JPH08509870A

JPH08509870A - 特定のｃｄ４５イソ型タンパク質の発現を遮断するトランスジェニック哺乳動物

Info

Publication number: JPH08509870A
Application number: JP7500454A
Authority: JP
Inventors: ワーマク、タク; マーティンペニンガー、ジョゼフ
Original assignee: オンタリオキャンサーインスティテュート
Priority date: 1993-05-26
Filing date: 1994-05-25
Publication date: 1996-10-22
Also published as: WO1994028122A1; US6552246B1; CA2161015A1; AU6760794A; EP0700435A1

Abstract

(57)【要約】免疫系のある種の細胞における特定のＣＤ４５イソ型タンパタ質の発現を欠く哺乳動物を提供する。該哺乳動物は、所望により、ＣＤ４５ＲＯイソ型タンパク質をコードするトランスジーンを含有していてもよい。また、これらの哺乳動物を使用する方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】特定のＣＤ４５イソ型タンパク質の発現を遮断するトランスジェニック哺乳動物本出願は１９９３年５月２６日付け出願の米国特許出願第０８／０６７，７６７号の一部継続出願である。発明の分野本発明は１以上の遺伝子の発現が抑制され、および／または１以上の遺伝子が挿入された哺乳動物に関する。さらに詳しくは、本発明は、外来性ＤＮＡ構築体を哺乳動物のゲノムＤＮＡに挿入し、それにより、内因性遺伝子もしくは遺伝子類の発現が低下もしくは完全に抑制され、および／または新規な遺伝子もしくは遺伝子類が発現されるトランスジェニック哺乳動物を作出することに関する。先行技術の記載哺乳動物の免疫系は、高度に複雑でかつ調和して作用して、侵入する病原体、トキシン、および他の外来性物質から当該哺乳動物を保護する多くの特別化された細胞よりなる。免疫系の特異性を担う細胞をリンパ球という。リンパ球は白血球細胞の１つのタラスである。リンパ球の２つの重要なクラスはＴ細胞およびＢ細胞である。Ｔ細胞は胸腺で発生分化し、細胞媒介免疫を担う。例えば、（他のタイプの白血球細胞の活性を増強する）ヘルパーＴ細胞、（他の白血球細胞の活性を抑制する）サプレッサーＴ細胞、および（細胞を殺す）細胞障害性Ｔ細胞のごとき多くのタイプの特異化されたＴ細胞がある。Ｂ細胞は骨髄で発生分化し、抗体を産生し分泌することによってその効果を発揮する。多くの免疫系障害が存在し、新しい障害が継続的に同定されている。通常起こる免疫障害の１つのタイプは免疫系の過剰活性化である。ここに、ある種の因子が免疫系で特定の細胞型を誘導して、それが活性化されるべきでない場合に活性化状態となる。もう１つのタイプの免疫障害は自己免疫である。この障害は、哺乳動物自身の組織に対する免疫応答を増大させる免疫によって特徴付けられる。哺乳動物の免疫系の応答を調節する鍵となる機能を有するものとして、いくつかの蛋白質および他の分子が同定されている。２つのかかる蛋白質はＣＤ２８およびＣＤ４５である。ＣＤ２８としても知られているＣＤ２８受容体は分子量約４４キロダルトン（ｋＤ）のホモダイマーである。ＣＤ２８は種々のＴ細胞の細胞表面で異なるレベルで発現され、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの受容体に類似した分子構造を有する。ＣＤ２８はＴ細胞活性化の調節に関与するらしく、結局、ある種のホスホリパーゼのごときある種の細胞内基質のチロシンリン酸化を介してＴ細胞サイトカイン遺伝子の発現を調節することによってこの効果を発揮するようである（Linsley etal.，Ann．Rev．I mmunol.，11:191-211［1993］参照）。免疫系の調節で重要なもう１つの蛋白質はＣＤ４５受容体またはＣＤ４５として知られている細胞表面受容体分子である。この分子は、例えば、Ｂ細胞およびある種のＴ細胞を含めた多くのタイプの造血細胞の表面で発現されている。ＣＤ４５をコードする遺伝子は別のスプライシングを受ける。ＣＤ４５は３４のエクソンを有する（Johnson et al.，J．Biol．Chem.，264:6220-6229［1989］）。その結果、エクソン４、５および６の別々のスプライシングに主として起因して、ＣＤ４５の多重のイソ型タンパク質がある（Trowbridge et al.，Biochem．Bi ophys．Acta．1095:46-56［1991］）。異なるイソ型タンパク質は異なる細胞で発現されるが、１つの細胞型は１を超えるイソ型タンパタ質を発現し得る（Thom as，Ann．Rev．Immunol.，7:339-369［1989］；Trowbridge et al.，前掲）。ＣＤ４５は、イソ型タンパク質に応じて、約１８０ｋＤと２３５ｋＤの間の分子量を有する。ＣＤ４５ＲＯとして知られているほぼ１８０ｋＤのイソ型タンパク質はエクソン４、５および６を発現しない。ＣＤ４５は蛋白質チロシンホスファターゼであって、細胞の信号伝達に関与している（Charbonneau et al.，Proc．Na tl． Acad．Sci．USA 85:7182-7186［1988］；Tonks et al.，Biochem.，27:8695-870 1［1988］）。ＣＤ４５は、細胞表面で発現される抗原受容体に関連する蛋白質とで複合体を形成することができ、また、これらの受容体のリン酸化を調節することによって信号の変換を調節できることが示唆されている（Justement et al. ，Science，252:1839-1842［1991］）。ＣＤ４５の発現を欠くマウスＴ細胞クローンが化学的突然変異誘発によって創製されている（Pingel et al.，Cell，58:1055-1065［1989］；Weaver et al.， Mol．Cell．Biol.，11:4415-4422［1991］）。これらの細胞は、通常は活性化信号として働くある種の化合物に応答して活性化された状態（すなわち、増殖する状態）とはならない。該細胞はサイトカイン産生の低下のごとき他の損なわれた機能も同様に有していた。ＣＤ４５発現が抑制された突然変異ヒトＴ細胞白血病細胞系が、ガンマ線の照射によって創製されている（Koretzky et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，8 8:2037-2041［1991］；Koretzky et al.，Nature，346：66-68［1990］）。他の損なわれた機能の中では、この細胞系がチロシンキナーゼが結合したＴ細胞受容体関連を活性化する能力を欠くことが示されている。単離された細胞系の使用は免疫系調節についての種々の蛋白質の役割を理解するのに助けとなるが、哺乳動物において（すなわち、in vivo系において）直接的にこれらの蛋白質の効果を研究することによってより完全な情報が得られる。この目的で、ある種の遺伝子の発現レベルを改変した種々の哺乳動物が作出されている。これらの哺乳動物の１のクラスは、いわゆるトランスジェニック哺乳動物である。これらの哺乳動物はそのゲノムに導入された新規な遺伝子または遺伝子類を有する。これらの哺乳動物のもう１つのクラスはいわゆるノックアウト哺乳動物であり、ここでは、内因性遺伝子の発現が遺伝子操作によって抑制されている。種々のトランスジェニック哺乳動物が開発されている。例えば、１９８８年４月１２日に発行された米国特許第４,７３６,８６６号は、オンコジーンをコードするトランスジーンを含有するマウスを記載している。１９９２年１２月２９日に発行された米国特許第５,１７５,３８４号は、成熟Ｔ細胞を欠くトランスジェニックマウスを記載している。１９９２年１２月２９日に発行された米国特許第５,１７５,３８３号は、int- ２／ＦＧＦファミリーにおける遺伝子をコードするトランスジーンを持つマウスを記載している。１９９２年１２月２９日に発行された米国特許第５,１７５,３８５号は、ある種のウイルスに対する耐性が増強されたトランスジェニックマウスを記載している。１９９２年１２月２３日に国際公開されたＰＣＴ出願（ＷＯ９２／２２６４５）はある種のリンパ系細胞型を欠くトランスジェニックマウスを記載している。ノックアウト哺乳動物を作出するには、まず、特定の遺伝子の発現を抑制するのに用いられる核酸構築体を、胚性幹細胞と呼ばれる未分化細胞型に導入することが必要である。次いで、この細胞を哺乳動物の胚に注入し、そこで発生分化する胚に取り込まれることが希望される。次いで、妊娠の持続のために、該胚を仮親に移植する。 Pfefferら（Cell，73:457-467［1993］）は、腫瘍壊死因子受容体ｐ５５をコードする遺伝子が抑制されているマウスを記載している。該マウスは腫瘍壊死因子信号伝達に対する応答の低下を示した。 Fung-Leungら（Cell，65:443-449［1991］）；J．Exp．Med.，174:1425-1429 ［1991］）は、ＣＤ８をコードする遺伝子の発現を欠くノッタアウトマウスを記載している。これらのマウスは、種々の抗原に対する、およびリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスのごときある種のウイルス病原体に対する細胞障害性Ｔ細胞の応答レベルが低下していることが判明している。 Kishiharaら（Cell，74:143-156［1993］）は、ＣＤ４５のエクソン６に突然変異を持つマウスの創製を記載している。報告されているところによると、このマウスはほとんどのＢおよびＴ細胞でＣＤ４５を発現しない。免疫障害に起因し得る被害効果に鑑みると、これらの障害の治療に有用な薬物をスクリーニングし評価するためのin vivo系を提供する必要が当該分野に存在する。従って、本発明の目的は、免疫系の調節に関与する遺伝子がノックアウト技術の使用により抑制されており、および／または哺乳動物がノックアウトトランスジェニック哺乳動物となり得るように、新規な遺伝子が該哺乳動物で発現される当該哺乳動物を提供することにある。本発明のさらなる目的は、かかるノックアウト哺乳動物およびノックアウトトランスジェニック哺乳動物の作出方法を提供することにある。これらの目的および他の目的は当業者に容易に理解されるであろう。発明の概要１の態様において、本発明は、Ｔ細胞上のＣＤ２８をコードする遺伝子の発現のレベルが抑制されたマウスおよびその後代を提供する。該遺伝子は、マーカー配列に連結したＣＤ２８暗号配列のエクソンの少なくとも一部よりなる核酸配列をマウスのゲノムに挿入することによって抑制することができ；該マーカー配列はネオマイシン耐性遺伝子であり得る。もう１つの態様において、本発明は、ＣＤ４５をコードする遺伝子の発現がＢ細胞にて抑制されているマウスおよびその後代を提供する。さらに、本発明は、胸腺細胞および末梢Ｔ細胞でのＣＤ４５発現のレベルが低下したマウスを提供する。ＣＤ４５遺伝子の発現は、ネオマイシン耐性遺伝子配列のごときマーカー配列に連結されたＣＤ４５の１のエクソンの少なくとも一部よりなる核酸配列をマウスのゲノムに挿入することによって抑制もしくは低下させることができる。好ましい具体例において、抑制もしくは低下されたＣＤ４５遺伝子はＣＤ４５エクソン６イソ型タンパタ質である。さらにもう１つの態様において、本発明は、ＣＤ４５イソ型タンパク質６をコードする内因性遺伝子の発現が抑制されたマウスおよびその後代を提供し、ここに、該マウスは新規なヌタレオチド配列またはトランスジーンを発現できる。もう１つの態様において、本発明は、ＣＤ２８またはＣＤ４５エクソン６イソ型タンパタ質のノックアウト構築体を含有する胚性幹細胞系を提供する。さらにもう１つの態様において、本発明は、免疫刺激効果用薬物を、ＣＤ２８もしくはＣＤ４５発現のレベルが抑制されたマウスに投与し、次いで、免疫刺激のためのマウスをアッセイすることを特徴とする該薬物をスクリーニングする方法を提供する。図面の簡単な記載図１は、ＣＤ２８の発現を抑制するのに用いるノックアウト構築体を示す。１Ａは、ネイティブＣＤ２８遺伝子の一部の構造を示す。１Ｂは、創製されたＣＤ２８ノッタアウト構築体を示し、１Ｃは、相同遺伝子組換えの後、ネイティブＣＤ２８遺伝子に挿入されたこのノックアウト構築体を示す。用いる制限酵素は１文字省略によって示す。Ｓ＝ＳａｌＩ；Ｘ＝ＸｂａＩ；Ｅ＝ＥｃｏＲＩ；およびＢ＝ＢａｍＨＩ図２は、１）ＰＭＡと組み合わせたカルシウムイオノフォア、および２）（ＩＬ−２の存在下または不存在下における）コンカナバリンＡの脾細胞増殖に与えるＣＤ２８ノックアウト構築体の効果を示す。塗り潰した黒色の棒線は野生型マウスからの脾細胞を表し、水平方向にハッチングを施した棒線はヘテロ接合ノックアウトマウスからの脾細胞を表し、また、交差するハッチングを施した棒線はホモ接合ノッタアウトマウスからの脾細胞を表す。これらの結果は細胞を培養した２日後に得られたものである。図３は、水疱性口炎ウイルスで免疫化した野生型（塗り潰した棒線）およびホモ接合ＣＤ２８ノックアウトマウス（交差したハッチングを施した）における中和ＩｇＭおよびＩｇＧ抗体のレベルを表す。データは免疫化の後に（示した）種々の時間に採取した。「ｎ.ｄ.」は、検出不可能なレベルを示す。図４は、ＣＤ４５エクソン６イソ型タンパク質の発現を抑制するのに用いるＤＮＡノックアウト構築体を示す。４Ａは、ネイティブＣＤ４５遺伝子の一部を示す。４Ｂは、エクソン６〜８をｎｅｏ配列で置き換えたノックアウト構築体を示す。４Ｃは、ノックアウト構築体の制限部位を示す。図５は、１）リポ多糖（ＬＰＳ）、または２）精製された抗−μ抗体（Ｂ−７ −６）いずれかに応答しての、野生型（塗り潰した棒線）、ヘテロ接合ＣＤ４５ノックアウト（単一ハッチングを施した棒線）またはホモ接合ＣＤ４５ノックアウト（二重ハッチングを施した棒線）マウスからの脾細胞の増殖を示す。これらのデータは培地に刺激因予を添加した後３、４または５日に得られたものであった。「Ｎ．Ｓ．」は刺激因子を添加しなかったことを示す。図６は、ＬＣＭＶ（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス株Armstrong）に暴露した場合の野生型およびＣＤ４５エクソン６イソ型タンパク質ホモ接合ノックアウトマウスの細胞障害性Ｔ細胞の応答を示す。６Ａは、足蹠腫大反応を示し、６Ｂは、ＬＣＭＶ感染細胞の特異的溶解を示す。中抜きの三角形はホモ接合ＣＤ４５エクソン６イソ型タンパク質ノックアウトマウスを示し、塗り潰した三角形は野生型マウスを示す。発明の詳細な記載本発明は、部分的には、哺乳動物における特定の遺伝子の発現レベルは、抑制すべき遺伝子のＤＮＡ配列のある部分を妨害するように働く新しいＤＮＡ配列を、当該哺乳動物のゲノムＤＮＡに導入することによって低下させ、もしくは完全に抑制することさえできるという発見に基づくものである。「ノックアウト」なる語は、細胞における内因性ＤＮＡ配列によってコードされた蛋白質の少なくとも一部の発現を部分的にもしくは完全に抑制することをいう。「ノックアウト構築体」なる語は、細胞における内因性ＤＮＡ配列によってコードされた蛋白質の発現を低下させもしくは抑制するように設計された核酸配列をいう。ノックアウト構築体として用いる核酸配列は、典型的には、（１）抑制すべき遺伝子のいくつかの部分からのＤＮＡ（エクソン配列、イントロン配列、および／またはプロモーター配列）および（２）該細胞においてノックアウト構築体の存在を検出するのに用いられるマーカー配列よりなる。該ノックアウト構築体は細胞に挿入され、ネイティブＤＮＡ配列の転写を妨げもしくは干渉するような位置にて、細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。かかる挿入は、通常、相同遺伝子組換えによって起こる（すなわち、ノックアウト構築体が細胞に挿入され、該ノッタアウト構築体が内因性ＤＮＡの対応する位置に組み込まれるように組換えられた場合、内因性ＤＮＡ配列に相同なノックアウト構築体の領域は相互にハイブリダイズする）。ノックアウト構築体核酸配列は、１）抑制すべき遺伝子の１以上のエクソンおよび／またはイントロンの全長もしくは部分的配列、２）抑制すべき遺伝子の全長もしくは部分的プロモーター配列、または３）それらの組合せよりなるものであってよい。典型的には、ノックアウト構築体を胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に挿入し、通常相同遺伝子組換えプロセスによって、該ＥＳ細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。次いで、このＥＳ細胞を発生分化中の胚に注入し、その胚と一体化させる。「遺伝子の破壊」および「遺伝子破壊」なる語句は、ネイティブＤＮＡ配列の１の領域（通常、１以上のエクソン）および／または遺伝子のプロモーター領域に核酸配列を挿入して、該遺伝子の野生型もしくは自然に生じる配列と比較して、細胞中でその遺伝子の発現を低下させもしくは妨げることをいう。例えば、破壊すべきＤＮＡ配列（プロモーターおよび／または暗号領域）に相補的なＤＮＡ配列に挿入された抗生物質耐性遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含有する核酸構築体を調製することができる。次いで、この核酸構築体を細胞にトランスフェクトすると、該構築体はゲノムＤＮＡに組み込まれるであろう。かくして、当該ＤＮＡは今や抗生物質耐性遺伝子によって破壊されたので、該細胞の多くの後代は少なくともいくつかの細胞において当該遺伝子をもはや発現しないか、あるいは低レベルでしか発現しないであろう。「トランスジーン」なる語は、哺乳動物または哺乳動物胚の１以上の細胞に挿入することができる単離されたヌクレオチド配列をいう。該トランスジーンは、所望により、細胞装置と協同して直接的にまたは間接的に当該トランスジーンの転写および／または発現を変調するよう働くことができる（プロモーター、ポリＡ配列等のごとき）他の遺伝エレメントに作動可能に連結していてもよい。別法としてまたはさらに、該トランスジーンは、哺乳動物の細胞もしくは胚の核の染色体ＤＮＡに当該トランスジーンを（例えば、相同遺伝子組換えによって）組み込むのを助けるヌクレオチド配列に連結されていてもよい。該トランスジーンは、哺乳動物の内因性遺伝物質中の特定のヌクレオチド配列に対して相同もしくは非相同であるヌクレオチド配列よりなるものであってよく、あるいはハイブリッド配列であってもよい（すなわち、該トランスジーンの１以上の部分が当該哺乳動物の遺伝物質に対して相同であるか、あるいは１以上の部分が非相同である）。該トランスジーンヌクレオチド配列は当該哺乳動物に本来見い出されるポリペプチドまたはポリペプチドの変異体をコードするものであってよく、それは、当該哺乳動物において自然には生じないポリペプチド（すなわち、外来性ポリペプチド）をコードするか、あるいはそれは、内因性もしくは外来性ポリペプチドのハイブリッドをコードするものであってもよい。該トランスジーンがプロモーターに作動可能に連結している場合、該プロモーターは当該哺乳動物および／またはトランスジーンに対して同種または異種であってよい。別法として、プロモーターは内因性および外来性プロモーターエレメント（エンハンサー、サイレンサー、サプレッサー等）のハイブリッドあってもよい。「ＣＤ２８」および「ＣＤ２８受容体」なる語は、免疫系のある種の細胞、特にＴ細胞で発現される細胞表面受容体蛋白質をいう。ＣＤ２８とそのリガンドＢ７／ＢＢ１との結合は、Ｔ細胞の活性化に必要な本質的共同剌激性シグナルであると信じられている。「ＣＤ４５」、「ＣＤ４５受容体」および「Ｌ−ＣＡ」なる語は、多くのタイプの造血細胞の表面で発現される細胞表面受容体糖蛋白質をいう。ＣＤ４５は、分子量が約１８０ｋＤないし約２３５ｋＤの範囲の多重のイソ型タンパク質を有する。異なる造血細胞系はＣＤ４５の異なるイソ型タンパタ質を発現し、いくつかの細胞は１を超えるイソ型タンパク質を発現し得る。本明細書中で用いるごとく、ＣＤ４５とは、これらのイソ型タンパタ質のいずれかまたは全てをいう。「ＣＤ４５エクソン６イソ型タンパク質」なる語は、ＣＤ４５遺伝予のエクソン６（ならびに他のエクソン）を発現するＣＤ４５イソ型タンパク質をいう。「ＣＤ４５エクソン６イソ型タンパク質ノックアウト構築体」とは、エクソン６（ならびに他のエクソン）を発現するＣＤ４５イソ型タンパク質の発現を抑制するように設計されたノックアウト構築体をいう。「ＣＤ４５ＲＯ」なる語は、ＣＤ４５遺伝子のエクソン４、５および６が発現されないＣＤ４５イソ型タンパク質をいう。「マーカー配列」なる語は、（１）（例えば、ＣＤ２８またはＣＤ４５のごとき）注目する遺伝子（類）の発現を破壊するために核酸構築体（すなわち、「ノックアウト構築体」）の一部として用いられる、および（２）ノックアウト構築体をゲノムに組み込んだ細胞を同定する手段として用いられる核酸配列をいう。マーカー配列は、典型的には、抗生物質耐性遺伝子のごとき当該細胞に検出可能な特性を付与する蛋白質または当該細胞で典型的には見い出されないアッセイ可能な酵素をコードする配列ということになろうが、これらの目的を達成するいずれの配列であってもよい。マーカー配列が蛋白質をコードする場合、該マーカー配列は、典型的には、その発現を調節するプロモーターも含有するであろう。「齧歯動物」および「齧歯動物類」なる語は、そこから由来する全ての将来の世代の何れかのおよび全ての後代を含めた、系統発生の目である齧歯目の全てのメンバーをいう。「ネズミ」なる語は、ラットおよびマウスを含めた、ネズミ科の何れかのおよび全てのメンバーをいう。「後代」なる語は、特定の哺乳動物、すなわちそのゲノムＤＮＡに挿入されたノックアウト構築体を含有する哺乳動物に由来するおよびその子孫である何れかのおよび全ての将来の世代をいう。かくして、本明細書中においては、後代であるＦ１、Ｆ２、Ｆ３世代等がこの定義に限りなく包含されるように、何れかの続く世代の後代をも含む。「免疫調節する」および「免疫調節」なる語は、特定の種についての免疫系の成分の平均活性と比較して、何れかのその成分の活性のレベルの変化をいう。かくして、本明細書中で用いるごとく、免疫調節とは、活性の増大もしくは低下をいう。免疫調節は、Ｂ細胞、何れかのもしくは全てのタイプのＴ細胞、抗原提示細胞、その他免疫機能に関与すると信じられている全ての細胞のレベルをアッセイすることによって検出することができる。加えてあるいは別法として、免疫調節は、１）免疫系で役割を有すると信じられている特定の遺伝子の発現レベル、２）サイトカイン（インターロイキン等）のごとき特定の化合物または免疫系で役割を有する他の分子のレベル、および／または、３）免疫系の機能発揮に関与する特定の酵素、蛋白質等のレベルを評価することによって検出することができる。「作動可能に連結した」なる語は、エレメントが機能的に結合し、かつ相互に作用できるような、相互に対する種々のヌクレオチド配列の配置をいう。かかるエレメントは、１種以上のプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列、およびトランスジーンを包含するが、限定されるものではない。適当な向きである場合、すなわち作動可能に連結した場合、ヌクレオチド配列エレメントは一緒に相互の活性を変調するよう作用し、結局は、トランスジーン（類）の発現レベルに影響し得る。変調とは、特定のエレメントの活性レベルの増大、低下、または維持を意味する。他のエレメントに対する各エレメントの位置は、各エレメントの５’末端および３’末端の表現で表すことができ、また、何れかの特定のエレメント間の距離は当該エレメント間に介在するヌクレオチド、もしくは塩基対の数によって参照することができる。「生物学的に活性な断片」なる語は、遺伝子もしくはトランスジーンの全長のゲノムもしくはｃＤＮＡヌクレオチド配列より短いが、生物学的に活性な断片の遺伝子（もしくはトランスジーン）産物が全長配列の遺伝子産物によって保有される生物学的活性の少なくとも一部を保有するように、全長ヌタレオチド配列の十分な部分を含有するヌタレオチド配列をいう。ノックアウト技術１．ノックアウト遺伝子（類）の選択ノックアウトすべき遺伝子は何れの遺伝子であってもよいが、破壊すべきＤＮＡ上の少なくともいくらかの配列情報がノックアウト構築体およびスクリーニングプローブ双方の調製で利用可能であることを条件とする。通常、ノックアウト構築体で使用すべきＤＮＡは１以上のエクソンおよび／またはイントロン領域、および／またはプロモーター領域となろうが、ｃＤＮＡが十分に大きいことを条件にｃＤＮＡ配列であってもよい。一般に、ＤＮＡは少なくとも約１キロベース（ｋｂ）長、好ましくは３〜４ｋｂ長であり、それにより、ノックアウト構築体を（後記する）ＥＳ細胞のゲノムＤＮＡに挿入した場合、ハイブリダイゼーションに十分な相補的配列が供される。典型的には、ノックアウトすべき遺伝子は、１）成熟および／または未成熟Ｔ細胞および／またはＢ細胞で発現され、２）免疫系による炎症または免疫抑制反応の間に活性化経路に直接または間接的に関与し、かつ３）ノックアウトされた場合に致死とはならない遺伝子ということになろう。ノックアウトすべき好ましい遺伝子はＣＤ２８およびＣＤ４５遺伝子である。本発明の範囲内には、２以上の遺伝子がノックアウトされた哺乳動物が含まれる。かかる哺乳動物は、各ノックアウト構築体を創製するために本明細書中に記載する手法を繰り返すことによって、あるいは各々がノックアウトされた単一の遺伝子を持つ哺乳動物を相互に交配させ、次いで、二重ノックアウト遺伝子型を持つものをスクリーニングすることによって作出することができる。選択した遺伝子をノックアウトするのに用いるＤＮＡ配列は、Sambrookら（Mo lecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Pres s，Cold Spring Harbor，NY［1989］）によって記載されているもののごとき当該分野でよく知られた方法を用いて得られる。かかる方法は、例えば、ゲノム配列の少なくとも一部を得るための、同一遺伝子の少なくとも一部をコードするｃＤＮＡプローブを用いてのゲノムライブラリーのスクリーニングを含む。別法として、ｃＤＮＡ配列をノックアウト構築体で用いるべき場合、該ｃＤＮＡは、オリゴヌクレオチドプローブまたは抗体を用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる（該ライブラリーは発現ベクターにクローン化されている）。プロモーター配列をノックアウト構築体で用いるべき場合、該プロモーター配列を含有するゲノムライブラリーをスクリーニングするために合成ＤＮＡプローブを設計することができる。ノックアウト構築体で用いるべきＤＮＡを得るための別の方法は、ＤＮＡ合成器を用いてＤＮＡ配列を合成により作製することである。ノックアウト構築体をコードするＤＮＡ配列は遺伝子操作およびＥＳ細胞への挿入のために十分な量を作製しなければならない。増幅は、１）当該配列を適当なベクターに入れ、次いで、容易に該ベクターを増幅できる細菌もしくは他の細胞を形質転換することによって、２）ＰＣＲ増幅によって、または３）ＤＮＡ合成器での合成によって行うことができる。２．ノックアウト構築体の作製ノックアウト構築体を産生するのに用いるべきＤＮＡ配列を、特定の位置で切断するように選択した特定の制限酵素で消化して、マーカー遺伝子をコードする新しいＤＮＡ配列がこのＤＮＡ配列内の適当な位置に挿入されるようにする。マーカー遺伝子挿入のための適当な位置は、ネイティブな遺伝子の発現を妨げるように働く位置であり；この位置は、切断すべき配列中の制限部位のごとき種々の因子、およびエクソン配列かまたはプロモーター配列か、あるいは双方が妨げられるか否か（すなわち、プロモーター機能を阻害する、またはネイティブエクソンの合成を阻害するのに必要な挿入の正確な位置）に依存するであろう。好ましくは、ＤＮＡを切断するのに選択した酵素により、より長いアームとより短いアームとが生じ、ここに、より短いアームは少なくとも約３００塩基対（ｂｐ）である。ある場合には、抑制すべき遺伝子の１以上のエクソンの一部または全てさえを現実に除去して、マーカー遺伝子がノックアウト構築体に挿入された場合に元のゲノム配列に匹敵するノックアウト構築体長を維持するのが望ましいであろう。これらの場合、ゲノムＤＮＡは、適当なサイズの断片が除去できるように、適当な制限エンドヌクレアーゼで切断する。マーカー遺伝子は検出可能なおよび／またはアッセイ可能な何れの核酸配列であってもよいが、典型的には、抗生物質耐性遺伝子、あるいはその発現または当該ゲノムにおける存在が容易に検出できる他の遺伝子である。通常、マーカー遺伝子は、それ自身のプロモーターに、あるいはそれが挿入された細胞で活性であるかまたは容易に活性化できる何れかの入手源からの他の強力なプロモーターに作動可能に連結されている；しかしながら、マーカー遺伝子は抑制すべき遺伝子のプロモーターを用いて転写できるので、連結されたそれ自身のプロモーターを有する必要はない。加えて、マーカー遺伝子は、通常、当該遺伝子の３’末端に結合したポリＡ配列を有し；この配列は当該遺伝子の転写を終結させるよう働く。好ましいマーカー遺伝予はｎｅｏ（ネオマイシン耐性遺伝子）およびβ−ｇａｌ（ベーターガラクトシダーゼ）のごとき何れかの抗生物質耐性遺伝子である。ゲノムＤＮＡ配列を適当な制限酵素で消化した後、当業者によく知られ、また、Sambrookら（前掲）に記載されている方法を用いてマーカー遺伝子配列をゲノムＤＮＡ配列に連結する。連結すべきＤＮＡ断片の末端は適合すべきものでなければならず；これは、適合末端を生じる酵素で全ての断片を切断するか、あるいは連結に先立って末端を平滑にすることによって達成される。平滑化は、例えば粘着末端を満たすためのクレノウ断片（ＤＮＡポリメラーゼＩ）の使用のごとき、当該分野でよく知られた方法を用いてなされる。連結したノックアウト構築体は（後記する）胚性幹細胞に直接挿入できるか、あるいは挿入に先立って増幅用の適当なベクターにまず入れることができる。好ましいベクターは、pBluescript II ＳＫベタター（Stratagene，San Diego，CA）またはｐＧＥＭ７（Promega Corp，Madison，WI）のごとき細菌細胞で容易に増幅されるものである。３．胚性細胞のトランスフェクション本発明は、限定されるものではないが、ウサギ、ラット、ハムスターおよびマウスを含めた齧歯類の何れかの種からノックアウト哺乳動物を作出することに関する。好ましい齧歯類は、ラットおよびマウスを含めたネズミ科のメンバーを含む。一般に、ノックアウト哺乳動物を作出するのに用いる胚性幹細胞（ES細胞）は、創製すべきノックアウト哺乳動物と同一の種となろう。かくして、例えば、マウス胚性幹細胞をノックアウトマウスの創製で通常使用することとなろう。典型的には、胚性幹細胞は、発生分化中の胚の生殖系に取り込まれその一部となって、ノックアウト構築体の生殖系伝達を生じるその能力について選択される。かくして、この能力を有すると考えられる何れのＥＳ細胞も本発明で適する。ＥＳ細胞の産生で典型的に用いられる１のマウス株は１２９Ｊ株である。好ましいＥＳ細胞系はネズミ細胞系Ｄ３である（American Type Culture Collectionカタログ番号ＣＲＬ１９３４）。Robertson（Teratocarcinomas and Embryonic St em Cells：A Practi cal Approach，E.J．Robertson編、IRL Press、Washington，D.C.［1987］）およびBradleyら（Current Topics in Devel．Biol.，20:357-371［1986］）およびHoganら（Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual，Cold Spri ng Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor，NY［1986］）によって記載されているごとき当業者によく知られた方法を用いて、細胞を培養し、調製する。ノックアウト構築体のＥＳ細胞への挿入は、例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、およびリン酸カルシウム処理（Lovell-Badge，in Robertson編，前掲参照）を含めた当該分野でよく知られた種々の方法を用いて達成できる。好ましい挿入方法はエレクトロポレーションである。ノックアウト構築体が既にベクターに挿入されているならば、細胞に挿入すべき各ノックアウト構築体ＤＮＡはまず線状化しなければならない。線状化は、ベクター配列内でのみ切断し、かつノックアウト構築体配列内では切断しないように選択された適当な制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡを消化することによって達成される。ＤＮＡ配列の挿入には、選択した挿入方法に適した条件下でノッタアウト構築体ＤＮＡをＥＳ細胞に添加する。１を超える構築体をＥＳ細胞に挿入すべき場合、各構築体をコードするＤＮＡを同時あるいは一度に挿入することができる。細胞をエレクトロポレーションに付すべきならば、エレクトロポレーション機器を用い、かつ製造業者の使用ガイドラインに従って、ＥＳ細胞およびノックアウト構築体ＤＮＡを電気パルスに暴露する。エレクトロポレーションの後、適当なインキュベーション条件下で細胞を回収する。次いで、該細胞をノックアウト構築体の存在につきスクリーニングする。スクリーニングは、種々の方法を用いて行うことができる。マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子である場合、致死濃度の抗生物質の存在下で細胞を培養する。生き残った細胞は恐らくはノックアウト構築体を取り込んだものである。マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子以外である場合、ＥＳ細胞ゲノムＤＮＡのサザンブロットを、マーカー配列に対してのみハイブリダイズするように設計されたＤＮＡ配列でプローブすることができる。最後に、マーカー遺伝子が、その活性が検出できる酵素（例えば、ベーターガラクトシダーゼ）をコードする遺伝子である場合、適当な条件下で酵素基質を細胞に添加し、酵素活性を分析することができる。ノックアウト構築体はＥＳ細胞ゲノムのいくつかの位置で取り込まれ、ランダム挿入事象の発生のため、各細胞ゲノムの異なる位置に取り込まれる；所望の挿入位置はノックアウトすべきＤＮＡ配列に対して相補的位置である。典型的には、ノックアウト構築体を取り込むＥＳ細胞の約１〜５パーセント未満が実際にはノックアウト構築体を所望の位置に取り込む。ノックアウト構築体を適切に取り込んだ細胞を同定するには、Sambrookら（前掲）によって記載されているもののごとき標準的な方法を用いてＤＮＡを細胞から抽出することができる。次いで、該ＤＮＡを、特定の制限酵素（類）で消化したゲノムＤＮＡに対して特異的パターンでハイブリダイズするように設計されたプローブもしくはプローブ類を用いてサザンブロットにプローブできる。別法として、または加えて、ゲノムＤＮＡは、特定のサイズおよび配列のＤＮＡ断片を増幅するように特別に設計されたプローブを用いるＰＣＲによって増幅することができる（すなわち、適当な位置にノックアウト構築体を含有する細胞のみが適当なサイズのＤＮＡ断片を生じるであろう）。４．胚の注入／移植適当な位置にノックアウト構築体を含有する適当なＥＳ細胞を同定した後、該細胞を胚に挿入する。挿入は種々の方法で達成できるが、好ましい方法はマイクロインジェクションによるものである。マイクロインジェクションでは、約１０〜３０個の細胞をマイクロピペットに収集し、適当な発生分化の段階にある胚に注入して、ＥＳ細胞を発生分化中の胚に取り込ませる。胚の適当な発生分化段階は非常に種依存的であるが、マウスでは、それは約３ .５日齢である。該胚は妊娠した雌の子宮を潅流することによって得られる。これを達成するための適当な方法は当業者に知られており、また、Bradley（Robertson編、前掲）によって記載されている。正しい年齢／発生分化の段階の何れの胚も使用するのに適するが、好ましい胚は雄であって、ＥＳ細胞遺伝子によってコードされた体毛色とは異なる体毛色についてコードする遺伝子を有する。このようにして、子孫は、（ＥＳ細胞が発生分化中の胚に取り込まれたことを示す）モザイク体毛色を探すことによって、ノックアウト構築体の存在につき容易にスクリーニングすることができる。かくして、例えば、ＥＳ細胞系が白色体毛についての遺伝子を担持すれば、選択される胚は黒色体毛または茶色体毛についての遺伝子を担持するであろう。ＥＳ細胞を胚に導入した後、該胚を偽妊娠仮親の子宮に移植する。何れの仮親を用いることもできるが、それらは、典型的には、交配し十分に再生するその能力、およびその子供を世話する能力について選択される。かかる仮親は、典型的には、同一種の精管切除した雄と交配させることによって作製される。偽妊娠仮親の段階は移植が成功するために重要であり、それは種依存的である。マウスについては、この段階は偽妊娠約２〜３日である。５．ノックアウト遺伝子の存在についてのスクリーニング仮親から生まれた子孫はまず体毛色についてスクリーニングすることができ、そこでは、（前記したごとき）体毛色選択戦略が用いられる。加えて、あるいは別法として、子孫の尾組織からのＤＮＡは、前記したサザンブロットおよび／またはＰＣＲを用いて、ノックアウト構築体の存在についてスクリーニングすることができる。次いで、モザイクであるように見える子孫がその生殖系にノックアウト構築体を担持してホモ接合ノックアウト動物を生じると考えられる場合は相互に交配させる。もし子孫が生殖系伝達を有するか否かが明確でないならば、それらを親または他の株と交配させ、子孫のヘテロ接合性についてスクリーニングする。該ヘテロ接合体は、前記したごとく、ＤＮＡのサザンブロットおよび／またはＰＣＲ増幅によって同定される。次いで、ヘテロ接合体を相互に交配させてホモ接合ノックアウト子孫を得る。ホモ接合体は、この交配の作出物であるマウス、ならびにヘテロ接合体であることが知られているマウスおよび野生型マウスからの等量のゲノムＤＮＡをサザンブロッティングに付すことによって同定することができる。サザンブロットをスクリーニングするためのプローブは前記したごとくに設計できる。ノックアウト子孫を同定し特徴付ける他の手段が利用できる。例えば、ノックアウトされた遺伝子、マーカー遺伝子、または双方をコードする転写体の存在または不存在についてｍＲＮＡをプローブするのにノーザンブロットを用いることができる。加えて、ノックアウトされた遺伝子によってコードされた蛋白質に対する抗体、またはこの遺伝子が発現された場合はマーカー遺伝子産物に対する抗体でウェスタンブロットをプローブすることによって、これらの子孫の種々の組織におけるノックアウトされた遺伝子の発現レベルを評価するのにウェスタンブロットを用いることができる。最後に、ノックアウト構築体遺伝子産物の存在または不存在を探すのに適した抗体を用いて、子孫からの種々の細胞の（細胞を固定し抗体で標識するごとき）in situ分析および／またはＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取）分析を行うことができる。トランスジーン技術１．トランスジーン（類）の選択典型的には、本発明で有用なトランスジーン（類）は、免疫応答、造血、炎症、細胞の成長および増殖、細胞系分化、および／またはストレス反応に関与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であろう。好ましいトランスジーンは、ＣＤ４５の種々のイソ型タンパク質、特にＣＤ４５ＲＯのごとき免疫系のポリペプチドからなるものである。２以上のトランスジーンの哺乳動物への挿入は本発明の範囲内に含まれる。１を超えるトランスジーンを本発明で用いる場合、該トランスジーンは個々に調製し挿入することができるか、あるいは挿入用の１の構築体として一緒に作製することができる。該トランスジーンは各トランスジーンの発現を駆動する選択されたプロモーター双方に対して、および／または哺乳動物に対して同種または異種であってよい。さらに、トランスジーンは全長ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ配列、あるいは少なくともいくらかの生物学的活性を有する、すなわち、同一種の野生型、非トランスジェニック哺乳動物で容易には観察されない（生物学的、細胞的および／または形態学的）何れかのレベルの効果を呈するどのような断片、サブユニットもしくは突然変異体であってもよい。所望により、トランスジーンはハイブリッドヌタレオチド配列であってもよい、すなわち、同種および／または異種ｃＤＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡ断片から構築された配列であってもよい。また、トランスジーンは、所望により、１以上の自然に生じるｃＤＮＡおよび／またはゲノム配列の突然変異体、またはその対立遺伝子変異体であってもよい。当該分野でよく知られた１以上の方法を用いて、各トランスジーンを適量にて単離し、得ることができる。トランスジーンを単離するのに有用なこれらの方法および他の方法は、例えば、Sambrookら（Molecular Cloning：A Laboratory Ma nual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY［1989 ］）およびBerg erおよびKimmel（Methods in Enzymology：Guide to Molecular Cloning Techni ques，vol.152，Acadcmic Press，Inc.，San Diego，CA［1987］）に記載されている。各トランスジーンのヌクレオチド配列が知られている場合、Engelsら（Angrew ．Chem．Int．Ed．Engl.，28:716-734［1989］）に記載されているごとき化学合成法を用いて、トランスジーンを全部または部分的に合成することができる。これらの方法は、とりわけ、核酸合成のホスホトリエステル、ホスホルアミダイトおよびＨ−ホスホネート方法を包含する。別法として、トランスジーンＤＮＡと選択的にハイブリダイズする１以上の核酸プローブ（クローン化すべきトランスジーンに対する許容されるレベルの相同性を有するオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）を用いて適当なｃＤＮＡまたはゲノムラリブラリーをスクリーニングすることによってトランスジーンを得ることができる。トランスジーンを得るための他の適当な方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。しかしながら、この方法を首尾よく使用するには、適当なヌクレオチド配列を増幅するのに有用である適当なオリゴヌクレオチドプライマーを設計するために、トランスジーンのヌタレオチド配列について十分な情報が入手できることが必要である。選択した方法がオリゴヌクレチオドプライマーもしくはプローブの使用を必要とする場合（例えば、ＰＣＲ、ｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリースクリーニング）、プローブまたはプライマーとして選択したオリゴヌクレオチド配列は、ライブラリーのスクリーニングまたはＰＣＲの間に起こるであろう非特異的結合の量を最小化するために、適当な長さであって十分に明確でなければならない。プローブまたはプライマーの現実の配列は、通常、他の生物からの同一または同様の遺伝子からの保存されたまたは高度に相同性の配列や領域に基づくものである。所望により、プローブまたはプライマーは縮重していてもよい。トランスジーンのアミノ酸配列のみが知られている場合、プローブ可能で機能的な核酸配列は、各アミノ酸残基についての公知かつ好ましいコドンを用いてトランスジーンにつき推定できる。次いで、この配列を化学的に合成することができる。本発明ではトランスジーン突然変異体配列の使用が考えられる。突然変異体トランスジーンは、野生型配列と比較して、１以上のヌクレオチドの置換、欠失、および／または挿入を含有するトランスジーンである。ヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入は、野生型アミノ酸配列とはそのアミノ酸配列が異なる遺伝子産物（すなわち、蛋白質）を生じ得る。かかる突然変異体の作製は当該分野でよく知られており、例えばWellsら（Gene，34:315［1985］）およびSambrook ら（前掲）に記載されている。２．調節エレメントの選択本発明におけるトランスジーンは、典型的には、プロモーターに作動可能に連結しており、ここに、プロモーターは各トランスジーンの発現を個々に調節するように選択される。１を超えるトランスジーンを用いるべき場合、各トランスジーンは同一または異なるプロモーターによって調節することができる。選択されたプロモーターは同種（すなわち、トランスジーンでトランスフェクトすべき哺乳動物と同一の種からのもの）であるか、あるいは異種（すなわち、トランスジーンでトランスフェクトすべき哺乳動物の種以外の入手源からのもの）であってよい。それ自体、各プロモーターの入手源は単細胞生物、原核生物または真核生物、あるいはいずれかの脊椎動物または無脊椎動物からのものであってよい。本発明におけるより好ましいプロモーターは、ヒトβ−グロブリン３’領域およびマウスＩｇμエンハンサーに作動可能に連結されたＣＤ４５プロモーター、マウスｌｃｋプロモーター、およびマウスＨ−２ｋｂプロモーターのごとき、免疫系の遺伝子の発現を調節するプロモーターである。最も好ましいプロモーターはマウスｌｃｋプロモーターである。発現の綿密な調節を可能にするために、本発明におけるプロモーターは、単独で、あるいは同種および／または異種エンハンサーおよび／またはサイレンサーと組み合わせて用いることができる。本発明におけるプロモーターのヌクレオチド配列は、当該分野でよく知られたいくつかの方法のうち何れかによって得ることができる。典型的には、本発明で有用なプロモーターはマッピングによっておよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって予め同定されているであろうし、かくして、適当な制限エンドヌクレアーゼを用いて適当な組織源のゲノムＤＮＡから単離することができる。ある場合においては、プロモーターは配列決定されているであろう。そのヌクレオチド配列が知られているプロモーターについては、該プロモーターはトランスジーン合成について前記した方法を用いて合成することができる。プロモーター配列の全てまたは一部のみが知られている場合、該プロモーターは、ＰＣＲを用いて、および／または適当なオリゴヌクレオチドおよび／または同一または他の種からのプロモーター配列断片でゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。プロモーター配列が知られていない場合、例えば、暗号配列または他の遺伝子または遺伝子類さえも含有し得るＤＮＡの大きな断片から、プロモーターを含有するＤＮＡの断片を単離することができる。単離は、１以上の注意深く選択した酵素を用いて制限エンドヌクレアーゼ消化して、適当なＤＮＡ断片を単離することによって達成できる。消化の後、所望の断片を、アガロースゲル精製、Qiagen^Rカラム（Qiagen Corp.，Chatsworth ，CA）または当業者に知られている他の方法によって単離する。この目的を達成するのに適した酵素の選択は当業者には容易に明らかとなるであろう。３．他のベクター成分の選択トランスジーンおよびプロモーターに加えて、本発明におけるトランスジーンを作製するのに有用なベクターは、典型的には、（１）トランスジーンが挿入される哺乳動物におけるトランスジーンの最適発現、および（２）細菌または哺乳動物宿主細胞におけるベクターの増幅に有用な１以上の他のエレメントを含有する。これらのエレメントの各々は、その各活性を最大化するように各他のエレメントに対してベクター中にて適当に位置させることとなろう。かかる位置付けは当業者によく知られている。以下のエレメントは、所望により、適当なものとしてベタターに含ませることができる。ｉ．シグナル配列エレメントトランスジーンによってコードされるポリペプチドが分泌されるべきである場合の本発明の具体例については、シグナル配列と呼ばれる小さなポリペプチドをしばしば存在させて、トランスジーンによってコードされたポリペプチドを、それが合成される細胞から外へと方向付ける。典型的には、シグナル配列は、トランスジーンの暗号領域中に、あるいは暗号領域の５’末端に位置させる。多くのシグナル配列が同定されており、機能的であって、かくして、トランスジェニック組織に適合するもののうち何れもトランスジーンと一緒に使用することができる。従って、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列はトランスジーンに対して同種または異種であってよく、また、トランスジェニック哺乳動物に対して同種または異種であってよい。加えて、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、前記した方法を用いて化学的に合成することができる。しかしながら、本発明の目的では、好ましいシグナル配列はトランスジーンに関して自然に生じるものである（すなわち、トランスジーンに対して同種である）。ｉｉ．膜固定ドメインエレメントいくつかの場合において、特定の細胞内膜の表面または原形質膜で発現されるトランスジーンを有するのが望ましいであろう。自然に生じる膜蛋白質は、ポリペプチドの一部として、蛋白質を膜に固定するよう働くアミノ酸のストレッチを含有する。従って、自然には膜上に見い出されない蛋白質について、アミノ酸のかかるストレッチをこの特徴を付与するために付加することができる。しばしば、アンカードメインはポリペプチド配列の内部部分であり、かくして、それをコードするヌクレオチド配列をトランスジーンヌクレオチド配列の内部領域に入れることとなろう。しかしながら、他の場合においては、アンカードメインをコードするヌクレオチド配列をトランスジーンヌクレオチド配列の５’または３’末端に連結することもできる。ここに、アンカードメインをコードするヌクレオチド配列を、まず、トランスジーンをコードするヌクレオチド配列からの別の成分として、適当な位置にてベクターに入れることができる。シグナル配列に関しては、アンカードメインは何れの入手源からのものであってもよく、かくして、トランスジーンおよびトランスジェニック哺乳動物双方に対して同種または異種であってよい。別法として、アンカードメインは前記した方法を用いて化学的に合成することができる。 iii．複製起点エレメントこの成分は、典型的には、商業的に購入した原核生物発現ベクターの一部であり、宿主細胞においてベクターの増幅を助ける。選択したベクターが複製起点部位を含有しないならば、公知の配列に基づいて化学的に合成し、ベタターに連結することができる。 iv．転写終結エレメントポリアデニル化またはポリＡ配列としても公知のこのエレメントは、典型的には、ベクター中でトランスジーンヌクレオチド配列に対して３’側に位置させ、トランスジーンの転写を終結させるように働く。このエレメントをコードするヌクレオチド配列は容易にライブラリーからクローン化されるか、あるいはベクターの一部として商業的に購入されるが、前記したごときヌクレオチド配列合成方法を用いて容易に合成することができる。 v．イントロンエレメント多くの場合において、トランスジーンの転写は、クローニングベクター上における１のイントロンまたは（エクソンによって連結された）１を超えるイントロンの存在によって増大される。該イントロン（類）は、トランスジーンヌクレオチド配列内に、特に該トランスジーンがゲノムＤＮＡ配列の全長物であるかまたはその断片である場合に自然に生じ得る。イントロン（類）がヌクレオチド配列内で自然に生じない場合（ほとんどのｃＤＮＡ）、イントロン（類）は他の入手源から得ることができる。イントロン（類）はトランスジーンに対しておよび／またはトランスジェニック哺乳動物に対して同種または異種であってよい。イントロンは転写されて有効とならなければならないので、プロモーターおよびトランスジーンに対するイントロンの位置は重要である。トランスジーンそれ自体がｃＤＮＡ配列である場合、イントロン（類）についての好ましい位置は転写スタート部位に対して３’側であって、ポリＡ転写終結配列に対して５’側である。好ましくは、ｃＤＮＡトランスジーンについては、イントロンは、それがトランスジーンヌクレオチド配列を中断しないように、該トランスジーンヌクレオチド配列の一方側もしくは他方側（すなわち、５’側もしくは３’側）に位置させることとなろう。何れのウイルス、原核および真核（植物または動物）生物も含めた、何れの入手源からの何れのイントロンを使用しても本発明を実施することができるが、それが挿入される宿主細胞（類）に適合することを条件とする。なお、合成したイントロンも含まれる。所望により、１を超えるイントロンをベクターで用いることもできる。イントロンおよびエクソンの好ましいセットはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ＤＮＡ配列である。 vi．選択マーカー（類）エレメント選択マーカー遺伝子は、選択培地で増殖した、トランスフェクトされた細胞の生存および増殖に必要なポリペプチドをコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質または他のトキシン、例えば、原核生物宿主細胞にはアンピシリン、テトラサイクリン、もしくはカナマイシン、および哺乳動物細胞にはネオマイシン、ヒグロマイシン、もしくはメトトレキセートに対して耐性を与える；（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補う；または（ｃ）複合培地からは入手できない非常に重要な栄養素、例えば、BaCilliの培養用のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子を、供給する蛋白質をコードする。前記したエレメントの全て、ならびに本発明で有用な他のものは当業者によく知られており、例えば、Sambrookら（Molecular Cloning：A Laboratory Manual ，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY［1989］）およびBergerら編（Guide to Molecular Cloning Techniques，Academic Press ，Inc.，San Diego，CA［1987］）に記載されている。４．クローニングベクターの構築本発明のトランスジェニック哺乳動物を作出するにおいて有用なトランスジーンカセットの増幅で最も有用なクローニングベクターは、原核細胞宿主に適合するものである。しかしながら、真核細胞宿主、およびこれらの細胞に適合するベクターは本発明の範囲内のものである。ある場合においては、クローニングベクターに含有されるべき種々のエレメントのいつくかは、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＧＥＭベクター（Promega Corp，Madison，WI）、pBIISK+/-のごときpBluescript^R（Stratagene Corp.，La Jolla，CA）等のような商業的に入手可能なクローニングもしくは増幅ベクター中に既に存在し得るものであり、それら全てが原核細胞宿主に適する。この場合、トランスジーンをベクターに挿入することのみが必要である。しかしながら、用いるべき１以上のエレメントがクローニングもしくは増幅ベクターに既に存在しない場合、それらを、個々に得て、個々にベクターに連結することができる。各エレメントを得てそれらを連結するのに用いる方法は当業者によく知られているか、あるいはトランスジーンを得るために前記した方法（すなわち、ＤＮＡの合成、ライブラリースクリーニング等）に同様である。トランスジーン（類）ヌクレオチド配列のタローニングもしくは増幅に、および／または哺乳動物胚のトランスフェクションに用いるベクターは当該分野でよく知られた方法を用いて構築される。かかる方法は、例えば、Sambrookら（前掲）に記載されたＤＮＡおよび／またはＲＮＡの制限エンドヌタレアーゼ消化、連結、アガロースおよびアタリルアミドゲル精製、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡのカラムクロマトグラフィー精製、ＤＮＡのフェノール／クロロホルム抽出、ＤＮＡ配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応増幅等の標準的な技術を含む。本発明を実施するのに用いる最終のベクターは、典型的には、商業的に入手可能なベクターのごとき出発のクローニングベクターまたは増幅ベクターから構築される。このベクターは、完成されたベクターに含むべきエレメントのいくつかを含有してしても、あるいは含有していなくてもよい。所望のエレメントの何れも出発ベクターに存在しなければ、連結すべきエレメントの末端およびベクターの末端が連結に適合するように、ベクターを適当な制限エンドヌクレアーゼ（類）で切断することによって、各エレメントを個々にベクターに連結することができる。いくつかの場合において、満足すべき連結を得るためには、一緒に連結すべき末端を「平滑とする」ことが必要であろう。平滑化は、まず、全ての４種のヌクレオチドの存在下でクレノウＤＮＡポリメラーゼまたはＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて「粘着末端」を満たすことによって達成される。この手法は当該分野でよく知られており、例えば、Sambrookら（前掲）に記載されている。別法として、ベクターに挿入すべき２以上のエレメントを（もしそれらが相互に隣接して位置すべき場合には）まず一緒に連結し、次いで、ベクターに連結することができる。ベクターを構築する１つの他の方法は、１つの反応混合物中にて種々のエレメントを同時に全て連結することを実行することである。ここに、多くのナンセンスもしくは非機能的ベクターが、エレメントの不適当な連結もしくは挿入に起因して生じるであろうが、機能的ベクターを同定し、制限エンドヌクレアーゼ消化によって選択することができる。ベクターを構築した後、増幅のためにそれを原核生物宿主細胞にトランスフェクトすることができる。増幅のために典型的に使用される細胞はイー・コリ（E ．coli.）ＤＨ５−アルファ（Gibco/BRL．Grand Island，NY）およびＤＨ５−アルファに類似の特性をもつ他のイー・コリ（E．coli.）株である。哺乳動物宿主細胞を用いる場合、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞；Urlab et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，77:4216［1980］）およびヒト胚性腎細胞系２９３（Graham et al.、J．Gen．Virol.，36:59［1977］）、ならびに他の細胞系が適当である。増幅用に選択した宿主細胞系へのベクターのトランスフェクションは、リン酸カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクションまたはＤＥＡＥ−デキストランのごとき方法を用いて達成される。選択する方法は、部分的には、トランスフェクトすべき宿主細胞の型と関係するであろう。これらの方法および他の適当な方法は当業者によく知られており、Sambrook ら（前掲）に記載されている。ベクターが十分に増幅されるのに十分に長い間細胞を培養した後（通常、イー・コリ（E．coli.）細胞については一晩）、（しばしばこの段階ではプラスミドと呼ばれる）ベクターを細胞から単離し、精製する。典型的には、細胞を溶解し、プラスミドを他の細胞内容物から抽出する。プラスミド精製に適した方法としては、とりわけ、アルカリ溶解ミニプレプ方法（Sambrook et al.、前掲）が含まれる。５．挿入用プラスミドの調製典型的には、トランスジーンを含有するプラスミドを線状化し、胚への挿入に先立って、選択された制限エンドヌクレアーゼを用いて、その部分を取り出す。いくつかの場合において、トランスジーン、プロモーター、および調節エレメントを、ベクターの他の部分から線状断片として単離し、それにより、トランスジーン、プロモーター、イントロン（使用すべき場合）、エンハンサー、ポリＡ配列、および所望によりシグナル配列もしくは胚への膜固定ドメインを含有する線状ヌクレオチドのみを注入するのが好ましい。これは、プラスミドを切断して、これらのエレメントを含有する核酸配列領域を取り出し、次いで、アガロース電気泳動または他の適当な精製方法を用いてこの領域を精製することによって達成することができる。６．トランスジェニック哺乳動物の産生トランスジェニック哺乳動物は当業者によく知られた方法を用いて容易に作製することができる。例えば、トランスジェニック齧歯類を作出するには、Hogan ら（Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual，Cold Spring Harb or Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York［1986］）によって記載されているごとき方法を使用することができる。本発明を実施するのに用いられる何れの哺乳動物種の特異的系列（類）も、胚の一般的良好な健康、良好な胚収率、良好な前核可視性、ならびに良好な再生適合性について選択される。加えて、ハプロタイプは重要な因子である。例えば、トランスジェニックマウスを産生すべき場合、（Charles River Labs，Boston， MA，The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME，またはTaconic Labs．から商業的に入手される）Ｃ５７ＢＬ／６またはＣ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ／２Ｆ₁、またはＦＶＢ系のごとき株をしばしば用いる。好ましい株はＣ５７ＢＬ／６またはＤＢＡ／１のごときＨ−２^b、Ｈ−２^dまたはＨ−２^qハプロタイプを持つものである。本発明を実施するのに用いる系（類）は、それ自体トランスジェニックであってよく、および／またはノックアウト（すなわち、部分的にまたは完全に抑制された１以上の遺伝子を有する哺乳動物）であってよい。好ましくは、同一の系を当初のノックアウト哺乳動物およびトランスジェニック哺乳動物双方の産生に用いる。これは、引き続いての交配および戻し交配をより効果的とするであろう。胚を得、代理宿主として働かせるのに用いられる哺乳動物の年齢は用いる種によるが、当業者によって容易に決定される。例えば、マウスを用いる場合、青春期前雌が好ましい。というのは、それらは多くの胚を生じ、ホルモン注射に対して良好に応答するからである。同様に、種雄として用いるべき雄哺乳動物は、他の基準の中でも、通常、性的成熟度の年齢によって選択されることとなろう。卵の生産、交配、および／または胚の再移植用の雌を作出するには、ホルモンまたは他の化学化合物の投与が必要となるであろう。ホルモン／助因子のタイプおよび用いる量、ならびにホルモン投与のタイミングは、哺乳動物の各々の種で変動し得る。かかる考慮は当業者に容易に明らかとなるであろう。典型的には、出発の雌（すなわち、受精できる卵を生産する雌）を種雄と交配させ、次いで、得られた受精胚をトランスジーン（類）の導入のために取り出す。別法として、卵および精子が適当な雌および雄から得られ、in vitro受精を用いてトランスジーンの導入に適した胚を得ることができる。通常、受精胚は前核が出現するまで適当な培地でインキュベートする。ほぼこの時点において、トランスジーンからなるヌクレオチド配列を前記した雌または雄の前核に導入する。マウスのごときいくつかの種において、雄の前核が好ましい。トランスジーンヌクレオチド配列の胚への導入は、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、またはリポフェクションのごとき当該分野で知られている何れの方法を用いても達成することができる。胚へのトランスジーンヌクレオチド配列の導入に続き、胚を種々の時間in vitroでインキュベートするか、あるいは代理宿主に再移植するか、あるいは双方を行うことができる。成熟するまでin vitroでインキュベーションすることは本発明の範囲内のものである。１つの通常の方法は、種に応じて、約１〜７日間、in vitroで胚をインキュベートし、次いで、それを代理宿主に再移植することである。再移植は標準的な方法を用いて達成される。用いるべき雌「仮親」株は、一般的な丈夫さおよび健康、ならびに子孫を世話するその能力について選択される。マウスの場合では、Ｃ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ１またはＣＤ１のごとき株が適当である。通常、代理宿主を麻酔し、胚を輸卵管に挿入する。特定の宿主に移植される胚の数は種によって変動するであろうが、通常は、該種が自然に生産する子孫の数に匹敵するであろう。代理宿主のトランスジェニック予孫は、何れかの適当な方法によって、トランスジーンの存在および／または発現についてスクリーニングすることができる。スクリーニングは、しばしば、トランスジーンの少なくとも一部に相補的なプローブを用いて、サザンブロットもしくはノーザンブロット分析によって達成される。トランスジーン産物の存在についてスクリーニングするには、トランスジーンによってコードされた蛋白質に対する抗体を用いるウェスタンブロットを別法またはさらなる方法として使用することができる。典型的には、ＤＮＡを尾組織から調製し（約１ｃｍを尾の先端から取り出す）、トランスジーンについてサザン分析またはＰＣＲによって分析する。別法として、何れかの組織または細胞型もこの分析で用いることもでき、トランスジーンを高レベルで発現すると考えられる組織または細胞を、サザン分析またはＰＣＲを用いて、トランスジーンの存在および発現につきテストする。トランスジーンの存在を評価する別法またはさらなる方法は、限定されるものではないが、酵素アッセイおよび／または免疫学的アッセイのごとき適当な生物化学的アッセイ、特定のマーカーもしくは酵素活性についての組織学的株、フローサイトメトリー分析等を含む。また、血液中のトランスジーン産物の存在を検出するには、ならびに種々のタイプの血液細胞および他の血液成分のレベルに対するトランスジーンの効果を評価するのは、血液の分析が有用である。トランスジェニック哺乳動物の後代は、トランスジェニック哺乳動物を適当なパートナーと交配させることによって、あるいはトランスジェニック哺乳動物から得られた卵および／または精子のin vitro受精によって得ることができる。パートナーとの交配を実行すべき場合、該パートナーはトランスジェニックおよび／またはノックアウトであってもなくてもよく；トランスジェニックである場合、それは同一または異なるトランスジーン、あるいは双方を含有することもできる。別法として、該パートナーは親系であってもよい。in vitro受精を用いる場合、受精胚を代理宿主に移植するか、またはin vitroでインキュベートするか、あるいはその双方を行うことができる。何れかの方法を用い、前記した、または適当な方法を使用して、トランスジーンの存在について後代を評価することができる。ノックアウト／トランスジェニック哺乳動物の作出１を超えるノックアウト構築体および／または１を超えるトランスジーンを含有する哺乳動物は、いくつかの方法のうち何れによっても作出される。好ましい作出方法は、各々が所望のノックアウト構築体もしくはトランスジーンのうちの１つを含有する、一連の哺乳動物を創製することである。かかる哺乳動物を一連の交配、戻し交配および選抜を通して一緒に育種して、最終的に結局、所望のノックアウト構築体および／またはトランスジーンの全てを含有する単一の哺乳動物を得るが、ここに、該哺乳動物は、その他の箇所においては、ノックアウト（類）構築体および／またはトランスジーン（類）の存在を除き、野生型に対してコンジェニック（遺伝的に同一）である。典型的には、交配および戻し交配は、育種プロセスの各個々の段階に応じて、同胞もしくは親株を子孫と交配させることによって達成される。ある場合には、各ノックアウト構築体および／またはトランスジーンを適当な染色体の位置に含有する単一の子孫を創製するために、非常に多くの子孫を創製する必要があるであろう。加えて、数世代にわたって交配もしくは戻し交配して、最終的に所望の遺伝子型を得ることが必要であろう。ノックアウト哺乳動物の用途抑制された遺伝子または遺伝子類に応じて、本発明の哺乳動物は種々の用途を有するであろう。抑制された遺伝子または遺伝子類が免疫抑制または炎症に関与すると考えられる蛋白質をコードする場合、該哺乳動物は免疫調節に有用な薬物、すなわち、これらの活性を増強もしくは阻害する薬物についてスクリーニングするのに用いることができる。有用な薬物についてのスクリーニングは、一定範囲の用量にわたって候補薬物をマウスに投与し、次いで、評価すべき免疫障害に対する薬物の免疫調節効果（類）について種々の時点でアッセイすることを含む。かかるアッセイは、例えば、増大もしくは低下したＴおよびＢ細胞レベル、増大もしくは低下した免疫グロブリン産生レベル、サイトカイン（例えば、インターロイキン等）のごとき化学メッセンジャーの増大もしくは低下したレベル、および／または増大もしくは低下した免疫応答に関与する特定の遺伝子の発現レベルを探すことを含む。例えば、化学療法を受けている患者は、しばしば、免疫抑制を体験する。免疫系を活性化する効果を生じることができる治療剤を患者に投与することによって、かかる個体の免疫系を活性化するのが望ましいであろう。本発明の哺乳動物は、単独または組み合わせて、種々の化合物をスクリーニングするのに用いて、免疫系の部分的もしくは全体的回復もしくは活性化が得られたか否かを判断するのに用いることができるであろう。同じ戦略は、関節炎を持つ多くの患者で観察される炎症反応を抑制するのに有用であるか、あるいは慢性関節リウマチおよび狼瘡を持つ患者で観察される自己免疫現象を抑制するのに有用であろう化合物を発見するのに適用できよう。加えて、本発明の哺乳動物は、免疫系の発達を評価するのに、また個々の遺伝子の突然変異を実験するのに有用であり得る。トランスジェニック／ノックアウト哺乳動物本発明のトランスジェニック／ノックアウト哺乳動物およびその後代は、発現されたトランスジーンおよびそれらが含有するノックアウト構築体に応じて、種々の用途を有するであろう。該哺乳動物は、敗血症または他の免疫学的疾患のごとき病気の予防的もしくは治療的処置に有用な薬物もしくは治療方法をスクリーニングするのに用いることができる。有用な薬物のスクリーニングは、まず、哺乳動物で病気を誘発し（すなわち、哺乳動物を敗血症を起こす病原体またはトキシンに暴露し）、次いで、一定範囲の用量にわたって候補薬物を該哺乳動物に投与し、評価すべき病気もしくは障害に対する薬物の効果（類）について種々の時点でアッセイすることを含むであろう。別法としてまたは加えて、病気の誘発に暴露する前に、またはそれと同時に、薬物を投与することができるであろう。病気または疾患を治療するのに用いる薬物をスクリーニングするに加えて、本発明の哺乳動物は、病気または疾患を防止しまたは治癒することを目的とする治療方法を設計するのに有用であろう。例えば、当該哺乳動物は、病気または疾患の開始に先立って、またはそれと同時に、またはその後に、特定の制限食、日常的運動、照射治療、および／または１以上の化合物もしくは物質を組み合わせて治療できるであろう。かかる全体的療法は、化合物単独での治療よりも病気または疾患と戦うのにより効果的であろう。化合物および／または治療方法の効果を評価するためのアッセイは、例えば、増大もしくは低下したＴおよびＢ細胞レベル、増大もしくは低下した免疫グロブリンの産生、サイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子等）のごとき化学メッセンジャーの増大もしくは低下したレベル、および／または増大もしくは低下した免疫応答に関与する特定の遺伝子の発現レベルを探すことを含むであろう。加えて、血圧、体温、体重、脈拍、挙動、体毛（波打った毛皮）の外観等のごとき基準を評価できるであろう。加えて、本発明の哺乳動物は、免疫系の発達を評価し、また、特定の遺伝子突然変異の効果を実験するのに有用であり得る。また、本発明のトランスジェニックノックアウト哺乳動物は、１以上の細胞系を創製するのに用いることができる。かかる細胞系は、例えば、特定の組織もしくは器官に対するトランスジーンノックアウトの効果（類）を評価し、また、組織中のトランスジーンの活性レベルに影響し得る化合物をスクリーニングするのに、多くの用途を有する。かかる化合物はトランスジーンの活性を調節する治療剤として有用であろう。かかる細胞系の産生は、当業者に知られている種々の方法を用いて達成することができる。実際の培養条件は、培養すべき細胞の組織および細胞型に依存するであろう。細胞の成長および増殖のための最適条件を決定するための余分な実験をしなくとも、異なる濃度のマクロおよびミクロの栄養素、成長因子、血清等を含有する種々の培地を細胞についてテストすることができる。同様に、細胞密度、培地温度、およびインキュベーター中の二酸化炭素濃度のごとき他の培養条件も容易に評価することができる。回復、およびこのプロセスに影響する化合物を同定することもできる。他の用途は当業者に容易に明らかとなるであろう。以下の実施例を参照すれば本発明はより十分に理解されるであろう。これらの実施例は本発明の範囲を限定するものとは断じて解釈されるべきでない。実施例Ｉ：ＣＤ２８ノッタアウトマウスの作出１．ノックアウトＤＮＡ構築体の作製ネズミＣＤ２８エクソン２ｃＤＮＡ配列をプローブとして用い、（Lee et a l.，J．Immunol.，145:344［1990］によって記載されている）ネズミＣＤ２８遺伝子のゲノムクローンを、ネズミＢＡＬＢ／ｃゲノムライブラリーから単離した。単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼプロモーターに連結したネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）をコードするＤＮＡ構築体を挿入することによって、イントロン１の３’末端およびエクソン２の５’末端を置き換えた。ｎｅｏＤＮＡ構築体は、プラスミドｐＭＣＩｎｅｏＰｏｌＡ（Thomas et al.，Cell，51:503［198 7］）を制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで消化することによって、該プラスミドから得た。ゲノム配列をＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切断することによってｎｅｏ配列をゲノムＣＤ２８配列に連結し、次いで、このｎｅｏ／ＣＤ２８ノックアウト構築体をベクターｐＧＥＭ７（Promega Corp．Madison ，WI）に連結した。このベタターを増幅のためにイー・コリ（E．coli）細菌株ＤＨ５アルファーに形質転換した。増幅の後、標準的なアルカリ溶解および精製用ＣｓＣｌグラジエントを用いて、該プラスミドを精製した。２．幹細胞のエレクトロポレーションおよび注入精製したプラスミドノックアウト構築体を制限ヌクレアーゼＡｔａＩＩで消化することによって線状化し、それにより、ｎｅｏ遺伝子の何れか側にＣＤ２８配列のより短いアームおよびより長いアームを生じさせた。次いで、線状化したノックアウト構築体を、以下のごとくに、胚性幹細胞系Ｄ３にトランスフェクトした：約５ｎｍｏｌの線状化ＤＮＡを容量約８００μｌの培地中の約５×１０⁶ＥＳ細胞に添加した。該細胞に０.３４キロボルトおよび２５０μＦにてパルスを与え、次いで、胚性繊維芽支持（フィーダー）細胞を含有し、１パーセントのゼラチンで予めコートし、かつ１０ｍｌＤＭＥＭ培地（Gibco/BRL，Grand Islan d，NY）、１５パーセント子ウシ血清（Gibco/BRL，Grand Island，NYまたはHycl one Labs，Logan，UTからの同等物）、および白血病抑制因子（Fung-Leung et a l.，Cell，65:443-449［1991］）を含有する２つの１０ｃｍ細胞培養プレート上で、細胞の各バイアルを平板培養した。２日後、２５０μｇ／ｍｌの抗生物質Ｇ４１８を培養に添加することによってｎｅｏ選択を開始した。Ｇ４１８の存在下で生存する細胞はほとんどノックアウト構築体を含有するようであった。次いで、これらの細胞をスクリーニングして、該細胞がノックアウト構築体をゲノムＤＮＡに組み込んだことを確認した。スクリーニングは、ＤＮＡ増幅用のポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）方法を用いて達成できた。２種のプライマーをＰＣＲで用いた。最初のプライマーはチミジンキナーゼプロモーターに特異的な配列に向けられたものであり、以下に記載する；第２のプライマーはＣＤ２８のイントロン２に特異的なものであり、これも以下に記載する。プライマー１（配列番号：１）：プライマー２（配列番号：２）：ＣＤ２８ノックアウト構築体を含有するＤ３細胞系は、受託番号ＣＲＬ１１３８２として、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）に寄託された。対照細胞およびトランスフェクトされた細胞からのゲノムＤＮＡのサザンブロットを分析して、ノックアウト構築体をゲノムＤＮＡ中の適当な位置および向きで含有するトランスフェクト細胞を評価した（すなわち、相同遺伝子組換えを受けた細胞を同定した）。サザンブロットは２種のプローブでプローブした。最初のプローブはＣＤ２８イントロン２の２００塩基対（ｂｐ）ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片であった。第２のプローブはｎｅｏ遺伝子の断片であって、（前記した）プラスミドｐＭＣｌＮｅｏＰｏｌＡをＨｉｎｄIIIおよびＸｈｏＩで消化し、標準的なアガロース電気泳動法を用いて１.２ｋｂ断片を単離することによって得たものであった。ゲノムＤＮＡに適切に挿入されたＣＤ２８−ｎｅｏインサートを含有する細胞系を、トリプシン処理と続くRobertson（Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：A Practical Approach，IRL Press，Washington，D.C.，［1987］，Rob ertson，E.J.編）によって記載されている方法により、ネズミ胚に注入して作製した。注入した胚は、雄マウスと交配させた雌マウスの子宮を灌流することによって得られた３.５日齢胚であった。胚性幹細胞を胚に注入した後、該胚を妊娠のための擬妊娠雌マウスに移植した。ノックアウト構築体の担持を検出することができるように、子孫は、相互にまたは適当な体毛色を持つマウスと交配させた。３．ノックアウト構築体用マウスのスクリーニングこれらの交配の子孫は、尾組織から得られたＤＮＡのサザンブロットを（前記した）ｎｅｏ遺伝子プローブでプローブすることによって、ノックアウト構築体の存在について評価した。該プローブは野生型マウスから得られたＤＮＡとはハイブリダイズしなかった。ノックアウトマウスおよび野生型マウスにおけるＣＤ２８発現のレベルを評価するために、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の２０ｍＭＥＤＴＡ１００μｌを含有する試験管に、尾出血からの約２５μｌの血液を収集することによって、末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）をこれらのマウスから得た。ＰＢＬは、（赤血球を溶血するための）Ｇｅｙの溶解緩衝液２ｍｌを血液溶液に添加し、１パーセントＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）および０.１パーセントのアジ化ナトリウムを補充したＰＢＳで２回洗浄することによって単離した。Pharmingen（San Diego，CA）から得られたハムスター抗−ネズミＣＤ２８モノクローナル抗体（０.２ｍｇ／ｍｌ溶液の５μｌ）が結合されたフィコエリトリン（ＰＥ）と共に、細胞をインキュベートした。次いで、ＰＢＬを１パーセントのパラホルムアルデヒドで固定した。各マウスにつき約５,０００個の細胞を分析した。次いで、ＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取；Becton-Dickinson［Mountain View，CA］ＦＡＣＳ装置を用いた）を用い、これらの細胞をＰＥ強度に基づいて分別した。４．ノックアウト遺伝子の効果の分析ホモ接合ノックアウトマウスおよび野生型マウスの胸腺細胞集団を、細胞表面ＣＤ４およびＣＤ８発現について評価した。ＣＤ８に向けられたＦＩＴＣ−結合モノクローナル抗体、またはＣＤ４に向けられたフィコエリトリン−結合モノクローナル抗体で胸腺細胞を染色した（抗体はBeckton-Dickinson，Mountain View ，CAから得た）。脾細胞は、ＦＩＴＣ標識抗Ｂ２２０およびＰＥ標識ストレプトアビジンで検出されるビオチン標識抗Ｂ７抗体で染色することによって、細胞表面マーカーＢ７の発現およびＢ細胞の量について評価した。細胞はＦＡＣＳによって分析し、約１０,０００細胞を各試料について分析した。全てのマウスは胸腺において正常なＣＤ４／ＣＤ８サブタイプを示し、これは、Ｔ細胞の発生分化がノックアウトマウスでは検出される程度には影響されていないことを示す。加えて、全てのマウスは同様のＢ細胞およびＢ７プロフィールを示し、これは、ノックアウトマウスは、Ｂ７発現のレベルが変化することによっては、突然変異とはならなかったことを示す。野生型、ヘテロ接合、およびホモ接合ノックアウトマウスの免疫応答は、種々のマイトジェンに暴露した場合に、各タイプのマウスからの脾細胞について増殖に対するアッセイを行うことによって評価した。脾細胞は、マウスを犠牲にし、その脾臓を抽出することによって得た。該脾臓を、２パーセントの子ウシ血清を含有する培地中に潰し、赤血球細胞を前記したごとくに溶解した。次いで、これらの細胞を、約２×１０⁵細胞／ウェルの密度にて９６ウェル平底プレートに平板培養し、種々のマイトジェンを以下のごとくに添加した：１）コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）は５.０μｇ／ｍｌおよび１.２５μｇ／ｍｌの間の濃度で、また、ＩＬ−２の存在下および不存在下において、２.５μｇ／ｍｌの濃度で評価し；および、２）２５０ｎｇ／ｍｌのカルシウムイオノフォアＡ２３１６７は、５０ｎｇ／ｍｌのフォルボールエステルＰＭＡの存在下で評価した。細胞増殖は、培養２日後における³Ｈ−チミジン摂取を測定することによって測定した。結果を図２に示す。ＣｏｎＡに関しては、野生型マウスからの細胞は大きな増殖反応を示し、ヘテロ接合ＣＤ２８ノックアウトマウスからの細胞はより小さい応答を示し、ホモ接合ＣＤ２８ノックアウトマウスからの細胞は最低量の³Ｈ−チミジン摂取を有していた。しかしながら、カルシウムイオノフォア／ＰＭＡに対する反応は、３つのタイプの細胞間でかなり近いものであった。水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ、Indiana株）での感染に応答する血清中における中和抗体の存在を評価した。マウスに２×１０⁶ｐｆｕのウイルスを注射した。４、１０または２０日後、マウスからの血清を、Leistら（J．Immunol.，138: 2278［1987］）によって記載されている方法を用いて中和ＩｇＭおよびＩｇＧ抗体について分析した。中和活性の力価で表した結果を図３に示す。各棒線は５匹のマウスの群についての平均値を表し；ｎ．ｄ．は「検出不可能」を意味する。ホモ接合ノックアウトマウスおよび野生型マウスの力価は４日後では近いものであったが、１０日および２０日においては、ホモ結合ノックアウトマウスは野生型マウスよりもかなり低レベルのＩｇＧを有していた。実施例２：ＣＤ４５ノックアウトマウスの作出１．ＤＮＡノッタアウト構築体の作製 Johnsonら（J．Biol．Chem.，264:6220-6229［1989］）によって記載されているごとくに、ＣＤ４５遺伝子の４.０ｋｂゲノムネズミＤＮＡ断片を単離した。この断片は当該遺伝子のエクソン６〜８にわたるものである。該断片を、制限エンドヌタレアーゼＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで既に消化してあるベクターｐＧＥＭ−９Ｚｆ（−）（Promega Corp.，Madison，WI）に挿入した。挿入の後、構築体を制限エンドヌタレアーゼＫｐｎＩおよびＮｓｉＩで消化した；これらの部位は、各々、ＣＤ４５遺伝子断片の、イントロン５および６の間、およびイントロン６および７の間に位置する。ポリＡ終結シグナルを含有するネオマイシン耐性遺伝子構築体は、プラスミドｐＭＣＩｎｅｏＰｏｌＡ（Th omas et al.，Cell，51:503［1987］）から得たものであり、ＫｐｎＩおよびＮｓｉＩで消化し、次いで、ＣＤ４５転写の向きに対してアンチセンスの向きにて構築体に連結した。得られたノックアウト構築体を図４に示す。２．幹細胞のエレクトロポレーションおよび注入制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩで消化することによってノックアウト構築体を線状化し、このＤＮＡの約２５μｇをＤ３胚性幹細胞にエレクトロポレーションした。該構築体を含有するエレクトロポレーションした細胞は受託番号ＣＲＬ１１３８１としてＡＴＣＣに寄託された。エレクトロポレーションは実施例１に記載した手法を用いて達成した。１０⁷細胞当たり約５０μｇＤＮＡを用いた。エレクトロポレーションの後、細胞を平板培養し、実施例１で記載したごとくにスクリーニングした。Ｇ４１８に対して耐性の細胞は、ネオマイシン耐性遺伝子に対して、およびＣＤ４５遺伝子に対する特異的な部位に対して特異的なプライマーを用いるＰＣＲによって、相同遺伝子組換えについてスクリーニングした。用いたプライマーは以下に記載する：プライマー１：（配列番号：３）プライマー２（配列番号：４）：ＰＣＲ反応条件は：９１℃で変性し、６０℃でアニールし、７２℃で鎖を伸長するものであった。約３５〜４０サイクルを行った。加えて、ＣＤ４５遺伝子のイントロン４および５間の領域にわたる³²Ｐ標識１.４ｋｂＤＮＡプローブを用い、これらの細胞にける相同遺伝子組換えを、サザンブロッティング分析によって確認した。サザンブロッティングは、Sambrookら（Molecular Cloning：A Lab oratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor ，NY［19891］）によって記載されている標準的な方法を用い、Ｇ４１８耐性細胞からゲノムＤＮＡを単離することによって行った。ゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、標準的なアガロース電気泳動を用いて分離し、 immobilon−Ｎ膜ペーパーにブロットした。膜への移行は１０パーセントＳＳＣ中、２０℃で１２時間行った（Sambrook et al.、前掲）。該膜を６７℃で１２時間プローブし、次いで、３回洗浄した。第１の洗浄は５パーセントＳＳＣ、０ .０１パーセントＳＤＳであり；第２の洗浄は３パーセントＳＳＣ、０.０１パーセントＳＤＳであり；第３の洗浄は１パーセントＳＳＣ、０.０１パーセントＳＤＳであった。ＥＳ細胞の作製、胚への注入、および仮親への移植は実施例１に記載した通りであった。３．ノックアウト構築体についてのマウスのスクリーニング子孫（創始マウス）は、体毛の着色を評価することによってモザイク性につきスクリーニングした（胚は黒色体毛のマウスからのものでって、胚性幹細胞はアグーチ（agouti）マウスからのものであり；ほとんどのモザイクマウスは、従って、部分的にアグーチ（agouti）であって部分的に黒色の体毛を有していた）。創始マウスを戻し交配して、ヘテロ接合ＣＤ４５ノックアウトマウスを得た。この交配からの子孫をスクリーニングして、それらがＣＤ４５ノックアウト構築体についてヘテロ接合またはホモ接合であるかを決定した。スクリーニングは、尾組織から得られたＤＮＡのサザンブロッティングによって行った。尾組織は、３週齢マウスの尾片を切断することによって得た。該尾組織を、１５０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ、１パーセントＳＤＳ、および１ｍｇ／ｍｌプロナーゼＥのＴＮＥ（Sambrook et al.、前掲）溶液５００μｌと共にインキュベートした。このインキュベーションの後、この溶液７５０μｌを７５０μｌのフェノール／クロロホルム（１：１ｖ／ｖ）に添加して、ＤＮＡを分離した。混合物を５分間遠心して細胞夾雑物をペレット化した。上清にイソプロピルアルコール４５０μｌを添加し、この混合物をドライアイス上でインキュベートし、ＤＮＡを沈殿させた。インキュベーションの後、沈殿したＤＮＡを遠心によってペレット化し、風乾し、蒸留水１００μｌ中に再懸濁し、４℃に保った。このＤＮＡのサザンブロットは胚性幹細胞について前記したごとくに行った。ＣＤ４５の発現についてマウスのＢ細胞およびＴ細胞をテストしてマウスの接合性を判断するために、前記した抗体および方法を用いて、種々のマウスからの細胞を、免疫学的マーカーの存在についてスクリーニングした。６〜１２週齢マウスからの胸腺細胞、脾細胞、腸間膜リンパ節細胞および骨髄細胞の単一細胞懸濁液は以下のごとくに調製した：Canadian Research Council の標準的なプロトコルに従い、二酸化炭素を用いてマウスを殺し、各マウスから器官を収集し、４℃のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に保った。単一細胞懸濁液は、シリンジプランジャーで器官をスチール製スクリーンメッシュに対して摩砕することによって調製した。細胞はＰＢＳ中で２回洗浄した。各懸濁液はＰＢＳに再懸濁し、以下のごとくに適当な抗体と共にインキキュベートした：１）Ｐａｎ−ＣＤ４５抗原を、１）ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアナート）またはＰＥ（フィコエリトリン）標識Ｌｙ−５モノクローナル抗体（Phar mingen，San Diego，CA）または２）上清に由来するＩｇＧモノクローナル抗体１３／２.３（Trowbridge et al.、J．Exp．Med.，148:313［1978］）のいずれかで検出した。２）エピトープをコードするＣＤ４５−エクソン４は、上清に由来するラットモノクローナル抗体１４.８で検出した；該抗体はKincade et al.，J．Immunol. ，127:2262-2268［1981］）から得たものであった。３）エピトープをコードするＣＤ４５−エクソン４は、上清から得たラットＩｇＧモノクローナル抗体ＭＢ２３Ｇ２（Birkeland et al.，Proc．Natl．Acad． Sci．USA，86:6734-6738［1989］）により検出した。４）Ｂ細胞のＣＤ４５グリコシル化エピトープはモノクローナル抗体Ｂ２２０（ＦＩＴＣもしくはＰＥ標識；Pharmingen，San Diego，CA）で検出した。５）ＣＤ４はBecton-Dickinson（Mountain View，CA）から得た抗−ＣＤ４モノクローナル抗体（ＦＩＴＣもしくはＰＥ標識）で検出した。６）ＣＤ８は、Becton-Dickinson（Mountain View，CA）から得た抗−ＣＤ８モノクローナル抗体（ＦＩＴＣ、ＰＥ、またはビオチン標識）で検出した。７）ＴＣＲＶｂｅｔａ８.１＋８.２はＫＪ１６ラットＩｇＧモノクローナル抗体（Hoskins et al.，J，Exp．Med.，160:452-471［1984］）で検出した。８）ＴＣＲＶｂｅｔａ８.２はマウスＩｇＧモノクローナル抗体Ｆ２３.２（St aerz et al.，J．Immunol.、134:3994-4000［1985］）で検出した。９）Ｈ−２ｂはＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体Ｂ８−２４（Pharmingen，Sa n Diego，CA）で検出した。１０）Ｈ−２ｄはＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体３４−２−１２（Pharming en，San Diego，CA）で検出した。１１）ＣＤ３は抗−ＣＤ３モノクローナル抗体（Pharmingen，San Diego，CA ）で検出した。１２）Ｔｈｙ１.２は抗−Ｔｈｙ１.２ＦＩＴＣまたはＰＥ標識モノクローナル抗体（Pharmingen，San Diego，CA）で検出した。１３）ｓｌｇＭ抗原はＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体（Pharmingen，San Di ego，CA）で検出した。細胞を抗体で標識するのは以下のごとくに行った：ＰＥまたはＦＩＴＣ標識抗体を用いて単一または二重染色するには、１０パーセント子ウシ血清（ＦＣＳ）および０.１パーセントのアジ化ナトリウムよりなる染色緩衝剤（Staining Buffer）の溶液約１００μｌ中で、約１×１０⁶細胞を標識抗体４μ ｌと共に４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を５ｍｌＰＢＳ中で１回洗浄し、１パーセントのパラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）で固定し、ＦＡＣＳ分析が準備できるまで４℃に保った。上清を用いて細胞を標識するには、１×１０⁶細胞を約５０μｌの適当な上清と共に１００μｌの染色緩衝剤（Staining Buffer）中、４℃で３０分間インキュベートした。このインキュベートの後、３μｌのＰＥまたはＦＩＴＣ標識ヤギ抗−マウスＩｇＧ、またはヤギ抗−ラットＩｇＧ（共に、Southern Biotechnolo gy Associates，Birmingham，ALから入手）と共に４℃で約３０分間インキュベーションすることによって、抗体結合を可視化した。次いで、細胞をＰＢＳ中で１回洗浄し、次いで、前記したごとくにパラホルムアルデヒド中で固定した。ラットまたはマウス抗体の可視化は、ＰＥまたはＦＩＴＣ標識ヤギ抗−ラットＩｇＧおよびＦＩＴＣ標識ヤギ抗−マウス抗血清（共に、Southern Biotechnolo gy Associates，Birmingham，ALから入手）を用いて行い、ビオチン標識抗体の可視化はストレプトアジビン−ＲＥＤ６１３（Gibco/BRL，Grand Island，NY）で行った。ラット抗体での二重染色プロトコルを用いた場合、残存する抗−ラットＩｇＧ部位に起因する非特異的染色は、２μｇ／１００μｌラットＩｇＧ（Si gma Chemical Co.，St．Louise，MO）を用い、ＰＢＳでの洗浄前に４℃で１０分間細胞をインキュベートすることによってまずブロックした。全ての試料は、Lisi s ＩＩプログラム（Becton-Dickinson，Mountain View，CA）を用い、FACSscan 機器で分析した。結果は、ＣＤ４５エクソン６イソ型タンパタ質は、ホモ結合ＣＤ４５エクソン６イソ型タンパク質ノックアウトマウスの骨髄および脾臓からのＢリンパ球の細胞表面では検出されないことを示した。加えて、ＣＤ４５エクソン６イソ型タンパク質を細胞表面に発現する末梢Ｔ細胞の数は野生型マウスと比較してかなり減少した。ヘテロ接合ノックアウトマウスは、野生型マウスと比較して、これらの細胞上でのＣＤ４５エクソン６イソ型タンパク質発現のレベルは低下していた。脾臓および骨髄におけるｓｌｇＭ＋細胞の合計数はホモ接合ノックアウトマウスおよび野生型マウスとの間でほぼ同程度であった。しかしながら、末梢リンパ系器官におけるＴ細胞の合計数は、野生型マウスと比較して、ホモ接合ノックアウトマウスではかなり減少した。野生型マウスと比較してＣＤ４５はヘテロ接合ノックアウトマウスでは減少したレベルで発現されているにも拘わらず、末梢ＴおよびＢ細胞区画と骨髄細胞とにおける有意な差異は、ヘテロ接合ノックアウトマウスおよび野生型マウスの間では検出されなかった。胸腺細胞上でのＣＤ４５エクソン６イソ型タンパク質の発現は野生型マウスと比較してホモ結合ノックアウトマウスでは有意に抑制されたにも拘わらず、ホモ接合ノックアウトマウスにおける胸腺細胞の合計数は野生型マウスと比較してわずかに減少したに過ぎなかった。加えて、ホモ接合ノックアウトマウスは、未成熟ＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性胸腺細胞の正常細胞数を有していたが、ＣＤ４− ＣＤ８−前駆体細胞の細胞合計数は増加し、また、成熟ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞系列双方のサイズはこれらのマウスではかなり減少した。４．ノックアウト遺伝子の効果の分析Ｂ細胞発生分化に対するＣＤ４５エクソン６イソ型タンパク質遺伝子抑制の効果を調べるために、骨髄、脾臓、または腹膜細胞の単一細胞懸濁液を、プレＢ細胞（ＩＬ−７またはＩＬ−７プラスストロマ細胞系Ｓ１７）、Ｂ細胞（ＬＰＳまたはＬＰＳ＋Ｓ１７）または骨髄性細胞（マクロファージコロニー剌激因子Ｍ −ＣＳＦ−１の源としてのＩＬ−３またはＬ９２９順化培地）のいずれかの選択的増殖を可能とする種々の条件下、半固体寒天にクローン化した。増殖を評価するために、二層寒天培養を以下のごとくに確立した：まず、２.４ｇ／ｌＮａＨＣＯ₃、５ｍｇ／ｌストレプトマイシン、５×１０³ｕ／ｌペニシリン、５×１０^-5Ｍ β−メルカプトエタノール、１０％子ウシ血清（Gibco/BRL，Grand Isla nd，New York）および０.３％融解Bacto寒天（Difco Labs）を補充したＯＰＴＩ −ＭＥＭ培地（Gibco/BRL，Grand Isl and，New York）よりなる１ｍｌの下層を調製した。次に、Ｓ１７ストロマ細胞（Collins et al.，J．Immunol．138:1082-1087［1987］）をプラスチック製プレートに５時間接着させた（２×１０⁴照射［２０００Ｇｙ］Ｓ１７／プレート）。次いで、非接着性細胞を真空吸引によって除去し、適切な補足物を含有する底部寒天層を注いだ。培地には、２５μｇ／ｍｌのＬＰＳ（Salmonella typhosa株ＷＯ９０１からのリポ多糖；Difco Labs）；ネズミＩＬ−７およびＩＬ−３（適当なベクターを含有する細胞系からの培養上清として培地に添加；Cumano et al.，Eur．J．Immun ol.，20:2183-2189［1990］；Cumano etal,，EMBO J.，11:593-601［1992］；Ka rasuyama et al.，Eur．J．Immunol．18:97-104［1988］）；またはマクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ−１；Ｌ９２９順化培地から入手）のいずれかを補充した。ＩＬ−３、ＩＬ−７およびＭ−ＣＳＦの最適量は、Cumanoら（前掲）によって記載されている力価測定実験で決定した。テストした異なる組織で見い出されるコロニー形成性細胞の絶対数として、結果を表４に示す。ホモ接合ノックアウト、ヘテロ接合ノックアウトおよび野生型マウスの間で、骨髄由来の骨髄性細胞またはＢ−細胞始原細胞のコロニー形成量に検出可能な差異はなかった。免疫グロブリン（Ｉｇ）媒介細胞信号伝達効果に関するＣＤ４５エクソン６イソ型タンパク質発現の重要性を判断するために、ホモ接合およびヘテロ接合ノックアウトマウスならびに野生型マウスから得られた脾臓Ｂ細胞に、抗−Ｉｇμ特異的モノクローナル抗体Ｂ−７６（Michael Julius博士，McGill University，M ontreal，Canadaから入手）を添加した。脾臓Ｂ細胞を約１０⁵細胞／ウェルの密度にてマイクロタイタープレートに入れ、外来性刺激因子を添加せず、あるいはリポ多糖もしくは抗体Ｂ−７６を添加して、３７℃で５パーセントＣＯ₂ の雰囲気中で３、４または５日間インキュベートした。ウェル当たり１μＣｉの³Ｈ−チミジンを用い、³Ｈ−チミジンを細胞に１０時間添加することによって剌激作用を測定した。次いで、各ウェルの内容物を濾紙上にブロットし、放射能を計測した。図５に示す結果は、抗−Ｉｇμ刺激作用にはＢ細胞上におけるＣＤ４５エクソン６イソ型タンパク質発現を必要とするが、ＬＰＳ剌激ではそれを必要としないことを示す。Ｔ細胞エフェクター機能をin Vivoで評価するために、ホモ接合およびヘテロ接合ノックアウトマウスを、抗ウイルス細胞障害性Ｔ細胞応答を生じるその能力についてテストした。約４００ｐｆｕに相当するリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス Armstrong（ＬＣＭＶ）約３０μｌをマウスの後足蹠に皮下注射した。足蹠の腫大は、バネを負荷したカリパで毎日測定した。結果を図６Ａに示す。腫大反応の初期相（注射後７〜９日）は、ホモ接合ノックアウトマウス（中抜き三角形）では完全になくなったが、野生型マウス（塗り潰した三角形）ではそうではなかった。ある種の病原体に対する細胞障害性反応を生じさせないホモ結合ノックアウトマウスの能力をさらに確認するために、マウスをＬＣＭＶで感染させた後、該マウスの脾臓から細胞障害性リンパ球を得た。次いで、これらの細胞障害性リンパ球を最初の感染後５または３０日にin vitroで再剌激した。再刺激は、以下のごとくに調製したＬＣＭＶ感染腹膜マクロファージ（Lehmann-Grube，Virol．Monogr.，10［1971］）に暴露することによって達成した：マクロファージは、６日前に２ｍｌのチオグリコール酸（３パーセントwt/vol.）を注射し、かつ４日前に１０００ｐｆｕのＬＣＭＶArm strongを腹腔内注射したＣ５７ＢＬ／６マウスの腹膜を洗浄することによって得た。培養は、４×１０⁶反応性脾細胞および２×１０⁵ＬＣＭＶを注射し、照射した（１２００ラド）腹腔マクロファージで確立した。１０パーセント子ウシ血清および１０^-5Ｍ β−メルカプトエタノールと共にＩＭＤＭ培地中で５日間培養物をインキュベートした。Cerrottini et al.（Adv．Immunol.，18:67-132［1974 ］）によって記載されている標準的なプロトコルに準じて、培養物の二倍希釈物を、ＬＣＭＶ感染⁵¹Ｃｒ標識ＭＣ５７（Ｈ−２ｂ）繊維肉腫標的細胞に対するＬＣＭＶ特異的Ｔ細胞の細胞障害性についてアッセイした。次いで、４時間後、Ce rrottiniら（前掲）によって記載されているごとくに、特異的溶解を計数した。図６Ｂに示す結果は、ホモ接合ノックアウトマウス（中抜き三角形）は細胞障害性応答を増やすことができなかったが、野生型マウス（塗り潰した三角形）はかかる応答を増やすことができたことを示す。実施例３：ＣＤ４５トランスジェニックマウスの作出１．トランスジーンカセットの調製全長暗号配列ならびに５’非翻訳配列の約７０塩基および３’非翻訳配列の約３００塩基を含有するＣＤ４５ＲＯイソ型タンパク質（エクソン４〜６を発現しないＣＤ４５遺伝子）をコードするネズミｃＤＮＡは、ネズミリンパ球ライブラリーから得られ、ほぼ３.５ｋｂのＳａ１１−ＳａｌＩ断片として単離した。この断片を、Chaffinら（EMBO J.，9:3821-3829［1990］）によって記載されている発現ベクターｐ１０１７のＢａｍＨＩクローニング部位に挿入した。該ベクターｐ１０１７はクローニングベクターｐＵＣ１９（Stratagene，La Jolla，CA，または同等物）のＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩ部位間に挿入されたほぼ３.２ｋｂ胸腺細胞特異的マウスｌｃｋプロモーター（Garvin eta al.，Int．Immunol.，2 :173-180［1990］）を含有する。加えて、該ｐ１０１７は、ｌｃｋプロモーターに隣接するポリリンカー領域およびポリリンカー配列の他端に隣接する（エクソン１中のＢａｍＨＩ部位からポリＡ配列のＥｃｏＲＩ部位側下流まで伸びる［Se eberg，DNA 1:239-249 1982］）ほぼ２.１ｋｂのヒト成長ホルモン遺伝子（ｈＧＨ）配列を含有する。ＣＤ４５ＲＯトランスジーンを含有する最終のベクターは標準的な手法を用いてイー・コリ（E．coli.）細胞中で増殖させ、標準的なミニプレプ方法（Sambro oket al.、前掲）を用いて精製した。図７に示すプロモーター、トランスジーン、およびｈＧＨ配列を含有するＤＮＡカセットをＮｏｔＩでの制限エンドヌクレアーゼ消化によって単離し、アガロースゲル電気泳動によって精製した。２．トランスジーンカセットのマウスへの挿入 Hoganら（前掲）によって記載されている標準的な手法を用い、精製されたＣＤ４５ＲＯＤＮＡカセットをＣ５７ＢＬ／６×ＤＢＡＦ２胚に微量注入した。該胚を仮親に移植した。子孫（創始マウス）は、マウス尾組織に由来するＤＮＡのサザンブロット分析によってトランスジーンの存在についてスクリーニングした。サザンブロット分析用のプローブはｈＧＨ遺伝子の３’領域よりなるものであった。Ｈ−２ｂまたはＨ−２ｄバックグラウンドのいずれかを持つトランスジェニック系を確立するために、創始マウスを５世代の間、Ｃ５７ＢＬ／６またはＤＢＡ／２マウスと交配させた。実施例４：ＣＤ４５ノックアウト、トランスジェニックマウスＣ５７ＢＬ／６ＣＤ４５ＲＯトランスジェニックマウス（ＣＤ４５エクソン６イソ型タンパク質についてホモ接合野生型）をＣＤ４５エクソン６ノックアウトマウス（実施例２に記載）と交配させて、ＣＤ４５ＲＯトランスジーンを含有し、ＣＤ４５エクソン６イソ型タンパク質ノックアウト構築体についてヘテロ接合であるＦ１子孫を得た。これらのマウスをホモ接合ＣＤ４５エクソン６ノックアウトマウスと戻し交配し、トランスジーンを含有し、かつＣＤ４５エクソン６ノックアウト構築体についてヘテロ接合もしくはホモ接合いずれかである子孫を得た。ＣＤ４５エクソン６ノックアウトヘテロ接合体およびホモ接合体は、（実施例１および２に記載したごとく）尾組織から得られたＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩＩで消化し、このＤＮＡをサザンブロットに付し、次いで、該ブロットを野生型全長ＣＤ４５ｃＤＮＡでプローブすることによって区別された。ＣＤ４５エクソン６ノックアウト構築体についてホモ接合であることが判明した（しかし、ＣＤ４５ＲＯトランスジーンを含有する）マウスを、Ｔ細胞の成熟および活性に対するトランスジーンの効果について分析した。マウスについての全ての分析は、複製として各遺伝子型の２匹の一腹子を用いて行った。すべてのマウスはおおよそ４週齢であった。以下の表において、対照マウスを「野生型」といい、ノックアウトもしくはトランスジーン構築体は含有していない；ＣＤ４５エクソン６ノックアウト構築体を含有するマウスを「ＣＤ４５エクソン６ＫＯ」といい；ＣＤ４５エクソン６ノックアウト構築体およびＣＤ４５ＲＯトランスジーンを含有するマウスを「ＣＤ４５ＲＯ／ＫＯ」という。胸腺細胞の成熟は前記した遺伝子型のマウスで評価した。マウスを犠牲にし、各マウスの胸腺を取り出した。胸腺細胞懸濁液は実施例２に記載されたごとくに調製し、次いで、（実施例２に記載されたごとくに）胸腺細胞をＣＤ４またはＣＤ８につき特異的な抗体で標識した。結果は表ＩＩに示す。明らかなごとく、ＣＤ４５エクソン６ノックアウトマウスにおけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の相対的レベルは、野生型またはＣＤ４５ＲＯ遺伝子型よりもかなり低かった。次に、マウスの種々のＣＤ４５遺伝子型を、リンパ節における異なる型のＴ細胞の相対的レベルについて評価した。マウスを殺し、リンパ節を取り出した。Ｔ細胞は実施例２に記載したごとくにリンパ節から得た。次いで、実施例２に記載したごとくに、Ｔ細胞を抗−ＣＤ４および抗−ＣＤ８抗体と共にインキュベートした。結果を表IIIに示す。明らかなごとく、ＣＤ４５ＲＯトランスジーンは、ＣＤ４５エクソン６ノックアウトと比較して、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞のレベルを増加させた。殺したマウスからの脾臓を抽出し、実施例２に記載したごとくに脾細胞を調製することによって、脾臓におけるＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の相対的集団をアッセイした。次いで、実施例２に記載した手法に従って脾細胞を抗−ＣＤ４および抗−ＣＤ８抗体と共にインキュベートした。結果を表ＩＶに示す。データは、ＣＤ４＋およびＣＤ＋８のレベルは、野生型と比較して、ノックアウトおよびノックアウト／トランスジーンマウス双方においてかなり低かったことを示す。本明細書中で引用した全ての文献は、出典明示して本明細書の一部とみなす。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者ペニンガー、ジョゼフマーティンカナダ国エム５エイ４エム９オンタリオ州トロントシャターストリート 220

Claims

【特許請求の範囲】１．ＣＤ４５をコードする遺伝子の発現がＢ細胞で抑制されているマウスまたはその後代。２．ＣＤ４５をコードする遺伝子の胸腺細胞および末梢Ｔ細胞での発現が野性型マウスと比べて低下している請求項１記載のマウスまたはその後代３．ＣＤ４５発現が対応する遺伝子配列の破壊によって抑制される請求項２記載のマウス。４．ＣＤ４５をコードする遺伝子の破壊が、マーカー配列に連結したＣＤ４５暗号配列の１のエクソンの少なくとも一部分からなる核酸配列をマウスのゲノムに挿入することによって生じた破壊である請求項３記載のマウス。５．ネオマイシン耐性遺伝子である請求項４記載のマーカー配列。６．ＣＤ２８の発現およびＣＤ４５の発現が低下されたマウスであって、ＣＤ２８ノックアウトマウスおよびＣＤ４５ノックアウトマウスの間の交配によって作出された該マウス。７．請求項６記載のマウスの後代。８．ＣＤ４５エクソン６イソ型タンパタ質である請求項１、２、３、４または５記載のＣＤ４５遺伝子。９．さらに、トランスジーンを含有し、該トランスジーンはＣＤ４５ＲＯイソ型タンパク質をコードするヌクレオチド配列を備える請求項１、２、３、４、６または７記載のマウス。１０．該トランスジーンがネズミｌｃｋプロモーターに作動可能に連結している請求項９記載のマウス。１１．ＣＤ４５エクソン６イソ型タンパタ質ノックアウト構築体を含有し、受託番号ＣＲＬ１１３８１としてＡＴＣＣに寄託されているＤ３細胞系。１２．請求項１１記載の細胞に挿入されたＣＤ４５エクソン６イソ型タンパク質ノックアウト構築体の核酸配列。１３．（ａ）ＣＤ４５をコードする遺伝子の発現レベルが抑制されたＴ細胞を有するマウスに薬物を投与し；次いで、（ｂ）免疫調節について該マウスをアッセイすることとを備える免疫調節に作用する薬物をスクリーニングする方法。１４．（ａ）Ｂ細胞およびＴ細胞がＣＤ４５をコードする内因性遺伝子の発現が抑制されたレベルを有し、さらに、ｌｃｋプロモーターに作動可能に連結されたＣＤ４５ＲＯイソ型タンパク質をコードするトランスジーンを含有するマウスに薬物を投与し；次いで、（ｂ）免疫調節について該マウスをスタリーニングすることとを備える免疫調節に作用する薬物をスクリーニングする方法。１５．ＣＤ４５をコードする該内因性遺伝子がエクソン６イソ型タンパク質である請求項１４記載の方法。