N RP S (SEQ ID NO: 118) DNN R RP S ( SEQ ID NO: 117) DNN X4 RP X5 (SEQ ID NO: 176) en donde 4 es K, N o R- y X5 es S o ausente Grupo 3 DTSNLET (SEQ ID NO: 114) Grupo 4 GASSRAT (SEQ ID NO: 115) Grupo 5 STNTRSS (SEQ ID NO: 116) CDRl cadena ligera Grupo 1 RSSQSLV Y S DGNTYLS (SEQ ID NO: 105) RSSQSLV H Y DGNTYLS (SEQ ID NO: 111) RSSQSLV X22 Y X23 DGNTYLS (SEQ ID NO: 177) en donde X22 es H o ausente y X23 es S o ausente.

Grupo 2 SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID NO: 107) Grupo 3 QASQDINNYLN (SEQ ID NO: 108) Grupo 4 RASQSVSGNYLA (SEQ ID NO: 109) Grupo 5 GVSSGSVSTRYYPS (SEQ ID NO: 110) CDR3 PESADA Grupo 1 G FD Y (SEQ ID NO: 98) G FD I (SEQ ID NO: 103) GWFD F (SEQ ID NO: 104) GWFD X6 (SEQ ID NO: 178) en donde X6 Es Y, I o F Grupo 2 GTSFDY (SEQ ID NO: 99) Grupo 3 YGGSFDY (SEQ ID NO: 100) Grupo 4 MVYVLDY (SEQ ID NO: 101) Grupo 5 VAGPFDF (SEQ ID NO: 102) CDR2 PESADA Grupo 1 WINP N SGGTNSAQKFQG (SEQ ID NO: 89) WTNP N SGGTNSAQKFQG (SEQ ID NO: 89) WTNP N SGGTNSAQKFQG (SEQ ID NO: 89) WINP Y SGGTNSAQKFQG (SEQ ID NO: 94) WINP X7 SGGTNSAQKFQG (SEQ ID NO: 179) en donde X7 Es N o Y Grupo 2 VI W F DG R N Q YYADSVKG (SEQ ID NO: 90) VI G Y DG S Y K YYADSVKG (SEQ ID NO: 91) VI G Y DG S Y K YYADSVKG (SEQ ID NO: 91) VI X8 X9 DG X10 Xn Xi2 YYADSVKG (SEQ ID NO: 180) en donde X8 Es W o G; X9 es F o Y; Xi0 es R o S; Xn es N o Y y X12 es Q o K Grupo 3 A ISG S G V S TYYADSVKG (SEQ ID NO: 92) D ISG R G G Y TYYADSVKG (SEQ ID NO: 93) X13 ISG X14 G X15 X16 TYYADSVKG ( SEQ ID NO: 181) en donde X13 es A o D; Xi4 es S o R; Xi5 es V o G; y Xi6 es S o Y Grupo 4 VI W YDGRNEY Y ADSVKG (SEQ ID NO: 95) VI S YDGSNKY Y ADSVKG (SEQ ID NO: 96) VI W YDGRNKY H ADSVKG (SEQ ID NO: 97) VI X17 YDGRNKY X18 ADSVKG (SEQ ID NO: 182) en donde X17 Es W o S Y Xi8 Es Y o H .

CDR1 PESADA Grupo 1 G Y Y M H (SEQ ID NO: 83) R Y G M H (SEQ ID NO: 84) S Y G M H (SEQ ID NO: 85) T Y A M S (SEQ ID NO: 86) I Y A M S (SEQ ID NO: 87) A Y Y M H (SEQ ID NO: 88)' Xi9 Y X20 M X2i (SEQ ID NO: 183) en donde Xi9 Es A, G, R, S., T o I, X20 Es Y, G o A Y X21 Es H o S.

En algunos casos la proteina enlazada al antígeno o componente de proteina enlazada al antigeno de fusión FGF21 de proteina enlazada al antigeno comprende al menos una cadena pesada CDR1, CDR2, o CDR3 que tiene una o más de las secuencias de consenso anteriores. En algunos casos, la proteina enlazada al antigeno o componente de proteina enlazada al antigeno de fusión FGF21 de proteina enlazada al antigeno comprende al menos una CDR1, CDR2, o CDR3 de cadena ligera que tiene una de las secuencias de consenso. En otros casos, la proteina enlazada al antigeno o componente de proteina enlazada al antigeno de fusión FGF21 de proteina enlazada al antigeno comprende al menos dos CDRs de cadena ligera de acuerdo a las secuencias de consenso, y/o al menos dos CDRs de cadena ligera de acuerdo a las secuencias de consenso anteriores. Aún en otros casos, la proteina enlazada al antigeno o componente de proteina enlazada al antigeno de fusión FGF21 de proteina' enlazada al antigeno comprende al menos tres CDRs de cadena pesada de acuerdo a las secuencias de consenso anteriores, y/o al menos tres CDRs de cadena ligera de acuerdo a las secuencias de consenso de arriba.

Péptidos de enlace FGFR Los péptidos que enlazan específicamente a una FGFR, por ejemplo, FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, o FGFR4 también se proporcionan. Dichos péptidos pueden formar un elemento de una cadena pesada, que en turno puede formar un elemento de una proteína enlazada al antígeno, tal como un anticuerpo que específicamente enlaza a ß-Klotho; La inserción puede cambiar la especificidad del anticuerpo de especificidad para un objetivo sencillo en la habilidad para asociar y/o específicamente enlazar con dos o más¦ diferentes objetivos. En varias modalidades, ' los péptidos descritos se insertan en una región de bucle CH2 o CH3 de una región Fe de una cadena pesada, como se describe en la presente.

Las bibliotecas de péptidos se seleccionaron, y se hicieron los experimentos ELISA para determinar el enlace, que resultó en un número de péptidos que se enlazan a una FGFR, por ejemplo, FGFRlc. La Tabla 4A describe los péptidos de ej emplificación de enlace a FGFRlc que se identificaron (también ver Figura 12) : Tabla 4 A - Péptidos de ej emplificación de enlace a FGFR Tabla 4B - Secuencias de ejemplificación de codificación de péptidos de enlace a FGFR Cadenas pesadas de longitud completa que comprenden un péptido de enlace a FGFR 'Habiendo proporcionado regiones variables de cadena pesada de ej emplificación, en otro aspecto, una cadena pesada de una proteina enlazada al antigeno que comprende un péptido de enlace a FGFR, tal como un péptido descrito en la tabla 4A, se proporciona. En este aspecto, el péptido de enlace a FGFR se inserta en la secuencia primaria de la cadena pesada y forma un componente integrado de cadena pesada. El péptido de enlace a FGFR puede localizarse en cualquier punto en la cadena pesada; en un ejemplo del péptido de enlace a FGFR se ubica en un bucle de CH2 o CH3 de cadena pesada.

Un péptido de enlace a FGFR puede flanquearse en los términos N, C o ambos términos por residuos de flanqueo. Los residuos de flanqueo, tal como residuos de glicina, pueden proporcionar un nivel de flexibilidad que conduce a la formación de un enlace de disulfuro entre los residuos de cisteina de flanqueo. En un ejemplo, un péptido de enlace a FGFR, tal como aquellos mostrados en la Tabla 4A, puede flanquearse sobre el término N por residuos GGC y sobre el término C por los residuos CGG. Las secuencias de flanqueo pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos.

Tabla 5A - Cadenas pesadas de anticuerpo de e j emplif icación que comprenden un péptido de enlace FGFR Clon Identificador SEQ ID Identificador SEQ ID Secuencia Aminoácidos Péptido NO Secuencia O Enlace Péptido FGFR Enlace FGFR JA 2- SR4 18? HI-SR4 24 QV0LV0SOAEVK PGA SV V SR4 SCKASGYTFTGYYMHWVRQ APGQGLEWMGWINPNSGGT NSAQKFQC VTMTRDTSTSTA YMELSRLRSDDTAVYYCA D ATSGW E V WGQGT LVTVSSA STt GPSV'FPl.AJ'SSJ STSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVPSSSLGTQTYIC V NHKPS TKVDK VEPFCSCDK THTCPPCPAP ELL GGPS VFLFP PKP DTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYQSTYRWS VLTVLHQDW LNOKEYKCKV SNKA L A P ! EKTIS A KGQ E PQV YTLPPS R.DE LGGC YOA W GYYVCGGT JNQVSLTCLV G FYPSDIAVEWESNGQPENNY K.TTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWOQGNVFSCSV H EA LHiNHYTQ S LSLS PGIv 5 0 5 Tabla 5B - Secuencia de codificación para cadenas pesadas de anticuerpo que comprende un péptido de enlace a FGFR Proteínas enlazadas al antígeno y componentes de protelna enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno de ej emplificación De acuerdo a un aspecto, una proteína enlazada al antígeno aislada gue ' comprende ( A ) una o más regiones determinantes de la complementaridad de cadena pesada (CDRHs) seleccionada del grupo gue consiste de: (i) una CDRH1 seleccionada del grupo gue consiste de SEQ ID NO: 83-88; (ii) una CDRH2 seleccionada del grupo gue consiste de SEQ ID NO: 89-97; (iii) una CDRH3 seleccionada del grupo gue consiste de SEQ ID NO: 98-105; y (iv) una CDRH de (i), (ii) y (iii) gue contiene una o más sustituciones de aminoácidos, eliminaciones o inserciones de no más de cinco, cuatro, tres, dos, un aminoácidos; (B) una- o más regiones de determinación de complementariedad de cadena pesada (CDRLs ) seleccionada del grupo gue consiste de: (i) una CDRL1 seleccionada del grupo gue consiste de SEQ ID NO: 106-1 1 1; (ii) una CDRL2 seleccionada del grupo gue consiste de SEQ ID NO: 112-119; (iii) una CDRL3 seleccionada del grupo gue consiste de SEQ ID NO: 120-127; y (iv) una CDRL de (i), (ii) y (iii) gue contiene una o más sustituciones de aminoácidos, eliminaciones o inserciones de no más de cinco, cuatro, tres, dos, un aminoácidos; o (C) una o más CDRHs de cadena pesada de (A) y una o más de CDRLs de cadena ligera (B) .

En otra modalidad, las CDRHs tienen al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 83-105, y/o las CDRLs tienen al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 106-127. En una modalidad adicional, la VH es seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 72-82, y/o la VL es seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 61-71.

De acuerdo a un aspecto, una proteína enlazada al antígeno aislada que comprende (A) una o más cadenas pesadas variables (VHs) seleccionadas del grupo que consiste de: (i) SEQ ID NO: 72- 82; y (ii) una VH de (i) que contiene una o más sustituciones de aminoácidos, eliminaciones o inserciones de no más de cinco, cuatro, tres, cuatro, dos o un aminoácidos; (B) una o más cadenas ligeras variables (VLs) seleccionadas del grupo que consiste de: (i) SEQ ID NO: 61-71, y (ii) una VL de (i) que contiene una o más sustituciones de aminoácidos, eliminaciones o inserciones de no más de cinco, cuatro, tres, dos, un aminoácidos; o (C) una o más cadenas pesadas de variables 'de (A) y una o más cadenas ligeras variables de (B) .

En otra modalidad, la cadena pesada variable (VH) tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 72-82, y/o la cadena ligera variable (VL) tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%. 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 61-71.- En un aspecto, también se proporciona una proteína enlazada al antígeno y un componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que asocia con un epítopo que comprende residuos de aminoácido de FGFRlc, FGRF2c, FGFR3c o FGFR4, cuando se asocia con ß-Klotho. En una modalidad particular el epítopo comprende residuos de aminoácido de FGFRlc. En un aspecto, también se proporciona una proteína enlazada al antígeno y componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que específicamente enlaza a un epítopo que comprende residuos de aminoácido de ß-Klotho.

En otro aspecto, también se proporciona una proteína enlazada al antígeno. aislada y componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que específicamente enlaza a un epítopo que comprende residuos de aminoácido tanto de ß-Klotho como residuos de aminoácido de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, o FGFR .

Aún en otra modalidad, la proteína aislada enlazada al antígeno y al componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno descrito en la presente anteriormente comprende una primer secuencia de aminoácidos que comprende al menos una de las secuencias de consenso CDRH descrita en la presente, y una segunda secuencia de aminoácidos que comprende al menos una de las secuencias de consenso de CDRL descritas en la presente. En un aspecto, la primera secuencia de aminoácidos comprende al menos dos de las secuencias de consenso CDRH, y/o la segunda secuencia de aminoácidos' comprende al menos dos de las secuencias de consenso de CDRL.

En ciertas modalidades, la primera y la segunda secuencia de aminoácidos están covalentemente enlazadas la una a la otra.

En una modalidad adicional, la primera secuencia de aminoácidos de la proteina aislada enlazada al antigeno o componente de proteina enlazada al antigeno de fusión FGF21 de proteina enlazada al antigeno incluye la CDRH3 de SEQ ID NO:98, la CDRH2 de SEQ ID NO:89,'y la CDRHl de SEQ ID NO:83, y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteina aislada enlazada al antigeno o componente de proteina enlazada al antigeno de fusión FGF21 de proteina enlazada al antigeno comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 120, la CDRL2 de SEQ ID NO: 1 12, y la CDRL1 de SEQ ID NO: 106.

En otra modalidad, la primera secuencia de aminoácidos de la proteina aislada enlazada al antigeno o componente de proteina enlazada al antigeno de fusión FGF21 de proteina enlazada al antigeno incluye la CDRH3 de SEQ ID NO: 99, la CDRH2 de SEQ ID NO: 90, y la CDRHl de SEQ ID NO: 84, y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteina aislada enlazada al antigeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno comprende la CDRL3 de SEQ ID. NO: 121, la CDRL2 de SEQ ID NO: 1 13, y la CDRLl de SEQ ID NO: 107.

En una modalidad adicional, la primera secuencia de aminoácidos de la proteína aislada enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 proteína de fusión enlazada al antígeno incluye la CDRH3 de SEQ ID NO: 100, la CDRH2¦ de SEQ ID NO:91, y la CDRHl de SEQ ID NO-.85, y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteína aislada enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 122, la CDRL2 de SEQ ID NO: 1 14, y la CDRLl de SEQ ID NO: 108.

En otra modalidad, la primera secuencia de aminoácidos de la proteína aislada enlazada al' antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno incluye la CDRH3 de SEQ ID NO: 102, la CDRH2 de SEQ ID NO: 93, y la CDRHl de SEQ ID NO: 87, y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteína aislada enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 124, la CDRL2 de SEQ ID NO: 116, y la CDRL1 de SEQ ID NO: 110.

En una modalidad adicional, la primera secuencia de aminoácidos de la proteina aislada enlazada al antígeno o componente de proteina enlazada al antigeno de fusión FGF21 de proteina enlazada al antigeno incluye la CDRH3 de SEQ ID NO: 103, la CDRH2 de SEQ ID NO: 89, y la CDRH1 de SEQ ID NO: 88, y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteina aislada enlazada al antigeno o componente de proteina enlazada al antigeno de fusión FGF21 de proteina enlazada al antigeno comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 125, la CDRL2 de SEQ ID NO: 112, y la CDRL1 de SEQ ID NO: 111.

En otra modalidad, la primera secuencia de aminoácidos de la proteína aislada enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno incluye la CDRH3 de SEQ ID NO: 104, la CDRH2 de SEQ ID NO: 89, y la CDRHl de SEQ ID NO: 88, y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteína aislada enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 127, la CDRL2 de SEQ ID NO: 112, y la CDRL1 de SEQ ID NO: 111.

En otra modalidad, la primera secuencia de aminoácidos de la proteína aislada enlazada al antígeno o componente de proteina enlazada al antigeno de fusión FGF21 de proteina enlazada al antigeno incluye la CDRH3 de SEQ ID NO: 104, la CDRH2 de SEQ ID NO: 94, y la CDRH1 de SEQ ID NO: 88, y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteina aislada enlazada al antigeno o componente de proteina enlazada al antigeno-FGF21 de proteina enlazada al antigeno comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 125, la CDRL2 de SEQ ID NO: 112, y la CDRL1 of SEQ ID NO: 111.

En una modalidad adicional, la primera secuencia de aminoácidos de la proteina aislada enlazada al antigeno o componente de proteina enlazada al antigeno de fusión FGF21 de proteina enlazada al antigeno incluye la CDRH3 de SEQ ID NO: 105, la CDRH2 de SEQ ID NO: 95, y la CDRH1 de SEQ ID NO: 85, y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteina aislada enlazada al antigeno o componente de proteina enlazada al antigeno de fusión FGF21 de proteina enlazada al antigeno comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 126, la CDRL2 de SEQ ID NO: 117, y la CDRL1 de SEQ ID NO: 107.

En otra modalidad, la primera secuencia de aminoácidos de la proteina aislada enlazada al antigeno o componente de proteina enlazada al antigeno de fusión FGF21 de proteina enlazada al antigeno incluye la CDRH3 de SEQ ID NO: 105, la CDRH2 de SEQ ID NO: 96, y la CDRH1 de SEQ ID NO: 85, y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteina aislada enlazada al antigeno o componente de proteína enlazada al antigeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 127, la CDRL2 de SEQ ID NO: 118, y la CDRLl de SEQ ID NO: 107.

En otra modalidad, la primera secuencia de aminoácidos de la proteína aislada enlazada al antígeno o componente de próteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno incluye la CDRH3 de SEQ ID NO: 105, la CDRH2 de SEQ ID NO: 97, y la CDRHl de SEQ ID NO: 85, y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteína aislada enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 126, la CDRL2 de SEQ ID NO: 119, y- la CDRLl de SEQ ID NO: 107.

En una modalidad adicional, la proteína enlazada al antígeno comprende al menos una secuencia CDRH de secuencias de cadena pesada Hl-Hll como se muestra en la Tabla 3A, o 1A2-SR4, 2G10-SR4, 14E8-SR4, 25B 10-SR4, 1A2-Rm26, 1A2-Rm40, 2G10-Rm26, 2G10-Rm40 como se muestra en la Tabla 5A. De nuevo en una modalidad adicional, la proteína enlazada al antígeno comprende al menos una secuencia .CDRL de secuencias de cadena ligera Ll-Lll como se muestra en la Tabla 3B.

De nuevo en una modalidad adicional, la proteína enlazada al antígeno comprende al menos dos secuencias CDRH de secuencias de cadena pesada Hl-Hll como se muestra en la Tabla 3A, o 1A2-SR4, 2G10-SR4, 14E8-SR4, 25B10-SR4, 1A2-Rm26, 1A2-Rm40, 2G10-Rm26, 2G10-Rm40 como se muestra en la . Tabla 5A, y al menos dos secuencias CDRL de secuencias de cadena ligera Ll-Lll como se muestra en la Tabla 3B.

De nuevo en otra modalidad, la proteina enlazada al antigeno comprende las secuencias CDRH1, CDRH2, y CDRH3 de secuencias de cadena pesada Hl-Hll como se muestra en la Tabla 3A, o 1A2-SR ,¦ 2G10-SR , 14E8-SR4, 25B10-SR4, 1A2-Rm26, 1A2-Rm40, 2G10-Rm26, 2G10- Rm40 como se muestra en la Tabla 5A. Aún en otra modalidad, la proteina enlazada al antigeno comprende las secuencias CDRL1, CDRL2, y CDRL3 de secuencias de cadena ligera Ll-Lll como se muestra en la Tabla 3B.

Aún en otra modalidad, la proteina enlazada al antigeno comprende todas las seis CDRs de Ll y Hl, o L2 y H2, o L3 y H3, o L4 y H4, o L5 y H5,. L6 y H6, L7 y H7, L8 y H8, L9 y H9, LIO y H10 o Lll y Hll o las seis CDRs de 1A2-SR4, 2G10-SR4, 14E8-SR4, 25B10-SR4, 1A2-Rm26, 1A2-Rm40, 2G10-Rm26 and 2G10-Rm40, como se muestra en las Tablas 6A, 6B y 6C.

Tabla 6A - Secuencias de cadena pesada sin un péptido de enlace a FGFR Tabla 6C- Secuencias de cadena pesada que comprenden un péptido de enlace FGFR En un aspecto, las proteínas enlazadas al antígeno aisladas y los componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que específicamente enlazan ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR.4 proporcionados en la presente pueden ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo ¦policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, .un fragmento de anticuerpo del mismo.

En otra modalidad, el fragmento de anticuerpo de las proteínas de enlace al antígeno aisladas y los componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno proporcionados en la presente puede ser un fragmento Fab, un fragmento. Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, un diacuerpo, o una molécula de anticuerpo de cadena sencilla.

En una modalidad adicional, una proteína enlazada al antígeno aislada y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno proporcionada en la presente que específicamente enlaza ß- Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 es un anticuerpo humano y puede ser del tipo IgGl-, IgG2- IgG3- o IgG4-.

En otra modalidad, una proteína enlazada al antígeno aislada o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que específicamente enlaza ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 comprende sólo un polipéptido de cadena pesada o ligera como se establece en las Tablas 1 y 5. En algunas modalidades, una proteína enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que específicamente enlaza ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y' FGFR4 consiste sólo de un dominio pesado variable o ligero variable tal como aquellos enlistados en la Tabla 2. Tales proteínas enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno pueden ser PEGilados con una o más moléculas PEG, por ejemplos las moléculas PEG que tiene un peso molecular seleccionado del grupo que consiste de 5K, 10K, 20K, 40K, 50K, 60K, 80K, 100K o mayor que 100K.

Aún en otro aspecto, las proteínas enlazadas al antígeno aisladas y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que específicamente enlazan ß-Klotho o ß-Klotho y una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 proporcionadas en la presente pueden acoplarse a un grupo de etiquetación y pueden competir para enlazar a la porción extracelular de ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 con una proteína enlazada al antígeno de una de las proteínas enlazadas al antigeno aisladas y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno proporcionados en la presente. En una modalidad, las proteínas enlazadas al antígeno aisladas y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno proporcionados en la presente pueden reducir los niveles de glucosa en la sangre, disminuir los niveles de triglicéridos y colesterol o mejorar otros parámetros glicémicos y factores de riesgo cardiovascular cuando se administran a un paciente.

Como se apreciará, para cualquier proteína enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que comprende más que una CDR de las secuencias representadas, cualquier combinación de CDRs independientemente seleccionada de las secuencias representadas es útil. De esta manera, las proteínas enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno con uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDRs independientemente seleccionadas puede generarse. Sin embargo, como se apreciará, las modalidades específicas generalmente utilizan combinaciones de CDRs que no son repetitivas, por ejemplo, las proteínas enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno no se hacen generalmente con dos regiones CDRH2, etc.

Algunas de las proteínas enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que específicamente enlazan ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 que se proporcionan en la presente se discuten a mayor detalle a continuación.

Proteínas enlazadas- al antígeno y componentes de Proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de Proteína enlazada al antígeno y epítopos de enlace y dominios de enlace Cuando una proteína enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno se dice enlaza un epítopo sobre ß-Klotho o ß- lotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4, o el dominio extracelular del mismo, por ejemplo, a lo que se refiere es que la proteína enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antigeno específicamente enlaza a una porción indicada de ß-Klotho o una porción indicada de un complejo que comprende ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGRR4. En algunas modalidades, por ejemplo, en ciertos casos donde la proteína enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno enlaza sólo ß-Klotho, la proteína enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno puede específicamente enlazar a un polipéptido que consiste de los residuos indicados (por ejemplo, un segmento especifico de ß-Klotho) . En otras modalidades, por ejemplo, en ciertos casos donde una proteína enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno interactúa tanto como ß-Klotho como con uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c and FGFR4, la proteína enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno enlazará residuos, secuencias de residuos, o regiones . tanto en ß-Klotho como en FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4, dependiendo de cuál receptor reconozca la proteína enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno. Aún otras modalidades la proteína enlazada al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno enlazarán residuos, secuencia o residuos o regiones de un complejo que comprende ß-Klotho y FGFRlc. En cualquiera de las modalidades precedentes, tal proteina enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno típicamente no necesita contactar cada residuo de ß-Klotho y/o una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. Ni cada sustitución o eliminación de aminoácido sencilla dentro de ß-Klotho y/o FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o ' FGFR4 , o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4, o el dominio extracelular de las proteínas recitadas o complejos necesariamente afectan de manera importante la afinidad de enlace.

La especificidad del epítopo y el dominio (s) de enlace de una proteína enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno puede determinarse por medio de una variedad de métodos. Algunos métodos, por ejemplo, pueden usar porciones truncadas de un antígeno. Otros métodos utilizan antígeno mutado en uno o más residuos específicos, tal como al emplear un escaneo de alanina o enfoque de tipo de escaneo de arginina o por la generación y estudio de proteínas quiméricas en las que varios dominios, regiones o aminoácidos se intercambian entre dos proteínas, o por ensayos de protección de proteasa.

Competencia de Proteínas enlazadas al antlgeno y componentes de proteína enlazada al antigeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antigeno En otro aspecto, las proteínas enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno se proporcionan pará que compitan con uno de los anticuerpos ejemplificados o enlace de fragmentos funcionales para un epítopo descrito en la presente para enlace específico para ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. Tales proteínas enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno también pueden enlazar al mismo epítopo como en las proteínas enlazadas al antígeno o componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno en la presente ejemplificadas, o un epítopo superpuesto. Las proteínas enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno y fragmentos de la misma que compiten o enlazan al mismo epítopo como las proteínas enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno ejemplificados se espera muestren propiedades funcionales similares. Las proteínas enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antigeno de fusión FGF21 de proteina enlazada al antigeno y fragmentos de los mismos de ej emplificación incluyen aquellas con cadenas ligera y pesada, dominios de región variable VL1-VL11 y VH1- VH11, y las CDRs incluidas en las Tablas 1 y 3, respectivamente. De esta manera, como un ejemplo especifico, las proteínas enlazadas al antígeno y los componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que se proporcionan incluyen aquellos que compiten con un anticuerpo o fragmento que tiene: (a) todas las 6 de las CDRs enlistadas para un anticuerpo como se enlista en la Tabla 3; (b) una VH y una VL seleccionada de VL1- VL11 y VH1- VH11 para un anticuerpo como se enlista en la Tabla 2; o (c) dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas como se especifica para un anticuerpo como se enlista en las Tablas 1 Y 5.

De esta manera, en una modalidad, la presente descripción proporciona proteínas enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que compiten para enlazar a ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 con un anticuerpo dé referencia, en donde el anticuerpo de referencia comprende una combinación de secuencias de dominio variable de cadena ligera y cadena pesada seleccionadas del grupo que consiste de L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H0 o L11H11.

En otra modalidad, la presente descripción proporciona proteínas enlazadas al antígeno humanas y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que ' compiten para enlazar a ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 con un anticuerpo de referencia, en donde el anticuerpo de referencia es 1A2, 2G10, 14E8, 25B10, 3B4, 1B5, 10H3, 9D10, 3F4 o 8F9.

En una modalidad adicional, una proteína enlazada al antígeno aislada humana o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno se proporciona que específicamente enlaza a ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 con sustancialmente el mismo' Kd como anticuerpo de referencia; inicia la señalización tipo FGF21 en un ensayo ELK-Luciferasa in vitro al mismo grado como anticuerpo de referencia; reduce la glucosa en la sangre; baja los niveles de lípido de suero; y/o compite para enlazar con dicho anticuerpo de referencia a ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 , en donde el .anticuerpo de referencia es seleccionado del grupo que consiste de 1A2, 2G10, 14E8, 25B10, 3B4, 1B5, 10H3, 9D10, 3F4 o 8F9. La habilidad para competir con una proteína enlazada al antigeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno puede determinarse usando cualquier ensayo idóneo, en el que 1A2, 2G10, 14E8, 25B10, 3B4, 1B5, 10H3, 9D10, 3F4, 8F9, 1A2-SR4, 2G10-SR4, 14E8-SR4, 25B10-SR4, 1A2-Rm26, . 1A2-Rm40, 2G10-Rm26, o 2GlO-Rm40 pueden usarse como anticuerpo de referencia.

Anticuerpos monoclonale.s Las proteínas enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que se proporcionan incluyen anticuerpos monoclonales que se enlazan a ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR , e inducen señalización tipo FGF21 a varios grados. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, inmortalizando células de bazo cosechadas del animal transgénico después de la finalización de la programación de . la inmunización. Las células de bazo pueden inmortalizarse usando cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, fusionándolas con células de mieloma para producir hibridomas. Las células de mieloma para su uso en procedimientos de fusión que producen hibridoma preferiblemente producen no anticuerpo, tiene eficiencia de fusión alta, y deficiencias de enzima que las hace incapaces de madurar en ciertos medios selectivos que respaldan el crecimiento de sólo las células fusionadas deseadas (hibridomas ) . Los ejemplos de lineas celulares idóneas para su uso en fusiones de ratón incluyen Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS 1/1 .Ag 4 1, Sp210-Agl4, FO, NSO/U, MPC-11, MPC1 1-X45-GTG 1.7 y S194/5XXO Bul; los ejemplos de lineas celulares usadas en las fusiones de rata incluyen R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210. Otras lineas celulares útiles para las fusiones de lineas celulares incluyen U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6.

En algunos casos, una linea celular de hibridoma se produce inmunizando un animal (por ejemplo, un animal transgénico que tiene secuencias de inmunoglobulina humana) con un inmunógeno FG.FRlc, ß-Klotho o FGFRlc y/o ß-Klotho (por ejemplo, un complejo soluble que comprende los dominios extracelulares de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 y/o ß- lotho como se muestra en los Ejemplos 2, y 3 membranas sobre las que los dominios extracelulares de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 y/o ß-Klotho se expresan, como se muestra en Ejemplos 1 y 3 o células enteras expresando FGFRlc y/o ß-Klotho, como se muestra en Ejemplos 1 y 3); cosechando células del bazo del animal inmunizado; fusionando las células del bazo cosechadas a una linea celular mieloma, asi generando células de hibridoma; estableciendo lineas celulares de hibridoma de las células hibridoma, e identificando una linea celular de hibridoma que produce un anticuerpo que específicamente enlaza a ß-Klotho or ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 (por ejemplo, como se describe en la presente) y puede inducir la señalización tipo FGF21 (por ejemplo, como se describe en Ejemplos 5-7). Tales líneas celulares de hibridoma, . y los anticuerpos monoclonales producidos por ellas, forman aspectos de la presente descripción.

Los anticuerpos monoclonales secretados por una línea celular de hibridoma pueden purificarse usando cualquier método conocido en la técnica. Los hibridomas o mAbs además pueden seleccionarse para identificar mAbs con propiedades particulares, tal como la habilidad para inducir la señalización tipo FGF21. Los ejemplos de tales selecciones se proporcionan en la presente.

Proteínas enlazadas al antígeno quiméricas y humanizadas y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno Las proteínas enlazadas al antígeno quiméricas y humanizadas y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno (por ejemplo, anticuerpos, tal como anticuerpos monoclonales) basados sobre las secuencias de la descripción también se proporcionan. Los anticuerpos monoclonales para su uso como agentes terapéuticos pueden modificarse de varias formas previo a su uso. Un ejemplo es un anticuerpo quimérico, que es un anticuerpo compuesto de segmentos de proteínas de diferentes anticuerpos que están covalentemente unidos para producir cadenas ligera o pesada de inmunoglobulina funcional o porciones inmunológicamente funcionales de las mismas. Generalmente, una porción de la cadena pesada y/o cadena ligera es idéntica con, u homologa a, una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de una especie en particular o perteneciendo a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena (s) es/son idéntica u homologa a la secuencia correspondiente en los anticuerpos derivados de otra especie o que pertenece a otra ' clase o subclase de anticuerpo. Para los métodos relacionados a los anticuerpos quiméricos, ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567; y Morrison et al, 1985, Proc. Nati. Acad. Sci . E-.U.A 81:6851-6855, que se incorporan en la presente como referencia. El injerto por CDR se describe, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 6, 180,370, No. 5,693,762, No. 5,693,761, No. 5,585,089, y No. 5, 530, 101.

Generalmente, la meta de hacer un anticuerpo quimérico es crear una quimera en la que el número de aminoácidos de la especie paciente pretendida se maximiza. Un ejemplo es el anticuerpo "CDR-injertado", en el que el anticuerpo comprende una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de una especie particular o pertenece a una clase o subclase de un anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena (s) de anticuerpo es/son idéntica u homologa a una secuencia correspondiente en . anticuerpos derivados de otra especie o pertenecen a una clase o subclase de un anticuerpo particular. Para su uso en humanos, la región variable o CDRs seleccionadas de un anticuerpo de roedor frecuentemente se injerta en un anticuerpo humano, remplazando las regiones variables que ocurren de manera natural o CDRs del anticuerpo humano. Un tipo útil de anticuerpo quimérico es un anticuerpo "humanizado". Generalmente, un anticuerpo humanizado se produce de un anticuerpo monoclonal levantado inicialmente en un animal no humano. Ciertos residuos de' aminoácido en este anticuerpo monoclonal, típicamente de porciones reconocidas de no antígeno del anticuerpo, se modifican para ser homologas a residuos correspondientes en un anticuerpo humano de isotipo correspondiente. La humanización puede realizarse por ejemplo, por ejemplo, usando varios métodos sustituyendo al menos una porción de una región variable de roedor para las regiones correspondientes de un anticuerpo humano (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 5,585,089, y No. 5,693, 762; Jones et al, 1986, Nature 321 : 522-525; Riechmann et al, 1988, Nature 332:323-27; Verhoeyen et al, 1988, Science 239: 1534-1536).

En un aspecto, las CDRs de las regiones variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos proporcionados en la presente (ver Tablas 3 y 6) se injertan a regiones de armazón (FRs) de anticuerpos de las mismas, o una diferente, especie patológica. Por ejemplo, las CDRs de las regiones variables de cadena pesada y ligera VHl , VH2, VH3, VH4 o VH5 y/o VL1, VL2, VL3, VL4 o VL5 pueden injertarse a FRs de consenso humano. Con el fin de crear FRs de consenso humano, las FRs muchas secuencias de aminoácidos de cadena ligera o cadena pesada humana pueden alinearse para identificar una secuencia de aminoácidos de consenso. En otras modalidades, las FRs de una cadena pesada o ligera descritas en la presente se remplazan con las FRs de una cadena pesada o cadena ligera diferente. En un aspecto, los aminoácidos raros en las FRs de las cadenas pesadas y ligeras de una proteina enlazada al antigeno (por ejemplo, un anticuerpo) que específicamente enlaza ß-Klotho o ,ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 no se remplazan, mientras que el resto de los aminoácidos FR se remplazan. Un "aminoácido raro" es un aminoácido especifico que está en una posición en la que este aminoácido particular usualmente no se encuentra en una FR. Alternativamente, las regiones variables injertadas de una cadena pesada o ligera pueden usarse con una región constante que es diferente de la región constante de la cadena pesada o ligera particular como se describe en la presente. En otras modalidades, las regiones variables injertadas son parte de un anticuerpo Fv de cadena sencilla.

En ciertas modalidades, las regiones constantes de otra especie que no es human pueden usarse junto con la(s) región (es) variables para producir anticuerpos híbridos.

Anticuerpos completamente humanos Los anticuerpos . completamente humanos también se proporcionan por descripción al instante. Los métodos están disponibles para hacer anticuerpos completamente humanos específicos para un antígeno dado sin exponer seres humanos al antígeno ("anticuerpos completamente humanos") . Un medio específico proporcionado para implementar la producción de anticuerpos completamente humanos es la "humanización" del sistema inmune humoral del ratón. La introducción de lugares de inmunoglobulina humana (Ig) en los ratones en los que los genes Ig endógenos han sido inactivados es un medio para producir anticuerpos completamente humanos monoclonales (mAbs) en ratón, un animal que puede inmunizarse con cualquier antigeno deseable. Al usar los anticuerpos completamente humanos se pueden inmunizar las respuestas inmunogénicas y alérgicas que a veces pueden ser causadas al administrar mAbs de ratón .o derivados de ratón a humanos como agentes terapéuticos.

Los anticuerpos completamente humanos pueden producirse inmunizando animales transgénicos (típicamente ratones) que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos en la ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Los antigenos para este propósito típicamente tienen seis o más aminoácidos contiguos, y opcionalmente se conjugan para un portador, tal como un hapteno. Ver, por ejemplo, Jakobovits et al, (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A 90:2551-2555; Jakobovits et al, (1993) Nature 362:255-258; and Bruggermann et al, (1993) Year in Immunol . 7:33. En un ejemplo de tal método, los animales transgénicos se producen incapacitando los lugares endógenos de inmunogloblulina de ratón que codifican las cadenas e inmunoglobulina de cadenas ligera y pesada de ratón en la presente, e insertando en los ratones fragmentos grandes de genoma de ADN de genoma humano que contienen lugares que codifica las proteínas de cadenas ligera y pesada humanas. Los animales parcialmente modificados, que tienen menos que el complemento completo de lugares de inmunoglobulina humana, entonces son reproducidos para obtener un animal que tenga todas las modificaciones al sistema inmune deseadas. Cuando se administra un inmunógeno, estos animales trangénicos producen anticuerpos que son inmunoespecífieos para el inmunógeno pero tienen secuencias de aminoácidos más humanas que de roedor, incluyendo las regiones variables. Para detalles adicionales de tales métodos, ver, por ejemplo, 096/33735 y WO94/02602. Los métodos adicionales relacionados a ratones transgénicos para hacer anticuerpos humanos se describen en la Patente de los E.U.A. No. 5,545,807; No. 6,713,610; No. 6,673,986; No. 6,162,963; No. 5,545,807; No. 6,300,129; No. 6,255,458; No. 5,877,397; No. 5,874,299 y No. 5,545,806; en publicaciones PCT WO91/10741, WO90/04036, y en EP 546073B1 y EP 546073A1.

Los ratones transgénicos descritos anteriormente, referidos en la presente como ratones "HuMab", contienen un gen de inmunoglobulina humana minilocus que codifica secuencias de inmunoglobulina de cadenas pesada ([ [µ] , mu] y [ [?] , gamma] ) y [ [?] , ' kappa] cadena ligera, junto con mutaciones ob etivizadas que . inactivan el loci de cadena endógena p[mu] y ? [kappa] (Lonberg et al, 1994, Nature 368:856-859). En consecuencia, los ratones exhiben expresión reducida de ratón IgM o [K, kappa] y en respuesta a la inmunización, los transgenes de cadena pesada y ligera humana introducidos se someten a una clase de cambio y mutación somática para generar anticuerpos monoclonales IgG huamnos de afinidad alta [?, kappa] (Lonberg et al, supra.; Lonberg and Huszar, (1995) Intern. Rev. Immunol . J_3 : 65-93; Harding and Lonberg, (1995) Ann. N. Y Acad. Sci. 764:536-546). La preparación de ratones Hu a ¦ se describe a detalle en Taylor et al, (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen et al, (1993) International Immunology 5:647- 656; Tuaillon et al, (1994) J. Immunol.. 152:2912-2920; Lonberg et al, (1994) Nature 368:856-859; Lonberg, (1994) Handbook of Exp. Pharmacology 1 13:49-101 ; Taylor et al, (1994) International Immunology 6:579-591; Lonberg and Huszar, (1995) Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding and Lonberg, (1995) Ann. N. YAcad. Sci. 764:536-546; Fishwild et al, (1996) Nature Biotechnology 14:845-851; las referencias precedentes se incorporan en la presente como referencia en su totalidad para todos los propósitos. Ver además, la Patente de los Estados Unidos No. 5,545,806; No. 5,569,825; No. 5,625, 126; No. 5,633,425; No. 5,789,650; No. 5,877,397; No. 5,661,016; No. 5,814,318; No. 5,874,299; y No. 5,770,429; asi como la Patente de los Estados Unidos No. 5,545,807; Publicación Internacional Nos. O 93/1227; WO 92/22646; y WO 92/03918, las descripciones de todas gue en la presente se incorporan como referencia en su totalidad para todos los' propósitos. Las tecnologías utilizadas para producir anticuerpos humanos en estos ratones transgénicos se describen también en WO 98/24893, and Méndez et al, (1997) Nature Genetics 15: 146-156, que se incorpora en la presente como referencia. Por ejemplo, las cepas de ratones transgénicos HCo7 y HCol2 pueden usarse para generar proteínas enlazadas al antígeno (por ejemplo, anticuerpos) que se enlazan a ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 e inducir la señalización FGF21-similar. Los detalles adicionales respecto a la producción de anticuerpos humanos usando ratones transgénicos se proporciona en los ejemplos en la. presente.

Al usar la tecnología de hibridoma, los mAbs humanos específicos de antígeno con la especificidad deseada pueden producirse y seleccionarse de los ratones transgénicos tal como aquellos descritos anteriormente. Tales anticuerpos pueden clonarse y expresarse usando un vector idóneo y célula hospedera, o los anticuerpos pueden cosecharse de células de hibridoma cultivadas.

Los anticuerpos completamente humanos también pueden derivarse de bibliotecas de exhibición de fagos (como se describe en Hoogenbóom et al, (1991) J. Mol. Biol. 227:381; and Marks et al, (1991) J. Mol. Biol. 222:581). Las técnicas de exhibición de fagos imitan la selección inmune a través de la exhibición de repertorios de anticuerpo en la superficie de bacteriófago filamentoso, y selección subsecuente de fago por su enlace a un antigeno de elección. Tal técnica se describe en Publicación PCT No. O 99/10494 (en la presente incorporada como referencia) , que describe el aislamiento de anticuerpos agonistas funcionales de alta afinidad para receptores MPL- y msk- usando tal enfoque.

Proteínas enlazadas al antígeno bioespecíficas o bifuncionales y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno Las proteínas enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que se proporcionan también incluyen anticuerpos bioespecífieos y bifuncionales que incluyen una o más CDRs o una o más regiones variables como se describe en la presente. Un anticuerpo bíoespecífico o bifuncional puede ser, en algunos casos, un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos diferentes pares de cadenas pesada/ligera y dos diferentes sitios de .enlace. Los anticuerpos biespecífieos pueden producirse por una variedad de métodos incluyendo, pero no limitado a, fusión de hibridomas o ligado de fragmentos Fab1. Ver, por ejemplo, Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; ostelny et al, 1992, J. Immunol. 148: 1547-1553. En una modalidad, una proteína enlazada al antígeno b componente de proteina enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno de la descripción instantánea puede enlazar ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc , FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 , que puede llevar a la inactivación de actividad FGF21-similar como se mide por ensayos de señalización funcional FGF21-similar descritos en los Ejemplos 5-7.

Fusiones FGF21 de Proteína enlazada al antígeno Se ha demostrado que la terminal N de FGF-21 proporciona especificidad para el receptor FGF, mientras que la terminal C de FGF-21 proporciona especificidad para ß-Klotho. En consecuencia, las fusiones FGF21 de proteína enlazada al antígeno pueden designarse de manera que imiten la habilidad de señalización FGF21 madura y puede comprender (a) un componente de proteína enlazada al antígeno que tenga una especificidad para ß-Klotho y (b). un componente FGF21 que comprenda una longitud variable del extremo de la terminal N de una secuencia de polipéptidos FGF21 que retiene la especificidad para un receptor FGF21. Alternativamente, una fusión FGF21 de proteina enlazada al antígeno puede comprender (a) un componente de proteína enlazada al antígeno que tiene especificidad para una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 y (b) un fragmento del componente FGF21 que comprende una longitud variable del extremo de la terminal C de una secuencia de polipéptidos FGF21 que mantiene la especificidad para ß-Klotho. Opcionalmente, pueden incluirse ligaduras para unir el componente FGF21 al componente de proteina enlazada al antigeno. De esta manera, en otro aspecto de la presente descripción, las fusiones de proteina enlazada al antigeno de FGF21 se proporcionan.

En una modalidad una fusión FGF21 de proteina enlazada al antigeno comprende (a) un componente proteina enlazado al antigeno que específicamente enlaza ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 ; y (b) un componente FGF21, que comprende una forma truncada de FGF21. En algunas modalidades, la fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno comprende un componente de proteína enlazada al antígeno que específicamente enlaza a ß-Klotho humano y se fusiona a un componente FGF21 que comprende una forma truncada de un FGF21 humano. En algunas modalidades, el componente de proteína enlazada al antígeno se selecciona de las proteínas enlazadas al antígeno de las Tablas 1-3 y 6. En algunas modalidades el componente FGF21 comprende entre 25 y 180 aminoácidos de SEQ ID NO: 341. En una modalidad particular el componente de proteína enlazada al antígeno es anticuerpo 2G10 y el componente FGF21 comprende residuos 1-170 de FGF21 (SEQ ID NO: 343) .

El componente FGF21 de una fusión puede unirse directamente al componente de proteina de enlace al antígeno de la fusión en la terminal N de ya sea la cadena pesada o cadena ligera del componente de la proteína enlazada al antígeno. En otras modalidades el componente FGF21 de una fusión puede unirse directamente al componente de la proteína enlazada al antígeno de la fusión en la terminal C- de la cadena pesada del componente de . la proteína enlazada al antígeno. Opcionalmente, puede emplearse una ligadura para unir los componentes de una fusión juntos, ya sea en la terminal N o C de la cadena pesada de una proteína enlazada al antígeno o la terminal N de la cadena ligera de una proteína enlazada al antígeno.

Las fusiones FGF21 de proteína enlazada al antígeno pueden exhibir una variedad de características tal como (i) potencia in vivo similar o igual a la forma madura de longitud completa de FGF21 ; (ii) afinidad de enlace alta y especificidad para un receptor FGF21 o ß-Klotho; (iii) inmunogenicidad disminuida debido a la presencia de secuencias nativas de FGF-21 truncada ; y (iv) la vida media extendida típica de un anticuerpo.

Componente de la proteína enlazada al antígeno Un componente, de la proteína enlazada al antígeno de una fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno comprende una proteína que específicamente enlaza (a) ß-Klotho, (b) una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4, o (c) ß- lotho y una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. La especificidad de la proteína enlazada al antígeno dependerá de la arquitectura total de la fusión, aunque todos los diseños preferiblemente producirán una fusión que imita la actividad de señalización de FGF21. Cualquiera de los formatos de la proteína enlazada al antígeno descrita en la presente puede emplearse en una fusión, tal como anticuerpos, hemicuerpos, fragmentos Fab, etc. Las proteínas enlazadas al antígeno y elementos de las mismas (por ejemplo, cadenas pesadas, cadenas ligeras, regiones variables y CDRs) proporcionadas en las Tablas 1-3 y 6 pueden servir como componentes de enlace al antígeno de una fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno-FGF21.

En una modalidad el componente de la proteína enlazada al antígeno específicamente enlaza ß-Klotho. En está modalidad el componente FGF21 de la fusión específicamente se asociará con una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 y comprenderá una forma N- terminalmente truncada de FGF21. El componente de enlace al antígeno también puede enlazar . a una o más FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 en adición a ß-Klotho.

En otra modalidad, el componente de proteína enlazada al antígeno específicamente, enlaza a una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. En esta modalidad- que el componente FGF21 de la fusión específicamente se asociará con ß-Klotho y comprenderá una forma C- terminalmente truncada de FGF21. EL componente de la proteína enlazada al antígeno puede también enlazar a ß-Klotho además de una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR .

Cuando el componente de enlace al antígeno es un anticuerpo, el anticuerpo puede comprender un anticuerpo proporcionado en la presente, tal como aquellos descritos en las Tablas 1-3 y 6, tal como aquellos secretados de los clones 1A2, 2G10, 14E8, 25B 10, 3B4, 1B5, 10H3, 9D10, 3F4, y 8F9. Los anticuerpos que comprende una o más de las CDRs descritas, incluyendo fragmentos Fab y regiones variables, también pueden emplearse en un¦ componente de proteína enlazada al antígeno.

El componente FGF-21 El componente FGF21 de la fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno puede comprender cualquier longitud de FGF21 que es al menos 25 aminoácidos en longitud.

En varias modalidades, el componente FGF21 de una proteína enlazada al antígeno comprende un fragmento de FGF21 (SEQ ID NO:341), que comprende entre 25 y 180 aminoácidos, por ejemplo 180, 179, 178, 177, 176, 175, 174, 173, 172, 171, 170, 169, 168, 167, 166, 165, 160, · 155, 150, 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30 o 25 aminoácidos. El componente FGF21 puede ser un fragmento de SEQ ID NO:341 que ha sido truncado de la terminal N, terminal C o ambas la terminal C para generar e fragmento que comprende entre 25 y 180 aminoácidos.

En algunas modalidades, el componente FGF21 puede comprender una secuencia FGF21 (por ejemplo, SEQ ID NO: 341) que se ha truncado sobre el extremo de la terminal C. Por ejemplo el componente FGF21 puede comprender residuos 1-180, 1-179, 1-178, 1-177, 1-176, 1-175, 1-174, 1-173, 1- 172, 1-171, 1-170, 1-169, 1-168, 1-167, 1-166, 1-165, 1-160, 1-155, 1-150, 1-145, 1-140, 1-135, ¦ 1-130, 1-125, 1-120, 1-115, 1-110, 1-105, 1-100, 1-95, 1-90, 1-85, 1-80, 1-75, 1-70, 1- 65, 1-60, 1-55, 1-50, 1-45, 1-40, 1-35, 1-30 o 1-25 de SEQ ID NO:341.

En otras modalidades el componente FGF21 puede comprender una secuencia FGF21 (por ejemplo, SEQ ID NO: 341) que se ha truncado en el extremo de terminal N. Por ejemplo el componente FGF21 puede comprender residuos 2-181, 3-181, 4-181, ' 5-181, 6-181, 7-181, 8-181, 9-181, 10-181, 1 1-181, 12-181, 13-181, 14-181, 15-181, 20-181, 25-181, 30-181, 35-181, 40-181, 45-181, 50-181,¦ 55-181, 60-181, 65-181, 70-181, 75-181, 80-181, 85-181, 90-181,. 95-181, 100-181, 105-181, 110-181, 115-181, . 120-181, 125-181, 130-181, 135-181, 140-181, 145- 181, 150-181, 155-181, 160-181 o 165-181.

Aún en otras modalidades el componente FGF21 puede comprender una secuencia FGF21 (por ejemplo, SEQ ID NO: 341) que se ha truncado sobre ambos extremos de las terminales N y C. Por ejemplo el componente FGF21 puede comprender 2-181, 3-180, 4-179, 5-178, 6-177,. 7-176, 8-175, 9-174, 10-173, 11-172, 12-171, 13-170, 14-165, 15-160, 20-155, 25-150, 30-145, 35- 140, 40-135, 45-130, 50-125, 55-120, 60-115, 65-110, 70-105 o 75-100.

Ligaduras El componente de la proteina enlazada al antigeno de una fusión puede, pero no necesita, asociarse con el componente FGF21 de la fusión por medio de una secuencia de ligadura. Los ejemplos de ligaduras se proporcionan aqui y pueden comprender péptidos, polisacáridos, PEG y otros tipos de polímeros. Los ejemplos de ligaduras de péptido idóneas se describen en Patentes de E.U.A. Nos. 4,751,180 and 4,935,233. En modalidades particulares una ligadura de péptido comprende una porción Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 344) repetida dos o más veces. De esta manera, una ligadura puede comprender, por ejemplo, (G4S)3 (SEQ ID NO: 336), (G4S)6 (SEQ ID NO: 337), (G4S)9 (SEQ ID NO: 338), (G4S)12 ( SEQ ID NO: 339), o (G4S)15 (SEQ ID NO: 340) . Otros ejemplos de ligaduras poliméricas incluyen moléculas PEG, tal como PEG 20, PEG 40 o PEG 60.

Las fusiones FGF21 de proteina enlazada al antigeno pueden expresarse y purificarse usando técnicas de laboratorio estándar como se describe en la presente, por ejemplo en el Ejemplo 17. Las fusiones pueden expresarse como una proteina de longitud completa sencilla o puede expresarse en componentes y subsecuentemente unirse por medio de una reacción química. Las técnicas de purificación estándar, tal como Proteína A, exclusión de tamaño y cromatografía de intercambio de iones, pueden emplearse para aislar una fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno.

Otras formas de proteínas enlazadas al antiqeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno Algunas de las proteínas enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que específicamente enlaza ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 que se proporcionan pueden comprender formas variantes de las proteínas enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno descritas en la presente (por ejemplo, aquellas que comprende una o más de las secuencias enlistadas en las Tablas 1-3 y 6) .

En varias modalidades, proteínas enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada -al antígeno descrita en la presente puede comprender uno o más aminoácidos que ocurren de manera natural. Por ejemplo, algunas de las proteínas enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno pueden tener una o más sustituciones de aminoácidos que ocurren de manera natural en una o más dé las cadenas pesadas o ligeras, regiones variables o CDRs enlistadas en las Tablas 1-3 y 6. Los ejemplos de aminoácidos no naturalmente (que pueden sustituirse por cualquier aminoácido que ocurre de manera natural encontrado en- cualquier secuencia descrita en la presente, como se desee) incluyen: 4-hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e-?, , -trimetilisina, e-?-acetilisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N- formilmetionina, 3-metilhistidina, 5 -hidroxilisina , s-?-metilarginina, y otros aminoácidos similares e imino ácidos (por ejemplo, 4-hidroxiproline ) . En la notación polipéptida usada en la presente, la dirección hacia la izquierda es la dirección amino terminal y la dirección hacia la derecha es la dirección carboxi terminal, de acuerdo con el uso y la convención estándar. Una lista sin límites de los ejemplos de aminoácidos que no ocurren de ' manera natural que pueden insertarse en una secuencia de aminoácidos primaria de proteína enlazada al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno o una secuencia de proteína enlazada al antígeno y componente de proteína, enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno incluye ß-aminoácidos , ácidos homoamino, aminoácidos cíclicos y aminoácidos con cadenas laterales derivadas. Los ejemplos incluyen (en la forma L o la forma D; abreviadas como en el paréntesis) : citrulina (Cit) , homocitrulina (hCit), Na-metilcitrulina ( MeCit), Na-metilhomocitrulina (Na-MeHoCit) , ornitina (Orn) , Na-Metilornitina (Na-MeOrn o NMeOrn) , sarcosina (Sar) , homolisina (hLys o hK) , homoarginina (hArg o hR) , homoglutamina (hQ) , Na-metilarginina (NMeR) , Na-metileucina (Na-MeL o NMeL) , . N-metilhomolisína (NMeHoK) , Na-metilglutamina (NMeQ) , norleucina (Nle) , norvalina (Nva) , 1, 2, 3, 4-tetrahidroisoquinolina (Tic), Octahidroindola-2-ácido carboxílico (Oic) ,. 3- ( 1-naftil) alanina (1-Nal) , 3- (2-naftil) alanina (2-Nal), 1, 2, 3, 4-tetrahidroisoquinolina (Tic), 2-indanilglicina (Igl), para-iodofenilalanina (pl-Phe) , para-aminofenilalanina (4AmP o 4-Amino-Phe) , 4-guanidino fenilalanina (Guf ) , glicilisina (abreviada "K( e-glicil)" o "K(glicil)" o "K(gly)"), nitrofenilalanina (nitrophe) , aminofenilalanina (aminophe o Amino-Phe) , bencilfenilalanina (bencilphe) , ácido ?-carboxiglutamico (?-carboxyglu) , hidroxiprolina (hidroxipro) , p-carboxyl-fenilalanina (Cpa) , ácido a-aminoadipico (Aad) , Na-metil valina ( MeVal), N-a-metil leucina (MeLeu) , Na-metilnorleucina (NMeNle) , ciclopentilglicina (Cpg) , ciclohexilglicina (Chg) , acetilarginina (acetylarg) , , ácido ß-diaminopropionoico (Dpr) , , ácido ' ß-diaminobutirico (Dab) , ácido diaminopropionico (Dap), ciclohexilalanina (Cha), 4-metil-fenilalanina (MePhe) , ß, ß-difenil-alanina (BiPhA) , ácido aminobutirico (Abu) , 4-fenil-fenilalanina (o bifenilalanina ; 4Bip) , a- amino-ácido isobutírico (Aib) , beta-alanina, beta-ácido aminopropanoico, ácido piperidinico, ácido aminocaprioico, ácido aminoheptanoico, ácido aminopimelico, desmosina, ácido diaminopimelico, N-etilglicina, N-etilaspargina , hidroxi lisina, allo-hidroxilisina , isodesmosina, allo-isoleucina, N-metilglicina, N-metilisoleucina, N-metilvalina, 4-hidroxiprolina (Hyp) , ?-carboxiglutamato, e-?, N, N-trimetilisina, e-?-acetilisina, 0-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina , 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, ?-metilarginina, 4- Amino-0-ácido itálico (4APA), y otros aminoácidos similares, y forms derivadas de cualquiera de aquellas específicamente enlistadas.

Adicionalmente, las proteínas enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno pueden tener una o más sustituciones de aminoácidos conservadores en una o más de las cadenas pesadas o ligeras, regiones variables o CDRs enlistadas en las Tablas 1-6. Los aminoácidos que ocurren de manera natural pueden dividirse en clases basándose en propiedades comunes de las cadenas laterales: 1) hidrofóbico: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, He; 2) hidrofílico neutral:- Cys, Ser, Thr, Asn, Gin; 3) acídico: Asp, Glu; 4) básico: His, Lys, Arg; 5) residuos que ejercen influencia en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y 6) aromático: Trp, Tyr, Phe .

Las sustituciones de aminoácidos conservadores pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases con otro miembro de la misma clase. Las sustituciones de los aminoácidos conservadores pueden abarcar residuos de aminoácidos que ocurren de manera no natural, que se incorporan típicamente por síntesis de péptido químico que por síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomimeticos y otras formas reservadas o invertidas de radicales de aminoácidos.

Las sustituciones no conservadoras pueden implicar el intercambio de un miembro de una de las clases de arriba por un miembro de otra clase. Tales residuos sustituidos pueden introducirse en regiones de la proteina enlazada al antigeno y componentes de proteina enlazada al antigeno de fusión FGF21 de proteina enlazada al antigeno que son homólogos con anticuerpos humanos, o en las regiones no homologas de la molécula.

Haciendo tales cambios, de acuerdo a ciertas modalidades, el índice hidropático de aminoácidos puede considerarse. El perfil hidropático de una proteína se calcula asignando a · cada aminoácido un valor numérico ("índice de hidropatía") y entonces promediando repetidamente estos valores a lo largo de la cadena de péptido. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático con base a su hidrofobicidad y características de carga. Estos son: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteína/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptofano (- 0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartata (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9); y arginina (-4.5) .

La importancia 'del- perfil hidropático confiriendo función biológica interactiva sobre una proteina se entiende en la técnica (ver, por ejemplo, Kyte et ah, 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-131). Se sabe que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por ciertos aminoácidos que tienen un índice o puntaje hidropático y aún mantienen una actividad biológica similar. Haciendo cambios basándose en el índice hidropático, en ciertas modalidades, la sustitución de aminoácidos de los que los índices hidropáticos están dentro +2 se incluyen. En algunos aspectos, aquellos qué están dentro de +1 se incluyen, y en otros aspectos, aquellos dentro +0.5 se incluyen .

También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede hacerse de manera efectiva en base a la hidrofilicidad, particularmente donde la proteína funcional biológica o péptido así creado se pretende para su uso en modalidades inmunológicas , como en el presente caso. En ciertas modalidades, el promedio más grande de hidrofilicidad local es la hidrofilicidad de una proteína, regida por la hidrofilicidad de ' sus aminoácidos adyacentes, correlaciona con su inmunogenicidad y enlace al antígeno o inmunogenicidad, que es, con una propiedad biológica de la proteína .

Los siguientes valores de hidrofilicidad se han asignado a estos residuos de. aminoácidos: arginina (+3.0); lisina (+3.0); aspartata (+3.0+1); glutamato (+3.0+1); serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0.5+1); alanina (- 0.5); histidina (-0.5); cisteina (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5) y. triptofano (-3.4). Haciendo cambios basándose en los valores de hidrofilicidad similares, en ciertas modalidades, la sustitución de aminoácidos de los que los valores de hidrofilicidad están dentro de +-2 se incluye, en otras modalidades, aquellos que están dentro +-1 se incluyen, y aún en otras modalidades, aquellos dentro +-0.5 se incluyen. En algunos casos, uno puede identificar epitopos de secuencias de aminoácidos primarias en la base de hidrofilicidad. Estas regiones también son referidas como "regiones de núcleo epitópico." Las sustituciones- de aminoácidos de conservación de ej emplificación se establecen en la Tabla 7.

Tabla 7 - Sustituciones conservadoras de aminoácidos Un experto será capaz de determinar las variantes idóneas de las proteínas enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno descritos como se establece en la presente usando técnicas bien conocidas. Alguien experimentado en la técnica pude identificar áreas idóneas de las moléculas que pueden cambiarse sin destruir la actividad al atacar regiones que se crea no son importantes para la actividad. El experto será capaz de identificar¦ los residuos y porciones de las moléculas que se conservan entre polipéptidos similares. En modalidades adicionales, incluso las áreas que pueden ser importantes para . la actividad biológica o para la estructura pueden ser sujetas a sustituciones de aminoácidos conservadores sin destruir la actividad biológica o sin afectar adversariamente la estructura del polipéptido.

Adicionalmente, alguien experimentado en la técnica puede revisar los estudios de función de estructura identificando los residuos en polipéptidos similares que son importantes para la actividad o estructura. En vista de tal comparación, uno puede predecir la importancia de los residuos de aminoácido en una proteina que corresponde a residuos de aminoácidos importantes para la actividad o estructura en proteínas similares. Alguien experimentado en la técnica puede optar por sustituciones de aminoácidos químicamente similares para tales residuos de aminoácidos importantemente predichos.

Alguien experimentado en la técnica también puede analizar la estructura tridimensional y la secuencia de aminoácidos en relación a la estructura en polipéptidos similares. En vista de tal información, alguien experimentado en la técnica puede predecir la alineación de los residuos de aminoácidos de una proteína enlazada al antígeno y componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno (por ejemplo, un anticuerpo) con respecto a su estructura tridimensional. Alguien experimentado en la técnica puede seleccionar no hacer cambios radicales a lis residuos de aminoácido predichos para estar en la superficie de la proteina, ya que tales residuos pueden implicarse en interacciones importantes con otras moléculas. Además, alguien experimentado en la técnica puede generar variantes de prueba que contienen una sustitución de aminoácido sencillo en cada residuo de aminoácido deseado. Estas variantes entonces pueden seleccionarse usando ensayos para señalización tipo. FGF21 (por ejemplo, como se describe en los Ejemplos proporcionados en la presente), de esta manera produciendo información respecto a que aminoácidos pueden cambiarse y cuales no deben cambiarse. En otras palabras, basándose en la información reunida de tales experimentos de rutina, alguien experimentado en la técnica puede determinar fácilmente las posiciones de los aminoácidos donde deben evitarse sustituciones adicionales ya sea solas o en combinación con otras mutaciones.

Un número de publicaciones científicas ha sido devoto para predecir la estructura secundaria. Ver, Moult, (1996) Curr. Op. in Biotech. 7 : 422-427; ' Chou et al, (1974) Biochem. 13:222-245; Chou et al, (1974) Biochemistry 1 13:21 1-222; Chou et al, (1978) Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-148; Chou et al, (1979) Ann. Rev. Biochem. 47:251-276; and Chou et al, (1979) Biophys. J. 26:367-384. Además, los programas de computadora están actualmente disponibles para ayudar a predecir la estructura secundaria. Un método para predecri una estructura secundaria se basa en el modelado de homología. Por ejemplo, . dos polipéptidos o proteínas que tienen una identidad de secuencia mayor que 30%, o similarmente mayor que 40% pueden tener topologías estructurales similares. El crecimiento de la base de datos estructural de proteínas (PDB) ha proporcionado capacidad de predicción mejorada , de estructura secundaria, incluyendo el número potencial de tantos dentro de la estructura de un polipéptido proteína. Ver, Holm et al, (1999) Nucí. Acid. Res. 27:244-247. Se ha sugerido (Brenner et al, (1997) Curr. Op. Struct. Biol. 7:369-376) que haya un número limitado de tantos en un polipéptido o proteína dado y una vez que se haya resuelto un número típico de estructuras, la predicción estructural se volverá dramáticamente más exacta.

Los métodos adicionales para predecir la estructura secundaria incluyen reconocimiento del plegamiento "threading" (Jones, (1997) Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-387; Sippl et al, (1996) Structure 4: 15-19), "análisis de perfil" (Bowie et al, (1991) Science 253 : 164-170; Gribskov et al, (1990) Meth. Enzym. 183: 146-159; Gribskov et al, (1987) Proc. Nat . Acad. Sci. 84:4355-4358), y "ligadura evolutiva" (Ver, Holm, (1999) supra; and Brenner, (1997) supra) .

En algunas modalidades, las sustituciones de los aminoácidos pueden hacerse en las proteínas enlazadas al antigeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno descritas que: (1) reducen la susceptibilidad para proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad para la oxidación, (3) alteran la afinidad de enlace para formar complejos de proteína, (4) alteran las afinidades de enlace del ligando o antígeno, y/o (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales sobre tales polipéptidos . Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos sencillas o múltiples (en ciertas modalidades, sustituciones de aminoácidos conservadores) pueden hacerse en' las secuencias descritas en la presente.

En otras modalidades, pueden hacerse sustituciones en la porción de las proteínas enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno descritas que se encuentran al exterior del dominio (s) formando contactos intermoleculares). En tales modalidades, las sustituciones de aminoácidos conservadores pueden usarse y no cambian sustancialmente las características estructurales de la secuencia precursora (por ejemplo, uno o más aminoácidos de remplazo que no interrumpan la estructura secundaria que caracteriza a la proteina nativa o precursora enlazada al antigeno) . Los ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidos por la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed. ) , 1984, . H. New York: Freeman and Company; Introduction to Protein Structure (Branden and Tooze, eds.), 1991, New York: Garland Publishing; and Thornton et al, (1991) Nature 354: 105, que se incorporan en la presente como referencia.

Las variantes de proteínas enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno adicionales incluyen variantes de cisterna en donde uno o más residuos de cisterna en la secuencia de aminoácido precursora o pariente se eliminan de o se sustituyen con otro aminoácido (por ejemplo, serina) . Las variantes de cisteína son útiles, ínter alia cuando los anticuerpos deben replegarse en una conformación biológicamente activa. Las variantes de cisteína pueden tener algunos residuos de cisteína que el anticuerpo nativo, y típicamente tienen incluso un número para minimizar las interacciones gue resultan de cisteínas no emparejadas.

Las cadenas ligeras y pesadas, dominios de regiones variables y CDRs que se describen pueden usarse para preparar polipéptidos que contengan una región de enlace al antígeno que pueda específicamente enlazar a ß-Klotho o ß- lotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 e inducir señalización FGF21-similar . Por ejemplo, una o más de las CDRs enlistadas en las Tablas 3 y 6 pueden incorporarse en una molécula (por ejemplo, proteínas enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno) covalentemente o no covalentemente para hacer una inmunoadhesión . Una inmunoadhesión puede incorporar una CDR(s) como parte de una cadena de polipéptido más larga, puede ligar covalentemente la CDR(s) a otra cadena de polipéptido, o puede incorporar la CDR(s) no covalentemente. La CDR(s) permite la inmunoadhesión para enlazar específicamente ¦ a un antígeno particular de interés (por ejemplo, ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 o un epítopo al respecto) .

Las cadenas pesadas y ligeras, dominios de regiones variables y CDRs que se describen pueden usarse para preparar proteínas enlazadas¦ al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que contengan, una región de enlace al antígeno que pueda específicamente enlazar a una o más de ß-Klotho o ß-Klotho y una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 e inducir señalización tipó FGF21. Por ejemplo, una o más de las CDRs enlistadas en' las Tablas 3 y 6 pueden incorporarse en una molécula (por ejemplo, una proteina enlazada al antigeno y componentes de proteina enlazada al antigeno de fusión FGF21 de proteina enlazada al antigeno) que es estructuralmente similar a un "anticuerpo a la mitad que comprende la cadena pesada, la cadena ligera de una proteina enlazada al antigeno emparejada con un fragmento Fe de manera que la región de enlace al antigeno es monovalente (como un fragmento Fab) pero con un resto Fe dimérico.

Los miméticos (por ejemplo, "miméticos de péptido" o "peptidomiméticos" ) basados en los dominios de región variable y CDRs que se describen en la presente también se proporcionan. Estos análogos pueden ser péptidos, no péptidos o combinaciones de regiones de péptidos y no péptidos. Ver, por ejemplo, Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15:29; Veber and Freidinger, 1985, TINS p. 392; and Evans et ah, 1987, J. Med. Chem. 30: 1229, que se incorporan en la presente como referencia para cualquier propósito. Los miméticos de péptido que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles pueden usarse para producir un efecto terapéutico similar ' o profiláctico. Tales compuestos frecuentemente se desarrollan con la ayuda de modelado molecular computarizado . Generalmente, los peptidomiméticos son proteínas que son estructuralmente similares a un anticuerpo exhibiendo una actividad biológica deseada, como tal, en el contexto de la descripción al instante, la habilidad para específicamente enlazar ß-Klotho o ß-Klotho y una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4, pero que tienen una o más ligaduras de péptido opcionalmente remplazadas por una ligadura seleccionada de: -CH2NH-, -CH2S-, - CH2-CH2-, -CH-CH-(cis y trans) , -COCH2-, -CH(OH)CH2-, y -CH2SO-, por métodos bien conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso con un aminoácido D del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L- lisina) puede usarse en ciertas modalidades para generar proteínas más estables. Además, los péptidos constreñidos, que comprenden una secuencia de consenso o una variación de secuencia de consenso sustancialmente idéntica puede generarse por métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Rizo and Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61:387), incorporada en la presente como referencia), por ejemplo, agregando residuos de cisteína interna capaces de formar puentes de disulfuro intramolecular que cicliza al péptido.

Los derivados de las proteína enlazada al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que específicamente enlazan ß-Klotho o ß-Klotho y una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 que se describen en la presente también se proporcionan. Las proteina enlazada al antigeno y componentes de proteina enlazada al antigeno de fusión FGF21 de proteina enlazada al antigeno derivadas pueden comprender cualquier molécula o sustancia que imparta la propiedad deseada para el anticuerpo o fragmento, tal como la vida media incrementada en un uso particular. La proteina. enlazada al antigeno y componentes de proteina enlazada al antigeno de fusión FGF21 de proteina enlazada al antigeno derivada puede comprender, por ejemplo, un resto detectable (o etiquetado) (por ejemplo, una molécula radioactiva, colorimétrica, antigénica o enzimática, unas perlas detectables (tal como una perla magnética o electrodensa (por ejemplo, oro)), o una molécula que específicamente enlaza a otra molécula (por ejemplo, biotina o estreptavidina) ) , ¦ un resto terapéutico o de diagnóstico (por ejemplo, un resto radioactivo, citotóxico, o farmacéuticamente activo) , o una molécula que incremente la idoneidad de la proteína enlazada al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno para un uso particular (por ejemplo, administración a un sujeto, tal como un sujeto humano, u otros usos in vivo o in vitro) . Los ejemplos de moléculas que pueden usarse para derivar una proteína enlazada al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno incluyen albúmina (por ejemplo, albúmina de. suero humano (HSA) ) y glicol polietileno (PEG) . Albúmina ligada y derivados PEGilados de proteínas enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno pueden prepararse usando métodos bien conocidos en la técnica. Ciertas, proteínas, enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno incluyen un polipéptido de cadena sencilla PEGilado como se describe en la presente. En una modalidad, la proteína enlazada al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno está conjugada o de otra forma ligada a transtretina (TTR) o una variante TTR. La TTR o variante TTR puede modificarse químicamente, por ejemplo, un químico seleccionado del grupo que consiste de dextrano, poli (n-vinil pirrolidona) , glicoles polietileno, homopolímeros glicol propileno, co-polímeros óxido óxido/etileo propileno, poliolos polioxietilados y alcoholes polivinilo.

Otros derivados incluyen conjugados agregados o covalentes de las proteínas enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que específicamente enlazan ß-Klotho o ß-Klotho y una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 que se describen en la presente con otras proteínas o polipéptidos , tal como por expresión de las proteínas de fusión recombinantes que comprenden polipéptidos heterólogos fusionados a la terminal N o término C de una proteína enlazada al antígeno que induce señalización tipo FGF21. Por ejemplo, el péptido conjugado puede ser un polipéptido de señal heteróloga (o líder), por ejemplo, la levadura alfa-factor líder, o un péptido tal como una etiqueta epítopo. Una proteína de fusión que contiene proteína enlazada al antígeno de la presente descripción puede comprender péptidos agregados para facilitar la purificación o identificación de una proteína enlazada al antígeno o proteína enlazada al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que específicamente enlazan ß-Klotho o ß- lotho y una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 (por ejemplo, poli -His) . Una proteína enlazada al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que específicamente enlaza ß-Klotho o ß-Klotho y una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 también puede ligarse al péptido FLAG como se describe en Hopp et ah, 1988, Bio/Technology 6: 1204; y la Patente de los Estados Unidos No. 5,01 1,912. El péptido FLAG es altamente antigénico y proporciona un epítopo reversiblemente enlazado por un anticuerpo monoclonal especifico (mAb) , permitiendo el ensayo rápido y la purificación fácil de proteína recombinante expresada. Los reactivos útiles para preparar las proteínas de fusión en las que el péptido FLAG se fusiona a un polipéptido · dado están comercialmente disponibles (Sigma, St . Louis, MO) .

Los multímeros que comprenden una o más proteínas enlazadas al antígeno o componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que específicamente enlazan ß-Klotho o ß-Klotho y una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 forman otro aspecto de la presente descripción. Los multímeros pueden tomar la forma de dímeros, trímeros, o multímeros más altos covalentemente ligados o no covalentemente ligados. Los multímeros que comprenden dos o más proteínas enlazadas al antígeno o componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que enlazan ß-Klotho o ß-Klotho y una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 y que inducen la señalización tipo FGF21 se contemplan para su uso como terapéuticos, diagnósticos y otros usos también, con un ejemplo de tal multímero siendo un homodímero. Otros multímeros de ej emplificación incluyen heterodímeros , homotrímeros, heterotrímeros, homotetrámeros, heterotetrámeros , etc.

Una modalidad se dirige a multímeros que comprenden múltiples proteínas enlazadas al antígeno o componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que específicamente enlazan ß-Klotho o ß-Klotho y una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 que se unen por medio de interacciones covalentes o no-covalentes entre radicales de péptido fusionados a una proteína enlazada al antígeno o componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que específicamente enlaza ß- lotho o ß-Klotho y una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. Tales péptidos pueden ser ligaduras péptido (espaciadores) , o péptidos que tiene la propiedad de promover la multimerización. Las cremalleras de leucina y ciertos polipéptidos derivados de anticuerpos están entre los péptidos que pueden promocionar la multimerización de proteínas enlazadas al antígeno adjuntas al mismo, como se describe en mayor detalle en la presente.

En modalidades particulares, los multímeros comprenden e dos a cuatro proteínas enlazadas al antígeno o componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que enlazan ß-Klotho o ß-Klotho y una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. Los radicales de proteína enlazada al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno del multimero pueden estar en cualquiera de las formas descritas anteriormente, por ejemplo, variantes o fragmentos. Preferiblemente, los. multímeros comprenden proteínas enlazadas al antígeno o componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que tienen la habilidad para específicamente enlazar ß-Klotho o ß-Klotho y üna o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4.

En una modalidad, un oligómero se prepara usando polipéptidos derivados de immunoglobulinas . La preparación de las proteínas de fusión que comprenden ciertos polipéptidos heterólogos fusionados a varias porciones de polipéptidos derivados de anticuerpo (incluyendo el dominio Fe) se ha descrito, por ejemplo, por Ashkenazi et al, (1991) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 88: 10535; Byrn et al, (1990) Nature 344:677; and Hollenbaugh et al, 1992 "Construcción de Immunoglobulin Fusión ' Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl . 4, páginas 10.19.1-10.19.11. Una modalidad se dirige a un dímero que comprende dos de las proteínas de fusión creadas fusionando una proteína enlazada al antígeno o componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que específicamente enlaza ß-Klotho o ß-Klotho y una o más de- FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 a la región Fe de un anticuerpo. El dímero puede estar hecho por, por ejemplo, insertando una fusión de gen que codifica la proteína de fusión' en un vector apropiado de expresión, expresando la fusión de gen en las s hospederas transformadas con el vector recombinante de expresión, y permitiendo a la proteína de fusión expresada ensamblar como moléculas de anticuerpo, después de lo cual los enlaces de disulfuro- de intercadena se forman entre los radicales Fe para producir el dímero.

El término "polipéptido Fe" como se usa en la presente incluye formas nativa y muteina de polipéptidos derivados de la región Fe de un anticuerpo. Las formas truncadas de tales polipéptidos que contienen la región eje que promueve la dimerización también se incluyen. Las proteínas de fusión que comprenden radicales Fe (y oligómeros formados de los mismos) ofrecen la ventaja de purificación fácil por cromatografía de afinidad sobre columnas de Proteína A o Proteína G.

Un polipéptido Fe idóneo, descrito en la solicitud PCT WO 93/10151 y las Patentes de los Estados Unidos. No. 5,426,048 y No. 5,262,522, es un polipéptido de cadena sencilla extendiéndose de la región del eje terminal N al término C nativo de la región Fq de un anticuerpo IgGl humano. Otro polipéptido Fe útil es la muteina Fe descrita en la Patente de los Estados Unidos No. 5,457,035, y en Baum et al, (1994) EMBO J. 13 : 3992-4001.. La secuencia de aminoácidos de esta muteína es idéntica a la de la secuencia Fe nativa presentada en WO .93/10151, excepto que el aminoácido 19 ha sido cambiado de Leu a Ala, el aminoácido 20 ha sido cambiado de Leu a Glu, y el aminoácido 22 ha sido cambiado de Gly a Ala. La muteina exhibe actividad reducida para los receptores Fe.

En otras modalidades, la porción variable de las cadenas pesadas y/o ligeras de una proteina enlazada al antigeno o componentes de proteina enlazada al antigeno de fusión FGF21 de proteina enlazada al antigeno, tal como se describen eñ la presente, pueden sustituirse por la porción variable de una cadena pesada y/o ligera de anticuerpo.

Alternativamente, el oligómero puede ser una proteina de fusión que comprende múltiples proteínas enlazadas al antígeno o componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que específicamente enlazan ß-Klotho' o ß-Klotho y una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 , con o sin ligaduras de péptido (péptidos espaciadores). Entre las ligaduras de péptido idóneas están aquellas descritas en las Patentes de los Estados Unidos No. 4,751,180 y No. 4,935,233.

Otro método para, preparar derivados oligoméricos que comprenden las proteínas enlazadas al antígeno o componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que específicamente enlazan ß-Klotho o ß-Klotho y una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 implica el uso de una cremallera de leucina. Los dominios de cremallera de leucina son péptidos que promueven la oligomerización de las- proteínas en las que se encuentran. Las cremalleras de leucina se identificaron originalmente en muchas proteínas de enlace a ADN (Landschulz et al, (1988) Science 240: 1759) . Y desde entonces se han encontrado en una variedad de proteínas diferentes. Entre las cremalleras de leucina conocidas se encuentran los péptidos que ocurren de manera natural y derivados de los mismos que dimerizan o trimerizan. Los ejemplos de dominios de cremallera de leucina idóneos para producir proteínas solubles oligoméricas se describen en la solicitud PCT WO 94/10308, y la cremallera de leucina derivada de la proteína D de surfactante de pulmón (SPD) descrita en. Hoppe et al, (1994) FEBS Letters 344: 191, en la presente incorporada como referencia. El uso de una cremallera de leucina modificada que permite la trimerización estable de una proteína heteróloga fusionada a la misma se describe en Fanslow et al, (1994) Semin. Immunol. 6:267-278. En un enfoque, las proteínas de fusión que comprenden una proteína enlazada al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno derivadas de fragmento o derivada que específicamente enlazan ß-Klotho o ß-Klotho y una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 se fusiona a un péptido de cremallera de leucina que se expresa en células hospederas idóneas, y los fragmentos de la proteína enlazada al antígeno oligoméricos solubles o los derivados que forman se recuperan del sobrenadante del cultivo.

En ciertas modalidades, la proteína enlazada al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno tiene una KD (afinidad de enlace de equilibrio) de menos que 1 pM, 10 pM, 100 pM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 n , 25 nM o 50 nM.

Otro aspecto proporciona una proteína enlazada al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno (o porción de la misma) que tiene una vida media de al menos un día in vitro o in vivo (por ejemplo, cuando se administra a un sujeto humano) . En una modalidad, la proteína enlazada al antígeno o componente ' de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno tiene una vida media de al menos tres días. En otra modalidad, la proteína enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno (o porción de la misma) tiene una vida media de cuatro días o más larga. En otra modalidad, la proteína enlazada al antigeno o componente de proteina enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno (o porción de la misma) tiene una vida media de ocho días o más larga. En otra modalidad, la proteína enlazada al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno (o porción de la misma) se deriva o modifica de manera que tenga una vida media más larga que la comparada a la de la proteína enlazada al antígeno no derivada o no modificada. En otra modalidad, una proteína enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que específicamente enlaza ß- lotho o ß-Klotho y una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 contiene mutaciones de punto que incrementan la vida media del suero, tal como se describe en O 00/09560, publicada Feb. 24, 2000, incorporada como referencia.

Glieosilación Una proteína enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que específicamente enlaza ß-Klotho o ß-Klotho y una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 puede tener un patrón de glicosilacion que sea diferente o alterado de la que se encontró en la especie nativa. Como se conoce en la técnica, los patrones de glicosilación pueden depender tanto de la secuencia de la proteina (por ejemplo, la presencia o ausencia de residuos de aminoácidos de glicosilación particular, discutida a continuación) , como de la célula hospedera u organismo en el que la proteina se produce. Los sistemas de expresión particular se discuten a continuación .

La glicosilación de polipéptidos es típicamente ya sea N-ligada u O-ligada. N-ligada se refiere al adjunto del resto de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tri-péptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para el adjunto enzimático del resto del carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. De esta manera, la presencia de ya sea de estas secuencias de tri-péptido secuencias en un polipéptido crean un sitio .de glicosilación potencial. La glicosilación O-ligada se refiere al adjunto de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa, a un ácido hidroxiamino, mayormente común serina o treonina, aunque 5- hidroxiprolina o 5-hidroxilisina también pueden usarse.

La adición de sitios de glicosilación a la proteína enlazada al antígeno se logra covalentemente alterando la secuencia de aminoácidos de manera que contenga una o más de las secuencias tri-péptido arriba descritas (para sitios de glicosilación N-ligada) . La alteración también puede hacerse por medio de la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina residuos a la secuencia de partida (para sitios de glicosilación O-ligada) . Para facilidad, la secuencia de aminoácidos de la proteina enlazada al antigeno o componente de proteina enlazada al antigeno de fusión FGF21 de proteina enlazada al antigeno puede alterarse a través de cambios en el nivel de ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el polipéptido objetivo en bases preseleccionadas de manera que los codones se generan para que se traduzcan en los aminoácidos deseados.

Otro medio para incrementar el número de radicales de carbohidratos en la proteina enlazada al antigeno es por acoplamiento químico o enzimático de glicósidos a la proteína. Estos procedimientos son ventajosos en que no requieren de la producción de proteína en una célula hospedera que tiene capacidades de glicosilación para glicosilación N- y O-ligada. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, el azúcar (es) puede adjuntarse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidril libres tal como aquellos de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tal como aquellos de serina, treonina, o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tal como aquellos de fenilalanina, tirosina, o triptofan, o (f) el grupo amida de glutamina. Estos métodos se describen en WO 87/05330 y en Aplin and Wriston, (1981) CRC Crit . Rev. Biochem. , pp. 259-306.

La remoción de los radicales de carbohidratos presentes en la proteina enlazada al antigeno o componente de proteina enlazada al antigeno de fusión FGF21 de proteina enlazada al antigeno de partida puede lograrse químicamente o enzimáticamente . La deglicosilación química requiere la exposición de la proteína al compuesto del ácido trifluorometanesulfonico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento resulta en la escisión de la mayoría de todos los azúcares excepto el azúcar de ligadura (N- acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina) , mientras deja al polipéptido intacto. La deglicosilación química es descrita por Hakimuddin et al, (1987) Arch. Biochem. Biophys . 259:52 and by Edge et al, (1981) Anal. Biochem. 1 18: 131. La escisión enzimática de radicales de carbohidratos en polipéptidos puede lograrse por medio del uso de una variedad de endo- y exo-glicosidasas como lo describe Thotakura et al, (1987) Meth. Enzymol. 138:350. La glicosilación en sitios de glicosilación potenciales puede prevenirse por medio del uso del compuesto tunicamicina como lo describe Duskin et al, (1982) J. Biol . Chem. 257:3105. La tunicamicina bloquea la fromación de ligaduras proteina-N-glicosida .

Por lo tanto, aspectos de la presente descripción incluyen variantes de glicosilación de proteínas enlazadas al antígeno NS fusión FGF21 proteína enlazada al antígeno de componentes de proteína enlazada al antígeno que específicamente enlazan ß-Klotho o ß-Klotho y una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 en donde el número y/o tipo de sitio (s) de glicosilación ha sido alterado comparado a las secuencias de aminoácidos del polipéptido precursor. En ciertas modalidades, las variantes de proteína enlazada al antígeno y fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno de componente de proteína enlazada al antígeno comprenden un mayor o menor número de sitios de glicosilación N-ligada que la secuencia nativa. Un sitio de glicosilación N-ligada se caracteriza por la secuencia: Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en donde el residuo de aminoácido designando como X puede ser cualquier residuo de aminoácido excepto prolina. La sustitución de residuos de aminoácido para crear esta secuencia proporciona u nuevo sitio potencial para la adición de una cadena de carbohidratos N-ligada. Alternativamente, las sustituciones que eliminan o alteran esta secuencia evitarán la adición de una cadena de carbohidratos N-ligada -presente en el polipéptido nativo. Por ejemplo, la glicosilación puede reducirse por la eliminación de un Asn o sustituyendo el Asn con un aminoácido diferente. En otras modalidades, uno o más sitios nuevos de N-ligada se crean. Los anticuerpos típicamente tienen un sitio de glicosilación N-ligada glicosilación en la región Fe.

Etiquetas y grupos efectores En algunas modalidades, una proteína enlazada al antígeno que específicamente enlaza ß-Klotho o ß-Klotho y una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 comprenden una o más etiquetas. El término "grupo de etiquetado" o "etiqueta" se refiere a cualquier etiqueta detectable. Los ejemplos de grupos de etiquetado idóneo incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 1N, 35S, 90Y, "Te, ^In, 12 I, 131I), grupos fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos lantánidos) , grupos enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, ß- galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina) , grupos quimioluminicentes, grupos biotinil, o epítopos de polipéptido determinados reconocidos por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias pare de cremallera de leucina, sitios de enlace para anticuerpos secundarios, dominios de enlace al metal, etiquetas epítopo) . En algunas modalidades, grupo de etiquetado se acopla a la proteína enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno por medio de unos brazos espaciadores de varias longitudes para reducir obstáculos estéricos potenciales. Se conocen varios métodos en la técnica para etiquetar proteínas y pueden usarse como se vea que ajustan.

El término "grupo efector" se refiere a cualquier grupo acoplado a una proteína enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que específicamente enlaza ß-Klotho o ß-Klotho y una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 que actúa como un agente citotóxico. Los ejemplos para grupos efectores idóneos son radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, ^In, 125I, 131I). Otros grupos idóneos incluyen toxinas, grupos terapéuticos, o grupos quimioterapéuticos . Los ejemplos de grupos idóneos incluyen caliqueamicina, auristatinas, geldanamicina y cantansina. En algunas modalidades, el grupo efector se acopla a la proteína enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno por medio de brazos espaciadores de varias longitudes para reducir obstáculos estéricos potenciales. En general, las etiquetas recaen en una variedad de clases, dependiendo del ensayo en el que se van a detectar: (a) etiquetas isotópicas, que pueden ser isótopos radioactivos o pesados;' (b) etiquetas magnéticas (por ejemplo, partículas magnéticas) ; (c) radicales activos redox; (d) colorantes ópticos; grupos enzimáticos (por ejemplo eroxidasa de rábano picante, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina); (e) grupos biotinilados ; y (f) epítopos de polipéptidos determinados reconocidos por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias de par de cremallera de leucina, sitios de enlace para anticuerpos secundarios, dominios de enlace al metal, etiquetas de epítopo, etc.). En algunas modalidades, el grupo de etiquetado se acopla a la proteína enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno por medio de brazos espaciadores de varias longitudes para reducir obstáculos estéricos potenciales. Se conocen varios métodos en la técnica para etiquetar proteínas.

Las etiquetas específicas incluyen colorantes ópticos, incluyendo, pero no limitado a, cromóforas, fósforos y fluoróforos, con los últimos siendo específicos en muchos ejemplos. Los fluoróforos pueden ser ya sea fluoros de "molécula pequeña", o fluoros proteínicos.

Por "etiqueta fluorescente" se refiere a cualquier molécula que pueda detectarse por medio de sus propiedades de fluorescencia inertes. Las etiquetas fluorescentes idóneas incluyen, pero no se limitan a, fluoresceina, rodamina, tetrametilrodamina , eosina, eritrosina, cumarina, metil-cumarinas, pireno, verde de Malacita, estilbeno, amarillo Lucifer Yellow, azul Cascade, rojo Texas, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, rojo LC 640, Cy 5, Cy 5.5, rojo LC 705, verde Oregon, los colorantes de Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), azul Cascade, amarillo Cascade y R-ficoeritrina (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR) , FITC, Rodamina, y Texas Red (Pierce, Rockford, IL) , Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amer.sham Life Science, Pittsburgh, PA) . Los colorantes ópticos idóneos, incluyendo fluoróforos, se describen en MOLECULAR PROBES HANDBOOK por Richard P. Haugland, en la presente expresamente incorporados como referencia.

Las etiquetas fluorescentes proteinicas idóneas también incluyen, pero no se limitan a, proteina fluorescente verde, incluyendo una Renilla, Ptilosarcus, o especie Aequorea de GFP (Chalfie et ah, (1994) Science 263:802-805). EGFP (Clontech Labs., Inc., número de acceso al Genbank U55762) , proteina fluorescente azul (BFP, Quantum Biotechnologies , Inc., Quebec, Canadá; Stauber, (1998) Biotechniques 24:462-471; Heim et al, (1996) Curr. Biol. 6: 178-182), proteina fluorescente amarilla potenciada (EYFP, Clontech Labs., Inc.), luciferasa (Ichiki et al, (1993) J. Immunol . 150:5408-5417), ß-galactosidasa . (Nolan et al, (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 85:2603-2607) y Renilla ( 092/15673, WO95/07463, O98/14605, W098/26277, WO99/49019, Patentes de E.U.A. No. 5292658, No. 5418155, No. 5683888, No. 5741668, No. 5777079, No. 5804387, No. 5874304, No. 5876995, No. 5925558) .

Preparación de proteínas enlazadas al antígeno o componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antigeno Los anticuerpos no humanos que se proporcionan pueden ser, por ejemplo, derivados de cualquier animal que produce anticuerpos, tal como ratón, rata, conejo, cabra, burro, o primate no humano (tal como mono (por ejemplo, mono cynomolgus o rhesus) o simio (por ejemplo, chimpancé)). Los anticuerpos no humanos pueden usarse, por ejemplo, en cultivo celular in vitro y aplicaciones basadas en cultivo celular, o cualquier otra aplicación donde una respuesta inmune al anticuerpo no ocurre o es insignificante, puede prevenirse, no es una preocupación, o es deseada. En ciertas modalidades, los anticuerpos pueden producirse inmunizando con ß-Klotho de longitud completa (Ejemplo 1), con el dominio extracelular de ß-Klotho (Ejemplo 2), con células completas que expresan ß-Klotho, con membranas preparadas de células que expresan ß-Klotho (Ejemplo 1), con proteínas de fusión, por ejemplo, fusiones Fe que comprenden ß-Klotho (o dominios extracelulares de las mismas) fusionadas a Fe, u otros métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en los ejemplos presentados en la presente. Alternativamente, anticuerpos no humanos pueden elevarse inmunizando con aminoácidos que son segmentos de ß-Klotho que forman parte del epítopo al que enlazan ciertos anticuerpos proporcionados en la presente. Los anticuerpos pueden ser policlonales , monoclonales, o pueden sintetizarse en células hospederas expresando ADN recombinante .

Los anticuerpos completamente humanos pueden prepararse como se describe en la presente inmunizando los animales transgénicos que contienen lugares de inmunoglobulina humana o seleccionando una colección de exhibición de fago que expresa un repertorio de anticuerpos humanos.

Los anticuerpos monoclonales (mAbs) pueden producirse POR una variedad de técnicas, incluyendo metodología convencional de anticuerpo, monoclonal, por ejemplo, la técnica de hibridación de célula somática estándar de Kohler and Milstein, (1975) Nature 256:495. Alternativamente, otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales pueden emplearse, por ejemplo, la transformación viral u oncogénica de B-linfocitos . Un sistema animal idóneo para preparar hibridomas es el sistema murino, que es un procedimiento bien establecido. Los protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para fusión son conocidos en la técnica. Para tales procedimientos, las células B de ratones inmunizados se fusionan con una pareja idónea de fusión inmortalizada adecuada, tal como una linea celular de mieloma murino. Si se desea, además de las ratas u otros mamíferos pueden inmunizarse en lugar de los ratones y las células B de tales animales pueden fusionarse con la línea celular el mieloma marino para formar hibridomas. Alternativamente, puede usarse una línea celular mieloma otra que no sea de un ratón. Los procedimientos de fusión para hacer hibridomas también son bien conocidos. La tecnología SLAM también puede emplearse en la producción de anticuerpos.

Los anticuerpos de cadena sencilla que se proporcionan pueden formarse ligando dominios variables de cadena pesada y ligera (región Fv) fragmentos por medio de un puente e aminoácidos (ligadura de péptido corto), resultando en una cadena de polipéptido sencilla. Tales Fvs de cadena sencilla (scFvs) pueden prepararse fusionando el ADN que codifica una ligadura de péptido entre ADNs que codifican los dos polipéptidos de dominio variable (VL y VH) . Los polipéptidos resultantes pueden plegarse- sobre si mismos para formar monómeros enlazados al antígeno, o que pueden formar multímeros (por ejemplo, dímeros, trímeros, o tetrámeros) , dependiendo de la longitud de una ligadura flexible entre los dos dominios variable.s (Kortt et al, (1997) Prot . Eng. 10:423; Kortt et al, (2001) Biomol. Eng. 18:95-108). Combinando diferentes polipéptidos que comprenden VL y Vn, uno puede formar . scFvs multiméricas que se enlazan a diferentes epítopos (Kriangkum et' al, (2001) Biomol. Eng. 18:31-40). Las técnicas desarrolladas para la producción de anticuerpos de cadena ligera incluyen aquellos escritos en la Pat. de E.U.A. No. 4,946,778; Bird, (1988) Science 242:423; Huston et al, (1988) Proc. Nati. Acad. Sci . E.U.A. 85:5879; ard et al, (1989) Nature 334:544, de Graaf et al, (2002) Methods Mol Biol. 178:379-387. Los anticuerpos de cadena sencilla derivados de anticuerpos proporcionados en la presente incluyen, pero no se limitan a scFvs que comprenden las combinaciones de dominio variable de las- regiones variables de las cadenas pesada y ligera representadas en las Tablas 2A-2D, o combinaciones de dominios variables de cadenas pesada y ligera que incluyen CDRs representadas en las Tablas 3 y 6.

Los anticuerpos proporcionados en la presente que son de una subclase pueden cambiarse a anticuerpos de diferentes subclases usando métodos de conmutación de subclase. De esta manera, los anticuerpos IgG pueden derivarse de un anticuerpo IgM, por ejemplo, y vice versa. Dichas técnicas permiten la preparación de nuevos anticuerpos que poseen las propiedades de enlace al antigeno de un anticuerpo dado (el anticuerpo precursor) , pero también exhiben las propiedades biológicas asociadas con un isotipo' o subclase de anticuerpo diferente de la del anticuerpo precursor. Las técnicas de ADN recombinantes pueden emplearse. El ADN clonado que codifica polipéptidos de anticuerpo particular puede emplearse en tales procedimientos, por ejemplo, ADN que codifica el dominio constante de un anticuerpo del isotipo deseado. Ver, por ejemplo, Lantto et al, (2002) Methods Mol. Biol. 178:303-316.

En consecuencia, los anticuerpos que se proporcionan incluyen aquellos que comprenden, por ejemplo, las combinaciones de dominio variable descritas, supra, que tienen un isotipo deseado (por ejemplo, IgA, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, y IgD) asi como fragmentos Fab o F(ab')2 del mismo. Además, si se desea un IgG4, también puede desearse introducir una mutación punto (CPSCP->CPPCP (SEQ ID NOS 266-267, respectivamente) en la .región eje como se describe en Bloom et ah, (1997). Protein Science 6:407, incorporado como referencia en la presente) para aliviar la tendencia a formar enlaces de disulfuro de cadena intra-H que pueden llevar a heterogeneidad en los anticuerpos IgG4.

Además, las técnicas para los anticuerpos derivados que tienen diferentes propiedades (esto es, afinidades variantes para el antigeno al que enlazan) también se conocen. Una tal técnica referida como arrastre de cadena, implica mostrar los repertorios de gen de dominio variable de inmunoglobulina en la superficie bacteriófaga filamentosa, frecuentemente referida como muestra de fagos. El arrastre de cadena ha sido usado para preparar anticuerpos de afinidad alta al hapteno 2-feniloxazol-5-ona, como' es descrito por Marks et ah, (1992) BioTechnology 10:779.

Pueden hacerse métodos de conservación para las regiones variables de cadenas pesada y ligera descritas en la Tabla 2, o las CDRs descritas en la Tabla 3 (y modificaciones correspondientes a las que modifican los ácidos, nucleicos) para producir una proteíña enlazada al antigeno que tiene características funcionales y bioquímicas. Los métodos para lograr tales modificaciones se describieron anteriormente.

Las proteínas enlazadas al antígeno o componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno que específicamente enlazan ß-Klotho o ß-Klotho y una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 pueden además modificarse de varias maneras. Por ejemplo, si se van a usar para propósitos terapéuticos, pueden conjugarse con glicol polietileno (PEGilado) para prolongar la vida media el suero o para mejorar la entrega de la proteina. Alternativamente, la región V de los anticuerpos sujeto o fragmentos de los mismos pueden fusionarse con la región Fe o una molécula de anticuerpo diferente. La región Fe usada para este propósito puede modificarse de manera que no enlace completamente, de esta manera reduciendo la probabilidad de inducir la lisis celular en el paciente cuando la proteina de fusión se usa como agente terapéutico. Además, las proteínas enlazadas al antígeno o componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno sujeto o fragmentos funcionales- de los mismos pueden conjugarse con albúmina de suero humano para mejorar la vida media del suero del anticuerpo o fragmento del mismo. Otra pareja de fusión útil para las proteínas enlazada al antígeno o componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno o fragmentos de los mismos es transtiretina (TTR) . TTR tiene la capacidad para formar un tetrámero, de esta manera una proteína de fusión de anticuerpo-TTR puede formar un anticuerpo multivalente que puede disminuir su avidez de enlace.

Alternativamente, pueden lograrse modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o bioquímicas de las proteínas enlazadas al antígeno de componentes de proteina enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno descritas en la presente creando sustituciones en la secuencia de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras que difieren significativamente en su efecto al mantener (a) la estructura de la columna vertebral molecular en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o en hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Una "sustitución de aminoácido conservadora" puede implicar una sustitución de un residuo de aminoácido nativo con un residuo no nativo que tiene poco o no tiene efecto en la polaridad o carga del residuo de aminoácido en esa posición. Ver, Tabla 7, presentada en la presente. Además, cualquier residuo nativo en el polipéptido también puede sustituirse con alanina, como se ha descrito previamente para mutagénesis de barrido de alanina .

Las sustituciones de aminoácidos (ya sean conservadores o no conservadores) de las proteína enlazadas al antígeno objetivo y de los componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno, pueden implementarse por medio de aquellos expertos en la técnica aplicando técnicas de rutina. Las sustituciones de aminoácidos pueden usarse para identificar residuos importantes de las proteínas enlazadas al antígeno proporcionadas en la presente, o para incrementar o disminuir la afinidad de estas proteínas enlazadas al antígeno para ß-Klotho o ß-Klotho y una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 o para modificar la afinidad de enlace de otras proteínas enlazadas al antígeno de componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno descritas en la presente.

Métodos para expresar proteínas enlazadas al antígeno o componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antigeno Los sistemas y cohstructos de expresión en la forma de plásmidos, vectores de expresiones, transcripción o casetes de expresión que comprenden al menos un polinucleótido como se escribe arriba también se proporcionan en la presente, así como las células hospederas que comprenden tales constructos o sistemas de expresión.

Las proteínas enlazadas al antígeno de componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de proteína enlazada al antígeno proporcionadas en la presente pueden prepararse por cualquiera de un número de técnicas convencionales. Por ejemplo, las proteínas enlazadas al antígeno de componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21 de . proteína enlazada al antígeno que específicamente enlazan ß-Klotho o ß-Klotho y una o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 pueden producirse por sistemas de expresión recombinante , usando cualquier método conocido en la técnica. Ver, por ejemplo, onoclonal Antibodies, Hybridoms : A New Dimensión in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.) Plenum Press, New York (1980); and Anticuerpos: A Laboratory Manual, Harlow and Lañe (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988) .

Las proteínas enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno pueden expresarse en líneas de célula de hibridoma (por ejemplo, en particular los anticuerpos pueden expresarse en hibridomas) o en líneas celulares diferentes a los hibridomas. Los constructos de expresión que codifican las proteínas enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno pueden usarse para transformar una célula hospedera de mamífero, insecto o microbiana. La transformación puede realizarse usando cualquier método conocido para introducir polinucleó idos en una célula hospedera, incluyendo, por ejemplo empacar el polinucleótido en un virus o bacteriófago y transducir una célula hospedera con el constructo por procedimientos de transfección conocidos en la técnica, como se ejemplifica por Patente de los Estados Unidos de América No. 4,399,216; No. 4,912,040; No. 4,740,461; No. 4,959,455. El procedimiento de transformación óptimo usado dependerá de que tipo de célula hospedera se transforma. Los métodos para introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, transfección mediada por dextrano, precipitación de fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos , electroporación, encapsulación de los polinucleótidos en liposomas, mezclado de ácido nucleico con lípidos cargados positivamente, y microinyección directa del ADN en el núcleo.

Los constructos de expresión recombinantes típicamente comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende uno o más de los siguientes: uno o más CDRs proporcionados en la presente; una región constante de cadena ligera; una región variable de cadena ligera; una región constante de cadena pesada (por ejemplo, CH1, CH2 y/o CH3) ; y/o otra porción de andamiaje de una proteína enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno. Estas secuencias de ácido nucleico se insertan en un vector de expresión apropiado usando técnicas de ligado estándar. En una modalidad, la región constante de cadena pesada o ligera se adjunta a la terminal C de una proteina enlazada al antígeno o componente de proteina enlazada al antigeno de fusión FGF21-proteina enlazada al antigeno que específicamente enlaza a ß-Klotho o ß-Klotho y una o más de las regiones variables ' de cadena pesada o ligera específicas de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 y se . liga en un vector de expresión. El vector se selecciona típicamente para ser functional en la célula hospedera particular empleada (esto es, el vector es compatible con la maquinaria de la célula hospedera, lo que permite que ocurra la amplificación y/o expresión del gen) . En algunas modalidades, se usan vectores que emplean ensayos de complemento proteína-fragmento que usan reporteros de proteína, tal como dihidro folato reductasa (ver, por ejemplo, Pat. E.U.A. No. 6,270,964, que se incorpora en la presente para referencia) . Los vectores de expresión apropiados pueden adquirirse, por ejemplo, de Invitrogen Life Technologies o BD Biosciences (anteriormente "Clontech"). Otros vectoers útiles para clonación y expresión de los anticuerpos y fragmentos incluyen aquellos descritos en Bianchi and cGrew, (2003) Biotech. Biotechnol. Bioeng. 84:439-44, que se incorpora en la presente para referencia. Los vectores de expresión apropiados adicionales se discuten, por ejemplo, en Methods · EnzymoL, vol. 185 (D. V. Goeddel, ed. ) , 1990, New York: Academic Press.

Típicamente, los vectores de expresión usados en cualquiera de las células hospederas contendrán secuencias para mantenimiento de plásmido y para clonación y expresión de secuencias de nucleótido exógenas. Tales secuencias, colectivamente referidas como "secuencias de flanqueo" en ciertas modalidades típicamente incluirán uno o más de las siguientes secuencias de nucleótido: un promotor, una o más secuencias potenciadoras, un origen de replicación, una secuencia de terminación transcripcional, una secuencia de intrón completa que contiene un sitio de empalme donador y aceptor, una secuencia que codifica una secuencia líder para secreción de polipéptido, un- sitio enlazado a ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región de poliligadura para insertar el ácido nucleico que codifica el polipéptido a expresarse, y un elemento marcador seleccionadle . Cada una de estas secuencias se discute enseguida.

Opcionalmente, el vector puede contener una secuencia que codifica la "etiqueta",- esto es, una molécula de oligonucleótido localizada en el extremo 5' o 3' de una proteína enlazada al antígeno o secuencia que codifica el componente de proteína enlazada al antigeno de fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno; la secuencia de oligonucleótido codifica polyHis (tal como hexaHis (SEQ ID NO: 268)), u otra "etiqueta" tal como FLAG®, HA (virus de influenza de hemaglutinina ) , o myc, para el cual existen anticuerpos comercialmente disponibles. Esta etiqueta se fusiona típicamente al polipéptido durante la expresión del polipéptido, y puede servir como medios para purificación o detección por afinidad de la proteína enlazada al antígeno o componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno a partir de la célula hospedera. La purificación por afinidad puede realizarse, por ejemplo, por cromatografía de columna usando anticuerpos contra la etiqueta como una matriz de afinidad. Opcionalmente, la etiqueta puede removerse posteriormente de la proteína enlazada al antígeno purificada por varios medios tales como usando ciertas peptidasas para escisión.

Las secuencias de flanqueo pueden ser homologas (esto es, de la misma especie y/o cepa como la célula hospedera) , heteróloga (esto es, de una especie diferente a la especies o cepa de la célula hospedera) , híbrida (esto es, una combinación de secuencias de flanqueo de más de una fuente), sintética o nativa. Como tal, la fuente de una secuencia de flanqueo puede ser cualquier organismo procariótico o eucariótico, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, con 'la condición de que la secuencia de flanqueo sea funcional en, y pueda activarse por, la maquinaria de la célula hospedera.

Las secuencias de flanqueo útiles en los vectores pueden obtenerse por varios métodos bien conocidos en la técnica. Típicamente, las secuencias de flanqueo útiles en la presente se identificarán previamente por mapeo y/o por digestión de endonucleasa de restricción y pueden de esta manera aislarse de la fuente de tejido apropiada usando las endonucleasas de restricción apropiadas. En algunos casos, la secuencia de nucleótido completa de una secuencia de flanqueo puede conocerse. Aquí, la secuencia de flanqueo puede sintetizarse usando los métodos descritos en la presente para síntesis o clonación de ácido nucleico.

Si se conoce todo o sólo una porción de la secuencia de flanqueo, puede obtenerse usando reacción de cadena de polimerasa (PCR) y/o al seleccionar una colección genómica con una sonda apropiada tal como un oligonucleótido y/o fragmento de secuencia de flanqueo de la misma u otra especie. Donde no se conoce la secuencia de flanqueo, un fragmento de ADN que contiene la secuencia de flanqueo puede aislarse de una pieza más grande de ADN que puee contener, por ejemplo, una secuencia de codificación o aún otro gen o genes. El aislado puede realizarse por digestión de endonucleasa de restricción para producir el fragmento de ADN apropiado seguido por el aislado usando purificación en gel de agarosa, cromatografía de columna Qiagen® (Chatsworth, CA) , u otros métodos conocidos para el técnico experto. La selección de enzimas apropiadas para realizar este propósito será fácilmente aparente para alguien de experiencia ordinaria en la técnica.

Un origen de replicación es típicamente una parte de aquellos vectores de. expresión procarióticos adquiridos comercialmente, y el origen ayuda en la amplificación del vector en la célula hospedera. Si el vector de elección no contiene un sitio de origen de replicación, puede sintetizarse químicamente con base en una secuencia conocida, y ligarse en el vector. Por ejemplo, el origen de replicación del plásmido pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) es apropiado para la mayoría de las bacterias gram-negativas , y varios orígenes virales (por. ejemplo, SV40, polioma, adenovirus, virus de estomatitus vesicular (VSV) , o virus de papiloma tal como VPH o VPB) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. Generalmente, el componente de origen de replicación no es necesario para vectores de expresión mamíferos (por ejemplo, el origen SV40 a menudo se usa sólo debido a que también contiene el promotor temprano del virus ) .

Una secuencia de terminación de transcripción se localiza típicamente 3' al extremo de una región que codifica el polipéptido y sirve para terminar la transcripción. Usualmente, la secuencia . de terminación de transcripción en las células procarióticas es un fragmento rico en G-C seguido por una secuencia poly-T. Aunque la secuencia se clona fácilmente de una colección o aún se adquiere comercialmente como parte de un vector, también puede sintetizarse fácilmente usando métodos para síntesis de ácido nucleico tal como aquellos descritos en la presente.

Un gen marcador seleccionable codifica una proteína necesaria para la supervivencia y crecimiento de una célula hospedera en un medio de cultivo selectivo. Los genes marcadores de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, tétraciclina, o canamicina para células hospederas procarióticas; (b) deficiencias auxotróficas de complemento de la célula; o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles del complejo o medio definido. Los marcadores seleccionables específicos son el gen de resistencia a la canamificna, el gen de resistencia a la ampicilina, y el gen de resistencia a la tétraciclina. Ventajosamente, también puede usarse gen de resistencia a la neomicina para seledcción en células hospederas tanto procarióticas como eucarióticas .

Otros genes seleccionables pueden usarse para amplificar el gen que se expresará. La. amplificación es el proceso en donde los genes que se requieren para la producción de un proteina critica para el crecimiento o supervivencia de la célula se reiteran en conjunto ' con los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes . Los ejemplos de marcadores seleccionables apropiados para células de mamífero incluyen dihidrofolato reductasa (DHFR) y genes de timidina cinasa promotores. Se colocan los transformantes de célula de mamífero bajo presión de selección en donde sólo los transformantes se adaptan únicamente para sobrevivir en virtud del gen seleccionable presente en el vector. Se impone la presión de selección al cultivar las células transaformantes bajo condiciones en las cuales la concentración del agente de selección en el medio se incrementa sucesivamente, por ello llevando a la amplificación tanto del gen seleccionable como el ADN que codifica otro gen, tal como una proteína enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno que específicamente enlaza a ß- lotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFFÜc, y FGFR4. Como un resultado, las cantidades incrementadas de un polipéptido tal como una proteína enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FG.F21-proteína enlazada al antígeno se sintetizan a partir del ADN amplificado.

Un sitio enlazado a ri osoma usualmente es necesario para iniciar la traducción del mARN y se caracteriza por la secuencia Shine-Dalgarno (procariótas ) o la secuencia Kozak (eucariotas) . El elemento se localiza típicamente 3' al promotor y 5' a la secuencia' de codificación del polipéptido a expresarse.

En algunos casos, tal como donde la glicosilación se desea en un sistema de expresión de célula hospedera eucariótica, se puede manipular las diversas pre- o prosecuencias para mejorar la glicosilación o rendimiento. Por ejemplo, se puede alterar el sitio de desdoblamiento de peptidasa de un péptido de señal particular, o agregar prosecuencias, que también afectan la glicosilación. El producto de proteína final puede tener, en la posición -1 (con relación al primer aminoácido de la proteína madura) , uno o más aminoácidos adicionales incidentes a la expresión, que pueden no removerse totalmente. Por ejemplo, el producto de proteína final puede tener uno o dos residuos de aminoácido encontrados en el sitio de desdoblamiento de peptidasa, enlazado a la temrinal amino. Alternativamente, el uso de algunos sitios de desdoblamiento de enzima puede resultar en una forma ligeramente truncada del polipéptido deseado, si la enzima se corta en tal área dentro del polipéptido maduro.

La expresión y clonación contendrán típicamente un promotor que se reconoce por el organismo hospedero y se liga operablemente a la molécula que codifica una proteína enlazada al antígeno o componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno que específicamente enlaza ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. Los promotores son secuencias no transcritas localizadas cadena arriba (esto es, 5') al codón de inicio de un gen estructural (generalmente dentro de alrededor de 100 hasta 1000 bp) que controlan la transcripción del gen estructural. Los promotores se agrupan convencionalmente en una de dos clases: promotores inducibles y promotores constitutivos. Los promotores inducibles inician incrementando los niveles de transcripción del ADN bajo su control en respuesta a' algunos cambios en las condiciones de cultivo, tal como la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. Los promotores constitutivos, por otro lado, transcriben uniformemente un gen al cual se ligan operablemente, esto es, con poco o nada de control sobre la expresión del gen. Un gran número de promotores, reconocidos por una variedad . de células hospederas potenciales, son bien conocidos. Un promotor apropiado se liga operablemente a la cadena pesada que codifica el ADN o cadena ligera que comprende una proteína enlazada al antígeno or componente de proteina enlazada al antigeno de fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno al remover el promotor del ADN fuente por digestión de enzima de restricción e insertado de la secuencia de promotor deseado en el vector.

Los promotores apropiados para uso con hospederos de levadura también son bien conocidos en la técnica. Se usan venta osamente potenciádores de levadura con promotores de levadura. Los promotores apropiados para uso con células hospederas de mamífero son bien conocidas e incluyen, pero no se limitan a, aquellos obtenidos de los genomas de virus tales como virus de polioma, virus de viruela aviar, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus de papiloma de bovino, virus de sarcoma de aves, citomegalovirus , retrovirus, virus de hepatitis B, y Virus 40 de Simio (SV40) . Otros promotores de mamífero apropiados incluyen promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, promotores de choque de calor y el promotor de actina.

Los promotores adicionales que pueden ser de interés incluyen, pero no se limitan a: promotor temprano SV40 (Benoist and Chambón, (1981) Nature 290:304-310): promotor C V (Thornsen et ah, (1984) Proc. Nati. Acad. U.S. A. 81:659-663) ; el promotor contenido en la repetición de terminal larga 3' del virus de sarcoma de Rous (Yamamoto et ah, (1980) Cell 22:787-797); promtor de timidina cinasa del herpes (Wagner et ah, (1981) Proc. Nati. Acad. Set U.S.A. 78: 1444-1445); secuencias promotora y reguladora del gen de metionina (Prinster et al, (1982) Nature 296:39-42); y promotores procarióticos tal como el promotor beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et al, (1978) Proc. Nati Acad. Sci. U.S. A. 75:3727-3731) ; o el promotor tac (DeBoer et al, (1983) Proc. Nati Acad. Sci. U.S. A. 80:21-25). También de interés son las siguientes regiones de control transcripcional animal, que exhiben especificidad de tejido y que se han utilizado en animales transgénicos : la región de control del gen I de elastasa que es activo en células acinares pancreáticas (Swift et al, (1984) Cell 38:639-646; Ornitz et al, (1986) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, (1987) Hepatology 7:425-515); la región de control del gen de insulina que es activo en células beta pancreáticas (Hanahan, (1985) Nature 315: 1 15-122); la región de control del gen de inmunoglobulina que es activo en células linfoides (Grosschedl et al, (1984) Cell 38:647-658; Adames et al, (1985) Nature 318:533-538; Alexander et al, (1987) Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444); la región de control del virus de tumor mamario de ratón que es activa en células testiculares , de mama, linfoides y mastocitos (Leder et al, (1986) Cell 45:485-495); la región de control del gen de albúmina que es activa en el hígado (Pinkert et al, (1987) Genes and Devel. 1 :268-276); la región de control del gen alfa-feto-proteína que es activa en el hígado (Krumlauf et al, (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammer et al, (1987) Science 253:53-58); la región de control de gen alfa 1-antitripsina que es activa en el hígado (Kelsey et al, (1987) Genes and Devel.1: 161-171); la región de control del gen beta-globina qu es activa en células mieloides (Mogram et al, (1985) Nature 315:338-340; Kollias et al, (1986) Cell 46:89- 94); la región de control del gen de proteína básica mielina que es activo en células oligodendrocito en. el cerebro (Readhead et al, (1987) Cell 48:703-712); la región de control del gen de cadena 2 ligera de miosina que es activa en el músculo esqueletal (Sani, (1985) Nature 314:283-286); y la región de control del gen que libera la. hormona gonadotrópica que es activa en el hipotálamo (Masón et al, (1986) Science 234: 1372-1378).

Puede insertarse una secuencia potenciado en el vector para incrementar la transcripción de la cadena ligera o cadena pesada que codifica el ADN que comprende una proteína enlazada al antígeno or componente de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno que específicamente enlaza' ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 por eucariotas superiores. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, usualmente de alrededor de 10-300 bp en longitud, que actúan en el promotor para incrementar la transcripción. Los potenciadores que tienen orientación y posición relativamente independiente, se han encontrado en las posiciones tanto 5' como 3' a la unidad de' transcripción. Se conocen varias secuencias potenciadores disponibles de genes de mamíferos (por ejemplo, globina, elastasa, albúmina, alfa-feto-proteína e insulina) . Típicamente, sin embargo, se usa un potenciador de un virus. El potenciador SV40, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus , el potenciador de polioma, y potenciadores de adenovirus conocidos en la técnica son elementos potenciadores ejemplares para la activación de promotores eucarióticos . Aunque puede colocarse un potenciador en el vector ya sea 5' o 3' a una secuencia de codificación, típicamente se localiza en un sitio 5' del promotor. Una secuencia que codifica una secuencia de señal heteróloga o nativa apropiada (secuencia líder o péptido de señal) puede incorporarse en un vector de expresión, para promover la secreción extracelular del anticuerpo. La elección del péptido de señal o líder depende del tipo de células hospederas en las cuales se produce el anticuerpo, y una secuencia de señal heteróloga puede reemplazar la secuencia de señal nativa. Los ejemplos de péptidos de señal que son funcionales en células hospederas de mamífero incluyen los siguientes: la secuencia de señal para interleucina 7 (IL.-7) descrita en Patente EUA No. 4,965,195; la secuencia de señal para receptor de interleucina 2 descrita en Cosman et al, (1984) Nature 312:768; el péptido de señal del receptor de interleucina 4 descrito en Patente EP No. 0367 566; el péptido de señal del receptor de interleucina 1 tipo I descrito en Patente E.U.A. No. 4,968,607; el péptido de señal del receptor de interleucina 1 tipo II descrito en Patente EP No. 0 460 846.

Los vectores de expresión que se proporcionan pueden construirse a partir de un vector de partida tal como un vector comercialmente disponible. Tales vectores pueden, pero no necesitan, contener todas las secuencias de flanqueo deseadas. Donde una o más secuencias de flanqueo descritas en la presente ya no están presentes en el vector, pueden obtenerse y ligarse individualmente en el vector. Los métodos usados para obtener cada una de las secuencias de flanqueo son bien conocidos para alguien experto en la técnica.

Después de que el .vector se ha construido y una molécula de ácido nucleico que codifica los componentes de cadena ligera, una cadena pesada, o una cadena ligera y una cadena pesada de una proteina enlazada al antigeno o componente de proteina enlazada al antigeno de fusión FGF21-proteina enlazada al antigeno que específicamente enlaza ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 se ha insertado en el sitio apropiado del vector, el vector completo pueden insertarse en una célula hospedera apropiada para amplificación y/o expresión de polipéptido. La transformación de un vector de expresión para una proteina enlazada al antigeno o componente de proteina enlazada al antigeno de fusión FGF21-proteina enlazada al antigeno en una célula hospedera seleccionada puede realizarse por métodos bien conocidos que. incluyen transíección, infección, co-precipitación en fosfato de calcio, electroporación, microinyección, lipofección, transíección mediada por DEAE-dextrano, u otras técnicas conocidas. El método seleccionado será en parte una función del tipo de célula hospedera a usarse. Estos métodos y otros métodos apropiados son bien conocidos para el técnico experto, y se establecen, por ejemplo, en Sambrook et al, (2001), supra.

Una célula hospedera, cuando se cultiva bajo condiciones apropiadas, sintetiza una proteina enlazada al antigeno o componente de proteina enlazada al antigeno de fusión FGF21-proteina enlazada al antigeno que puede posteriormente colectarse del medio de cultivo (si la célula hospedera se secreta en el medio) o directamente de la célula hospedera que la produce (si esta no se secreta) . La selección de una célula hospedera apropiada dependerá de varios factores, tal como niveles de expresión deseados, modificaciones de polipéptido que son deseables o necesarios para la actividad (tal como glicosiláción o fosforilación) y facilidad de plegado en una molécula biológicamente activa.

Las lineas celulares mamiferas disponibles como hospederos para expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, lineas de células inmortalizadas disponibles de la Colección de Tipo de Cultivo Americana (ATCC, por sus siglas en inglés) , que incluyen pero no se limitan a células de ovarios de hámster chino (CHO) , células HeLa, células de riñon de hámber bebe (BHK) , células de riñon de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular de humano (por ejemplo, Hep G2), y un número de otras lineas de células. En ciertas modalidades, las lineas de células pueden seleccionarse a través de determinar que lineas de células tienen altos niveles de expresión y constitutivamente producen proteínas enlazadas al antígeno y componentes de proteína enlazada al antígeno de fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno que se enlazan específicamente a ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4. En otra modalidad, puede seleccionarse una línea de célula de un linaje de célula B que no hace su propio anticuerpo pero que tiene una capacidad para hacer y secretar un anticuerpo heterólogo. La capacidad para inducir la señalización tipo FGF21 también puede formar un criterio de selección.

Usos de las Proteínas Enlazadas al Antígeno y Fusiones FGF21-Proteína Enlazada al Antígeno para Propósitos de Diagnóstico y Terapéutico Las proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno descritas aquí son útiles para detectar la presencia de ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 en muestras biológicas y la identificación de células o tejidos que producen ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. Por ejemplo, las proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno descritas en este documento pueden usarse en ensayos de diagnóstico, ensayos de enlace, por ejemplo, para detectar y/o cuantificar ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 expresado en un tejido o célula.- Las proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21.-proteína enlazada al antígeno que se unen específicamente a ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 se pueden utilizar en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la señalización tipo FGF21 en un paciente en necesidad del mismo, tales como la diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, NASH, enfermedad cardiovascular, y síndrome metabólico. Al formar un complejo de señalización que comprende una proteina enlazada al antigeno o fusiones FGF21-proteina enlazada al antigeno, ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4, la actividad natural in vivo de FGF21, que se asocia con FGFR tales como FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, FGFR4 y ß-Klotho in vivo para iniciar la señalización, pueden ser imitados y/o potenciados, dando lugar a efectos terapéuticos.

Indicaciones Una enfermedad o afección asociada con FGF21 humano incluye cualquier enfermedad o afección cuyo inicio en un paciente es causado por, al menos en parte, la inducción de señalización tipo FGF21, que se inicia in vivo por la formación de un complejo que comprende FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4, ß-Klotho y FGF21. La gravedad de la enfermedad o afección también puede ser reducida por la inducción de señalización tipo FGF21. Los ejemplos de enfermedades y afecciones que pueden ser tratadas con las proteínas enlazadas al antígeno incluyen diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, NASH, enfermedad cardiovascular, y síndrome metabólico.

Las proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno descritas aquí pueden usarse para tratar diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, NASH, enfermedad cardiovascular, y síndrome metabólico, o se pueden emplear como un tratamiento profiláctico administrado, por ejemplo, diario, semanal, quincenal, mensual, bimestral, semestral, etc, para prevenir o reducir la frecuencia y/o severidad de los síntomas, por ejemplo, niveles elevados de glucosa en plasma, niveles de triglicéridos y colesterol elevados, lo que proporciona un perfil de factor de riesgo cardiovascular y glicémico mejorado.

Métodos de diagnóstico Las proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno aquí descritas se pueden utilizar con fines diagnósticos para detectar, diagnosticar o vigilar enfermedades y/o afecciones asociadas con FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, FGFR4, ß-Klotho, FGF21 o combinaciones de los mismos. También se proporcionan métodos para la detección de la presencia de ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 en una muestra usando métodos inmunohistológicos clásicos conocidos por los expertos en la materia (por ejemplo, Tijssen, 1993, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Vol 15 (Eds R.H. Burdon and P.H. van Knippenberg, Elsevier, Amsterdam) ; Zola, (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc.); Jalkanen et al, (.1985) J. Cell. Biol. 101 : 976-985; Jalkanen et al, (1987) J. ¦ Cell Biol. 105:3087-3096). La detección de ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 se puede realizar in vivo o in vitro.

Las aplicaciones · de diagnóstico proporcionadas en la presente memoria incluyen el uso de las proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno para detectar la expresión de ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4.

Los ejemplos de métodos útiles en la detección de la presencia de ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 incluyen inmunoensayos , tales como la ensayo inmunosorbente ligado · a enzima (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA) .

Para aplicaciones · de diagnóstico, la proteína enlazada al antígeno o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno típicamente se etiquetará con un grupo de etiquetado detectable. Los grupos adecuados de etiquetado incluyen, pero no están limitados a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 5S, 90Y, 99Tc, niIn, 125I, 131I), los grupos fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos lantánidos) , . grupos enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano- picante, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina) , grupos de biotinilo, grupos quimioluminiscentes , o epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por. un reportero secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de enlace para anticuerpos secundarios, dominios de enlace a metal, etiquetas de epitopo) . En algunas modalidades, el grupo de etiquetado está acoplado a la proteina enlazada al' antigeno a través de brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial. Varios métodos para etiquetar proteínas son conocidos en la técnica y pueden ser utilizados.

En otro aspecto, una proteína enlazada al antígeno o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno se puede utilizar para identificar una célula o células que expresan ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. En una modalidad específica, la proteína enlazada al antígeno o fusión FGF21-proteína enlazada al · antígeno está etiquetada con un grupo de etiquetado y el enlace de la proteína enlazada al antígeno etiquetada o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno a ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 se detecta. En una modalidad específica adicional, el enlace de la proteína enlazada al antígeno o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno a ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 es detectado in vivo. En una modalidad específica adicional, la proteína enlazada al antígeno o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno se aisla y se mide usando técnicas conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow and Lañe, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Nueva York: . Cold Spring Harbor (ed. 1991 y suplementos periódicos) ; John E. Coligan, ed,' (1993) Current Protocols in Immunology Nueva York: John Wiley & Sons.

Otro aspecto proporcionado para detectar la presencia de una molécula de ensayo que compite por el enlace a ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 con las proteínas enlazadas al antígeno y antígeno de la proteína de unión FGF21 fusiones es proporcionado, como se describe aquí. Un ejemplo de uno de tales análisis podría implicar la detección de la cantidad de proteína enlazada al antígeno libre o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno en una solución que contiene una cantidad de ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 en la presencia o ausencia de la molécula de ensayo. Un aumento en la cantidad de proteína enlazada al antígeno libre o de unión al antígeno de proteína FGF21 fusión (es decir, la proteína enlazada al antígeno -o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno no unido a ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de los FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c , y FGFR4) indicaría que la molécula de ensayo es capaz de . competir por el enlace a ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 con la proteína enlazada al antígeno o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno. En una modalidad, la proteina enlazada al antígeno o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno está etiquetada con un grupo de etiquetado. Alternativamente, la molécula de ensayo está etiquetada y la cantidad de molécula de ensayo libre se . vigila en presencia y ausencia de una proteína enlazada al antígeno o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno.

Métodos de tratamiento: Formulaciones farmacéuticas, vías de administración Los métodos de utilización de las proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno también se proporcionan. En algunos métodos, una proteína enlazada al antígeno o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno se proporciona a un paciente. La proteína enlazada al antígeno o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno provoca señalización tipo FGF21.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de una o una pluralidad de las proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno descritas y un diluyente, portador, solubilizante, emulsionante, conservador y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable también se proporcionan. Además, los métodos de tratamiento de un paciente mediante la administración de dicha composición farmacéutica están incluidos. El término- "paciente" incluye a los pacientes humanos.

Los materiales aceptables de formulación son no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas. En modalidades especificas, las composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de las proteínas enlazadas al ántígeno humano o fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno que enlazan específicamente ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c , FGFR3c, y FGFR4 se proporcionan . En ciertas modalidades, los materiales aceptables de formulación preferiblemente no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas. En ciertas modalidades, la composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de ' disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición. En tales modalidades, los materiales de formulación adecuados incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina) ; antimicrobianos, antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio o sulfito ácido de sodio) ; soluciones amortiguadoras (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos) ; agentes de volumen (tales como manitol o glicina) , agentes quelantes (tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) ) , agentes formadores de complejo (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina ) ; rellenos; monosacáridos; disacáridos, y otros carbohidratos (tales como glucosa, mañosa o dextrinas) , proteínas (tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas ) ; colorantes, agentes aromatizantes y diluyentes; agentes emulsionantes, polímeros hidrofílico (tales como polivinilpirrolidona) ; polipéptidos de bajo peso molecular; contraiones formadores de sales (tales como sodio) , conservadores (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol de fenetilo, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno) , solventes (tales como propilenglicol o glicerina, o polietilenglicol ) , alcoholes de azúcar (tales como manitol o sorbitol) , agentes de suspensión, agentes tensoactivos o agentes humectantes (tales como Pluronicos, PEG, ásteres de sorbitán, polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato, Tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal) , agentes para mejorar la estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol) , agentes mejoradores de la tonicidad (tales como haluros de metales alcalinos, preferiblemente cloruro de sodio o potasio, manitol sorbitol), vehículos de entrega; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. Véase, Remington Pharmaceutical Sciences, 18a Edición, (AR Gennaro, ed. ) , 1990, Mack Publishing Company.

En ciertas modalidades, la composición farmacéutica óptima será determinada por un experto en la técnica dependiendo de, por ejemplo, la vía de administración pretendida, el formato de suministro y la dosificación deseada. Véase, por ejemplo, Pharmaceutical Sciences de Remington, supra . En ciertas modalidades, tales composiciones pueden influir en el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de aclaramiento in vivo de las proteínas enlazadas al antígeno dadas a conocer. En ciertas modalidades, el vehículo o portador primario en una composición farmacéutica puede ser acuoso o no acuoso en la naturaleza. Por ejemplo, un vehículo o portador adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o líquido cefalorraquídeo artificial, posiblemente complementado con otros materiales comunes en composiciones para administración parenteral. La solución salina amortiguada neutra o solución salina mezclada con albúmina de suero son vehículos ejemplares adicionales. En modalidades específicas, las composiciones farmacéuticas comprenden solución amortiguadora Tris de aproximadamente pH 7.0-8.5, o solución amortiguadora de · acetato de aproximadamente pH 4.0-5.5, y puede incluir además sorbitol o un sustituto adecuado. En ciertas modalidades, las composiciones que comprenden proteínas enlazadas al antígeno o fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno que enlazan específicamente ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 se pueden preparar para el almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tiene el grado de pureza deseado con agentes de formulación opcionales (Remington Pharmaceutical Sciences, supra) ' en la forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Además, en ciertas modalidades, una proteína enlazada al antígeno o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno que se enlaza a ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 puede formularse como .un liofilizado utilizando excipientes apropiados tales como sacarosa.

Las composiciones farmacéuticas se pueden seleccionar para la administración parenteral. Alternativamente, las composiciones pueden . seleccionarse para inhalación o para administración a través del tracto digestivo, tal como por vía oral. La preparación de tales composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de la experiencia de la técnica.

Los componentes de la formulación están presentes preferiblemente en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. En ciertas modalidades, las soluciones amortiguadoras se utilizan para mantener la composición a pH fisiológico o a un pH ligeramente inferior, típicamente dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8. Cuando se contempla la administración parenteral, las composiciones terapéuticas se pueden proporcionar en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable, libre de pirógenos, que comprende la proteína enlazada al antígeno deseado .o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para inyección parenteral es agua destilada estéril en la que se formula la proteína enlazada al antígeno como una solución isotónica estéril, apropiadamente conservada. En ciertas modalidades, la preparación puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bio-erosionables , compuestos poliméricos (tales como ácido poliláctico o ácido poliglicólico) , perlas o liposomas, que pueden proporcionar una liberación controlada o sostenida del producto que se puede administrar a través de inyección de depósito. En ciertas modalidades, el ácido hialurónico también puede ser utilizado, que tiene el efecto de promover la duración sostenida en la circulación. En ciertas modalidades, los dispositivos implantables de suministro de fármacos pueden ser utilizados para introducir la proteina enlazada al antigeno deseado o fusión FGF21-proteina enlazada al antigeno.

Ciertas composiciones farmacéuticas se formulan para la inhalación. En algunas formas de modalidad, las proteínas enlazadas al antígeno o fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno que se unen á ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2C, FGFR3c, y FGFR4 se formulan como un polvo seco, inhalable. En modalidades específicas, la proteína enlazada al antígeno p soluciones de inhalación de fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno también se pueden formular con un propelente para administración por aerosol. En ciertas modalidades, las soluciones se pueden nebulizar. Los métodos de administración y formulación pulmonares por lo tanto se describen además en' la solicitud de patente internacional No. PCT/US94/001875, que se incorpora para referencia, y describe la administración pulmonar de proteínas modificadas químicamente. Algunas formulaciones se pueden administrar por vía oral. Las proteínas enlazadas al antígeno o fusiones FQF21-proteína enlazada al antígeno que enlazan específicamente ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 que se administra de esta manera se pueden formular con o sin vehículos habitualmente utilizados en la composición de formas de dosificación sólidas tales como comprimidos y cápsulas. En ciertas modalidades, una cápsula puede diseñarse para liberar la porción activa de la formulación en el punto en el tracto gastrointestinal cuando la biodisponibilidad es maximizada y la degradación presistémica se minimiza. Los agentes adicionales pueden ser incluidos para facilitar la absorción de una proteína enlazada al antígeno o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno. Los diluyentes, aromatizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes ' desintegrantes de comprimidos y aglutinantes pueden emplearse también.

Algunas composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad eficaz de una o una pluralidad de proteínas enlazadas al antígeno humano o fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno que enlazan específicamente ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 en una mezcla con excipientes no tóxicos que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Mediante la disolución de los comprimidos en agua estéril, u otro vehículo apropiado, las soluciones se pueden preparar en forma de dosis unitaria. Los excipientes adecuados' incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato o bicarbonato de sodio, lactosa o fosfato de calcio, o agentes aglutinantes, tales como almidón, gelatina o goma arábiga; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico, o talco.

Las composiciones farmacéuticas adicionales serán evidentes para los expertos en la técnica, incluyendo formulaciones que implican proteínas enlazadas al antígeno o fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno que enlazan específicamente ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 en formulaciones de liberación sostenida o controlada. ¦ Las técnicas para formular una variedad de otros medios de liberación sostenida o controlada, tales como portadores de liposomas, micropartículas bio-erosionable o perlas porosas e inyecciones de depósito, también son conocidas por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US93/00829, que se incorpora para referencia, describe la liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para la administración de composiciones farmacéuticas. Las preparaciones de liberación sostenida pueden incluir matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas . Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidro.geles, polilactidos (como se describe en la patente de E.U.A. No. 3.773.919 y la Publicación de Solicitud de Patente Europea No. EP 058481, cada una de las cuales se incorpora para referencia) , copolimeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al, 1983, ' Biopolymers 2:547-556), poli (2-hidroxietil-inetacrilato) (Langer et al, 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 y Langer, 1982, Chem. Ber. Tech. 12:98-105), acetato de etilen vinilo (Langer et al, 1981, supra) o poli-D (- ) -3-hidroxibutírico (Publicación de Solicitud de Patente Europea No. EP 133.988). Las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas que se pueden preparar por cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Eppstein et al, 1985, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A 82:3688-3692; Publicación de Solicitud de Patente Europea Nos. EP 036.676, EP 088.046 y EP 143.949, que se incorporan para referencia.

Las composiciones farmacéuticas utilizadas para la administración in vivo se proporcionan típicamente como preparaciones estériles. La esterilización puede conseguirse por filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición es liofilizada, la esterilización utilizando este método se puede realizar ya sea antes o después de la liofilización y reconstitución. Las composiciones para administración parenteral se pueden almacenar en forma liofilizada o en una solución. Las composiciones parenterales se colocan generalmente en un contenedor que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.

En ciertas modalidades, las . células que expresan una proteína enlazada al antígeno recombinante como se describe aquí se encapsulan -para el suministro (ver, Invest. Ophthalmol Vis Sci (2002)* 43: 3292 a 3298 y Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. (2006) 103:3896-3901).

En ciertas formulaciones, una proteína enlazada al antígeno o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno tiene una concentración de al menos 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml ', 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml . o 150 mg/ml. Algunas formulaciones contienen una' solución amortiguadora, sacarosa y polisorbato. Un ejemplo de una formulación es una que contiene 50-100 mg/ml de proteína enlazada al antígeno, acetato de sodio 5-20 mM, sacarosa 5-10% p/v, y desde 0.002 hasta 0.008% p/v de polisorbato. Ciertas formulaciones, por ejemplo, contienen 65-75 mg/ml de una proteína enlazada al antígeno en solución amortiguadora de acetato de sodio 9-11 mM, sacarosa al 8-10% p/v, y polisorbato al 0.005-0.006 % p/v. El pH de ciertas de tales formulaciones está en el intervalo de 4.5-6. Otras formulaciones tienen un pH de 5.0 a 5.5 (por ejemplo, pH de 5.0, 5.2 o 5.4) .

Una vez que ¦ la composición farmacéutica ha sido formulada, puede ser almacenada en viales estériles como una solución, suspensión, . gel, emulsión, sólido cristalino, o como un polvo deshidratado o liofilizado. Tales formulaciones se pueden almacenar ya sea en una forma lista para usar o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que se reconstituye antes de la administración. Los kits para producir una unidad de administración de dosis única también se proporcionan. Ciertos kits contienen un primer recipiente que tiene una proteína seca y un segundo recipiente que tiene una formulación acuosa. En ciertas modalidades, los kits que contienen jeringas pre-llenadas de cámaras individuales y múltiples (por ejemplo,, jeringas de líquido y liojeringas) se proporcionan. La cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína enlazada al antígeno que contiene composición farmacéutica para ser empleada dependerá, por ejemplo, del contexto terapéutico y de los objetivos. El experto en la técnica apreciará que los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento variarán dependiendo, en parte, de la molécula administrada, la indicación para la que la proteína enlazada al antígeno o fusión FGF21-proteina enlazada al antígeno está siendo u'tilizada, la vía de administración, y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño de los órganos) y/o la condición (la edad y salud general) del paciente. En ciertas modalidades, el profesional del cuidado de la salud puede titular la dosificación y modificar la ruta de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo.

Una dosis típica puede variar de aproximadamente 1 pg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados . anteriormente. En modalidades específicas, la dosificación puede oscilar desde 10 pg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, opcionalmente, de 0.1 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, de forma alternativa de 0.3 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg. En algunas aplicaciones, la dosis es de 0.5 mg/kg a 20 mg/kg. En algunos casos, una proteína enlazada al antígeno se dosifica a 0.3 mg/kg, 0.5mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg, o 20 mg/kg. El programa de dosificación en algunos regímenes de tratamiento es a una dosis de 0.3 mg/kg cP, 0.5mg/kg cP, 1 mg/kg cP, 3 mg/kg cP, 10 mg/kg cP, o 20 mg/kg cP.

La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos de la proteína enlazada al antígeno particular o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno en la formulación utilizada. Típicamente, un profesional del cuidado de la salud administra la composición hasta que se alcance una dosis que consiga el efecto deseado. La composición por lo tanto se puede administrar como una dosis única, o como dos o más dosis (que pueden o no pueden contener la misma cantidad de la molécula deseada) en el tiempo, o como una infusión continua mediante un dispositivo de implantación o catéter. Las dosificaciones apropiadas pueden ser determinadas mediante- el uso de datos apropiados de respuesta a la dosis. En ciertas modalidades, las proteínas enlazadas al antígeno o fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno se pueden administrar a los pacientes a lo largo de un período de tiempo extendido. La administración crónica de una proteína enlazada al antígeno o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno minimiza la respuesta inmunitaria adversa alérgica o comúnmente asociada con las proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno que no son totalmente humanas, por ejemplo un anticuerpo contra un antígeno humano en un animal no humano, por ejemplo., un anticuerpo humano que no totalmente humano o anticuerpo no humano producido en una especie no humana. La vía de administración de la composición farmacéutica está de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo, oralmente, por inyección por vía intravenosa, intraperitoneal , intracerebral (intraparenquxmal), intracerebroventricular , intramuscular, intraocular, intraarterial , intraportal, o intralesional ; por sistemas de liberación sostenida o por dispositivos de implantación. En ciertas modalidades, las . composiciones se pueden administrar mediante inyección de bolo o por infusión continua, o mediante dispositivo de implantación . La composición también se puede administrar localmente a través de implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado sobre el que se ha absorbido la molécula deseada o encapsulada. En ciertas modalidades, donde un dispositivo de implantación se utiliza, el dispositivo se puede implantar en cualquier tejido u órgano adecuado, y el suministro de la molécula deseada puede ser mediante difusión, bolo de liberación cronometrada, o administración continua.

También puede ser deseable usar proteina enlazada al antigeno o composiciones farmacéuticas de fusión FGF21-proteina enlazada al antigeno ex vivo. En tales casos, células, tejidos u órganos que han sido retirados del paciente son expuestos a la proteina enlazada al antigeno o composiciones farmacéuticas de fusión FGF21-proteina enlazada al antigeno después de lo cual las células, tejidos y/u órganos se implantan posteriormente de nuevo en el paciente.

En particular, las proteínas enlazadas al antígeno, o fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno que enlazan específicamente ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 pueden ser suministradas mediante el implante de ciertas células que han sido producidas por ingeniería genética, utilizando métodos tales como los descritos en este documento, para expresar y secretar el polipéptido. En ciertas modalidades, tales células pueden ser células animales o humanas, y pueden ser autólogas, heterólogas, o xenogénicas. En . ciertas modalidades, las células pueden ser inmortalizadas. En otras modalidades, con el fin de disminuir la posibilidad de una respuesta inmunológica , las células pueden ser encapsuladas para evitar la infiltración de los tejidos circundantes. En modalidades adicionales, los materiales de encapsulación son típicamente aislamientos o membranas biocompatibles , semipermeables poliméricos que permitan la liberación de los productos proteicos pero evitan -la destrucción de las células por el sistema inmunitario del paciente o por otros factores perjudiciales de los tejidos circundantes.

Terapias de Combinación En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método de tratamiento de un sujeto para la diabetes con un antígeno de la proteína terapéutica de unión o fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno de la presente descripción, tales como los anticuerpos terapéuticos completamente humanos descritos en la presente descripción, junto con uno o más de otros tratamientos. En una modalidad, una terapia de combinación consigue un efecto aditivo o sinérgico. Las proteínas enlazadas al antígeno o fusiones FGF21-proteina enlazada al antígeno se pueden administrar en combinación con uno o más de la diabetes tipo 2 o tratamientos de la obesidad actualmente disponibles. Estos tratamientos para la diabetes incluyen biguanida (metaformin) , y las sulfonilureas (tales como gliburida, glipizida) . Los tratamientos adicionales dirigidos a mantener la homéostasis de la glucosa incluyen agonistas de PPAR gamma (por ejemplo, pioglitazona, rosiglitazona ) glinidas (tales como meglitinida, repaglinida, y nateglinida) , inhibidores de DPP-4 (tal como Januvia® y Onglyza®) e inhibidores de la alfa glucosidasa (tales como acarbosa, voglibosa) .

Los tratamientos adicionales de combinación para la diabetes incluyen tratamientos inyectables tales como la insulina y análogos de la incretina (tales como Byetta®, exenatida®) , otros análogos de GLP-1 (péptido similar al glucagón) tales como liraglutida, con otros agonistas de GLP-1R y Symlin® (pramlintida) .

El tratamiento adicional dirigido a medicamentos para bajar de peso incluyen Meridia y Xenical.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos realizados y los resultados obtenidos, se proporcionan con fines ilustrativos solamente y no deben interpretarse como limitantes.

EJEMPLO 1. PREPARACIÓN DE CÉLUIAS QUE SOBRE-EXPRESAN FGFR1C PARA SU USO COMO ANTÍGENO Las secuencias de ácido nucleico que codifican el polipéptido FGFRlc humano de longitud completa (SEQ ID NO: 305; Figuras la-lb) y una secuencia separada que codifica el polipéptido ß-Klotho humano de longitud completa (SEQ ID NO: 308; Figuras 2a-2c) se subclonaron en vectores de expresión de células de mamífero apropiados (por ejemplo, pcADN3.1 Zeo, Hyg pcADN3.1 (Invitrogen, Calsbad, CA) o pDSRa20). El vector pDSRo¡20 contiene promotor/potenciador SV40 temprano para expresar el gen de interés y un cásete de expresión de DHFR de ratón para la selección en células hospederas CHO DHFR (-) tales como CHO AMI (un derivado de DG44, CHO DHFR (-)) .Las células AM-1 CHO se sembraron a 1.5xl06 células por placa de 100 mm. Después de 24 horas, las células fueron co-transfectadas con ADN linealizado de pDSRa20/huFGFRlc y pDSRa20/hup-Klotho con FuGene6 (Roche Applied Science) . Las células transfectadas se trataron con tripsina 2 días después de la transfección y se sembraron en medio de cultivo CHO DHFR selectivo que contiene FBS al 10% dializado y sin suplemento de hipoxantina/timidina . Después de 2 semanas, las colonias resultantes transfectadas se trataron con tripsina y se agruparon.

Las células HEK293T fueron transfectadas con huFGFRlc de longitud completa y HUp-Klotho en serie pcADN3.1 o vector basado en pTT14 (un vector de expresión desarrollado por Durocher, NRCC, con promotor de CMV y EBV ori, similar a pTT5 y un marcador de' selección de puromicina) y se selecciona con los fármacos correspondientes siguiendo un procedimiento similar al de la transfección y selección de CHO.

Agrupados de células AM1 CHO o 293T (es decir, FGFRlc y ß-Klotho) transfectadas con FGF21R fueron ordenados repetidamente con FGF21 etiquetado con Alexa 647. Como un reactivo de tinción de la superficie celular, FGF21 se etiquetó con Alexa 647-NHS siguiendo el método recomendado por el fabricante (Molecular Probes, Inc. Cat A 2006) . El FGF21 etiquetado con Alexa 647 muestra tinción especifica de las células que expresan el receptor FGF21R y no las células precursoras no transfectadas (Figura 3) . Las células de expresión superiores se recogieron al final de la selección final, se expandieron y congelaron en viales. Las células AM-l/huFGF21R se prepararon para la inmunización y las células 293T/huFGF21R se usaron para titular suero de ratón por FACS después de la inmunización y en selecciones de enlace de los sobrenadantes de hibridoma por FMAT (véase el Ejemplo 4).

EJEMPLO 2 PREPARACIÓN DE UN COMPLEJO FGFR1C/B-KLOTHO SOLUBLE PARA USO COMO ANTÍGENO Los constructos .del receptor de FGF21 solubles se generaron en vectores de expresión pTT14 o pcADN3.1. El constructo FGFRlc ECD-Fc (SEQ ID NO: 31 1, Figura 4) comprende el dominio extracelular de terminal N de FGFRlc (residuos de aminoácidos # 1 - 374; SEQ ID NO: 5) fusionado a IgGl Fe (SEQ ID NO: 20). El constructo ß-Klotho ECD-Fc (SEQ ID NO: 312, Figura 5) comprende el dominio extracelular de terminal N de ß- lotho (residuos de aminoácidos 1-996 #; SEQ ID NO: 8) fusionado a IgGl Fe .(SEQ ID NO: 20) .Las células HEK293 (293F, Invitrogen) fueron transíectadas con FGFRlc ECD-Fc/pTT5, ß-Klotho ECD-Fc/pTTl4-puro humano y dGFP/pcADN3.1-Neo y se seleccionan en presencia de los fármacos correspondientes seguido por clasificación FACS repetida basada en la expresión dGFP. Las células fueron cultivadas en Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) libre de suero suplementado con aminoácidos no esenciales en HyperFlasks (Corning) durante 4 dias y cosechadas en medio condicionado (CM) para la purificación.293 CM se concentró 6 veces y se aplicó a Proteina A FF equilibrada en PBS. La proteina se eluyó con solución amortiguadora de elución Pierce Gentle Ag/Ab. El agrupado de proteina A se dializó contra Tris-HCl 20 mM, pH 7, NaCl lOmM y se aplicó a SP HP a H 7.0. El FGFRlc ECD-Fc se presentó en el flujo transversal y el heterodimero se eluyó con un gradiente lineal de NaCl 0-0.4 M, Tris-HCl 20 mM pH 7.0. El procesado por secuencia del aminoácido de terminal N verifica que el FGF21R soluble purificado sea un heterodimero compuesto de relación (1:1) de FGFRlc ECD-Fc y betaKlótho ECD-Fc. Se usó el FGF2 ÍR-Fc soluble purificado (Figura . 6) como antigeno para la inmunización .

EJEMPLO 3 PREPARACIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES Las inmunizaciones se llevaron a cabo utilizando una o más formas adecuadas de antigeno del receptor de FGF21, incluyendo: (1) receptor enlazado a la célula de transfectantes CHO que expresan FGFRlc humano de longitud completa y ß-Klotho en ' la superficie celular, obtenidas mediante la transfección de células CHO con cADN que codifica un polipéptido FGFRlc humano de longitud completa de SEQ ID NO: 305 (ver también las figuras la-lb) y cADN que codifica un polipéptido humano ß-Klotho de. SEQ ID NO: 308 (ver también las figuras 2a-2c) , (2) extracto de membrana a partir de Isa células antes mencionadas que expresan el complejo receptor FGF21R, o (3) receptor. FGF21R soluble obtenible mediante co-expresión el dominio extracelular de terminal N (ECD) de FGFRlc (SEQ ID NO: 311, véase también la Figura 4) y el dominio extracelular de terminal N (ECD) de ß-Klotho (SEQ ID NO: 312, véase también la Figura 5) o (4) combinaciones de los mismos.

Una cantidad adecuada del inmunógeno (es decir, 10 ugs/ratón de FGF21R soluble o 3-4 x 106 células/ratón de células CHO transfectadas establemente o 150 pgs/ratón de membranas FGF21R purificadas preparadas a partir de células CHO que expresan establemente FGF21R) se utilizó para la inmunización inicial en XenoMouse™ de acuerdo con los métodos descritos en la Solicitud de Patente E.U.A. No. de serie 08/759,620, presentada el 03 de diciembre 1996 y Solicitud de Patente Internacional Nos. O 98/24893, y WO 00/76310, cuyas descripciones se incorporan aquí ' para referencia. Después de la inmunización inicial, inmunizaciones de estimulación posteriores de inmunógeno (5 pg/ratón de FGF21R soluble o 1.7 x 106 células transfectadas FGF21R/ratón o 75 de membranas purificadas FGF21R) se administraron en un horario y durante la duración, necesaria para inducir una adecuada titulación anti-FGF21R en los ratones. Las titulaciones se determinaron por un método adecuado, por ejemplo, por inmunoensayo enzimático, clasificación de célula activada por fluorescencia (FACS), o por otros métodos (incluyendo combinaciones de los inmunoensayos enzimáticos y FACS) .Los animales que exhiben las titulaciones adecuadas se identificaron, y los linfocitos se obtuvieron a partir de ganglios linfáticos drenados y, si es necesario, se reunieron para cada cohorte. Los linfocitos fueron disociados a partir de tejido linfoide por molienda en un medio adecuado (por ejemplo, Medio Eagle modificado de Dulbecco; DMEM; obtenible a partir de Invitrogen, Carlsbad, CA) para liberar las células de los tejidos, y se suspendieron en DMEM. Las células B se seleccionaron y/o expandieron utilizando métodos estándar, y se fusionan con compañeros de fusión adecuados, por ejemplo, células P3X63Ag8.653 de mieloma no secretantes (American Type Culture Collection CRL 1580; Kearney et al, J. Immunol 123, 1979, 1548 - 1550), usando técnicas que se conocen en la técnica.

En un método de fusión adecuado, los linfocitos se mezclaron con células compañeras de fusión en una proporción de 1:4. La mezcla de. células se peletizó suavemente por centrifugación a 400 x g durante 4 minutos, el sobrenadante se decantó, y la mezcla de células se mezcla suavemente (por ejemplo, mediante el uso de una pipeta de 1 mi) . La fusión fue inducida con PEG/DMSO (polietilen glicol/sulfóxido de dimetilo; obtenidas de Sigma-Aldrich, St. Louis MO; 1 mi por millón de linfocitos) . PEG/DMSO se añadió lentamente con agitación suave durante un minuto seguido, por un minuto de mezclado. IDMEM (DMEM sin glutamina; 2 mi por millón de células B) , se añadió ' a continuación durante 2 minutos con agitación suave, seguido por IDMEM adicional (8 mi por millón de células B) que se añadió durante 3 minutos.

Las células fusionadas se peletizaron (400 x g 6 minutos) y se resuspendieron en 20 mi de medio de selección (por ejemplo, DMEM que contenia Azáserina e Hipoxantina [HA] y otros materiales suplementarios, . según sea necesario) por millón de células B. Las células se incubaron durante 20-30 minutos a 37 °C y luego se resuspendieron en 200 mi de medio de selección y se cultivaron durante tres a cuatro días en matraces T 175 antes dé colocar en placas de 95 pocilios.

Las células se distribuyeron en placas de 96 pocilios utilizando técnicas estándar para maximizar la capacidad de clonación de las colonias resultantes. Después de varios días de cultivo, los sobrenadantes se recogieron y se sometieron a ensayos de selección como se detalla en los ejemplos siguientes, incluyendo la confirmación del enlace a receptor humano FGF21, especificidad y/o reactividad cruzada entre especies. Las células positivas se seleccionaron y se sometieron adicionalmente a técnicas de clonación y subclonación estándar. Las lineas clónales se expandieron in vitro, y los anticuerpos- secretados humanos son obtenidos para el análisis.

De esta manera, los ratones fueron inmunizados con ya sea células o membranas que expresan células FGF21R de longitud completa,, o dominio FGF21R extracelular soluble, con un intervalo de 11-17 inmunizaciones durante un periodo de aproximadamente de uno a tres y medio meses. Varias lineas de células que secretan anticuerpos específicos FGF21R se obtuvieron, y los anticuerpos fueron caracterizados adicionalmente. Las secuencias dé los mismos se presentan en este documento y en el Listado de Secuencias, y los resultados de diversos ensayos que utilizan estos anticuerpos se proporcionan.

EJEMPLO 4 SELECCIÓN DE ANTICUERPOS DE ENLACE POR FMAT Después de 14 días de cultivo, los sobrenadantes de hibridoma se seleccionaron para anticuerpos monoclonales específicos de FGF21R por Tecnología de Ensayo de Microvolumen Fluorométrico (FMAT) mediante selección contra cualquiera de la línea de- célula CHO AMl/huFGF21R o células HEK293 recombinantes que fueron transfectadas con FGF21R humano y contra seleccionadas contra células CHO o HEK293 precursoras. Brevemente, las células en medios Freestyle (Invitrogen) se sembraron en placas FMAT de 384 pocilios en un volumen de 50 L/pocillo a una densidad de 4,000 células/pocilio para los transfectantes estables, y a una densidad de 16,000 células/pocilio para las células precursoras, y las células se incubaron durante la noche a 37 °C. Se añadió a continuación 10 pL/pocillo de sobrenadante, y las placas se incubaron durante aproximadamente una hora a 4°C, después de lo cual 10 µ]_,/??? 11? de anticuerpo secundario IgG-Cy5 anti-humano se añadió a una concentración de 2.8 µ?/p?? (400 ng/ml de concentración final). Las placas se incubaron a continuación durante una hora a 4°C, y se leyó la fluorescencia usando un Sistema de Detección Celular FMAT (Applied Biosystems) .

En total, más de 3,000 sobrenadantes de hibridomas fueron identificados como enlazados a las células que expresan el receptor FGF21 pero no a células precursoras por el método FMAT. Estos sobrenadantes se ensayaron a continuación en los ensayos funcionales FGF21 como se describe a continuación.

EJEMPLO 5 SELECCIÓN DE ANTICUERPOS QUE INDUCEN SEÑALIZACIÓN TIPO FGF21 Los experimentos se realizaron para identificar anticuerpos funcionales que son análogos a la actividad FGF21 tipo natural (por ejemplo, la capacidad para inducir señalización tipo FGF21) , utilizando un ensayo reportero FGF21 adecuado. El ensayo reportero FGF21 descrito mide la activación de señalización FGFR a través de una lectura de la trayectoria APK. ß-Klotho es un co-receptor para señalización FGF21, y aunque se cree que no tiene ninguna capacidad de señalización inherente debido a su dominio citoplásmico muy corto, se requiere por FGF21 para inducir la señalización a través de FGFRs. 5.A Ensayo Reportero ELK-luciferasa Los ensayos ELK-luciferasa se realizaron con un sistema de célula de riñon humano .293T o células CHO. Específicamente, las células hospederas fueron diseñadas para sobreexpresar ß-Klotho . y constructos reporteros de luciferasa. Los constructos reporteros contienen secuencias que codifican GAL4-ELK1 y 5xUAS-Luc, un reportero de luciferasa dirigido por un promotor que contiene cinco copias en tándem del sitio enlazado a Gal4. La activación del complejo receptor de FGF21 en estas líneas de células reporteras recombinantes induce la transducción de señal intracelular , que a su vez conduce a la fosforilación de ERK y ELK. La actividad de luciferasa está regulada por el nivel de ELK fosforilada, y se' utiliza para vigilar y cuantificar indirectamente la actividad FGF21.En un ejemplo, las células CHO se transíectaron secuencialmente usando el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante con los constructos del receptor que expresan ß-Klotho, FGFRlc y los plásmidos reportero: 5x Gal4-luciferasa (promotor TK mínimo con sitios de enlace 5xGAL4 cadena arriba de luciferasa) y Gal4-Elkl. Gal4 -ELK1 se enlaza a los sitios de enlace Gal4 y activa la transcripción cuando es fosforilada por ERK. La transcripción de luciferasa, y por lo tanto la actividad enzimática correspondiente en este contexto, está regulada por el nivel de ELK1 fosforilado, y se utiliza para vigilar y cuantificar la actividad de FGF21.

El clon 2E10 fue seleccionado como la línea de célula reportero de luciferasa FGF21 basado en la ventana del ensayo óptima de 10-20 veces con FGF21 nativo que exhiben un CE50 en el intervalo nM sencillo.

Para el ensayo, las células reportero ELK-luciferasa se sembraron en placas de ensayo de 96 pocilios, y privadas de suero durante la noche. FGF21 o muestras de ensayo se añadieron durante 6 horas a 37 grados. Las placas se dejaron enfriar luego a la temperatura ambiente y la actividad de la luciferasa en los Usados- celulares se midió con Bright-Glo ( Promega ) . 5.B Ensayo de fosforilación de ERK Las lineas de. células hospederas alternativas, específicamente una L6 (una línea de células mioblástica de rata) , fue desarrollada y utilizada para identificar anticuerpos con actividad de señalización tipo FGF21. La línea de célula L6 de rata es una línea de célula hospedera deseable para el ensayo de actividad, ya que se sabe que expresa niveles mínimos de receptores de FGF endógenos. Las células L6 no responden a FGF21 incluso cuando son transíectadas con el vector de expresión ß-Klotho y por lo tanto proporcionan un respaldo más limpio. (Kurosu et al, (2007) J. Biol. Chem. 282, 26687-26695).

Las células L6 se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco suplementado con suero fetal de bovino al 10% y penicilina/estreptomicina. Las células fueron transfectadas con plásmidos que expresan ß??????? y FGFR individual usando el reactivo de transfección Lipófectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

El análisis de señalización FGF en células L6 se realizó como se describe en la literatura (Kurosu et al, (2007) J. Biol. Chem. 282, 26687-26695). Los cultivos de células se recogieron 10 min después del tratamiento de FGF21 o moléculas de prueba y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido, se homogeneizaron en el solución amortiguadora de lisis y se sometió a análisis Western blot utilizando una cinasa anti-fosfo-p44/42 MAP (ERK1/2) y anticuerpo un anticuerpo anti-ERK (Cell Signaling) . El porcentaje de ERK fosforilado contra proteína ERK total fue determinada de esta manera.

Además, el ensayo de proliferación basado en célula BaF3 de ratón dependiente del factor utilizado con frecuencia para los receptores de citoquinas también puede ser desarrollado y aplicado .

Entre los sobrenadantes de hibridoma probados en ensayo reportero ELK-luciferasa FGF21 humano basado en célula CHO (clon 2E10), más de 30 fueron identificadas como positivas (> 5% de la actividad de FGF21) en comparación con FGF21 20 nM como control positivo. Los anticuerpos se purificaron a continuación de los medios acondicionados de los cultivos de hibridoma de estos positivos y se prueban de nuevo en el ensayo reportero ELK-luciferasa basado en célula CHO. (Figura 7) muestra los anticuerpos representativos en el ensayo de potencia que responde a la dosis con EC50 estimado inferior a l g/ml (o 6.7Nm). Las actividades fueron confirmadas en el ensayo de fosforilación ERKl/2 basado en célula L6 (Figura 8) con EC50 inferior a 10 nM, que es consistente con el ensayo ELK-luciferasa en la linea de célula 2E10 CHO estable.

EJEMPLO 6 ELISA DE AGLUTINANTES FGFRlc Los péptidos que se enlazan a FGFRlc se identificaron y se examinaron en un ensayo ELISA. Posteriormente, FGFRlc humano (hu-FGFRlc) , y. FGFRlc murino (mu-FGFRlc) se expresaron y purificaron. Anti- 13-HRP se adquirió de GE Healthcare (Piscataway, NJ) . Placas Maxisorp de 96 pocilios (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) se recubrieron con 2 pg/ml hu-FGFRlc y mu-FGFRlc en PBS, respectivamente. Las placas se incubaron a continuación a 4°C durante la noche y se bloqueó en MPBS al 2% a temperatura ambiente durante 1 h el dia siguiente. Las placas se incubaron entonces 1 h con muestras diluidas en MPBS al 2% y se lavó 3 veces con PBST (Tween 20) después de 1 h de incubación. Anti-M13-HRP se diluyó 1: 10000 en MPBS al 2% y se añadió a cada pocilio después se incubó durante 1 h. Después de 1 h de incubación, las placas se lavaron 3 veces con 300 µ? PBST. Se agregó lumiglo reactivo quimioluminiscente (KPL; Gaithersburg, MD) se añadió y la luminiscencia se midió usando un lector Perkin Elmer Envision (Perkin Elmer; Waltham,. MA) .

EJEMPLO 7 CONSTRUCCIÓN DE PROTEÍNAS ENLAZADAS AL ANTÍGENO QUE SON ANÁLOGOS A FGF21 El vector pTT5 SNS (National Research Council of Canadá, Ottawa, Canadá) fue utilizado para las cadenas pesadas. El sitio de glicosilación ligada a N en IgGl se removió por PCR traslapada como sigue usando Novagen (Darmstadt, Alemania) Hot Start PCR kit KOD 71086. La reacción contenia 30.5 µ? H20, 2.5 µ? DMSO, 5 µ? solución 'amortiguadora lOx # 1, 5 µ? dNTPs para concentración final de 0.2 mM, 2 µ? MgC12 (número de catálogo 71153) para una concentración final de 1 mM, 1 µ? plantilla de ADN preparado por circuito Qiagen Mini-Prep (Valencia, CA) , 1.5 µ? cada uno de oligos delanteros e inversos a 10 pmol/µ? para una concentración final de 0.3 µ? cada uno, y 1 µ? polimerasa KOD ADN Hot Start. La reacción se termocicla 94 °C 2 min, luego 30 ciclos de [94°C durante 15 seg, 45°C durante 30 seg, y 68°C durante 3 min] . Dos primeras reacciones de PCR se realizaron para introducir la mutación. Las secuencias de pares de cebadores fueron GGAGGAGCAGTACCAGAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC (SEQ ID NO: 269) con CTTCCGAGTGAGAGACAC (SEQ ID NO: 270) y CAGCTGGCGTAATAGCGAAG (SEQ ID NO: 271) con TGCTCTGGTACTGCTCCTCCCGCGGCTTTGTCTTGGCATTATG (SEQ ID NO: 272) .

Los productos de PCR se purificaron en gel usando un kit de columna de circuito QIAGEN (Valencia, CA) y después se añadieron juntos en una reacción PCR traslapada usando los cebadores CTTCCGAGTGAGAGACAC (SEQ ID NO: 273) y CAGCTGGCGTAATAGCGAAG (SEQ ID NO: 274) . El producto final de PCR se purificó en gel y se utiliza para sustituir el fragmento original en el vector pTT5 SNS usando sitios de restricción. Notl y BsmBl . El kit Quick ligasa de New England Biolabs (Ipswich, MA) y células químicamente competentes TOP 10 de Invitrogen (Carlsbad, California) fueron utilizados para la clonación y luego los constructos de ADN se purificaron y se verificó la secuencia.

Los CDRs de cadena pesada se colocaron en PCRed y clonaron en este vector utilizando BssHII y BsmBI y cebadores AAAAAAGGCACTAGAGACGGTGACCAGGGTTCC (SEQ ID NO: 275) y TTTTTTTTGCGCGCTGTCAGGTGCAACTGGTGCAGTC (SEQ ID NO: 276) para 1A2 o cebadores AAAAAAGGCACTAGAGACGGTGACCAGGGTTCC (SEQ ID NO: 277) y TTTTTTTTGCGCGCTGTCAGGTGCAGTTGGTGGAGTC (SEQ ID NO: 278) para 2G10. La cadena ligera 1A2 se clonó en pTT5 Kappa usando BssHII y BsiWI y cebadores TTTTTTTTGCGCGCTGTGATATTGTGATGACCCAGAC (SEQ ID NO: 279) y AAAAAACGTACGTTTGATTTCCACCTGGGTCC (SEQ ID NO: 280) . La cadena ligera 2G10 fue clonado en pTT5 Lambda usando BssHII y BsmBI y cebadores TTTTTTTTGCGCGCTGTCAGTCTGTGTTGACGCAGCC (SEQ ID NO: 281) y TTTTTTCGTCTCTGACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCC (SEQ ID NO: 282) .

Todos los oligos (ver Tabla 8) se diluyeron a 10 µ? en agua. Se usaron 9 µ? de oligos UB y LA para fosforilación interna 5' . Una mezcla de (1 µ?) de solución amortiguadora NEB PNK al 90% (Ipswich, MA) y NEB PNK al 10% (Ipswich, MA) se añadió. La mezcla se incubó a 37 °C durante 10 min y después a 60°C durante 20 min (en una máquina de PCR) . 9 µ? del oligo complementario se añadió entonces. Todos los pares de oligo se colocaron en ciclos a 95°C durante 20 segundos, luego disminuyó 0.1°C/seg a 50°C (una elevación de 7:30 min). Ambos pares de oligos fueron mezclados y "cosido" a 55°C durante 20 segundos, utilizando una elevación de 5 min a 25°C (a disminución 0.1°C/seg). 150 µ? de Tris-HCl 5 mM pH 8.5/EDTA 0.1 mM se añadió a la preparación ligadora. La ligadura se ligó en pTT5-LA2 o 2G10 que había sido digerido con BsrGI y SexAI y purificado en gel.

TABLA 8 Oligos Utilizados en la Construcción de Proteínas Enlazadas al Antigeno La FGFRlc aglutinante SR4 se añadió también a la terminal N de 1A2 o 2G10 como sigue: Una reacción de PCR se llevó a cabo en la cadena pesada plásmido usando cebadores AAAAAAGGCACTAGAGACGGTGACCAGGGTTCC (SEQ ID NO: 295) y TCAGGCGTGGGGCTATTATGTGTGCGGAGGCGGAGGAGGCCAGGTGCAACTGGTGCAGTC (SEQ ID NO: 296) . Un µ? de esta reacción se utilizó a continuación como plantilla para la PCR con cebadores AAAAAAGGCACTAGAGACGGTGACCA.GGGTTCC (SEQ ID NO: 297) y TCAGGCGTGGGGCTATTATGTGTGCGGAGGCGGAGGAGGCCAGGTGCAGTTGGT GGAGTC ( SEQ ID NO: 298). Esta PCR proporciona un fragmento SR4-CDR que se purificó usando un kit Qiagen PCR Clean Up (Valencia, CA) y se ligó en pTT5-IgGl Aglyco BssHII a BsmBI .

El SR4 se añadió también a la terminal C de 1A2 o 2G10 como sigue: Una reacción de PCR se realizó en pTT5-IgGl Aglyco usando cebadores CGGCGTGGAGGTGCATAATG (SEQ ID NO: 299) y AATAGCCCCACGCCTGATAGCAGCCTCCTCCGCCTCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAG (SEQ ID NO: 300) . Un µ? de esta reacción se utilizó a continuación como plantilla para la PCR con cebadores CGGCGTGGAGGTGCATAATG (SEQ ID NO: 301) y GATGTCGAGGCGGCCGCTCAGCCGCCGCACACATAATAGCCCCACGCCTGATAG ( SEQ ID NO: 302) . Esta PCR proporciona un fragmento de IgGl-SR4 que se purificó usando un kit Qiagen PCR Clean Up (Valencia, CA) y se ligó en pTT5-IgGl Aglyco SacII a NotlI. Antes de la ligación, el vector fue desfosforil-ado en una reacción de 30 min utilizando un kit de Roche Rapid AP (Mannheim, Alemania) .

EJEMPLO 8 EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS ENLAZADAS AL ANTÍGENO QUE SON ANÁLOGOS A FGF21 BIESPECÍFICO Las proteínas enlazadas al antigeno que son análogos a FGF21 biespecíficas en el vector pTT5 se expresaron transitoriamente en células 293-6E adaptadas a suspensión libre de suero mantenidas en medio FreeStyle (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) , complementado con (25 g / mi) de geneticina (Invitrogen ) y Pluronic F68 al 0.1% (Invitrogen). Las transfecciones se realizaron como cultivos de 1 litro-Brevemente, el inoculo celular se cultivó a 1.1 x 106 células/ml en un matraz de agitación de 3 L fernbach (Corning, Inc.). El cultivo del matraz de agitación se mantuvo en una plataforma agitadora Innova 2150 (News Brunswick Scientific, Edison, NJ) a 65 RPM que se colocó en un incubador humidificado mantenido a 37 °C y C02 al 5%. En el momento de la transfección, las células 293-6E se diluyeron a 1.0 x 106 células/ml. Los complejos de transfección se formaron en 100 mi de medio FreeStyle. 1 mg de ADN plásmido se añadió primero al medio seguido por 3 mi de reactivo de transfección FuGene HD (Roche Applied Science, Indianapolis , IN) . El complejo de transfección se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 minutos y después se añadió a las células en el matraz de agitación. Veintidós horas después de la transfección, 20% (p/v) de peptona TNI (OrganoTechnie SA, TeknieScience, QC, Canadá) se añadió para alcanzar una concentración final de 0.5% (p/v). La transíección/expresión se realizó durante 4-7 días, después de lo cual el medio acondicionado se cosechó por centrifugación a 4,0.00 rpm durante 60 minutos a 4°C.

EJEMPLO 9 PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS ENLAZADAS AL A TÍGENO DE CULTIVO DE CÉLULA TRANSITORIA Las proteínas enlazadas al antígeno que son análogos a FGF21 se purificaron a partir de cultivo celular transitorio de la siguiente manera.. Todos los procesos de purificación se llevaron a cabo a temperatura ambiente o 4°C. Un esquema de purificación se usó para purificar diversos anticuerpos análogos de FGF21 y .cromatografía de afinidad. 9.A Cromatografía de Pro eína A El fluido de cultivo de célula hospedera (CCF) se cargó en medio de cromatografía de Proteína G en la forma de una columna, proteína A de Alto Rendimiento (GE Healthcare, anteriormente Amersham Biosciences) , equilibrada en PBS.

Después de la carga, la columna de Proteína A se lavó con PBS hasta que la absorbancia a 280 nm del flujo a través volvió al nivel inicial. Los anticuerpos se eluyeron luego de la columna usando acetato 10 mM, pH 3,5 e inmediatamente se neutralizó mediante la adición de 80 L de una solución madre de Tris Base 1 M por mL de volumen de elución. La absorbancia a 280 nm del eluido se vigiló y las fracciones que contenían proteina se recogieron para hacer el agrupado de proteína A. 9.B Formulación y concentración Después de la purificación, los anticuerpos se formularon en DPBS (NaHP04-H20 8.1 mM, NaC12 138 mM, KH2P04 1.2 mM, KCL 2.7 mM pH ' 7,4) mediante diálisis utilizando membranas de 10,000 M CO (Pierce Slide-A-Lyzer ) . Si la medición de la concentración de los anticuerpos fuera necesaria, un dispositivo centrífugo (Macrocep, Pall) con una membrana de MWCO de 10,000 se utilizó. Tras la formulación los anticuerpos se filtraron a través de un filtro estéril 0.2 µp? y se almacenó a 4°C o congelado.

EJEMPLO 10 ELISA DE LOS ANTICUERPOS ANÁLOGOS FGF21 BIESPECÍFICOS Se expresaron y purificaron Biotina-hu-p-Klotho-His, biotina-mu-pKlotho-His, hu-FGFRlc-His , y mu-FGFRlc-Fc . El anti-Fc-HRP se adquirió de Thermo Fisher Scientific (Rockford, IL) . Las placas de 96 pocilios con neutravidina (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) se recubrieron con 2 µ?/p?? de biotina-hu- -Klotho-His o biotina-mu-p-Klotho-His en PBS (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Las placas de 96 pocilios Maxisorp (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) se recubrieron con 2 g/ml de Hu-FGFRlc-His o mu-FGFRlc-Fc en PBS. Las placas se incubaron a continuación a 4°C durante la noche. Las placas se bloquearon en leche-PBS al 2% a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocilio se incubó 1 hora con muestras diluidas en leche-PBS al 2%. Las placas se lavaron 3 veces con 300 µ? PBS/0.1% de Tween 20 (Invitrogen, Carlsbad, CA y Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) . Se diluyó anti-hu-Fc-HRP 1:10000 en leche-PBS al 2% y se añadió a cada pocilio. Las placas se lavaron de nuevo 3 veces con 300 µ? PBS/0.1% Tween 20. El reactivo Lumiglo (KPL; Gaithersburg, MD) se añadió y se midió la luminiscencia (Perkin Elmer; altham, MA) .

EJEMPLO 11 ENSAYOS DE LUCIFERASA DE LOS ANTICUERPOS ANÁLOGOS FGF21 BIESPECÍFICOS Las células AMID que expresan FGFRlc, Elk y luciferasa con o sin ß???-tho se construyeron. FGF21 se expresó y purificó. Las células AMID que expresan FGFRlc, ß??????, Elk, y luciferasa se mantuvieron en medio DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con suero fetal de bovino dializado al 10% (Invitrogen , Carlsbad, CA) , 200 ug/ml de higromicina B (Invitrogen, Carlsbad, CA) , 4 ug/ml de puromicina (Invitrogen, Carlsbad, CA) , penicilina-estreptomicina-glutamina (Invitrogen, Carlsbad, CA) , piruvato de sodio (Invitrogen, Carlsbad, CA) , y aminoácidos MEM no esenciales (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Las células AMID que expresan FGFRlc, Elk, y luciferasa se mantuvieron en medio DMEM suplementado con suero fetal de bovino dializado al 10%, 400 pg/ml de higromicina B, 6 g/ml de puromicina, HT Supplement (Invitrogen, Carlsbad, CA) , penicilina-estreptomicina-glutamina, piruvato sódico, y aminoácidos MEM no esenciales . Las células se sembraron a una densidad de 3xl04 células/pocilio en una placa de 96 pocilios medios (Corning; Lowell, MA) en medio F-12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) que contiene BSA al 0.1% ( Sigma-Aldrich, St . Louis,. MO) para un volumen total de 30 µ? / pocilio. Las células se incubaron a continuación a 37°C durante 20-22 horas. Las muestras fueron diluidas en PBS (Invitrogen, Carlsbad, CA) y 15 µ? se añadió a cada pocilio. Las células se incubaron a continuación a 37 °C durante .15 minutos. FGF21 humano se diluyó en medio F-12 y 5 µ? se añadió a las células para una concentración final de 3 nM. Las células se incubaron a continuación a 37 °C durante 5-7 horas. El reactivo de luciferasa (Perkin Elmer; Waltham, MA) se añadió y se midió la luminiscencia (Perkin Elmer; Waltham, MA) .

EJEMPLO 12 ESTUDIO CINÉTICO DE ANTICUERPOS ANTI-B-KLOTHO Se preparó hu-p-Klotho biotinilado. La medición de afinidad del anticuerpo anti-p-Klotho purificado se realizó mediante Octeto QK (fortéBIO Inc., Menlo Park, CA) siguiendo el protocolo del fabricante. Se incubaron Biosensores FA de enlace superior de Estreptavidina durante 1 h con hu-p-Klotho biotinilado a 100 nM en solución amortiguadora cinética (fortéBIO Inc., Menlo Park, CA) para el revestimiento de antigeno y en solución amortiguadora cinética durante 1 min para establecer la linea de base. Los biosensores se incubaron con IgG de control a 2 µg/ml en solución amortiguadora cinética durante 15 min para medir la asociación y, a continuación en solución amortiguadora cinética durante 15 min, para medir la disociación. Los datos de afinidad se obtuvieron utilizando el software de análisis integrado.

EJEMPLO 13 ALMACENADO DE EPITOPO DE ANTICUERPOS ANTI-B-KLOTHO Si bien fuera de línea, las columnas de Biosensores FA de Enlace superior de estreptavidina pueden ser incubadas en hu^-Klotho biotinilada a 100 nM en solución amortiguadora cinética (fortéBIO Inc., Menlo Park, CA) , durante 1 hora para el recubrimiento de antigeno, a continuación, en solución amortiguadora cinética durante 2 min, seguido de incubación con los anticuerpos ant?-ß-Klotho, diferentes para cada columna, a 11 pg/ml en solución amortiguadora cinética durante 2.5 horas. Los anticuerpos para la primera carga puede ser Abl en la columna 1, Ab2 en la columna 2, etc. En principio, los sensores en cada columna se puede precargar con un IgG de primera carga específico, y se incuban con IgGs de prueba diferentes en diferentes pocilios a 11 g/ml durante 30 minutos. La orden para IgGs de 2a carga son Abl en el pocilio A, Ab2 en pocilio B, etc. Las señales de enlace de IgGs 2a se pueden grabar como la lectura.

EJEMPLO 14 BARRIDO DE ARGININA Como se describe en este documento, las proteínas enlazadas al antígeno análogas FGF21 y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno que enlazan ß-Klotho o ambos ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, o FGFR4, es decir, FGFRlc, se han creado y' caracterizado. Para determinar los determinantes neutralizantes en FGFRlc y/o ß-Klotho humana que estas diversas proteínas enlazadas al antígeno y fusiones FGF21-proteína enlazada al antígeno enlazan, una serie de proteínas FGFRlc y/o ß-Klotho mutantes se pueden construir con sustituciones arginina en residuos de aminoácidos seleccionados de FGFRlc y/o ß-Klotho humana. La selección de arginina es un método reconocido en la técnica de la evaluación de los anticuerpos, u otras proteínas, enlazadas a otra proteína, véase, por ejemplo, Nanevicz et ah, (1995) J. Biol. Chem. 270:37. 21619-21625 y Zupnick et ah, (2006) J. Biol. Chem. 281: 29, 20464-20473. En general, la cadena lateral de la arginina está cargada positivamente y es relativamente voluminosa en comparación con otros aminoácidos, los cuales pueden interrumpir el enlace del anticuerpo a una región del antígeno donde se introduce la mutación. La selección de arginina es un método que determina si un residuo es parte- de una determinante de neutralización y/o un epítopo.

Varios aminoácidos distribuidos en todos los dominios extracelulares FGFRlc y/o ß-Klotho humanos pueden ser seleccionados para mutación de arginina. La selección puede estar desviada hacia los aminoácidos cargados o polares para maximizar la posibilidad de que el residuo esté en la superficie y reducir la probabilidad de que la mutación resulte en la proteína mal plegada. Utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica, los oligonucleótidos sentido y anti-sentido que contienen los residuos mutados se pueden diseñar basándose en los criterios proporcionados por el kit de protocolo Stratagene QuickChange® II (Stratagene/Agilent, Santa Clara, CA) . La mutagénesis de secuencias FGFRlc y/o ß-Klotho de tipo natural puede realizarse utilizando un kit QuickChange® II (Stratagene) . Las construcciones quiméricas pueden ser diseñadas por ingeniería para codificar una etiqueta FLAG-histidina (seis histidinas (SEQ ID NO: .268)) en la terminal carboxi del dominio extracelular para facilitar la purificación a través de su etiqueta poli-His.

Puede realizarse el análisis multiplex usando la estación de trabajo y software Bio-Plex (BioRad, Hercules, CA) para determinar las determinantes neutralizantes en FGFRlc humana y/o ß-Klotho mediante el análisis del enlace diferencial mAbs FGFRlc y/o ß-Klotho ejemplar humano para los mutantes de arginina contra proteínas FGFRlc y/o ß-Klotho de tipo natural. Cualquier número de códigos de perla de perlas recubiertas con pentaHis ("penta-His" descrito como SEQ ID NO: 303) (Qiagen, Valencia, CA) puede utilizarse para capturar proteína etiquetada con histidina. Los códigos de perla puede permitir' la multiplexación de mutantes de arginina FGFRlc y/o ß-Klotho y de FGFRlc y/o ß-Klotho humano de tipo natural.

Para preparar, las perlas, 100 µ? de FGFRlc y/o ß-Klotho tipo natural y sobrenadantes mutantes de arginina FGFRlc y/o ß-Klotho del cultivo de expresión transitoria están enlazados a perlas cubiertas con penta-His ("penta-His" descrito como SEQ ID NO: 303) durante la noche a 4°C o 2 horas a temperatura ambiente con agitación vigorosa. Las perl-as se lavan a continuación según el protocolo del fabricante y el conjunto de perlas se agrupa y coloca en alícuotas en 2 o 3 columnas de una placa filtro de 96 pocilios (Millipore, Bellerica, MA, producto # MSBVN1250) para los puntos de ensayo por duplicado, o triplicado, respectivamente. Se agregan ???µ? de proteína enlazada al antígeno anti-FGFRlc y/o anti^-Klotho en diluciones de 4 veces a los pocilios, se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente, y se lavaron. Se agrega ???µ? de una dilución 1:100 de IgG Fe anti-humano conjugado a PE (Jackson Labs, Bar Harbor, ME, producto # 109-1 16-170) a cada pocilio, se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y se lavaron. Las perlas se resuspendieron en BSA al 1%, se agita durante 3 minutos, y se leyó en la estación de trabajo Bio-Plex. El enlace del anticuerpo a proteina mutante de arginina FGFRlc y/o ß-Klotho se compara con el enlace del anticuerpo a la FGFRlc y/o ß-Klotho humana de tipo natural del mismo agrupado. Una titulación de anticuerpos en aproximadamente una escala log 5 se puede realizar. La intensidad media de fluorescencia (MFI) de proteínas mutantes de arginina FGFRlc y/o ß-Klotho puede ser representada como un porcentaje de la señal FGFRlc y/o ß-Klotho humana de tipo natural máxima. Aquellos mutantes para los cuales la señal de todas las proteínas enlazadas al antígeno están por debajo de · un valor de corte, por ejemplo, 30% de FGFRlc y/o ß-Klotho de tipo natural se puede considerar que es cualquiera de una concentración demasiado baja de proteína en la. perla debido a la pobre expresión en el cultivo transitorio o posiblemente mal plegada y puede ser excluido del análisis. Las mutaciones (es decir, sustituciones de arginina) que aumentan la CE50 para la proteína enlazada al antígeno FGFRlc y/o ß-Klotho por un valor de corte, por ejemplo, 3 veces o mayor (tal como se calcula mediante, por ejemplo, GraphPad Prism®) se puede considerar que han afectado negativamente la proteina enlazada al antigeno FGFRlc y/o ß-Klotho enlazada. A través de estos métodos, las determinantes de neutralización y epitopos para varias proteínas enlazadas al antigeno FGFRlc y/o ß-Klotho puede ser dilucidado.

EJEMPLO 15 CONSTRUCCIÓN DE RECEPTORES QUIMÉRICOS En otro método para determinar las determinantes de activación en FGFRlc humano y/o ß-Klotho que estas diversas proteínas enlazadas al antígeno y fusiones de proteína FGF21 enlazada al antígeno enlazan, las proteínas FGFRlc quimérica específicas y/o ß-Klotho que comprenden secuencias de proteínas humanas y de ratón se pueden construir, expresado en células 293 transitorias o estables o CHO como se describió antes y probó. Por ejemplo, un receptor FGF21 quimérico que puede construirse comprende FGFRlc, FGFR2C, FGFR3c o FGFR4 humano nativo, en un ejemplo FGFRlc, emparejado con ß-Klotho de ratón o humano quimérico en el cual regiones seleccionadas o secuencias en el ß-Klotho de humano se remplazan sistemáticamente por los residuos específicos de ratón correspondientes (ver, por ejemplo, Figura 2). Similarmente, ß-Klotho humano nativo emparejado es con FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 de ratón/humano quimérico, en un ejemplo FGFRlc, en cuyas regiones seleccionadas o secuencias en el FGFRlc humano se remplazan sistemáticamente por los residuos específicos de ratón correspondientes. Las secuencias críticas implicadas en el enlace y/o actividad de las proteínas enlazadas al antígeno se pueden derivar a través del ensayo de enlace o mediciones de actividad descritas en la presente o conocidas en la técnica, basadas en los receptores FGF21 quiméricos.

EJEMPLO 16 ANÁLISIS DE PROTECCIÓN DE PROTEASA Las regiones del receptor FGF21 humano enlazadas por las proteínas enlazadas al antígeno y fusiones de proteína FGF21 enlazada al antígeno que enlazan receptor FGF21 humano, por ejemplo, FGFRlc, ß-Klotho o un complejo que comprende FGFRlc y ß-Klotho se puede identificar al fragmentar el receptor FGF21 humano en péptidos con proteasas específicas, por ejemplo, AspN, Lys-C, quimiotripsina o tripsina. La secuencia de los péptidos del receptor FGF21 humano resultantes (esto es, ambos fragmentos de péptido que contienen disulfuro y sin disulfuro de porciones FGFRlc y ß-Klotho) se pueden luego determinar. En un ejemplo, las formas solubles de un complejo de receptor FGF21 humano, por ejemplo, un complejo que comprende el heterodímero FGFRlc ECD-Fc y ß-Klotho ECD-Fc descrito en la presente, se puede digerir con AspN (que corta después de ácido aspártico y algunos residuos de ácido glutámico en el extremo amino) al incubar alrededor de 100 \iq de receptor FGF21 soluble en 1.0 mg/ml en fosfato de sodio 0.1M (pH 6.5) por 20 hrs a- 37 °C con 2 µg de AspN.

Un perfil de péptido del AspN digerido se puede luego generar en cromatografía HPLC mientras que una digestión de control con una cantidad similar de anticuerpo se espera para ser esencialmente resistente a endoproteinasa AspN. Un ensayo de protección de proteasa se puede luego realizar para determinar la digestión proteolítica de receptor FGF21 humano en la presencia de .las proteínas enlazadas al antígeno. El principio general de este ensayo es que el enlace de una proteína enlazada al antígeno o fusión de proteína FGF21 enlazada al antígeno al receptor FGF21 puede resultar en la protección de ciertos sitios de desdoblamiento de proteasa específicos y esta información se pueden usar para determinar la región o porción de receptor FGF21 donde la proteína enlazada al antígeno o- fusión de proteína FGF21 enlazada al antígeno enlazan.

Brevemente, el péptido digerido puede someterse a trazado de péptido HPLC; los picos individuales se colectan, y los péptidos se identifican y trazan por análisis LC-MS (ESI-LC-MS) de ionización por electro rocío en línea y/o por secuenciación de terminal N. El análisis HPLC para estos estudios se puede realizar usando una columna C18 de fase inversa de calibre estrecho (Agilent Technologies) para análisis desconectado y usando una columna C18 de fase inversa capilarmente (EL Grupo de Separación) por LC-MS. El péptido de HPLC trazado se puede realizar con un gradiente lineal desde ácido trifluoroacético al 0.05% (fase móvil A) hasta acetonitrilo al 90% en ácido trifluoroacético al 0.05%. Las columnas se pueden desarrollar en velocidad de flujo deseada por HPLC de calibre estrecho para análisis LC-MS desactivado o activado, y para HPLC capilar para análisis LC-MS activado.

Los análisis de secuencia pueden conducirse por LC-MS/MS activado y por secuenciación Edman en los picos de péptido recuperados de HPLC. Los análisis ESI LC-MS activados del péptido digerido se pueden realizar para determinar la masa precisa y secuencia de- los péptidos que se separan po HPLC. Las identidades de péptidos seleccionados presentes en los picos de péptido de la digestión de proteasa pueden de esta manera determinarse.

EJEMPLO 17 FUSIONES DE PROTEÍNA FGF21 ENLAZADA AL ANTÍGENO La terminal C de FGF21 se ha reportado para ser la porción critica para especificidad de enlace ß-Klotho (Wu, et al, J. Biol. Chem.' 283, 33304-33309 (2008)). Un grupo de sitios de desdoblamiento altamente susceptibles a proteasa se han identificado cerca de la terminal C de FGF21 basado en prueba in vivo, específicamente entre Prol71 y Ser 172. El desdoblamiento en este grupo de residuos disminuye el enlace a ß-Klotho y FGF21 inactivado in vivo. Las series de fusiones de proteína FGF21 enlazada al antígeno descrita en la presente se diseñaron para remplazar la porción de enlace ß-Klotho nativa en FGF21 con una proteína enlazada al antígeno de alta afinidad. Un serie de diez fusiones de proteína FGF21 enlazada al antígeno se generaron lo que comprende (a) un componente de proteína enlazada al antígeno que específicamente enlaza ß-Klotho o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4; y (b) un componente FGF21 que comprende FGF21 o un fragmento de los mismos. Las diez fusiones de proteína FGF21 enlazadas al antígeno se fabricaron por ingeniería con la ventaja de que el componente de proteína enlazada al antígeno específicamente enlazará ß-Klotho humano y el componente FGF21 se asociaría con FGFRlc, formando en última instancia un complejo que puede iniciar la señalización inducida por FGF21. De esta manera, las fusiones se diseñaron como FGF21 miméticos.

Las fusiones se .probaron en ensayos de actividad in vitro como se describe a continuación. 17. A.

Construcción Diez fusiones de proteina enlazada al antigeno especificas se generaron.- Estas fusiones cada una comprende el anticuerpo anti-p-Klotho 2G10 (como se describió en las Tablas 1-3 y 6) fusionadas a los residuos 1-169 (SEQ ID NO: 342) o 1-170 de FGF21 maduro (SEQ ID NO: 343) en diversas orientaciones por medio de una ligadura (esto es, (G4S)is (SEQ ID NO: 340), (G4S) 12 (SEQ ID NO: 339), (G4S)9 (SEQ ID NO: 338), (G4S)6 (SEQ ID NO: 337), y (G4S)3 (SEQ ID NO: 336)), y se muestran abajo.

Las fusiones de proteina enlazada al antigeno generadas, que se presentan de la terminal N- hasta C-, incluyen: (a) FGF21 (1-169) - (G4S) 3-2G10 (SEQ ID NOs:315 (secuencia de codificación) y 316 (secuencia de aminoácidos)); (b) FGF21 (1-169) - (G4S) 6-2G10 (SEQ ID NOs:319 (secuencia de codificación) y 320 (secuencia de aminoácidos)); (c) FGF21 (1-169) - (G4S) 9-2G10 (SEQ ID NOs:321 (secuencia de codificación) y 322 (secuencia de aminoácidos)); (d) FGF21 (1-169) - (G4S) X2-2G10 (SEQ ID NOs:323 (secuencia de codificación) y 324 (secuencia de aminoácidos) ) ; (e) FGF21 (1-169) - (G4S) 15-2G10 (SEQ ID NOs:325 (secuencia de codificación) y 326 (secuencia de aminoácidos) ) ; (f) 2G10- (G4S) 3-FGF21 (1-170) (SEQ ID NOs:317 (secuencia de codificación) y 318 (secuencia de aminoácidos)); (g) 2G10- (G4S) 5-FGF21 (1-170) (SEQ ID NOs:327 (secuencia de codificación) y 328 (secuencia de aminoácidos)); (h) 2G10- (G4S) 9-FGF21 (1-170) (SEQ ID NOs:329 (secuencia de codificación) y 330 (secuencia de aminoácidos) ) ; (i) 2G10- (G4S) 12-FGF21 (1-170) (SEQ ID NOs:331 (secuencia de codificación) y 332 (secuencia de aminoácidos)); y (j) 2G10- (G4S) 15-FGF21 (1-170) (SEQ ID NOs:333 (secuencia de codificación) y 334 (secuencia de aminoácidos)).

La fusiones de proteina enlazada al antigeno se construyeron como sigue: Construcción de Secuencia de codificación FGF21 ( 1-169 ) -(G4S)3-2G10 (SEQ ID NOs:316) Una secuencia de ácido nucleico que codifica aminoácidos 1-197 de FGF21 humano de tipo natural de longitud completa (SEQ ID NO: 2), esto es, la secuencia de señal y residuos 1-169 de la forma madura de FGF21 (SEQ ID NO:342)), se amplificó con dos cebadores, uniendo un sitio de restricción Salí así como una secuencia Kozak en extremo 5' y dos copias de una ligadura (G4S)3 (SEQ ID NO: 336) más un sitio de restricción BamHI en el extremo 3' .

La forma madura 2G10 del anticuerpo anti- -Klotho (esto es, menos péptido de señal) se amplificó usando dos cebadores. El primer cebador enlazado al sitio BamHI así como una copia de una ligadura (G4S) 3 (SEQ ID NO: 336) en el extremo 5' y el segundo cebador agregado al sitio de restricción Notl después del codón de paro.

El fragmento PCR que contiene FGF21 se digirió con enzimas de restricción Salí y BamHI, similarmente el fragmento PCR 2G10 de anticuerpo ant?-ß-Klotho se digirió con enzimas de restricción BamHI y Notl. Ambos fragmentos, así como un fragmento de plásmido de expresión pTT5 digerido con Salí y Notl, se purificaron con gel y los fragmentos resultantes se ligan para obtener pTT5 - FGF21 humano (1-197 (esto es, residuos 1-169 más la secuencia de señal de residuo 28)) - (G4S)3 - anticuerpo 2G10 anti-p-Klotho.

Construcción de secuencias de codificación FGF21 ( 1-169) -(G4S)6-2G10 (SEQ ID NO:320). FGF21-169V (G4S) 9-2G10 (SEQ ID NO:322), FGF21 ( 1-169) - (G4S) 12-2G10 (SEQ ID NO:324), FGF21(1- 169) - (G4S) 15-2G10 (SEQ ID NO:326) Usando el clon de expresión transitoria - FGF21 humano (1-197) - (G4S)3 - anticuerpo 2G10 anti-p-Klotho, todos los clones posteriores se' hicieron con ligaduras más grandes. Tomando ventaja del sitio de restricción BamHI único dentro de la ligadura (G4S)3 (SEQ ID NO: 336) asi como el clon general, dos oligómeros fosforilados y combinados en sus pares de base codificados para una ligadura (G4S)3 adicional (SEQ ID NO: 336) se insertaron. Estos oligómeros combinados en sus pares de base contienen extremos compatibles con BamHI que permiten el ligado en un fragmento linearizado BamHI de pTT5 - FGF21 humano (1-197) - (G4S)3 - clon de anticuerpo 2G10 anti- ß-Klotho. En este proceso, sólo un sitio de restricción BamHI en un extremo de los oligómeros combinados en sus pares de base se regeneró, proporcionando pTT5 - FGF21 humano (1-197) - (G4S)6 - anticuerpo 2G10 anti- ß-Klotho. Similarmente, el pTT5 - FGF21 humano - (G4S)6 - clon anticuerpo 2G10 anti-p-Klotho se usó para producir la versión (G4S)9. Finalmente, el -clon (G4S)15 se produjo a partir de un clon (G4S)12.

Construcción de Secuencia de codificación 2G10-(G4S)3 FGF21 (1-170) ( SEQ ID NO:318) Una secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura de anticuerpo 2G10 anti- ß-Klotho de longitud completa (más péptido de señal) pero que carece de la lisina terminal se amplificó usando dos cebadores. El primer cebador enlazado al sitio de restricción Salí asi como una secuencia Kozak en el extremo 5' y dos copias de una ligadura (G4S)3 (SEQ ID NO: 336) más un sitio de restricción BamHI en el extremo 3'.

Una secuencia de ácido nucleico que codifica aminoácidos 1-170 de la forma madura de FGF21 (SEQ ID NO: 343) se amplificó con dos cebadores. El primer cebador enlazado a sitio BamHI asi como una copia de una ligadura (G4S)3 (SEQ ID NO: 336) en el extremo 5' y el segundo cebador agregado a sitio de restricción Notl después del codón de paro.

El anticuerpo 2G10 anti- ß-Klotho que contiene fragmento PCR se digirió con enzimas de restricción Salí y BamHI, similarmente el fragmento PCR FGF21 se digirió con enzimas de restricción BamHI y Notl. Ambos fragmentos asi como un fragmento de plásmido de expresión pTT5 digerido con Salí y Notl se purificaron con gel y los fragmentos resultantes se ligan para obtener pTT5 - anticuerpo 2G10 anti-p-Klotho -(G4S)3 - FGF21 humano (1-170).· Construcción de secuencias de codificación 2G10-(G4S)6 FGF21 (1-170) (SEQ ID NO:328), 2G10-(G4S)9 - FGF21(1- 170) (SEQ ID NO:330). 2G10-(G4S)12 -FGF21 (1-170) (SEQ ID NO:332), 2G10- (G4iS) 15 - FGF21 q-170) (SEQ. ID NO:334) Usando el clon de expresión transitoria pTT5 anticuerpo 2G10 anti- ß-Klotho - (G4S)3 - FGF21 humano (1-170), todos los clones posteriores se hicieron con ligaduras más grandes. Tomando ventaja del sitio de restricción BamHI único dentro de la ligadura (G4S)3 (SEQ ID NO: 336) asi como el clon general, dos oligómeros fosforilados y combinados en sus pares de base codificados para una ligadura (G4S) 3 adicional (SEQ ID NO: 336) se insertaron. Estos oligómeros combinados en sus pares de base contienen extremos compatibles con BamHI que permiten el ligado en un fragmento linearizado BamHI de p'TT5 - anticuerpo 2G10 anti-p-Klotho - (G4S) 3 - FGF21 humano (1-170). En este proceso, sólo un sitio de restricción BamHI en un extremo de los oligómeros combinados en sus pares de base se regeneró, proporcionando pTT5 - anticuerpo 2G10 anti-p-Klotho - (G4S)6 - FGF21 humano (1-170). Similarmente, el pTT5 - anticuerpo 2G10 anti-ß-Klotho - (G4S)6 - clon FGF21 humano (1-170) se usó para producir la versión (G4S)3. Finalmente, el clon (G4S)15 se produjo de un clon (G4S)12. ' 17. B.

Expresión y Purificación El cADN que codifica cada una de las proteínas de fusiones se generó e insertó en un vector de expresión pTT5, con cadena pesada desK 2G10 usada en las fusiones de terminal C.

Los constructos . se expresaron en células 293 transfectadas transitoriamente. La linea de célula 293 de riñon embriónica humana que expresa establemente el antigeno 1 nuclear del virus. Epstein Barr (células 293-6E) se obtuvo del National Research Council (Montreal, Canadá) . Las células se mantuvieron como cultivos dé suspensión libre de suero usando medio F17 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con L-glutamina 6mM (Invitrogen, Carlsbad, CA) , F-68 Plurónico al 1.1% (Invitrogen, Carlsbad, CA) y 50 ug/ul Geneticina (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Los cultivos celulares de suspensión se mantuvieron en cultivos de matraz de agitación Erlenmeyer. Los matraces de cultivo se agitaron a 65 rpm a 37 °C en una atmósfera de C02 al 5%, humidificada . Las células se pasaron de forma rutinaria por dilución hasta 3.0e5 células viables/ml los lunes y miércoles y hasta 1.5e5 célula viable/ml los viernes durante un periodo de tres meses antes de remplazarse con un vial recientemente descongelado de células .

Se prepararon soluciones madre (lmg/ml) de PEImax lineal 25-kDa ( Polysciences , Warrington, PA) en agua, se hace ácido con HC1 hasta pH 2.0 hasta disolverse, luego se neutraliza con NaOH, se esteriliza por filtración (0.2 µp?) , se forma en alícuota, y se almacena a -20°C hasta que se usa. Se obtuvo Tryptone NI de OrganoTechni S.A. (TekniScience , QC, Canadá).

Se prepararon soluciones madre (20%, p/v) en medio Freestyle (Invitrogen, Carlsbad, CA) , esterilizado por filtración a través de filtros de 0.2 µ?t?, y se almacena a 4°C hasta que se usa .

Para la transfección, las células se diluyeron hasta 1.1 e6 células/ml. La mezcla de transfección de ADN and PEImax se preparó en medio fresco a 10% del volumen de cultivo. Las mezclas de transfección consisten de 500ug de ADN por mi de cultivo seguido por 3ug de PEImax por ug de ADN y se incubaron por 10 minutos antes de agregarse al cultivo celular. Los cultivos se cosecharon típicamente 6-7 dias después de la transfección.

Se cosechó el medio de acondicionado y las fusiones se purificaron usando cromatografía de Proteína A (MabSelect Sure, Millipore) a pH 3.5. Los agrupados de elución se titularon hasta alrededor de pH 7.0 y la solución amortiguadora se intercambió entonces en PBS. 17.C.

Ensayos de Enlace Las fusiones se evaluaron para enlazarse a ß-Klotho de humano y ratón usando un formato ELISA. Como se muestra en la Figura 16, todas de las fusiones se observaron que se enlazan a ß-Klotho humano, y la Figura 17 demuestra que todas de las fusiones se observaron que se enlazan a ß-Klotho de murino. El enlace observado fue independiente de la orientación relativa del componente FGF21 con respecto al componente de anticuerpo 2G10. 17. D.

Ensayos de Actividad In vitro Las fusiones luego se probaron en un ensayo de luciferasa usando células reporteras A ID que expresan ß-Klotho y FGFRlc. La Figura 18 demuestra que todas de las fusiones son activas en el ensayo reportero. Adicionalmente la Figura 18 demuestra que aunque la actividad observada es independiente de la longitud de la ligadura, la orientación relativa del componente FGF21 con respecto al componente de anticuerpo 2G10 de la fusión es importante. Más particularmente, se observó que las fusiones en las cuales el componente de anticuerpo de la fusión está localizado en la terminal N de la fusión mostrando un nivel más alto de actividad que aquellas fusiones en las cuales el componente de anticuerpo está localizado en la terminal C de la fusión general .

Las fusiones luego se probaron en un ensayo de luciferasa usando células reporteras AMID que expresan ß-Klotho y FGFRlc. Cuando las proteínas de fusión se incubaron con FGF21 3n ninguna de las fusiones demuestra ninguna actividad antagónica detectable, como se muestra en la Figura 19. Adicionalmente, la Figura 20 demuestra que las fusiones no interactúan con a-Klotho humano, lo que confirma la especificidad de las fusiones para ß-Klotho. Por otro lado, no se detectó actividad en el ensayo de luciferasa usando células reporteras AMID que expresan ß-Klotho y FGFRlc en ausencia de ß-Klotho.. 17.E.

Conclusiones En resumen, los resultados de los experimentos presentados en este Ejemplo 17 indican que las fusiones de proteina FGF21 enlazada al antigeno que se generaron (a) enlazan específicamente ß-Klotho humana e inducen actividad mediada por FGF21; y (b) no inducen actividad mediada por FGF21 en ausencia de ß-Klotho humana.

Las proteínas de fusión descritas combinan los beneficios de actividad FGF21 natural muentras que eliminan una región sensible a la proteólisis de la terminal C, que de otra manera lleva a la inactivación de FGF21 a través de la degradación. El anticuerpo enlazado a ß-Klotho proporciona enlace específico objetivo con una afinidad más alta que solo FGF21. En particular, la afinidad de enlace de FGF21 a ß-Klotho está en el intervalo de 10 - 20nM mientras que la afinidad de enlace para anticuerpos específicos de ß-Klotho está típicamente en el intervalo sub-nanomolar' o picomolar. Esta afinidad altamente aumentada se espera que mejore la eficiencia objetivo in vivo. Adicionalmente, en contraste con la liberación rápida de FGF21 administrado exógenamente observada in vivo (tl/2 < 30min) , estas proteínas de fusión basadas en anticuerpo se espera que exhiban una vida media extendida de días o semanas, alusivo de un anticuerpo típico in vivo. Estos atributos benéficos combinados hacen a las proteínas de fusión descritas especialmente adecuadas para un papel terapéutico.

Cada referencia citada en la presente se incorpora en su totalidad para todas las enseñanzas y para todos los propósitos.

La presente descripción no se limita en alcance por las modalidades específicas descritas en la presente, que se pretenden como ilustraciones de aspectos individuales de la descripción, y métodos y componentes funcionalmente equivalentes forman aspectos de la descripción. Al contrario, varias modificaciones de la descripción, además de aquellas mostradas y descritas en la presente, serán aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y figuras acompañantes. Tales modificaciones se pretende que caigan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Una proteina . enlazada al antigeno aislada, caracterizada porque comprende uno o más de: (a) una CDR3 de cadena ligera que comprende uno o más de: (i) una secuencia de CDR3 de cadena ligera que difiere por no más de dos adiciones, sustituciones, eliminaciones y combinaciones de las mismas de aminoácidos a partir de una secuencia de CDR3 de Ll-Lll, SEQ ID NOs: 17-27; (ii) MQAXiEFPWT (SEQ ID NO: 174); (iii) GTWDSSLSX2VX3 (SEQ ID NO: 175); (iv) QQYDNLFT (SEQ ID NO: 122); (v) QQYGSAPLT (SEQ ID NO: 123); (vi) VLYMGSGIWV (SEQ ID NO: 124); (vii) ET DSSLSAGV (SEQ ID NO: 127); en donde Xi es L o I; X2 es V o A; y X3 es V o A; (b) una CDR3 de cadena pesada que comprende uno o más de: (i) una secuencia de CDR3 de cadena pesada que difiere por no más de una adiciones, sustituciones, eliminaciones y o combinaciones de las mismas de aminoácidos a partir de una secuencia de CDR3 de Hl-Hll, SEQ ID NOs:28-38; (ii) GWFDX6 (SEQ ID NO: 178); (iii) GTSFDY ( SEQ ID NO: 99); (iv) YGGSFDY (SEQ -ID NO: 100); (v) MVYVLDY (SEQ ID NO: 101) ; (vi) VAGPFDF (SEQ ID NO: 102); en donde X6 es Y, l o F; y (c) la secuencia CDR3 de cadena ligera de (a) y la secuencia de cadena pesada CDR3 de (b) ; y en donde la proteina enlazada al antigeno específicamente enlaza ß-Klotho.

2. La proteína enlazada al antígeno de conformidad con la reivindicación 1,· caracterizada porque la proteína enlazada al antígeno comprende además uno o más de: (a) una CDR1 de cadena ligera que comprende uno o más de: (i) un secuencia de CDR1 de cadena ligera que difiere por no más de dos adiciones, sustituciones, eliminaciones, y combinaciones de aminoácidos de los mismos, a partir de una secuencia CDR1 de Ll-Lll, SEQ ID NOs : 17-27; (ii) RS SQSLVX22YX23 DGNTYLS (SEQ ID NO: 177); (iii) SGSSSNIGNNYVS ( SEQ' ID NO; 107); (iv) QASQDINNYLN (SEQ ID NO:- 108); (v) RASQSVSGNYLA (SEQ. ID NO: 109) ; (vi) GVSSGSVSTRYYPS (SEQ ID NO: 110); en donde X22 es H o está ausente; y X23 es S o está ausente; (b) una CDR2 de cadena ligera que comprende uno o más de : (i) una secuencia CDR2 de cadena ligera que difiere por no más de dos adiciones, sustituciones, eliminaciones, y combinaciones de aminoácidos de los mismos, a partir de una secuencia CDR2 de Ll-Lll, .SEQ ID NOs: 17-27; (ii) KISNRFS (SEQ ID NO: 112) ; (iii) DNNX4RPX5 (SEQ ID NO: 176); (iv) DTSNLET (SEQ ID NO: 114); (v) GASSRAT (SEQ ID NO: 115); (vi) STNTRSS (SEQ ID NO: 116); en donde X4 es K, N o R; y X5 es S o está ausente; y (c) una CDRl de cadena pesada que comprende uno o más de: (i) una secuencia CDRl de cadena pesada que difiere por no más de tres adiciones, sustituciones, eliminaciones, y combinaciones de las mismas de aminoácidos, a partir de una secuencia CDRl de Hl-Hll, SEQ ID NOs : 28-38; (ii) Xi9YX2oMX2i en donde X19 es A, G, R, S, T, o I; X20 es Y, G o A; y X21 es H o S; (d) una CDR2 de cadena pesada que comprende uno o más de (i) una secuencia CDR2 de cadena pesada que difiere por no más de cinco adiciones, sustituciones, y/o eliminaciones de aminoácidos a partir de una secuencia CDR2 de Hl-Hll, SEQ ID NOs:28-38; (ii) WI PX7SGGTNSAQKFQG (SEQ ID NO: 179); '(iii) VIXsXgDGXioXuX^YYADSVKG (SEQ ID NO: 180); (iv) Xi3ISGX14GXi5X16TYYADSVKG (SEQ ID NO: 181); (v) VIXi7YDGRNKYXi8ADSV G (SEQ ID NO: 182); en donde ?? es N o Y; Xa es W o G; Xg es F o Y; ?? es R o S Xll es N o Y; Xl2 es Q o K; Xl3 es A o D; Xl es S 0 R; Xl5 es V 0 G; Xl6 es S o Y; Xl7 es o S; y Xl8 es Y o H; (e) la CDRl de cadena ligera de (a) y la CDR2 de cadena ligera de (b) ; (f) la CDRl de cadena ligera de (a) y la CDRl de cadena pesada de (c) ; (g) la CDRl de cadena ligera de (a) y la CDR2 de cadena pesada de (d) ; (h) la CDRl de cadena ligera (b) y la CDRl de cadena pesada de (c) ; (i) la CDRl de cadena pesada (c) y la CDR2 de cadena pesada de (d) ; (j) la CDR2 de cadena ligera de (b) y la CDR2 de cadena pesada de (d) ; (k) la CDRl de cadena ligera de (a), la CDR2 de cadena ligera de (b) , y la CDRl de cadena pesada de (c) ; (1) la CDR2 de cadena ligera de (b) , la CDRl pesado de (c) , y la CDR2 de cadena pesada de (d) ; (m) la CDRl de cadena ligera de (a) , la CDRl de cadena pesada de (c) , y la CDR2 de cadena pesada de (d) ; y (n) la CDRl de cadena ligera de (a) , la CDR2 de cadena ligera de (b) , la CDR2 de cadena pesada de (c), y la CDR2 de cadena pesada de (d) , en donde dicha proteina enlazada al antigeno específicamente enlaza ß-Klotho.

3. La proteína enlazada al .antígeno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína enlazada al antígeno comprende uno o más de: (a) un dominio variable de cadena ligera que comprende; (i) una CDRl de cadena ligera que comprende uno o más de SEQ ID NOs: 106-111; (ii) una CDR2 de cadena ligera que comprende uno o más de SEQ ID NOs: 112-119; (iii) una CDR3 de cadena ligera que comprende uno o más de SEQ ID NOs: 120-127; y (b) un dominio variable de cadena pesada que comprende: (i) una CDRl de cadena pesada que comprende uno o más de SEQ ID NOs: 83-88; (ii) una CDR2 de cadena pesada que comprende uno o más de SEQ ID NOs: 89-97; y (iii) una CDR3 de cadena pesada que comprende uno o más de SEQ ID NOs: 98-105; o (c) el dominio, variable de cadena ligera de (a) y el dominio variable de cadena pesada de (b) , en donde la proteína enlazada al antígeno específicamente enlaza ß-Klotho.

4. La proteína enlazada al antígeno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína enlazada al antígeno comprende uno o más de: (a) un dominio variable de cadena ligera que comprende uno o más de: (i) aminoácidos que tienen una secuencia al menos 80% idéntica a una secuencia de dominio variable de cadena ligera que comprende uno o más de Ll-Lll, SEQ ID NOs: 17-27; (ii) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de polinucleótido que es al menos 80% idéntica a una secuencia de polinucleótido que codifica una secuencia de dominio variable de cadena ligera de Ll-Lll, SEQ ID NOs: 17-27; (b) un dominio variable de cadena pesada que comprende uno o más de: (i) una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a una secuencia de dominio variable de cadena pesada de Hl-Hll de SEQ ID NOs:28-38; (ii) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de polinucleótido que es al menos 80% idéntica a una secuencia de polinucleótido que codifica una secuencia de dominio variable de cadena pesada de Hl-Hll, SEQ ID NOs : 28-38; y (c) el dominio variable de. cadena ligera de (a) y el dominio variable de cadena pesada de (b) ; en donde la proteina enlazada al antígeno específicamente enlaza ß-Klotho.

5. La proteína aislada enlazada al antígeno de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la proteína enlazada al antígeno comprende uno o más de: (a) una secuencia de dominio variable de cadena ligera que comprende uno o más de Ll-Lll de SEQ ID NOs: 17-27; (b) una secuencia de dominio .variable de cadena pesada que comprende uno o más de Hl-Hll. de SEQ ID NOs: 28-38; y (c) el dominio variable de cadena ligera de (a) y el dominio variable de cadena pesada de (b) , en donde la proteína enlazada al antígeno específicamente enlaza a ß-Klotho.

6. La proteína enlazada al antígeno de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada se seleccionan del grupo de combinaciones que consiste de: L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10 y L11H11, en donde la proteína enlazada al antígeno específicamente enlaza 'a ß-Klotho.

7. La proteína enlazada al antígeno de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la proteína enlazada al antígeno' comprende: (a) la secuencia constante de cadena ligera de SEQ ID NO : 13; (b) la secuencia constante de. cadena ligera de SEQ ID NO: 15; (c) la cadena pesada< constant sequence de SEQ ID NO: 9; y (d) la secuencia constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15 y la secuencia constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 9.

8. La proteína enlazada al antígeno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína enlazada al antígeno comprende un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, anticuerpo quimérico, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombínante , un fragmento de anticuerpo enlazado al antígeno, un anticuerpo de cadena sencilla, un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo, un fragmento Fab, un fragmento F(fa')x, un anticuerpo de dominio, un anticuerpo IgD, un anticuerpo IgE, un anticuerpo IgM, un anticuerpo IgGl, un anticuerpo IgG2, un anticuerpo IgG3, un anticuerpo IgG4, o un anticuerpo IgG4 que tiene al menos una mutación en la región de bisagra.

9. La proteina enlazada al antigeno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque, cuando se enlaza a ß-Klotho: (a) se enlaza a ß-Klotho sustancialmente con el mismo Kd como un anticuerpo de referencia; (b) induce la señalización tipo FGF21 de 10 % o mayor que la señalización inducida por un FGF21 de tipo natural estándar que comprende la forma madura de SEQ ID NO: 2 como se mide en un ensayo del reportero de ELK-luciferasa ; (c) exhibe un EC50 de ???? o menos de señalización tipo FGF21 en un ensayo seleccionado del grupo que consiste de: (i) un ensayo basado en célula recombinante in vitro mediado por FGFRlc/pKlotho; (d) exhibe un EC50 de menos de ???? de actividad agonista en FGFRlc en presencia de ß-Klotho en un ensayo reportero mediado por el receptor FGFRlc recombinante; y (e) un EC50 de más de ?µ? de actividad agonista en FGFRlc en ausencia de ß-Klotho en un ensayo reportero mediado por el receptor FGFRlc recombinante in vitro; y (f) compite para enlazarse con un anticuerpo de referencia a ß-Klotho, en donde el anticuerpo de referencia comprende uno o más de las siguientes combinaciones de secuencias de dominio variable de cadena ligera y cadena pesada: L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10 y L11H11.

10. La proteina enlazada al antigeno de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque, cuando se enlaza a ß-Klotho: (a) reduce la glucosa en la sangre en un modelo animal; (b) reduce los niveles de lipidos en el suero en un modelo animal; o (c) (a) y (b) .

11. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende la proteina enlazada al antigeno de conformidad con la reivindicación 1 o 9 en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable del mismo.

12. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de polinucleótido que codifica el dominio variable de cadena ligera, el dominio variable de cadena pesada, o ambos, de la proteina enlazada al antigeno de conformidad con la reivindicación 4.

13. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la secuencia se selecciona de Ll-Lll, SEQ ID NOs : 17-27; Hl-Hll, SEQ ID NOs: 28-38, o ambos.

14. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 13.

15. Una célula aislada, caracterizada porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 13.

16. La célula aislada de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque comprende un vector de expresión que comprende el ácido nucleico.

17. Un método para producir una proteina enlazada al antigeno que específicamente enlaza a ß-Klotho, caracterizado porque comprende incubar la .célula hospedera de conformidad con la reivindicación 16 bajo condiciones que permiten expresar la proteína enlazada al antígeno.

18. Un polipéptido, caracterizado porque comprende uno o más de: TRL KYWV (SEQ ID NO: 184); RRLYIFWE (SEQ ID NO: 185); YKAWGYYV (SEQ ID NO: 186); YQAWGYYV (SEQ ID NO: 187); YQAWGYLV (SEQ ID NO: 188); . YQAWGYFV (SEQ ID NO: 189); FTWVFWNV (SEQ ID NO: 190); YQVWGYFV (SEQ ID NO: 191); YKWL WNL (SEQ ID NO: 192); RRLYIFEW (SEQ ID NO: 193); WAERGG (SEQ ID NO: 194); GGWAVGRI (SEQ ID NO: 195); YKYLVF V (SEQ ID NO: 196); YKYLSYWV (SEQ ID -NO: 197); YKTAWYWK (SEQ ID NO: 198); YVFHKW V (SEQ . ID NO: 199); YVFYLWWK (SEQ ID NO: 200); YRWLH HV (SEQ ID NO: 201); YKFLF HA (SEQ ID NO: 202); RRQ GF V (SEQ ID NO: 203); YSAWSFWV (SEQ ID NO: 204); LARWGF V (SEQ ID NO: 205); YDAWGYWV (SEQ ID NO: 206); WRKYYHFWVS (SEQ ID NO: 207); KRLYGLF' YD (SEQ ID NO: 208); KKHWSSLFFE (SEQ ID NO: 209); KAWPYSWEAV (SEQ ID NO: 210); E YCGVLFNCQQ (SEQ ID NO: 211); HFGCGVIFNCVSD (SEQ ID NO: 212); WELCASGYGWCYLH '(SEQ ID NO: . 213); APSCKSYIGFGLYHC DG (SEQ ID NO: 214); y HFKCGMGLFECADP (SEQ ID NO: 215).

19. La proteina enlazada al antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizada porque la cadena pesada comprende además un péptido que específicamente enlaza a uno o más de FGFRlc , FGFR2c, FGFR3c, y FGFR .

20. La cadena pesada de la proteína enlazada al antígeno de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el péptido comprende uno o más de: TRLWKYWV ( SEQ ID NO: 184); RRLYIF E (SEQ ID NO: 185); YKAWGYYV (SEQ ID NO: 186); YQAWGYYV (SEQ ID NO: 187); YQA GYLV (SEQ ID NO: 188); YQAWGYFV (SEQ ID NO: 189); FT VFWNV (SEQ ID NO: 190); YQVWGYFV (SEQ ID NO: 191); YKWLK NL (SEQ ID NO: 192); RRLYIFEW (SEQ ID NO: 193); WAERGG (SEQ ID NO: 194); GGWAVGRI (SEQ ID NO: 195) ; YKYLVFWV (SEQ ID NO: 196); YKYLSY V (SEQ ID NO: 197); YKTAWYWK (SEQ ID NO: 198); YVFHK V (SEQ ID NO: 199); YVFYLWWK (SEQ' ID NO: 200); YRWLH HV (SEQ ID NO: 201); YKFLFWHA ( SEQ ID NO: 202); RRQWGFWV (SEQ ID NO: 203); YSA SFWV (SEQ ID NO: 204); LARWGFWV (SEQ ID NO: 205); YDAWGYWV (SEQ ID NO: 206); WRKYYHF VS (SEQ ID NO: 207); KRLYGLFWYD (SEQ ID NO: 208); KKHWSSLFFE (SEQ ID NO: 209); KAWPYSWEAV (SEQ ID NO: 210); E YCGVLFNCQQ (SEQ ID NO: 211); HFGCGVI FNCVSD (SEQ ID NO: 212); ELCASGYG CYLH (SEQ ID NO: 213); APSCKSYIGFGLYHC DG (SEQ ID- NO: 214); y HFKCGMGLFECADP (SEQ ID NO: 215) .

21. La cadena pesada de proteína enlazada al antígeno de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque la cadena pesada comprende un circuito CH2, un circuito CH3 o tanto un circuito CH2 como un CH3.

22. La cadena pesada de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque la cadena pesada comprende un circuito CH3.

23. La cadena pesada de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el circuito CH3 comprende el péptido.

24. La cadena ' pesada de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque la cadena pesada comprende un circuito CH2.

25. La cadena pesada de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el circuito CH2 comprende el péptido.

26. Una proteína enlazada al antígeno, caracterizada porque comprende la cadena pesada de conformidad con la reivindicación 23 o 25.

27. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende la proteina enlazada al antigeno de conformidad con la reivindicación 19 en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable del mismo.

28. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de polinucleótido que codifica el dominio variable de cadena ligera, el dominio variable de cadena pesada, o ambos, de la proteina enlazada al antigeno de conformidad con la reivindicación 19.

29. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la secuencia se selecciona de Ll-Lll, SEQ ID NOs : 17-27; Hl-Hll, SEQ ID NOs : 28-38, o ambos.

30. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 29.

31. Una célula aislada, caracterizada porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 29.

32. La célula aislada de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque comprende un vector de expresión que comprende el ácido nucleico.

33. Un método para producir una proteina enlazada al antigeno que específicamente enlaza a ß-Klotho, caracterizado porque comprende incubar la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 32 bajo condiciones que permiten expresar la proteina enlazada al antigeno.

34. Una fusión FGF21-proteina enlazada al antigeno, caracterizada porque comprende: (a) un componente enlazado al antigeno; y (b) un componente FGF21.

35. La fusión FGF21-proteina enlazada al antigeno de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque el componente que enlaza el antigeno comprende una proteina enlazada al antigeno de conformidad con la reivindicación 1.

36. La fusión FGF21-proteina enlazada al antigeno de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque el componente FGF21 comprende al menos 25 residuos consecutivos de SEQ ID NO:341.

37. La fusión- FGF21-proteina enlazada al antigeno de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque el componente FGF21 comprende uno de (a) SEQ ID NO: 342 o (b) SEQ ID NO:343.

38. La fusión FGF21-proteina enlazada al antigeno de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada además porque comprende una ligadura.

39. La fusión FG'F21-proteina enlazada al antigeno de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque (a) el componente, que enlaza el antígeno comprende SEQ ID NOS: 18 y 29; y (b) un componente FGF21 que comprende uno de: (i) SEQ ID NO: 342; y (ii) SEQ ID NO: 343.

40. La fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque el componente que enlaza el antígeno se une al componente FGF21 por una ligadura seleccionada del grupo que consiste de (G4S)3, (SEQ ID NO: 336) (G4S)6 ( SEQ ID NO: 337), (G4S)9 (SEQ ID NO: 338), (G4S)i2 ( SEQ ID NO: 339) y (G S)is (SEQ ID NO: 340) .

41. La fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque el componente FGF21 se une a la cadena pesada del componente que enlaza el antígeno.

42. La fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque la cadena pesada comprende uno o más de: SEQ ID NOs:316, 320, 322, 324, 326, 318, 328, 330, 332 y 334.

43. La fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque el componente FGF21 se une a la cadena ligera del componente que enlaza el antígeno.

44. La proteína enlazada al antígeno de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque, cuando se une a ß-Klotho, o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR : (a) reduce la glucosa en la sangre en un modelo animal; (b) reduce los niveles de lípidos en suero en un modelo animal; y (a) y (b) .

45. Un ácido nucleico aislado que codifica la cadena ligera, la cadena pesada o ambas del componente que enlaza el antígeno de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado poque el ácido nucleico comprende: (a) Ll-Lll, SEQ ID NOs : 17-27; (b) Hl-Hll, SEQ ID NOs: 28-38; o (c) SEQ ID NOs: 316, 320, 322, 324, 326, 318, 328, 330, 332 o 334.

46. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 45.

47. Una célula aislada, caracterizada porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 46.

48. La célula aislada de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque comprende un vector de expresión que comprend el ácido nucleico.

49. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una fusión FGF21-prote'ina enlazada al antigeno de conformidad con la reivindicación 34, que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.

50. Un método para prevenir o tratar una afección en un sujeto que necesita de tal tratamiento, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición de conformidad con la reivindicación 49 al sujeto, en donde la afección se trata al reducir la glucosa en la sangre.

51. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque la afección se selecciona de diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, NASH, enfermedad cardiovascular, y síndrome metabólico. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona composiciones y métodos relacionados a o derivados de proteínas enlazadas al antígeno y fusión FGF21-proteina enlazada al antigeno que específicamente enlaza a ß-Klotho, o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. En algunas modalidades las proteínas enlazadas al ' antígeno y fusión FGF21-proteína enlazada al antígenos induce, señalización tipo FGF21. En algunas modalidades, una proteína enlazada al antígeno o componente que enlaza el antígeno de fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno es un anticuerpo completamente humano, humanizado, o quimérico, fragmento enlazados y derivados de tales anticuerpos, polipéptidos que enlazan específicamente a ß-Klotho, o ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. Otras modalidades proporcionan ácidos nucleicos que codifican tales proteínas enlazadas al antígeno y fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno, y fragmentos y derivados de los mismos, y polipéptidos, células que comprenden tales polinucleótidos , métodos para hacer tales proteínas enlazadas al antígeno y fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno, y fragmentos y derivados de los mismos, y polipéptidos, y métodos de uso de tales proteínas enlazadas al antígeno y fusión FGF21-proteína enlazada al antígeno, fragmentos y derivados de los mismos, y polipéptidos, incluyendo métodos de tratamiento o diagnóstico de sujetos que padecen de diabetes tipo 2, obesidad, NASH, síndrome metabólico y enfermedades o trastornos relacionados.