JP2014516511A - 抗ｆｇｆｒ４抗体及び使用方法 - Google Patents

抗ｆｇｆｒ４抗体及び使用方法 Download PDF

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Abstract

発明は抗ＦＧＦＲ４抗体及びその使用方法を提供する。

Description

(関連出願の相互参照)
この出願は、２０１１年４月７日に出願された米国特許出願番号６１／４７３，１０６の優先権を主張するものであり、その内容を出典明記によってここに援用する。
(配列表)
本出願はＥＦＳ-Ｗｅｂを通してＡＳＣＩＩフォーマットにおいて提出されている配列表を含み、その全体を出典明記によってここに援用する。２０１２年３月２２日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、名称P4524R1WO.txtであり、サイズは３７，０２０である。
(発明の分野)
本発明は抗ＦＧＦＲ４抗体、及びその使用方法に関する。
線維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)は多様な生物学的活性を伴うポリペプチドに構造的に関連する２２のファミリーを含む；これらのシグナル伝達分子の多くはそれらの同族の受容体(ＦＧＦＲ；ＦＧＦＲ１-４と命名される)、受容体チロシンキナーゼのファミリーに結合し活性化させることによって機能する。これらの受容体-リガンド相互作用は、受容体二量体化及び自己リン酸化、膜結合型及び細胞質アクセサリータンパク質との複合体の形成、及び複数のシグナル伝達カスケードの開始をもたらす。ＦＧＦＲ-ＦＧＦシグナル伝達系は、細胞機能／プロセス、例えば増殖、分化、遊走、形態形成、及び血管新生を制御することにより、発生及び組織修復において重要な役割を果たす。
ＦＧＦＲにおける変更(すなわち過剰発現、変異、トランスロケーション、及びトランケーション)は、骨髄腫 乳房、胃、結腸、膀胱、膵臓、及び肝細胞癌を含む多くのヒト癌に伴われる。肝細胞癌(ＨＣＣ)は、癌に関連した死亡の主要な世界的原因の一つであり、年あたり５０万を超す死亡者をだす。癌におけるＦＧＦＲ４の役割は十分に解明されないままであり、幾つかの発見はこの受容体がＨＣＣ発生及び／又は進行において重要な役割を果たしうることを示唆する。ＦＧＦＲ４はヒト肝細胞に存在する主なＦＧＦＲアイソフォームである；我々はまた肝臓組織が最も高い転写レベルのＦＧＦＲ４を有することを既に報告した(Lin et al., 2007)。肝癌(並びに幾つかのタイプのヒト腫瘍)において過剰に発現されているＦＧＦＲ４に加えて、幾つかのミスセンス遺伝子変化がＨＣＣ患者サンプルにおいて観察されている；特に、ＦＧＦＲ４における高頻度のＧ３８８Ｒ一塩基多型(頭頸部癌では低減された生存率、並びに結腸、軟部組織、前立腺、及び乳癌では悪性表現型を伴う)が同定された。更に、マウスにおけるＦＧＦ１９(すなわちＦＧＦＲ４−特異的リガンド)の異所性発現が肝細胞増殖、肝細胞異形成、及び新生物形成を促進することが既に実証されている。
治療剤として開発に最適である臨床特性を有する薬剤に対するニーズがいまだあることが明らかである。ここに記載の発明はこのニーズを満たし、また他の利点を提供する。ここに引用される全ての参照文献は、特許出願及び刊行物を含め、その全体が出典明記により援用される。
発明は抗ＦＧＦＲ４抗体及びその使用方法を提供する。
一態様では、発明は、ＦＧＦＲ４に結合する単離された抗体であって、≦１ｎＭの親和性でヒトＦＧＦＲ４に結合する抗ＦＧＦＲ４抗体を提供する。幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は≦１ｎＭの親和性でヒト、マウス及びカニクイザルＦＧＦＲ４に結合する。幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は≦０．０５ｎＭの親和性でヒトＦＧＦＲ４に結合する。
幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は図１２Ｄに示すアミノ酸配列を有するマウスＣ３タンパク質に実質的に結合しない。
幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は変性ＦＧＦＲ４に結合する。幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は変性、還元ＦＧＦＲ４に結合する。幾つかの実施態様では、ＦＧＦＲ４に対する抗ＦＧＦＲ４抗体の結合はウエスタンブロットを使用して検出される。
幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はＧ１６５Ａ変異を含んでなるヒトＦＧＦＲ４に有意に結合しない。幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はアミノ酸番号１５０〜１７０の成熟ヒトＦＧＦＲ４アミノ酸配列を含んでなるか、から基本的に成るか又はから成る配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％の配列同一性又は類似性を有するポリペプチドに結合する。幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はアミノ酸番号１５０〜１７０の成熟ヒトＦＧＦＲ４アミノ酸配列を含んでなるか、から基本的になるか又はからなるポリペプチドに結合する。
幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４はＦＧＦＲ４活性のアンタゴニストである。幾つかの実施態様では、ＦＧＦＲ４活性はＦＧＦ誘導細胞増殖、ＦＧＦＲ４へのＦＧＦ結合、ＦＧＦ１９に曝露された細胞におけるＣＹＰ７α７発現のＧＦ１９−媒介阻害、又はＦＧＦ１９−誘導コロニー形成である。幾つかの実施態様では、ＦＧＦＲ４に対するＦＧＦ１及び／又はＦＧＦ１９結合が阻害される。幾つかの実施態様では、ＦＧＦＲ４に対するＦＧＦ１結合の阻害のＩＣ５０は約０．１０ｎＭであり、ＦＧＦＲ４に対するＦＧＦ１９結合の阻害のＩＣ５０は約０．１０ｎＭである。
幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体モノクローナル抗体である。
幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はヒト、ヒト化、キメラ抗体である。
幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はＦＧＦＲ４に結合する抗体断片である。
幾つかの実施態様では、抗体は(ａ)配列番号：３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ３、(ｂ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ３、及び(ｃ)配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ２を含む。
幾つかの実施態様では、抗体は(ａ)配列番号：１のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ１、(ｂ)配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ２、及び(ｃ)配列番号：３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ３を含む。幾つかの実施態様では、抗体は(ａ)配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ１、(ｂ)配列番号：５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ２、及び(ｃ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ３を更に含む。
幾つかの実施態様では、抗体は(ａ)配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ１、(ｂ)配列番号：５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ２、及び(ｃ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ３を含む。幾つかの実施態様では、抗体は配列番号：９、１０、１１及び／又は１２の軽鎖可変ドメインフレームワーク配列を更に含む。
幾つかの実施態様では、抗体は配列番号：１３、１４、１５及び／又は１６の重鎖可変ドメインフレームワーク配列を更に含む。
幾つかの実施態様では、抗体は、(ａ)配列番号：７のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；(ｂ)配列番号：８のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は(ｃ)(ａ)のＶＨ配列及び(ｂ)のＶＬ配列を含む。幾つかの実施態様では、抗体は配列番号：７のＶＨ配列を含む。幾つかの実施態様では、抗体は配列番号：８のＶＬ配列を含む。
幾つかの実施態様では、抗体は配列番号：７のＶＨ配列及び配列番号：８のＶＬ配列を含む。
幾つかの実施態様では、抗体は完全長ＩｇＧ１抗体である。
発明はまた、ここに記載の何れかの抗体をコードする単離された核酸を提供する。
発明はまた、ここに記載の何れかの核酸を含んでなる宿主細胞を提供する。
発明はまた、抗体が生産されるようにここに記載の宿主細胞を培養することを含んでなる抗体の生産方法を提供する。幾つかの実施態様では、方法は宿主細胞から抗体を回収することを更に含む。
発明はまた、ここに記載の何れかの抗体及び細胞傷害剤を含んでなるイムノコンジュゲートを提供する。
発明はまた、ここに記載の何れかの抗体及び薬学的に許容可能な担体を含んでなる薬学的製剤を提供する。幾つかの実施態様では、薬学的製剤は更なる治療剤を更に含む。
発明はまた、医薬としての使用のためのここに記載の何れかの抗体を提供する。
幾つかの実施態様では、抗体は癌の治療における使用のためである。
幾つかの実施態様では、抗体は細胞増殖の阻害における使用のためである。
幾つかの実施態様では、抗体は医薬の製造における使用のためである。
幾つかの実施態様では、医薬は癌の治療のためである。
幾つかの実施態様では、医薬は細胞増殖の阻害のためである。
発明はまた、癌を有する個体を治療する方法において、個体に有効量のここに記載の何れかの抗体を投与することを含んでなる方法を提供する。幾つかの実施態様では、方法は個体に更なる治療剤を投与することを更に含む。
発明はまた、個体における細胞増殖を阻害する方法において、細胞増殖を阻害するために個体に有効量のここに記載の何れかの抗体を投与することを含んでなる方法を提供する。
幾つかの実施多様では、癌は、乳房、肺、膵臓、脳、腎臓、卵巣、胃、白血病、子宮内膜、結腸、前立腺、下垂体、乳房線維腺腫、頭頸部、軟部組織、神経芽細胞腫、メラノーマ、子宮内膜、精巣、胆管細胞癌、胆嚢及び／又は肝臓の癌である。
ある実施態様はでは、癌はＦＧＦＲ４発現(例えば過剰発現)、増幅、又は活性化を呈する。ある実施態様はでは、癌はＦＧＦＲ４増幅を呈する。
ＦＧＦＲ４はＦＧＦ１９−媒介肝腫瘍形成に必要である。Ａ、年齢１０ヶ月のＦＧＦ１９−ＴＧ：ＦＧＦＲ４−ＷＴマウスの肝臓表面から突出する複数の大きい隆起腫瘍(矢印)(左パネル)。年齢１０ヶ月のＦＧＦ１９−ＴＧ：ＦＧＦＲ４−ＫＯマウスからの肝臓(右パネル)。Ｂ、ＦＧＦＲ４−ＫＯ又はＦＧＦＲ４−ＷＴマウスで交配された雌(左パネル)及び雄(右パネル)ＦＧＦ１９−ＴＧ又は野生型マウスにおけるＢｒｄＵ取り込み。Ｃ、ＤＥＮで処置された年齢４ヶ月のＦＧＦ１９−ＴＧ：ＦＧＦＲ４−ＷＴマウスの肝臓の表面上の複数の大きい隆起腫瘍(矢印)。Ｄ、肉眼及び組織学的検査で決定されるＤＥＮで処置された雄及び雌ＦＧＦ１９−ＴＧマウスにおける肝腫瘍の有病率。Ｅ、ＤＥＮで処置されたＦＧＦ１９−ＴＧ又は野生型雌(左パネル)及び雄(右パネル)マウスからの肝重量。アステリスク(＊)は、肝臓の重量はＤＥＮで処置された雄ＦＧＦ１９−ＴＧマウスについては７ヶ月の時点から測定不可能であることを示し、なぜなら６ヶ月の年齢を超すと何れも生存しなかったからである。Ｆ、ＤＥＮで処置されたＦＧＦ１９−ＴＧ又は野生型雌(左パネル)及び雄(右パネル)ＦＧＦＲ４−ＫＯマウスの肝重量。 ＦＧＦＲ４へのＬＤ１結合。Ａ、ＬＤ１はヒト(ｈ)、マウス(ｍ)、及びカニクイザル(ｃ)ＦＧＦＲ４に結合するが、ｈＦＧＦＲ１、ｈＦＧＦＲ２、又はｈＦＧＦＲ３に結合しない。固定化ＦＧＦＲ−Ｆｃキメラタンパク質へのＬＤ１の結合を固相結合アッセイで決定した。Ｂ、表面プラズモン共鳴で決定されるマウスカニクイザル、及びヒトＦＧＦＲ４へのＬＤ１結合の親和性。Ｃ、ＦＡＣＳで測定される安定してトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の細胞表面に発現されたｈＦＧＦＲ４へのＬＤ１の結合(ＲＦＵ＝相対蛍光単位)。Ｄ、固相結合アッセイで決定される点変異を持つ固定化ｈＦＧＦＲ４−Ｆｌａｇキメラタンパク質へのＬＤ１の結合。Ｅ、ウエスタンブロットで決定される点変異を持つｈＦＧＦＲ４−Ｆｌａｇキメラタンパク質へのＬＤ１の結合。変異タンパク質を電気泳動し、ＬＤ１、抗ＦＧＦＲ４(８Ｇ１１)、及び抗Ｆｌａｇ抗体を使用して逐次的に免疫ブロットした。Ｆ、ＦＧＦ１９(灰色)に結合したＦＧＦＲ４(黒及び白)上のＧ１６５(黒)の位置を示す二量体モデル。 ＬＤ１はＦＧＦＲ４活性を阻害する。Ａ、ＬＤ１はＦＧＦ１及びＦＧＦ１９へのＦＧＦＲ４結合を阻害し、固相結合アッセイで決定される。Ｂ、ＬＤ１はＦＧＦＲ４／Ｒ１を安定に発現するＢａＦ３細胞のＦＧＦ１−刺激増殖を阻害する。Ｃ、ＬＤ１はＦＧＦＲ４を安定に発現するＬ６細胞におけるＦＧＦＲ４シグナル伝達を阻害する。Ｄ、ＬＤ１を使用したＦＡＣＳ分析で決定される肝腫瘍細胞株のサブセットにおけるＦＧＦＲ４タンパク質の細胞表面発現。 ＬＤ１は肝癌細胞株におけるＦＧＦＲ４生物学的活性を阻害する。Ａ、ＬＤ１はＨＥＰ３Ｂ細胞におけるＦＧＦＲ４シグナル伝達を阻害し、ウエスタンブロットで評価される。Ｂ、ＬＤ１はＨＥＰ３Ｂ細胞におけるＦＧＦＲ４−制御化ＣＹＰ７α１発現を阻害する。ＣＹＰ７α１レベルは未処置細胞におけるレベルに対する倍発現として表される。Ｃ、ＬＤ１は肝癌細胞株のパネルにおいてＦＧＦＲ４−制御化ｃ−Ｆｏｓ発現を阻害する。結果は未処置細胞におけるｃ−Ｆｏｓレベルに対する倍発現として表される。Ｄ、ＦＧＦＲ４ｓｈＲＮＡドキシサイクリン−誘導ベクターで安定にトランスフェクトされたＪＨＨ５細胞におけるＦＧＦＲ４発現の抑制によるコロニー形成の阻害。Ｅ、ＬＤ１はＨＣＣ細胞株コロニー形成を阻害する。Ｆ、ＬＤ１−阻害化肝癌細胞株コロニー形成の数え上げ。値は添加ＬＤ１の非存在において数え上げられたコロニーの数のパーセントとして表される。 ＬＤ１のインビボ効果。Ａ、ＬＤ１はマウス肝臓におけるＦＧＦ１９−制御化ｃ−Ｆｏｓ発現を阻害する。結果は非処置マウスの肝臓におけるｃ−Ｆｏｓレベルに対する倍発現として表される。Ｂ、ＬＤ１(３０ｍｇ／ｋｇ；週に２回)はインビボでＨＵＨ７異種移植腫瘍増殖を阻害する。Ｃ、図５ＢからのＨＵＨ−７異種移植腫瘍におけるＦＧＦＲ４、ＣＹＰ７α１、ｃ−Ｆｏｓ、及びｅｇｒ−１のｍＲＮＡ発現におけるＬＤ１の効果。Ｄ、コントロール抗体で処置されたＤＥＮ−促進化ＦＧＦ１９−ＴＧ：ＦＧＦＲ４−ＷＴマウスの肝臓表面から突出した複数の大きい隆起腫瘍(矢印)(上パネル)。ＬＤ１で処置されたＤＥＮ−促進化ＦＧＦ１９−ＴＧ：ＦＧＦＲ４−ＷＴマウスの肝臓(下パネル)。Ｅ、コントロール抗体、ＬＤ１、又は１Ａ６(抗ＦＧＦ１９抗体)で処置されたＤＥＮ−促進化ＦＧＦ１９−ＴＧ：ＦＧＦＲ４−ＷＴマウスの肝重量。 ＦＧＦＲ４発現は癌において調節解除される。Ａ、箱ひげプロットはＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓデータベースのｍＲＮＡ分析で決定されるヒト腫瘍及び正常組織におけるＦＧＦＲ４発現を示す。中心線は中央値を示す；箱は第一及び第三四分位間の四分位範囲を表す。「ひげ」は四分位間から極値の位置まで延在する。Ｂ、乳房(Ｘ１００拡大率)及び膵臓(Ｘ１００拡大率)腺癌、及び肝細胞癌(Ｘ２００拡大率及びＸ４００拡大率)のサンプルにおけるＦＧＦＲ４免疫染色。Ｃ、ｑＲＴ−ＰＣＲで決定されるヒト正常肝及び肝腫瘍のパネルにおけるＦＧＦＲ４ｍＲＮＡ発現。各サンプルの値をサンプルＮ１において観察されるレベルに対する倍発現として表す。 肝癌細胞株におけるＦＧＦＲの発現。Ａ、ｑＲＴ−ＰＣＲで決定される肝腫瘍細胞株のパネルにおけるＦＧＦＲ４ｍＲＮＡ発現。値はＪＨＨ４細胞株におけるＦＧＦＲ１レベルに対する倍発現として表される。Ｂ、ウエスタンブロットで決定される図Ｓ１Ａにおける同じパネルの細胞株におけるＦＧＦＲ４タンパク質発現。 ＬＤ１はＨＵＨ７細胞におけるＦＧＦＲ４生物学的活性を阻害する。ＬＤ１はＨＵＨ７細胞におけるＦＧＦＲ４−制御化ＣＹＰ７α１発現を阻害する。ＣＹＰ７α１レベルは未処置細胞におけるレベルに対する倍発現として表される。 ＬＤ１のインビボ効果。ＬＤ１(３０ｍｇ／ｋｇ)はインビボでのＨＵＨ７異種移植腫瘍増殖を阻害する。ＬＤ１の抗腫瘍効果を隔週モダリティにおいて評価した。 抗ＦＧＦＲ４のマウス及びヒト化変異体の可変ドメイン配列。マウスＬＤ１及びヒト化変異体ｈＬＤ１のアミノ酸配列。ｖＢ及びｈＬＤ１．ｖ２２をトラスツズマブにおいて使用される(Ａ)ヒトカッパＩ(ｈｕＫＩ)及び(Ｂ)ヒトＶＨサブグループＩＩＩ(ｈｕＩＩＩ)可変ドメインフレームワークとアラインする。差異をドットボックスにおいてハイライトし、位置をＫａｂａｔに従って番号付けする。マウスＬＤ１からヒト可変カッパＩ及びサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークに移植された超可変領域を配列、構造及び接触ＣＤＲ定義の組合せに基づいて選択し(MacCallum RM et al.. J of Molec Biol (1996); 262:732-45)、ボックスで囲む。軽鎖における３つの副尺位置を変更し、ヒト化の間親和性を回復した；これらの位置が曝露される表面であると予測された。 抗ＦＧＦＲ４抗体変異体の薬物動態及び分布。(Ａ)ＦＧＦＲ４ ＥＬＩＳＡを使用したＦＧＦＲ４へのｃｈＬＤ１及びｈＬＤ１．ｖＢの結合の比較。(Ｂ)ＣＲＬｎｕ／ｎｕマウスにおけるＨＵＨ７ヒト肝細胞癌異種移植モデルにおけるｃｈＬＤ１、ｈＬＤ１．ｖＢ及びビヒクルの１６日目の腫瘍体積の比較。抗体を週に２回３０ｍｇ／ｋｇで投与した(１０マウス／グループ)。ｃｈＬＤ１のみがＰＢＳコントロールと比較して腫瘍増殖の低減に有効であり(ｐ値＝０．０１４)、ｈＬＤ１．ｖＢは有意には有効ではなかった(ｐ値＝０．４８６)。(Ｃ)ｃｈＬＤ１及びｈＬＤ１．ｖＢＮＣＲｎｕｄｅマウスの薬物動態を１又は２０ｍｇ／ｋｇＩＶで投与し、サンプルをＦＧＦＲ４ ＥＬＩＳＡを使用して分析した。類似な結果がＩｇＧ ＥＬＩＳＡを使用して得られた(示さず)。(Ｄ)ＮＣＲｎｕｄｅマウスにおける１２５Ｉ−ｃｈＬＤ１及び１２５Ｉ−ｈＬＤ１．ｖＢの組織分布。マウスに１２５Ｉ−ｃｈＬＤ１又は１２５Ｉ−ｈＬＤ１．ｖＢを投与し、組織の投与量／グラムのパーセント(％ＩＤ／ｇ)を方法に記載のように投与の２時間後に決定した。 ｈＬＤ１．ｖＢ及びマウスＣ３ｄ間の相互作用の同定。(Ａ)ＰＢＳ／ＢＳＡ又はＮＣＲｎｕｄｅマウス、ラット、ヒト及びカニクイザル血漿における４８時間のインキュベーション後のｃｈＬＤ１(斜線バー)及びｈＬＤ１．ｖＢ(白色バー)の検出。パーセント回収をＦＧＦＲ４ ＥＬＩＳＡを使用して決定した。(Ｂ)１２５Ｉ−ｃｈＬＤ１(中実線)及び１２５Ｉ−ｈＬＤ１．ｖＢ(点線)の血漿結合分析。トレースはオフセットである；ドットは１５０ｋＤａピークの位置を示す。抗体を０及び４８時間マウス血漿においてインキュベートし、その後サイズ排除ＨＰＬＣを使用して分析した。ＰＢＳ／ＢＳＡにおけるインキュベーションでは、ヒト血漿又はカニクイザル血漿であり、図１５を参照のこと。全インキュベーションはＩｇＧに対応する予測された１５０ｋＤａでピークを生じた。高分子量ピークはｈＬＤ１．ｖＢを含有するマウス血漿サンプルにおいてのみ観察された。最初の時間点はおよそ２７０及びおよそ５５０ｋＤａで更なるピークを示したが、４８時間では２７０ｋＤａピークのみが観察された。高分子量ピークはｈＬＤ１．ｖＢ／マウス血漿インキュベーションがｐＨ４で実施された場合には観察されず、これらの高分子量ピークの存在がｐＨ依存であることを示す(図１５)。(Ｃ)マウス血漿の免疫沈降。ｃｈＬＤ１及びｈＬＤ１．ｖＢを３７°Ｃで２４時間マウス血漿においてインキュベートし、サイズ排除ＨＰＬＣで分析した。次いでプロテインＧビーズを画分に加え、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析をした。およそ３７ｋＤａでのバンドがｈＬＤ１．ｖＢ／マウス血漿サンプル(レーン３)に存在する２７０ｋＤａピークに対応する画分において検出されたが、カニクイザル又はヒト血漿又はＰＢＳ／ＢＳＡからのサンプルでは検出されなかった(図１５)。このバンドはマウス血漿のみ(レーン４)又はｃｈＬＤ１でインキュベートされたマウス血漿(レーン２)において観察されなかった。タンパク質分子量マーカーをレーン１において実行した。(Ｄ)ｈＬＤ１．ｖＢでの免疫沈降から得られたマウスＣ３のＭＳ／ＭＳ配列包括度。マウスＣ３の配列を示し(配列番号：３８)、Ｃ３ｄをコードする領域に下線をひく。同定されたペプチドは以下の通りである：ＤＶＰＡＡＤＬＳＤＱＶＰＤＴＤＳＥＴＲＩＩＬＱＧＳＰＶＶＱＭＡＥＤＡＶＤＧＥＲ(配列番号：１７)ＲＱＥＡＬＥＬＩＫＫＧＹＴＱＱＬＡＦＫ(配列番号：１８)ＡＡＦＮＮＲＰＰＳＴＷＬＴＡＹＶＶＫ(配列番号：１９)ＡＡＮＬＩＡＩＤＳＨＶＬＣＧＡＶＫ(配列番号：２０)ＱＫＰＤＧＶＦＱＥＤＧＰＶＩＨＱＥＭＩＧＧＦＲ(配列番号：２１)ＥＡＤＶＳＬＴＡＦＶＬＩＡＬＱＥＡＲＤＩＣＥＧＱＶＮＳＬＰＧＳＩＮＫＡＧＥＹＩＥＡＳＹＭＮＬＱＲＰＹＴＶＡＩＡＧＹＡＬＡＬＭＮＫ(配列番号：２２)ＷＥＥＰＤＱＱＬＹＮＶＥＡＴＳＹ(配列番号：２３)ＹＹＧＧＧＹＧＳＴＱＡＴＦＭＶＦＱＡＬＡＱＹＱＴＤＶＰＤＨＫ(配列番号：２４)ＧＴＬＳＶＶＡＶＹＨＡＫ(配列番号：２５)ＤＬＥＬＬＡＳＧＶＤＲ(配列番号：２６)ＮＴＬＩＩＹＬＥＫ(配列番号：２７)． Ｃ３ｄ結合を欠く親和性成熟抗ＦＧＦＲ４変異体。(Ａ)ＦＧＦＲ４ＥＬＩＳＡを使用した評価より前にＮＣＲｎｕｄｅ、Ｃ３野生型(ｗｔ)及びＣ３ｋｏマウス血清において１６時間インキュベートされたｃｈＬＤ１、ｈＬＤ１．ｖＢ及びｈＬＤ１．ｖ２２のＦＧＦＲ４結合の検出。サンプルをＰＢＳ／０．５％ＢＳＡにおいてインキュベートされた同一のサンプルに対して正規化した。(Ｂ)ｈＬＤ１．ｖ２２によるマウスＣ３ｄ免疫沈降の欠如。ｃｈＬＤ１(レーン２)、ｈＬＤ１．ｖＢ(レーン３)及びｈＬＤ１．ｖ２２(レーン４)を使用したＮＣＲｎｕｄｅマウス血漿からの免疫沈降をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。￣３７ｋＤａでのバンドはｈＬＤ１．ｖＢ／マウス血漿サンプルにおいてのみ検出された。タンパク質分子量マーカーをレーン１において実行した。 Ｃ３ｄ結合の欠如は薬物動態及び効果を回復させる。(Ａ)Ｃ３ｗｔ及びＣ３ｋｏマウスにおけるｃｈＬＤ１及びｈＬＤ１．ｖＢの薬物動態分析。抗体を２０ｍｇ／ｋｇで静脈内に投与した；血液におけるそれらの濃度をＦＧＦＲ４ＥＬＩＳＡを使用してモニタした。Ｃ３ｋマウスにおけるｈＬＤ１．ｖＢのクリアランスはＣ３ｋｏ及びＣ３ｗｔマウス双方におけるｃｈＬＤ１のものと類似する。(Ｂ)ＮＣＲｎｕｄｅマウスにおけるｃｈＬＤ１ｈＬＤ１．ｖＢ及びｈＬＤ１．ｖ２２の薬物動態分析。抗体を２０ｍｇ／ｋｇで静脈内に投与した；血液におけるそれらの濃度をＦＧＦＲ４ ＥＬＩＳＡを使用してモニタした。ｈＬＤ１．ｖ２２のクリアランスはｃｈＬＤ１のものに類似する。(Ｃ)ＣＲＬｎｕ／ｎｕマウスにおけるＨＵＨ７ ヒトＨＣＣ異種移植モデルにおけるｃｈＬＤ１ ｈＬＤ１．ｖＢ及びｈＬＤ１．ｖ２２の比較。抗体を毎週３０ｍｇ／ｋｇで投与し(１０マウス／グループ)、腫瘍体積を４週間モニタした。２１日目にｃｈＬＤ１及びｈＬＤ１．ｖ２２(それぞれｐ値＝７ｘ１０−７及び３ｘ１０−５)はＰＢＳコントロール(中空四角)と比較して腫瘍増殖の低減に効果的であったが、ｈＬＤ１．ｖＢはわずかのみ効果的だった(ｐ値＝０．０１１)。 インビトロ(Ａ−Ｂ)及びインビボ試験(Ｃ)サンプルからの血漿における放射標識ｃｈＬＤ１及びｈＬＤ１．ｖＢのサイズ排除ＨＰＬＣ分析。１２５Ｉ−ｈＬＤ１．ｖＢ(Ａ)及び１２５Ｉ−ｃｈＬＤ１(Ｂ)をＰＢＳ／ＢＳＡ又はマウス、ヒト及びカニクイザル血漿に加え、０又は４８時間にサイズ排除ＨＰＬＣで分析した。全トレースはＩｇＧの予測された１５０ｋＤａ(右のピーク)でピークを呈した。およそ２７０(真ん中のピーク)及びおよそ５５０ｋＤａ(左のピーク)での高分子量ピークがｈＬＤ１．ｖＢを含有する最初のマウス血漿サンプルにおいてのみ観察された；４８時間では更なる２７０ｋＤａピークのみが観察された。これらの高分子量ピークはｐＨ４．０のマウス血漿においてｈＬＤ１．ｖＢで観察され、高分子量ピークの生成がｐＨ依存であることを示す。高分子量ピークはカニクイザル又はヒト血漿又はｃｈＬＤ１が加えられたいかなる血漿において観察されなかった；(Ｃ)インビボマウス血漿サンプル。マウスに、ｃｈＬＤ１については１２．５２μＣｉ／μｇ及びｈＬＤ１．ｖＢについては９．９９μＣｉ／ｕｇの比活性を有する〜０．１ｍｇ／ｋｇの抗体を投与した。血清サンプルを０．２５、２、５、２４、７２及び１２０時間で収集した。全トレースはＩｇＧの予測された１５０ｋＤａ(右のピーク)でピークを呈した。〜２７０(真ん中のピーク)及び〜５５０ｋＤａ(左のピーク)での高分子量ピークはｈＬＤ１．ｖＢ血清サンプルにおいてのみ観察された。高分子量ピークはｃｈＬＤ１では観察されなかった。 免疫沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。抗体を３７°Ｃで２４時間血漿においてインキュベートし、次いでサイズ排除ＨＰＬＣで分画化した。プロテインＧビーズを高分子量ピークを有するサイズ排除ＨＰＬＣ分画に加えた。プルダウンサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。(Ａ)インビトロラット血漿；(Ｂ)インビトロカニクイザル血漿；(Ｃ)インビトロヒト血漿。〜３７ｋＤａのタンパク質がｈＬＤ１．ｖＢでインキュベートされたラットサンプルにおいて検出されたが、カニクイザル及びヒトサンプルでは検出されなかった(それらのそれぞれのゲルのレーン４)。いかなるブランク血漿(各ゲルのレーン２)又はｃｈＬＤ１サンプル(各ゲルのレーン３)においても〜３７ｋＤａタンパク質ではバンドは観察されなかった。タンパク質分子量マーカーをレーン１において実行した。(Ｄ)インビボマウス血漿。マウスに「方法」に記載のようにｈＬＤ１．ｖＢ又はｃｈＬＤ１を投与した。次いでプロテイン−Ｇビーズを２時間の投与後時点から収集された血清サンプルに加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。〜３７ｋＤａでのバンドはｈＬＤ１．ｖＢ(レーン３)において検出されたが、ｃｈＬＤ１血清サンプル(レーン２)では検出されなかった。タンパク質分子量マーカーをレーン１において実行した。 Ｃ３ｗｔ血清、Ｃ３ｋｏマウス血清、及びＰＢＳ／ＢＳＡに加えられたｃｈＬＤ１及びｈＬＤ１．ｖＢのＥＬＩＳＡ検出。抗体を血清又はＰＢＳ／ＢＳＡにおいて一晩インキュベートし、次いでＥＬＩＳＡで分析した。ＰＢＳ／ＢＳＡと比較して、ｈＬＤ１．ｖＢはＣ３ｋｏマウス血清において十分に回収されたが、Ｃ３ｗｔマウス血清では回収されなかった。ｃｈＬＤ１は全マトリックスから十分に回収された。 GenBank Accession No. AAB25788の例示的なヒトＦＧＦＲ４アミノ酸配列を示す。
(発明の実施態様の詳細な説明)
Ｉ．(定義)
ここでの目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、下に定義するようにヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)フレームワーク又は重鎖可変ドメイン(ＶＨ)フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「から得られる」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含むか、又はアミノ酸配列変化を含んでいてもよい。幾つかの実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下又は２以下である。幾つかの実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
「親和性」は、分子(例えば抗体)の単一の結合部位とその結合パートナー(例えば抗原)との間の非共有相互作用の合計の強度を意味する。特に示さない限り、ここで使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば、抗体と抗原)間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を意味する。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数(Ｋｄ)により表すことができる。親和性は、ここに開示されたものを含む、当該分野で知られている一般的な方法により測定することができる。結合親和性を測定するための、特定の例証及び例示的実施態様を以下に記載する。
「親和性成熟」抗体は、一又は複数の超可変領域(ＨＶＲ)における一又は複数の変化を有する抗体であって、このような変化を持たない親抗体と比較され、このような変化は抗原に対する抗体の親和性における改善をもたらす。
抗血管新生剤は血管の発生をある程度、阻止又は干渉する化合物を指す。抗血管新生剤は、例えば血管新生の促進に関与する増殖因子又は増殖因子受容体に結合する小分子又は抗体でありうる。一実施態様では、抗血管新生剤は血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)、例えばベバシズマブ(ＡＶＡＳＴＩＮ(登録商標))に結合する抗体である。
「抗ＦＧＦＲ４抗体」及び「ＦＧＦＲ４に結合する抗体」なる用語は、抗体がＦＧＦＲ４を標的にする診断及び／又は治療剤として有用であるような、十分な親和性でＦＧＦＲ４に結合できる抗体を指す。一実施態様では、無関係な非ＦＧＦＲ４タンパク質への抗ＦＧＦＲ４抗体の結合の程度は、ＦＧＦＲ４への抗体の結合の約１０％未満であり、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)で測定される。ある実施態様では、ＦＧＦＲ４に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ(例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ)の解離定数(Ｋｄ)を有する。ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は異なる種からのＦＧＦＲ４間で保存されているＦＧＦＲ４のエピトープに結合する。
「抗体」なる用語はここでは、最も広い意味において使用され、様々な抗体構造を包含し、限定するものではないがモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及び所望の抗原結合活性を呈する限り抗体断片を含む。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例は、限定するものではないがＦｖ，Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ(ａｂ’)２；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子(例えばｓｃＦｖ)；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、参照抗体のその抗原への結合を競合アッセイにおいて５０％以上阻止する抗体を指し、逆に、参照抗体は抗体のその抗原への結合を競合アッセイにおいて５０％以上阻止する。例示的な競合アッセイがここに提供されている。
「ＦＧＦＲ４」なる用語は、ここで使用される場合、別段に記載される場合を除き、霊長類(例えばヒト)及びげっ歯類(例えばマウス及びラット)などの哺乳類を含む何れかの脊椎動物供給源からの何れかの天然ＦＧＦＲ４を指す。用語は「完全長」、非プロセシングＦＧＦＲ４並びに細胞におけるプロセシングから生じるＦＧＦＲ４の何れかの形態を包含する。用語はまたＦＧＦＲ４の天然に生じる変異体、例えばスプライスバリアント又は対立遺伝子多型を包含する。例示的なヒトＦＧＦＲ４のアミノ酸配列を図１８に示す。
「ＦＧＦＲ４活性化」は、ＦＧＦＲ４受容体の活性化、又はリン酸化を指す。一般的に、ＦＧＦＲ４活性化はシグナル伝達(例えばＦＧＦＲ４又は基質ポリペプチドにおけるチロシン残基をリン酸化するＦＧＦＲ４受容体の細胞内キナーゼドメインによって引き起こされる)をもたらす。ＦＧＦＲ４活性化は興味のＦＧＦＲ４受容体へのＦＧＦＲ４リガンド(Ｇａｓ６)結合によって媒介されうる。ＦＧＦＲ４へのＧａｓ６結合はＦＧＦＲ４のキナーゼドメインを活性化し得、これによって、ＦＧＦＲ４におけるチロシン残基のリン酸化及び／又は更なる基質ポリペプチドにおけるチロシン残基のリン酸化がもたらされる。
「癌」又は「癌性」なる用語は典型的には無秩序な細胞成長／増殖によって特徴づけられる哺乳類における生理的状態を指すか又は説明する。癌の例は、限定するものではないが、細胞腫、リンパ腫(例えばホジキン及び非ホジキンリンパ腫)、芽細胞腫、肉腫、及び白血病を含む。このような癌のより特定の例は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵癌、神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝細胞癌、白血病及び他のリンパ増殖性障害、及び様々なタイプの頭頸部癌を含む。
「細胞増殖性疾患」および「増殖性疾患」なる用語は、ある程度の異常な細胞増殖と関係している疾患を指す。一実施態様では、細胞増殖性疾患は癌である。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(商標登録))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethiylenethiophosphoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン)；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール(ドロナビロール、MARINOL(登録商標))；β−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン(合成アナログトポテカン(HYCAMTIN(登録商標)、ＣＰＴ−１１(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))、アセチルカンプトテシン、スコポレチン、及び９−アミノカンプトテシンを含む)；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む)；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン(合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む)；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１(例えばNicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)参照)；ＣＤＰ３２３、経口α-４インテグリンインヒビター；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン(ADRIAMYCIN(登録商標)、モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射(ＤＯＸＩＬ(登録商標))、リポソームドキソルビシンＴＬＣ Ｄ−９９(ＭＹＯＣＥＴ(登録商標))、ペグ化リポソームドキソルビシン(ＣＡＥＬＹＸ(登録商標))及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート、ゲムシタビン(ＧＥＭＺＡＲ(登録商標))、テガフール(ＵＦＴＯＲＡＬ(登録商標))、カペシタビン(ＸＥＬＯＤＡ(登録商標))、エポチロン及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidainine)；メイタンシノイド(maytansinoid)類、例えばメイタンシン(maytansine)及びアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidanmol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類(特にＴ-２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａ及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン(ＥＬＩＤＩＳＩＮＥ(登録商標)、ＦＩＬＤＥＳＩＮ(登録商標))；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル(ＴＡＸＯＬ(登録商標))、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤(ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ)およびドセタキセル(ＴＡＸＯＴＥＲＥ(登録商標))；クロランブシル；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；プラチナ薬剤、例えばシスプラチン、オキサリプラチン(例えばＥＬＯＸＡＴＩＮ(登録商標))及びカルボプラチン；チューブリン重合が微小管を形成するのを妨げるビンカ、例えばビンブラスチン(ＶＥＬＢＡＮ(登録商標))、ビンクリスチン(ＯＮＣＯＶＩＮ(登録商標))、ビンデシン(ＥＬＤＩＳＩＮＥ(登録商標)、ＦＩＬＤＥＳＩＮ(登録商標))およびビノレルビン(ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標))；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；マイトキサントロン；ロイコボリン；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド、例えばベキサロテン(ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ(登録商標))；ビスホスホネート、例えばクロドロネート(例えばＢＯＮＥＦＯＳ(登録商標)又はＯＳＴＡＣ(登録商標))、エチドロン酸(ＤＩＤＲＯＣＡＬ(登録商標))、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート(ＺＯＭＥＴＡ(登録商標))、アレンドロネート(ＦＯＳＡＭＡＸ(登録商標))、パミドロン酸(ＡＲＥＤＩＡ(登録商標))、チルドロネート(ＳＫＥＬＩＤ(登録商標))、又はリセドロネート(ＡＣＴＯＮＥＬ(登録商標))；トロキサシタビン(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関係するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓおよび上皮増殖因子レセプター(ＥＧＦ-Ｒ)；ワクチン、例えばＴＨＥＲＡＴＯＰＥ(登録商標)ワクチンおよび遺伝子治療ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチンおよびＶＡＸＩＤ(登録商標)ワクチン；トポイソメラーゼ１インヒビター(例えばＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ(登録商標))；ｒｍＲＨ(例えばＡＢＡＲＥＬＩＸ(登録商標))；ＢＡＹ４３９００６(ソラフェニブ；Bayer)；ＳＵ-１１２４８(スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ(登録商標)、Pfizer)；ペリホシン、ＣＯＸ-２インヒビター(例えばセレコキシブ又はエトリコキシブ)、プロテオゾームインヒビター(例えばＰＳ３４１)；ボルテゾミブ(ＶＥＬＣＡＤＥ(登録商標))；ＣＣＩ-７７９；ティピファニブ(Ｒ１１５７７)；オラフェニブ(orafenib)、ＡＢＴ５１０；ＢＣＬ-２インヒビター、例えばオブリメルセンナトリウム(ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ(登録商標))；ピクサントロン；ＥＧＦＲインヒビター(下の定義を参照)；チロシンキナーゼインヒビター(下の定義を参照)；セリン-スレオニンキナーゼインヒビター、例えばラパマイシン(シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ(登録商標))；ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、例えばロナファーニブ(ＳＣＨ６６３６、ＳＡＲＡＳＡＲＴＭ)；及び上述したものの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体、並びに、上記のうちの２つ以上の組み合わせ、例えば、ＣＨＯＰ(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの併用療法の略称)、及びＦＯＬＦＯＸ(５−ＦＵ及びロイコボリンと組み合わせたオキサリプラチン(ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ)を用いる治療計画の略称)、及び上記何れかの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体類；並びに上記の２以上の組合せが含まれる。
ここに定義される化学療法剤は、癌の増殖を促進しうるホルモンの効果を制御、低減、阻止、又は阻害するように作用する「抗ホルモン剤」又は「内分泌治療剤」を含む。それらはホルモン自体であり得、例えば限定するものではないが：混合アゴニスト／アンタゴニストプロファイルを伴う抗エストロゲン、例えばタモキシフェン(ＮＯＬＶＡＤＥＸ(登録商標))、４−ヒドロキシタモキシフェン、トレミフェン(ＦＡＲＥＳＴＯＮ(登録商標))、イドキシフェン、ドロロキシフェン、ラロキシフェン(ＥＶＩＳＴＡ(登録商標))、トリオキシフェン、ケオキシフェン、及び選択的エストロゲン受容体モジュレーター(ＳＥＲＭ)、例えばＳＥＲＭ３；アゴニスト特性をもたない純抗エストロゲン、例えばフルベストラント(ＦＡＳＬＯＤＥＸ(登録商標))、及びＥＭ８００(このような薬剤はエストロゲン受容体(ＥＲ)二量体化を阻止、ＤＮＡ結合を阻害、ＥＲターンオーバーを増加、及び／又はＥＲレベルを抑制しうる)；アロマターゼ阻害剤、例えばステロイド性アロマターゼ阻害剤、例えばホルメスタン及びエキセメスタン(ＡＲＯＭＡＳＩＮＲ)、及び非ステロイド性アロマターゼ阻害剤、例えばアナストラゾール(ＡＲＩＭＩＤＥＸＲ)、レトロゾール(ＦＥＭＡＲＡ(登録商標))及びアミノグルテチミド、及び他のアロマターゼ阻害剤、例えばボロゾール(ＲＩＶＩＳＯＲ(登録商標))、酢酸メゲストロール(ＭＥＧＡＳＥ(登録商標))、ファドロゾール、及び４(５)-イミダゾール；黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト、例えばリュープロリド(ＬＵＰＲＯＮ(登録商標)及びＥＬＩＧＡＲＤ(登録商標))、ゴセレリン、ブセレリン、及びトリプテレリン；性ステロイド、例えばプロゲスチン、例えば酢酸メゲストロール及び酢酸メドロキシプロゲステロン、エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロール及びプレマリン、及びアンドロゲン／レチノイド、例えばフルオキシメステロン、全てのトランスレチノイン酸及びフェンレチニド；オナプリストン；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体ダウンレギュレーター(ＥＲＤ)；抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド及びビカルタミド；及び上記の何れかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体；並びに上記の二つ以上の組合せを含む。
「キメラ」抗体なる用語は抗体であって、重及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来し、重及び／又は軽鎖の残りが異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。
抗体の「クラス」は、それの重鎖が持つ定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。５つの主要クラスの抗体：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらの内幾つかはサブクラス(アイソタイプ)、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分けられ得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
「細胞分裂阻害剤」なる用語は、インビトロ又はインビボで細胞の増殖を停止させる化合物又は組成物を指す。従って、細胞分裂阻害剤はＳ期における細胞のパーセンテージを有意に低減されるものでありうる。細胞分裂阻害剤の更なる例は、Ｇ０／Ｇ１停止又はＭ−期停止を誘導することによって細胞周期進行を阻止する薬剤を含む。ヒト化抗Ｈｅｒ２抗体トラスツズマブ(ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ(登録商標))はＧ０／Ｇ１停止を誘導する細胞分裂阻害剤の例である。古典的Ｍ−期ブロッカーは、ビンカ(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキサン、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。Ｇ１を停止させる特定の薬剤はＳ−期停止にも波及し得、例えばＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン, メクロレタミン, シスプラチン, メトトレキサート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-Ｃがある。更なる情報は、Mendelsohn and Israel, eds., The Molecular Basis of Cancer, Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (W.B. Saunders, Philadelphia, 1995), e.g., p. 13に見出される。タキサン(パクリタキセル及びドセタキセル)は、双方ともイチイ(yew tree)に由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル(TAXOTERER, Rhone-Poulenc Rorer)は、パクリタキセル(ＴＡＸＯＬ(登録商標), Bristol-Myers Squibb)の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルはチューブリン二量体から微小管の組立てを促進し、脱重合を防ぐことによって微小管を安定化させ、細胞における有糸分裂の阻害をもたらす。
ここで用いられる「細胞傷害剤」なる用語は、細胞の機能を阻害又は抑制し、及び／又は細胞死又は破壊を生じせしめる物質を意味する。細胞傷害剤は、限定するものではないが、放射性同位体(例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体)、化学療法剤又は薬物(例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド類(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤、増殖阻害剤；酵素及びその断片、例えば核溶解性酵素、抗生物質、毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、並びに下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含む。
「ＦＧＦＲ４発現、増幅、又は活性化を呈する」癌又は生物学的サンプルは、診断テストにおいて、ＦＧＦＲ４を発現する(過剰発現を含む)、増幅ＦＧＦＲ４遺伝子を有する、及び／又は他にＦＧＦＲ４の活性化又はリン酸化を呈するものである。
「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域に起因するそれらの生物学的活性を指し、抗体アイソタイプによって異なる。抗体エフェクター機能の例は：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害(ＣＤＣ)；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)；食作用；細胞表面受容体(例えばＢ細胞受容体)のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化を含む。
「有効量」の薬剤、例えば薬学的製剤は、所望の治療的又は予防的結果を達成するために、必要な投与量及び期間での有効な量を指す。
ここでは「Ｆｃ領域」なる用語は、少なくとも定常領域の一部を有する免疫グロブリン重鎖のＣ-末端領域を定義するために使用される。用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端まで伸展する。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ-末端リジン(Ｌｙｓ４４７)は存在する場合もあればしない場合もある。ここで別段に示さない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域(ＨＶＲ)残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４から一般的に成る。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般的に次の配列ＶＨ(又はＶＬ)：ＦＲ１-Ｈ１(Ｌ１)-ＦＲ２-Ｈ２(Ｌ２)-ＦＲ３-Ｈ３(Ｌ３)-ＦＲ４において見られる。
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全体抗体」なる用語は、ここでは互換的に使用され、天然抗体構造に実質的に類似した構造を有するか、又はここに定義されるFc領域を有する重鎖を有する抗体を指す。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」なる用語は互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、このような細胞の子孫を含む。宿主細胞は「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、これは継代の回数に関係なく一次形質転換細胞及びそれに由来する子孫を含む。子孫は核酸内容において親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含みうる。最初に形質転換された細胞についてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体子孫がここに含まれる。
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞から生産されるか又はヒト抗体レパートリー又は他のヒト抗体-コード配列を利用する非ヒト供給源から得られる抗体のものに対応するアミノ酸配列を持つものである。ヒト抗体のこの定義は非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を特異的に除外する。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選別において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列は、可変ドメイン配列のサブグループから選別する。一般に、配列のサブグループはKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3におけるようなサブグループである。一実施態様では、ＶＬについて、サブグループはKabat等におけるようなサブグループκＩである。一実施態様では、ＶＨについて、サブグループは上掲のKabat等におけるようなサブグループＩＩＩである。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基及びヒト ＦＲからのアミノ酸残基を含んでなるキメラ抗体を指す。ある実施態様では、ヒト化抗体は実質的には全ての少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインを含み、全て又は実質的には全てのＨＶＲ (例えばＣＤＲ)は非ヒト抗体のものに態様し、全て又は又は実質的には全てのＦＲはヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は場合によっては、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含みうる。抗体の「ヒト化形態」、例えば非ヒト抗体は、ヒト化を経た抗体を指す。
「超可変領域」又は「ＨＶＲ」なる用語は、ここで使用される場合、配列において超可変であるか及び／又は構造的に定義されたループ(「超可変ループ」)を形成する抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般的に、天然の４鎖抗体は６つのＨＶＲ；３つはＶＨ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)であり、３つはＶＬ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)を含む。ＨＶＲは一般的に超可変ループから及び／又は「相補性決定領域」(ＣＤＲ)からのアミノ酸残基を含み、後者は最も高い配列可変性のものであるか及び／又は抗原認識に関与する。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)、９１−９６(Ｌ３)、２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)、及び９６−１０１(Ｈ３)で生じる。(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。例示的なＣＤＲ(ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３)はアミノ酸残基Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２で生じる。(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。ＶＨにおけるＣＤＲ１を除き、ＣＤＲは一般的に超可変ループからのアミノ酸残基を含む。ＣＤＲはまた「特異性決定領域」又は「ＳＤＲ」を含み、これは抗原に接触する残基である。ＳＤＲはabbreviated-ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含まれる。例示的なａ−ＣＤＲ(ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３)はアミノ酸残基３１−３４(Ｌ１)、５０−５５(Ｌ２)、８９−９６(Ｌ３)、３１−３５Ｂ(Ｈ１)、５０−５８(Ｈ２)、及び９５−１０２(Ｈ３)で生じる。(Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照)。別段の記載がある場合を除き、ＨＶＲ残基及び可変ドメインにおける他の残基(例えばＦＲ残基)はここでは上掲のKabat et al.に従って番号付けされる。
「イムノコンジュゲート」は、限定するものではないが細胞傷害剤を含む一又は複数の異種性分子にコンジュゲートされた抗体である。
「個体」又は「被験体」は哺乳類である。哺乳類は、限定するものではないが、家畜動物(例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ)、霊長類(例えばヒト及び非ヒト霊長類、例えばサル)、ウサギ、及びげっ歯類(例えばマウス及びラット)を含む。ある実施態様では、個体又は被験体はヒトである。
「細胞成長又は増殖を阻害する」とは、細胞の成長又は増殖を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％低下させることを意味し、細胞死の誘導を含む。
「単離された」抗体は、その自然環境の構成要素から切り離されたものである。
幾つかの実施態様では、例えば、抗体は95%を超えるまたは99%まで純度を純化される。そして、電気泳動的である(例えばSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリー電気泳動法)かまたはクロマトグラフィである(例えばイオン交換または逆位相HPLC)。抗体純度の評価のための方法の再調査のために、Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
「単離された」核酸は、その自然環境の構成要素から切り離された核酸分子に関連する。単離された核酸は通常核酸分子を含む細胞に含まれる核酸分子を含む、しかし、核酸分子は外部染色体的にまたはその自然染色体場所と異なる染色体場所である。
「抗ＦＧＦＲ４ 抗体をコード化している単離された核酸」は抗体重鎖および軽鎖(またはそれの断片)をコード化している一つ以上の核酸分子に関連する。そして、宿主細胞の一つ以上の場所に存在するこの種の核酸分子及び、この種の核酸分子を単一のベクトルまたは別々のベクトルに含む。
本願明細書において使われるように、本発明の抗体に関する「全くかほとんど結合しない」なるフレーズは抗体が締め具の生物学上意味がある量を示さないことを意味しない。従来技術において理解されるように、活性の量は量的にまたは質的に、参照相対物及び本発明の抗体の間の比較がされることができるくらい長く決定されることができる。活性は測定されることができるかまたは従来技術において公知のいかなる分析もまたはテクニックに従って検出されることができる。そして、例えば、本願明細書において記載されているそれらを含む。その参照相対物及び本発明の抗体のための活性の量は、平行したか別々の実行において決定されることができる。
「モノクローナル抗体」なる用語は本願明細書において使用する、すなわち、実質的に均一な抗体の人口から得られた抗体に照会する、人口から成る個々の抗体は同一でおよび／または例えば、可能な異型抗体を除いて、同じエピトープを結合する。そして、自然に起こっている突然変異を含むかまたは単クローン抗体準備の製造の間、起こる。そして、この種の異型が一般に軽微な総計に存在する。ポリクロナール抗体試薬(概して、異なる決定要素(エピトープ)に向けられる異なる抗体を含む)とは対照的に、単クローン抗体準備の各々の単クローン抗体を、テスト上の単一の決定要素にあてる。このように、修飾子「モノクローナル抗体」は、抗体の実質的に均一な人口から得られるとして抗体の特徴を示して、いかなる特定の方法にもよって抗体の生産を必要とするものとして解釈されることになっていない。例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子座、この種の方法および他の典型的な方法の遺伝子導入実験動物を含んでいる全部または一部を本願明細書において記載されている単クローン抗体を作ることのために利用しているハイブリードーマ法、組換えＤＮＡ方法、バクテリオファージ-表示方法および方法を含むがこれに限らず、本発明によれば使用される単クローン抗体は、種々の技術によって作られることができる。
「裸の抗体」は、異形の部分(例えば細胞毒の部分)または放射標識に接合されない抗体に関連する。裸の抗体は、製薬製剤に存在してもよい。
「天然の抗体」は、構造を変化させることに関する自然に起こっている免疫グロブリン分子に関連する。例えば、自国のＩｇＧ抗体は約１５０，０００のダルトンのヘテロ四分割のグリコプロテインである。そして、ジスルフィド保税倉庫留め置きである２つの同一のＨ鎖及び２つの同一のＬ鎖から成る。Ｎ−からＣ末端まで、各々のＨ鎖は可変部(ＶＨ)を有する。そして、また、可変的な重い領域またはＨ鎖可変ドメインと呼ばれている。そして、３つの不変領域(ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３)が続く。同様に、Ｎ−からＣ末端まで、各々のＬ鎖は可変部(ＶＬ)を有する。そして、また、可変的な明るい領域またはＬ鎖可変ドメインと呼ばれている。そして、恒常的な明るい(ＣＬ)領域が続く。抗体のＬ鎖は、２つのタイプ(その不変領域のアミノ酸配列に基づいて、ラムダ(λ)及びカッパ(κ)と呼ばれている)のうちの１つに割り当てられることができる。
「パッケージ挿入物」なる用語は、慣習的に、治療的な製品(この種の治療的な製品の使用法に関して徴候、使用、投薬量、管理、複合治療、禁忌および／または警告に関する情報を含む)の市販パッケージに含まれる指示に関連するために用いる。
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を達成するために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ(ＤＮＡＳＴＡＲ)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって著作され、そのソースコードは米国著作権庁(ワシントン D.C.，20559)に使用者用書類と共に提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社(サウスサンフランシスコ, カリフォルニア)から公的に入手可能であり、又はソースコードからコンパイルされうる。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ(登録商標)オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ(登録商標)Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされなければならない。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され、変動しない。
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対するある程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＡ及びＢのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることが理解されるであろう。特に断らない限りは、ここで使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ-２コンピュータプログラムを用いて直ぐ上の段落に記載されるようにして得られる。
「薬学的製剤」なる用語は、有効成分の生物学的活性度ができるようにするために、効果的であるためにその中で含むような形である、そして、製剤が投与される主題に容認できないほど有毒である付加的な構成要素を含まない準備に関連する。
有効成分以外の、「薬学的に許容可能な担体」は製薬製剤の成分に関連する。そして、それは被験体に対する非毒性である。薬学的に受け入れられるキャリアは、バッファ、賦形剤、スタビライザまたは防腐剤を含むが、これに限定されるものではない。
ここで使用しているように、「治療」(及びそれの文法のバリエーション(例えば「治療」または「治療する」))は、治療されている個人の自然のコースを変える試みへの臨床介入に関連して、予防のために臨床病理学のコースの間、実行されることができる。処理の望ましい効果は疾患の発生または再発を予防することを含むが、これに限定されるものではない。そして、症状(疾患のいかなる直接的または間接的な病理学的結果もの減少)の緩和が転移を予防する。そして、緩解または改良された予後及び、疾病状態の疾患進行、改善または一時的緩和の率を低下させる。幾つかの実施態様では、本発明の抗体は、疾患の発現を遅延させるかまたは疾患の進行を減速するために用いる。
「腫瘍」なる用語は、全ての前癌でガン細胞および組織及び、悪性であるか良性であるにせよ、増殖及び全ての新生物形成細胞発育に関連する。本願明細書において関連されるように、条件「癌」、「癌性」、「細胞増殖障害」、「増殖性障害」及び「腫瘍」は排他的でない。
「可変領域」又は「可変ドメイン」なる用語は、抗体をテストに結合することに関係している重い抗体またはＬ鎖の領域に関連する。3つの高度変異部(HVRs)及び4つの保全されたフレームワーク地方(FRs)から成る各々の領域については、天然の抗体のＬ鎖(VL及びVH、それぞれ)及びＨ鎖の可変ドメインは、一般に類似した構造を有する。(Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照)単一のVHまたはVL領域は、テスト結合性特異性を与えるのに十分でもよい。さらにまた、特定のテストを結合する抗体は、それぞれ、補完的なVLまたはVH領域のライブラリを放送するためにテストを結合する抗体からVHまたはVL領域を使用して分離されることができる。Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照。
本願明細書において使われるように、「ベクトル」なる用語ははそれが連結される他の核酸を伝播することができる核酸分子に関連する。項は、それが導かれた宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクトルと同様に、自己再生する核酸構造としてベクトルを含む。特定のベクトルは、それらが有効に連結される核酸の表現度を導くことができる。この種のベクトルは、本明細書において、「発現ベクトルと称される。」
「ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク」は、Kabat et al.の可変重サブグループＩＩＩのアミノ酸配列から得られるコンセンサス配列を含む。一実施態様では、ＶＨ サブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーアミノ酸配列は、次の配列：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ(配列番号：１３)−Ｈ１−ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ(配列番号：１４)−Ｈ２−ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣ(配列番号：１５)−Ｈ３−ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ(配列番号：１６)の各々の少なくとも一部又は全てを含む。
「ＶＬサブグループＩコンセンサスフレームワーク」は、Kabat et alの可変軽カッパサブグループＩにおけるアミノ酸配列から得られるコンセンサス配列を含む。一実施態様では、ＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワーアミノ酸配列は次の配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ(配列番号：２８)−Ｌ１−ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ(配列番号：２９)−Ｌ２−ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ(配列番号：３０)−Ｌ３−ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ(配列番号：３１)の各々の一部又は全てを含む。
「消耗性」障害なる用語は(例えば消耗性症候群、悪液質、サルコペニア)は、望まない及び／又は不健康な体重の減少又は体細胞量の減少を指す。高齢者並びにＡＩＤＳ及び癌患者では、消耗性疾患は、脂肪及び除脂肪区画の双方を含む望まない体重の減少をもたらしうる。消耗性疾患は、疾病及び／又は老化過程に関連する不十分な食品の摂取及び／又は代謝性変化から生じうる。癌患者及びＡＩＤＳ患者、並びに広範囲の手術後又は慢性感染症、免疫疾患、甲状腺機能亢進症、クローン病、心因性疾患、慢性心不全又は他の重症な外傷を有する患者はしばしば、悪液質、代謝性及び時に摂食障害とも呼ばれる消耗性障害を患う。悪液質はまた代謝亢進及び異化亢進によって特徴づけられる。悪液質及び消耗性疾患は消耗性状態を指すのにしばしば互換的に用いられるが、除脂肪体重、特に体細胞量の減少として消耗症候群から悪液質を区別する少なくとも一体の研究がある (Mayer, 1999, J. Nutr. 129(1S Suppl.):256S-259S)。加齢個体に影響するまた別のこのような障害であるサルコペニアは、筋量の減少によって典型的に特徴づけられる。上記の末期消耗性疾患は悪液質又はサルコペニアを患っている個体において発生しうる。
ＩＩ．組成物及び方法
一態様では、発明は一部には、様々なＦＧＦＲ４結合剤(例えば抗体及びその断片)の同定に基づく。ある実施態様では、ＦＧＦＲ４に結合する抗体が提供される。発明の抗体は、例えば癌、肝臓疾患、及び消耗の診断又は治療に有用である。
Ａ．例示的な抗ＦＧＦＲ４抗体
一態様では、発明はＦＧＦＲ４に結合する単離された抗体を提供する。
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は≦１ｎＭの親和性でヒトＦＧＦＲ４に結合する。幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は≦０．０５ｎＭの親和性でヒトＦＧＦＲ４に結合する。
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は≦１ｎＭの親和性でマウスＦＧＦＲ４に結合する。
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は≦１ｎＭの親和性でカニクイザルＦＧＦＲ４に結合する。
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は≦１ｎＭの親和性でヒト、マウス及びカニクイザルＦＧＦＲ４に結合する。
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はヒトＦＧＦＲ１、ヒトＦＧＦＲ２及び／又はヒトＦＧＦＲ３に実質的に結合しない。ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はヒトＦＧＦＲ１、ヒトＦＧＦＲ２及び／又はヒトＦＧＦＲ３にほとんどあるいは全く結合を示さない。
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はマウスＣ３タンパク質(幾つかの実施態様では、図１２Ｄに示すアミノ酸配列を有するマウスＣ３タンパク質)に実質的に結合しない。ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はマウスＣ３タンパク質(幾つかの実施態様では、図１２Ｄに示すアミノ酸配列を有するマウスＣ３タンパク質)にほとんどあるいは全く結合を示さない。
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はヒト化抗ＦＧＦＲ４抗体であり、ヒトＦＧＦＲ４への抗体の一価の親和性は、それぞれ配列番号：８及び７に記載される軽鎖及び重鎖可変配列を含んでなるマウス抗体の一価の親和性と実質的に同じである。幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はヒト化及び親和性成熟抗体である。
ある実施態様では抗ＦＧＦＲ４抗体はＦＧＦＲ４活性のアンタゴニストである。
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はＦＧＦＲ４へのＦＧＦ結合を阻害する。幾つかの実施態様では、ＦＧＦＲ４へのＦＧＦ１及び／又はＦＧＦ１９結合が阻害される。幾つかの実施態様では、ＦＧＦＲ４へのＦＧＦ１結合の阻害のＩＣ５０は約０．１０ｎＭである。幾つかの実施態様では、ＦＧＦＲ４へのＦＧＦ１９結合の阻害のＩＣ５０は約０．１０ｎＭである。
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は細胞増殖を阻害する。幾つかの実施態様では、増殖はＦＧＦ−誘導細胞増殖である。幾つかの実施態様では、細胞増殖はＢＡＦ３／ＦＧＦＲ４トランスジェニック細胞増殖である。
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はＦＧＦＲ４を発現する細胞のＦＧＦ(例えばＦＧＦ１)刺激増殖を阻害する。幾つかの実施態様では、細胞はＨＵＨ７細胞である。
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は、ＦＧＦ１９に曝露された細胞におけるＣＹＰ７α７発現のＦＧＦ１９−媒介阻害を阻害する。
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は、ＦＧＦ１９に曝露された細胞におけるＦＧＦＲ４、ＭＡＰＫ、ＦＲＳ２及び／又はＥＲＫ２のＦＧＦ１９−誘導リン酸化を阻害する。
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はＦＧＦ１９−誘導コロニー形成を阻害する。幾つかの実施態様では、コロニー形成はＨＣＣ細胞株コロニー形成である。幾つかの実施態様では、ＨＣＣ細胞株はＪＨＨ５である。
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は変性ＦＧＦＲ４に結合する。幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は還元、変性ＦＧＦＲ４に結合する。幾つかの実施態様では、還元、変性ＦＧＦＲ４の結合はウエスタンブロットを使用してアッセイされる。
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は細胞表面で発現されたＦＧＦＲ４に結合する。幾つかの実施態様では、細胞はＨＵＨ７又はＪＨＨ５細胞である。
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はＧ１６５Ａ変異を含んでなるヒトＦＧＦＲ４に実質的に結合しない。ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はＧ１６５Ａ変異を含んでなるヒトＦＧＦＲ４にほとんどあるいは全く結合しない。
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は、アミノ酸番号１５０〜１７０の成熟ヒトＦＧＦＲ４アミノ酸配列を含んでなる、から基本的に成る又はから成るポリペプチドに結合する。ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はアミノ酸番号１４５〜１８０の成熟ヒトＦＧＦＲ４アミノ酸配列を含んでなる、から基本的に成る又はから成るポリペプチドに結合する。
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はアミノ酸番号１５０〜１７０の成熟ヒトＦＧＦＲ４アミノ酸配列を含んでなる、から基本的に成る又はから成る配列と少なくとも７０％，８０％，９０％，９５％，９８％の配列同一性又は類似性を有するポリペプチドに結合する。ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はアミノ酸番号１４５−１８０の成熟ヒトＦＧＦＲ４アミノ酸配列を含んでなる、から基本的に成る又はから成る配列と少なくとも７０％，８０％，９０％，９５％，９８％の配列同一性又は類似性を有するポリペプチドに結合する。
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はＦＧＦＲ４二量体化を阻害する。
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はＦＧＦＲ４二量体化界面で結合する。
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は腫瘍増殖を阻害する。幾つかの実施態様では、腫瘍増殖は肝臓腫瘍増殖である。
一態様では、発明は、(ａ)ＮＨＷＭＮのアミノ酸配列(配列番号：１)を含んでなるＨＶＲ−Ｈ１；(ｂ)ＭＩＬＰＶＤＳＥＴＴＬＥＱＫＦＫＤのアミノ酸配列(配列番号：２)を含んでなるＨＶＲ−Ｈ２；(ｃ)ＧＤＩＳＬＦＤＹのアミノ酸配列(配列番号：３)を含んでなるＨＶＲ−Ｈ３；(ｄ)ＲＴＳＱＤＩＳＮＦＬＮのアミノ酸配列(配列番号：４)を含んでなるＨＶＲ−Ｌ１；(ｅ)ＹＴＳＲＬＨＳのアミノ酸配列(配列番号：５)を含んでなるＨＶＲ−Ｌ２；及び(ｆ)ＱＱＧＮＡＬＰＹＴのアミノ酸配列(配列番号：６)を含んでなるＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６のＨＶＲを含んでなる抗ＦＧＦＲ４抗体を提供する。
一態様では、発明は(ａ)配列番号：１のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ１；(ｂ)配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１、少なくとも２、又は全３つのＶＨ ＨＶＲ配列を含んでなる抗体を提供する。一実施態様では、抗体は、配列番号：３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ３を含む。別の実施態様では、抗体は、配列番号：３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ３及び配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ３を含む。更なる実施態様では、抗体は、配列番号：３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ３、配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ２を含む。更なる実施態様では、抗体は、(ａ)配列番号：１のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ１；(ｂ)配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ３を含む。
別の態様では、発明は、(ａ)配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ１；(ｂ)配列番号：５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、少なくとも２、又は全３のＶＬ ＨＶＲ配列を含んでなる抗体を提供する。
一実施態様では、抗体は、(ａ)配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ１；(ｂ)配列番号：５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ３を含む。
別の態様では、発明の抗体は、(ａ)(ｉ)配列番号：１のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ１、(ｉｉ)配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ２、及び(ｉｉｉ)配列番号：３から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１、少なくとも２、又は全３つのＶＨ ＨＶＲ配列を含んでなるＶＨドメイン；及び(ｂ)(ｉ)配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ１、(ｉｉ)配列番号：５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ２、及び(ｃ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、少なくとも２、又は全３つのＶＬ ＨＶＲ配列を含んでなるＶＬドメインを含む。
別の態様では、発明は、(ａ)配列番号：１のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ１；(ｂ)配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ２；(ｃ)配列番号：３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ３；(ｄ)配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ１；(ｅ)配列番号：５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ２；及び(ｆ) 配列番号：６から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ３を含んでなる抗体を提供する。
別の態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＨＷＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＭＩＬＰＶＤＳＥＴＴＬＥＱＫＦＫＤＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＧＤＩＳＬＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ (配列番号：７)のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン(ＶＨ)配列を含む。
ある実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比較して置換(例えば、保存的置換)、挿入、又は欠失を有するが、その配列を含んでなる抗ＦＧＦＲ４抗体はＦＧＦＲ４に結合する能力を保つ。ある実施態様では、合計で１〜１０アミノ酸が配列番号：７において置換、挿入及び／又は欠失されている。ある実施態様では、置換、挿入又は欠失はＨＶＲ外の領域 において(すなわちＦＲにおいて)生じる。場合によっては、抗ＦＧＦＲ４抗体は、配列番号：７におけるＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様では、(ａ)配列番号：１のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ１、(ｂ)配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ２、及び(ｃ)配列番号：３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ３から選択される１、２、又は３のＨＶＲを含む。
別の態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体であって、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＴＳＱＤＩＳＮＦＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＦＫＩＬＩＳＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＮＡＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ(配列番号：８)のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)を含む抗体が提供される。
ある実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比較して置換(例えば、保存的置換)、挿入、又は欠失を有するが、その配列を含んでなる抗ＦＧＦＲ４抗体はＦＧＦＲ４に結合する能力を保つ。ある実施態様では、合計で１〜１０アミノ酸が配列番号：８において置換、挿入及び／又は欠失されている。ある実施態様では、置換、挿入又は欠失はＨＶＲ外の領域において(すなわちＦＲにおいて)生じる。場合によっては、抗ＦＧＦＲ４抗体は、配列番号：８におけるＶＬ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様では、ＶＬは(ａ)配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ１；(ｂ)配列番号：５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ３から選択される１、２又は３のＨＶＲを含む。
別の態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体であって、上記の実施態様の何れかに記載のＶＨ、及び上記の実施態様の何れかに記載のＶＬを含む抗体が提供される。一実施態様では、抗体はそれぞれ配列番号：７及び配列番号：８におけるＶＨ及びＶＬ配列を含み、これらの配列の翻訳後修飾を含む。
何れかの上記の実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はヒト化である。一実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は上記の実施態様の何れかに記載のＨＶＲを含み、更にアクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。発明の抗体は、何れかの好適なフレームワーク可変ドメイン配列を含むが、ＦＧＦＲ４への結合活性が実質的に保たれているとする。例えば、幾つかの実施態様では、発明の抗体はヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。これらの抗体の一実施態様では、フレームワークコンセンサス配列は位置７１、７３、及び／又は７８に置換を含む。これらの抗体の幾つかの実施態様では、位置７１はＡであり、７３はＴであり及び／又は７８はＡである。一実施態様では、これらの抗体は、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８の重鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む(HERCEPTIN(登録商標), Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (also referred to in U.S. Patent Nos. 6,407,213 & 5,821,337, and Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-1093)。一実施態様では、フレームワーク配列は次のアクセプターヒトフレームワーク：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ(配列番号：９)−Ｌ１−ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＦＫＩＬＩＳ(配列番号：１０)−Ｌ２−ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ(配列番号：１１)−Ｌ３−ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ(配列番号：１２)を含む。
更なる態様では、発明はここに提供される抗ＦＧＦＲ４抗体と同じエピトープに結合する抗ＦＧＦＲ４抗体が提供される。例えば、ある実施態様では、配列番号：７のＶＨ配列及び配列番号：８のＶＬ配列を含んでなる抗ＦＧＦＲ４抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。ある実施態様では、図１８に示す配列(配列番号：３９)のアミノ酸１４５−１８０から成るＦＧＦＲ４の断片内のエピトープに結合する抗体が提供される。
更なる態様では、発明は、配列番号：７のＶＨ配列及び配列番号：８のＶＬ配列を含んでなる抗ＦＧＦＲ４抗体と、ヒトＦＧＦＲ４への結合について競合する抗ＦＧＦＲ４抗体を提供する。
発明の更なる態様では、上記実施態様の何れかによる抗ＦＧＦＲ４抗体はモノクローナル抗体であり、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含む。一実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は抗体断片、例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ(ａｂ’)２断片である。別の実施態様では、抗体は完全長抗体、例えばインタクトなＩｇＧ１抗体又はここに定義される他の抗体クラス又はアイソタイプである。
更なる態様では、上記実施態様の何れかによる抗体は、下のセクション１−７に記載される何れかの特性を単独で又は組合せにおいて組み込みうる。
１．抗体親和性
ある実施態様では、ここに提供される抗体は≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ(例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ)の解離定数(Ｋｄ)を有している。
一実施態様では、Ｋｄは、次のアッセイによって記載されるように、対象の抗体のＦａｂ型とその抗原を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ(ＲＩＡ)によって測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、一連の力価の非標識抗原の存在下で、最小濃度の(１２５Ｉ)標識抗原でＦａｂを均衡にし、ついで抗Ｆａｂ抗体被覆プレートで結合抗原を捕獲することによって測定する(例えばChen等, J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照)。アッセイ条件を確率するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ(登録商標)マルチウェルプレート(Thermo Scientific)を５μｇ／ｍｌの５０ｍＭ炭酸ナトリウム(ｐＨ９．６)中の捕獲抗Ｆａｂ抗体(Cappel Labs)で一晩被覆し、その後ＰＢＳ中の２％(ｗ／ｖ)のウシ血清アルブミンで室温(およそ２３℃)で２から５時間、ブロックする。非吸着プレート(Nunc #269620)において、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した対象のＦａｂと混合する(例えば、Presta等, Cancer Res. 57: 4593-4599(1997)における抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ-１２の評価と一致する)。ついで対象のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでより長い時間(例えば約６５時間)継続する場合がある。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で(例えば１時間)インキュベートする。ついで、溶液を取り除き、プレートをＰＢＳ中の０．１％ポリソルベート２０(Ｔｗｅｅｎ-２０(登録商標))で８回洗浄した。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質(MicroScint-20ＴＭ；Packard)を加え、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴＴＭγカウンター(Packard)で１０分間計数する。最大結合の２０％か又はそれ以下を与える各Ｆａｂの濃度を選択して競合結合測定に用いる。
他の実施態様によれば、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップで２５℃のＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)-２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)-３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を使用して表面プラズモン共鳴アッセイを行ってＫｄを測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)で活性化する。抗原を１０ｍＭの酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈した後、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流量で注入する。抗原の注入後、未反応群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動力学的な測定では、２倍の段階希釈したＦａｂ(０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃、およそ２５μｌ／分の流量で０．０５％ポリソルベート２０(Ｔｗｅｅｎ-２０ＴＭ)界面活性剤(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入する。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model)(BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(ｋｏｎ)と解離速度(ｋｏｆｆ)を算出する。平衡解離定数(Ｋｄ)をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出する。例えば、Chen等, J. Mol Biol 293:865-881(1999)を参照のこと。上記の表面プラスモン共鳴アッセイにより結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、ストップフロー具備分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下で、ＰＢＳ(ｐＨ７．２)、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体(Ｆａｂ型)の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、バンドパス＝１６ｎｍ)の増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
２．抗体断片
ある実施態様では、ここに提供される抗体は抗体断片である。抗体断片は、限定しないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ'−ＳＨ、Ｆ(ａｂ')２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、及び以下に記載の他の断片を含む。所定の抗体断片の概説については、Hudson等 Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照のこと。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えばPluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編,(Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照のこと；また国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号を参照のこと。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含みインビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ(ａｂ')２断片の検討については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
ダイアボディは、二価又は二重特異性でありうる二つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許出願公開第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson等, Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及びHollinger等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディはまたHudson等, Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。
単一ドメイン抗体は抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。ある実施態様では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である(Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば米国特許第６２４８５１６Ｂ１号を参照)。
抗体断片は、限定しないが、ここに記載されるようにインタクトな抗体のタンパク質消化並びに組換え宿主細胞(例えば大腸菌又はファージ)による生産を含む様々な技術によって作製されうる。
３．キメラ及びヒト化抗体
ある実施態様では、ここで提供される抗体はキメラ抗体である。あるキメラ抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, PNAS USA, 81:6851-6855 (1984)に記載されている。一例では、キメラ抗体は非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又は非ヒト霊長類、例えばサル由来の可変領域)とヒト定常領域を含む。更なる例では、キメラ抗体はクラス又はサブクラスが親抗体のものとは変化せられた「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体はその抗原結合断片を含む。
ある種の実施態様では、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低下させるためにヒト化される。一般的に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えばＣＤＲ(又はその一部)が非ヒト抗体由来であり、ＦＲ(又はその一部)がヒト抗体配列由来である一又は複数の可変ドメインを含む。場合によっては、ヒト化抗体は、ヒト定常領域の少なくとも一部を含むであろう。幾つかの実施態様では、ヒト化抗体における幾つかのＦＲ残基は、非ヒト抗体(例えば、ＨＶＲ残基が誘導される抗体)からの対応する残基で置換され、例えば抗体特異性又は親和性が回復又は改善される。
ヒト化抗体及びそれらを作製する方法は、例えばAlmagro 及び Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に概説されており、更に例えば、Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988)；Queen等, PNAS USA 86:10029-10033 (1989)；米国特許第５８２１３３７号、同７５２７７９１号、同６９８２３２１号、及び同７０８７４０９号；Kashmiri等, Methods 36:25-34 (2005)(ＳＤＲ(ａ-ＣＤＲ)グラフトを記載)；Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)(「リサーフェシング(resurfacing)」を記載)；Dall'Acqua等, Methods 36:43-60 (2005) (「ＦＲシャッフリング」を記載)；及びOsbourn等, Methods 36:61-68 (2005) 及び Klimka等, Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)(ＦＲシャッフリングに対する「案内選別(guided selection)」アプローチ法を記載)に記載されている。
ヒト化に使用されうるヒトフレームワーク領域には、限定されるものではないが、「ベストフィット法」を使用して選択されるフレームワーク領域(例えば、Sims等 J. Immunol. 151:2296 (1993)を参照)；軽鎖又は重鎖可変ドメインの特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列から誘導されるフレームワーク領域(例えば、Carter等 PNAS USA, 89:4285 (1992)；及び Presta等 J. Immunol., 151:2623 (1993))；ヒト成熟(体細胞的に変異された)フレームワーク領域又はヒト生殖系列フレームワーク領域(例えば、Almagro及びFransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照)；及びＦＲライブラリーのスクリーニング由来のフレームワーク領域(例えば、Baca等, J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 及び Rosok等, J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照)が含まれる。
４．ヒト抗体
ある実施態様では、ここで提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で知られている様々な技術を使用して産生せしめることができる。ヒト抗体は、一般的に、van Dijk及びvan de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。
ヒト抗体は、抗原投与に反応してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に免疫源を投与することによって調製することができる。このような動物は、ヒト免疫グロブリン座位の全て又は一部を典型的には含み、内在性免疫グロブリン座位を置き換えるか、又は染色体外、又は動物の染色体内にランダムに組み込まれて存在する。このようなトランスジェニックマウスにおいて、内在性免疫グロブリン座位は、一般的に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法の概説は、Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照のこと。また、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載する米国特許第６０７５１８１号及び同６１５０５８４号；ＨＵＭＡＢ(登録商標)技術を記載した米国特許第５７７０４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ(登録商標)技術を記載した米国特許第７０４１８７０号；ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ(登録商標)技術を記載した米国特許出願公開第２００７／００６１９００号を参照。このような動物により産生されるインタクトな抗体からのヒト可変領域は、例えば異なるヒト定常領域と組合せることにより、更に修飾することができる。
また、ヒト抗体は、ハイブリドーマベース法により作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒトミエローマ及びマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株が記載されている。(例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及びBoerner等, J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照)。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して産生されるヒト抗体は、Li等, PNAS. USA, 103:3557-3562 (2006)にまた記載されている。付加的な方法には、例えば米国特許第７１８９８２６号(ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の生産を記載)、及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)(ヒト-ヒトハイブリドーマを記載)に記載されている。また、ヒトハイブリドーマ技術(トリオーマ技術)は、Vollmers 及びBrandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 及び Vollmers及びBrandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)にも記載されている。
ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することにより産生せしめることもできる。ついで、このような可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組合せられうる。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術を以下に記載する。
５．ライブラリー由来抗体
本発明の抗体は、所望の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特性を有する抗体について、そのようなライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が当該技術分野で知られている。このような方法は、例えばHoogenboom等 Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien等編, Human Press, Totowa, NJ, 2001)において概説され、更に例えばMcCafferty等, Nature 348:552-554；Clackson等, Nature 352: 624-628 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)；Marks及びBradbury, Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo編, Human Press, Totowa, NJ, 2003)；Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee等, J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)；Fellouse, PNAS USA 101(34): 12467-12472 (2004)；及びLee等, J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。
ある種のファージディスプレイ法では、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーが、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により別々にクローニングされ、ファージライブラリーにおいてランダムに組換えられ、これがついで、Winter等, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されているように、抗原-結合ファージについてスクリーニングされうる。ファージは、典型的には、単鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)断片又はＦａｂ断片として、抗体断片をディスプレイする。免疫化されたソースからのライブラリーにより、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原に対して高親和性の抗体が提供される。あるいは、天然レパートリーを、Griffiths等, EMBO J, 12: 725-734 (1993)に記載されているように、免疫化をすることなく、広範囲の非自己、更には自己抗原に対するヒト抗体の単一供給源を提供するために(例えばヒトから)クローニングすることができる。最後に、ナイーブライブラリーは、幹細胞から再配置されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することで合成的に作製することができ、高頻度可変ＣＤＲ３領域をコードし、Hoogenboom 及び Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)により記載されているような、再配置をインビトロで達成することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載する特許文献には、例えば米国特許第５７５０３７３号、及び米国特許出願第２００５／００７９５７４号、同２００５／０１１９４５５号、同２００５／０２６６０００号、同２００７／０１１７１２６号、同２００７／０１６０５９８号、同２００７／０２３７７６４号、同２００７／０２９２９３６号、及び同２００９／０００２３６０号が含まれる。
ヒト抗体ライブラリーから単離される抗体又は抗体断片は、ここでのヒト抗体又はヒト抗体断片と考えられる。
６．多重特異性抗体
ある実施態様では、ここで提供される抗体は多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある種の実施態様では、結合特異性の一つはＦＧＦＲ４に対してであり、他方は任意の他の抗原に対してである。ある実施態様では、二重特異性抗体は、ＦＧＦＲ４の二つの異なるエピトープに結合しうる。また二重特異性抗体はＦＧＦＲ４を発現する細胞に細胞傷害剤を局在化させるために使用することができる。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
多重特異性抗体を作製するための技術には、限定されるものではないが、異なる特異性を有する二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の組換え同時発現(Milstein及びCuello, Nature 305: 537 (1983)を参照)、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker等, EMBO J. 10: 3655 (1991))、及び「ノブ-イン-ホール」技術(例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照)が含まれる。また、多重特異性抗体は、抗体ヘテロ二量体分子を作製するための静電気操縦効果の設計(国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号)；２又はそれ以上の抗体又は断片の架橋(例えば、米国特許第４６７６９８０号、及びBrennan等, Science, 229: 81 (1985)を参照)；二重特性抗体の産生のためのロイシンジッパーの使用(例えば、Kostelny等, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992))；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術の使用(例えば、Hollinger等, PNAS USA, 90:6444-6448 (1993)を参照)；及び単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)二量体の使用(例えば、Gruber等, J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照)；及びTutt等 J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているような三重特異性抗体の調製により、作製することができる。
「オクトパス抗体」を含む３又はそれ以上の機能的抗原結合部位を有する操作抗体もここに含まれる(例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６Ａ１号を参照)。
また、ここでの抗体又は断片は、ＦＧＦＲ４並びに他の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」も含む(例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号を参照)。
７．抗体変異体
ある実施態様では、ここに提供される抗体のアミノ酸配列変異体が考えられる。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的性質を改善させることが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な修飾を導入して、又はペプチド合成により調製されうる。そのような修飾は、抗体のアミノ酸配列内の残基の、例えば、欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば抗原結合性を有している限り、欠失、挿入、及び置換をどのように組合せて、最終コンストラクトに到達してもよい。
ａ)置換、挿入、及び欠失変異体
ある実施態様では、一又は複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異誘発のために関心ある部位はＨＶＲ及びＦＲを含む。保存的置換は、「保存的置換」と題して表１に示す。より実質的な変化は「例示的置換」との項目で表１に提供され、アミノ酸側鎖クラスを基準にして以下に更に記載される。アミノ酸置換は関心ある抗体に導入され得、生成物が所望の活性、例えば保持された／改善された抗原結合性、低減した免疫原性、改善されたＡＤＣＣ又はＣＤＣについて、スクリーニングされる。
Figure 2014516511
アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる：
(１)疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
(２)中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
(３)酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
(４)塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
(５)鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
(６)芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを他のクラスに交換することを必要とするであろう。
一タイプの置換変異体は、親抗体(例えばヒト化又はヒト抗体)の一又は複数の高頻度可変領域残基を置換することを含む。一般的に、更なる研究のために選択される得られた変異体は、親抗体に対して所定の生物学的性質(例えば親和性の増加、免疫原性の減少)に修飾(例えば改善)を有するか、及び／又は親抗体の実質的に保持された所定の生物学的性質を有しているであろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、これは、例えばここに記載されたもののようなファージディスプレイベースの親和性成熟技術を使用して簡便に産生せしめることができる。簡潔に言えば、一又は複数のＨＶＲ残基を変異させ、変異体抗体をファージにディスプレイさせ、特定の生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。
改変(例えば置換)は、例えば抗体親和性を改善するために、ＨＶＲにおいてなされうる。このような改変はＨＶＲ「ホットスポット」、つまり体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基(例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照)、及び／又はＳＤＲｓ(ａ−ＣＤＲｓ)においてなされる場合があり、得られる変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリーを構築しそれから再選択することによる親和性成熟は、例えばHoogenboom等 Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien等編, Human Press, Totowa, NJ, (2001))に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様では、様々な方法(例えばエラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発)の何れかによって成熟のために選択された可変遺伝子中に多様性が導入される。ついで、二次抗体が作製される。ついで、ライブラリーがスクリーニングされ、所望の親和性を有する任意の抗体変異体が同定される。多様性を導入する他の方法は、幾つかのＨＶＲ残基(例えば一度に４−６残基)が無作為化されるＨＶＲ指向性アプローチを含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基が、例えばアラニンスキャン突然変異誘発又はモデリングを使用して、特に同定されうる。特にＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的とされる。
ある実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、一又は複数のＨＶＲ内で生じうる。例えば、結合親和性を実質的に減少させない保存的改変(例えばここで提供される保存的置換)をＨＶＲにおいてなすことができる。そのような改変はＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側でありうる。上に提供された変異ＶＨ及びＶＬ配列の所定の実施態様では、何れかの各ＨＶＲが改変されず、又は一、二又は三のアミノ酸置換を含む。
突然変異誘発の標的とされうる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham及びWells (1989) Science 244:1081-1085 (1989)によって記載されている「アラニンスキャンニング突然変異誘発法」と呼ばれる。この方法において、残基又は標的残基の群(例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電残基)が同定され、中性の又は負に荷電したアミノ酸(例えばアラニン又はポリアラニン)で置換され、抗体の抗原との相互作用に影響があるかどうかが決定される。最初の置換に対して機能的感受性を示しているアミノ酸位置に更なる置換を導入することができる。あるいは、又は付加的に、抗原-抗体複合体の結晶構造が抗体と抗原間の接触点を同定する。そのような接触残基及び近傍の残基は置換のための候補として標的にされるか又は削除されうる。変異体は、それらが所望の性質を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされうる。
アミノ酸配列挿入は、長さが１残基から百以上の残基を含むポリペプチドまで及ぶアミノ末端及び／又はカルボキシ末端融合体、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を増加させる酵素(例えばＡＤＥＰＴ)又はポリペプチドへの抗体のＮ又はＣ末端の融合を含む。
ｂ)グリコシル化変異体
ある実施態様では、ここで提供される抗体は、抗体がグリコシル化される度合いを増大又は減少させるように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、アミノ酸配列を、一又は複数のグリコシル化部位が作られ又は除去されるように改変させることによって、簡便に達成されうる。
抗体がＦｃ領域を含む場合、そこに結合される炭水化物が改変されうる。哺乳動物細胞により産生される天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に対してＮ結合により一般的に結合する分枝状で二分岐のオリゴ糖を含む。例えば、Wright等 TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は様々な炭水化物、例えばマンノース、Ｎ-アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)、ガラクトース、及びシアル酸を含み得、並びにフコースが二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合される。幾つかの実施態様では、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾が、ある改善された特性を有する抗体変異体を生じせしめるために、なされうる。
一実施態様では、Ｆｃ領域に(直接又は間接的に)結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、かかる抗体におけるフコースの量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％、又は２０％から４０％でありうる。フコースの量は、例えば国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定して、Ａｓｎ２９７(例えば複合のハイブリッド及び高マンノース構造)に結合した全ての糖構造の合計に対してＡｓｎ２９７の糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７はＦｃ領域内の約２９７位(Ｆｃ領域のＥｕ番号付け)に位置したアスパラギン残基を意味する；しかしながら、Ａｓｎ２９７は、抗体中のマイナーな配列変異のために、２９７位から約±３アミノ酸上流又は下流に、つまり２９４位と３００位の間に位置している場合がありうる。そのようなフコシル化変異体は改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号(Presta, L.)；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)を参照。「脱フコシル化された」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連した刊行物の例には、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；国際公開第２０００／６１７３９号；国際公開第２００１／２９２４６号；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号；米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号；米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号；米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号；米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号；米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号；国際公開第２００３／０８５１１９号；国際公開第２００３／０８４５７０号；国際公開第２００５／０３５５８６号；国際公開第２００５／０３５７７８号；国際公開第２００５／０５３７４２号；国際公開第２００２／０３１１４０号；Okazaki等 J. Mol. Biol. 336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)が含まれる。脱フコシル化抗体を生産可能な細胞株の例には、タンパク質フコシル化に欠けているＬｅｃ１３ＣＨＯ細胞(Ripka等 Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８Ａ１号, Presta, L；及び国際公開第２００４／０５６３１２Ａ１号, Adams等，特に実施例１１)、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ-１,６-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞(例えば、Yamane-Ohnuki等 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda, Y等, Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照)が含まれる。
例えば抗体のＦｃ領域に結合した二分オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分される二分オリゴ糖を有する抗体変異体が更に提供される。そのような抗体変異体は、フコシル化が低減され、及び／又はＡＤＣＣ機能が改善されている場合がある。そのような抗体変異体の例は、例えば国際公開第２００３／０１１８７８号(Jean-Mairet等)；米国特許第６６０２６８４号(Umana等)；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号(Umana等)に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖に少なくとも一のガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。このような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有している場合がある。このような抗体変異体は、例えば国際公開第１９９７／３００８７号(Patel等)；国際公開第１９９８／５８９６４号(Raju, S.)；及び国際公開第１９９９／２２７６４号(Raju, S.)に記載されている。
ｃ)Ｆｃ領域変異体
ある実施態様では、一又は複数のアミノ酸修飾が、ここに提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それによりＦｃ領域変異体を産生せしめてもよい。Ｆｃ領域変異体は、一又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾(例えば、置換)を含んでなるヒトＦｃ領域配列(例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４Ｆｃ領域)を含みうる。
ある実施態様では、本発明は、幾つかであるが全てではないエフェクター機能を持つ抗体変異体を考察し、これは、抗体を、インビボでの抗体の半減期は重要であるが、あるエフェクター機能(例えば、補体及びＡＤＣＣ)は不要か又は有害である用途のために望ましい候補とする。ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／喪失を確認するために、インビトロ及び／又はインビボ細胞傷害性アッセイが実施されうる。例えば、Ｆｃレセプター(ＦｃＲ)結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠く(よってＡＤＣＣ活性を欠くと思われる)が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確かめるために実施されうる。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＩ、ＦｃγＩＩ及びＦｃγＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-492(1991)の４６４頁の表３に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するための非限定的なインビトロアッセイが米国特許第５５００３６２号(例えばHellstrom, I.等 Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)を参照)及びHellstrom, I等, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；５８２１３３７(Bruggemann, M.等, J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照)に記載されている。別法では、非放射性アッセイ法が用いられ得る(例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ(商標)非放射性細胞傷害性アッセイ(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及びＣｙｔｏ Ｔｏｘ９６(登録商標)非放射性細胞傷害性アッセイ(Promega, Madison, WI)を参照)。このようなアッセイのために有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー(ＮＫ)細胞を含む。あるいは、又は付加的に、対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等PNAS(USA)95:652-656(1998)に記載されているような動物モデルにおいてインビボで評価されうる。Ｃｌｑ結合アッセイが、抗体がＣｌｑに結合できず、よってＣＤＣ活性を欠くことを確認するためにまた実施されうる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施することができる(例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M.S.等, Blood 101:1045-1052 (2003)；及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照)。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期定量も当該技術分野で知られている方法を使用して実施することがまたできる(例えば、Petkova, S.B.等, Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照)。
減少したエフェクター機能を有する抗体は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の一又は複数の置換を有するものを含む(米国特許第６７３７０５６号)。このようなＦｃ変異体は、二又はそれ以上のアミノ酸位２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７に置換を有するＦｃ変異体を含み、アラニンへの残基２６５及び２９７の置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む(米国特許第７３３２５８１号)。
ＦｃＲへの改良又は減少された結合を有するある種の抗体変異体が記載されている(例えば米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照)。
ある実施態様では、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する一又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４での置換(残基のＥＵ番号付け)を有するＦｃ領域を含む。
幾つかの実施態様では、例えば米国特許第６１９４５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)に記載されているように、改変された(つまり、改善され又は減少した)Ｃｌｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害性(ＣＤＣ)を生じる改変がＦｃ領域に改変がなされる。
増加した半減期及び胎児への母性ＩｇＧｓの移動に関与する新生児Ｆｃレセプター(ＦｃＲｎ)(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim等, J. Immunol. 24:249 (1994))への改善された結合性を有する抗体が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１(Hinton等)に記載されている。その抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一又は複数の置換をそこに有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の一又は複数での置換、例えばＦｃ領域残基４３４の置換を有するものを含む(米国特許第７３７１８２６号)。
Ｆｃ領域変異体の他の例に関しては、Duncan及びWinter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
ｄ)システイン操作抗体変異体
ある実施態様では、システイン操作抗体、例えば抗体の一又は複数の残基がシステイン残基で置換される「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」を作ることが望ましいことがある。特定の実施態様では、置換される残基が抗体の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインと置換することによって、反応性チオール基が抗体の接近可能な部位に位置させられ、抗体を他の部分、例えば薬剤部分又はリンカー薬剤部分に結合させ、ここで更に記載されるように免疫コンジュゲートを作るために使用されうる。ある実施態様では、以下の残基の任意の一又は複数がシステインと置換されうる：軽鎖のＶ２０５(カバット番号付け)；重鎖のＡ１１８(ＥＵ番号付け)；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００(ＥＵ番号付け)。システイン操作抗体は、例えば米国特許第７５２１５４１号に記載されるようにして、産生されうる。
ｅ)抗体誘導体
ある実施態様では、ここに提供される抗体は、当該技術分野において知られ直ぐに利用できる更なる非タンパク質性部分を含むように更に修飾することができる。抗体の誘導体化に適した部分は、限定しないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-１,３-ジオキソラン、ポリ-１,３,６-トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーかランダムコポリマー)、及びデキストラン又はポリ(ｎ-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中におけるその安定性のために製造の際に有利でありうる。ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じでも異なった分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定されるものではないが、抗体誘導体が定まった条件下での治療に使用されるかどうか等を含む、改善される抗体の特定の性質又は機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
他の実施態様では、放射線への暴露によって選択的に加熱されうる非タンパク質様部分及び抗体のコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質様部分はカーボンナノチューブである(Kam等 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005))。放射線は任意の波長のものであってよく、限定するものではないが、通常の細胞に害を与えないが、抗体-非タンパク質様部分に近位の細胞が死滅させられる温度まで非タンパク質様部分を加熱する波長が含まれる。
Ｂ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載されているように、組換え法及び構成物を使用して製造することができる。一実施態様では、ここに記載される抗ＦＧＦＲ４抗体をコードする単離核酸が提供される。このような核酸は、ＶＬを含んでなるアミノ酸配列及び／又は抗体のＶＨを含んでなるアミノ酸配列(例えば、抗体の軽及び／重鎖)をコードしてもよい。更なる実施態様では、このような核酸を含んでなる一又は複数のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。更なる実施態様では、このような核酸を含んでなる宿主細胞が提供される。このような一実施態様では、宿主細胞は、(１)抗体のＶＬを含んでなるアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含んでなるアミノ酸配列をコードする核酸を含んでなるベクター、又は(２)抗体のＶＬを含んでなるアミノ酸配列をコードする核酸を含んでなる第一ベクター、及び抗体のＶＨを含んでなるアミノ酸配列をコードする核酸を含んでなる第２ベクターを含む(例えば、これらによって形質転換される)。一実施態様では、宿主細胞は真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞又はリンパ球系細胞(例えばＹ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞)である。一実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体の作製方法が提供され、該方法は、上に提供された抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で、培養し、場合によっては宿主細胞(又は宿主細胞培養培地)から抗体を回収することを含む。
抗ＦＧＦＲ４抗体の組換え生産では、例えば上述のような抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞での更なるクローニング及び／又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このような核酸は、直ちに単離され、一般的な手順を使用して(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)配列決定されうる。
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現のために適した宿主細胞は、ここに記載される原核細胞又は真核細胞である。例えば、抗体は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要でない場合に、細菌で生産されうる。細菌での抗体断片及びポリペプチドの発現については、米国特許第５６４８２３７号、米国特許第５７８９１９９号、及び米国特許第５８４０５２３号を参照のこと。(また大腸菌中での抗体断片の発現を記述しているCharlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254を参照)。発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離され得、更に精製されうる。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物が、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路が「ヒト化」された菌及び酵母株を含み、部分的に又は完全にヒト化したグリコシル化パターンを持つ抗体の生産を生じる。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004),及びLi等, Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照。
グリコシル化抗体の発現のために適した宿主細胞は、多細胞生物(無脊椎動物及び脊椎動物)からもまた誘導される。無脊椎動物細胞の例は、植物及び昆虫の細胞を含む。特にヨウトガ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併用されうる多くのバキュロウィルス株が同定されている。
植物細胞培養もまた宿主として利用することができる。例えば米国特許第５９５９１７７号、同第６０４０４９８号、同第６４２０５４８号、同第７１２５９７８号、及び同第６４１７４２９号(遺伝子導入植物において抗体を生産するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記述)を参照。
脊椎動物細胞をまた宿主として使用することができる。例えば、懸濁状態で増殖するよう適合化された哺乳動物細胞株が有用な場合がある。有用な哺乳動物細胞株の他の例は、ＳＶ４０(ＣＯＳ−７)によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株(Graham等, J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３又は２９３細胞)；ベビーハムスター腎細胞(ＢＨＫ)；マウスセルトリ細胞(例えばMather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞)；サル腎細胞(ＣＶ１)；アフリカミドリザル腎細胞(ＶＥＲＯ−７６)；ヒト子宮頸癌細胞(ＨＥＬＡ)；イヌ腎細胞(ＭＤＣＫ)；バッファローラット肝細胞(ＢＲＬ３Ａ)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８)；ヒト肝細胞(ＨｅｐＧ２)；マウス乳腺腫瘍(ＭＭＴ０６０５６２)；Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞(Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；及びＹ０、ＮＳ０、及びＳｐ２／０等のミエローマ細胞株である。抗体生産のために適した哺乳類動物宿主細胞株の概説として、例えばYazaki及びWu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp255-268 (2003)を参照のこと。
Ｃ．アッセイ
ここに提供されている抗ＦＧＦＲ４抗体は、当分野で知られている様々なアッセイによってそれらの物理的／化学的特性及び／又は生物学的活性について同定、スクリーニング、又は特徴付けされうる。
１．結合アッセイ及び他のアッセイ
一態様では、発明の抗体は、知られている方法、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどによってその抗原結合活性について試験される。
別の態様では、競合アッセイが、ＦＧＦＲ４への結合について抗体ＬＤ１と競合する抗体を同定するために使用されうる。ある実施態様では、このような競合抗体は抗体ＬＤ１に結合される同じエピトープ(例えば線形又は立体構造エピトープ)に結合する。抗体が結合するエピトープのマッピングのための詳細な例示的方法は、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。
例示的な競合アッセイでは、固定化ＦＧＦＲ４が、ＦＧＦＲ４(例えば抗体 ＬＤ１)に結合する第一標識抗体及びＦＧＦＲ４への結合について第一抗体と競合するその能力について試験されている第二標識抗体を含んでなる溶液中においてインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在しうる。コントロールとして、固定化ＦＧＦＲ４が、第一標識抗体を含むが第二非標識抗体を含まない溶液中においてインキュベートされる。ＦＧＦＲ４への第一抗体の結合が可能な条件下でのインキュベーション後、過剰な非結合抗体が取り除かれ、固定化ＦＧＦＲ４に伴う標識の量が測定される。固定化ＦＧＦＲ４に伴う標識の量がコントロールサンプルと比較して試験サンプルにおいて実質的に低減されている場合、それは第二抗体がＦＧＦＲ４への結合について第一抗体と競合していることを示す。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照のこと。
２．活性アッセイ
一態様では、アッセイは、生物学的な活性を有する抗ＦＧＦＲ４抗体を同定するために提供される。生物学的な活性には、例えば:FGFR4を発現する細胞(例えばHUH7細胞)のFGF (例えばFGF1)刺激増殖、FGF19に曝露された細胞におけるCYP7α7発現のFGF19-媒介阻害、FGF19に曝露された細胞におけるFGFR4、MAPK、FRS2及び／又はERK2のFGF19-誘発リン酸化、及びFGF19-誘発コロニー形成(幾つかの実施態様では、HCC細胞株コロニー形成)の阻害を含みうる。
インビボ及び／又はインビトロにおいてこのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。
ある実施態様では、発明の抗体がこのような生物学的活性について検査される。このような生物学的活性を検査するためのアッセイがここに記載されている。
ある実施態様では、発明の抗体は、インビトロでの細胞成長又は増殖を阻害する能力について試験される。細胞成長又は増殖の阻害のためのアッセイは当分野で周知である。本明細中に記載の「細胞殺傷」アッセイにて例示した細胞増殖のためのあるアッセイは、細胞生存度を測定する。このようなあるアッセイは、Promega (Madison, WI)から市販されているCellTiter-GloTM発光細胞生存率アッセイである。このアッセイは、代謝活性のある細胞の指標であるＡＴＰの存在の量に基づいて生細胞数を決定する。Crouch等 (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88、米国特許第6602677号を参照。アッセイは、自動ハイスループットスクリーニング(ＨＴＳ)に用いられるように96-又は３８４-ウェルフォーマットで行ってもよい。Cree等 (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404を参照。アッセイ手順は、単一の試薬(ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏ(登録商標)試薬)を直接培養細胞に加えることを伴う。この結果細胞溶解が生じ、ルシフェラーゼ反応によって生産される発光シグナルが生成される。この発光シグナルは、培養物中に存在する生細胞の数に直接比例している、ＡＴＰの存在の量に比例する。データは、ルミノメーター又はＣＣＤカメラ画像デバイスによって記録することができる。発光の結果は相対的な光の単位(ＲＬＵ)として表す。
細胞増殖についての他のアッセイは「ＭＴＴ」アッセイであり、これは、ミトコンドリアレダクターゼによる３-(４,５-ジメチルチアゾール-２-イル)-２,５-ジフェニルテトラゾリウムブロマイドのホルマザンへの酸化を測定する比色アッセイである。CellTiter-GloTMアッセイのように、このアッセイは、細胞培養物に存在する代謝活性のある細胞の数を表す。例としてMosmann (1983) J. Immunol. Meth. 65:55-63及びZhang等 (2005) Cancer Res. 65: 3877-3882を参照。
上記いずれかのインビトロアッセイに用いるための細胞には、天然でＦＧＦＲ４を発現する又はＦＧＦＲ４を発現するように操作された細胞ないしは細胞株が含まれる。このような細胞には、同じ細胞起源の正常細胞と比べてＦＧＦＲ４を過剰発現する腫瘍細胞が含まれる。また、このような細胞には、ＦＧＦＲ４を発現する細胞株(腫瘍細胞株を含む)や、正常にＦＧＦＲ４を発現しないがＦＧＦＲ４をコードする核酸を形質移入してある細胞株が含まれる。上記いずれかのインビトロアッセイに用いるための本明細書中に挙げる例示的な細胞株には、ＨＣＣ細胞株ＨＵＨ７が含まれる。
一態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は、インビボでの細胞成長又は増殖を阻害する能力について試験される。ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は、インビボでの腫瘍成長を阻害する能力について試験される。異種移植片モデルなどのインビボモデルシステムが前記の試験のために用いられうる。例示的な異種移植片システムでは、好適に免疫を低下させた非ヒト動物、例えば胸腺「ヌード」マウスにヒト腫瘍細胞が導入される。本発明の抗体は動物に投与される。抗体の腫瘍成長を阻害するか又は減少させる能力が測定される。上記の異種移植片システムのある実施態様では、ヒト腫瘍細胞はヒト患者の腫瘍細胞である。このような異種移植片モデルはOncotest GmbH (Frieberg, Germany)から市販されている。ある実施態様では、ヒト腫瘍細胞は、ＨＵＨ７ ＨＣＣ腫瘍細胞株などのヒト腫瘍細胞株由来の細胞である。ある実施態様では、皮下投与や、哺乳動物の脂肪体などの好適な部位に移植することによって好適に免疫を低下させた非ヒト動物にヒト腫瘍細胞を導入する。ある実施態様では、ヒト腫瘍細胞は、乳房脂肪パッドなどの好適な部位に皮下注射によって又は移植によって好適に免疫抑制された非ヒト動物に導入される。ある実施態様では、異種移植モデルは例えばここにおいて、またnicholes et al, Am J Pathol 160:2295-2307に記載されるようにＦＧＦ１９を過剰発現するトランスジェニックマウスである。
上記アッセイの何れかは、抗ＦＧＦＲ４抗体の代わりに又は加えて、発明のイムノコンジュゲートを使用して実施されてもよいことが理解される。
上記アッセイの何れかは、抗ＦＧＦＲ４抗体及び更なる治療剤、例えば化学療法剤を使用して実施されうることが理解される。
Ｄ．免疫コンジュゲート
本発明は、また、例えば化学療法剤又は薬物、増殖阻害剤、毒素(例えばタンパク質毒素、酵素的に活性な細菌、真菌、植物、又は動物由来の毒素、又はその断片)、又は放射性同位体のような一又は複数の細胞傷害性薬剤とここでコンジュゲートされる抗体を含む免疫コンジュゲートを提供する。
一実施態様では、免疫コンジュゲートは、限定しないが、メイタンシノイド(米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号及び欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号を参照)；アウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチン薬剤部分ＤＥ及びＤＦ(ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ)(米国特許第５６３５４８３号及び同第５７８０５８８号及び同第７４９８２９８号を参照)；ドラスタチン；カリケアマイシン又はその誘導体(米国特許第５７１２３７４号、同第５７１４５８６号、同第５７３９１１６号、同第５７６７２８５号、同第５７７０７０１号、同第５７７０７１０号、同第５７７３００１号、及び同第５８７７２９６号；Hinman等, Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)；及びLode等, Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)を参照)；アントラサイクリン、例えばダウノマイシン又はドキソルビシン(Kratz等, Current Med. Chem. 13:477-523 (2006)；Jeffrey等, Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006)；Torgov等, Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005)；Nagy等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000)；Dubowchik等, Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002)；King等, J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)；及び米国特許第６６３０５７９号を参照)；メトトレキセート；ビンデシン；タキサン、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセル；トリコテシン及びＣＣ１０６５を含む一又は複数の薬物に抗体がコンジュゲートされる抗体薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)である。
他の実施態様では、免疫コンジュゲートは、限定しないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)阻害剤、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)阻害剤、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)を含む、酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートされたここに記載された抗体を含む。
他の実施態様では、免疫コンジュゲートは放射性コンジュゲートを形成するために放射性原子にコンジュゲートされるここに記載の抗体を含む。様々な放射性同位元素が放射性コンジュゲートの生産のために利用可能である。例は、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位元素を含む。放射性コンジュゲートが検出に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばＴｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)イメージング(磁気共鳴イメージング、ｍｒｉとしても知られている)用のスピン標識、例えばまたヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含みうる。
抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシレート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣｌ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと。リンカーは細胞中の細胞傷害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」でありうる。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)。
ここでの免疫コンジュゲート又はＡＤＣは、限定するものではないが、(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより)市販されているＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ(スクシンイミジル-(４-ビニルスルホン)安息香酸塩)を含む架橋剤を用いて調製されるコンジュゲートが明示的に考えられる。
Ｅ．診断及び検出のための方法及び組成物
ある実施態様では、ここに提供される何れかの抗ＦＧＦＲ４抗体は、生物学的サンプル中におけるＦＧＦＲ４の存在の検出に有用である。「検出」なる用語は、ここで使用される場合、定量的又は定性的検出を包含する。ある実施態様では、生物学的サンプルは、細胞又は組織、例えば乳房、膵臓、食道、肺及び／又は脳を含む。
一実施態様では、診断又は検出の方法における使用のための抗ＦＧＦＲ４抗体が提供される。更なる態様では、生物学的サンプル中におけるＦＧＦＲ４の存在の検出の方法が提供される。ある実施態様では、方法は、ＦＧＦＲ４への抗ＦＧＦＲ４抗体の結合が可能な条件下で生物学的サンプルをここに記載の抗ＦＧＦＲ４抗体と接触させる工程、複合体が抗ＦＧＦＲ４抗体及びＦＧＦＲ４間で形成されているかを検出する工程を含む。一実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は、抗ＦＧＦＲ４抗体による治療に適格である被験体を選択するために、例えばＦＧＦＲ４が患者の選択のバイオマーカーである場合に、使用される。
発明の抗体を使用して診断されうる例示的な障害は、癌(例えば乳房、肺、膵臓、脳、腎臓、卵巣、胃、白血病、子宮内膜、結腸、前立腺、下垂体、乳房線維腺腫、頭頸部、軟部組織、神経芽細胞腫、メラノーマ、子宮内膜、精巣、胆管細胞癌、胆嚢及び肝臓の癌)を含む。
ある実施態様では、標識化抗ＦＧＦＲ４抗体が提供される。標識は、限定するものではないが、直接検出される標識又は部分(例えば蛍光、発色団、高電子密度、化学発光、及び放射性標識)、並びに例えば酵素反応又は分子相互作用を通して間接的に検出される酵素又はリガンドなどの部分を含む。例示的な標識は、限定するものではないが、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ(米国特許番号４、７３７、４５６)、ルシフェリン、２、３−ジヒドロフタルアジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素、複素環オキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、(ＨＲＰ等の色素前駆体を酸化するために過酸化水素を伴う酵素にカップリングされる)、ラクトペルオキシダーゼ、又はミクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定フリーラジカルなどを含む。
Ｆ．薬学的製剤
ここに記載される抗ＦＧＦＲ４抗体の薬学的製剤は、所望の純度を有するこのような抗体を一又は複数の任意の薬学的に許容可能な担体と混合することによって凍結乾燥製剤又は水溶液の形態において調製される(Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編(1980))。薬学的に許容可能な担体は一般的に、用いられる用量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存料(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド；ベンゼトニウムクロライド；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体)及び／又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。ここでの 例示的な薬学的に許容可能な担体は、insterstitial drug分散剤、例えば可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えばヒト可溶性ＰH-２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒＨｕＰＨ２０(HYLENEX(登録商標, Baxter International, Inc.)を含む。特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及びその使用は、ｒＨｕＰＨ２０を含み、米国特許公開番号２００５／０２６０１８６及び２００６／０１０４９６８に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは一又は複数のグリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと組み合わせられる。
例示的な凍結乾燥抗体製剤は米国特許番号６，２６７，９５８に記載されている。水性抗体製剤は米国特許番号６，１７１，５８６及びＷＯ２００６／０４４９０８に記載されるものを含み、後者の製剤はヒスチジンアセテートバッファーを含む。
ここでの製剤はまた、治療されている特定の徴候の必要に応じて２以上の活性成分を含み得、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものである。例えば、ＥＧＦＲアンタゴニスト(例えばエルロチニブ)、抗血管新生剤(例えばＶＥＧＦアンタゴニスト、例えば抗ＶＥＧＦ抗体)又は化学療法剤(例えばタキソイド又は白金剤)を更に提供することが望まれうる。このような活性成分は、意図される目的に有効な量において組合せで適切に存在する。
活性成分は、例えばコアセルべーション技術又は界面重合により調製したマイクロカプセル、例えば、それぞれコロイド状ドラッグデリバリーシステム(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルジョンの、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセル中に捕捉することもできる。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
徐放製剤を調製してもよい。徐放製剤の好適な例は、抗体を含む固形疎水性ポリマーの半透過性基質を含み、該基質は、成形品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形である。徐放性基質の例は、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリ乳酸(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸及びγエチル-Ｌ-グルタメートの共重合体、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸共重合体、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ(乳酸-グリコール酸共重合体及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸を含む。
インビボ投与に使用される製剤は一般的に無菌である。無菌性は、例えば滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成されうる。
Ｇ．治療方法及び組成物
ここに提供される抗ＦＧＦＲ４抗体の何れかは治療方法において使用されうる。
一態様では、医薬としての使用のための抗ＦＧＦＲ４抗体が提供される。更なる態様では、癌の治療における使用のための抗ＦＧＦＲ４抗体が提供される。更なる実施態様では、肝疾患(例えば硬変)の治療における使用のための抗ＦＧＦＲ４抗体が提供される。更なる実施態様では、消耗性障害の治療における使用のための抗ＦＧＦＲ４抗体が提供される。ある実施態様では、治療の方法における使用のための抗ＦＧＦＲ４抗体が提供される。ある実施態様では、発明は、個体に有効量の抗ＦＧＦＲ４抗体を投与することを含んでなる、癌を有する個体の治療方法における使用のための抗ＦＧＦＲ４抗体を提供する。ある実施態様では、発明は、個体に有効量の抗ＦＧＦＲ４抗体を投与することを含んでなる、肝障害(例えば硬変)を有する個体の治療方法における使用のための抗ＦＧＦＲ４抗体を提供する。一つのこのような実施態様では、方法は、個体に有効量の少なくとも１つの更なる治療剤、例えば下記のものを投与することを更に含む。更なる実施態様では、発明は、細胞増殖の阻害における使用のための抗ＦＧＦＲ４抗体を提供する。ある実施態様では、発明は、細胞増殖を阻害するために有効量の抗ＦＧＦＲ４抗体を個体に投与することを含んでなる、個体における細胞増殖を阻害する方法における使用のための抗ＦＧＦＲ４抗体を提供する。上記実施態様の何れかによる「個体」は、好ましくはヒトである。
更なる態様では、発明は医薬の製造又は調製における抗ＦＧＦＲ４抗体の使用を提供する。一実施態様では、医薬は癌の治療のためである。更なる実施態様では、医薬は、癌を有する個体に有効量の医薬を投与することを含んでなる癌の治療方法における使用のためである。一実施態様では、医薬は肝障害(例えば硬変、非アルコール性脂肪性肝疾患、胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症)の治療のためである。更なる実施態様では、医薬は、有効量の医薬を肝障害を有する個体に投与することを含んでなる肝障害(例えば硬変、非アルコール性脂肪性肝疾患、胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症)の治療方法における使用のためである。一つのこのような実施態様では、方法は、個体に有効量の少なくとも一つの更なる治療剤、例えば下記のものを投与することを更に含む。更なる実施態様では、医薬は細胞増殖を阻害するためである。更なる実施態様では、医薬は、細胞増殖を阻害するために有効量の医薬を個体に投与することを含んでなる、個体における細胞増殖を阻害する方法における使用のためである。上記実施態様の何れかによる「個体」はヒトでありうる。
更なる態様では、発明は、癌を治療するための方法を提供する。一実施態様では、方法は、このような癌を有する個体に有効量の抗ＦＧＦＲ４抗体を投与することを含む。一つのこのような実施態様では、方法は、個体に有効量の少なくとも一つの更なる治療剤、例えば下記のものを投与することを更に含む。上記実施態様の何れかによる「個体」はヒトでありうる。
更なる態様では、発明は、肝障害(例えば硬変、非アルコール性脂肪性肝疾患、胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症)を治療するための方法を提供する。一実施態様では、方法は、このような肝障害を有する個体に有効量の抗ＦＧＦＲ４抗体を投与することを含む。一つのこのような実施態様では、方法は、個体に有効量の少なくとも一つの更なる治療剤、例えば下記のものを投与することを更に含む。上記実施態様の何れかによる「個体」はヒトでありうる。
更なる態様では、発明は、消耗性障害を治療するための方法を提供する。一実施態様では、方法は、このような消耗性障害を有する個体に有効量の抗ＦＧＦＲ４抗体を投与することを含む。一つのこのような実施態様では、方法は、個体に有効量の少なくとも一つの更なる治療剤、例えば下記のものを投与することを更に含む。上記実施態様の何れかによる「個体」はヒトでありうる。
更なる態様では、発明は個体における細胞増殖を阻害するための方法を提供する。一実施態様では、方法は、細胞増殖を阻害するために個体に有効量の抗ＦＧＦＲ４抗体を投与することを含む。一実施態様では、「個体」はヒトである。
更なる態様では、発明は、例えば上記治療方法の何れかにおける使用のための、ここに提供される抗ＦＧＦＲ４抗体の何れかを含んでなる薬学的製剤を提供する。一実施態様では、 薬学的製剤は、ここに提供される抗ＦＧＦＲ４抗体の何れか及び薬学的に許容可能な担体を含む。別の実施態様では、薬学的製剤は、ここに提供される抗ＦＧＦＲ４抗体の何れか及び少なくとも一つの更なる治療剤、例えば下記のものを含む。
発明の抗体は治療において、単独で又は他の薬剤との組合せにおいて使用されうる。例えば、発明の抗体は少なくとも一つの更なる治療剤と共投与されうる。ある実施態様では、更なる治療剤は化学療法剤である。ある実施態様では、更なる治療剤は抗血管新生剤である。
この種の複合治療は上記が、別々の管理及び、合同の管理(2つ以上の治療薬が同じであるか別々の製剤に含まれる所で)を含む点に注意した。その場合には、同時に、本発明の抗体の管理はあとに続いている及び／又は、付加的な治療薬の管理および／またはアジュバントの前に起こることができる。本発明の抗体が、また、放射線療法と結合して用いられることができる。
本発明(いかなる付加的な治療薬及びも)の抗体はいかなる適当手段にもよって投与されることができる。そして、非経口投与薬を含む。そして、必要に応じて局所療法(病巣内管理)のための鼻くう(及び)及び、肺内である。非経口的注入は、筋肉内であるか、静脈内であるか、動脈内であるか、腹腔内であるか、皮下の管理を含む。例えば管理が簡単であるか慢性的かどうか一つにはに依存して、注射(例えば静脈内であるか皮下の注射)、投薬が、いかなる適切なルートにもよってあることができる。さまざまな時間-位置、食物塊管理およびパルス注入の上の一つであるか多数の経営陣を含むがこれに限らずさまざまな投薬スケジュールは、本願明細書において考察される。
本発明の抗体は、医学的実用性に合わせた様式で調製し、１回分に分けて、投与される。ここで考慮する要因は、治療する特定の疾患、治療する特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の運搬部位、投与の方法、投与の日程計画、及び医師が知る他の因子を含む。必要ではないが場合によっては、問題の疾患を予防するか又は治療するために一般に用いられる一つ以上の作用剤と抗体とを調製する。そのような他の作用剤の有効量は、製剤中の抗体の量、疾患の型又は治療、及び上記の他の因子に依存する。これらは、一般的に、ここに記載されるものと同じ用量及び投与経路で、又はここに記載される用量の１〜９９％で、或いは経験的／臨床的に適切と判断される任意の用量及任意の投与経路で、用いられる。
疾患の予防又は治療のために、本発明の抗体の好適な用量は(単独で用いる場合、又は一又は複数の他の付加的な治療剤と組み合わせて用いる場合)、治療する疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及び抗体への応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。抗体は一時的又は一連の治療にわたって適切に患者に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ)の抗体を、例えば一以上の分割投与又は連続注入による患者投与の初期候補用量とすることができる。ある典型的な１日量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、通常、所望の疾患症状の抑制が得られるまで持続する。このような用量は、間欠的に、例えば週ごと又は３週ごとに投与してもよい(例えば患者に約２〜約２０、例えば約６用量の抗体が投与される)。初期のより高い負荷投与量の後、一以上のより低い用量を投与してもよい。しかしながら、他の投与計画が有効かもしれない。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターすることができる。
上記製剤又は治療方法の何れも、抗ＦＧＦＲ４抗体の代わりに又は加えて発明のイムノコンジュゲートを使用して実施されてもよいことが理解される。
Ｈ．製造品
本発明の他の態様では、上記の疾患の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。該製造品は容器と該容器上又は該容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、症状を治療、予防及び／又は診断するために有効な組成物単独又は他の組成物と組み合わせる組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる)。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明の抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が選択された症状の治療に使用されることを示す。更に、製造品は、(a)本発明の抗体を含有する組成物を中に収容する第一の容器；と(b)更なる細胞障害剤又はそれ以外の治療薬を含有する組成物を中に収容する第二の容器とを含みうる。本発明のこの実施態様における製造品は、組成物を特定の症状の治療に使用することができることを示しているパッケージ挿入物を更に含む。あるいは、もしくは付加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の(又は第三の)容器を更に具備してもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
上記製造品の何れも、抗ＦＧＦＲ４抗体の代わりに又は加えて発明のイムノコンジュゲートを含んでいてもよいことが理解される。
ＩＩＩ．実施例
Ａ．抗ＦＧＦＲ４抗体での治療は肝細胞癌を阻害する
材料及び方法
インシリコ発現分析。 発現分析では、箱ひげプロットをBioExpressＴＭデータベース(Gene Logic, Gaithersburg, MD)から抽出した正規化遺伝子発現データを用いてFGFR4について生成した。正常及び癌組織におけるFGFR4発現の分布をプローブ204579_atに伴うシグナルを使用して評価した。
免疫組織化学。ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片をTrilogy (Cell Marque, Rocklin, CA)を使用して抗原回復のために処理し、次いで10 μg/ml 抗FGFR4抗体 (8G11; Genentech, South San Francisco, CA)でインキュベートした。免疫染色をビオチン化二次抗体、 ABC-HRP試薬(Vector Laboratories, Burlingame, CA)、及び金属増感DAB比色ペルオキシダーゼ基質(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)を使用して達成した。
半定量的RT-PCR。全RNAをRNeasyキット(Qiagen, Valencia, CA)を使用して抽出した。特異的プライマー及び蛍光発生プローブを使用し、遺伝子発現 を増幅し定量化した。遺伝子特異的シグナルをRPL19ハウスキーピング遺伝子に正規化した。全てのTaqMan qRT-PCR試薬をApplied Biosystems (Foster City, CA)から購入した。最小限の三つ組セットのデータを各条件について分析した。データを平均±SEMとして示す。
免疫沈降及び免疫ブロット。培養細胞又は凍結組織の溶解物をコンプリートEDTA-フリープロテアーゼインヒビターカクテル(Roche, Indianapolis, IN)、ホスファターゼインヒビターカクテル1及び2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、2 mMフッ化ナトリウム、及び2 mMオルトバナジウム酸ナトリウムで補充されたRIPA溶解バッファー(Millipore, Billerica, MA)で調製した。等量のタンパク質がBCAアッセイ(Thermo Fisher Scientific)によって決定され、FGFR4 (8G11; Genentech)、FGFR3 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)、FGFR2 (GeneTex, Irvine, CA)及びFGFR1 (Santa Cruz Biotechnology)に対する抗体を使用して免疫ブロット分析によって分析した。ヒト肝臓溶解物では、免疫ブロット分析を前述のようにFGFR4の免疫沈降によって実施した。
FGFR4モノクローナル抗体の生成。FGFR4ヌルマウスを組換えヒト及びマウスFGFR4-Fcキメラタンパク質(Genentech)で免疫化した。脾臓を8週間に収集し、ハイブリドーマを生成した。培養上清を集め、免疫原に対して固相抗体結合アッセイによってスクリーニングした。陽性細胞株を、ヒト及びマウス FGFR4に対するFGF1及びFGF19結合を阻害する有効性について固相受容体結合アッセイを使用して更にスクリーニングした。
LD1の分子クローニング。全RNAをRNeasy Mini kit (Qiagen)を使用してmuLD1を生産するハイブリドーマ細胞から抽出した。可変軽及び可変重ドメインを逆転写-PCR (RT-PCR)を使用して増幅した。順方向プライマーは可変軽及び可変重領域のNH2-末端アミノ酸配列に特異的であった。それぞれ軽鎖及び重鎖逆方向プライマーを、種にわたって高度に保存されている定常軽及び定常重ドメイン1における領域にアニールするように設計した。増幅された可変軽鎖をヒトκ定常ドメインを有する哺乳類発現ベクターにクローン化した。増幅可変重鎖を完全長ヒトIgG1定常ドメインをコードする哺乳類発現ベクターに挿入した。キメラ抗体を前述のように一過性に発現させた。実施例(図1-9を含む)のこのパートAに記載される実験はキメラLD1を使用した。
固相抗体結合アッセイ。Maxisorp96ウェルプレートを50 μlの2 μg/ml 抗ヒト免疫グロブリンFc断片特異的(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)又は抗FLAG抗体 (Sigma-Aldrich)で4oCで一晩コートした。非特異的結合部位を1時間200 μl PBS/3%ウシ血清アルブミン(BSA)で飽和させ、FGFRs-IgG (Genentech and R&D Systems, Minneapolis, MN)又はFLAGタグ-FGFR4 (FGFR4ΔTM-FLAG)を1時間、PBS/0.3% BSAにおいてインキュベートした。プレート洗浄し、PBS/0.3% BSAにおいて抗FGFR4抗体で1時間インキュベートした。結合抗体をHRP-コンジュゲート抗IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories)及びTMBペルオキシダーゼ発色基質(KPL, Gaithersburg, MD)を使用して検出した。
フローサイトメトリー分析。フローサイトメトリー分析のための細胞を5mMのEDTAを含有するPBSで再懸濁させ、2%熱失活ウシ胎仔血清(FBS)を含有するPBSで洗浄した。続く全ての工程を氷上で実施した。細胞 (1x106)を30分間一次抗体(LD1又はアイソタイプコントロール)でインキュベートし、その後、フィコエリトリン(PE)- コンジュゲート抗ヒトIgG抗体(Jackson ImmunoResearch)でインキュベーションした。細胞をFACScanフローサイトメーター(BD Biosciences, San Jose, CA)で分析した。
DNAコンストラクト。ヒトFGFR4 (hFGFR4) cDNAを前述のようにクローン化した。FGFR4の細胞外ドメインをまた発現ベクター pCMV-Tag4A (Stratagene, La Jolla, CA)にサブクローニングし、C-末端でのFLAGタグ(FGFR4DTM-Flag)でFGFR4の分泌形態を得た。一塩基変異をQuikChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を使用してFGFR4DTM-Flagコンストラクトに導入した。我々はまた、ヒトFGFR1の細胞質ドメイン (FGFR1のアミノ酸残基K398 - R820)に融合されたヒトFGFR4の細胞外及び膜貫通ドメイン(アミノ酸残基M1-G392 of FGFR4)を有するヒトFGFR4-FGFR1キメラコンストラクト(hFGFR4/R1)を生成した。FGFR4 (太線)をFGFR1 (プレイン)に連結したアミノ酸配列は・・・AVLLLLAGLYRGKMKSG・(配列番号: 32)・・である。hFGFR4 cDNA又はhFGFR4/R1 cDNAをpQCXIPレトロウイルスバイシストロニック発現ベクター (Clontech Laboratories, Mountain View, CA)にライゲートした。
FGFR4DTM-Flag-条件培地。HEK293細胞を野生型又は変異体FGFR4DTM-Flagコンストラク又は対応するエンプティベクターでトランスフェクトし、72〜96時間、無血清PS25培地において維持した。得られた培地を濾過し、HEPES pH 7.2 (最終濃度40mM)及びプロテアーゼインヒビターを補充し、使用まで4°Cで保管した。
細胞培養及び安定細胞株。HEK293、HEPG2、及びHEP3B細胞をAmerican Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)から入手し、10% FBS及び2 mM L-グルタミンで補充されたF-12:DMEM mix (50:50)において維持した。HUH7及びPLC/PRF/5細胞をDMEM高グルコース、10% FBSにおいて培養した。JHH4、JHH5、及びJHH7細胞をJapanese Cancer Research Resources Bank (Tokyo, Japan)から購入し、10% FBS及び2 mM L-グルタミンで補充されたWilliams Medium Eにおいて維持した。SNU449細胞をATCCを入手し、10% FBS及び2 mM L-グルタミンを含有するRPMI 1640において維持した。BaF3細胞を10% FBS、1 ng/ml IL-3、及び2 mM L-グルタミンで補充されたRPMI 1640 (Life Technologies, Carlsbad, CA)において維持した。L6細胞をATCCから入手し、10% FBSで補充されたDMEM高グルコースにおいて維持した。BaF3及びL6細胞の培養物を製造者の指示に従ってエンプティ、hFGFR4、又はhFGFR4/R1レトロウイルス発現ベクターで感染させ、10〜12間、2.5 μg/mLピューロマイシン(Life Technologies)を含有する培地において選択した。選択したプールから、５thパーセンタイルの最も高く発現する細胞を抗FGFR4抗体(8G11; Genentech)を使用してFluorescence Activated Cell Sorting (FACS)で単離した。高レベルのFGFR4、高レベルのFGFR4/R1を発現する細胞、及びエンプティベクターで安定にトランスフェクトされたコントロール細胞の得られたプールを、2.5 μg/mLピューロマイシンを含有する完全培地において維持した。
分裂促進アッセイ。BaF3/コントロール、BaF3/FGFR4、及びBaF3/FGFR4/R1細胞を２回洗浄し、10% FBS、2 mM L-グルタミン、及び2 μg/mlヘパリンで補充されたRPMI 1640において96-ウェルプレート(22,500細胞/ウェル)に播種した。FGFを各ウェルに加え、細胞を72時間、37°Cでインキュベートした。相対細胞密度を製造者の指示に従ってCellTiter-Glo (Promega, Madison, WI)を使用して測定した。
FGF経路活性化の抗FGFR4抗体阻害。細胞をLD1又はアイソタイプコントロール抗体の有無において24時間血清飢餓にした。次いでそれらを5 ng/ml FGF1 (FGF acidic, R&D Systems)及び10 μg/mlヘパリンで5分間刺激した。細胞を、コンプリートEDTA-フリープロテアーゼインヒビターカクテル(Roche)、ホスファターゼインヒビターカクテル1及び2 (Sigma-Aldrich)、2 mMフッ化ナトリウム、及び2 mMオルトバナジウム酸ナトリウムで補充されたRIPA溶解バッファー(Millipore)で溶解させた。等量のタンパク質をホスホ-ERK1/2、ホスホ-FRS2、ERK1/2 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA)、及びFRS2 (Millipore)に対する抗体を使用して免疫ブロットで分析した。
クローン形成アッセイ。HUH7 (5,000細胞/well)、PLC/PRF/5 (2,000細胞/ウェル)、JHH5 (500細胞/ウェル)、又はJHH5/hFGFR4 shRNA (500細胞/ウェル)細胞を、三つ組において6ウェルプレートにおいて2 ml培地/ウェルにおいて播種した。播種の３時間後、HUH7及びPLC/PRF/5細胞を抗FGFR4抗体(chLD1; Genentech)の有無で処理した。抗体を実験の間(14日) 週に2回かえた。JHH5及びJHH5/hFGFR4 shRNA細胞では、2 mg/mlドキシサイクリンの有無での処理を播種の３時間後に開始し、実験の間週に３回かえた。細胞をPBSで洗浄し、0.5%クリスタルバイオレット溶液で染色した。コロニーをMetaMorphソフトウェア(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を使用してカウントした。
インビボ実験。全動物のプロトコルはInstitutional Animal Care and Use Committeeに承認された。年齢5〜6週である雌nu/nuマウスをCharles River Laboratories International (Wilmington, MA)から得た。マウスは、餌が注射の12時間まで自由に標準的な餌及び水を与えられた。マウスは腹腔内(IP)注射(10 mg/kg)のコントロール又は抗FGFR4 (chLD1)抗体を与えられた。１８時間後、マウスはビヒクル(PBS)又は1mg/kg FGF19静脈内(IV)を受けた。30分後、全グループからのマウスは剖検され、組織サンプルが収集され、液体窒素において凍結され、-70oCに保管した。凍結組織からの全RNAをRNeasyキット(Qiagen)を使用して調製した。3〜5匹の動物のグループを各条件について分析した。データを平均±SEMとして表し、スチューデントt検定によって分析した。
異種移植実験では、年齢6-〜8-週のnu/nuの雌マウス (Charles River Laboratories International)を5x106細胞 (200ul/マウス)及びMatrigel (BD Biosciences)で皮下に播種した。7日後、等量(~150mm3)の腫瘍を有するマウスをグループ(n=10)にランダム化し、週に２回IPで処置した。腫瘍を電子キャリパー(Fowler Sylvac Ultra-Cal Mark III; Fred V. Fowler Company, Newton, MA)で測定し、腫瘍体積を式:(W2 x L)/2を使用して算出し、ここでW及びLはそれぞれ小直径及び大直径である。データを平均腫瘍体積±SEMとして表し、スチューデントt検定によって分析した。
FGF19トランスジェニックマウスを前述のように生産した。FGFR4ヌル変異体(FGFR4-KO)動物は前に方向したように構築され、Material Transfer Agreement (University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX)のもと、W. L. McKeehanによって提供された。FGF19を過剰発現し、且つFGFR4受容体を欠くマウス(FGF19-TG:FGFR4-KO)を、ヤングアダルトFGF19-TGの雄とヤングアダルトFGFR4-KOの雌とを交配させることによって作った。双方の遺伝子工学イベントの存在をテイルDNAについてPCRによって離乳時に確認した。
結果
FGFR4は、FGF19トランスジェニック・マウスの肝臓癌形成に、有用である。トランスジェニック・マウスのFGF19の外因の表示は、以前、10ヵ月歳までにHCCが生じることを示した(18)。FGFR4がこのFGF19によって媒介される腫瘍形成に関係しているかどうか判断するために、我々は、FGF19をFGFR4ノックアウト(FGFR4-KO)マウスまたはFGFR4野生型(FGFR4-WT)マウスを有するトランスジェニック(FGF19-TG)マウスに育てた。肝臓発癌が組織の総及びを実行することによって評価された及び、マウスはさまざまな時間位置で検死を行われた。新生物発生前の肝細胞性の増殖(すなわちBrdU編入)を測定することによる及び検査(18)。FGF19-TGのHCCの発現：FGFR4-WTマウスは、先に述べたものとしていた。FGF19-TGに対する反対：FGFR4-WTマウス(FGF19-TG)：FGFR4-KOマウスは、この実験(図1A)の間に、いつでも肝細胞性の新形成の著しいか組織の証拠を進展させなかった。また、新生物発生前の肝細胞性の増殖は、FGFR4-WT遺伝子型を有したFGF19-TGマウスにおいてかなり上昇したが、FGF19-TGに明らかでなかった：FGFR4-KO腹子(図1B)。雌のFGF19-TGマウスの腫瘍開発のひどさ及び前に報告されたより高い頻度と整合した(18)、BrdU編入は、FGF19-TGにおいて増加した：対応する男性(図1Bの左右のパネルを比較する)と比較したFGFR4-WT女性。我々も、FGF19-TGマウスのHCCの発現上のジエチル・ニトロソアミン(DEN)(有力な肝臓発癌物質)の効果を評価した。DENの管理は、FGF19-TGのHCCの発現を加速した：FGFR4-WTマウス。新生物発生前で腫瘍性の病変 ― 変えられた(塩基親和の)肝の焦点、中心周囲の肝細胞形成異常症、よく区別された肝細胞性の腫瘍および積極的な肝細胞癌 ― の全ての範囲は、全てのDEN-既治療FGF19-TGから、肝臓に示した：非DEN既治療FGF19-TGの10ヵ月の年齢と比較した4ヵ月の年齢(図1D)までのFGFR4-WT動物：FGFR4-WTマウス。ほとんどすべてのFGF19-TGからの肝臓の基本的な形態学の特徴：全ての時間位置のFGFR4-WTマウスは、多数の葉(図1C)上のHCCのはなはだしく明白な小結節であった。腫瘍の負担は、肝臓重量を計量することによって評価された。FGF19-TGの全ての時間位置で、次第に増加する相対的な肝臓重量：DEN(図1E)を有するFGFR4-WTマウス既治療。面白いことに、肝臓重量の増加は、女性(6ヵ月の2.7倍)において、男性(6ヵ月の1.8倍)(図1Eの左右のパネルを比較する)においてより発音された。男性の誰も過去6ヵ月の年齢(図1E)を生き残らなかった点に留意する必要がある。肝臓癌形成はFGF19-TGにおいて述べた：DENを有するFGFR4-WTマウス既治療はFGFR4-KOマウスのFGFR4表現の除去によって廃止された。したがって、FGF19-TGの相対的な肝臓重量：FGFR4-KOマウスは、成人期(図1F)の間に一定のままだった。これらの結果は、FGFR4表現がマウスのFGF19を促進された肝臓癌形成のために必要なことを示唆する。
抗-FGFR4中和モノクローン抗体の生成。ターゲッティングFGFR4がHCCの治療的な影響を有することができたかどうか評価するために、我々は、人間のFGFR4及び組み換えマウスをもつFGFR4-KOマウスに予防接種をすることによって、FGFR4に特有の単クローン抗体を生成した。結果として生じるクローン(LD1に指定される)のうちの1台は、マウス、カニクイザルおよび人間のFGFR4(図2A)にその締め具の特異性のために選ばれた。この抗体は、マウスまたは人間FGFR1、FGFR2またはFGFR3(図2A)と結合しなかった。表面プラスモン共鳴分析で、相当する親和性(図2B)を有するマウス、カニクイザルおよび人間のFGFR4行きのそのLD1がみられた。我々は、FGFR4行きのLD1が細胞表面で現れるかどうか評価するために、フローサイトメトリを使用した。LD1を人間のFGFR4によって安定してトランスフェクションするHEK293細胞に具体的に結合することは、加えられる(図2C)抗体量と比例していた。LD1の締め具が、空のベクトルによって安定してトランスフェクションするHEK293電池を制御するためになかった。一緒に、これらのデータは、細胞表面で表されるときに、LD1が特にマウス、カニクイザルおよび人間のFGFR4と結合して、更に人間の受容体を認識することを証明する。
LD1のためのFGFR4エピトープをマップするために、我々は、人間のFGFR1、FGFR2、FGFR3およびFGFR4及びマウスのアミノ酸配列を比較した。8つのアミノ酸は、FGFR1-3オルト・ログのそれらの差違及び、FGFR4オルト・ログとのそれらの類似点に基づいて選ばれた。FGFR4のこれらのアミノ酸は、人間のFGFR4の8つの異なる変異体構造物を生成するために、FGFR3の等価な位置に存在するアミノ酸によって置換された。これらの構造物は、表されて、固相結合実験を使用することを結合しているLD1のために評価された。LD1は、大部分の変異体構造物及び等しくよく野生型FGFR4と結合した;G165Aは、結合しているLD1が危うくされた(図2D)唯一のFGFR4変異体であった。LD1は、陰性対照野生型FGFR3(図2D)と、結合しなかった。我々も、LD1をイムノブロット分析を使用している変異体構造物に結合することを試験した。全ての先に述べたタンパク質構造物は、減少して、変性して、電気泳動にかけられて、ニトロセルロースにelectro-transferredされた。ニトロセルロース膜はLD1によって順次暖められた。そして、抗-FGFR4抗体が異なるエピトープ(8G11)または抗-FLAG抗体を認識した。LD1がG165A変異体(図2E)を除いて等しくよく全ての構造物を検出すると共に、8G11及び抗-FLAG抗体は全てのFGFR4変異体構造物及び野生型FGFR4を検出した。タンパク質バンドは、管制レーン(図2E)の抗体の何れかによって検出されなかった。我々は、G165(図2F)の位置を視覚化するためにFGF19の2つの分子に結合されるFGFR4ダイマーの三次元モデルを生成した。G165は、2台のFGFR4装置との接触の間際に、FGFR4-FGF19複合体の中央に局所化される。一緒に、これらの結果は、G165が人間のFGFR4を有するLD1の相互作用のために決定的であることを示す。LD1を還元して変性するFGFR4にも結合することは、エピトープが三成分の確認に依存しないことを示唆する。
次に、我々は、LD1がFGF1およびFGF19を固相受容体-結合実験を使用しているFGFR4に結合することをブロックすることができるかどうか検査した。結合しているFGFのLD1抑制は、服用に依存して、FGF19(図3A)のための0.003nM、0.102の±及びFGF1のための0.006nM、0.093の±のIC50に着いた。LD1が細胞表面で表されるFGFR4の機能を阻害することができたかどうか評価するために、我々は、最初に、それがFGFR1(BaF3/FGFR4/R1)の細胞内の領域及びFGFR4の細胞外の領域のためにコード化する空想的な構造物によって安定してトランスフェクションするBaF3ネズミ・プロB細胞系を利用した。何れかFGFRs.を表さない、野生型BaF3細胞系は、インターロイキン３(IL-3)である-依存している細胞系ヘパリン及びFGFによって刺激されるときに、FGFRsによってトランスフェクションするBaF3細胞はIL-3がない場合、増殖する。この構造物のトランスフェクションは、我々がBaF3細胞の成長を支えるためにFGFsをIL-3と置換することができた。5nM FGF1がある場合には、LD1は、5.4nM(図3B)、17.4の±のIC50を有するBaF3/FGFR4/R1細胞の激増を阻害した。
我々も、FGFシグナリング上のLD1の効果を評価するためにFGFR4(L6/FGFR4)を表しているベクトルによって安定してトランスフェクションするL6ネズミ骨格筋細胞系を使用した。LD1が服用に依存する方法(図3C)のこれらの二次伝達物質のリガンドによって誘発されたリン酸化を阻害すると共に、FGF1およびヘパリンのFGFR経路を起動するL6/FGFR4細胞培養への追加は細胞外の信号を調整されたキナーゼ1/2(ERK1/2)及びFGFR基質2(FRS2)のリン酸化によってデモをした。面白いことに、LD1の追加も、これらの細胞(図3C)の全体のFRS2内容の増加を誘発した。
我々がLD1を結合することを評価したフローサイトメトリを使用することは、HCC細胞系のサブセットの細胞表面で、FGFR4の表示を確認した。LD1は、JHH5細胞(図3D)及び、最も高くより小さい範囲でHUH7行きのPLC/PRF/5及びと結合した。制御抗体をこれらの細胞の表面に結合することは、ごくわずかだった(図3D)。さらにまた、BaF3細胞(それらがFGFR4を表さないので、陰性対照として使われた)の表面に対する制御抗体及びLD1を結合することは、また、ごくわずかだった(図3D)。
LD1は、肝癌細胞系のFGFR4機能を阻害する。LD1の阻害力は、内因性のFGFR(すなわちFGFR1-4)表現(図7)の各種レベルを有する肝癌細胞系を使用して特徴づけられた。HEP3B細胞において、LD1がFRS2(図4A)のFGF19を刺激されたリン酸化を阻害すると共に、FGF19の追加はERK1/2及びFRS2のリン酸化を起動させた。そして、L6/FGFR4細胞に対するその効果と同様だった。LD1は、しかしながら、ERK1/2(図4A)のリン酸化をこれといって変えなかった。
チトクロームP450 7α1(CYP7α1)の表示およびc-Fosは、肝細胞線のFGF19によって調整される(16, 22)。我々は、LD1がこのFGF19によって媒介される遺伝子変調を禁止することができるかどうか検査した。HEB3B細胞において、FGF19の追加は、81%(図4B)、CYP7α1の表示を減らした。LD1の追加は、CYP7α1(図4B)の基礎表示の67%を復元した。加算FGF19の非存在下で、LD1は、2倍(図4B)、CYP7α1表現を増やした。FGF19の追加がHUH7細胞のCYP7α1の表示に影響を及ぼさなかったにもかかわらず、LD1の追加は、FGF19の存在または欠如の2.9-および3.5倍この遺伝子の表現度を増やして、それぞれHEP3B細胞(図8)に記載の類似した効果を有した。陰性対照抗体の追加は、HEP3BかHUH7細胞(8及び図4B、それぞれ)のCYP7α1の表示に、影響を及ぼさなかった。面白いことに、LD1の追加は、HEP3BおよびHUH7細胞の外因的に加算FGFR4リガンドの非存在下で、CYP7α1表現のアップレギュレーションにつながる。これは、LD1が基礎活性がおそらくFGFR4リガンド・オートクリン/パラ分泌ループによって維持したFGFR4を阻害することを示す。
更にFGFR4の基礎活性上のLD1の効果を評価するために、我々は、外因的に加算FGFR4リガンドの非存在下でc-Fosの表示を測定した。FGFR4経路の活性化は、以前、c-Fosの表示を増やすことを示した(16)。LD1の追加は、PLC/PRF/5つのセル線の75%、JHH5、JHH7およびHUH7細胞系及びの50%、c-Fosの基礎表示を減少させた;制御抗体の追加は、基礎c-Fos表現(図4C)に、影響を及ぼさなかった。これらの結果は、FGFR4の基礎活性を阻害するために、LD1の能力を示す。
LD1は、コロニー形成を阻害する。我々は、最初にコロニー形成をドキシサイクリン誘導性のFGFR4特定のshRNAまたは制御shRNAによって安定してトランスフェクションするJHH5細胞で測定した。非存在下でコロニーを形成するために制御構造物によってトランスフェクションするJHH5細胞の能力またはドキシサイクリンの存在の違いがなかったにもかかわらず、ドキシサイクリンのshRNAが造るFGFR4によってトランスフェクションするJHH5細胞への追加はドキシサイクリン(図4D)の非存在下で細胞と比較して、76%コロニー形成を阻害した。この結果は、FGFR4が肝癌細胞系のコロニー形成に関係していることを示唆する。
次に、我々は、肝癌細胞系のパネルによってコロニー形成を阻害するために、LD1の能力を試験した。LD1のJHH5、HUH7およびPLC/PRF/5セルの培養組織への追加は、26%、50%および82%の最大の抑制に達して、それぞれコロニー形成(図4F)の服用に依存する減少を引き起こした。HUH7細胞培養及びPLC/PRF/5の代表例は、図4Eに示される。制御抗体の追加は、コロニー形成(図4F及び4E)に影響を及ぼさなかった。これらの結果は、LD1が肝癌細胞系のFGFR4によって媒介されるコロニー形成を阻害することを示す。
LD1は、活発な活性のFGFR4を阻害する。我々は、LD1または制御抗体を注射されるマウスの肝臓のFGF19を起動するc-Fos誘導を測定することによって、LD1の生体内での有効性を評価した。肝臓のc-Fos誘導がFGF19刺激に影響されるので、我々はFGF19へのc-Fos反応をモニタするほうを選択した(16)。C-Fos表現は、53倍、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(図5A)を有するマウス既治療の肝臓と比較して、FGF19を有するマウス既治療の肝臓においてより高かった。LD1の管理は、18時間、FGF19の注射の前に、3.5倍(図5A)、c-Fos誘導を減らした。LD1も、6倍(図5A)、単純なマウスのc-Fos表現の基礎レベルを減らした。制御抗体の注入は、未処置のマウス(図5A)と比較して、c-Fosの基礎であるかFGF19を刺激された表示を変えなかった。これらのデータは、FGF19を刺激されたFGFR4活性及び基礎ものを阻害することで、LD1の生体内での有効性を示す。
LD1は、生体内で腫瘍成長を阻害する。腫瘍成長を阻害することで、LD1の生体内での有効性を調べるために、我々は、最初にHUH7肝癌細胞系異種移植片モデルを利用した。定着腫瘍(ほぼ150のmm3)を支えているマウスは、30mg/kgのLD1、30mg/kgの制御抗体またはPBSを有する一回分を盛られた週刊誌であった。13日後に、PBSか制御抗体を有するマウス既治療のHUH7腫瘍は、720のmm3(図5B)の平均サイズに増大した。しかしながら、LD1を有するマウス既治療のHUH7腫瘍は、28のmm3、制御抗体と比較した腫瘍成長の96%の抑制またはPBS(図5B)の平均サイズに増大した。繰り返された実験において、二回週につき30mg/kgのLD1の管理によって、完全な腫瘍成長阻害(図9)が生じた。剖検で、FGFR4を調整された遺伝子及びFGFR4の表示上のLD1の効果が評価された及び、腫瘍は切除された。LD1の管理は、HUH7異種移植片腫瘍(図5C)のFGFR4表現に影響を及ぼさなかった。しかしながら、LD1は、PBS既治療マウス(図5C)の腫瘍において測定されるCYP7α1の発現レベルと比較して、3倍CYP7α1の表示を増やした。LD1も、PBS治療をうけているマウス(図5C)と比較して、17-および6倍、それぞれ、egr-1及びc-Fosの表示を減らした。
更にLD1の生体内での有効性を評価するために、我々は、FGF19-TGマウスモデルを使用した。FGF19-TGマウスは、腫瘍形成を加速するために15日の年齢でDENで扱われて、それから4週間目でランダムに3つの一団に分類された。その他の2つのグループがLD1か毎週の基礎上の抗-FGF19抗体(1A6)を受けた及び、1つのグループは制御抗体を受けた。1A6は、以前、FGF19-TGマウスの腫瘍形成を予防することを示した(23)。肝臓が分析のために切除された及び、6ヵ月後に、マウスは検死を行われた。制御抗体を有するマウス既治療の肝臓は、多数の葉(図5D)に、はなはだしく明白な大きな小結節があった。しかしながら、LD1(図5D)または1A6を有するマウス既治療の肝臓には、新形成の証拠がなかった。このパラメータが以前強くFGF19-TGモデルのパーセント腫瘍ボリュームと相関することを示したので、我々も腫瘍の負担を評価するために肝臓重量を計量した(18, 23)。LD1または1A6を有するマウス既治療からの肝臓の重量は、制御抗体(図5E)を有するマウス既治療から、肝臓の重量より有意に低かった(p = 0.035及びp = 0.052、それぞれ)。LD1を有するマウス既治療および1A6を有するマウス既治療間の肝臓重量の違いは、重要でなかった(図5E)(p = 0.439)。一緒に、これらのデータは、症状発現前のモデルの肝細胞癌を阻害することで、明らかにLD1の生体内での有効性を示す。
FGFR4表現は、癌において変えられる。我々は、BioExpressデータベース(遺伝子Logic、会社、Gaithersburg、MD、米国)を分析することによって、種々の人間の通常の及びガン組織のFGFR4表現を評価した。FGFR4表現は、大部分の種類の癌において非常に可変的である。正常組織と比較して、FGFR4表現は、肝臓において高架鉄道で、結腸直腸で、胃で、食道、小腸癌だった(図6A)及び、しかし、腎臓、肺、リンパ性において減弱して、及び精巣癌。免疫組織化学(IHC)を使用して、我々は、肺、胸部、膵臓、及び卵巣の腺癌、肺扁平上皮癌、肝細胞癌、甲状腺癌、及び正常はい、膵臓および甲状腺のサンプルのパネルのFGFR4を局所化した。FGFR4の検出は、通常で腫瘍性の上皮細胞(代表例は、図6Bに示される)の膜で細胞質の染色を引き起こした。正常組織と比較して、染色のより高い等級は、通常、腫瘍サンプルで見つかった。抗-FGFR4による著しい標識に適度な膵臓(41%の標本において)、胸部(46%)、肺(31%)、卵巣(41%)、コロン(90%)、肝臓(33%)および甲状腺(11%)(ref. 23及び表2)からの腫瘍において明らかだった。
表２：正常及び癌組織におけるＦＧＦＲ４発現。ＦＧＦＲ４免疫染色の病理組織学的評価によって決定される正常及び癌組織におけるにおけるＦＧＦＲ４発現の蔓延
Figure 2014516511
人間のHCCのFGFR4の広範囲にわたる表示は、また、以前ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成によって確認された(23)。HCC及びFGFR4の関連がすでに提案されたので、我々は定量的リアルタイムPCR法(qRT-PCR)を使用している11の正常肝及び更に23の主要な人間の肝腫瘍のFGFR4表現を評価することに決めた。各々のサンプルのFGFR4の表示は、第1の正常肝サンプル(N1)のこの受容体の表示に正常化された。FGFR4の平均レベルは正常肝(0.90-±0.04-折り目)と比較して肝腫瘍(1.22-±0.05-折り目)において適度に増加した、しかし、その人口が全体として考慮される(図6C)ときに、違いは統計的有意差(p = 0.23)に着かなかった。しかしながら、FGFR4表現は、腫瘍のサブセットが、かなりより高かった(2倍以上)(7/23;30%).これらの結果は、FGFR4表現が数種類の癌において規制撤廃されることを示す。肝腫瘍のサブセットのFGFR4の発現増加は、それが肝癌の治療の魅力的な目標を診断選択された患者集団において代表することができることを示唆する。
この研究において、抗体を機能させなくなっているFGFR4を有するその処理が抗腫瘍利点を提供することができる及び、我々はFGFR4が肝細胞癌に参加するという証拠を提供する。肝臓腫瘍形成のFGFR4の関与を評価するために、我々は、遺伝子工学によるマウスモデルを使用した。FGF19の外因の表示は、肝細胞増殖、肝細胞性の形成異常症およびマウスのHCCの発現を促進することを示した。加えて、我々その他は、KlothoβがFGF19の肝臓-比活性のために必要なことを証明した(16,19,24)。FGFR4及びKLBが肝臓において最も高く表されるので、我々はFGFR4経路の規制緩和がFGF19によって媒介される肝臓腫瘍形成の原因となると仮定した。この仮説を検証するために、我々は、FGFR4-KOマウスを有するFGF19-TGマウスを育てた。肝細胞性の新形成及び新生物発生前の肝細胞性の増殖は、FGFR4-WT背景をもつFGF19-TGマウスだけで発見された。より生きている腫瘍形成は、FGFR4-KOマウスにおいて廃止された。我々は、有力な肝癌誘発物質(ジエチル・ニトロソアミン)を投与することによって、更にマウスに疑問を呈した。DENを有する処理はFGFR4-WT背景をもつFGF19-TGマウスのHCCの発現を加速したのに、肝臓新形成の証拠はFGFR4-KOマウスで発見されなかった。はっきりした結論は、FGFR4がFGF19を促進された肝臓腫瘍形成のために必要であるということである。
一緒に、これらのデータは、FGFR4、肝臓腫瘍形成および肝癌進行の関連を提案する。従って、その抑制が肝癌患者に治療的な利点を提供することができる及び、FGFR4は潜在的治療的な目標である。このために、我々は、抗-FGFR4中和抗体(LD1)を呈した。LD1は、FGFR4と結合して、生体外でリガンド締め具、経路活性化、遺伝子形質発現の調節、細胞増殖およびコロニー形成を阻害する。LD1がFGFR4と結合するサイトは、FGFR4オルト・ログの間で類似であるが、FGFR1-3オルト・ログにおいて異なるサイトでポイントミューテーションを支えているFGFR4構造物を有するLD1の相互作用を評価することによって局所化された;FGFR4のこれらのアミノ酸残基は、FGFR3の等価な位置に存在するアミノ酸残基によって置換された。LD1は、FGFR4がG165A変異体を除いて造る変異体の全て及び、野生型FGFR4と結合した。FGFR4の位置165のアラニンによるグリシンの置換は、ほとんど、結合しているLD1を廃止した。FGFRs間のこの領域の高いアイデンティティと結合されるFGFR4のためのLD1の洗練された特異性は、結合しているLD1のためのこの残りの重要性を強調する。FGFR4のグリシン165は、FGFR1のアラニン171に対応する。面白いことに、アラニン171は、FGFR1ダイマー・インタフェースで最も近い方法の残りである(25)。ダイマーの軸全体に、1つの受容体のアラニン171の側鎖は、隣接した受容体のアラニン171と恐怖病に連絡をとる。FGFRsのこの領域のシーケンスの保護は、受容体-受容体インタフェースを形成しているこの領域と整合している(26, 27)。このように、LD1をFGFRのこの等価な領域に結合することは、受容体二量体化を崩壊させてありそうである。リガンドによって誘発された受容体二量体化は、FGFRsの活性化にとって重要である。従って、FGFR4二量体化の抑制は、LD1のための潜在的作用機構である。類似した作用機構は、他の治療的な抗体のためにすでに記載されていた(28)。
我々は、生体内で、LD1が遮断の腫瘍成長によってFGFR4及びの下流に遺伝子の変調を禁止することによって肝癌異種移植片腫瘍に従って行動することを示した。加えて、LD1の管理は、FGF19-TGマウスのHCCsの形成および開発を禁止した。
これらのデータは、FGFR4が癌進行及び腫瘍形成を促進することに関係していることを証明する。特に、我々の結果は、FGFR4が肝細胞癌において重要な役割を果たすことができることを示唆する。証拠のいくつかの境界は、この仮説をサポートする。FGFR4は、人間の肝細胞に存在する支配的なFGFRの等形である(15)。我々は肝臓組織がKLB反訳記録レベル及び最も高いFGFR4を有すると前に報告した。そして、その両方はこのシグナリング複合体によってリガンドを刺激された活性にとって重要である(16)。さらにまた、マウスのFGF19(すなわちFGFR4に特有のリガンド)の異所性の表示は、肝細胞増殖、肝細胞性の形成異常症および新形成を促進する(18)FGF19によって誘発された肝細胞及び、増殖は、FGFR4によって独自に調停されることが報告された(24)。最近の報告は、FGFR4もアルファ胎仔タンパク質分泌、増殖および抗-アポトーシスを調整することによって有意にHCC進行に関与することを示唆する(17)。FGFR4表現は、また、化学療法に対する抵抗を促進することを示した(29)。1つのグループがマウスのFGFR4のための保護役割(HCCプロモーティング作用よりむしろ)を報告した点に留意する必要がある(30)。リガンド、同じくFGFRsのレベルおよび共同受容体発現の集中及び識別を含む前後関係の要因が腫瘍形成のFGFR4の役割を調整するかもしれないかもしれない。例えば、我々はFGFR4表現が主要な肝腫瘍のサブセットにおいてかなり増加するとわかった。そして、FGFR4が肝癌の治療の魅力的な目標を診断選択された患者集団において代表することができることを示唆した。HCC進行及び肝臓腫瘍形成のFGFR4の関与に対して蓄積している証拠を与えられて、我々は、抗-FGFR4中和抗体を含む治療的な介入が肝癌の治療において有益にしそうであると思っている。
部分的参照リスト
1. Ornitz, D.M., and Itoh, N. 2001. Fibroblast growth factors. Genome Biol 2:REVIEWS3005.
2. Eswarakumar, V.P., Lax, I., and Schlessinger, J. 2005. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine Growth Factor Rev 16:139-149.
3. Powers, C.J., McLeskey, S.W., and Wellstein, A. 2000. Fibroblast growth factors, their receptors and signaling. Endocr Relat Cancer 7:165-197.
4. Bange, J., Prechtl, D., Cheburkin, Y., Specht, K., Harbeck, N., Schmitt, M., Knyazeva, T., Muller, S., Gartner, S., Sures, I., et al. 2002. Cancer progression and tumor cell motility are associated with the FGFR4 Arg(388) allele. Cancer Res 62:840-847.
5. Cappellen, D., De Oliveira, C., Ricol, D., de Medina, S., Bourdin, J., Sastre-Garau, X., Chopin, D., Thiery, J.P., and Radvanyi, F. 1999. Frequent activating mutations of FGFR3 in human bladder and cervix carcinomas. Nat Genet 23:18-20.
6. Chesi, M., Brents, L.A., Ely, S.A., Bais, C., Robbiani, D.F., Mesri, E.A., Kuehl, W.M., and Bergsagel, P.L. 2001. Activated fibroblast growth factor receptor 3 is an oncogene that contributes to tumor progression in multiple myeloma. Blood 97:729-736.
7. Chesi, M., Nardini, E., Brents, L.A., Schrock, E., Ried, T., Kuehl, W.M., and Bergsagel, P.L. 1997. Frequent translocation t(4;14)(p16.3;q32.3) in multiple myeloma is associated with increased expression and activating mutations of fibroblast growth factor receptor 3. Nat Genet 16:260-264.
8. Gowardhan, B., Douglas, D.A., Mathers, M.E., McKie, A.B., McCracken, S.R., Robson, C.N., and Leung, H.Y. 2005. Evaluation of the fibroblast growth factor system as a potential target for therapy in human prostate cancer. Br J Cancer 92:320-327.
9. Jaakkola, S., Salmikangas, P., Nylund, S., Partanen, J., Armstrong, E., Pyrhonen, S., Lehtovirta, P., and Nevanlinna, H. 1993. Amplification of fgfr4 gene in human breast and gynecological cancers. Int J Cancer 54:378-382.
10. Jang, J.H., Shin, K.H., and Park, J.G. 2001. Mutations in fibroblast growth factor receptor 2 and fibroblast growth factor receptor 3 genes associated with human gastric and colorectal cancers. Cancer Res 61:3541-3543.
11. Jang, J.H., Shin, K.H., Park, Y.J., Lee, R.J., McKeehan, W.L., and Park, J.G. 2000. Novel transcripts of fibroblast growth factor receptor 3 reveal aberrant splicing and activation of cryptic splice sequences in colorectal cancer. Cancer Res 60:4049-4052.
12. Jeffers, M., LaRochelle, W.J., and Lichenstein, H.S. 2002. Fibroblast growth factors in cancer: therapeutic possibilities. Expert Opin Ther Targets 6:469-482.
13. Xiao, S., Nalabolu, S.R., Aster, J.C., Ma, J., Abruzzo, L., Jaffe, E.S., Stone, R., Weissman, S.M., Hudson, T.J., and Fletcher, J.A. 1998. FGFR1 is fused with a novel zinc-finger gene, ZNF198, in the t(8;13) leukaemia/lymphoma syndrome. Nat Genet 18:84-87.
14. Shariff, M.I., Cox, I.J., Gomaa, A.I., Khan, S.A., Gedroyc, W., and Taylor-Robinson, S.D. 2009. Hepatocellular carcinoma: current trends in worldwide epidemiology, risk factors, diagnosis and therapeutics. Expert Rev Gastroenterol Hepatol 3:353-367.
15. Kan, M., Wu, X., Wang, F., and McKeehan, W.L. 1999. Specificity for fibroblast growth factors determined by heparan sulfate in a binary complex with the receptor kinase. J Biol Chem 274:15947-15952.
16. Lin, B.C., Wang, M., Blackmore, C., and Desnoyers, L.R. 2007. Liver-specific activities of FGF19 require Klotho beta. J Biol Chem 282:27277-27284.
17. Ho, H.K., Pok, S., Streit, S., Ruhe, J.E., Hart, S., Lim, K.S., Loo, H.L., Aung, M.O., Lim, S.G., and Ullrich, A. 2009. Fibroblast growth factor receptor 4 regulates proliferation, anti-apoptosis and alpha-fetoprotein secretion during hepatocellular carcinoma progression and represents a potential target for therapeutic intervention. J Hepatol 50:118-127.
18. Nicholes, K., Guillet, S., Tomlinson, E., Hillan, K., Wright, B., Frantz, G.D., Pham, T.A., Dillard-Telm, L., Tsai, S.P., Stephan, J.P., et al. 2002. A mouse model of hepatocellular carcinoma : ectopic expression of fibroblast growth factor 19 in skeletal muscle of transgenic mice. Am J Pathol 160:2295-2307.
19. Kurosu, H., Choi, M., Ogawa, Y., Dickson, A.S., Goetz, R., Eliseenkova, A.V., Mohammadi, M., Rosenblatt, K.P., Kliewer, S.A., and Kuro-o, M. 2007. Tissue-specific expression of betaKlotho and fibroblast growth factor (FGF) receptor isoforms determines metabolic activity of FGF19 and FGF21. J Biol Chem 282:26687-26695.
20. Pai, R., Dunlap, D., Qing, J., Mohtashemi, I., Hotzel, K., and French, D.M. 2008. Inhibition of fibroblast growth factor 19 reduces tumor growth by modulating beta-catenin signaling. Cancer Res 68:5086-5095.
21. Ornitz, D.M., Yayon, A., Flanagan, J.G., Svahn, C.M., Levi, E., and Leder, P. 1992. Heparin is required for cell-free binding of basic fibroblast growth factor to a soluble receptor and for mitogenesis in whole cells. Mol Cell Biol 12:240-247.
22. Holt, J.A., Luo, G., Billin, A.N., Bisi, J., McNeill, Y.Y., Kozarsky, K.F., Donahee, M., Wang da, Y., Mansfield, T.A., Kliewer, S.A., et al. 2003. Definition of a novel growth factor-dependent signal cascade for the suppression of bile acid biosynthesis. Genes Dev 17:1581-1591.
23. Desnoyers, L.R., Pai, R., Ferrando, R.E., Hotzel, K., Le, T., Ross, J., Carano, R., D'Souza, A., Qing, J., Mohtashemi, I., et al. 2008. Targeting FGF19 inhibits tumor growth in colon cancer xenograft and FGF19 transgenic hepatocellular carcinoma models. Oncogene 27:85-97.
24. Wu, X., Ge, H., Gupte, J., Weiszmann, J., Shimamoto, G., Stevens, J., Hawkins, N., Lemon, B., Shen, W., Xu, J., et al. 2007. Co-receptor requirements for fibroblast growth factor-19 signaling. J Biol Chem 282:29069-29072.
25. Plotnikov, A.N., Schlessinger, J., Hubbard, S.R., and Mohammadi, M. 1999. Structural basis for FGF receptor dimerization and activation. Cell 98:641-650.
26. Ibrahimi, O.A., Yeh, B.K., Eliseenkova, A.V., Zhang, F., Olsen, S.K., Igarashi, M., Aaronson, S.A., Linhardt, R.J., and Mohammadi, M. 2005. Analysis of mutations in fibroblast growth factor (FGF) and a pathogenic mutation in FGF receptor (FGFR) provides direct evidence for the symmetric two-end model for FGFR dimerization. Mol Cell Biol 25:671-684.
27. Mohammadi, M., Olsen, S.K., and Ibrahimi, O.A. 2005. Structural basis for fibroblast growth factor receptor activation. Cytokine Growth Factor Rev 16:107-137.
28. Agus, D.B., Akita, R.W., Fox, W.D., Lewis, G.D., Higgins, B., Pisacane, P.I., Lofgren, J.A., Tindell, C., Evans, D.P., Maiese, K., et al. 2002. Targeting ligand-activated ErbB2 signaling inhibits breast and prostate tumor growth. Cancer Cell 2:127-137.
29. Roidl, A., Berger, H.J., Kumar, S., Bange, J., Knyazev, P., and Ullrich, A. 2009. Resistance to chemotherapy is associated with fibroblast growth factor receptor 4 up-regulation. Clin Cancer Res 15:2058-2066.
30. Huang, X., Yang, C., Jin, C., Luo, Y., Wang, F., and McKeehan, W.L. 2009. Resident hepatocyte fibroblast growth factor receptor 4 limits hepatocarcinogenesis. Mol Carcinog 48:553-562.
31. Winer, J., Jung, C.K., Shackel, I., and Williams, P.M. 1999. Development and validation of real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction for monitoring gene expression in cardiac myocytes in vitro. Anal Biochem 270:41-49.
32. Tomlinson, E., Fu, L., John, L., Hultgren, B., Huang, X., Renz, M., Stephan, J.P., Tsai, S.P., Powell-Braxton, L., French, D., et al. 2002. Transgenic mice expressing human fibroblast growth factor-19 display increased metabolic rate and decreased adiposity. Endocrinology 143:1741-1747.
33. Yu, C., Wang, F., Kan, M., Jin, C., Jones, R.B., Weinstein, M., Deng, C.X., and McKeehan, W.L. 2000. Elevated cholesterol metabolism and bile acid synthesis in mice lacking membrane tyrosine kinase receptor FGFR4. J Biol Chem 275:15482-15489.
Ｂ．的外れに非常に特定のFGF受容体4に対して抗体の人間化の間、除去される識別された及びを結合する
方法及び材料
FGFR4はSulfo-NHS-LC-ビオチンを使用してビオチン化された(入る;ネコ21335)。
キメラLD1の生成−本願明細書において記載されてるように、人間のFGF受容体4(FGFR4)の細胞外の領域は、記載されているにつれて、及びが純化したCHO細胞を中で表したbalb/cマウスに予防接種をするために用いた。クローンがタンパク質ベースのＥＬＩＳＡのFGFR4と結合しているFGF19を遮断する能力のために放送されるときに、LD1を表しているハイブリドーマは識別された。
ネズミのLD1可変ドメインは、標準分析法を使用しているハイブリドーマ細胞を生じているLD1から抽出される完全リボゾームリボ核酸からクローンをつくられた。可変的な重い(VH)領域及び可変照明(VL)は、VH地方及びVLのＮ末端アミノ酸配列に特有の前方のプライマ及び恒常的な重い領域1(CH1)及び恒常的な光(CL)に変性復帰プライマを有するRT-PCRを使用して増幅された。これらの可変ドメインは、それから、Ｈ鎖恒常部及びそれぞれの人間の光を含んだベクトルへのクローンをつくられたin-frameであった。
LD1の親和性成熟及びヒト化−LD1のHypervariableな領域は、人間のVHサブグループIII(huIII)可変ドメイン・フレームワーク及び私(huKI)がtrastuzumabにおいて使用した人間のカッパに移植された。フレームワーク変化の最小限の組合せが識別された非常に完全に回復するFGFR4結合能であるまで、フレームワーク修理はマウス副尺位置の追加によるFGFR4結合能を最適化するために用いた。
hLD1.vB(バクテリオファージ上の一価性のＦａｂ-P3融合として示される)は、柔らかい機会的分布戦略を使用して熟成する親和性であった。ネズミの高度変異部シーケンスへの偏りが毒入りのオリゴヌクレオチド合成戦略を使用して維持されたように、シーケンス多様性は別に各々の高度変異部にもたらされた。各々の多様化された位置のために、野生型アミノ酸をコード化しているコードンは、各々の位置で平均50パーセントの突然変異率に結果としてなっているヌクレオチドの70-10-10-10の混成によって有害にされた。
hLD1.vB多様化されたバクテリオファージ・ライブラリは、可溶性の選択方法を使用してパンされた。この方法は溶液のビオチン化されたFGFR4の低い集中を有する短い結合期間に依存した。そして、固定された中性アビジン上のFGFR4にバクテリオファージ-跳躍の短い5分の捕獲が続いた。過剰なラベルのないFGFR4(100nMを超える)は、増加した外れた率選択厳しさのための捕獲ステップの前に加えられた。縛られたバクテリオファージは30分の間の100mMのHClを有する井戸を暖めることによって抜き取られた。そして、M13/KO7ヘルパーファージ及び1Mのトリス、pH 8および増幅された使用しているXL1-Blue電池で効力を消された。バクテリオファージ抗体はノーカット免疫グロブリンGに再フォーマットされた。そして、一過性に哺乳動物細胞において表されて、Protein Aクロマトグラフィによって純化された。
親和性の決定−親和性の決定は、BIAcoreTM-2000を使用している表面プラスモン共鳴によって実行された。
PBSTのFGFR4(0.48-1000nM)の連続2倍の希釈剤が30のμl/最小限度の流速で、注入された及び、hLD1.vB免疫グロブリンGのほぼ50のRUはCM5センサチップ上の10mMのSodium Acetate pH 4.8において固定された。各々のサンプルは、10分の解離及び4分の関連によって分析された。各々の注射の後、チップは、10mMのグリシンpH 1.7を使用して再生した。結合反応は、RUを類似した密度で固定される無関係な免疫グロブリンGを有する流れセルから減算することによって修正された。Languirがkoff及びkonの同時合わせることの中でモデル化する1:1が、キネティクス分析のために使われた。
異種移植片実験−全動物プロトコルは、Genentech’s Institutional Animal CareおよびUse委員会の承認を得た。7週間目の雌のnu/nu(裸の品種相似係数)マウスは、チャールズ川Laboratoriesインターナショナル(コード088の重圧となる)から得られた。マウスは、特定病原体感染防止条件状況の下で維持された。HUH7細胞(5つのx 106;日本Health科学Research Resourcesバンク(ネコJCRB0403))HBSS/Matrigelの0.2mL量のマウスの横腹に、皮下に植設した(1:1にv/v;BD Biosciences(ネコ354234))。腫瘍ボリュームが公式を使用して算出された及び、腫瘍はカリパス副木で毎週二回測定された：V = 0.5 x L x W2(LおよびWが腫瘍の長さおよび幅である)、それぞれ。平均腫瘍ボリュームが145のmm3に着くときに、マウスは車両(PBS)、30mg/kgのchLD1、30mg/kgのhLD1.vBまたは30mg/kgのhLD1.v22の0.2mLの腹こう内投与によって１週間に１回既治療及びグループ(n = 15)にランダム化された。処理後の、腫瘍体積は、上記の通りに計量された。パーセント腫瘍成長阻害(% TGI)は以下の公式を使用して算出された、制御車両のDay 21の平均腫瘍ボリュームはどのC =で試験処理を与えられる各々のグループのマウスからT =及びDay 21上の平均体積を分類する：100が×印を付ける((CT)/C)%TGI =。ログランク検定がJMPソフトウェアをもつグループの腫瘍を２倍にしている違いを評価するために用いた及び、データが分析されて、Version 6.0(SAS研究所;ケアリー(NC))。データは、平均腫瘍ボリューム±SEMとして示される。
マウスの薬物動態学的研究−NCRヌードマウスは、Taconic(ネコNCRNU)によって供給された。C3ノックアウト・マウスは、少なくとも10世代のためのC57BL/6マウスに戻し交配された。子供たちは、野生型の統制及びC3ノックアウト・マウスを生産するために交差した。この研究において、それぞれ、それらは、C3 wtマウス及びC3 koと称する。
15.5および38.3gの間で体重があっているマウスは、尾静脈を経て抗-FGFR4抗体の1、5または20mg/kgの体重点滴大量瞬時投与量を施された。選択された時間に分離される血清及び心臓棒(時間につきn=3マウスは、ポイントする)が最高28日のポスト服用を示す又は、血液サンプルはレトロ軌道裁切りを経て集められた。血清サンプルは、格納された-80°CＥＬＩＳＡを使用している抗-FGFR4抗体血清中濃度のために検定される。
抗-FGFR4抗体血清中濃度-時間側面は、WinNonlin Enterprise Version 5.2.1(Pharsight社)を使用しているPKパラメータを推定するために用いた。単一の集中?時間側面が各々のグループのために決定されたので、各々のPKパラメータの発作の標準誤差(SE)とともに、各々のPKパラメータの1つの評価は得られて、報告される。各々のグループのために管理される名目服用が、モデリングのために使われた。
放射性ヨウ素化−抗体は、間接的なヨード情報追加方法を使用してradioiodinatedされた。放射性同位元素で識別されたタンパク質は、NAP5TM柱を使用して精製された(GE HealthcareライフSciences,cat。17-0853-01)予めPBSにおいて釣り合わせられた。生体外実験において使用する分子の比活性は、hLD1.vBのための15.05mCi/mg及びchLD1のための14.38mCi/mgであった。生体内での研究において使用する分子の比活性は、hLD1.vBのための9.99mCi/mg及びchLD1のための12.52mCi/mgであった。放射性ヨウ素化後の、radioiodinatedされた、抗体は、ラベルのない抗体と結合している相当するテストを保持している完全な及びとして、サイズ排除高圧液体クロマトグラフィ(HPLC)、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動)およびＥＬＩＳＡによって特徴づけられた。
インビトロインキュベーション−200mg/mlの終濃度おいて血清においてFor潜伏、抗体は、NCR裸像(C3 koまたはC3 wtマウス血清)に加えられたPBS + 0.5%及びBSAアリクォット(100のμl)は、作られて、穏やかな回転を有する37°Cで暖められた。サンプルは、及びが保存した0、4、8、24、48および96hで、ドライアイスへ転送された-ＥＬＩＳＡ分析まで70°C。
プラズマの潜伏のために、抗体がカニクイザル(人間)に加えられたことネズミ(バイオ開発LLC(ネコ)。CYNPLLIHP、HMLLIHP、そして、それぞれ、RATPLLIHP)、0.5% PBS +及びNCRヌードマウス・プラズマ(Taconic、ネコNCRNU-E)及び5つの×106のCPM/mlの終濃度の200mg/mlの±125I-抗体の終濃度でBSA。アリクォット(100のμl)は、作られて、穏やかな回転を有する37°Cで暖められた。0、24および48hでサンプルが及びが保存したドライアイスへ転送されたこと-サイズ-除外HPLC(ラベルのない抗体がサンプルをとる125I-抗体+)による分析まで70°CまたはSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ラベルのない抗体サンプル)が続くタンパク質-G摘出を受ける。
組織分布試験−雌NCRヌードマウスは、20mg/kgで300mCi/kgの±ラベルのないhLD1.vBで、20mg/kgまたは125I-hLD1.vBで300mCi/kgの±ラベルのないchLD1で、125I-chLD1の点滴大量瞬時投与量を受信した。血液は、2、5、24、72および120hのポスト服用及び15分に集められて、血清のために処理された。血清は、凍られた-サイズ-除外HPLCによって分析されるまで、タンパク質-G摘出を受ける及びがSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動分離によってあとに続いて70°C。総放射性カウントは、また、ウォーレス1480ウィザード3”を使用して得られた(EC&Gウォーレス(ネコ)。1480-011).肝臓(肺)心臓が2、72集められた及び腎臓凍られる120時間のポスト服用及び及び-全体の放射能のための分析まで70°C。全ての動物は、IACUCガイドラインに従って慣らされた。
IgG及びFGFR4 ELISA−特定の免疫グロブリンG及び免疫グロブリンGは、FGFR4 ＥＬＩＳＡを使用して測定された。FGFR4はミクロタイタープレートに固定されたと、捕獲免疫グロブリンGが2つのヤギ抗-huIgG Fcがワサビペルオキシダーゼ(HRP、ジャクソン、cat# 109-036〜098)に接合したF(ab’)によって検出された及び、0.35MのNaCl(1x PBS pH 7.4、0.5%のBSA、0.05%のTween-20、0.25%のChaps、5mMのＥＤＴＡ、0.2%のBgG、0.35MのNaCl、15ppmのProclin)がそうであったMagic Buffer +において希釈されるサンプル及びLD1標準(chLD1、hLD1.vBまたはhLD1.v22)が付け加えた。
全抗体は、2つのウサギ抗-huIgG Fc(ジャクソン、cat# 309-006〜008)及びが2つのヤギ抗-huIgG FcがHRP(ジャクソン、cat# 109-036〜098)に接合したF(ab’)によって検出したF(ab’)でおおわれているミクロタイタープレート上の希釈されたサンプルを暖めることによってHuman Fc ＥＬＩＳＡを使用して決定された。1MのH3PO4が反応を止めるために加えられた及び、TMBペルオキシダーゼ基質溶液が発色現像(コケ、cat# TMBE-1000)のために用いられた。プレートは、450/620ナノメートルでマイクロプレート読者(Biotek EL311または等価物)に読み込まれた。
サイズ-除外HPLC−Size-除外HPLCは3000桁、Phenomenexa BioSep-SEC-Sを使用しているPBSにおいて実行された(7.8mm 300´、5mmの柱‖(トランス(ネコ)。00H-2146-KO)pH 7.0及びpH 4.0から始まっているサンプルによって。pH 7.0のサンプルは、PBSにおいて希釈された;pH 4.0のサンプルは、200mMのCitric Acid(pH 3.0)を有するpHを低下させることによって発生した。移動比は30分の間の0.5ml/分であった。そして、isocraticだった。アナログ／ディジタル変換器が25,000のunits/mVに課されたChemStationは、2秒、幅をピークまで上げる、4nMを切り開く(Agilent Technologies;35900Eネコ)。放射能は、raytestなラモーナ90と検出された(raytestな米国社;ウィルミントン(NC))標準のAgilent 1100 HPLCモジュール・システム(サンタクララ、CA)と同一線上に。
タンパク質-Gビード抽出及びSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動分離−X-100(1%(v/v)の終濃度)トリトンProtein-Gビードの加算が続くサイズ-除外HPLCから集められる分数まで加えた(GE Lifesciences Inc(ネコ)。17-0885-01).サンプルが穏やかな回転を有する4°Cで終夜暖められてそれからビードが1% PBS +を有する4回洗われた及び、トリトンX-100。サンプルの半分がNuPageR Sample Reducing Agen(ネコ。NP0004)tを使用して減少した及び、各々のサンプルは分割された。ビードは、NuPAGER ４倍速LDS Sample Buffer(pH 8.4)(ネコ。NP00007)±NuPAGER Sample Reducing代理人を有する既治療であって、5分の間の99°Cに孵化した;それから、NuPAGER 1x MOPS SDS Runningバッファ(ネコ。NP0001)を有するNuPAGER 4-12%のBis-トリス・ゲル類(ネコ。NP0321BOX)に適用される。ゲル類は、クーマシーBlue R250染料で染色された。全てのNuPAGER試薬は、インビトロゲン(株式会社)から得られた..
質量分析及びバイオ情報科学分析−SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動から削除されるサンプルズは、前述したように治療された。簡潔には、以下の急速なin-solutionマイクロ波によって援助されたトリプシン性消化ペプチドは、逆相クロマトグラフィによって切り離されて、2kVのスプレー電圧を有するナノ・スプレー・イオン化源に直接抜き取られて、LTQ XL-Orbitrapマススペクトロメータ(サーモ・ウオクイキテン)を使用して分析された。前駆体イオンは、60,000の解像度でFTMSにおいて分析された。MS/MSは、トップ10の最も大量のイオンが断片化のために従属したそれによってデータ従属するモードで作動される計測器を有するLTQにおいて実行された。データは、Mascot Search Algorithm(マトリックスSciences)を使用してまたはデノボ解釈によって検索された。
Mascotデータを検索するために：検索基準は、最高3つのミス裂開を有する可変変更態様として、Y及び20ppmの最大限のMS耐性、Lys上のGlyGlyを有する0.5のDaのMS/MS耐性、MethionineのOxidation、Cys上の+57のDaおよびSTのPhosphorylationを含んだ。データは、SwissprotデータベースのMammalianサブセットに対して検索された。
結果
LD1の特徴描写及び人間化。人間のキメラ抗体LD1(chLD1)は、人間のFGFR4を結合して、他のFGFリガンド及びFGF19によってシグナリングを遮断して、HUH7人間肝セルロース者癌(HCC)異種移植片モデルの腫瘍成長を抑制することを示した。trastuzumab(図10)において使用する人間のVHサブグループIII(huIII)可変ドメイン・フレームワーク及び私(huKI)は、LD1、可変照明およびchLD1の重い領域の人間化ぶりのステップとして、人間のカッパに合わせられた。chLD1からの高度変異部は、直接的なCDR-移植片(hLD1.vA)を生成するために、これらの人間の可変枠に移植された。chLD1と比較してとき、FGFR4を結合するための表面プラスモン共鳴によって、hLD1.vAの親和性は約5倍の(図示せず)によって減少した。結合及びを改良する手段がLCの3つの重要なマウス副尺位置の識別に至ったので、可変照明および重い領域のさまざまな副尺位置のマウス・シーケンスの置換は調査された：P44F、L46IおよびY49S。これらの変化は、chLD1(表3)と同等のFGFR4が好きだったhLD1.vBに取り入れられた。
表３．抗ＦＧＦＲ４抗体変異体の結合キネティクス。固定化抗体変異体へのヒトＦＧＦＲ４結合の会合及び解離を表面プラズモン共鳴を使用して測定した。
Figure 2014516511
驚くべきことに、類似したFGFR4結合能(図11A)にもかかわらず、hLD1.vBは、ｎｕ／ｎｕマウス(図11B)のHUH7人間HCC異種移植片モデルのchLD1と比較して、抗-腫瘍有効性を減弱させた。9日後に、PBSを有するマウス既治療のHUH7腫瘍は、ほぼ700のmm3の平均量に増大した。chLD1処置群において、平均HUH7腫瘍ボリュームはほぼ400のmm3であった。そして、PBS治療をうけている動物の腫瘍と比較して腫瘍成長の43%の抑制を表した。しかしながら、hLD1.vBを有するマウス既治療の平均腫瘍ボリュームはほぼ600のmm3であった。そして、PBS治療をうけている動物の腫瘍と比較して腫瘍成長の14%の抑制を表した。
胸腺欠損なNCRヌードマウスにおいて行われるhLD1.vB及びchLD1の薬物動態学的評価は1mg/kgの点滴(132のmL/day/kg及び140、それぞれ)でchLD1およびhLD1.vBのための急速クリアランスを現した。そして、目標がクリアランス機構を調停したことを示唆した。このクリアランス機構は、20mg/kgの高用量でchLD1のために飽和するように見えた。これで観察されたクリアランスの一回分を盛ること(11.7mL/day/kg;11C図)マウス(P.タイル個人連通及びref. 17)の典型的ヒト化抗体のために観察される目標から独立したクリアランスの範囲(6-12mL/day/kg)においてあった。しかしながら、hLD1.vBは、急速にクリアされ続けた(34.2のmL/day/kg;11C図)。これは、hLD1.vBのための付加的なクリアランス機構がマウス異種移植片モデルの効力の見かけの欠如の原因となることがありえることを示唆した。
PKの発見と整合して、125I-hLD1.vB及び125I-chLD1を使用している生体分布研究でかなり異なる配布側面図(図11D)が現れた。125I-hLD1.vBの限定量だけが2時間(~80対35%のID/g)だけ等価量で肝臓で見つかると共に、125I-chLD1は特に急速に及びを肝細胞上のFGFR4の高い表示による肝臓に配布した。対照的に、これらの抗体の観察された配布は、競争している相互作用が生体内で、全体の放射能の損失に至った抗体安定性の損失に対して肝臓にhLD1.vBの配布を予防したことを示唆している血液において逆転した。
C3干渉の識別。hLD1.vB及びchLD1の間で観察される生体内での違いを調停する努力において、我々は、それらの機能に影響を及ぼすかもしれない潜在的外れた目標プラズマまたは組織相互作用と同様に、プラズマの抗体安定性を評価した。37°Cの48時間のマウス、ネズミ、サルまたは人血しょうのhLD1.vBがFGFR4結合活性および完全な人間の免疫グロブリンG集中の評価によってあとに続いた又は、プラズマ安定性はchLD1を暖めることによって評価された。全体のchLD1またはhLD1.vB集中ＥＬＩＳＡが変えなかった(図示せず)免疫グロブリンGで測定されるにつれて、FGFR4 ＥＬＩＳＡによって検出されるhLD1.vBの回復がPBS/BSA(図12A)の制御潜伏と比較してネズミ・プラズマ及びマウスにおいてかなり還元してい(~30%によって)て。対照的に、試験されるいかなる状態ものchLD1 FGFR4結合活性の損失が、なかった。hLD1.vB回復の重要な減少は、特に齧歯目のプラズマから、損失が低下、しかし、よりたぶん齧歯目のプラズマの干渉する複合体の形成によらないことを示唆した。マウス・プラズマを有するhLD1.vBの相互作用がより高分子量複合体の生成に結果としてなるかもしれないので、hLD1.vB及びヨード化されたchLD1はまた、プラズマにおいて暖められて、サイズ-除外HPLCを使用して分析された。高分子量ピークは、125I-chLD1でなく125I-hLD1.vBを含んでいるマウス・プラズマ・サンプルだけにおいて、検出された。150kDaの予想される抗体ピークに加えて、およそ550kDaがそうであったおよそ270の及びに対応するピークがまず最初に検出され(図12B)て、しかしながら48h、150および270kDaのピークだけは、残った;550kDaのピークは、もはや観察されなかった。これらのより高分子量ピークは、人血しょうまたはPBS/BSAを含んでいるhLD1.vB及びカニクイザルにおいてまたはchLD1(図15)を含んでいるいかなるサンプルにもおいて検出されなかった。面白いことに、これらの高分子量ピークの存在は、直接FGFR4 ＥＬＩＳＡで得られた抗体回復データと相関した。更に、分析がpH 4.0(図15)で実行されるときに、これらのピークの存在は減弱した。そして、更にマウス血清を有するhLD1.vB従属する相互作用を支えた。
マウス・プラズマの免疫沈降は、chLD1(図12C)でなく、hLD1.vBを使用して、選択的に下げられた1ca. 37kDaのタンパク質を現した。サイズ-除外HPLCから所見と整合して、この37kDaのタンパク質バンドはカニクイザルでないおよび人血しょうサンプル(図16A-C)以外のネズミにおいて観察された。さらにまた、タンパク質は、hLD1.vB(図16D)によって薬をのむマウスから、プラズマにおいて検出された。37kDaのマウス血漿タンパクに由来するトリプシン性ペプチドのMS/MS分析は、このバンドをマウス補足C3(図12D)に由来すると確認した。C3の直接の参加は、C3ノックアウト(ko)マウス(図17)からプラズマにおいて暖められるhLD1.vBの完全な回復で支えられた。
結合しているC3のRe-評価及び親和性成熟。chLD1およびhLD1.vBは、補完的な決定地方(CDRs)及び同じ人間の恒常部を共有して、このようにそれらの可変ドメイン・フレームワークだけによって異なる。更に、hLD1.vBを人間らしくするために使用する光およびＨ鎖可変ドメイン・フレームワークは、相同の非常に高い程度をマウス血清タンパクを有する相互作用を呈することが報告されなかったtrastuzumabを含んでいるいくつかのヒト化抗体と共有する。このように、マウスC3を有するhLD1.vBの外れた目標相互作用は、たぶん人間の可変ドメイン・フレームワークを有するマウスLD1 CDRsの特定の組合せから生じた。
我々は、hLD1.vB(バクテリオファージに表示されるＦａｂフラグメントの親和性成熟から生じた)のCDRシーケンスのいくつかの変化が結合しているマウスC3の付随する損失を有するFGFR4のための改良された親和性につながることができると結論した。免疫グロブリンG及びがSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析に連結する免疫沈降分析を使用しているマウスC3を有する潜在的相互作用に関しては同様にFGFR4結合能を検査したので、バクテリオファージ選択された異型は表された。hLD1.vB(H52L、S53VおよびD60E、図10)と比較したCDR-H2の3つのアミノ酸変化によって、1つの異型(hLD1.v22)は、FGFR4(表3)のための改良された結合能および締め具の損失がC3(図13B)を補足することを示した。
マウス補足C3が生体内にhLD1.v22及びhLD1.vBのクリアランスを変えた程度は、20mg/kgでC3 koマウスをC3 wtマウスと比較している薬物動態学的研究において評価された。NCRマウスにおいて以前に観察されるにつれて、hLD1.vBはC3 wtマウス(29のmL/day/kg)の循環から急速にクリアされた;しかしながら、chLD1およびhLD1.vBは、C3 koマウス(表4及び図14A)の相似薬物動態学的輪郭(8.7の9.3のmL/day/kgのクリアランス、それぞれ)を有した。
表４．２０ｍｇ／ｋｇＩＶで投与される抗ＦＧＦ．Ｒ４変異体の薬物動態パラメーター
Figure 2014516511
これらのデータは、組織配布データと整合していて、生体内マウス補足C3を有する特定の相互作用がhLD1.vBの急速クリアランスに至ることを確認する。hLD1.v22がC3と結合しない及びhLD1.vBのクリアランスがC3 koマウスにおいて大幅に改善されているので、我々はhLD1.v22がNCRヌードマウスのchLD1に類似した薬物動態学的側面を有することを予期した。図14B(我々の前の所見と整合した間hLD1.v22がNCRヌードマウス(11.8の11.3のmL/day/kgそれぞれ)において同様の及びchLD1のクリアランス)に示すように、hLD1.vBは、急速にクリアされる(46.7のmL/day/kg)。
HUH7 HCC異種移植片モデルの腫瘍成長を阻害するhLD1.v22の能力は、hLD1.vB及びchLD1と比較して評価された。21日後に、PBSを有するマウス既治療のHUH7腫瘍は、ほぼ2,100のmm3(図14C)の平均量に増大した。PBS-処置群の15匹の動物の中で、3は、腫瘍ボリューム限度(ほぼ2,500のmm3)による研究の端の前に安楽死した。hLD1.vB処置群において、平均HUH7腫瘍ボリュームはほぼ1,200のmm3であった。そして、PBS治療をうけている動物の腫瘍と比較して腫瘍成長の43%の抑制を表した。しかしながら、hLD1.v22を有するマウス既治療の平均腫瘍ボリュームは、ほぼ530のmm3であった。この結果は、平均HUH7腫瘍ボリュームがほぼ350のmm3であったchLD1既治療マウスと同等だった。hLD1.v22およびchLD1処置群のために、これは、腫瘍サイズの83%の減少及び、それぞれ、75%がPBS車両治療群と比較されることを表す。グループのダブリングタイムがhLD1.vB(12.2日)、hLD1.v22(15.8日)またはchLD1(17.1日)で扱った腫瘍は、かなりPBS-処置群(8.2日)のそれより大きい。加えて、hLD1.v22またはchLD1-処置群の腫瘍ダブリングタイムは、hLD1.vB処置群のためのそれよりかなり長かった。hLD1.v22およびchLD1の類似した生体内でのパフォーマンスは、hLD1.vBに匹敵して、マウス補足C3を有する特定の外れた目標相互作用によって下部の露出に結果としてなっているさらなる一掃が生じていたことを強く意味して、hLD1.vBの有効性を減らした。
このように、抗-FGFR4抗体hLD1.v22の生成は、次の工程を有した：1)人間のIgG1不変領域及びLD1のVH領域及び、ネズミのVLを含んでいる人間のキメラLD1(chLD1)の生成;2)chLD1から、直接のHCR移植片をつくって、人間のVHサブグループIII可変ドメイン及び私が接ぎ木をする人間のVLカッパへの6つのネズミのHVRsの移植片が、抗体hLD1.vA.を生成する抗体hLD1.vAは、ChLD1未満の5倍について、FGFR4を結合した;3)、Ｌ鎖突然変異P44F、L46IおよびY49Sの導入は、抗体hLD1.vBに結果としてなった。抗体hLD1.vBは抗体chLD1がそうしたより弱く人間のFGFR4を約2倍で縛った、しかし、hLD1.vBが生体内で腫瘍有効性(chLD1と比較して生体内急速クリアランス)を減らして、マウス補体タンパク質C3を結合するとわかった;4)、親和性成熟は実行された、そして、FGFR4に結合能を改良されるHVR H2(H52L、S53V、D60E)に対する3つの変化の加算はマウス補足c3タンパク質に締め具を除去した。結果として生じるヒト化および親和性成熟された抗体(抗体hLD1.v22)は、chLD1に相当する生体内での有効性、pKおよび組織配布を有した。さらにまた、人間の異種移植片腫瘍研究の癌を阻害する際の実施例のために、抗体hLD1.v22は、親のようなchLD1抗体として少なくとも相当する生物学的活性度を有するために決定された。
部分的参照リスト
1. James LC, Roversi P, Tawfik DS. Antibody multispecificity mediated by conformational diversity. Science 2003; 299:1362-7.
2. Krishnan L, Sahni G, Kaur KJ, Salunke DM. Role of antibody paratope conformational flexibility in the manifestation of molecular mimicry. Biophys J 2008; 94:1367-76.
3. Notkins AL. Polyreactivity of antibody molecules. Trends Immunol 2004; 25:174-9.
4. Thorpe IF, Brooks CL, 3rd. Molecular evolution of affinity and flexibility in the immune system. Proc Natl Acad Sci U S A 2007; 104:8821-6.
5. Yin J, Beuscher AEt, Andryski SE, Stevens RC, Schultz PG. Structural plasticity and the evolution of antibody affinity and specificity. J Mol Biol 2003; 330:651-6.
6. Thielges MC, Zimmermann J, Yu W, Oda M, Romesberg FE. Exploring the energy landscape of antibody-antigen complexes: protein dynamics, flexibility, and molecular recognition. Biochemistry 2008; 47:7237-47.
7. Feyen O, Lueking A, Kowald A, Stephan C, Meyer HE, Gobel U, et al. Off-target activity of TNF-α inhibitors characterized by protein biochips. Analytical and Bioanalytical Chemistry 2008; 391:1713-20.
8. Kijanka G, Ipcho S, Baars S, Chen H, Hadley K, Beveridge A, et al. Rapid characterization of binding specificity and cross-reactivity of antibodies using recombinant human protein arrays. J Immunol Methods 2009; 340:132-7.
9. Lueking A, Beator J, Patz E, Mullner S, Mehes G, Amersdorfer P. Determination and validation of off-target activities of anti-CD44 variant 6 antibodies using protein biochips and tissue microarrays. Biotechniques 2008; 45:Pi-v.
10. Wu H, Pfarr DS, Johnson S, Brewah YA, Woods RM, Patel NK, et al. Development of motavizumab, an ultra-potent antibody for the prevention of respiratory syncytial virus infection in the upper and lower respiratory tract. J Mol Biol 2007; 368:652-65.
11. Rosenwald S, Kafri R, Lancet D. Test of a statistical model for molecular recognition in biological repertoires. J Theor Biol 2002; 216:327-36.
12. James LC, Tawfik DS. The specificity of cross-reactivity: promiscuous antibody binding involves specific hydrogen bonds rather than nonspecific hydrophobic stickiness. Protein Sci 2003; 12:2183-93.
13. Kramer A, Keitel T, Winkler K, Stocklein W, Hohne W, Schneider-Mergener J. Molecular basis for the binding promiscuity of an anti-p24 (HIV-1) monoclonal antibody. Cell 1997; 91:799-809.
14. French DM, Lin BC, Wang M, Hotzel K, Bolon B, Ferrando R, et al. Targeting FGFR4 Inhibits Hepatocellular Carcinoma in Preclinical Animal Models. J Clin Invest 2011; Submitted.
15. Dennis MS. Humanization by CDR Repair In: Shire S, Gombotz W, Bechtold-Peters K, Andya J, eds. Pharmaceutical Aspects of Monoclonal Antibodies. New York: Co-published by the Association for Pharmaceutical Scientists & Springer, 2010:9-28.
16. MacCallum RM, Martin ACR, Thornton JT. Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography. Journal of Molecular Biology 1996; 262:732-45.
17. Adams CW, Allison DE, Flagella K, Presta L, Clarke J, Dybdal N, et al. Humanization of a recombinant monoclonal antibody to produce a therapeutic HER dimerization inhibitor, pertuzumab. Cancer Immunol Immunother 2006; 55:717-27.
18. Kim SJ, Park Y, Hong HJ. Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies. Mol Cells 2005; 20:17-29.
19. Lutz HU, Jelezarova E. Complement amplification revisited. Mol Immunol 2006; 43:2-12.
20. Sahu A, Lambris JD. Structure and biology of complement protein C3, a connecting link between innate and acquired immunity. Immunological Reviews 2001; 180:35-48.
21. Manderson AP, Pickering MC, Botto M, Walport MJ, Parish CR. Continual low-level activation of the classical complement pathway. Journal of Experimental Medince 2001; 194:747-56.
22. Thurman JM, Holers VM. The central role of the alternative complement pathway in human disease. The Journal of Immunology 2006; 176:1305-10.
23. Sahu A, Pangburn MK. Covalent attachment of human complement C3 to IgG. The Journal of Biological Chemistry 1994; 269:28997-9002.
24. Vidarte L, Pastor C, Mas S, Blazquez AB, de los Rios V, Guerrero R, et al. Serine 132 is the C3 covalent attachment point on the CH1 domain of human IgG1. J Biol Chem 2001; 276:38217-23.
25. Osmers I, Szalai AJ, Tenner AJ, Barnum SR. Complement in BuB/BnJ mice revisited: serum C3 levels and complement opsonic activity are not elevated. Mol Immunol 2006; 43:1722-5.
26. Otte L, Knaute T, Schneider-Mergener J, Kramer A. Molecular basis for the binding polyspecificity of an anti-cholera toxin peptide 3 monoclonal antibody. J Mol Recognit 2006; 19:49-59.
27. Arenkov P, Kukhtin A, Gemmell A, Voloshchuck S, Chupeeva V, Mirzabekov A. Protein microchips: use for immunoassay and enzymatic reactions. Analytical Biochemistry 2000; 278:123-31.
28. Ge H. UPA, a universal protein array system for quantitative detected protein-protein, protein-DNA, protein-RNA, and protein-ligand interactions. Nucleic Acids Research 2000; 28:i-vii.
29. Fodor SP, Read JL, Pirrung MC, Stryer L, Lu AT, Solas D. Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis. Science 1991; 251:767-73.
30. Forster R, Valin M, Lemarchand T, Palate B, Fifre A. Validation of tissue cross reactivity (TCR) studies: Tissue cross reactivity of anti-human CD209 in cynomolgus tissues. Toxicology Letters 2009; 189:S100-S.
31. Kallioniemi O-P, Wagner U, Kononen J, Sauter G. Tissue microarray technology for high-throughput molecular profiling of cancer. Human Molecular Genetics 2001; 10:657-62.
32. Lynch C, Grewel I. Preclinical safety evaluation of monoclonal antibodies. In: Chernajovsky Y, Nissim A, eds. Therapeutic Antibodies: Handbook of Experimental Pharmacology. Berlin: Springer-Verlag, 2008:19-44.
33. Dennis MS. CDR Repair: A novel approach to antibody humaization. In: Shire SJ, Gombotz W, Bechtold-Peters K, Adndya J, eds. Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing. New York: Springer, 2010:9-28.
34. Gallop MA, Barrett RW, Dower WJ, Fodor SPA, Gordon EM. Applications of combinatorial technologies to drug discovery. 1. Background and peptide combinatorial libraries. J Med Chem 1994; 37:1233-51.
35. Lee CV, Liang W-C, Dennis MS, Eigenbrot C, Sidhu SS, Fuh G. High-affinity human antibodies from phage-displayed synthetic Fab libraries with a single framework scaffold. J Mol Bio 2004; 340:1073-93.
36. Circolo A, Garnier G, Fukuda W, Wang X, Hidvegi T, Szalai AJ, et al. Genetic disruption of the murine complement C3 promoter region generates deficient mice with extrahepatic expression of C3 mRNA. Immunopharmacology 1999; 42:135-49.
37. Chizzonite R, Truitt T, Podlaski FJ, Wolitzky AG, Quinn PM, Nunes P, et al. IL-12:Monocloncal antibodies specific for the 40-kDa subunit block receptor binding and biological activity on activated human lymphoblasts. The Journal of Immunology 1991; 147:1548-56.
38. Jin Z, Li Y, Pitti R, Lawrence D, Pham VC, Lill JR, et al. Cullin3-based polyubiquitination and p62-dependent aggregation of caspase-8 mediate extrinsic apoptosis signaling. Cell 2009; 137:721-35.
前述の本発明が理解の明快さのために図と例とをあげて若干の詳細に記載されていたにもかかわらず、実施例及び説明は本発明の範囲を制限するものとして解釈されてはならない。本願明細書において引用される科学文献及び全ての特許の開示は、参照によってそれらの全部にはっきりと取り入れられる。

Claims (41)

  1. 抗ＦＧＦＲ４抗体が≦１ｎＭの親和性でヒトＦＧＦＲ４に結合する、ＦＧＦＲ４に結合する単離された抗体。
  2. 抗ＦＧＦＲ４抗体が≦１ｎＭの親和性でヒト、マウス及びカニクイザルＦＧＦＲ４に結合する請求項１に記載の単離された抗体。
  3. 抗ＦＧＦＲ４抗体が≦０．０５ｎＭの親和性でヒトＦＧＦＲ４に結合する請求項２に記載の単離された抗体。
  4. 抗ＦＧＦＲ４抗体が図１２Ｄに示すアミノ酸配列を有するマウスＣ３タンパク質に実質的に結合しない請求項１−３の何れか一項に記載の単離された抗体。
  5. 抗ＦＧＦＲ４抗体がＧ１６５Ａ変異を含んでなるヒトＦＧＦＲ４に実質的に結合しない請求項１−４の何れか一項に記載の単離された抗体。
  6. 抗ＦＧＦＲ４抗体がアミノ酸番号１５０〜１７０の成熟ヒトＦＧＦＲ４アミノ酸配列を含んでなるか、から基本的に成るか又はから成る配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％の配列同一性又は類似性を有するポリペプチドに結合する請求項１−５の何れか一項に記載の単離された抗体。
  7. 抗ＦＧＦＲ４抗体がアミノ酸番号１５０〜１７０の成熟ヒトＦＧＦＲ４アミノ酸配列を含んでなるか、から基本的になるか又はからなるポリペプチドに結合する請求項６に記載の単離された抗体。
  8. 抗ＦＧＦＲ４がＦＧＦＲ４活性のアンタゴニストである請求項１−７の何れか一項に記載の抗体。
  9. ＦＧＦＲ４活性がＦＧＦ誘導細胞増殖、ＦＧＦＲ４へのＦＧＦ結合、ＦＧＦ１９に曝露された細胞におけるＣＹＰ７α７発現のＧＦ１９−媒介阻害、又はＦＧＦ１９−誘導コロニー形成である請求項８に記載の抗体。
  10. ＦＧＦＲ４に対するＦＧＦ１及び／又はＦＧＦ１９結合が阻害される請求項９に記載の抗体。
  11. ＦＧＦＲ４に対するＦＧＦ１結合の阻害のＩＣ５０が約０．１０ｎＭであり、ＦＧＦＲ４に対するＦＧＦ１９結合の阻害のＩＣ５０が約０．１０ｎＭである請求項１０に記載の抗体。
  12. モノクローナル抗体である請求項１−１１の何れか一項に記載の抗体。
  13. ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である請求項１−１１の何れか一項に記載の抗体。
  14. ＦＧＦＲ４に結合する抗体断片である請求項１−１１の何れか一項に記載の抗体。
  15. 抗体が(ａ)配列番号：３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ３、(ｂ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ３、及び(ｃ)配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ２を含む請求項１−１４の何れか一項に記載の抗体。
  16. 抗体が(ａ)配列番号：１のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ１(ｂ)配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ２、及び(ｃ)配列番号：３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ３を含む請求項１−１４の何れか一項に記載の抗体。
  17. (ａ)配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ１；(ｂ)配列番号：５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ３をさらに含んでなる請求項１６に記載の抗体。
  18. (ａ)配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ１；(ｂ)配列番号：５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ３を含んでなる請求項１−１４の何れか一項に記載の抗体。
  19. 配列番号：９、１０、１１及び／又は１２の軽鎖可変ドメインフレームワーク配列を更に含んでなる請求項１−１８の何れか一項に記載の抗体。
  20. 配列番号：１３、１４、１５及び／又は１６の重鎖可変ドメインフレームワーク配列を更に含んでなる請求項１−１９の何れか一項に記載の抗体。
  21. (ａ)配列番号：７のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；(ｂ)配列番号：８のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は(ｃ)(ａ)のＶＨ配列及び(ｂ)のＶＬ配列を含んでなる請求項１−２０の何れか一項に記載の抗体。
  22. 配列番号：７のＶＨ配列を含んでなる請求項２１に記載の抗体。
  23. 配列番号：８のＶＶＬ配列を含んでなる請求項２１に記載の抗体。
  24. 配列番号：７のＶＨ配列及び配列番号：８のＶＬ配列を含んでなる抗体。
  25. 完全長ＩｇＧ１抗体である請求項１−２４の何れか一項に記載の抗体。
  26. 請求項１−２４の何れか一項に記載の抗体をコードする単離された核酸。
  27. 請求項２６に記載の核酸を含んでなる宿主細胞。
  28. 抗体が生産されるように請求項２７に記載の宿主細胞を培養することを含んでなる抗体の生産方法。
  29. 宿主細胞から抗体を回収することを更に含んでなる請求項２８に記載の方法。
  30. 請求項１−２４の何れか一項に記載の抗体及び細胞傷害性剤を含んでなるイムノコンジュゲート。
  31. 請求項１−２４の何れか一項に記載の抗体及び薬学的に許容可能な担体を含んでなる薬学的製剤。
  32. 更なる治療剤をさらに含んでなる請求項１６に記載の薬学的製剤。
  33. 医薬としての使用のための請求項１−２４の何れか一項に記載の抗体。
  34. 癌の治療における使用のための請求項１−２４の何れか一項に記載の抗体。
  35. 細胞増殖の阻害における使用のための請求項１−２４の何れか一項に記載の抗体。
  36. 医薬の製造における請求項１−２４の何れか一項に記載の抗体の使用。
  37. 医薬が癌の治療のためである請求項３６に記載の使用。
  38. 医薬が細胞増殖の阻害のためである請求項３６に記載の使用。
  39. 癌を有する個体を治療する方法において、個体に有効量の請求項１−２４の何れか一項に記載の抗体を投与することを含んでなる方法。
  40. 個体に更なる治療剤を投与することを更に含んでなる請求項３９に記載の方法。
  41. 個体における細胞増殖を阻害する方法において、細胞増殖を阻害するために個体に有効量の請求項１−２４の何れか一項に記載の抗体を投与することを含んでなる方法。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017526671A (ja) * 2014-08-11 2017-09-14 ダイイチサンキョウヨーロッパ ゲーエムベーハー ヒト抗−ｆｇｆｒ４抗体
JP2019536062A (ja) * 2016-11-04 2019-12-12 セントロ デ インベスティガシオン ビオメディカ エン レッド 敗血症又は敗血症性ショック（ｓｓ）患者に由来する血漿中の循環ヒストンｈ３及びｈ２ｂを検出する質量分析ベースの方法
KR20200040772A (ko) * 2017-08-16 2020-04-20 엑시리스 에스.알.엘. 모노클로날 항체 항-fgfr4

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8754114B2 (en) 2010-12-22 2014-06-17 Incyte Corporation Substituted imidazopyridazines and benzimidazoles as inhibitors of FGFR3
EP3822273B1 (en) 2012-06-13 2024-04-10 Incyte Holdings Corporation Substituted tricyclic compounds as fgfr inhibitors
WO2014026125A1 (en) 2012-08-10 2014-02-13 Incyte Corporation Pyrazine derivatives as fgfr inhibitors
US9266892B2 (en) 2012-12-19 2016-02-23 Incyte Holdings Corporation Fused pyrazoles as FGFR inhibitors
WO2014165287A1 (en) * 2013-03-12 2014-10-09 The Translational Genomics Research Institute Hybridoma clones and monoclonal antibodies to fibroblast growth factor 4
CN105307657B (zh) * 2013-03-15 2020-07-10 西建卡尔有限责任公司 杂芳基化合物和其用途
TWI647220B (zh) 2013-03-15 2019-01-11 美商西建卡爾有限責任公司 雜芳基化合物及其用途
UA120248C2 (uk) 2013-03-15 2019-11-11 Селджен Кар Ллс Гетероарильні сполуки та їх застосування
SG10201708520YA (en) 2013-04-19 2017-12-28 Incyte Corp Bicyclic heterocycles as fgfr inhibitors
BR112016008276B1 (pt) 2013-10-25 2021-03-02 Novartis Ag derivados bicíclicos de piridila fundidos ao anel, seus usos e seu intermediário, e composição farmacêutica
CN103558372B (zh) * 2013-11-08 2017-02-15 博弈诺生物科技（无锡）有限公司 一种elisa用的抗原标准品和样本稀释液的制备方法
EP3134115A4 (en) 2014-04-25 2017-10-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for treating metastatic breast cancer and other cancers in the brain
SG11201609207SA (en) 2014-05-13 2016-12-29 Univ Pennsylvania Compositions comprising aav expressing dual antibody constructs and uses thereof
US20170348234A1 (en) * 2014-07-24 2017-12-07 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Method and composition for targeted delivery of therapeutic agents
US20180185341A1 (en) 2014-10-03 2018-07-05 Novartis Ag Use of ring-fused bicyclic pyridyl derivatives as fgfr4 inhibitors
US10851105B2 (en) 2014-10-22 2020-12-01 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as FGFR4 inhibitors
MX2017010673A (es) 2015-02-20 2018-03-21 Incyte Corp Heterociclos biciclicos como inhibidores de receptores del factor de crecimiento fibroblastico (fgfr).
WO2016134294A1 (en) 2015-02-20 2016-08-25 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as fgfr4 inhibitors
MA41551A (fr) 2015-02-20 2017-12-26 Incyte Corp Hétérocycles bicycliques utilisés en tant qu'inhibiteurs de fgfr4
AU2016238436A1 (en) 2015-03-25 2017-08-17 Novartis Ag Formylated N-heterocyclic derivatives as FGFR4 inhibitors
EP3095465A1 (en) 2015-05-19 2016-11-23 U3 Pharma GmbH Combination of fgfr4-inhibitor and bile acid sequestrant
MA43416A (fr) 2015-12-11 2018-10-17 Regeneron Pharma Méthodes pour ralentir ou empêcher la croissance de tumeurs résistantes au blocage de l'egfr et/ou d'erbb3
WO2017189983A1 (en) * 2016-04-29 2017-11-02 Pfizer Inc. Interferon beta antibodies and uses thereof
WO2018055503A1 (en) 2016-09-20 2018-03-29 Novartis Ag Combination comprising a pd-1 antagonist and an fgfr4 inhibitor
MA46712A (fr) 2016-11-02 2019-09-11 Novartis Ag Combinaisons d'inhibiteurs de fgfr4 et de chélateurs de l'acide biliaire
AR111960A1 (es) 2017-05-26 2019-09-04 Incyte Corp Formas cristalinas de un inhibidor de fgfr y procesos para su preparación
CN112566912A (zh) 2018-05-04 2021-03-26 因赛特公司 Fgfr抑制剂的盐
CN112867716A (zh) 2018-05-04 2021-05-28 因赛特公司 Fgfr抑制剂的固体形式和其制备方法
AU2019312692A1 (en) 2018-08-02 2021-03-11 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
WO2020185532A1 (en) 2019-03-08 2020-09-17 Incyte Corporation Methods of treating cancer with an fgfr inhibitor
WO2021007269A1 (en) 2019-07-09 2021-01-14 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as fgfr inhibitors
AU2020366006A1 (en) 2019-10-14 2022-04-21 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as FGFR inhibitors
US11566028B2 (en) 2019-10-16 2023-01-31 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as FGFR inhibitors
CN112812182B (zh) * 2019-11-15 2023-01-06 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向fgfr4的单链抗体、嵌合抗原受体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
EP4069696A1 (en) 2019-12-04 2022-10-12 Incyte Corporation Tricyclic heterocycles as fgfr inhibitors
KR20220131900A (ko) 2019-12-04 2022-09-29 인사이트 코포레이션 Fgfr 억제제의 유도체
CN111471109B (zh) * 2020-04-08 2021-07-23 中国科学院深圳先进技术研究院 一种抗成纤维细胞生长因子受体4单克隆抗体及其制备方法和用途
WO2022221193A1 (en) 2021-04-12 2022-10-20 Affinia Therapeutics Inc. Recombinant aav for treatment of neural disease
WO2023113806A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Affinia Therapeutics, Inc. Recombinant aav for treatment of neural disease
IL308404A (en) 2021-04-27 2024-01-01 Generation Bio Co Non-viral DNA vectors expressing therapeutic antibodies and uses thereof
US11939331B2 (en) 2021-06-09 2024-03-26 Incyte Corporation Tricyclic heterocycles as FGFR inhibitors
CN117980006A (zh) * 2021-07-09 2024-05-03 达因疗法公司 用于治疗肌养蛋白病的肌肉靶向复合物和制剂
US11771776B2 (en) 2021-07-09 2023-10-03 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
WO2023177655A1 (en) 2022-03-14 2023-09-21 Generation Bio Co. Heterologous prime boost vaccine compositions and methods of use
US11931421B2 (en) 2022-04-15 2024-03-19 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and formulations for treating myotonic dystrophy
TW202402797A (zh) 2022-05-19 2024-01-16 美商泰拉生物科學公司 使用ppar促效劑及fgfr4抑制劑之療法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005066211A2 (en) * 2003-12-19 2005-07-21 Five Prime Therapeutics, Inc. Fibroblast growth factor receptors 1, 2, 3, and 4 as targets for therapeutic intervention
JP2005530687A (ja) * 2002-01-31 2005-10-13 マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ Ｆｇｆｒアゴニスト
JP2008501302A (ja) * 2003-10-16 2008-01-24 イムクローン システムズ インコーポレイティド 繊維芽細胞増殖因子レセプター−１阻害物質及びその治療方法
WO2010004204A2 (fr) * 2008-07-08 2010-01-14 Sanofi-Aventis Antagonistes specifiques du recepteur fgf-r4
WO2010026291A1 (en) * 2008-09-03 2010-03-11 Licentia Ltd. Materials and methods for inhibiting cancer cell invasion related to fgfr4
JP2010508369A (ja) * 2006-11-03 2010-03-18 マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ Ｆｇｆｒ４は化学療法薬剤に対する応答において癌細胞の抵抗性を促進する
JP2010508037A (ja) * 2006-11-03 2010-03-18 ユースリー ファーマ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｆｇｆｒ４抗体

Family Cites Families (94)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2 Inc Geänderte antikörper.
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
DE69334255D1 (de) 1992-02-06 2009-02-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Marker für Krebs und biosynthetisches Bindeprotein dafür
EP1005870B1 (en) 1992-11-13 2009-01-21 Biogen Idec Inc. Therapeutic application of chimeric antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
PT994903E (pt) 1997-06-24 2005-10-31 Genentech Inc Metodos e composicoes para glicoproteinas galactosiladas
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US6602677B1 (en) 1997-09-19 2003-08-05 Promega Corporation Thermostable luciferases and methods of production
AU759779B2 (en) 1997-10-31 2003-05-01 Genentech Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
BR9813365A (pt) 1997-12-05 2004-06-15 Scripps Research Inst Método para produção e humanização de um anticorpo monoclonal de rato
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
JP2002510481A (ja) 1998-04-02 2002-04-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗体変異体及びその断片
ATE458007T1 (de) 1998-04-20 2010-03-15 Glycart Biotechnology Ag Glykosylierungs-engineering von antikörpern zur verbesserung der antikörperabhängigen zellvermittelten zytotoxizität
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
PL209786B1 (pl) 1999-01-15 2011-10-31 Genentech Inc Przeciwciało zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgG1, przeciwciało wiążące czynnik wzrostu śródbłonka naczyń oraz immunoadhezyna
EP2264166B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
WO2001025454A2 (en) 1999-10-04 2001-04-12 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes in the presence of nitrogen
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
US7504256B1 (en) 1999-10-19 2009-03-17 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing polypeptide
US20030180714A1 (en) 1999-12-15 2003-09-25 Genentech, Inc. Shotgun scanning
PT1242438E (pt) 1999-12-29 2007-02-28 Immunogen Inc Agentes citotóxicos compreendendo dixorrubicinas e daunorrubicinas modificadas e seu uso terapêutico
HUP0300369A2 (hu) 2000-04-11 2003-06-28 Genentech, Inc. Többértékű antitestek és alkalmazásuk
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
DK2314686T4 (da) 2000-10-06 2023-08-21 Kyowa Kirin Co Ltd Celler, der danner antistofsammensætninger
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
KR100857943B1 (ko) 2000-11-30 2008-09-09 메다렉스, 인코포레이티드 인간 항체의 제조를 위한 형질전환 트랜스염색체 설치류
WO2003011878A2 (en) 2001-08-03 2003-02-13 Glycart Biotechnology Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
WO2003035835A2 (en) 2001-10-25 2003-05-01 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
EP1502603A4 (en) 2002-04-09 2006-12-13 Kyowa Hakko Kogyo Kk AN ANTIBODY COMPOSITION CONTAINING MEDICAMENT FOR PATIENTS WITH Fc gamma RIIIa POLYMORPHISM
US20040132140A1 (en) 2002-04-09 2004-07-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
US20040110704A1 (en) 2002-04-09 2004-06-10 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells of which genome is modified
CA2481656A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells in which activity of the protein involved in transportation of gdp-fucose is reduced or lost
US7691568B2 (en) 2002-04-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Antibody composition-containing medicament
AU2003236018A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcGamma RECEPTOR IIIa
WO2003102157A2 (en) 2002-06-03 2003-12-11 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
CN103833854B (zh) 2002-12-16 2017-12-12 健泰科生物技术公司 免疫球蛋白变体及其用途
WO2004065416A2 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
CA2542046A1 (en) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Fused protein composition
CA2542125A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of .alpha.1,6-fucosyltransferase
SI2380911T1 (en) 2003-11-05 2018-07-31 Roche Glycart Ag ANTIGEN-RELATED PATIENTS WITH INCREASED ATTENTION ON THE RECEPTOR FC AND EFFECTORAL FUNCTION
SG195524A1 (en) 2003-11-06 2013-12-30 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
ES2527292T3 (es) 2004-03-31 2015-01-22 Genentech, Inc. Anticuerpos anti-TGF-beta humanizados
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
CA2885854C (en) 2004-04-13 2017-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
SI1791565T1 (sl) 2004-09-23 2016-08-31 Genentech, Inc. Cisteinsko konstruirana protitelesa in konjugati
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
WO2007056441A2 (en) 2005-11-07 2007-05-18 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
WO2007064919A2 (en) 2005-12-02 2007-06-07 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
CA2651567A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
MX350962B (es) 2008-01-07 2017-09-27 Amgen Inc Metodo para fabricar moleculas heterodimericas de fragmentos cristalizables de anticuerpo, utilizando efectos electrostaticos de direccion.

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005530687A (ja) * 2002-01-31 2005-10-13 マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ Ｆｇｆｒアゴニスト
JP2008501302A (ja) * 2003-10-16 2008-01-24 イムクローン システムズ インコーポレイティド 繊維芽細胞増殖因子レセプター−１阻害物質及びその治療方法
WO2005066211A2 (en) * 2003-12-19 2005-07-21 Five Prime Therapeutics, Inc. Fibroblast growth factor receptors 1, 2, 3, and 4 as targets for therapeutic intervention
JP2010508369A (ja) * 2006-11-03 2010-03-18 マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ Ｆｇｆｒ４は化学療法薬剤に対する応答において癌細胞の抵抗性を促進する
JP2010508037A (ja) * 2006-11-03 2010-03-18 ユースリー ファーマ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｆｇｆｒ４抗体
WO2010004204A2 (fr) * 2008-07-08 2010-01-14 Sanofi-Aventis Antagonistes specifiques du recepteur fgf-r4
WO2010026291A1 (en) * 2008-09-03 2010-03-11 Licentia Ltd. Materials and methods for inhibiting cancer cell invasion related to fgfr4

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HYBRIDOMA, vol. 24, no. 3, JPN5014005755, 2005, US, pages 152 - 9 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017526671A (ja) * 2014-08-11 2017-09-14 ダイイチサンキョウヨーロッパ ゲーエムベーハー ヒト抗−ｆｇｆｒ４抗体
JP2020183418A (ja) * 2014-08-11 2020-11-12 ダイイチサンキョウヨーロッパ ゲーエムベーハー ヒト抗−ｆｇｆｒ４抗体
JP7011939B2 (ja) 2014-08-11 2022-01-27 ダイイチサンキョウヨーロッパ ゲーエムベーハー ヒト抗－ｆｇｆｒ４抗体
JP2019536062A (ja) * 2016-11-04 2019-12-12 セントロ デ インベスティガシオン ビオメディカ エン レッド 敗血症又は敗血症性ショック（ｓｓ）患者に由来する血漿中の循環ヒストンｈ３及びｈ２ｂを検出する質量分析ベースの方法
JP7173495B2 (ja) 2016-11-04 2022-11-16 セントロ デ インベスティガシオン ビオメディカ エン レッド 敗血症又は敗血症性ショック（ｓｓ）患者に由来する血漿中の循環ヒストンｈ３及びｈ２ｂを検出する質量分析ベースの方法
US11740245B2 (en) 2016-11-04 2023-08-29 Centro De Investigación Biomédica En Red (Ciber-Isciii) Mass spectrometry-based methods for the detection of circulating histones H3 and H2B in plasma from sepsis or septic shock (SS) patients
KR20200040772A (ko) * 2017-08-16 2020-04-20 엑시리스 에스.알.엘. 모노클로날 항체 항-fgfr4
JP2020537490A (ja) * 2017-08-16 2020-12-24 エクシリス・ソチエタ・ア・レスポンサビリタ・リミタータＥｘｉｒｉｓ Ｓ．Ｒ．Ｌ． モノクローナル抗体抗ｆｇｆｒ４
JP7235723B2 (ja) 2017-08-16 2023-03-08 エクシリス・ソチエタ・ア・レスポンサビリタ・リミタータ モノクローナル抗体抗ｆｇｆｒ４
KR102644658B1 (ko) 2017-08-16 2024-03-08 엑시리스 에스.알.엘. 모노클로날 항체 항-fgfr4

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