JP2005530687A - Ｆｇｆｒアゴニスト - Google Patents

Abstract

本発明は、高増殖性疾病、骨疾病および血管疾病（これに制限することはない）を含む病理学的症状の診断、予防および／または治療のための、線維芽細胞増殖因子レセプター（ＦＧＦＲ）の使用に関する。特に、ＦＧＦＲ−４アゴニスト、たとえば抗−ＦＧＦＲ−４抗体の使用が開示されている。さらに本発明は、前記に示したようにアゴニストを含む医薬品組成物およびスクリーニング方法に関する。

Description

本発明は、高増殖性疾病、骨障害および血管障害を含む病理学的症状（ただし、これらに限定されることはない）を診断、予防および／または治療するための線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）アゴニストの使用に関する。特に、ＦＧＦＲ−４アゴニスト、たとえば抗−ＦＧＦＲ−４抗体の使用が記載されている。さらに、本発明は、前記アゴニストを含む医薬組成物およびスクリーニング方法に関する。

ＷＯ９９／３７２９９は、ＦＧＦＲ過剰作用、特に癌に関連する疾病の治療および／または予防のためのＦＧＦＲインヒビターの使用を開示している。

驚くべきことに、多くの場合において、ＦＧＦＲインヒビターばかりでなく、選択的ＦＧＦＲアクチベーターが、高増殖性疾病の予防および／または治療に適していることが見出され、それというのも、これらのアゴニストが細胞分化プロセスを刺激するためである。

したがって、本発明は、治療薬または診断薬、たとえば、病理学的症状、たとえば高増殖性疾患、特に腫瘍形成疾病の予防および／または治療のための薬剤を製造するためのＦＧＦＲ種の活性を刺激しうる化合物の使用に関する。

現在において、４個の構造的に関連するＦＧＦＲ遺伝子が知られており、この場合、これらは４個の種々のタンパク質、すなわちＦＧＦＲ−１、−２、−３および−４をコードする。ＦＧＦＲタンパク質は、３個の免疫グロブリンループおよび酸性部分から成る細胞外領域、疎水性膜内外領域およびチロシンキナーゼ活性を示す細胞内領域を示す。異なるイソフォームは、ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２およびＦＧＦＲ−３であることが知られており、この場合、これらは、たとえば二者択一的なスプライシングから得られてもよい。少なくとも２個の対立変異体がＦＧＦＲ−４に関して存在し、この場合、これらは、アミノ酸３８８位で異なっており（たとえば、ＷＯ９９／３７２９９）、すなわちＦＧＦＲ−４ Ｇｌｙ３８８およびＦＧＦＲ−４ Ａｒｇ３８８である。

ＦＧＦＲアゴニスト化合物は、好ましくはＦＧＦＲ種の活性を刺激し、この場合、これらは、ＦＧＦＲ−１，ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−３およびＦＧＦＲ−４から成る群から選択される。より好ましくは、ＦＧＦＲ種はＦＧＦＲ−４である。好ましくは、刺激は選択的であり、すなわち、前記ＦＧＦＲ種の刺激は、他のＦＧＦＲ種の有意刺激を誘発することはない。これに関して「有意刺激（significant stimulation）」とは、拮抗化合物が、病理学的に関連する範囲において、他のＦＧＦＲ分子の生物学的活性を刺激しえないことを意味する。しかしながらいくつかの実施態様に関しては、一つのみのＦＧＦＲ種に関する選択性を要求することはできず、すなわち、アゴニストは、２個またはそれ以上のＦＧＦＲ種を刺激してもよく、その際、刺激の度合いは個々の種に対して同様かまたは異なっていてもよい。

第１の実施態様において、化合物はＦＧＦＲ種に対する結合によってその刺激活性を示し、すなわちＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−３および特にＦＧＦＲ−４またはそのイソフォームまたはその対立変異体から選択されたＦＧＦＲ種と結合することで、ＦＧＦＲ活性を増加させる。特に好ましくは、ＦＧＦＲ−４ Ｇｌｙ３８８の活性を増加させる。化合物は、好ましくはＦＧＦＲ種の選択的活性を示す。より好ましくは、化合物は種々のＦＧＦＲ種と交差反応することなく、すなわち、定められたＦＧＦＲ種に対して選択的に結合する。しかしながら、いくつかの実施態様に関しては選択性が要求されないことを言及すべきである。

結合する化合物は、天然または合成のＦＧＦＲリガントであってもよく、この場合、これは要求された結合活性を有する。たとえばＦＧＦ−１９（Ｘｉｅら）は、ＦＧＦＲ−４に対して高く選択的に結合する。他方では、結合する化合物は抗−ＦＧＦＲ抗体であってもよく、この場合、これらは特にＦＧＦＲ種、たとえばＦＧＦＲ−４と特異的に結合し、かつ他のＦＧＦＲ種に対して有意な交差反応性を示すことはない。適した抗体は、実施例に記載されている。用語「抗体」は本発明によれば、モノクローナル抗体および公知技術によって誘導されたキメラまたはヒト化抗体、ヒト抗体、組換え抗体、たとえば一本鎖抗体または抗体フラグメント、たとえばＦａｂ、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆａｂ’抗体フラグメントまたはｓｃＦＶフラグメントのような組換え抗体フラグメントであるが、但し、これらは前記に示したようにＦＧＦＲ種と選択的かつ拮抗的に結合するものを示す。さらに、結合化合物は、抗体様の結合特性を有するスカフォールドタンパク質であってもよい。

ＦＧＦＲ種と結合することによって、化合物はレセプターの生物学的活性、たとえばチロシンキナーゼ活性、他のタンパク質との相互作用、たとえば細胞間接触を促進するか、および／またはＦＧＦＲの下流の標的（Downstream target）、たとえばタンパク質との他の相互作用を増加させる。より好ましくは、ＦＧＦＲ種のチロシン燐酸化反応を増加させる。チロシンキナーゼ活性の増加は、たとえば、ＦＧＦＲ種の免疫沈降反応および後の実施例で記載するような適した抗−ホスホチロシン抗体を用いての測定によって定めることができる。

第２の実施態様において、ＦＧＦＲ活性は間接的な相互作用によって刺激される。化合物は上流の標的（upstream target）、たとえば、ＦＧＦＲとは異なるタンパク質との結合性または相互作用を有していてもよいが、しかしながら、これは、ＦＧＦＲ活性を刺激する能力を有するものである。

第３の実施態様において、ＦＧＦＲ活性は、遺伝子投与量を増加させることによって、たとえば、ＦＧＦＲ遺伝子、特にＦＧＦＲ−４遺伝子および特にはＦＧＦＲ−４ Ｇｌｙ３８８遺伝子を、標的細胞または標的生体中で投与および／または過剰発現することによって刺激される。この実施態様は、好ましくは遺伝子治療的アプローチを含み、その際、ＦＧＦＲ遺伝子は標的細胞中に適したベクター、たとえば、技術水準による公知のウイルスまたは非ウイルス性遺伝子導入ベクターによって導入される。

ＦＧＦＲアゴニストのデザインおよびＦＧＦＲ活性を刺激するための他の手段は、Ｂａｌｌｉｎｇｅｒら（Nature Biotech 17 (1999), 1199-1204）；ＷＯ９８／２１２３７；ＦＡ−Ａ２７９６０７３；およびＷＯ００／３９３１１に記載されており、この場合、これらは参考のために引用されているものである。しかしながら、これらの文献は、ＦＧＦＲ活性が、腫瘍形成を減少させることについて示唆するものではない。

本発明は、ＦＧＦＲ活性の刺激が、ｉｎ ｖｉｖｏで、マウスモデル中で腫瘍サイズの減少を導くといった驚くべき発見に基づくものである。結果として、ＦＧＦＲ活性の刺激は、ＦＧＦＲ−関連疾病、たとえば高増殖性疾病、たとえば腫瘍形成性疾病、たとえば大腸、腎臓、膀胱、膵臓、前立腺、胃、乳房、肺、甲状腺、下垂体、副腎および卵巣の腫瘍またはグリア芽細胞腫、白血病、ならびに甲状腺肥大、色素性網膜症、性的早熟、肢端肥大症および喘息の予防および／または治療のために使用されてもよい。他の例は、骨障害、たとえば骨粗鬆症および血管障害、たとえばレスチノシス（restinosis）、アルテオスクローシス（arterosclerosis）および高血圧である。

したがって、本発明は、ＦＧＦＲ機能不全に関連する疾病、特にＦＧＦＲ活性の少なくとも部分的な欠損に関連する疾病の予防および／または治療のための方法に関し、この場合、この方法は、これを必要とする対象物に、ＦＧＦＲ活性を刺激するのに十分な量で化合物を投与することを含む。特に本発明は、ＦＧＦＲ機能不全に関連する疾病、特に、ＦＧＦＲ活性の少なくとも部分的な欠損に関連する疾病の予防および／または治療のための方法に関し、この場合、この方法は、これを必要とする対象物に、ＦＧＦＲ種に対する選択的な結合を示し、かつ結合によりＦＧＦＲ活性を刺激する能力を示す十分な量で化合物を投与することを含む。対象物は、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトである。医薬目的のために、化合物は通常は製薬学的に許容可能な組成物として投与され、この場合、これらは、さらに適した希釈剤、キャリアおよび／またはアジュバントを含有することができる。さらに組成物は、製薬学的に活性の薬剤、たとえば癌の治療のための細胞毒性薬剤を含有することができる。

本発明での使用に適した医薬組成物は、活性成分を、その意図する目的、たとえば治療または診断目的を達成するのに有効な量で含有する組成物を含む。治療的有効投与量は、患者の症状の緩和または延命を生じる化合物の量に関する。このような化合物の毒性および治療効率は、標準的な製薬学的工程によって、細胞培養物または実験動物におけるＬＤ_５０（全体の５０％の致死投与量）およびＥＤ_５０（全体の５０％の治療有効量）を測定することで定められてもよい。本発明の方法において使用される任意の化合物に関しては、治療的有効量は、最初に細胞培養アッセイから確立される。たとえば、投与量は、動物モデル中において処方されてもよく、細胞培養物中で測定されたＩＣ_５０を含む循環濃度範囲を達成する（すなわち、成長因子受容活性の半−最大抑制を達成する試験化合物の濃度）。このようなインフォメーションは、ヒトにおいて有用な投与量をより正確に測定するために使用することができる。毒性作用と治療的効果との投与量比は、治療インデックスであり、かつＬＤ_５０とＥＤ_５０との比として示すことができる。高い治療的インデックスを示す化合物が好ましい。正確な処方、投与経路および投与量は、医師により、個々の患者の状態により選択することができる（たとえば、Ｆｉｎｇｌら、１９７５、in “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Ch.1, p.1）。

投与量および投与間隔は、レセプター修飾作用を維持するのに十分な活性部分の血漿レベルまたは最少有効濃度（ＭＥＣ）を提供するためにそれぞれ調節されてもよい。ＭＥＣはそれぞれの化合物に関して可変であってもよいが、しかしながら、ｉｎ ｖｉｔｒｏデータ、たとえば、記載されたアッセイを用いてレセプターの５０〜９０％の抑制を達成するのに必要な濃度から定めることができる。化合物は、時間の１０〜９０％、好ましくは３０〜９０％およびより好ましくは５０〜９０％に亘ってＭＥＣを上廻る血漿レベルを維持する処方を用いて投与すべきである。ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は、個々の性質および投与経路に依存してもよい。局所的投与または選択的摂取の場合には、薬剤の有効な局所的濃度は血漿濃度に関連するものでなくてもよい。

勿論、投与される正確な組成物量は、治療すべき対象物、対象物の体重、疾患の重症度、投与方法および処方した医師の判断に依存されてもよい。

投与の適した経路は、たとえば、経口、直腸、粘膜内または腸内投与；非経口的送達、この場合、これらは、筋肉内、皮下、髄内注入、ならびに髄腔内注入、直接的心室（脳室）内注射、静脈内、腹腔内、鼻腔内または眼内注入である。

二者択一的に、化合物は局所的よりもむしろ全身的投与方法で、たとえば、化合物の注入により直接的に充実性腫瘍へ投与されてもよいか、しばしばデポー製剤または持続的放出製剤によって投与されてもよい。

さらに、薬剤を、標的薬剤送達系、たとえば腫瘍特異的抗体で被覆されたリポソームを用いて投与してもよい。リポソームは、腫瘍により標的化され、かつ選択的に取り込まれる。

種々の実施態様において、医薬組成物は診断薬組成物であってもよい。好ましい実施態様において、診断薬組成物は、標的細胞または標的生体中でのＦＧＦＲ種の発現を測定するための診断薬を含む。発現は、タンパク質レベルで測定されてもよく、たとえば、抗−ＦＧＦＲ抗体を使用することによってか、および／またはＦＧＦＲ活性を測定することによって定めることができる。他方では、ＦＧＦＲ発現は、核酸レベルにおいて測定されてもよく、たとえば、ＦＧＦＲｍＲＮＡを測定することによって、たとえばＲＴ−ＰＣＲプロトコールまたは従来技術から公知の他の適した検出プロトコールによって測定することができる。

さらに本発明の他の態様は、病理学的状態、たとえば細胞または生体中、この場合、これは特に哺乳類細胞または生体、たとえばヒト細胞または生体での高増殖性プロセスの新規抑制剤を同定するための方法であり、この場合、これらは、
（１）ＦＧＦＲ種に対して結合を示し、かつ好ましくは
（２）結合することによってＦＧＦＲ活性を刺激する
化合物の能力を試験することを含む。

方法は高スループットスクリーニング法としておこなわれてもよく、この場合、これらは、ＦＧＦＲ発現を用いての細胞ベースのアッセイであるか、あるいは、本質的にかまたは部分的に精製されたＦＧＦＲタンパク質を用いての過剰発現細胞アッセイまたは無細胞アッセイであってもよい。アッセイは、たとえば、生物学的化合物または合成化合物のライブラリーから新規化合物または好ましい特性を有する化合物の群を同定するために適している。さらに、本発明は、開示された方法によって同定された任意の新規インヒビターを包含する。

好ましい性質を示す試験化合物の能力は、実施例に示すようにして測定されてもよい。

最終的に本発明は、前記に示すような拮抗的抗−ＦＧＦＲ抗体を製造する能力を有する細胞系に関する。細胞系は原核細胞または真核細胞系であってもよく、たとえば哺乳類細胞系、特にリンパ系細胞系、たとえばハイブリドーマ細胞系またはＣＨＯ細胞系であってもよい。さらに細胞は、昆虫細胞系、植物細胞系、真核単細胞器官、たとえば、酵母菌、または細菌、特にグラム陰性細菌、たとえば、Ｅ．Ｃｏｌｉであってもよい。細胞系は、前記に示すような拮抗的抗ＦＧＦＲ抗体の製造に適している。

図面の説明
図１：
ヒトＦＧＦＲ−４Ｇｌｙ３８８を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞（ＡＴＣＣＨＴＢ−２６）は、創傷アッセイにおいて減少した遊走を示す。ベクターコントロール（Ａ，Ｂ）、ＦＧＦＲ−４ Ａｒｇ３８８（Ｃ，Ｄ）またはＦＧＦＲ−４ Ｇｌｙ３８８ｃＤＮＡｓ（Ｅ，Ｆ）を含有するレトロウイルスで感染させた細胞のコンフレントなモノレイヤーを、プラスチックチップで引掻き、かつ、０％ＦＣＳ（Ａ，Ｃ，Ｅ）または０．５％ＦＣＳ（Ｂ、Ｄ、Ｆ）でインキュベートした。２４時間の後に、個々のコントロールおよびＦＧＦＲ−４ Ａｒｇ３８８細胞の多くが、創傷（Ｂ，Ｄ）中に遊走し、ＦＧＦＲ−４ Ｇｌｙ３８８細胞とは対照的に、この場合、これらは創傷（Ｆ）中のいくつかの独立した細胞のみを示す。

図２：
ヒトＦＧＦＲ−４を発現するＬ６筋芽細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４５８）は、１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌの４ＦＡ６Ｄ３Ｃ１０で刺激するか、同時に同量のコントロール抗体（α−Ｃ）で１０分間に亘って刺激する。細胞溶解物は、ポリクローナル抗−ＦＧＦＲ−４（α−ＦＧＦＲ−４）抗体を用いて免疫沈降反応（ＩＰ）をおこなった。チロシンリン酸化レベルを、モノクローナル抗−リン酸化抗体（α−ＰＹ）でのウエスタンブロッティング（ＷＢ）によって分析した（上部パネル）。タンパク質の等量のローディングを、α−ＦＧＦＲ−４抗体で再度ブロッティングすることによってチェックした（下部パネル）。

図３：
異所的にヒトＦＧＦＲ−４を発現する多数のＭＣＦ７乳癌生細胞（ＭＣＦ７／ＦＧＦＲ−４クローン１および−クローン２）を、リガンドａＦＧＦおよびｂＦＧＦで処理することによって減少させることができる。

図４：
異所的にヒトＦＧＦＲ−４を発現する多数のＢＴ５４９乳癌生細胞（ＢＴ５４９／ＦＧＦＲ４−クローン１および−クローン２）を、リガンドａＦＧＦおよびｂＦＧＦで処理することによって減少させることができる。

腫瘍細胞遊走におけるＦＧＦＲ−４の役割を明らかにするために、ヒト乳癌細胞中でヒトＦＧＦＲ−４Ｇｌｙ３８８およびＦＧＦＲ−４Ａｒｇ３８８イソフォームを異所的に発現させた。適したＦＧＦＲ−４ｃＤＮＡｓを、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１３１）およびＫ５６２細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４３）から、それぞれ増幅させ、かつＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩ ＫＳベクター（Stratagene）中に標準的なプロトコール（Current Protocols）によってサブクローニングした。双方のｃＤＮＡｓをｐＬＸＳＮベクター（Stratagene）中にクローニングした。両栄養性ウイルスを製造するパッケージング細胞系Ｐｈｏｅｎｉｘ Ａ（Prof. Nolan, Stanford University）を、燐酸カルシウムＤＮＡ共沈法を用いて、これらのベクターでトランスフェクトした。トランスフェクトされたＰｈｏｅｎｉｘＡ細胞の上清を捕集し、かつ０．４５μｍのフィルターを通して濾過した。ベクターｐＬＸＳＮ単独でトランスフェクトされた細胞をコントロールとして使用した。

ＦＧＦＲ−４の検出可能量を発現しないヒト乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の感染のために、細胞をウイルス性の上清で２４時間に亘ってインキュベートした。４８時間の後に、培地を４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する培地で置換し、さらにＧ４１８下で１４日間に亘って選択した。クローン細胞系は、限界希釈法によって製造された。ＦＧＦＲ−４発現はウエスタンブロット分析によって測定された。それぞれのＦＧＦＲ−４イソフォームに関して、ＦＧＦＲ−４ Ｇｌｙ３８８およびＦＧＦＲ−４ Ａｒｇ３８８はそれぞれ、ＦＧＦＲ−４と同様の発現レベルを示す２個のクローン細胞系を、他の分析のために選択した。同様の方法において、マウスＮＩＨ−３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５８）およびラットＬ６筋芽細胞を、異所的ウイル生成細胞系ＧＦ＋Ｅ８６（Markowitz et al., 1988）からの上清で感染させ、これによって細胞系 ＮＩＨ−３Ｔ３／ｈｕＦＧＦＲ−４およびＬ６／ｈｕＦＧＦＲ−４がそれぞれ得られた。

次に、引掻き創傷法（Hutenlochner et al., 1998）を用いて、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞の遊走を試験した。細胞はコンフレントなモノレイヤー中で増殖させ、かつ創傷クロージャー中での遊走は、創傷がプラスチックチップでやさしく引掻かいた後に試験した。培地を除去し、かつ細胞をＰＢＳで２回に亘って洗浄した。ウシ胎児血清（ＦＣＳ）不含の培地または０．５％ＦＣＳを含む培地を添加し、かつ細胞をばらまき／２４時間に亘ってクリアーな領域に遊走させた。驚くべきことに、コントロールＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞と比較して、創傷のクロージャー率が、ＦＧＦＲ−４ Ｇｌｙ３８８を発現する細胞培養物中で減少する（図１）。対照的に、コントロールウイルス感染細胞またはＦＧＦＲ−４ Ａｒｇ３８８を発現する細胞は、創傷中で拡散して遊走した。したがって、ＦＧＦＲ−４ Ｇｌｙ３８８を発現するＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞は、細胞移動の抑制を示した。

ＦＧＦＲ−４のｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍表現型上での効果が、腫瘍発生上のｉｎ ｖｉｖｏでの効果に言い換えることができるかどうかを決定するために、マウスでの腫瘍成上におけるＦＧＦＲ−４発現の役割を評価した。７〜１０週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（Max-Planck-Institut, Mrtinstried, Germanyの動物施設でブリーディングされたもの）をアッセイに使用した。これらは、特定の病原菌不含条件で飼育されたものである。これらの飼育および処理については、ドイツの法律にしたがい認可された研究者によって監視された。ＦＧＦＲ−３ Ｇｌｙ３８８またはＦＧＦＲ−４ Ａｒｇ３８８を発現する新鮮にトリプシン処理されたセミコンフレントなＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞クローンまたはコントロール細胞を、燐酸緩衝液（ＰＢＳ）中で懸濁し、かつ２．８ｘ１０^７細胞／ｍｌの濃度にした。それぞれのマウスについて、頸部領域に４万個の細胞（１４０μｌ細胞懸濁液＋６０μｌマトリゲル；１３μｇ／ｍｌ）を皮下接種した。ＦＧＦＲ−４ Ｇｌｙ３８８とＦＧＦＲ−４ Ａｒｇ３８８の双方に関して、２個の独立したクローン細胞系を選択し、かつ前記に示したように５〜８個体の動物群に注入した。腫瘍形成は、６週間までモニタリングした。その後は、あるいは１ｃｍ^３の大きさに腫瘍の直径が達した時点で動物を殺処分した。腫瘍の大きさは、キャリパを用いて週３回に亘って測定し、かつ腫瘍体積を長さ×幅^２／２の式を用いて評価した。

第１表に示すように、ＦＧＦＲ−４ Ｇｌｙ３８８またはＦＧＦＲ−４ Ａｒｇ３８８レセプターのいずれも発現しないコントロール細胞を注入されたマウスは、１週間以内に腫瘍を形成し、かつ４週間後の平均腫瘍サイズは１ｃｍ^３であった。驚くべきことに、ＦＧＦＲ４−Ｇｌｙ３８８を発現する細胞を注入された１３個のマウス中１２個のマウスにおいて腫瘍成長は観察されず、この場合、これはＦＧＦＲ−４ Ｇｌｙ３８８が腫瘍形成の完全な抑制を生じ、よって腫瘍サプレッサーとして作用することが示唆された。６週間に亘るモニタリング期間において腫瘍は全く観察されなかった。興味深いことに、ＦＧＦＲ−４ Ａｒｇ３８８イソフォームを発現する細胞は、注入されたマウスの８０％および６２．５％で腫瘍を生じた。しかしながら、これらの細胞によって形成された腫瘍サイズは、ｐＬＸＳＮベクター単独で感染させたコントロール細胞によって形成された腫瘍のサイズよりも著しく小さい。さらに腫瘍は、ＦＧＦＲ−４ Ａｒｇ３８８を発現するクローンでの感染から生じた腫瘍は、コントロール細胞から誘導された腫瘍よりもすべてゆっくりと成長する。したがって、ＦＧＦＲ−４ Ａｒｇ３８８は、ＦＧＦＲ−４ Ｇｌｙ３８８よりも抑制された腫瘍成長において低い活性を示すけれども、なおもＦＧＦＲ−４発現を欠くものと比較して著しい効果がみられる。

これらの結果は、ＦＧＦＲ−４の特異的活性が腫瘍成長を遮断および／または阻害に対するポテンシャルを有することを明らかにする。したがって、次にＦＧＦＲ−４の細胞外領域に対してのモノクローナル抗体の製造およびＦＧＦＲ−４の活性化におけるその使用について検討した。この目的のために、ＦＧＦＲ−４細胞外領域（FGFR-4 ex）を含む組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（smith & Johnson, 1988）融合タンパク質が製造された。真核細胞における発現および組換え融合タンパク質の分泌に関してデザインし、ｐＣＤＮＡ３クローニングベクター（Invitrpgen, Groningen, The Netherlands）から、シストゾーマ ジャポニクム グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（Pharmacia Biothech, Freiburg, Germany）をコードする全ＤＮＡ配列を、ｐＣＤＮＡ３のＸｈｏ１およびＡｐａ１サイトに挿入することによって得たクローニングベクターｐＳｊ２６（ｍｏｄ）（Seiffert et al., 1999）を使用した。

ＦＧＦＲ−４の細胞外領域を、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅をおこなった：センス：

アンチセンス：

ＰＣＲ産物をＥｃｏＲ１およびＸｈｏ１で消化し、かつｐＳｊ２６（ｍｏｄ）中にクローニングした。得られたｐＳｊ２６（ｍｏｄ）−ＦＧＦＲ−４ｅｘ発現プラスミドを２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）中に燐酸カルシウム塩ＤＮＡ共沈法を用いてトランスフェクトした。細胞を、１０％ＦＣＳを添加したダルベッコ モディファイト イーグルス バッファー（ＤＭＥＭ）中で成長させた。１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Sigma, Deisenhofen, Germany）を用いて２週間に亘って選択淘汰した後に、生存するクローンをＧＳＴに対する抗体を用いてウエスタンブロッティングによって、融合タンパク質の発現および分泌に関して試験した。高発現性細胞をＦＧＦＲ−４ｅｘを製造するために使用した。培地をコンフレントな培養物から２日間毎に捕集した。捕集された培地１Ｌを滅菌濾過し、かつ１ｍｌのグルタチオンセファロース（PPharmacia Biothech, Freiburg, Germany）で４℃で一晩に亘ってインキュベートした。セファロースを分離し、かつ燐酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄した。溶離を２０℃で、５ｍｌの１０ｍｍｏｌ／ｌグルタチオンでおこなった。溶離した融合タンパク質を、ＰＢＳ／１０％グリセロール中１：１０^６（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で透析した。タンパク質濃度を、ＭｉｃｒｏＢＣＡタンパク質測定キット（Pierce, Rockfold, IL）を用いて測定した。

モノクローナル抗体は、前記に示したようにＦＧＦＲ−４の全細胞外領域を含有する、精製された組み換えＦＧＦＲ−４−ＧＳＴ融合タンパク質を用いての４週から８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの免疫化によって製造された。マウスは、ＡＢＭ−２アジュバント（PanSystems, Aidenbach, Germany）中で希釈された５０μｇタンパク質（１：２）を用いて、１４日間隔で３回に亘って筋肉内注射した。脾臓をＳＰ２／０骨髄細胞系と融合させるための最終注入から４日後に除去した。得られたハイブリドーマ細胞を、１０％ＦＣＳ、抗生物質およびハイポキサチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ）（Sigma）を含有するＰＲＭＩ１６４０培地中で成長させた。カルチャー上清をＮＩＨ−３Ｔ３／ｈｕＦＧＦＲ−４細胞（前記に示す）および選択的にトランスフェクタントを認識するポジティブなハイブリドーマ分泌抗体上でフローサイトメトリーによりスクリーニングするが、しかしながら、親ＮＩＨ−３Ｔ３細胞は限界希釈によってクローニングされなかった。ＦＧＦＲ−４反応性クローン（４ＦＡ６Ｄ３Ｃ１０）を１％ニュートリドーマ（Roche, Germany）を含有する血清不含の培地中で培養し、かつ抗体をタンパク質Ｇ−セファロースカラム（Pharmacia Biothech, Freiburg, Germany）を用いて上清から精製した。

ＦＧＦＲ−４活性上の４ＦＡ６Ｄ３Ｃ１０の機能的役割を評価するために、Ｌ６／ｈｕＦＧＦＲ−４細胞を３７℃で１０分に亘って未処理のままにするか、あるいは１０および２０μｇ／ｍｌの４ＦＡ６Ｄ３Ｃ１０で刺激した。細胞を、溶解バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、この場合、これは１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭ フッ化ナトリウム、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、１ｍＭナトリウムオルトバナデート、１ｍＭ β−グリセロールホスフェート、１０μｇ／ｍｌ アプロチニン）上で、氷上で溶解した。粗溶解物を１２５００ｇで、４℃で２０分に亘って遠心分離した。過剰発現されたＦＧＦＲ−４を、ポリクローナルＦＧＦＲ−４抗体（Santa Cruz）およびクリアーな溶解物に添加された３０μｌのプロテインＡ−セファロース（Pharmacia）によって免疫沈降させ、４℃で３時間に亘ってインキュベートした。免疫沈降物を洗浄バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、この場合、これは、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭフッ化ナトリウム１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する）で洗浄した。ＳＤＳおよび２−メルカプトエタノールを含有する試料バッファーを添加し、かつ試料を９５℃で４分に亘って加熱することによって変性させた。

タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、かつニトロセルロースフィルターにトランスファーした。ＦＧＦＲ−４のチロシン燐酸化レベルを測定するために、ニトロセルロースフィルターを、ホスホチロシン特異的マウスモノクローナル抗体４Ｇ１０（Upstate Biotechnology）で４℃でインキュベートした。その後にＨＴＰ−結合ヤギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギ第２抗体を添加し、その後に、増強ケミルミネセンス（ＥＣＬ）基質反応（Amersham, Germany）をおこなった。基質反応を、ＫｏｄａｋＸ−Ｏｍａｒｔフィルム上で検出した。免疫沈降したＦＧＦＲ−４タンパク質の等量を確定するために、フィルターを製造者によるプロトコール（Amersham, Germany）にしたがってストリッピングし、ブロッキングし、かつ、ポリクローナルＦＧＦＲ−４抗体でリプロービングした。

４ＦＡ６Ｄ３Ｃ１０でのＬ６／ｈｕＦＧＦＲ−４細胞の処理によって、図２に示すようなＦＧＦＲ−４チロシンリン酸化の著しい増加を導いた。これらのデータは、モノクローナル抗体および特に４ＦＡ６Ｄ３Ｃ１０が、ＦＧＦＲ−４レセプター活性のために使用できることを明らかにした。

第１表：
４ｘ１０^６細胞を、それぞれのマウスに頸部領域に皮下注射によって接種した（１４０μｌ細胞懸濁液＋６０μｌマトリゲル；１３μｇ／ｍｌ）。腫瘍成長を２〜３日毎にモニタリングした。動物を、６週間後かまたは腫瘍直径が１ｃｍ^３の大きさに達した時点で殺処分した。これらの細胞によって形成された腫瘍の大きさ^ａは、ｐＬＸＳＮベクター単独で感染されたコントロール細胞によって形成された腫瘍の大きさよりも有意に小さい。ｐｌｘ：コントロール細胞、ＷＴ：ＦＧＦＲ−４ Ｇｌｙ３８８；ＭＴ：ＦＧＦＲ−４ Ａｒｇ３８８。
例２：
ＦＧＦＲ４およびそのリガンドは、多くのヒト癌細胞系において発現するけれども、ヒト腫瘍発達の調整におけるＦＧＦ４の役割は完全には知られていなかった。ヒト癌細胞の腫瘍成長を調節するＦＧＦＲ４の機能を分析するために、異所的にヒトＦＧＦＲ４を発現するヒト乳癌細胞系ＢＴ５４９およびＭＣＦ７を使用した。

乳癌細胞ＭＣＦ７細胞を１２穴プレート中で３重にプレーティングし、５０００細胞／１０％ＦＣＳを含有する５００μｌ培地上清で２４時間に亘ってインキュベートした。細胞を、１％ＦＣＳ中の１０ｎｇ／ｍｌのａＦＧＦおよびｂＦＧＦまたは２５ｎｇ／ｍｌのβ−ヘレグリンで刺激し、かつ６日間に亘って成長させた。乳癌細胞系ＢＴ５４９の場合においては、細胞を９６穴プレート中で６重にプレーティングし、１０００細胞／１００μｌで、通常の成長培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ；０．０６５％インスリン４０Ｕ／ｍｌ）で、２４時間に亘ってインキュベートした。培地を除去し、かつ細胞を１０ｎｇ／ｍｌのａＦＧＦ、ｂＦＧＦまたは２５ｎｇ／ｍｌのβ−ヘレグリンで、７２時間に亘ってＦＣＳおよびインスリンを用いることなく処理した。増殖を非ＲＩ ＡｌｍａｒＢｌｕｅ アッセイ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を用いてアッセイした。要するに、ＡｌｍａｒＢｌｕｅをカルチャー容量の１０％と同量で添加し、かつ３７℃で２時間に亘ってインキュベートした。フルオレセンスを５４４ｎｍでの励起波長および５８０ｎｍでの放出波長で測定した。比較目的のために容量を算定し、かつコントロールの百分率として示した（未刺激細胞）。

図３で示すように、空ベクターで感染させたＭＣＦ７細胞のａＦＧＦまたはｂＦＧＦ刺激によって、生細胞の有意な増加が示された。さらに、β−ヘレグリンでの処理またはβ−ヘレグリンとｂＧＦＧとでの同時の処理によって細胞増殖を活性化させた。しかしながら、ａＦＧＦまたはｂＦＧＦでの、異所的にＦＧＦＲ４（ＭＣＦ７ ＦＧＦＲ４−クローン１、−クローン２）を発現するＭＣＦ７細胞の暴露は減少した細胞成長を示す。さらに、ＦＧＦＲ４を発現するＢＴ５４９乳癌細胞の増殖は、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦまたはβ−ヘレグリン（図４）で刺激する場合には減少するが、それにもかかわらずＢＴ５４９コントロール細胞の細胞増殖は作用しない。したがって、ＦＧＦＲ４は、ＭＣＦ７およびＢＴ５４９乳癌細胞のインヒビターとして機能するものである。

創傷アッセイにおけるヒトＦＧＦＲ−４Ｇｌｙ３８８を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞（ＡＴＣＣＨＴＢ−２６）の遊走を示す図 ヒトＦＧＦＲ−４を発現するＬ６筋芽細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４５８）のウエスタンブロッティングの結果を示す図 ヒトＦＧＦＲ−４を発現するＭＣＦ７乳癌生細胞（ＭＣＦ７／ＦＧＦＲ−４クローン１および−クローン２）を、リガンドａＦＧＦおよびｂＦＧＦで処理した結果を示す図 ヒトＦＧＦＲ−４を発現するＢＴＢ５４９乳癌生細胞（ＢＴＢ５４９／ＦＧＦＲ−４クローン１および−クローン２）を、リガンドａＦＧＦおよびｂＦＧＦで処理した結果を示す図

Claims (21)

1. 診断薬または治療薬を製造するための、線維芽細胞成長因子レセプター種４（ＦＧＦＲ−４）の活性を刺激しうる化合物の使用。
2. ＦＧＦＲ−４機能不全と関連する病理学的症状の予防および／または治療のための薬剤を製造するための、請求項１に記載の使用。
3. ＦＧＦＲ−４が、ＦＧＦＲ−４ Ｇｌｙ３８８である、請求項１または２に記載の使用。
4. ＦＧＦＲ−４活性が、チロシンキナーゼ活性および／または他のタンパク質との相互作用から選択される、請求項１から３までのいずれか１項に記載の使用
5. 化合物がＦＧＦＲ−４種と結合する、請求項１から４までのいずれか１項に記載の使用。
6. 化合物が、天然または合成のＦＧＦＲ−４リガンドである、請求項１から５までのいずれか１項に記載の使用。
7. 化合物が、抗ＦＧＦＲ−４抗体またはスカフォールドタンパク質である、請求項１から５までのいずれか１項に記載の使用。
8. 化合物が、ＦＧＦＲ−４の上流の標的と相互に作用する、請求項１から４までのいずれか１項に記載の使用。
9. 化合物が、標的細胞または標的生体中に投与および／または過剰発現されるＦＧＦＲ−４遺伝子である、請求項１から４までのいずれか１項に記載の使用。
10. 病理学的症状が、高増殖性疾病、たとえば腫瘍形成性疾病、骨障害または血管障害である、請求項２に記載の使用。
11. ＦＧＦＲ−４機能不全と関連する疾病の予防および／または治療のための方法において、化合物を、線維芽細胞増殖因子レセプター種４（ＦＧＦＲ−４）との結合を示し、かつ結合によりＦＧＦＲ−４活性を刺激することが可能な十分な量で、これを必要とする対象物に投与することを含む、ＦＧＦＲ−４機能不全と関連する疾病の予防および／または治療のための方法。
12. ＦＧＦＲ−４機能不全と関連する疾病の予防および／または治療のための方法において、化合物を、ＦＧＦＲ−４活性を刺激する十分な量でこれを必要とする対象物に投与することを含む、ＦＧＦＲ−４機能不全と関連する疾病の予防および／または治療のための方法。
13. 対象物が哺乳類である、請求項１１または１２に記載の方法。
14. 対象物がヒト患者である、請求項１１または１２に記載の方法。
15. 線維芽細胞増殖因子レセプター種４（ＦＧＦＲ−４）と結合し、かつ結合によりＦＧＦＲ−４活性を刺激することが可能な化合物を有効成分として、かつ場合によってはさらに製薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤および／またはアジュバントと一緒に含有する、医薬品組成物。
16. ＦＧＦＲ−４機能不全、特に高増殖性疾病と関連する病理学的症状を予防および／または治療するための、請求項１５に記載の医薬組成物。
17. 試料中でのＦＧＦＲ−４の発現を測定することを含む、ＦＧＦＲ−４機能不全と関連する病理学的症状を診断するための方法。
18. 細胞または生体において、ＦＧＦＲ−４機能不全と関連する病理学的プロセスの新規インヒビターを同定するための方法において、
    （１）ＦＧＦＲ−４との結合を示し、かつ好ましくは、
    （２）これと結合することによってＦＧＦＲ−４活性を刺激する、
    ことについての化合物の性能を試験することを含む、細胞または生体において、ＦＧＦＲ−４機能不全と関連する病理学的プロセスの新規インヒビターを同定するための方法。
19. 高スループットアッセイである、請求項１８に記載の方法。
20. ＦＧＦＲ−４と結合し、かつ前記ＦＧＦＲ−４の活性を刺激しうる抗体を発現可能な細胞系。
21. ＦＧＦＲ−４と結合し、かつ前記ＦＧＦＲ−４の活性を刺激しうる抗体。

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