PL209786B1 - Przeciwciało zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgG1, przeciwciało wiążące czynnik wzrostu śródbłonka naczyń oraz immunoadhezyna - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgG1 niebędący natywną sekwencją regionu Fc, przeciwciało wiążące czynnik wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF) zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgG1 niebędący natywną sekwencją regionu Fc oraz immunoadhezyna zawierająca wariant regionu Fc ludzkiej IgG1 niebędący natywną sekwencją regionu Fc.

Dziedzina wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy polipeptydów zawierających wariant regionu Fc. W szczególności niniejszy wynalazek dotyczy polipeptydów zawierających region Fc o zmienionej funkcji efektorowej, wynikającej z modyfikacji jednej lub więcej reszt aminokwasowych w obrębie regionu Fc tych polipeptydów.

Opis stanu techniki

Przeciwciała są białkami wykazującymi swoiste powinowactwo do wiązania ze specyficznym antygenem. Natywne przeciwciała są zazwyczaj heterotetramerycznymi glikoproteinami o masie około 150000 daltonów, składającymi się z dwóch identycznych łańcuchów lekkich (L) i dwóch identycznych łańcuchów ciężkich (H). Każdy z łańcuchów lekkich połączony jest z łańcuchem ciężkim za pomocą jednego kowalencyjnego wiązania disiarczkowego, natomiast liczba wiązań disiarczkowych pomiędzy łańcuchami ciężkimi jest zmienna dla różnych odmian izotypowych immunoglobulin. Każdy łańcuch ciężki i lekki posiada również regularnie rozmieszczone wewnątrzłańcuchowe wiązania disiarczkowe. Każdy łańcuch ciężki posiada na jednym końcu domenę zmienną (VH), poprzedzoną licznymi domenami stałymi. Każdy łańcuch lekki posiada na jednym końcu domenę zmienną (VL) oraz na drugim swym końcu pewną liczbę domen stałych, domena stała łańcucha lekkiego jest położona równolegle w stosunku do pierwszej domeny stałej łańcucha ciężkiego, natomiast domena zmienna łańcucha lekkiego jest położona równolegle w stosunku do domeny zmiennej łańcucha ciężkiego. Uważa się, że za powstanie powierzchni styku pomiędzy domenami zmiennymi łańcucha lekkiego i ciężkiego odpowiedzialne są szczególne reszty aminokwasowe.

Termin „zmienny odnosi się do faktu, że w różnych przeciwciałach pewne fragmenty domen zmiennych różnią się znacznie sekwencją i warunkują swoistość wiązania specyficznego antygenu przez specyficzne przeciwciało. Jednakże, zmienność nie jest rozmieszczona równomiernie w obrębie domen zmiennych przeciwciał. Skupia się ona w trzech segmentach, zwanych regionami determinującymi dopasowanie (CDR), zarówno w domenach zmiennych łańcuchów lekkich, jak i ciężkich. Najbardziej konserwatywne części domen zmiennych, zwane są regionami zrębowymi (FR). Każda z domen zmiennych natywnych łańcuchów lekkich i ciężkich obejmuje cztery FR, przyjmujące głównie strukturę harmonijki β, połączone poprzez trzy CDR, tworzące pętle łączące, a w pewnych przypadkach stanowiące fragment, o konformacji harmonijki β. W obrębie każdego z łańcuchów CDR znajdują się w bliskim sąsiedztwie FR i, wraz z CDR innego łańcucha, uczestniczą w formowaniu miejsca wiązania antygenu przeciwciała (patrz Kabat i wsp.. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)).

Domeny stale nie uczestniczą bezpośrednio w wiązaniu przeciwciała z antygenem, jednakże wykazują różne funkcje efektorowe. W zależności od sekwencji aminokwasowej regionu stałego łańcuchów ciężkich przeciwciała lub immunoglobuliny podlegają podziałowi na różne klasy. Istnieje pięć głównych klas immunoglobulin: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM oraz kilka podklas (odmiany izotypowe), wynikających z podziału klas głównych, np. IgG1, IgG2, IgG3 oraz IgG4; IgA1 oraz IgA2. Regiony stałe łańcucha ciężkiego odpowiadające różnym klasom immunoglobulin nazywane są odpowiednio, α, β, ε, γ oraz μ. Spośród różnych klas ludzkich immunoglobulin, jedynie ludzkie IgG1, IgG2, IgG3 oraz IgM s ą zdolne do aktywacji dopełniacza, przy czym ludzkie IgG1 i IgG3 pośredniczą w ADCC skuteczniej niż IgG2 i IgG4.

Na Figurze 1 schematycznie przedstawiono strukturę natywnej IgG1 i wskazano różne fragmenty natywnego przeciwciała. Trawienie przeciwciała papaina skutkuje powstaniem dwóch identycznych fragmentów wiążących antygen, zwanych fragmentami Fab, przy czym, każdy zawiera pojedyncze miejsce wiązania antygenu oraz pozostały fragment „Fc, którego nazwa wywodzi się z jego łatwej krystalizacji. Określono strukturę krystaliczną regionu Fc ludzkiej IgG (Deisenhofer, Biochemistry 20: 2361-2370 (1981)). W cząsteczkach ludzkich IgG region Fc otrzymywany jest w wyniku cięcia papainą od N-końca do reszty Cys 226. Fragment Fc jest kluczowy dla funkcji efektorowych przeciwciał.

PL 209 786 B1

Zależne od regionu Fc funkcje efektorowe przeciwciał można podzielić na dwie kategorie: (1) funkcje efektorowe występujące po związaniu antygenu przez przeciwciało (funkcje te obejmują udział w kaskadzie dopeł niacza lub wiązanie się z receptorami Fc przeciwciał (komórki z FcR); oraz (2) funkcje efektorowe występujące niezależnie od wiązania antygenu (funkcje te zapewniają ciągłość działania i zdolność przenoszenia przez bariery komórkowe w wyniku transcytozy). Ward i Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77-94 (1995).

Podczas gdy wiązanie przeciwciała z wymaganym antygenem wywiera efekt neutralizujący, który może chronić przed wiązaniem obcego antygenu z endogenną cząsteczką docelową (np. receptorem lub ligandem), samo wiązanie nie usuwa obcego antygenu. W celu skutecznego usunięcia i/lub zniszczenia obcych antygenów, przeciwciało powinno wykazywać zarówno wysokie powinowactwo do swoistego antygenu, jak i skuteczne funkcje efektorowe.

Wiązanie receptora Fc (FcR)

Oddziaływania przeciwciał i kompleksów przeciwciało-antygen z komórkami układu immunologicznego wywołuje różnego typu odpowiedzi, włączając cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC) oraz cytotoksyczność zależną od dopełniacza (CDC) (praca przeglądowa, Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997); Ward i Ghetie, Therapeutic Immunol. 2: 77-94 (1995); jak również Ravetch i Knet, Annu. Rev.Immunol. 9: 457-492 (1991)).

W kilku funkcjach efektorowych przeciwciał uczestniczą receptory Fc (FcR), wiążące region Fc przeciwciała. FcR definiowane są na podstawie ich specyficzności względem poszczególnych odmian izotypowych immunoglobulin; receptory Fc dla przeciwciał IgG to FcyR, dla IgE - FcεR, dla IgA - FcaR, ltd. Zidentyfikowano trzy podklasy FcyR: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) oraz FcyRIII (CD16). Ze względu na to, że każda podklasa FcyR kodowana jest przez dwa lub trzy geny, a alternatywne składanie RNA prowadzi do powstania różnorodnych transkryptów, występuje duże zróżnicowanie pomiędzy odmianami izotypowymi FcyR. Trzy geny kodujące podklasę FcyRI (FcyRIA, FcyRIB i FcyRIC) skupione są w regionie 1q21.1 długiego ramienia chromosomu 1; geny kodujące odmiany izotypowe FcyRII (FcyRIIA, FcyRIIB i FcyRIIC) oraz geny kodujące FcyRIII (FcyRIIIA i FcyRIIIB) skupiają się w regionie 1q22. Te różne podtypy FcR ulegają ekspresji na różnych typach komórek (praca przeglądowa, Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991)). Przykładowo FcyRIIIB występuje u ludzi tylko na neutrofilach, natomiast FcyRIIIA występuje na makrofagach, monocytach, komórkach naturalnych zabójców (NK) i w subpopulacji komórek T. W szczególności, FcyRIIIA jest jedynym FcR obecnym na komórkach NK, jednym z typów komórek uczestniczących w ADCC.

FcyRI, FcyRII oraz FcyRIII należą do nadrodziny receptorów immunoglobulinowych (IgSF); FcyRI posiada trzy domeny IgSF w obszarze domeny zewnątrzkomórkowej, podczas gdy FcyRII i FcyRIII posiadają jedynie dwa fragmenty IgSF w swych domenach zewnątrzkomórkowych.

Innym typem receptora Fc jest noworodkowy receptor Fc (FcRn). FcRn wykazuje podobieństwo strukturalne do głównego układu zgodności tkankowej i składa się z łańcucha α niekowalencyjnie związanego z mikroglobuliną β2.

Miejsce wiązania FcyR na ludzkich i mysich przeciwciałach zostało uprzednio zmapowane do tzw. „dolnego regionu zawiasowego składającego się z reszt 233-239 (indeks EU według Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Woof i wsp., Molec. Immunol. 23: 319-330 (1986); Duncan i wsp., Nature 332: 563 (1988); Canfield i Morrison, J.Exp.Med. 173: 1483-1491 (1991); Chappel i wsp.. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88: 9036-9040 (1991). Region obejmujący reszty 233-239, P238 i S239 był brany pod uwagę jako mogący uczestniczyć w wiązaniu, ale rola tych dwóch reszt nie była nigdy oceniana drogą substytucji lub delecji.

Inne opisane wcześniej obszary prawdopodobnie zaangażowane w wiązanie z FcyR to: G316-K338 (ludzka IgG) dla ludzkiego FcyRI (jedynie na podstawie porównania sekwencji, nie analizowano żadnych mutantów substytucyjnych) (Woof i wsp., Molec.Immunol. 23: 319-330 (1986)); K274-R301 (ludzka IgG1) dla ludzkiego FcyRIII (w oparciu o peptydy) (Sarmay i wsp., Molec.Immunol. 21: 43-51 (1984)); Y407-R416 (ludzka IgG) dla ludzkiego FcyRIII (w oparciu o peptydy) (Gergely i wsp., Biochem.Soc.Trans. 12:739-743 (1984)); jak również N297 i E318 (mysie IgG2b) dla mysiego FcyRII (Lund i wsp., Molec.Immunol., 29:53-59 (1992)).

Pro331 w IgG3 zastąpiono Ser i analizowano powinowactwo tego wariantu względem komórek docelowych. Powinowactwo to było sześciokrotnie niższe od powinowactwa obserwowanego dla niezmutowanej IgG3, co wskazało na udział Pro331 w wiązaniu FcyRI. Morrison i wsp., Immunologist, 2:119-124 (1994); oraz Canfield i Morrison, J.Exp.Med. 173:1433-91 (1991).

PL 209 786 B1

Wiązanie C1q

C1q oraz dwie proteazy serynowe, C1r i C1s, tworzą kompleks C1, pierwszy składnik szlaku cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC). C1q jest sześciowartościową cząsteczką o masie cząsteczkowej w przybliżeniu 460000 i strukturze przypominającej bukiet tulipanów, w którym sześć kolagenowych „łodyg jest połączonych z sześcioma regionami globularnych główek. Burton i Woof, Advances in Immunol., 51:1-84 (1992). Do aktywacji kaskady dopełniacza niezbędne jest związanie z C1q przy najmniej dwóch czą steczek IgG1, IgG2 lub IgG3 (istnieje zgoda co do tego, ż e IgG4 nie aktywuje dopełniacza), natomiast tylko jednej cząsteczki IgM, przyłączonej do docelowego antygenu. Ward i Ghetie, Therapeutic Immunology, 2: 77-94 (1995), str. 80.

W oparciu o wyniki uzyskane na podstawie modyfikacji chemicznych i analizy krystalograficznej Burton i wsp., (Nature, 288: 338-344, (1980)) zaproponowali, że miejsce wiązania dla jednego ze składników dopełniacza C1q na IgG, obejmuje przynajmniej dwie (C-końcowe) nici β domeny CH2.

Burton następnie zasugerował (Molec.Immunol., 22(3): 161-206 (1985)), że region zawierający reszty aminokwasowe 318 do 337 może uczestniczyć w wiązaniu dopełniacza.

Duncan i Winter (Nature 332: 738-40 (1988)), stosując mutagenezę ukierunkowaną, odkryli, że Glu318, Lys320 i Lys322 tworzą miejsce wiązania C1q. Dane dostarczone przez Duncan'a i Winter'a pochodzą z testów wiązania mysiej odmiany izotypowej IgG2b z pochodzącym ze świnki morskiej C1q. Znaczenie reszt Glu318, Lys320 i Lys322 w wiązaniu C1q zostało potwierdzone na podstawie zdolności jaką wykazywał krótki, syntetyczny peptyd zawierający te reszty do hamowania zależnej od dopełniacza lizy. Podobne rezultaty ujawniono w Patencie USA Nr 5,648,260, wydanym 15 lipca, 1997 r. oraz Patencie USA Nr 5, 624,821, wydanym 29 kwietnia, 1997 r.

Na podstawie analizy zdolności podklasy ludzkiej IgG do uczestniczenia w zależnej od dopełniacza lizie komórkowej, wykazano, że reszta Pro331 jest zaangażowana w wiązanie C1q. Mutacja reszty Ser331 do reszty Pro331 w IgG nadaje zdolność aktywacji dopełniacza. (Tao i wsp., J.Exp.Med., 178: 661-667 (1993); Brekke i wsp., Eur.J.Immunol., 24: 2542-47 (1994)).

Ward i Ghetie zaprezentowali w swoim artykule przeglądowym, na podstawie porównania wyników otrzymanych przez zespół Winter'a i Tao i wsp. oraz Brekke i wsp., twierdzenie, że istnieją przynajmniej dwa różne regiony zaangażowane w wiązanie C1q: jeden w obrębie nici β domeny CH2, zawierającej reszty Glu318, Lys320 i Lys322 oraz drugi, w obszarze skrętu, w bliskim sąsiedztwie tej samej nici β, zawierający kluczową resztę aminokwasową w pozycji 331.

Inne doniesienia literaturowe sugerowały, że reszty Leu235 i Gly237 ludzkiego białka IgG1, zlokalizowane w dolnym regionie zawiasowym, odgrywają krytyczną rolę w wiązaniu i aktywacji dopełniacza. Xu i wsp., Immunol. 150:15A (Streszczenie) (1993). WO94/29351, wydany 2 grudnia, 1994 r. donosi, że reszty aminokwasowe niezbędne do wiązania C1q i FcR ludzkiej IgG1 zlokalizowane są w N-koń cowym regionie domeny CH2, tj. reszty 231-238.

Ponadto zaproponowano, że zdolność IgG do wiązania C1q i aktywacji kaskady dopełniacza zależy również od obecności, braku lub modyfikacji, ugrupowania węglowodanowego znajdującego się pomiędzy dwiema domenami CH2 (zazwyczaj zakotwiczonego przy reszcie Asn297). Ward i Ghetie, Therapeutic Immunology 2: 77-04 (1995), str. 81.

Streszczenie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgG1 niebędący natywną sekwencją regionu Fc i zawierające substytucję aminokwasową w pozycji aminokwasowej 434 regionu Fc, przy czym numeracja reszt w regionie Fc jest zgodna z indeksem EU według Kabat, i przy czym wariant regionu Fc wiąże ludzki noworodkowy receptor Fc (FcRn) ze zwiększonym powinowactwem wiązania w porównaniu z natywną sekwencją regionu Fc ludzkiej IgG1.

Korzystnie przeciwciało to zawiera substytucję aminokwasową tylko w pozycji 434 w regionie Fc.

Korzystnie przeciwciało to zawiera substytucję N434A.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto przeciwciało wiążące czynnik wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF), zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgG1 niebędący natywną sekwencją regionu Fc i zawierające substytucję aminokwasową w pozycji aminokwasowej 434 regionu Fc, przy czym numeracja reszt w regionie Fc jest zgodna z indeksem EU według Kabat, i przy czym wariant regionu Fc wiąże ludzki noworodkowy receptor Fc (FcRn) ze zwiększonym powinowactwem wiązania w porównaniu z natywną sekwencją regionu Fc ludzkiej IgG1.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto immunoadhezyna, charakteryzująca się tym, że zawiera wariant regionu Fc ludzkiej IgG1 niebędący natywną sekwencją regionu Fc i zawiera substytucję aminokwasową w pozycji aminokwasowej 434 regionu Fc, przy czym numeracja reszt w regionie Fc jest

PL 209 786 B1 zgodna z indeksem EU według Kabat, i przy czym wariant regionu Fc wiąże ludzki noworodkowy receptor Fc (FcRn) ze zwiększonym powinowactwem wiązania w porównaniu z natywną sekwencją regionu Fc ludzkiej IgG1.

Korzystnie zawiera substytucję aminokwasową tylko w pozycji 434 w regionie Fc.

Korzystnie zawiera substytucję N434A.

Zgodnie z wynalazkiem opisano wariant macierzystego polipeptydu zawierający region Fc, uczestniczący w procesie cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC) w obecności ludzkich komórek efektorowych skuteczniej, lub wiążący receptor gamma Fc (FcyR) z wyższym powinowactwem niż macierzysty polipeptyd i zawierający przynajmniej jedną modyfikację aminokwasową w regionie Fc. Taki wariant polipeptydu może, na przykład, zawierać przeciwciało lub immunoadhezynę. Taki region Fc macierzystego polipeptydu dogodnie zawiera ludzki region Fc, np. region Fc ludzkiej IgG1, IgG2, IgG3 lub IgG4. Taki wariant polipeptydu zawiera dogodnie modyfikację aminokwasową (np. substytucję) w jakiejkolwiek jednej lub więcej pozycji 256, 290, 298, 312, 326, 330, 333, 334, 360, 378 lub 430 regionu Fc, którego reszty aminokwasowe oznaczone są zgodnie z indeksem EU według Kabat.

Ponadto, zgodnie z wynalazkiem opisano polipeptyd zawierający wariant regionu Fc o zmienionym powinowactwie wiązania receptora Fc gamma (FcyR), który to polipeptyd zawiera modyfikację reszty aminokwasowej w jakiejkolwiek, jednej lub więcej, pozycji 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255,

256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295,

296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 lub 439 regionu Fc, przy czym numeracja reszt jest zgodna z indeksem EU według Kabat. Wariant regionu Fc dogodnie zawiera wariant regionu Fc ludzkiej IgG, np. wariant regionu ludzkiej IgG1, IgG2, IgG3 lub IgG4. Zauważono, że w powyżej cytowanych pracach z tej dziedziny, dotyczących macierzystego polipeptydu posiadającego niepochodzący od ludzi mysi region Fc, wymienionym powyżej resztom przypisywano udział w wiązaniu Fc. Na przykład, w układzie mysia IgG2b/mysi FcyRII, wykazano, że IgGE318 jest istotna w procesie wiązania (Lund i wsp., Molec.Immunol. 27(1): 53-59 (1992)), podczas gdy E318A nie wywierała żadnego wpływu w układzie ludzka IgG/ludzki FcyRII (Tabela 6, poniżej).

W jednym z rozwiązań wariant polipeptydu o zmienionej aktywności wiązania FcyR charakteryzuje się zredukowanym wiązaniem z FcyR i zawiera modyfikację reszty aminokwasowej w jakiejkolwiek, jednej lub więcej, pozycji 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 lub 439 regionu Fc, przy czym numeracja reszt jest zgodna z indeksem EU według Kabat.

Na przykład, wariant polipeptydu może wykazywać zredukowane wiązanie z FcyRI oraz zawierać modyfikację aminokwasu w jakiejkolwiek, jednej lub więcej, pozycji 238, 265, 269, 270, 327 lub 329 regionu Fc, przy czym numeracja reszt jest zgodna z indeksem EU według Kabat.

Wariant polipeptydu może wykazywać zredukowane wiązanie z FcyRII oraz zawierać modyfikację aminokwasu w jakiejkolwiek, jednej lub więcej, pozycji 238, 265, 269, 270, 292, 294, 295, 298, 303, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 373, 376, 414, 416, 419, 435, 438 lub 439 regionu Fc, przy czym numeracja reszt jest zgodna z indeksem EU według Kabat.

Będący przedmiotem zainteresowania wariant polipeptydu może wykazywać zredukowane wiązanie z FcyRIII oraz zawierać modyfikację aminokwasu w jakiejkolwiek, jednej lub więcej, pozycji 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 293, 294, 295, 296, 301, 303, 322, 327, 329, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 416, 434, 435 lub 437 regionu Fc, przy czym numeracja reszt jest zgodna z indeksem EU według Kabat.

W innym rozwiązaniu, wariant polipeptydu o zmienionym powinowactwie wiązania FcyR wykazuje zwiększone wiązanie FcyR i zawiera modyfikację aminokwasową w jakiejkolwiek, jednej lub więcej, pozycji 255, 256, 258, 267, 268, 272, 276, 280, 283, 285, 286, 290, 298, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 326, 330, 331, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398 lub 430 regionu Fc, przy czym numeracja reszt jest zgodna z indeksem EU według Kabat.

Na przykład, wariant polipeptydu może wykazywać zwiększone wiązanie FcyRIII oraz, ewentualnie, może dodatkowo wykazywać zredukowane wiązanie FcyRII. Przykładowo, taki wariant zawiera modyfikację lub modyfikacje reszty aminokwasowej lub reszt aminokwasowych w pozycji 298 i/lub 333 regionu Fc, przy czym numeracja reszt jest zgodna z indeksem EU według Kabat.

PL 209 786 B1

Wariant polipeptydu może wykazywać silniejsze wiązanie z FcyRII oraz zawierać modyfikację aminokwasową w jakiejkolwiek, jednej lub więcej, pozycji 255, 256, 258, 267, 268, 272, 276, 280, 283,

285, 286, 290, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 326, 330, 331, 337, 340, 378, 398 lub 430 regionu Fc, przy czym numeracja reszt jest zgodna z indeksem EU według Kabat. Takie warianty polipeptydu o zwiększonym wiązaniu FcyRII mogą, ewentualnie, dodatkowo charakteryzować się zredukowanym wiązaniem FcyRIII i mogą, na przykład, zawierać modyfikację reszty aminokwasowej w jakiejkolwiek, jednej lub więcej, pozycji 268, 272, 298, 301, 322 lub 340 regionu Fc, przy czym numeracja reszt jest zgodna z indeksem EU według Kabat.

Zgodnie z wynalazkiem opisano też polipeptyd zawierający wariant regionu Fc o zmienionym powinowactwie wiązania noworodkowego receptora Fc (FcRn), który to polipeptyd zawiera modyfikację aminokwasową w jakiejkolwiek, jednej lub więcej, pozycji 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272,

286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400,

413, 415, 424, 433, 435, 436, 439 lub 447 regionu Fc, przy czym numeracja reszt jest zgodna z indeksem EU według Kabat. Takie warianty polipeptydu o zredukowanym wiązaniu FcRn mogą zawierać modyfikację aminokwasową w jakiejkolwiek, jednej lub więcej, pozycji 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 lub 447 regionu Fc, przy czym numeracja reszt jest zgodna z indeksem EU według Kabat. Wyżej wymienione warianty polipeptydu mogą, alternatywnie, wykazywać silniejsze wiązanie FcRn i zawierać modyfikację aminokwasu w jakiejkolwiek, jednej lub więcej, pozycji 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 lub 434 regionu Fc, przy czym numeracja reszt jest zgodna z indeksem EU według Kabat.

Zgodnie z wynalazkiem opisano też kompozycję zawierającą wariant polipeptydu i fizjologicznie lub farmaceutycznie akceptowany nośnik lub rozpuszczalnik. Kompozycja ta, służąca do potencjalnego zastosowania terapeutycznego, jest sterylna i może być liofilizowana.

Rozważano diagnostyczne i terapeutyczne zastosowanie zawartych w niniejszym opisie wariantów polipeptydu. W jednym z zastosowań diagnostycznych zgodnie w wynalazkiem opisano sposób określenia obecności antygenu będącego przedmiotem zainteresowania, obejmujący kontaktowanie próbki przypuszczalnie zawierającej antygen z wariantem polipeptydu i określanie wiązania wariantu polipeptydu z tą próbką. W jednym z zastosowań terapuetycznych zgodnie z wynalazkiem opisano sposób leczenia ssaków dotkniętych chorobą lub zaburzeniem, lub predysponowanych do wystąpienia takiej choroby lub zaburzenia, obejmujący podawanie ssakom terapeutycznie skutecznej ilości wariantu opisywanego polipeptydu, lub kompozycji zawierającej wariant polipeptydu i farmaceutycznie akceptowany nośnik.

Zgodnie z wynalazkiem opisano również: wyizolowany kwas nukleinowy kodujący wariant polipeptydu; wektor zawierający kwas nukleinowy, ewentualnie operacyjnie połączony z sekwencją rozpoznawaną przez transformowane wektorem komórki kontrolną gospodarza; komórki gospodarza zawierające wektor; sposób otrzymywania wariantu polipeptydu obejmujący hodowlę tych komórek gospodarza w celu osiągnięcia w nich ekspresji kwasu nukleinowego, i ewentualnie odzyskanie wariantu polipeptydu z hodowli komórek gospodarza (np. z pożywki hodowlanej komórek gospodarza).

Zgodnie z wynalazkiem opisano również sposób otrzymywania wariantu regionu Fc o zmienionym powinowactwie wiązania receptora (FcR) lub o zmienionej cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC), który to sposób obejmuje:

(a) wprowadzanie jednej lub więcej modyfikacji aminokwasowych w regionie Fc macierzystego polipeptydu w celu uzyskania wariantu regionu Fc;

(b) określanie wiązania wariantu regionu Fc z FcR lub określanie aktywności ADCC regionu Fc wariantu polipeptydu.

Etap (b) sposobu może obejmować określanie wiązania in vitro regionu Fc wariantu polipeptydu z jednym lub więcej FcR. Ponadto, sposób może pozwalać na identyfikację regionu Fc wariantu polipeptydu o zwiększonym powinowactwie wiązania z FcR lub o zwiększonej aktywności ADCC w etapie (b). Etap (b) obejmuje określanie wiązania regionu Fc z FcR, który na przykład, może być ludzkim receptorem III Fc gamma (FcyRIII). Gdy etap (b) dotyczy określania wiązania wariantu regionu Fc z przynajmniej dwoma różnymi FcR, to testowane FcR dogodnie zawierają ludzki receptor II Fc gamma (FcyRII) oraz ludzki receptor III Fc gamma (FcyRIII).

Krótki opis Rysunków

Na Figurze 1 przedstawiono schematycznie natywną IgG. Wiązania disiarczkowe zaznaczono grubą linią pomiędzy domenami CH1 a CL oraz dwiema domenami CG2. V jest domeną zmienną; C jest domeną stałą; literą L oznaczono łańcuch lekki, zaś literą H łańcuch ciężki.

PL 209 786 B1

Na Figurze 2 przedstawiono wiązanie C1q przeciwciała dzikiego typu (wt) C2B8; przeciwciała C2B8 zawierającego region stały ludzkiej IgG2 (IgG2) oraz warianty K322A, K320A i K318A.

Na Figurze 3 zaprezentowano wiązanie C1q wariantów P331A, P329A i K322A.

Na Figurze 4A oraz 4B przedstawiono sekwencje aminokwasowe łańcucha lekkiego (Fig. 4A; SEQ ID NO:1) oraz łańcucha ciężkiego (Fig. 4B; SEQ ID NO:2) przeciwciała E27 skierowanego przeciwko IgE.

Na Figurze 5 zaprezentowano schematyczny diagram „kompleksu immunologicznego przygotowanego do zastosowania w analizie FcR opisanej w Przykładzie 1. Przedstawiono heksamer zawierający trzy cząsteczki przeciwciała skierowanego przeciwko IgE (polipeptyd zawierający region Fc) oraz trzy cząsteczki IgE („pierwsza cząsteczka docelowa). IgE posiada dwa „miejsca wiązania przeciwciała skierowanego przeciwko IgE (E27) w regionie Fc tego białka. Każda cząsteczka IgE w tym kompleksie jest ponadto zdolna do wiązania dwóch cząsteczek VEGF („drugi polipeptyd docelowy). VEGF posiada dwa „miejsca wiązania IgE.

Na Figurze 6 zademonstrowano wyniki wiązania C1q otrzymanego dla wariantów D270K oraz D270V, w porównaniu z wynikami uzyskanymi dla dzikiego typu C2B8.

Na Figurze 7 przedstawiono wyniki dotyczące cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC) wariantów D270K i D270V w porównaniu do wyników uzyskanych dla dzikiego typu C2B8.

Na Figurze 8 zawarto wyniki testu ELISA dotyczące wiązania C1q dla dzikiego typu przeciwciała C2B8 produkowanego przez komórki 293 (293-Wt-C2B8), dzikiego typu przeciwciała C2B8 produkowanego przez CHO (CHO-Wt-C2B8) oraz różnych typów przeciwciał.

Na Figurze 9 przedstawiono wyniki testu ELISA dotyczące wiązania C1q dla dzikiego typu (wt) C2B8 oraz różnych wariantów przeciwciał, zgodnie z tym jak określono w Przykładzie 3.

Na Figurze 10 zamieszczono strukturę trójwymiarową regionu Fc ludzkiego białka IgG, zaznaczono reszty aminokwasowe: Asp270, Lys326, Pro329, Pro331, Lys322 oraz Glu333.

Na Figurze 11 zawarto wyniki testu ELISA wiązania C1q, uzyskane dla dzikiego typu C2B8 oraz różnych wariantów przeciwciał, zgodnie z tym jak określono w Przykładzie 3.

Na Figurze 12 przedstawiono wyniki testu ELISA wiązania C1q uzyskane dla dzikiego typu C2B8 oraz podwójnych wariantów, K326M-E333S i K326A-E333A.

Na Figurze 13 przedstawiono CDC dzikiego typu C2B8 oraz podwójnych wariantów, K326ME333S i K326A-E333A.

Na Figurze 14 zawarto wyniki testu ELISA wiązania C1q, uzyskane dla C2B8 z ludzką IgG4 (IgG4), dzikiego typu C2B8 (Wt-C2B8), C2B8 z regionem stałym ludzkiej IgG2 (IgG2) oraz dla wariantów przeciwciał, zgodnie z opisem w Przykładzie 3.

Na Figurze 15A i 15B pokazano wzorce wiązania uzyskane dla macierzystego przeciwciała (E27) z FcyRIIB oraz FcyRIIIA. Na Figurze 15A przedstawiono wzorce wiązania dla humanizowanego przeciwciała IgG1, E27, skierowanego przeciwko IgE, w postaci monomeru (okręgi), heksameru (pełne kwadraty) oraz kompleksu immunologicznego składającego się z wielu heksamerów (pełne trójkąty), z rekombinowanym białkiem fuzyjnym GST podjednostki α ludzkiego receptora FcyRIIB (CD32). Heksameryczny kompleks (pełne kwadraty) utworzono poprzez zmieszanie równych stężeń molarnych E27 (wiążącego się z regionem Fc ludzkiej IgE) oraz IgE ludzkiego szpiczaka. Heksamer jest stabilnym, 1.1 kDa kompleksem, składającym się z 3 cząsteczek IgG (każda o masie 150 kDa) oraz 3 cząsteczek IgE (każda o masie 200 kDa). Kompleks immunologiczny (pełne trójkąty) utworzono kolejno łącząc równe stężenia molarne E27 oraz rekombinowanej IgE, skierowanej przeciwko VEGF (ludzka IgE z domenami zmiennymi wiążącymi ludzki VEGF) z utworzeniem heksameru. Następnie, w celu utworzenia kompleksu immunologicznego, heksamery łączono z 2x stężeniem molarnym ludzkiego VEGF, homodimeru 44kDa, posiadającego dwa miejsca wiązania dla IgE skierowanej przeciwko VEGF na mol VEGF. Na Figurze 15B pokazano przebieg wiązania z rekombinowanym białkiem fuzyjnym GST podjednostki α ludzkiego receptora FcyRIIIA (CD16).

Na Figurze 16A przedstawiono wiązanie kompleksów immunologicznych z wykorzystaniem różnych par typu antygen-przeciwciało w reakcji z rekombinowanym białkiem fuzyjnym GST podjednostki α receptora FcyRIIA. Na Figurze 16B pokazano wiązanie tych samych par antygen-przeciwciało z fuzyjnym białkiem GST podjednostki α receptora FcyRIIIA. Wiązanie ludzkiego IgE:anty-IgE E27 IgG1 zaznaczono za pomocą pełnych kółek; wiązanie ludzkiego VEGF:humanizowane anty-VEGF IgG1 zaznaczono za pomocą pustych kółek.

Na Figurze 17 podsumowano różnice w selektywności wiązania pomiędzy pewnymi wariantami alaninowymi różnych FcyR. Wiązanie wariantów alaninowych w miejscu reszt domeny CH2 IgG1 anty8

PL 209 786 B1

-IgE, E27, przedstawiono dla FcyRIIA, FcyRIIB oraz dla FcyRIIIA. Typ 1 nie wykazuje wiązania z żadnym z trzech receptorów: D278A (265 według indeksu EU). Typ 2 cechuje się zwiększonym wiązaniem z FcyRIIA i FcyRIIB, podczas gdy wiązanie z FcyRIIIA nie ulega zmianie: S280A (267 według indeksu EU). Typ 3 wykazuje zwiększone wiązanie z FcyRIIA i FcyRIIB, natomiast zredukowane wiązanie z FcyRIIIA: H281A (268 według indeksu EU). Typ 4 cechuje się zmniejszonym wiązaniem z FcyRIIA i FcyRIIB, ale zwiększonym wiązaniem z FcyRIIIA: S317A (298 według indeksu EU). Typ 5 wykazuje zwiększone wiązanie z FcyRIIIA, natomiast wiązanie z FcyRIIA i FcyRIIB nie ulega zmianie: E352A, K353A (333 i 334 według indeksu EU).

Na Figurze 18A i 18B porównano wyniki uzyskane, odpowiednio, w wyniku analizy typu białko FcyRIIIA/białko oraz analizy wykonanej w oparciu o komórki CHO GPI-FcyRIIIA. Na Figurze 18A przedstawiono wiązanie wybranych wariantów alaninowych z białkiem fuzyjnym FcyRIIIA-GST. S317A (298 według indeksu EU) oraz S317A/K353A (298 i 334 według indeksu EU) wykazywały się lepszym wiązaniem niż dzikiego typu E27, podczas gdy D278A (265 według indeksu EU) utracił niemal całkowicie zdolność wiązania. Na Figurze 18B wykazano, że podobny wzorzec wiązania występuje w przypadku komórek CHO, wykazujących ekspresję rekombinowanej postaci FcyRIIIA związanej z GPI.

Na Figurze 19A i 19B porównano wyniki uzyskane, odpowiednio, w wyniku analizy typu białko FcyRIIB/białko oraz analizy wykonanej w oparciu o komórki CHO GPI-FcyRIIB. Na Figurze 19A przedstawiono wiązanie wybranych wariantów alaninowych z białkiem fuzyjnym FcyRIIB-GST. H281A (268 według indeksu EU) wykazał się lepszym wiązaniem niż dziki typ E27, podczas gdy dla S317A (298 według indeksu EU) odnotowano zredukowane wiązanie. Na Figurze 19B pokazano, że podobny wzorzec wiązania występuje w przypadku komórek CHO wykazujących ekspresję rekombinowanego FcyRIIB związanego z błoną.

Na Figurze 20 zademonstrowano pojedyncze substytucje alaniny w domenie CH2 przeciwciała IgG1 skierowanego przeciwko HER2 (HERCEPTIN®), które wpływają na wiązanie FcyRIIIA w obu analizach, typu białko-białko i analizie opartej na wykorzystaniu komórek, zmieniając zdolność wiązania z FcyRIIIA na efektorowych jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej (PBMC). Rekombinowane humanizowane przeciwciała anty-HER2 (HERCEPTIN®), które wiążą się z eksprymującymi HER-2 komórkami raka sutka SK-BR-3, inkubowano wstępnie ze znakowanymi ⁵¹Cr komórkami SK-BR-3 przez 30 min (opsonizacja), stosując stężenie 100 ng/ml (pełne kółka) i 1,25 ng/ml (pełne kwadraty). Stosując stałe stężenie docelowych komórek nowotworowych, zwiększano stosunek komórek efektorowych od 0 do 100. Poziom spontanicznej cytotoksyczności przy braku przeciwciała (przekreślone kwadraty) wynosił 20%, przy stosunku komórka efektorowa:komórka docelowa wynoszącym 100:1. Pojedyncza mutacja alaninowa, niewywierająca wpływu na wiązanie z FcyRIIIA, wariant G31=R309A (292 według indeksu EU), nie wpływała na ADCC (pełne trójkąty). Pojedyncza mutacja alaninowa, zwiększająca jedynie nieznacznie wiązanie z FcyRIIIA, wariant G30=K307A (290 według indeksu EU), również powodowała niewielki wzrost ADCC (tj. 1,1-krotne zwiększenie aktywności ADCC, obliczonej na podstawie obszaru pod krzywą) w stężeniu 1,25 ng/ml dla stosunków komórka efektorowa:komórka docelowa (pełne romby) porównywanych do przeciwciała dzikiego typu w stężeniu 1,25 ng/ml (pełne kwadraty). Pojedyncza mutacja alaninowa obniżająca wiązanie z FcyRIIIA, wariant G34=Q312A (295 według indeksu EU), również powodowała obniżenie aktywności ADCC (pełne, odwrócone trójkąty).

Na Figurze 21 pokazano, że pojedyncza mutacja alaninowa, powodująca wzmocnienie wiązania z FcyRIIIA, wariant G36=S317A (298 według indeksu EU), w analizie typu białko-białko i analizie opartej na zastosowaniu komórek również powoduje wzrost ADCC (pełne trójkąty), obserwowany wśród wariantów porównywanych z dzikim typem (pełne kwadraty), w stężeniu 1,25 ng/ml. Zastosowanie G36 powodowało 1,7-krotny wzrost aktywności ADCC, wyrażony jako obszar pod krzywą. Oba warianty, G17=E282A (269 według indeksu EU) oraz G18=D283A (270 według indeksu EU), wykazywały zredukowane wiązanie z FcyRIIIA, jak również obniżoną skuteczność ADCC. Komórkami efektorowymi były PBMC.

Na Figurze 22A przedstawiono przyrównania natywnych sekwencji regionów Fc IgG. Przedstawiono natywną sekwencję regionu Fc ludzkiej IgG, humlgG1 (allotypy nie-A i A) (odpowiednio SEQ ID NO: 3 i 4), humIgG2 (SEQ ID NO: 5), humIgG3 (SEQ ID NO: 6) oraz humIgG4 (SEQ ID NO: 7). Sekwencja ludzkiej IgG1 jest allotypem nie-A, a różnice pomiędzy tą sekwencją a allotypem A (w pozycjach 356 i 358; zgodnie z indeksem EU) pokazano poniżej sekwencji ludzkiej IgG1. Przedstawiono również natywne sekwencje regionu Fc mysiej IgG, murlgG1 (SEQ ID NO: 8), murIgG2A (SEQ ID NO: 9), murIgG2B (SEQ ID NO: 10) oraz murIgG3 (SEQ ID NO: 11). Na Figurze 22B pokazano procent identyczności pomiędzy sekwencjami regionu Fc przedstawionymi na Figurze 22A.

PL 209 786 B1

Na Figurze 23 pokazano przyrównania natywnych sekwencji regionu Fc ludzkiej IgG, humlgG1 (allotypu nie-A i A; odpowiednio SEQ ID NO: 3 i 4), humIgG2 (SEQ ID NO: 5), humIgG3 (SEQ ID NO: 6) oraz humIgG4 (SEQ ID NO: 7, przy czym różnice pomiędzy sekwencjami zaznaczono za pomocą gwiazdek.

Na Figurze 24 przedstawiono obszar pod krzywą (AUC) dla wybranych wariantów w porównaniu z IgG1 anty-HER2 (HERCEPTIN®) w 4-godzinnej analizie ADCC. Komórkami efektorowymi były P3MC (N=5). Wariant G36 (S317A; 298 według indeksu EU) o zwiększonym wiązaniu FcyRIIIA wykazywał zwiększoną aktywność ADCC; wariant G31 (R309A; 292 według indeksu EU), niewykazujący zmiany wiązania FcyRIIIA, również nie posiadał zmienionej aktywności ADCC, a G14 (D265A; 278 według indeksu EU) cechujący się zredukowanym wiązaniem FcyRIIIA, także posiadał obniżoną aktywność ADCC.

Szczegółowy opis zalecanych wykonań

I. Definicje

W niniejszym opisie i zastrzeżeniach numeracja reszt w łańcuchu ciężkim immunoglobuliny jest zgodna z indeksem EU według Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), wyraźnie włączonym tu przez odesłanie. „Indeks EU według Kabat dotyczy numeracji reszt ludzkiego przeciwciała IgG1 EU.

„Macierzysty polipeptyd jest polipeptydem o sekwencji aminokwasowej bez ujawnionych tu, jednej lub więcej, modyfikacji w regionie Fc, różniącym się od ujawnionego tu wariantu polipeptydu funkcją efektorową. Polipeptyd macierzysty może zawierać natywną sekwencję regionu Fc lub regionu Fc obejmującego istniejące pierwotnie modyfikacje sekwencji aminokwasowej (takie jak addycje, delecje i/lub substytucje).

Termin „region Fc'' stosowany jest w celu zdefiniowania C-końcowego regionu łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, np. jak przedstawiono na Figurze 1. „Region Fc może być natywną sekwencją regionu Fc lub wariantem regionu Fc. Mimo, że granice regionu Fc łańcucha ciężkiego immunoglobuliny mogą różnić się, region Fc łańcucha ciężkiego ludzkiej immunoglobuliny IgG rozciąga się od reszty aminokwasowej w pozycji Cys226, lub od Pro230, do jego karboksylowego końca. Region Fc immunoglobuliny, ogólnie, obejmuje dwie domeny stałe, CH2 i CH3, jak przedstawiono na Figurze 1.

„Domena CH2 regionu Fc ludzkiej IgG (również nazywana domeną „Cy2) obejmuje zazwyczaj obszar od reszty aminokwasowej 231 do około aminokwasu 340. Domena CH2 jest jedynym fragmentem, który nie jest połączony ściśle z inną domeną. Dwa rozgałęzione, połączone wiązaniem przez atom N, łańcuchy węglowodanowe umieszczone są pomiędzy dwiema domenami CH2 we wnętrzu nienaruszonej natywnej cząsteczki IgG. Przypuszcza się, że te węglowodany zastępują łączenia pomiędzy domenami i pomagają stabilizować domenę CH2. Burton, Molec. Immunol., 22: 161-206 (1985).

„Domena CH3 obejmuje obszar reszt od C-końcowych do domeny CH2 regionu Fc (tj. od około reszty aminokwasowej 341 do około reszty aminokwasowej 447 IgG).

„Funkcjonalny region Fc posiada „funkcję efektorową natywnej sekwencji regionu Fc. Przykładowe, „funkcje efektorowe obejmują wiązanie C1q; cytotoksyczność zależną od dopełniacza; wiązanie receptora Fc, cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC); fagocytozę; inhibicję receptorów powierzchniowych komórki (np. receptora komórki B, BCR), itp. Takie funkcje efektorowe wymagają połączenia regionu Fc z domeną wiążącą (np. domeną zmienną przeciwciała) oraz mogą być oceniane za pomocą różnych analiz, np. opisanych w niniejszym wynalazku.

„Natywna sekwencja regionu Fc obejmuje sekwencję aminokwasową identyczną z sekwencją aminokwasową regionu Fc występującą w naturze. Natywne sekwencje ludzkich regionów Fc przedstawiono na Figurze 23 i obejmują one natywną sekwencję regionu Fc ludzkiej IgG1 (allotypu nie-A i allotypu A); natywną sekwencję regionu Fc ludzkiej IgG2; natywną sekwencję regionu Fc ludzkiej IgG3 oraz natywną sekwencję regionu Fc ludzkiej IgG4, jak również ich warianty występujące w naturze. Na Figurze 22A przedstawiono natywną sekwencję mysiego regionu Fc.

„Wariant regionu Fc obejmuje sekwencję aminokwasową różniącą się od natywnej sekwencji regionu Fc tym, że zawiera przynajmniej jedną, zgodnie z niniejszym opisem, „modyfikację aminokwasową. Dogodnie wariant regionu Fc posiada przynajmniej jedną substytucję aminokwasu innym aminokwasem, w porównaniu z natywną sekwencją regionu Fc lub regionu Fc macierzystego polipeptydu, np. od około jednej do około dziesięciu substytucji aminokwasowych, i dogodnie, od około jednej do około pięciu substytucji aminokwasowych w obrębie natywnej sekwencji regionu Fc lub regionu Fc macierzystego polipeptydu. Wariant regionu Fc dogodnie wykazuje przynajmniej około 80% homologii

PL 209 786 B1 z natywną sekwencją regionu Fc i/lub z regionem Fc macierzystego polipeptydu, a dogodniej okoł o 90% homologii z tymi regionami, a zwłaszcza przynajmniej około 95% homologii z tymi regionami.

„Homologia definiowana jest jako procent reszt sekwencji aminokwasowej wariantu, które są identyczne po przyrównaniu sekwencji i, w razie konieczności, wstawieniu odpowiednich przerw celem uzyskania maksymalnego procentu homologii. Metody i programy komputerowe do przyrównywania sekwencji są dobrze znane w dziedzinie. Jednym z takich programów jest program komputerowy „Align 2, Genetech, Inc., złożony wraz z dokumentacją dla użytkownika w the United States Copyright Office, Washington, DC 20559, 10 grudnia, 1991.

Termin „polipeptyd zawierający region Fc odnosi się do polipeptydu, takiego jak przeciwciało lub immunoadhezyna (patrz definicje poniżej), który zawiera region Fc.

Terminy „receptor Fc lub „FcR stosowane są w celu określenia receptora wiążącego region Fc przeciwciała. Zalecany FcR jest natywną sekwencją ludzkiego FcR. Ponadto, zalecany FcR posiada zdolność wiązania przeciwciała IgG (receptor gamma) i obejmuje receptory podklasy FcyRI, FcyRII i FcyRIII, włączając warianty alleliczne i warianty alternatywnego składania tych receptorów. Receptory FcyRII obejmują receptory FcyRIIA (receptor aktywujący) oraz FcyRIIB (receptor hamujący), które posiadają podobne sekwencje aminokwasowe, różniące się głównie w obszarze ich domen cytoplazmatycznych. Receptor aktywujący FcyRIIA zawiera w swojej domenie cytoplazmatycznej immunoreceptorowy motyw aktywujący (ITAM) obejmujący resztę tyrozyny. Receptor hamujący FcyRIIB zawiera w swej domenie cytoplazmatycznej immunoreceptorowy motyw hamujący (ITIM) obejmujący resztę tyrozyny. (Patrz praca przeglądowa M. Daeron, Annu.Rev.Immunol. 15: 203-234 (1997)). FcR opisane są w Raveth i Kinet, Annu.Rev.Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel i wsp., Immunomethods 4:25-34 (1994) oraz de Haas i wsp., J.Lab.Clin.Med. 126: 330-41 (1995). Inne FcR, w tym również te które zostaną zidentyfikowane w przyszłości, nazywane są w niniejszym opisie „FcR. Termin ten obejmuje również receptor noworodkowy, FcRn, odpowiedzialny za przeniesienie matczynych IgG do płodu (Guyer i wsp., J. Immunol. 117: 587 (1976) oraz Kim i wsp., J.Immunol. 24: 249 (1994)).

„Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał i „ADCC odnosi się do zależnej od komórek reakcji, w której niespecyficzne, cytotoksyczne komórki ekspresjonujące FcR (np. komórki zwane naturalnymi zabójcami (NK), neutrofile i makrofagi) rozpoznają przeciwciało związane z komórką docelową, a następnie powodują lizę tej komórki. Główne komórki uczestniczące w ADCC, komórki NK, ekspresjonują jedynie FcyRIII, podczas gdy monocyty ekspresjonują FcyRI, FcyRII i FcyRIII. Ekspresję FcR na komórkach uczestniczących w hematopoezie podsumowano w Tabeli 3, na stronie 464, Ravetch i Kinet, Annu.Rev.Immunol 9: 457-92, (1991).

„Ludzkie komórki efektorowe są leukocytami eksprymującymi jeden lub więcej FcR i wykazującymi funkcję efektorową. Zalecane komórki eksprymują przynajmniej FcyRIII i wykazują funkcję efektorową ADCC. Przykładami ludzkich leukocytów uczestniczących w ADCC są jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC), komórki zwane naturalnymi zabójcami (NK), monocyty, cytotoksyczne komórki T i neutrofile; przy czym zalecane są komórki PBMC i NK. Komórki efektorowe mogą być izolowane ze źródła natywnego np. z krwi lub komórek PBMC, zgodnie z niniejszym opisem.

Wariant polipeptydu o „zmienionym powinowactwie wiązania FcR lub aktywności ADCC jest polipeptydem o zwiększonej lub zmniejszonej aktywności wiązania FcR i/lub aktywności ADCC, w porównaniu z polipeptydem macierzystym lub z polipeptydem zawierającym natywną sekwencję regionu Fc. Wariant polipeptydu, który „wykazuje zwiększone wiązanie z FcR wiąże przynajmniej jeden FcR z większym powinowactwem niż macierzysty polipeptyd. Wariant polipeptydu, który „wykazuje zmniejszone wiązanie z FcR, wiąże przynajmniej jeden FcR z mniejszym powinowactwem niż macierzysty polipeptyd. Takie warianty, wykazujące osłabione wiązanie FcR, mogą posiadać małą lub nie posiadać żadnej znaczącej zdolności wiązania FcR, np. 0-20% wiązania z FcR, w porównaniu z natywną sekwencją regionu Fc IgG, np. jak określono w załączonych Przykładach.

Wariant polipeptydu, który wiąże FcR z „lepszym powinowactwem niż macierzysty polipeptyd, wykazuje zdolność wiązania jakiegokolwiek, jednego lub więcej, z powyżej wymienionych FcR z istotnie lepszym powinowactwem wiązania niż macierzyste przeciwciało, w przypadku gdy zastosowane w analizie wiązania ilości wariantu polipeptydu i polipeptydu macierzystego są zasadniczo takie same. Na przykład, wariant polipeptydu o lepszym powinowactwie wiązania FcR może wykazywać od około 1,15-krotną do około 100-krotnej, np. od około 1,2-krotną do około 50-krotną poprawę powinowactwa wiązania FcR niż polipeptyd macierzysty, przy czym powinowactwo wiązania jest określane, na przykład, zgodnie z opisem w załączonych Przykładach.

PL 209 786 B1

Wariant polipeptydu, który „uczestniczy w cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC) w obecności ludzkich komórek efektorowych skuteczniej„ niż przeciwciało macierzyste jest polipeptydem, który jest in vitro lub in vivo zasadniczo skuteczniejszy w procesie ADCC, przy czym zastosowane w analizie ilości wariantu polipeptydu i przeciwciała macierzystego są zasadniczo takie same. Ogólnie, takie warianty są identyfikowane za pomocą analizy ADCC in vitro, zgodnie z niniejszym opisem. Jednakże, rozważa się zastosowanie również innych analiz i metod służących wykrywaniu aktywności ADCC, np. w doświadczeniu na zwierzętach itp. Zalecany wariant jest około 1,5-krotnie do około 100-krotnie, np. od około dwukrotnie do około pięciokrotnie, bardziej skuteczny w procesie ADCC niż macierzysty polipeptyd, np. w opisanej tu analizie in vitro.

„Modyfikacja aminokwasowa odnosi się do zmiany sekwencji aminokwasowej w stosunku do określonej uprzednio sekwencji aminokwasowej. Przykładowe modyfikacje obejmują substytucję aminokwasowa, insercję i/lub delecję. Zalecaną modyfikacją aminokwasową jest substytucja.

„Modyfikacja aminokwasowa w specyficznej pozycji, np. regionu Fc, odnosi się do substytucji lub delecji specyficznej reszty, lub wstawienia przynajmniej jednej reszty aminokwasowej w sąsiedztwie specyficznej reszty. Przez wstawienie „w sąsiedztwie specyficznej reszty rozumie się wstawienie w tym miejscu jednej lub dwóch reszt aminokwasowych. Wstawienie może dotyczyć wstawienia reszty od N-końca lub C-końca względem specyficznej reszty.

„Substytucja aminokwasowa odnosi się do zastąpienia przynajmniej jednej istniejącej reszty aminokwasowej w pierwotnie określonej sekwencji aminokwasowej, inną, odmienną „zastępczą resztą aminokwasową. Zastępcza reszta lub reszty mogą być „naturalnie występującymi resztami aminokwasowymi (tj. kodowanymi przez kod genetyczny) i wybranymi z grupy istniejących reszt, takich jak: alanina (Ala); arginina (Arg); aspargina (Asn); kwas asparaginowy (Asp); cysteina (Cys); glutamina (Gln); kwas glutaminowy (Glu); glicyna (Gly); histydyna (His); izoleucyna (Ile); leucyna (Leu); lizyna (Lys); metionina (Met); fenyloalanina (Phe); prolina (Pro); seryna (Ser); treonina (thr); tryptofan (Trp); tyrozyna (Tyr) i walina (Val). Zaleca się jednak, żeby reszta zastępcza nie była cysteiną. Definicja obejmuje również substytucję jedną lub więcej niewystępującymi naturalnie resztami aminokwasowymi. „Niewystępująca naturalnie reszta aminokwasowa odnosi się do reszty innej niż wymienione powyżej naturalnie występujące reszty aminokwasowe, zdolnej do kowalencyjnego wiązania z sąsiednią resztą aminokwasowąa (sąsiednimi resztami aminokwasowymi w łańcuchu polipeptydowym). Przykłady niewystępujących naturalnie reszt aminokwasowych obejmują norleucynę, ornitynę, homoserynę oraz inne analogi reszt aminokwasowych, takie jak opisane przez Ellman i wsp., Meth. Enzym. 202: 301-336 (1991). W celu uzyskania takich niewystępujących naturalnie reszt aminokwasowych można zastosować procedury według Noren i wsp., Science 244: 182 (1989) i Ellman i wsp., jak wyżej. W skrócie, procedury te obejmują chemiczną aktywację supresorowego tRNA z niewystępującą naturalnie resztą aminokwasowa, a następnie transkrypcją in vitro i translacją RNA.

„Wstawienie aminokwasu (insercja) odnosi się do wbudowania przynajmniej jednego aminokwasu do określonej uprzednio sekwencji aminokwasowej. Podczas gdy insercja dotyczy zazwyczaj wstawienia jednej lub dwóch reszt aminokwasowych, w niniejszym zgłoszeniu brane są pod uwagę większe „insercje peptydowe, np. wstawienie około trzech do około pięciu lub nawet do około dziesięciu reszt aminokwasowych. Wstawiona reszta lub reszty mogą być resztami występującymi naturalnie lub niewystępującymi naturalnie, jak opisano powyżej.

„Delecja aminokwasu odnosi się do usunięcia przynajmniej jednej reszty aminokwasowej z określonej uprzednio sekwencji aminokwasowej.

„Region zawiasowy jest ogólnie zdefiniowany jako obszar od Glu216 do Pro230 ludzkiej IgG1 (Burton, Molec.Immunol. 22: 161-206 (1985)). Regiony zawiasowe innych postaci izotypowych IgG mogą być porównane z sekwencją IgG1 poprzez umieszczenie w tych samych pozycjach pierwszej i ostatniej reszty cysteiny, tworzących wiązania disiarczkowe S-S pomiędzy łańcuchami ciężkimi.

„Niższy region zawiasowy regionu Fc jest zazwyczaj zdefiniowany jako obszar rozciągający się od reszt następujących bezpośrednio od C-końca do regionu zawiasowego, tj. od reszty 233 do reszty 239 regionu Fc. W badaniach wykonanych wcześniej niż niniejszy wynalazek stwierdzono, że wiązanie FcyR było ogólnie związane z resztami aminokwasowymi niższego regionu zawiasowego w regionie Fc białka IgG.

„C1q jest polipeptydem zawierającym miejsce wiązania regionu Fc immunoglobuliny. C1q wraz z dwiema proteazami serynowymi, C1r i C1s, tworzy kompleks C1, pierwszy składnik szlaku cytotoksyczności (CDC) zależnej od dopełniacza. Ludzki polipeptyd C1q można zakupić np. w Quidel, San Diego, CA.

PL 209 786 B1

Termin „domena wiążąca odnosi się do regionu polipeptydu, który wiąże inną cząsteczkę. W przypadku FcR, domena wiążąca może obejmować fragment jego łańcucha polipeptydowego np. jego łańcuch α, który jest odpowiedzialny za wiązanie regionu Fc. Jedną z użytecznych domen wiążących jest zewnątrzkomórkowa domena łańcucha α FcR.

Termin „przeciwciało stosowane jest w najszerszym możliwym znaczeniu, a specyficznie dotyczy przeciwciałmonoklonalnych (włączając pełnej długości przeciwciała monoklonalne), przeciwciał poliklonalnych, przeciwciał wielospecyficznych (np. bispecyficzne) oraz fragmentów przeciwciał pod warunkiem, że wykazują aktywność biologiczną.

„Fragmenty przeciwciała zdefiniowane są dla potrzeb niniejszego wynalazku jako zawierające część nienaruszonego przeciwciała, ogólnie włączając region wiązania antygenu lub region zmienny nienaruszonego przeciwciała, lub też zachowujący zdolność wiązania FcR region Fc przeciwciała. Przykłady fragmentów przeciwciała obejmują przeciwciała liniowe; jednołańcuchowe cząsteczki przeciwciał oraz, utworzone z fragmentów przeciwciał, przeciwciała wielospecyficzne. Zalecane fragmenty przeciwciał posiadają przynajmniej część regionu zawiasowego i, ewentualnie, region CH1 łańcucha ciężkiego IgG. Bardziej zalecane fragmenty przeciwciał obejmują cały region stały łańcucńa ciężkiego IgG i zawierają łańcuch lekki IgG.

Stosowany tu termin „przeciwciało monoklonalne odnosi się do przeciwciała otrzymanego z populacji zasadniczo homogennych przeciwciał, tj. poszczególne przeciwciała wchodzące w skład populacji są identyczne, za wyjątkiem różnic wynikających z możliwych, naturalnie występujących mutacji, które mogą pojawiać się w nieznacznych ilościach. Przeciwciała monoklonalne są wysoce swoiste i skierowane są przeciwko pojedynczemu miejscu antygenowemu. Ponadto, w przeciwieństwie do konwencjonalnych preparatów przeciwciał (poliklonalnych), zawierających zazwyczaj różne przeciwciała skierowane przeciwko różnym determinantom (epitopom), każde przeciwciało monoklonalne jest skierowane przeciwko pojedynczej determinancie na antygenie. Modyfikacje „monoklonalne wskazują na charakter przeciwciała wynikający z otrzymania go z zasadniczo homogennej populacji przeciwciał i nie wymagają wytwarzania jakąkolwiek szczególną metodą. Na przykład, według niniejszego wynalazku, przeciwciała monoklonalne mogą być otrzymane metodą z użyciem hybrydom, opisaną po raz pierwszy przez Kohler i wsp., Nature 256: 495 (1975), lub metodami rekombinacji DNA (patrz, np. Patent USA Nr 4, 816, 567). „Przeciwciała monoklonalne mogą być również wyizolowane z fagowej biblioteki przeciwciał, za pomocą technik opisanych, na przykład, przez Clackson i wsp., Nature 352: 624-628 (1991) oraz Marks i wsp., J.Mol.Biol. 222: 581-594 (1991).

Opisane tu przeciwciała monoklonalne specyficznie obejmują przeciwciała (immunoglobuliny) „chimerowe, których fragment łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego jest identyczny lub homologiczny z odpowiadającymi mu sekwencjami przeciwciał pochodzących z poszczególnych gatunków, lub należącymi do poszczególnej klasy lub podklasy, przy czym pozostały łańcuch (lub łańcuchy) jest identyczny lub homologiczny z odpowiadającymi mu sekwencjami przeciwciał pochodzących z innego gatunku lub należącymi do innej klasy lub podklasy, jak również obejmują fragmenty takich przeciwciał pod warunkiem, że wykazują one aktywność biologiczną (Patent USA Nr 4, 816, 567; oraz Morrison i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)).

Postaci „humanizowane przeciwciał niepochodzących od ludzi (np. mysich) to chimerowe przeciwciała, które zawierają minimalnej długości sekwencję niepochodzącą od immunoglobuliny człowieka. W większości, humanizowane przeciwciała są ludzkimi immunoglobulinami (przeciwciało biorcy), w których reszty regionu hiperzmiennego biorcy są zastąpione resztami z regionu hiperzmiennego innego gatunku (przeciwciało dawcy), takiego jak mysz, szczur, królik lub Naczelny inny niż człowiek, posiadające pożądaną swoistość, powinowactwo i zdolność wiązania. W pewnych przypadkach, reszty regionu zrębowego (FR) Fv ludzkiej immunoglobuliny są zastąpione odpowiadającymi im resztami innych gatunków. Ponadto, przeciwciała humanizowane mogą zawierać reszty niewystępujące w przeciwciele biorcy lub w przeciwciele dawcy. Modyfikacje te służą dalszemu udoskonaleniu przeciwciała. Ogólnie, przeciwciało humanizowane obejmuje zasadniczo każdą z przynajmniej jednej, a zazwyczaj dwóch domen zmiennych, w których wszystkie lub zasadnicza większość pętli hiperzmiennych odpowiada pętlom immunoglobulin z gatunku innego niż człowiek, a wszystkie lub zasadnicza większość regionów FR pochodzi z sekwencji immunoglobuliny ludzkiej. Humanizowane przeciwciało może, ewentualnie, zawierać również przynajmniej fragment regionu stałego immunoglobuliny (Fc), zazwyczaj ludzkiej immunoglobuliny. Bardziej szczegółowo omówiono to zagadnienie w Jones i wsp., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann i wsp., Nature 332: 323-329 (1988) oraz Presta, Curr.Op.Struct.Biol. 2: 593-596 (1992).

PL 209 786 B1

Termin „region hiperzmienny dotyczy reszt aminokwasowych przeciwciała odpowiedzialnych za wiązanie antygenu. Region hiperzmienny zawiera reszty aminokwasowe z „regionu determinującego dopasowanie lub „CDR (tj. reszty 24-34 (L1), 50-56 (L2) oraz 89-97 (L3) domeny zmiennej łańcucha lekkiego; Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)) i/lub reszty „pętli hiperzmiennej (tj. reszty 26-32 (L1), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) domeny zmiennej łańcucha lekkiego oraz reszty 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) domeny zmiennej łańcucha ciężkiego; Chothia i Lesk, J.Mol.Biol. 196: 901-917 (1987)). Reszty „regionu zrębowego lub „FR są resztami domeny zmiennej, innymi niż zdefiniowane w niniejszym opisie reszty regionu hiperzmiennego.

Stosowany tu termin „immunoadhezyna określa cząsteczkę podobną do przeciwciała, której struktura stanowi połączenie „domeny wiążącej heterologicznego białka o właściwościach „adhezyjnych (np. receptora, ligandu lub enzymu) z domeną stałą immnoglobuliny. Strukturalnie immunoadhezyna obejmuje fuzję sekwencji aminokwasowej adhezyny z sekwencją o pożądanej swoistości wiązania, inną niż miejsce rozpoznawania i wiązania antygenu (miejsce łączenia antygenu) przeciwciała (tj. jest „hetrologiczna) oraz z sekwencją domeny stałej immunoglobuliny.

Stosowany tu termin „domena wiążąca ligand odnosi się do jakiegokolwiek natywnego receptora powierzchniowego komórki lub jakiegokolwiek regionu, lub jego pochodnej, zachowującego przynajmniej jakościowo w stosunku do odpowiadającego mu natywnego receptora zdolność wiązania ligandu. W specyficznym wykonaniu receptor pochodzi z polipeptydu powierzchni komórki, posiadającego domenę komórkową homologiczną z domeną kodowaną przez nadrodzinę genów immunoglobulin. Inne receptory, nienależące do nadrodziny genów immunoglobulin, lecz objęte niniejszą definicją, należą do nadrodzin receptorów cytokin i, w szczególności, receptorów cechujących się aktywnością kinazy tyrozynowej (receptory kinaz tyrozynowych), nadrodzin receptorów hematopoetyny oraz nadrodzin czynnika wzrostu nerwów, i cząsteczek adhezji komórkowej, np. selektyn (E-, L-i P-selektyny).

Termin „domena wiążąca receptor stosowany jest w celu określenia jakiegokolwiek natywnego ligandu receptora, włączając cząsteczki adhezji komórkowej, lub jakikolwiek region lub pochodną takiego natywnego ligandu o zachowanej, przynajmniej jakościowo, względem natywnego ligandu, zdolności wiązania receptora. Definicja ta, między innymi, dotyczy specyficznie sekwencji wiążących ligandów dla wyżej wymienionych receptorów.

„Chimera przeciwciało-immunoadhezyna obejmuje cząsteczkę stanowiącą połączenie przynajmniej jednej domeny wiążącej przeciwciała (zgodnie z niniejszą definicją) z przynajmniej jedną immunoadhezyną (zgodnie z niniejszą definicją). Przykładowymi chimerami przeciwciało-immunoadhezyna są bispecyficzne chimery CD4-IgG, opisane przez Berg i wsp., PNAS (USA), 88: 4723-4727 (1991) oraz Chamów i wsp., J.Immunol. 153: 4268 (1994).

„Wyizolowany polipeptyd jest zidentyfikowanym i wydzielonym i/lub odzyskanym polipeptydem ze składnika jego naturalnego środowiska. Składnikami stanowiącymi zanieczyszczenie naturalnego środowiska polipeptydu są materiały, mogące kolidować z diagnostycznym lub terapeutycznym zastosowaniem polipeptydu, i mogą one obejmować enzymy, hormony i inne białkowe lub niebiałkowe substancje rozpuszczone. W zalecanych wykonaniach polipeptyd podlega oczyszczeniu (1) na poziomie ponad 95% wagowo, określonym metodą Lowry'ego i w szczególności, ponad 99% wagowo, (2) w stopniu wystarczającym do uzyskania, za pomocą sekwentatora (spinning cup sequentator), co najmniej 15 reszt z N-końca lub wewnętrznej sekwencji aminokwasowej, lub (3) do homogenności, w warunkach redukującej i nieredukującej elektroforezy SDS-PAGE z wykorzystaniem Coomassie blue lub, dogodnie, barwiona srebrem. Wyizolowany polipeptyd obejmuje polipeptyd in situ w komórkach rekombinowanych, ponieważ nie będzie obecny przynajmniej jeden składnik naturalnego środowiska polipeptydu. Jednakże, zazwyczaj, wyizolowany polipeptyd otrzymywany jest w wyniku co najmniej jednego etapu oczyszczania.

„Leczenie odnosi się zarówno do leczenia terapeutycznego, jak i środków profilaktycznych lub zapobiegawczych. Osobniki potrzebujące leczenia obejmują zarówno osobniki chore, jak i osobniki, u których należy zapobiegać zaburzeniu.

„Zaburzenie jest dowolnym stanem, w którym leczenie za pomocą wariantu polipeptydu może spowodować poprawę. Obejmuje to przewlekłe i ostre zaburzenia lub choroby, włączając stany patologiczne predysponujące do pojawienia się rozważanego zaburzenia u ssaka. W jednym z wykonań zaburzenie jest nowotworem.

Termin „nowotwór i „nowotworowy odnosi się do, lub opisuje, stan fizjologiczny organizmu ssaka zazwyczaj cechujący się niekontrolowanym wzrostem komórek. Przykłady nowotworów obejmu14

PL 209 786 B1 ją, lecz bez ograniczenia, raka, chłoniaka, blastomę, mięsaka i białaczkę. Bardziej szczegółowe przykłady takich nowotworów obejmują raka płaskokomórkowego, raka drobnokomórkowego płuc, raka niedrobnokomórkowego płuc, gruczolakoraka płuc, raka płaskonabłonkowego płuc, raka otrzewnej, raka komórek wątroby, raka żołądkowo-jelitowego, raka trzustki, glejaka, raka szyjki macicy, raka jajników, raka wątroby, raka pęcherza, wątrobiaka, raka piersi, raka okrężnicy, raka jelita grubego, raka śluzówki macicy lub macicy, raka ślinianek, raka nerek, raka prostaty, raka sromu, raka tarczycy, raka wątrobowego oraz różnych typów nowotworów głowy i szyi.

„Rak z ekspresją HER2 jest nowotworem zawierającym komórki posiadające białko receptora HER2 (Semba i wsp., PNAS (USA) 82: 6497-6501 (1985) oraz Yamamoto i wsp., Nature 319: 230-234 (1986) (Genebank, numer dostępu X03363)) obecne na powierzchni tych komórek, co powoduje, że możliwe jest wiązanie z tymi komórkami przeciwciała skierowanego przeciwko HSR2.

Słowo „znacznik odnosi się do wykrywalnego związku lub kompozycji, połączonych bezpośrednio lub pośrednio z polipeptydem. Znacznik może być sam w sobie wykrywalny (np. znaczniki radioizotopowe lub znaczniki fluoroscencyjne) lub, w przypadku znacznika enzymatycznego, może katalizować chemiczne zmiany w obrębie wykrywanego związku substratu lub kompozycji.

„Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego jest cząsteczką kwasu nukleinowego zidentyfikowaną i oddzieloną od przynajmniej jednej będącej zanieczyszczeniem cząsteczki kwasu nukleinowego, z którą jest zazwyczaj związana w naturalnym źródle kwasu nukleinowego polipeptydu. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego jest inną cząsteczką niż w postaci lub zestawie występującym w naturze. Wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego są zatem inne niż cząsteczki kwasu nukleinowego występujące w naturalnych warunkach. Jednakże, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego znajdującą się w komórkach, które zazwyczaj ekspresjonują polipeptyd, na przykład, cząsteczka kwasu nukleinowego znajduje się w lokalizacji chromosomowej innej niż w naturalnych komórkach.

Termin „sekwencje kontrolne odnosi się do sekwencji DNA niezbędnych do ekspresji operacyjnie połączonej sekwencji kodującej w organizmie szczególnego gospodarza. Odpowiednie dla organizmów prokariotycznych sekwencje kontrolne, na przykład, zawierają promotor, ewentualnie, sekwencję operatorową i miejsce wiązania rybosomu. Wiadomo, że komórki eukariotyczne wykorzystują promotory, sygnały poliadenylacji i sekwencje wzmacniaczy.

Kwas nukleinowy jest „operacyjnie połączony gdy umieszczony jest w funkcjonalnej zależności z inną sekwencją kwasu nukleinowego. Na przykład, DNA presekwencji lub liderowej sekwencji wydzielniczej jest operacyjnie połączony z DNA polipeptydu jeśli ten DNA ekspresjonowany jest jako białko uczestniczące w wydzielaniu tego polipeptydu; promotor lub wzmacniacz jest operacyjnie połączony z sekwencją kodującą jeżeli oddziałuje na transkrypcję tej sekwencji; lub miejsce wiązania rybosomu jest operacyjnie połączone z sekwencją kodującą jeśli jego lokalizacja ułatwia translację. Ogólnie, „operacyjnie połączony oznacza, że związane sekwencje DNA są ciągłe, a w przypadku liderowej sekwencji wydzielniczej ciągłe i w ramce odczytu. Jednakże, wzmacniacze nie muszą być ciągłe. Łączenie przeprowadza się poprzez ligację w odpowiednich miejscach restrykcyjnych. W przypadku gdy takie miejsca nie istnieją, stosuje się, zgodnie z przyjętymi metodami, syntetyczne oligonukleotydowe sekwencje adaptorowe lub łączniki.

Wyrażenie „komórka, „linia komórkowa i „hodowla komórkowa stosowane są w niniejszym opisie zamiennie i wszystkie te określenia obejmują potomstwo. Zatem, termin „transformanty i „komórki transformowane obejmuje pierwotne komórki i pochodzące z nich hodowle, bez względu na liczbę pasaży. Przyjmuje się też, że, na skutek zaplanowanych i przypadkowych mutacji, nie całe potomstwo musi posiadać dokładnie identyczną zawartość DNA. Objęte tą definicją jest potomstwo, które posiada taką samą funkcję lub aktywność biologiczną jak pierwotnie transformowane komórki. W przypadku stosowania odmiennych znaczeń, ich znaczenie jest zrozumiałe z kontekstu opisu.

Stosowany tu termin „kompleks molekularny odnosi się do względnie stabilnej struktury utworzonej w wyniku wiązania dwóch lub więcej heterologicznych cząsteczek (np. polipeptydów) (dogodnie połączonych wiązaniem niekowalencyjnym). Zalecanym tu kompleksem molekularnym jest kompleks immunologiczny.

„Kompleks immunologiczny odnosi się do względnie stabilnej struktury utworzonej w wyniku połączenia przynajmniej jednej docelowej cząsteczki i przynajmniej jednego polipeptydu zawierającego region Fc. Takie połączenie powoduje powstanie kompleksu o wyższej masie cząsteczkowej. Przykładami kompleksów immunologicznych są agregaty antygen-przeciwciało i agregaty cząsteczka docelowa-immunoadhezyna. Stosowany tu termin „kompleks immunologiczny w wypadku jeśli nie został

PL 209 786 B1 określony inaczej, odnosi się do kompleksu ex vivo (tj. różnego od postaci lub ułożenia występującego w naturze). Jednakże, kompleks immunologiczny może być podawany ssakom, np. w celu oszacowania klirensu kompleksu immunologicznego u ssaka.

Termin „cząsteczka docelowa odnosi się do cząsteczki, zazwyczaj polipeptydu, zdolnej do wiązania przez cząsteczkę heterologiczną, i posiadającej jedno lub więcej miejsc wiążących dla cząsteczki hetrologicznej. Termin „miejsce wiążące odnosi się do regionu cząsteczki, z którym możliwe jest związanie innej cząsteczki. „Pierwsza cząsteczka docelowa obejmuje przynajmniej dwa różne miejsca wiążące (na przykład, dwa do pięciu oddzielnych miejsc wiążących) dla analizowanej cząsteczki (np. polipeptyd zawierający region Fc), takie, że przynajmniej dwie analizowane cząsteczki mogą ulec związaniu z pierwszą cząsteczką docelową. W zalecanym wykonaniu, dwa lub więcej miejsc wiążących jest identycznych (np. posiadający taką samą sekwencję aminokwasową, gdy cząsteczka docelowa jest polipeptydem). W poniżej zamieszczonym Przykładzie 1 pierwszą cząsteczką docelową jest IgE, posiadająca dwa oddzielne miejsca wiążące w jej regionie Fc, z którymi może ulec związaniu polipeptyd posiadający region Fc (przeciwciało skierowane przeciwko IgE, E27). Inne pierwsze cząsteczki docelowe obejmują dimery składające się z zasadniczo identycznych monomerów (np. neurotrofiny, IL8 i VEGF) lub są polipeptydami zawierającymi dwa lub więcej zasadniczo identycznych łańcuchów polipeptydowych (np. przeciwciała lub immunoadhezyny). „Druga cząsteczka docelowa obejmuje przynajmniej dwa oddzielne miejsca wiążące (na przykład, dwa do pięciu oddzielnych miejsc wiążących) dla pierwszej cząsteczki docelowej, takie, że przynajmniej dwie pierwsze cząsteczki docelowe mogą ulec związaniu z drugą cząsteczką docelową. Dogodnie dwa lub więcej miejsca wiążące są identyczne (np. posiadają taką samą sekwencję aminokwasową, gdy docelowa cząsteczka jest polipeptydem). W Przykładzie 2, drugą cząsteczką docelową jest VEGF, posiadająca parę oddzielnych miejsc wiążących, do których może ulec przyłączeniu domena zmienna przeciwciała IgE. Innymi drugimi cząsteczkami docelowymi są np. inne dimery składające się z zasadniczo identycznych monomerów (np. neurotrofiny lub IL8) lub polipeptydy zawierające dwa lub więcej zasadniczo identycznych domen (np. przeciwciała lub immunoadhezyny).

„Analit jest substancją poddawaną analizie. Zalecanym analitem jest polipeptyd zawierający region Fc, który ma być analizowany pod kątem jego zdolności do wiązania receptora Fc.

„Receptor jest polipeptydem zdolnym do wiązania przynajmniej jednego ligandu. Zalecanym receptorem jest receptor powierzchni komórkowej, posiadający zewnątrzkomórkową domenę wiążącą ligand i, ewentualnie, inne domeny (np. domenę przezbłonową, domenę wewnątrzkomórkową i/lub domenę zakotwiczoną w błonie komórkowej). Oceniany w tym teście receptor może być stosowany w całości lub jako jego fragment, lub też pochodna (np. białko fuzyjne zawierające domenę wiążącą receptora połączone z jednym lub więcej heterologicznym polipeptydem). Ponadto, receptor oceniany pod kątem właściwości wiązania może być obecny w komórce lub w postaci wyizolowanej i, ewentualnie, analizowany na płytkach lub innych stałych fazach.

Wyrażenie „receptor o niskim powinowactwie dotyczy receptora o słabym powinowactwie wiązania badanego ligandu, np. posiadającego stałą wiązania wynoszącą około 50 nM lub słabsze powinowactwo. Przykłady receptorów o niskim powinowactwie obejmują FcyRII i FcyRIII.

II. Sposoby wykonania wynalazku

Zgodnie z wynalazkiem opisano sposób otrzymywania wariantu polipeptydu. „Macierzysty, „wyjściowy lub „niezmieniony polipeptyd wytwarza się za pomocą znanych w dziedzinie technik wytwarzania polipeptydów zawierających region Fc. W zalecanym wykonaniu polipeptyd macierzysty jest przeciwciałem, a przykładowe sposoby otrzymywania przeciwciał opisano bardziej szczegółowo w kolejnych podrozdziałach. Polipeptyd macierzysty może, jednakże, być jakimkolwiek polipeptydem zawierającym region Fc, np. cząsteczką immunoadhezyny. Sposoby otrzymywania immunoadhezyny omówiono szczegółowo poniżej.

W alternatywnym wykonaniu wariant regionu Fc może być otrzymany zgodnie ze sposobami zawartymi w niniejszym opisie i taki „wariant regionu Fc może być poddany fuzji z wybranym heterologicznym polipeptydem, takim jak domena zmienna przeciwciała lub domena wiążąca receptora lub ligandu.

Polipeptyd macierzysty zawiera region Fc. Ogólnie, region Fc macierzystego polipeptydu zawiera natywną sekwencję regionu Fc i dogodnie, ludzką natywną sekwencję regionu Fc. Jednakże, region Fc macierzystego polipeptydu może posiadać jedną lub więcej istniejących wcześniej zmian w sekwencji aminokwasowej lub modyfikacji w stosunku do natywnego regionu Fc. Na przykład, aktywność wiążąca C1q regionu Fc może być uprzednio zmieniona (inne rodzaje modyfikacji regionu Fc

PL 209 786 B1 opisano bardziej szczegółowo poniżej). W kolejnym rozwiązaniu region Fc macierzystego polipeptydu istnieje na poziomie „koncepcyjnym, podczas gdy region ten fizycznie nie istnieje, projektant przeciwciała może zdecydować co do wyboru pożądanej sekwencji aminokwasowej regionu Fc i otrzymać polipeptyd zawierający sekwencję lub DNA kodujący pożądaną sekwencję aminokwasową wariantu regionu Fc.

Jednakże w zalecanym rozwiązaniu kwas nukleinowy kodujący region Fc macierzystego polipeptydu jest dostępny i, w celu uzyskania wariantu sekwencji kwasu nukleinowego kodującego wariant regionu Fc, sekwencja tego kwasu jest poddawana zmianie.

DNA kodujący wariant sekwencji aminokwasowej wyjściowego polipeptydu otrzymywany jest w wyniku zastosowania różnych, znanych w dziedzinie, sposobów. Sposoby te obejmują, lecz bez ograniczenia, ukierunkowaną (lub zależną od oligonukleotydu) mutagenezę, mutagenezę PCR i mutagenezę kasetową uprzednio otrzymanego DNA kodującego polipeptyd.

Mutageneza ukierunkowana jest zalecanym sposobem otrzymywania wariantów substytucyjnych. Technika ta jest dobrze znana w dziedzinie (patrz np. Carter i wsp., Nucleic Acids Res. 13: 4431-4443 (1935) oraz Kunkel i wsp., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82: 488 (1987)). W skrócie, podczas mutagenezy ukierunkowanej DNA zmianie ulega najpierw wyjściowy DNA, na drodze hybrydyzacji oligonukleotydu kodującego pożądaną mutację z pojedynczą nicią tego wyjściowego DNA. Po hybrydyzacji, stosowana jest polimeraza DNA, służąca syntezie całości drugiej nici, przy pomocy przyłączonego na etapie hybrydyzacji oligonukleotydu jako startera i pojedynczej nici wyjściowego DNA jako matrycy. Zatem, w rezultacie, oligonukleotyd kodujący pożądaną mutację zostaje wbudowany w uzyskany w ten sposób dwuniciowy DNA.

Mutageneza PCR jest również odpowiednia w celu uzyskania wariantów sekwencji aminokwasowej wyjściowego polipeptydu. Patrz, Higuchi, PCR Protocols, str. 177-183 (Academic Press, 1990) oraz Vallette i wsp., Nucl.Acids Res. 17: 723-733 (1989). W skrócie, w przypadku zastosowania małych ilości matrycowego DNA jako materiału wyjściowego w PCR, w celu uzyskania względnie dużych ilości specyficznego fragmentu DNA, różniącego się od sekwencji matrycy jedynie w pozycjach, w których startery różnią się od matrycy, stosuje się startery o jedynie nieznacznie zmienionej sekwencji, w stosunku do odpowiadającego im regionu na matrycy DNA.

Innym sposobem otrzymywania wariantów jest mutageneza kasetowa, oparta na technice opisanej przez Wells i wsp., Gene 34: 315-323 (1985). Wyjściowy materiał jest plazmidem (lub innym wektorem) zawierającym poddawany mutagenezie wyjściowy polipeptyd DNA. W poddawanym mutagenezie wyjściowym DNA identyfikowany jest kodon lub kodony. Po obu stronach wskazanego miejsca lub miejsc mutacji powinno znajdować się unikalne miejsce dla endonukleazy restrykcyjnej. W przypadku gdy takie miejsca nie istnieją, można je utworzyć za pomocą opisanych powyżej metod mutagenezy zależnej od oligonukleotydu, pozwalających na wprowadzenie takich miejsc w odpowiednim położeniu w wyjściowym polipeptydzie DNA. Następnie, w celu linearyzacji, plazmidowy DNA jest w tych miejscach poddawany trawieniu. Dwuniciowy oligonukleotyd kodujący sekwencję DNA znajdującą się pomiędzy miejscami restrykcyjnymi, lecz również zawierający pożądaną mutację lub mutacje syntetyzowany jest za pomocą standardowych procedur, w których dwie nici oligonukleotydu syntetyzowane są oddzielnie, a następnie poddawane wzajemnej hybrydyzacji za pomocą standardowych technik. Dwuniciowy oligonukleotyd określany jest jako kaseta. Kaseta ta zaprojektowana jest w taki sposób, żeby zawierała końce 5' i 3' kompatybilne z końcami zlinearyzowanego plazmidu, co pozwala na bezpośrednie włączenie jej do plazmidu. W rezultacie plazmid zawiera zmutowaną sekwencję DNA.

Alternatywnie, lub dodatkowo, możliwe jest określenie pożądanej sekwencji aminokwasowej, kodującej wariant polipeptydu i otrzymanie na drodze syntezy sekwencji kwasu nukleinowego kodującej wariant takiej sekwencji aminokwasowej.

W celu otrzymania wariantu regionu Fc o zmienionym powinowactwie wiązania receptora Fc lub aktywności in vitro i/lub in vivo i/lub zmienionej aktywności cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC) in vitro i/lub in vivo, sekwencję aminokwasową macierzystego polipeptydu poddaje się modyfikacji.

Ogólnie, modyfikacja obejmuje jedną lub więcej substytucji aminokwasowych. W jednym z rozwiązań zastąpiona reszta nie odpowiada żadnej reszcie w tej samej pozycji w jakimkolwiek z regionów Fc o natywnej sekwencji przedstawionych na Figurze 22A. Na przykład, zgodnie z tym rozwiązaniem, Pro331 z regionu ludzkiej IgG3 lub IgG1, zastąpiona jest inną niż seryna resztą (odpowiadająca jej przyrównana reszta w natywnej sekwencji ludzkiej IgG4). W jednym z rozwiązań reszta z polipeptydu

PL 209 786 B1 macierzystego, która zastąpiona jest inną resztą jest inna niż alanina i/lub nie jest resztą Ala339 z regionu Fc. W przypadku substytucji aminokwasowej zalecane jest by reszta macierzystego polipeptydu zastąpiona była resztą alaniny. Jednakże, zgodnie z niniejszym wynalazkiem brana jest pod uwagę substytucja reszty macierzystego polipeptydu jakąkolwiek inną resztą aminokwasową. Substytucja może, na przykład, mieć charakter „substytucji konserwatywnej. Takie konserwatywne substytucje zaprezentowano w Tabeli 1, pod nagłówkiem „zalecane substytucje. Bardziej istotne zmiany mogą być uzyskane w wyniku jednego lub więcej „przykładowych substytucji, które nie należą do zalecanych podstawień zawartych w Tabeli 1.

T a b e l a 1

Pierwotna reszta	Przykładowe substytucje	Zalecane substytucje
Ala (A)	val; leu; ile	val
Arg (R)	lys; gln; asn	lys
Asn (N)	gln; his; lys; arg	gln
Asp (D)	glu	glu
Cys (C)	ser	ser
Gln (Q)	asn	asn
Glu (E)	asp	asp
Gly (G)	pro; ala	ala
His (H)	asn; gln; lys; arg	arg
Ile (I)	leu, val, met; ala; phe; norleucyna	leu
Leu (L)	norleucyna; ile; val; met, ala, phe	ile
Lys (K)	arg; gln; asn	arg
Met (M)	leu; phe; ile	leu
Phe (F)	leu; val; ile, ala; tyr	leu
Pro (P)	ala	ala
Ser (S)	thr	thr
Thr (T)	ser	ser
Trp (W)	tyr; phe	tyr
Tyr (Y)	trp; phe; thr; ser	phe
Val (V)	ile; leu; met; phe; ala; norleucyna	leu

Istotne modyfikacje właściwości biologicznych regionu Fc można uzyskać w wyniku selekcji substytucji wywołujących silnie zróżnicowany efekt na utrzymanie (a) struktury szkieletu polipeptydu w obszarze substytucji, na przykład, konformacji harmonijki lub struktury helisy, (b) ładunku lub hydrofobowości cząsteczki w miejscu docelowym, lub (c) objętości łańcuchów bocznych. Naturalnie występujące reszty aminokwasowe podzielono na grupy w oparciu o wspólne właściwości łańcucha bocznego.

(1) hydrofobowe: norleucyna, met, ala, val, leu, ile;

(2) obojętne hydrofilowe: cys, ser, thr;

(3) kwaśne: asp, glu;

(4) zasadowe: asn, gln, his, lys, arg;

PL 209 786 B1 (5) reszty wpływające na ułożenie łańcucha: gly, pro, i (6) aromatyczne: trp, tyr, phe.

Substytucje o charakterze niekonserwatywnym dotyczą wymiany reszty należącej do jednej z tych klas na resztę należącą do innej klasy. Przykłady konserwatywnych i niekonserwatywnych substytucji aminokwasowych przedstawiono poniżej w Tabeli 8.

Jak pokazano w Przykładzie 4, możliwe jest utworzenie wariantu regionu Fc o zmienionym powinowactwie wiązania jednego lub więcej FcR. Jak zademonstrowano w tym Przykładzie, możliwe jest uzyskanie różnych klas wariantów regionu Fc, np. przedstawionych w poniższej tabeli. W przypadku gdy wariant regionu Fc posiada więcej niż jedną substytucję aminokwasową, ogólnie, lecz niekoniecznie, łączy się substytucje aminokwasowe w tych samych klasach w celu uzyskania pożądanego efektu.

T a b e l a 2

Klasy wariantów regionu Fc

Klasa	Właściwość wiązania FcR	Pozycja substytucji w regionie Fc
1A	zredukowane wiązanie wszystkich FcyR	238, 265, 269, 270, 297*, 327, 329
1B	zredukowane wiązanie zarówno FcyRII, jak i FcyRIII	239, 294, 295, 303, 338, 373, 376, 416, 435
2	wzmocnione wiązanie zarówno FcyRII, jak i FcyRIII	256, 290, 312, 326, 330, 339#, 378, 430
3	wzmocnione wiązanie FcyRII oraz brak efektu na wiązanie FcyRIII	255, 258, 267, 276, 280, 283, 285, 286, 305, 307, 309, 315, 320, 331, 337, 398
4	wzmocnione wiązanie FcyRII oraz zredukowane wiązanie dla FcyRIII	268, 272, 301, 322, 340
5	zredukowane wiązanie FcyRII oraz brak efektu na wiązanie FcyRIII	292, 324, 335, 414, 419, 438, 439
6	zredukowane wiązanie FcyRII oraz wzmocnione wiązanie FcyRIII	298, 333
7	brak efektu na wiązanie FcyRII oraz zredukowane wiązanie FcyRIII	248, 249, 252, 254, 278, 289, 293, 296, 338, 382, 388, 389, 434, 437
8	brak efektu na wiązanie FcyRII oraz wzmocnione wiązanie FcyRIII	334, 360

* wersja deglikozylowana # Zalecane połączenie z inną lub innymi modyfikacjami regionu Fc (np. ujawnionymi w niniejszym opisie)

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem oprócz substytucji aminokwasowych opisano inne modyfikacje sekwencji aminokwasowej macierzystego regionu Fc, które służą do otrzymania wariantów regionu Fc o zmienionej funkcji efektorowej.

W celu zredukowania wiązania z FcR możliwe jest, na przykład, usunięcie jednej lub więcej reszt aminokwasowych regionu Fc. Ogólnie, w celu stworzenia wariantu regionu Fc możliwe jest wycięcie jednej lub więcej reszt regionu Fc, zidentyfikowanych tu jako reszty wpływające na wiązanie FcR (patrz poniżej, Przykład 4). Ogólnie, w takim wykonaniu można wyciąć nie więcej niż jedną do dziesięciu reszt regionu Fc. Opisywany tu region Fc, z delecją jednej lub więcej reszt aminokwasowych, zachowuje dogodnie przynajmniej 80%, i w szczególności przynajmniej 90%, a zwłaszcza przynajmniej 95% sekwencji macierzystego regionu Fc lub natywnej sekwencji ludzkiego regionu Fc.

Możliwe jest również otrzymanie wariantów regoinu Fc o zmienionej funkcji efektorowej poprzez insercje aminokwasowe. Na przykład, możliwe jest wprowadzenie przynajmniej jednej reszty aminokwasowej (np. jednej do dwóch reszt aminokwasowych, ogólnie nie więcej niż dziesięciu reszt), w sąsiedztwie jednej lub więcej reszt regionu Fc, zidentyfikowanych tu jako wpływające na wiązanie FcR. Terminem „w sąsiedztwie określa się położenie w odległości jednej do dwóch reszt aminokwasowych od zidentyfikowanych tu reszt regionu Fc. Takie warianty regionu Fc mogą wykazywać wzmocnione lub osłabione wiązanie FcR i/lub aktywność ADCC. W celu otrzymania takich wariantów insercyjnych i racjonalnego zaprojektowania wariantu regionu Fc, np. o wzmocnionym wiązaniu FcR, można dokonać oceny struktury krystalicznej polipeptydu zawierającego region wiążący FcR (np. zewnątrzkomórkowej domeny FcR) będącego przedmiotem zainteresowań i regionu Fc, do którego ma być wstawiona reszta lub reszty aminokwasowe (patrz, na przykład, Deisenhofer, Biochemistry 20(9):

PL 209 786 B1

2361-2370 (1981) oraz Burmeister i wsp., Nature 342: 379-383, (1994)). Taką insercję lub insercje, ogólnie, wprowadza się w obszarze pętli regionu Fc, a nie w obrębie struktur drugorzędowych (tj. w strukturze nici β regionu Fc.

W wyniku wprowadzenia odpowiednich modyfikacji sekwencji aminokwasowej macierzystego regionu Fc możliwe jest otrzymanie wariantu regionu Fc, który (a) skuteczniej uczestniczy w cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC) w obecności ludzkich komórek efektorowych i/lub (b) wiąże receptor gamma Fc (FcyR) z wyższym powinowactwem niż macierzysty polipeptyd. Takie warianty regionu Fc, ogólnie, zawierają przynajmniej jedną modyfikację aminokwasową w regionie Fc. Uważa się, że szczególnie zalecane jest połączenie modyfikacji aminokwasowych. Na przykład, wariant regionu Fc może obejmować dwie, trzy, cztery, pięć, itd. substytucji, np. w specyficznych, zidentyfikowanych tu pozycjach regionu Fc.

Zalecany region Fc macierzystego polipeptydu jest ludzkim regionem Fc, np. natywną sekwencją ludzkiego regionu Fc ludzkiej IgG1 (aliotypy A i nie-A), regionu Fc IgG2, IgG3 lub IgG4. Sekwencje te przedstawiono na Figurze 23.

W celu uzyskania regionu Fc o wzmocnionej aktywności ADCC, polipeptyd macierzysty powinien, dogodnie, wykazywać już wcześniej aktywność ADCC, np. posiadać region Fc ludzkiej IgG1 lub ludzkiej IgG3. W jednym rozwiązaniu wariant o wzmocnionej ADCC uczestniczy w ADCC istotnie skuteczniej niż przeciwciało o natywnej sekwencji regionu Fc IG1 lub IgG3 i regionu wiążącego antygen wariantu. Dogodnie, wariant zawiera substytucje dwóch lub trzech reszt w pozycjach 298, 333 i 334 regionu Fc, dogodniej mogą to być jedyne substytucje. Dogodnie substytucji poddaje się reszty w pozycjach 298, 333 i 334 (np. resztami alaniny). Ponadto, w celu otrzymania wariantu regionu Fc o wzmocnionej aktywności ADCC, możliwe jest ogólnie, otrzymanie wariantu regionu Fc o wzmocnionym powinowactwie wiązania FcyRIII, który uważany jest za istotny FcR w procesie ADCC. Na przykład, w celu otrzymania takiego wariantu, możliwe jest wprowadzenie modyfikacji aminokwasowej (np. substytucji) w obrębie macierzystego regionu Fc w jakiejkolwiek jednej lub więcej pozycjach aminokwasowych 256, 290, 298, 312, 326, 330, 333, 334, 360, 378 lub 430. Wariant o wzmocnionym powinowactwie wiązania FcyRIII może ponadto wykazywać zredukowane powinowactwo wiązania FcyRII, w szczególności zredukowane powinowactwo dla hamującego receptora FcyRIIB.

Modyfikację lub modyfikacje aminokwasowe dogodnie wprowadza się w domenie CH2 regionu Fc, ponieważ ujawnione tu doświadczenia wskazują, że domena CH2 jest istotna dla aktywności wiązania FcR. Ponadto, odmiennie niż w cytowanej powyżej literaturze, w niniejszym zgłoszeniu rozważane jest wprowadzanie modyfikacji w części regionu FC innej niż niższy region zawiasowy.

Użyteczne do modyfikacji celem otrzymania wariantu regionu Fc IgG o zmienionym powinowactwie wiązania receptora gamma (FcyR) lub aktywności pozycje aminokwasowe obejmują jedną lub więcej spośród następujących pozycji aminokwasowych: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 lub 439 regionu Fc. W celu otrzymania takich wariantów, stosowany jako matryca region macierzysty Fc dogodnie zawiera region Fc ludzkiej IgG. W przypadku substytucji reszty 331, region macierzysty Fc, dogodnie, nie jest natywną sekwencją ludzkiej IgG3, lub gdy wariant regionu Fc zawiera substytucję w pozycji 331, dogodnie wykazuje on wzrost wiązania FcR, np. FcyRII.

W celu otrzymania wariantu regionu Fc o zredukowanym wiązaniu FcyR możliwe jest wprowadzenie modyfikacji aminokwasowej w jakiejkolwiek, jednej lub więcej, pozycji aminokwasowej spośród 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 lub 439 regionu Fc.

Warianty cechujące się zredukowanym wiązaniem FcyRI, obejmują te warianty, które zawierają modyfikację aminokwasową regoinu FC w jakiejkolwiek, jednej lub więcej, spośród pozycji aminokwasowych 238, 265, 269, 270, 327 lub 329.

Warianty wykazujące zredukowane wiązanie FcyRII obejmują te warianty, które zawierają modyfikację aminokwasową regionu Fc w jakiejkolwiek, jednej lub więcej, spośród pozycji aminokwasowych 238, 265, 269, 270, 292, 294, 295, 298, 303, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 373, 376, 414, 416, 419, 435, 438 lub 439.

Warianty regionu Fc wykazujące zredukowane wiązanie FcyRIII obejmują te warianty, które zawierają modyfikację aminokwasową regionu FC w jakiejkolwiek, jednej lub więcej, spośród pozycji

PL 209 786 B1 aminokwasowych 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 293, 294, 295, 296, 301, 303, 322, 327, 329, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 416, 434, 435 lub 437.

Możliwe jest również otrzymanie wariantów o wzmocnionym wiązaniu jednego lub więcej FcyR. Takie warianty regionu Fc mogą zawierać, modyfikację aminokwasową w jakiejkolwiek, jednej lub więcej, spośród pozycji aminokwasowych 255, 256, 258, 267, 268, 272, 276, 280, 283, 285, 286, 290, 298, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 326, 330, 331, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398 lub 430 regionu Fc.

Na przykład, wariant o wzmocnionej aktywności wiązania FcyR może wykazywać silniejsze wiązanie z FcyRIII i, ewentualnie, może również cechować się zredukowanym wiązaniem z FcyRII; np. wariant może zawierać modyfikację aminokwasową w pozycji 298 i/lub 333 regionu Fc.

Warianty wykazujące wzmocnione wiązanie FcyRII obejmują te warianty, które zawierają modyfikację aminokwasową w jakiejkolwiek, jednej lub więcej, spośród pozycji aminokwasowych 255, 256, 258, 267, 268, 272, 276, 280, 283, 235, 286, 290, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 326, 330, 331, 337, 340, 378, 398 lub 430 regionu Fc. Takie warianty mogą również cechować się zredukowanym wiązaniem FcyRIII. Na przykład, mogą one zawierać modyfikację aminokwasową regionu Fc w jakiejkolwiek, jednej lub więcej, spośród pozycji aminokwasowych 268, 272, 298, 301, 322 lub 340.

Chociaż zmiana wiązania FcyR jest zalecana, to rozważa się tu również warianty regionu Fc o zmienionym powinowactwie wiązania noworodkowego receptora (FcRn). Uważa się, że warianty regionu Fc o zwiększonym powinowactwie wiązania FcRn posiadają dłuższy okres półtrwania w surowicy i takie cząsteczki są użyteczne w sposobach leczenia ssaków, gdzie pożądany jest długi okres półtrwania podawanego polipeptydu, np. w leczeniu przewlekłych chorób lub zaburzeń. Przeciwnie, oczekuje się, że warianty regionów Fc o zredukowanym powinowactwie wiązania FcRn posiadają krótszy okres półtrwania, i tego typu cząsteczki mogą, na przykład, być podawane ssakom w sytuacjach gdy zalecany jest skrócony okres półtrwania w krążeniu, np. w celu obrazowania diagnostycznego in vivo lub w przypadku polipeptydów wywołujących toksyczne skutki uboczne podczas krążenia przez dłuższy czas w krwioobiegu, itp. W wypadku wariantów regionu Fc o obniżonym powinowactwie wiązania FcRn jest mniej prawdopodobne, że przekroczą one łożysko i mogą być zatem użyteczne w leczeniu chorób i zaburzeń u kobiet w ciąży.

Warianty regionu Fc o zmienionym powinowactwie wiązania FcRn obejmują te warianty, które posiadają modyfikację aminokwasową w jakiejkolwiek, jednej lub więcej, spośród pozycji aminokwasowych 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 lub 447. Te, które wykazują zredukowane wiązanie FcRn obejmują ogólnie modyfikację aminokwasową regionu Fc w jakiejkolwiek, jednej lub więcej, spośród pozycji aminokwasowych 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 lub 447, natomiast te, które cechują się wzmocnionym wiązaniem FcRn obejmują zazwyczaj modyfikację aminokwasową regionu Fc w jakiejkolwiek, jednej lub więcej, spośród pozycji aminokwasowych 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 282, 413, 424 lub 434.

Wariant lub warianty polipeptydu otrzymane zgodnie z powyższym opisem mogą być poddane dalszym modyfikacjom, często zależnym od przewidywanego zastosowania polipeptydu. Modyfikacje te mogą obejmować dalsze zmiany sekwencji aminokwasowej (substytucję, insercję i/lub delecję reszt aminokwasowych), fuzję z heterologicznym polipeptydem lub polipeptydami heterologicznymi i/lub modyfikacje kowalencyjne. Takie „dalsze modyfikacje mogą być wprowadzane wcześniej, równolegle lub po opisanej powyżej modyfikacji lub modyfikacjach aminokwasowych, w których efekcie następuje zmiana wiązania receptora Fc i/lub aktywności ADCC. W jednym rozwiązaniu możliwe jest połączenie opisywanej tu modyfikacji regionu Fc z substytucjami w regionie Fc, ujawnionymi w cytowanych publikacjach w opisie stanu techniki niniejszego zgłoszenia.

Alternatywnie, lub dodatkowo, użyteczne może być połączenie powyższych modyfikacji aminokwasowych z jedną lub więcej dalszych modyfikacji aminokwasowych, zmieniających wiązanie C1q i/lub funkcję cytotoksyczności zależnej od dopełniacza regionu Fc.

Wyjściowym polipeptydem będącym tu przedmiotem zainteresowania jest zazwyczaj polipeptyd, który wiąże się z C1q i wykazuje cytotoksyczność zależną od dopełniacza (CDC). Dalsze, ujawnione powyżej, substytucje aminokwasowe służą ogólnie zmianie zdolności wyjściowego polipeptydu wiązania C1q i/lub modyfikacji jego funkcji cytotoksyczności zależnej od dopełniacza, np. w celu zredukowania, a w szczególności zniesienia, tych funkcji efektorowych. Jednakże, rozważane są tu również polipeptydy zawierające substytucje w jednej lub więcej spośród opisanych pozycji i wykazujące

PL 209 786 B1 wzmocnione wiązanie C1q i/lub funkcję cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC). Na przykład, wyjściowy polipeptyd może być niezdolny do wiązania C1q i/lub uczestniczenia w CDC a w wyniku zastosowania opisywanych tu modyfikacji możliwe jest nadanie mu tych funkcji efektorowych. Ponadto, polipeptydy posiadające wcześniej aktywność wiązania C1q, i, ewentualnie, zdolność uczestniczenia w CDC, mogą zostać poddane modyfikacjom, w wyniku których jedna, lub obie, z tych funkcji ulegną wzmocnieniu.

W celu otrzymania regionu Fc o zmienionym wiązaniu C1q i/lub funkcji cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC) do modyfikacji wybiera się ogólnie reszty aminokwasowe spośród pozycji łańcucha ciężkiego 270, 322, 326, 327, 329, 331, 333 i 334, przy czym numeracja w łańcuchu ciężkim IgG jest zgodna z indeksem EU według Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). W jednym rozwiązaniu w celu otrzymania wariantu polipeptydu o zmienionym wiązaniu C1q i/lub funkcji cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC) zmianie poddawana jest jedynie jedna z ośmiu wymienionych powyżej pozycji. W tym przypadku, zmianie podlega dogodnie jedynie reszta 270, 329 lub 322. Alternatywnie, modyfikowane mogą być dwie lub więcej spośród wymienionych reszt. W przypadku gdy substytucje mają być połączone, ogólnie łączy się substytucje zwiększające wiązanie ludzkiego C1q (np. reszty w pozycjach 326, 327, 333 i 334) lub osłabiające wiązanie ludzkiego C1q (np. reszty w pozycjach 270, 322, 329 i 331). W kolejnym rozwiązaniu możliwa jest substytucja wszystkich czterech pozycji (tj. 270, 322, 329 i 331). W celu otrzymania polipeptydu o zwiększonej zdolności wiązania ludzkiego C1q, a zwłaszcza wyższej aktywności CDC in vitro lub in vivo, dogodnie łączy się dalsze substytucje w dwóch, trzech lub wszystkich pozycji spośród 326, 327, 333 lub 334, ewentualnie z innymi substytucjami w regionie Fc.

Prolina w pozycji 329 jest konserwatywna w ludzkich IgG. Reszta ta jest dogodnie zastępowana alaniną, jednakże brana jest również pod uwagę substytucja jakimkolwiek innym aminokwasem, np. seryną, treoniną, asparaginą, glicyną lub waliną.

Prolina w pozycji 331 jest konserwatywna w ludzkiej IgG1, IgG2 i IgG3, lecz nie w IgG4 (w której w pozycji 331 występuje seryna). Reszta 331 jest dogodnie zastępowana alaniną lub innym aminokwasem, np. seryną (dla regionów IgG innych niż IgG4), glicyną lub waliną.

Lizyna 322 jest konserwatywna w ludzkich IgG i reszta ta jest dogodnie zastępowana resztą alaniny, brana jest również pod uwagę substytucja jakąkolwiek inną resztą aminokwasową, np. seryną, treoniną, glicyną lub waliną.

D270 jest konserwatywna w ludzkich IgG i reszta ta może być zastąpiona inną resztą aminokwasową, np. alaniną, seryną, treoniną, glicyną, waliną lub lizyną.

K326 jest również resztą konserwatywną w ludzkich IgG. Reszta ta może być podstawiona przez inną resztę, w tym, lecz bez ograniczenia, walinę, kwas glutaminowy, alaninę, glicynę, kwas asparaginowy, metioninę lub tryptofan, przy czym zalecany jest tryptofan.

Podobnie, E333 jest również konserwatywna w ludzkich IgG. E333 jest dogodnie zastępowana resztą aminokwasową o mniejszym łańcuchu bocznym, taką jak walina, glicyna, alanina lub seryna, przy czym zalecana jest seryna.

K334 jest resztą konserwatywną w ludzkich IgG, i która może być podstawiona inną resztą, taką jak alanina lub inną resztą.

W ludzkich IgG1 i IgG3 resztą 327 jest alanina. W celu otrzymania wariantu o zwiększonym wiązaniu C1q ta reszta alaniny może być podstawiona inną resztą, taką jak glicyna. W IgG2 i IgG4 resztą 327 jest glicyna, która, w celu osłabienia wiązania C1q, może być zastąpiona alaniną (lub inną resztą).

Jak ujawniono powyżej, możliwe jest zaprojektowanie regionu Fc o zmienionej funkcji efektorowej, np. poprzez modyfikację wiązania C1q i/lub wiązania FcR, a przez to zmianę aktywności CDC i/lub aktywności ADCC. Na przykład, możliwe jest otrzymanie wariantu regionu Fc o wzmocnionym wiązaniu C1q i wzmocnionym wiązaniu FcyRIII; np. wykazującego zarówno podwyższoną aktywność ADCC, jak i podwyższoną aktywność CDC. Alternatywnie, w celu zredukowania lub zniesienia funkcji efektorowych, możliwe jest otrzymanie wariantu regionu Fc o zredukowanej aktywności CDC i/lub zredukowanej aktywności ADCC. W innych rozwiązaniach, możliwe jest nasilenie jedynie jednej z tych aktywności i, ewentualnie, również obniżenie innej aktywności, np. w celu otrzymania wariantu regionu Fc o podwyższonej aktywności ADCC, lecz obniżonej aktywności CDC, i odwrotnie.

W odniesieniu do dalszych zmian sekwencji aminokwasowej, możliwe jest podstawienie jakiejkolwiek reszty cysteiny, która nie jest zaangażowana w utrzymanie odpowiedniej konformacji polipep22

PL 209 786 B1 tydu, ogólnie seryną, w celu zwiększenia stabilności wobec utleniania cząsteczki i zapobiegnięcia powstawania nieprawidłowego sieciowania.

Inny typ substytucji aminokwasowej służy do zmiany wzorca glikozylacji polipeptydu. Można ją uzyskać poprzez delecję jednej lub więcej jednostek węglowodanowych polipeptydu i/lub dodania jednego lub więcej miejsc glikozylacji, nieobecnych uprzednio w polipeptydzie. Glikozylacja polipeptydów związana jest zazwyczaj z powstaniem wiązań poprzez atom N lub atom O. Wiązanie poprzez atom N dotyczy przyłączenia jednostki węglowodanowej do łańcucha bocznego reszty asparaginy. Sekwencje trójpeptydowe, obejmujące reszty takie jak asparagina-X-seryna oraz asparagina-X-treonina, gdzie X jest jakimkolwiek aminokwasem za wyjątkiem proliny, są sekwencjami rozpoznawanymi do enzymatycznego przyłączenia jednostki węglowodanowej do łańcucha bocznego asparaginy. Zatem, obecność dowolnej z tych sekwencji trójpeptydowych w polipeptydzie stwarza potencjalne miejsce glikozylacji. Glikozylacja poprzez wiązanie przez atom O odnosi się do przyłączenia jednego z cukrów N-acetylogalaktozoaminy, galaktozy lub ksylozy do hydroksyaminokwasu, najczęściej seryny lub treoniny, jednakże do tego celu mogą być także wykorzystane 5-hydroksyprolina lub 5-hydroksylizyna. Wprowadzenie miejsc glikozylacji do polipeptydu przeprowadza się dogodnie poprzez zmianę sekwencji aminokwasowej, w wyniku której zawiera ona jedną lub więcej powyżej wymienionych sekwencji trójpeptydowych (dla miejsc N-glikozylacji). Zmiana ta może być dokonana również poprzez dodanie lub substytucję, jednej lub więcej reszt seryny lub treoniny, w pierwotnej sekwencji polipeptydu (dla miejsc O-glikozylacji). Przykładowy wariant glikozylacji posiada substytucję aminokwasową reszty Asn297 łańcucha ciężkiego.

Ponadto, w wyniku jednej lub więcej dalszych substytucji aminokwasowych możliwa jest zmiana klasy, podklasy lub allotypu regionu Fc, co prowadzi, w razie potrzeby, do otrzymania regionu Fc o sekwencji aminokwasowej o wyższej homologii względem innej klasy, podklasy lub allotypu. Na przykład, możliwa jest zmiana mysiego regionu Fc, dająca w rezultacie sekwencję aminokwasową bardziej homologiczną względem ludzkiego regionu Fc; możliwe jest zmodyfikowanie ludzkiego regionu Fc, allotypu nie-A, prowadzące do otrzymania ludzkiego regionu Fc IgG1 allotypu A, itp. W jednym rozwiązaniu w regionie Fc przeprowadza się modyfikację lub modyfikacje aminokwasowe w domenie CH2, które zmieniają wiązanie FcR i/lub aktywność ADCC oraz poddaje się delecji domenę CH3, lub zastępuje się ją inną domeną dimeryzacji. Dogodnie jednak domena CH3 pozostaje (oprócz ujawnionych tu modyfikacji aminokwasowych, wywołujących zmianę funkcji efektorowej).

Wariant polipeptydu może być poddany jednej lub więcej analizom pozwalającym na oszacowanie jakiejkolwiek zmiany aktywności biologicznej w porównaniu do aktywności wyjściowego polipeptydu.

Wariant polipeptydu dogodnie zachowuje zasadniczo zdolność wiązania antygenu w porównaniu do polipeptydu niezmienionego, tj. zdolność wiązania nie ulega więcej niż 23-krotnemu obniżeniu, np. nie ulega obniżeniu większemu niż około 5-krotnemu w porównaniu do polipeptydu niezmienionego. Zdolność wiązania wariantu polipeptydu może być określona za pomocą takich technik jak np. sortowanie fluorescencyjnie aktywowanych komórek (FACS) lub radioimmunoprecypitacja (RIA).

Możliwe jest określenie zdolności wariantu polipeptydu do wiązania FcR. W przypadku gdy receptor FcR jest receptorem Fc o wysokim powinowactwie FR, takim jak FcyRI, FcRn lub FcyRIIIAV158, wiązanie to może być mierzone poprzez miareczkowanie monomeru wariantu polipeptydu i pomiar związanego wariantu polipeptydu za pomocą specyficznie łączącego się z wariantem polipeptydu w standardowym teście ELISA przeciwciała (patrz, poniżej, Przykład 2). Inną analizę wiązania FcR w przypadku FcR o niskim powinowactwie opisano w Przykładach 1 i 4.

W celu określenia aktywności ADCC wariantu polipeptydu analizę ADCC in vitro, taką jak w Przykładzie 4, można przeprowadzić z użyciem różnych stosunków komórka efektorowa: komórka docelowa. Użytecznymi do takich analiz komórkami efektorowymi:komórkami docelowymi są jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) oraz komórki NK. Alternatywnie, lub dodatkowo, aktywność ADCC wariantu polipeptydu można oceniać in vivo, np. w analizie modelu zwierzęcego opisanego przez Clynes i wsp., PNAS (USA) 95: 652-656 (1998).

Możliwa jest również ocena zdolności wiązania wariantu z C1q oraz jego udziału w cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC).

W celu określenia wiązania C1q możliwe jest wykonanie analizy wiązania C1q w teście ELISA. W skrócie, płytki do analizy można pokrywać wariantem polipeptydu lub wyjściowym polipeptydem (kontrola) w buforze do pokrywania w temperaturze 4°C przez noc. Następnie płytki można płukać i blokować. Po płukaniu do każdej studzienki można dodać porcję C1q i inkubować w temperaturze

PL 209 786 B1 pokojowej przez 2 godziny. Po kolejnym płukaniu do każdej studzienki można dodać 100 μl owczego przeciwciała skoniugowanego z peroksydazą, skierowanego przeciwko dopełniaczowi C1q, a następnie płytki można inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę. Płytki można ponownie płukać buforem do płukania i do każdej studzienki można dodawać 100 μl buforu substratowego, zawierającego OPD (dichlorowodorek O-fenylenodiaminy (Sigma)). Reakcja utleniania, obserwowana na podstawie pojawienia się żółtego koloru, może być prowadzona przez 30 minut, a następnie zatrzymana przez dodanie 100 μl 4,5 N H₂SO₄. Absorbancję można następnie odczytywać przy długości fali (492-405) nm.

Przykładowy wariant polipeptydu w takiej analizie cechuje się „znaczną redukcję wiązania C1q. Oznacza to, że około 100 Lil/ml wariantu polipeptydu wykazuje około 50-krotną, lub większą, redukcję wiązania C1q w porównaniu do kontrolnego przeciwciała posiadającego niezmutowany region Fc IgG1. W najbardziej zalecanym rozwiązaniu wariant polipeptydu „nie wiąże C1q, tj. 100 L l/ml wariantu polipeptydu wykazuje około 100-krotną, lub większą, redukcję wiązania C1q w porównaniu do 100 L l/ml kontrolnego przeciwciała.

Innym przykładem wariantu jest wariant „posiadający wyższe powinowactwo wiązania ludzkiego C1q niż macierzysty polipeptyd. Cząsteczka taka może cechować się, na przykład, około dwukrotnym lub wyższym, a zwłaszcza około pięciokrotnym, lub wyższym, wiązaniem ludzkiego C1q, w porównaniu do macierzystego polipeptydu (np. określonym dla IC50 tych cząsteczek). Na przykład, wiązanie ludzkiego C1q może być około dwukrotnie do około 500-krotnie, a zwłaszcza od około dwukrotnie lub od około pięciokrotnie do około 1000-krotnie wyższe w porównaniu do macierzystego polipeptydu.

W celu określenia aktywacji dopełniacza można zmierzyć cytotoksyczność zależną od dopełniacza (CDC), np. zgodnie z Gazzano-Santoro i wsp., J.Immunol.Methods 202: 1633 (1996). W skrócie, poprzez wykonanie odpowiednich rozcieńczeń w buforze otrzymać można różne stężenia wariantu polipeptydu i ludzkiego dopełniacza. Komórki eksprymujące antygen, z którym wiąże się wariant polipeptydu, można rozcieńczyć do gęstości ~1x10⁶ kom./ml. Mieszaninę wariantu polipeptydu, rozcieńczonego ludzkiego dopełniacza i komórek eksprymujących antygen można przenosić do płaskodennej, 96-studzienkowej płytki do hodowli tkankowej i inkubować przez 2 godziny w 37°C i w atmosferze 5% CO2, celem ułatwienia zależnej od dopełniacza lizy komórek. Następnie, do każdej studzienki można dodać 50 L l alamar blue (Accumed International) i inkubować przez noc w temperaturze 37°C. Absorbancję mierzy się za pomocą 96-studzienkowego fluorometru ze wzbudzeniem przy 530 nm i emisją przy 590 nm. Wyniki można wyrazić we względnych jednostkach fiuorescencji (RFU). Stężenia próbek można obliczyć na podstawie krzywej standardowej, a następnie dla wariantu polipeptydu podaje się procent aktywności w porównaniu do polipeptydu niezmienionego.

Jeszcze innym przykładem jest wariant „nieaktywujący dopełniacza. Na przykład, w analizie tej 0,6 L g/ml wariantu polipeptydu wykazuje około 0-10% aktywności CDC w porównaniu do aktywności 0,6 L g/ml przeciwciała kontrolnego z niezmutowanym regionionem Fc IgG1. W powyższej analizie CDC wariant nie przejawia żadnej aktywności CDC.

Zgodnie z wynalazkiem opisano również wariant polipeptydu o podwyższonej CDC w porównaniu do polipeptydu macierzystego, np. wykazującego, in vitro lub in vivo, około dwukrotnie do około 100-krotnie wyższą aktywność CDC (np. dla wartości IC50 każdej porównywanej cząsteczki).

A. Analiza wiązania receptora i kompleksu immunologicznego

Opracowana zgodnie z niniejszym wynalazkiem analiza wiązania receptora jest szczególnie użyteczna do określania wiązania badanej cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania (analitu) z receptorem w przypadku gdy powinowactwo wiązania receptora dla badanej cząsteczki jest relatywnie słabe, np. rzędu mikromoli, jak w przypadku FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIIA i FcyRIIIB. W sposobie tym dochodzi do tworzenia kompleksu molekularnego o zwiększonej zachłanności wiązania receptora będącego przedmiotem zainteresowania w porównaniu do badanej cząsteczki w postaci nieskompleksowanej. Zalecany kompleks molekularny jest kompleksem immunologicznym zawierającym: (a) polipeptyd zawierający region Fc (taki jak przeciwciało lub immunoadhezyna); (b) pierwszą cząsteczkę docelową, która posiada przynajmniej dwa miejsca wiążące polipeptyd zawierający region Fc i (c) drugą cząsteczkę docelową, posiadającą przynajmniej dwa miejsca wiążące pierwszą cząsteczkę docelową.

W poniżej przedstawionym Przykładzie 1, polipeptydem zawierającym region Fc jest przeciwciało skierowane przeciwko IgE, takie jak przeciwciało E27 (Figury 4A-4B). E27, po zmieszaniu z ludzką IgE w stosunku molowym 1:1, tworzy stabilny heksamer, składający się z trzech cząsteczek E27 i trzech cząsteczek IgE. W poniższym Przykładzie 1, „pierwszą cząsteczką docelową jest chimerowa

PL 209 786 B1 postać IgE, w której fragment Fab skierowanego przeciwko VEGF przeciwciała jest połączony z fragmentem Fc ludzkiej IgE, a „drugą cząsteczką docelową jest antygen, z którym wiąże się Fab (tj. VEGF). Każda cząsteczka IgE wiąże dwie cząsteczki VEGF. VEGF również wiąże dwie cząsteczki IgE na cząsteczkę VEGF. Po dodaniu rekombinowanego ludzkiego VEGF w stosunku molowym 2:1 do heksamerów IgE:E27, heksamery ulegały połączeniu z utworzeniem postaci kompleksów o wyższej masie cząsteczkowej poprzez interakcję IgE:VEGF (Fig. 5). Region Fc przeciwciała skierowanego przeciwko IgE (anty-IgE) otrzymanego w ten sposób kompleksu immunologicznego wiąże FcR z wyższą zachłannością wiązania niż zarówno nieskompleksowane anty-IgE, jak i heksamery anty-IgE:IgE.

Również inne formy kompleksów molekularnych mogą być zastosowane w analizie wiązania receptora. Przykłady, obejmujące jedynie połączenie polipeptyd zawierający region Fc: pierwsza cząsteczka docelowa, obejmują połączenie immunoadhezyna:ligand, takie jak receptor VEGF (KDR)immunoadhezyna:VEGF oraz pełnej długości przeciwciało bispecyficzne (bsAb): pierwsza cząsteczka docelowa. Kolejny przykład połączenia polipeptyd zawierający region Fc: pierwsza cząsteczka docelowa: druga cząsteczka docelowa, obejmuje połączenie przeciwciało nieblokujące:rozpuszczalny receptor:ligand, takie jak przeciwciało any-Trk:rozpuszczalny receptor Trk:neutrofina (Urfer i wsp., J.Biol.Chem. 273 (10): 5829-5840 (1998)).

Oprócz zastosowania w analizie wiązania receptora, opisane powyżej kompleksy immunologiczne posiadają inne zastosowania, włączając ocenę funkcji polipeptydu zawierającego region Fc oraz klirensu kompleksu immunologicznego in vivo. Zatem, kompleksy immunologiczne mogą być podawane ssakom (np. w przedklinicznej fazie badań na zwierzętach) i oceniane pod kątem ich okresu półtrwania, itp.

W celu określenia wiązania receptora, polipeptyd zawierający przynajmniej domenę wiążącą receptor będący przedmiotem zainteresowania (np. zewnątrzkomórkowa domena podjednostki α FcR) może być umieszczony na fazie stałej, takiej jak płytka do analizy. Sama domena wiążąca receptor, albo białko fuzyjne receptora mogą być rozmieszczane na płytce za pomocą standardowych procedur. Przykłady białek fuzyjnych receptora obejmują białko fuzyjne receptor-transferaza S glutationu (GST), białko fuzyjne receptor-domena wiążąca chitynę, białko fuzyjne receptor-znacznik heksahistydynowy, (umieszczone na płytkach pokrytych, odpowiednio, glutationem, chityną i niklem). Alternatywnie, możliwe jest pokrywanie płytek do analizy cząsteczką wychwytującą i wiązanie białka fuzyjnego receptora poprzez fragment niereceptorowy białka fuzyjnego. Przykłady obejmują pokrycie płytki do analizy F(ab') anty-heksaHis, w celu wychwycenia fuzji receptora z końcem heksaHis lub pokrycie płytki do analizy przeciwciałem skierowanym przeciwko GST (anty- GST), w celu wychwycenia białka fuzyjnego receptor-GST. W innych rozwiązaniach, oceniane może być wiązanie komórek eksprymujących przynajmniej domenę wiążącą receptora. Komórki mogą być naturalnie występującymi komórkami hematopoetycznymi eksprymującymi FcR będący przedmiotem zainteresowania lub komórkami transformowanymi kwasem nukleinowym kodującym FcR lub jego domenę wiążącą, przy czym taka domena wiążąca ulega ekspresji na powierzchni komórek do analizy.

Następnie, opisany powyżej kompleks immunologiczny dodawany jest do płytek pokrytych receptorem i całość inkubowana jest przez czas wystarczający do związania receptora przez badaną cząsteczkę. Płytki można następnie płukać w celu usunięcia nie związanych kompleksów, po czym wiązanie badanej cząsteczki można wykrywać za pomocą znanych metod. Na przykład, wiązanie można wykrywać za pomocą reagenta (np. przeciwciała lub jego fragmentu) specyficznie wiążącego się z badaną cząsteczką, i, ewentualnie, sprężonego z wykrywalnym znacznikiem (wykrywalne znaczniki i metody sprzęgania polipeptydami opisano poniżej, w rozdziale zatytułowanym „Nieterapeutyczne zastosowania wariantu polipeptydu).

Dogodnie, reagenty mogą znajdować się w zestawie do analizy, tj. opakowana kombinacja reagentów do połączenia z badaną cząsteczką przy analizie zdolności badanej cząsteczki do wiązania receptora będącego przedmiotem zainteresowania. Zestawy takie powinny zawierać składniki w określonych wcześniej stosunkach. Zestaw może zawierać pierwszą cząsteczkę docelową i/lub drugą cząsteczkę docelową, ewentualnie obie w kompleksie ze sobą. Zestaw może również zawierać płytki do analizy, pokryte receptorem lub jego domeną wiążącą (np. zewnątrzkomórkową domeną podjednostki α FcR). Zazwyczaj, w skład zestawu wchodzą również inne reagenty, takie jak przeciwciało wiążące się swoiście z badaną cząsteczką do analizy, bezpośrednio lub pośrednio znakowane za pomocą znacznika enzymatycznego. W przypadku gdy znacznikiem wykrywalnym jest enzym, zestaw zawiera także wymagane przez enzym substraty i kofaktory (np. prekursor substratu dostarczający wykrywalny chromofor lub fluorofor). Ponadto, mogą być zawarte inne dodatki, takie jak stabilizatory,

PL 209 786 B1 bufory (np. bufor do analizy i/lub bufor do płukania i lizaty) itp. Względne ilości różnych reagentów mogą podlegać szerokim zmianom, po to by zapewnić stężenia reagentów w roztworze, które pozwalają na zasadnicze zoptymalizowanie czułości analizy. Szczególnie, reagenty mogą być udostępniane w postaci suchych proszków, zazwyczaj liofilizowanych, zawierających zaróbki, które po rozpuszczeniu zapewniają odpowiednie stężenie reagentu w roztworze. Zestaw zawiera również odpowiednie instrukcje do przeprowadzenia analizy.

B. Otrzymywanie przeciwciała

W zalecanym rozwiązaniu polipeptyd zawierający region Fc, modyfikowany zgodnie z niniejszym opisem, jest przeciwciałem. Techniki otrzymywania przeciwciał obejmują:

(i) Selekcję i otrzymywanie antygenu

W przypadku gdy polipeptyd jest przeciwciałem, skierowany jest on przeciwko antygenowi będącemu przedmiotem zainteresowania. Zalecany antygen jest polipeptydem istotnym biologicznie, a podawanie przeciwciała dotkniętym chorobą i zaburzeniem ssakom może przynieść im korzyść terapeutyczną. Jednakże brane są również pod uwagę przeciwciała skierowane przeciwko antygenom niepolipeptydowym (takim jak antygeny glikolipidowe związane z guzem nowotworowym; patrz Patent USA nr 5,091,178).

W przypadku, gdy antygen jest polipeptydem może on być cząsteczką przezbłonową (np. receptorem) lub ligandem, takim jak czynnik wzrostu. Przykładowe antygeny obejmują cząsteczki, takie jak renina; hormon wzrostu, włączając ludzki hormon wzrostu i wołowy hormon wzrostu; czynnik uwalniający hormon wzrostu; hormon przytarczyczny; hormon stymulujący tarczycę; lipoproteiny; alfa-1-antytrypsynę; łańcuch A insuliny; łańcuch B insuliny; proinsulinę, hormon folikulotropowy; kalcytoninę; hormon lutenizujący; glukagon; czynniki krzepnięcia, takie jak czynnik VIIIC, czynnik IX, czynnik tkankowy (TF) oraz czynnik von Wilebrand'a; czynniki przeciwkrzepliwe, takie jak Białko C; przedsionkowy czynnik natriuretyczny; surfaktant płucny; aktywator plazminogenu, taki jak urokinaza lub ludzki aktywator plazminogenu moczu, lub też tkankowy aktywator plazminogenu (t-PA); bombezynę; trombinę; hemopoetyczny czynnik wzrostu; czynnik martwicy nowotworu alfa i beta; enkefalinazę; RANTES (czynnik regulowany przez aktywację, zazwyczaj ekspresjonowany i wydzielany przez komórki T); ludzkie makrofagowe białko zapalne (MIP-1-alfa); albuminę surowicy krwi, taką jak ludzka albumina surowicy; substancję hamującą Muellerian; łańcuch A relaksyny; łańcuch B relaksyny; prorelaksynę; mysi peptyd związany z gonadotropiną; białko drobnoustrojowe, takie jak beta-laktamaza; DNaza; IgE; antygen związany z cytotoksycznym limfocytem T (CTLA), takie jak CTLA-4; inhibinę; aktywinę; czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF); receptory hormonów lub czynników wzrostu; białko A lub D; czynniki reumatoidalne; czynnik neurotroficzny, taki jak kościopochodny czynnik neurotroficzny (BDNF), neutrofina 3, 4, 5 lub 6 (NT-3, NT-4, NT-5 lub NT-6); lub czynnik wzrostu nerwów, taki jak NGF-β; płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF); czynnik wzrostu fibroblastów, taki jak aFGF i bFGF; czynnik wzrostu naskórka (EGF); transformujący czynnik wzrostu (TGF), taki jak TGF-alfa i TGF-beta, włączając TGF-e1, TGF-e2, TGF-e3, TGF-e4 lub TGF-e5; insulinopodobny czynnik wzrostu I i II (IGF-I i IGF-II); des(1-3)-IGF (mózgowy IGF-I), białka wiążące insulinopodobny czynnik wzrostu; białka CD, takie jak CD3, CD4, CD8, CD19 i CD20; erytropoetynę; czynniki osteoindukcyjne; immunotoksyny; białko morfogenetyczne kości (BMP); interferon, taki jak interferon alfa, beta i gamma; czynniki stymulujące powstawanie kolonii (CSF), np. M-CSF, GM-CSF i G-CSF; interleukiny (IL), np. IL-1 do IL-10; dysmutazę nadtlenkową; receptory komórek T; białka powierzchniowo-błonowe; czynnik przyspieszający rozkład, antygen wirusowy, taki jak np. fragment otoczki AIDS; białka transportowe; receptory zasiedlania; adresyny; białka regulatorowe; integryny, takie jak CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 i VCAM; antygen związany z guzem nowotworowym, taki jak receptor HER-2, HER3 lub KER4; oraz fragmenty jakiegokolwiek z wyżej wymienionych polipeptydów.

Zalecanymi cząsteczkami docelowymi dla przeciwciał tu opisanych są białka CD, takie jak CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 i CD34; białka wchodzące w skład rodziny receptora ErbB, takie jak receptor EGF, receptor HER2, HER3 lub HER4; cząsteczki adhezji komórkowej, takie jak LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, integryna α4/β7 oraz integryna αν/β3, zawierająca albo jej podjednostkę α albo β (np. przeciwciała antyCD11a, anty-CD18 lub anty-CD11b); czynniki wzrostu, takie jak VEGF); czynnik tkankowy (TF); interferon alfa (α-lFN); interleukinę, taką jak IL-8; IgE; antygeny grupowe krwi; receptor flk2/flt3; receptor otyłości OB; receptor mpl; CTLA-4; białko C, itp.

Rozpuszczalne antygeny lub ich fragmenty, ewentualnie sprężone z innymi cząsteczkami, mogą być stosowane jako immunogeny do produkcji przeciwciał. W przypadku cząsteczek przezbłonowych, takich jak receptory, możliwe jest zastosowanie jako immunogenów ich fragmentów (np. ze26

PL 209 786 B1 wnątrzkomórkowej domeny receptora). Alternatywnie, rolę immunogenów mogą odgrywać cząsteczki ekspresjonujące cząsteczki przezbłonowe. Komórki te mogą pochodzić z naturalnego źródła (np. linie komórek nowotworowych) lub mogą być otrzymane drogą transformacji z zastosowaniem technik rekombinacji, mających na celu uzyskanie ekspresji cząsteczki przezbłonowej. Inne antygeny i ich postacie, użyteczne do otrzymywania przeciwciał są oczywiste dla specjalistów w dziedzinie.

(ii) Przeciwciała poliklonalne

Przeciwciała poliklonalne są wzbudzane dogodnie w organizmach zwierzęcych poprzez podskórne (sc) lub wewnątrzotrzewne (ip) wstrzyknięcia odpowiedniego antygenu i adiuwantu. Użyteczne może być sprzęganie odpowiednio wybranego antygenu z białkiem o właściwościach immunogennych w immunizowanym gatunku, np. hemocyjaniną ze skałoczepa, albuminą surowicy, tyroglobuliną wołową lub inhibitorem trypsyny z soi z użyciem czynnika dwufunkcyjnego lub derywatyzującego, na przykład, estru maleimidobenzoilowego sukcynoimidu (sprzęganie przez reszty cysteiny), N-hydroksysukcynoimidu (przez reszty lizyny), glutaraldehydu, bezwodnika bursztynowego, SOCl2 lub R¹N=C=NR, gdzie R i R¹ są różnymi grupami alkilowymi.

Zwierzęta immunizuje się przeciwko antygenowi, koniugatom immunogennym lub pochodnym poprzez łączenie, np. 100 μg lub 5 μg, białka lub koniugatu (odpowiednio dla królików lub myszy) z trzema objętościami kompletnego adiuwanta Freunda i wstrzykuje się śródskórnie w wielu miejscach. Miesiąc później zwierzęta szczepione są dawką przypominającą, poprzez podskórne wstrzyknięcie w wielu miejscach 1/5 do 1/10 pierwotnej ilości peptydu lub koniugatu w kompletnym adiuwancie Freunda. 7 do 14 dni później, zwierzęta skrwawia się i oznacza się miano przeciwciała w surowicy. Zwierzętom podaje się dawki przypominające aż do uzyskania maksymalnego miana. Dogodne dawki przypominające zawierają koniugat tego samego antygenu, lecz połączony z innym białkiem i/lub za pomocą innego reagenta sieciującego. Koniugaty można także otrzymać w hodowli komórek rekombinowanych jako białka fuzyjne. Również czynniki agregujące, takie jak ałun, mogą być odpowiednie do zastosowannia w celu wzmacniania odpowiedzi immunologicznej.

(iii) Przeciwciała monoklonalne

Przeciwciała monoklonalne mogą być otrzymane przy użyciu metody z zastosowaniem hybrydom, opisanej po raz pierwszy przez Kohler i wsp., Nature, 256:495 (1975) lub metody rekombinacji DNA (Patent U.S.A. Nr 4,816,567).

W metodzie z zastosowaniem hybrydom, myszy lub inne organizmy zwierzęce gospodarza, takie jak chomiki lub małpy makaki, szczepi się (jak opisano powyżej), w celu otrzymania limfocytów produkujących lub zdolnych do produkcji przeciwciał swoiście wiążących białko zastosowane do immunizacji. Alternatywnie, możliwa jest immunizacja in vitro limfocytów. Następnie limfocyty poddaje się fuzji z komórkami szpiczaka, za pomocą odpowiedniego czynnika fuzyjnego, takiego jak glikol polietylenowy, co pozwala na uzyskanie komórek hybrydoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, str. 59-103 (Academic Press, 1986)).

Tak otrzymane komórki hybrydoma wysiewa się i hoduje w odpowiedniej pożywce hodowlanej, zawierającej dogodnie jedną lub więcej substancji hamujących wzrost lub przeżycie macierzystych komórek szpiczaka, jakie nie uległy fuzji. Na przykład, jeżeli macierzyste komórki szpiczaka nie posiadają enzymu fosforybozylotransferazy hipoksantyno-guaninowej (HGPRT lub HPRT), pożywka hodowlana dla hybrydom zazwyczaj będzie zawierała hipoksantynę, aminopterynę i tymidynę (pożywka HAT), które to substancje zapobiegają wzrostowi komórek nieposiadających HGPRT.

Zalecanymi komórkami szpiczaka są komórki wydajnie ulegające fuzji, wspomagające stabilną produkcję na wysokim poziomie przeciwciała przez wyselekcjonowane komórki produkujące przeciwciało oraz wrażliwe na pożywkę typu HAT. Wśród tych komórek, zalecanymi liniami komórkowymi szpiczaka są linie komórkowe pochodzące z mysich guzów MOPC-21 i MPC-11, dostępne w Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA oraz komórki SP-2 lub X63-Ag8-653, dostępne w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. Ludzkie linie komórkowe szpiczaka i mysio-ludzkie linie komórkowe hetero-szpiczkowe zostały również opisane jako odpowiednie do produkcji ludzkich przeciwciał monoklonalnych (Kozbor, J.Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur i wsp., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

Pożywkę hodowlaną, w której rosną komórki hybrydoma analizuje się pod kątem produkcji przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko antygenowi. Dogodnie, określa się swoistość wiązania wyprodukowanego przez komórki hybrydoma przeciwciała monoklonalnego, na drodze imPL 209 786 B1 munoprecypitacji lub analizy wiązania in vitro, takiej jak test radioimmunologiczny (RIA) lub test immunoenzymatyczny (ELISA).

Po dokonaniu identyfikacji komórek hybrydoma produkujących przeciwciało o pożądanej swoistości, powinowactwie i/lub aktywności klony te można subklonować metodą ograniczających rozcieńczeń i hodować według standardowych metod (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practoce, str. 59-103 (Academic Press, 1986)). Odpowiednie do tego celu pożywki hodowlane obejmują, na przykład, D-MEM lub RPMI-1640. Ponadto, komórki hybrydoma można hodować in vivo w postaci wysięku nowotworowego u zwierząt.

Wydzielane przez subklony przeciwciała monoklonalne odpowiednio oddziela się od pożywki hodowlanej, płynu wysiękowego lub surowicy konwencjonalnymi metodami oczyszczania immunoglobulin, takimi jak chromatografia na sefarozie z białkiem A, chromatografia na hydroksylacie, elektroforeza żelowa, dializa lub chromatografia powinowactwa.

DNA kodujący przeciwciała monoklonalne izoluje się i sekwencjonuje za pomocą konwencjonalnych procedur (np. poprzez zastosowanie sond oligonukleotydowych, zdolnych do specyficznego wiązania genów kodujących łańcuchy ciężkie i lekkie przeciwciał monoklonalnych). Komórki hybrydoma stanowią zalecane źródło takiego DNA. W celu uzyskania syntezy przeciwciał monoklonalnych w rekombinowanych komórkach gospodarza wyizolowany DNA można umieszczać w wektorach ekspresyjnych, którymi transfekuje się następnie komórki gospodarza, takie jak komórki E.coli, małpie komórki COS, komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) lub komórki szpiczaka, które w inny sposób nie produkują białka immunoglobuliny. Rekombinowaną produkcję przeciwciał opisano bardziej szczegółowo poniżej.

W kolejnym rozwiązaniu, przeciwciała lub ich fragmenty, mogą zostać wyizolowane z biblioteki fagowej przeciwciał, utworzonej za pomocą technik opisanych w McCafferty i wsp., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson i wsp., Nature, 352: 624-628 (1991) oraz Marks i wsp., J.Mol.Biol., 222: 581-597 (1991) opisali izolację, odpowiednio, mysich i ludzkich przeciwciał przy użyciu bibliotek fagowych. Kolejne publikacje opisują produkcję ludzkich przeciwciał o wysokim powinowactwie (rzędu nM) za pomocą tasowania łańcuchów (Marks i wsp., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)) oraz kombinatorycznego zakażenia, jak również rekombinacji in vivo, jako strategii pozwalającej na otrzymanie bardzo dużych bibliotek fagowych (Waterhouse i wsp., Nuc.Acids.Res., 21: 2265-2266 (1993)). Techniki te są zatem alternatywnymi, względem tradycyjnej metody z zastosowaniem hybrydom, sposobami izolacji przeciwciał monoklonalnych.

DNA może również podlegać modyfikacjom, na przykład przez substytucję sekwencji kodującej ludzkie domeny stałe łańcucha ciężkiego i lekkiego w miejscu homologicznych mysich sekwencji (Patent USA nr 4,816,567; Morrison i wsp., Proc.Natl. Acad.Sci. USA, 81: 6351 (1984)) lub przez kowalencyjne łączenie sekwencji kodującej immunoglobulinę z całą lub częścią sekwencji kodującej polipeptyd nie-immunoglobulinowy.

Zazwyczaj, takie polipeptydy nie-immunoglobulinowe podstawiane są za domeny stałe przeciwciała lub za domeny zmienne jednego miejsca przyłączającego antygen przeciwciała, w celu otrzymania chimerowych, biwalentnych przeciwciał, zawierających jedno miejsce przełączania antygenu o swoistości wobec jednego antygenu i drugie miejsce przyłączania antygenu, wykazujące swoistość dla innego antygenu.

(iv) Przeciwciała humanizowane i ludzkie

Humanizowane przeciwciało posiada jedną lub więcej reszt aminokwasowych wprowadzonych z organizmu innego niż ludzki. Takie niepochodzące z organizmu człowieka reszty aminokwasowe określane są często jako reszty „importowane, zazwyczaj pobierane z „importowanej domeny zmiennej. Humanizacja może być przeprowadzona zasadniczo zgodnie z metodą Winter i wsp., (Jones i wsp., Nature, 321: 522-525 (1986), Riechmann i wsp., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen i wsp., Sciene, 239: 1534-1536 (1988)), przez substytucję sekwencji CDR gryzoni lub sekwencji CDR dla odpowiednich sekwencji ludzkiego przeciwciała. Zatem, takie „humanizowane przeciwciała są przeciwciałami chimerowymi (Patent USA nr 4,816,567), w których zasadniczo mniej niż całość ludzkiej domeny zmiennej została podstawiona odpowiadającą temu obszarowi sekwencją pochodzącą z innego niż człowiek gatunku. W praktyce, przeciwciała humanizowane są zazwyczaj ludzkimi przeciwciałami, w obrębie których pewne reszty CDR i, ewentualnie, pewne reszty FR, podstawiono resztami pochodzącymi z analogicznych miejsc w przeciwciałach gryzoni.

Wybór ludzkich domen zmiennych, zarówno łańcucha lekkiego, jak i ciężkiego, do zastosowania w metodzie otrzymywania przeciwciał humanizowanych jest bardzo istotny ze względu na obniże28

PL 209 786 B1 nie ich antygenności. Zgodnie z tzw. metodą best-fit, sekwencja domeny zmiennej przeciwciała gryzonia podlega przeszukiwaniu wobec całej biblioteki znanych ludzkich sekwencji domeny zmiennej. Ludzka sekwencja, najbliższa sekwencji gryzonia, przyjmowana jest jako ludzki region zrębowy przeciwciała humanizowanego (Sims i wsp., J.Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia i wsp., J.Mol.Biol., 196: 901 (1987)). W innej metodzie wykorzystywany jest szczególny region zrębowy, pochodzący z sekwencji najwyż szej zgodnoś ci wszystkich ludzkich przeciwciał należących do danej podgrupy łańcuchów lekkich lub ciężkich. Ten sam region zrębowy może być zastosowany do otrzymania kilku różnych przeciwciał humanizowanych (Carter i wsp., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89: 4285 (1992); Presta i wsp., J.Immunol., 151: 2623 (1993)).

Istotne jest również, żeby przeciwciała były humanizowane z zachowaniem wysokiego powinowactwa do antygenu i innych zalecanych właściwości biologicznych. W celu osiągnięcia takiego rezultatu, zgodnie z zalecanym sposobem, przeciwciała humanizowane otrzymuje się w wyniku analizy sekwencji i różnych zaprojektowanych produktów humanizowanych, za pomocą trójwymiarowych modeli wyjściowych i sekwencji humanizowanych. Trójwymiarowe modele immunoglobulin są powszechnie dostępne i znane specjalistom w dziedzinie. Dostępne są również programy komputerowe prezentujące i wykazujące prawdopodobną konformację trójwymiarowej struktury wybranych sekwencji immunoglobulin. Analiza ich pozwala na określenie prawdopodobnej roli reszt w funkcjonowaniu badanej sekwencji immunoglobuliny, tj. określenie wpływu tych reszt na zdolność badanej immunoglobuliny do wiązania antygenu. W ten sposób, możliwe jest dokonanie wyboru reszt FR i połączenie z sekwencjami biorcy i importowanymi w sposób pozwalający na uzyskanie pożądanych właściwości przeciwciała, takich jak zwiększone powinowactwo względem docelowego antygenu lub antygenów. Ogólnie, reszty CDR bezpośrednio i istotnie uczestniczą w wiązaniu antygenu.

Alternatywnie, możliwe jest obecnie otrzymanie zwierząt transgenicznych (np. myszy) zdolnych, po immunizacji, do produkcji pełnego zestawu ludzkich przeciwciał, przy braku produkcji immunoglobulin endogennych. Na przykład, opisano, że homozygotyczna delecja regionu genu łączącego łańcuch ciężki przeciwciała (JH) w chimerowych i zarodkowych mysich mutantach skutkuje całkowitym zahamowaniem produkcji endogennych przeciwciał. Przeniesienie macierzy genów immunoglobulin ludzkiej linii zarodkowej do takiej zmutowanej linii zarodkowej myszy wywołuje po prowokacji antygenem produkcję przeciwciał ludzkich. Patrz np., Jakobovits i wsp., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits i wsp., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann i wsp., Year in Immuno., 7:33 (1993) oraz Duchosal i wsp., Nature, 355: 258 (1992). Ludzkie przeciwciała mogą również być otrzymane z bibliotek prezentacji na fagach (Hoogenboom i wsp., J.Mol.Biol., 227: 381 (1991); Marks i wsp., J.Mol.Biol., 222: 581-597 (1991); Vaughan i wsp., Nature Biotech, 14:309 (1996)).

(v) Przeciwciała wieloswoiste

Przeciwciała wieloswoiste wykazują specyficzność wiązania względem przynajmniej dwóch różnych antygenów. Cząsteczki takie zazwyczaj wiążą jedynie dwa antygeny (tj. są przeciwciałami biswoistymi, BsAb), jednak pojęcie to obejmuje przeciwciała o dodatkowych swoistościach, takie jak przeciwciała o potrójnej swoistości. Przykłady BsAb obejmują przeciwciała posiadające jedno ramię skierowane przeciwko antygenowi komórki nowotworowej, a drugie skierowane przeciwko cytotoksycznej cząsteczce wzbudzającej, takiej jak anty-FcYRI/anty-CD15, anty-p185^HER2/FcYRIII (CD16), anty-CD3/anty-uzłośliwione komórki B (1D10), anty-CD3/anty185^HER2, anty-CD3/anty-p97, antyCD3/przeciwko komórce raka nerki, anty-CD3/anty-OVCAR-3, antyCD3/L-D1 (przeciwko rakowi jelita grubego), anty-CD3/anty-analog czynnika stymulującego melanocyty, anty-receptor EGF/anty-CD3, anty-CD3/anty-CAMA1, anty-CD3/anty-CD19, anty-CD3/moV18, anty-cząsteczka adhezji komórek nerwowych (NCAM)/anty-CD3, białko wiążące folian(FBP)/anty-CD3, związany z rakiem anty-antygen AMOC-31 (ang. anti-pan carcinoma associated antigen)(AMOC-31)/anty-CD3; BsAb o jednym ramieniu wiążącym swoiście antygen rakowy i drugim, wiążącym toksynę, takie jak anty-saporyna/anty-Id-1, anty-CD22/anty-saporyna, anty-CD7/anty-saporyna, anty-CD38/anty-saporyna, anty-CEA/przeciwko łańcuchowi A rycyny, anty-interferon-a(IFN-a)/przeciwko idiotypowi hybrydomu, anty-CEA/anty-alkaloid winka; BsAb do konwersji enzymatycznie aktywowanych proleków, takich jak anty-CD30/anty-alkaliczna fosfataza (która katalizuje zamianę proleku fosforanu mitomycyny do alkoholu mitomycynowego); BsAb, które mogą być stosowane jako czynniki fibrynolityczne, takie jak antyfibryna/anty-tkankowy aktywator plazminogenu (tPA), anty-fibryna/anty-aktywator plazminogenu typu urokinazy (uPA); BsAb do kierowania kompleksów immunologicznych do receptorów powierzchniowo-komórkowych, takie jak anty-lipoproteina o niskiej gęstości (LDL)/anty-receptor Fc (np. FcyRI, FcyRII lub FcyRIII); BsAb do zastosowania w terapii chorób zakaźnych, takie jak anty-CD3/anty-wirus

PL 209 786 B1 opryszczki (HSV), anty-receptor komórek T:kompleks CD3/anty-wirus grypy, anty-FcyR/anty-HIV; BsAb do wykrywania nowotworów in vitro lub in vivo, takie jak anty-CEA/anty-EOTUBE, antyCEA/anty-DPTA, anty-p185^HER”/anty-hapten; BsAb jako adiuwanty szczepionkowe; oraz BsAb jako narzędzia diagnostyczne, takie jak anty-królicza IgG/anty-ferrytyna, anty-peroksydaza chrzanowa (HRP)/anty-hormon, anty-somatostatyna/anty-substancja P, anty-HRP/anty-FITC, anty-CEA/anty-β-galaktozydaza. Przykłady przeciwciał o potrójnej swoistości obejmują anty-CD3/anty-CD4/anty-CD37, anty-CD3/anty-CD5/anty-CD37 oraz anty-CD3/anty-Cd8/anty-CD37. Przeciwciała o podwójnej swoistości można otrzymywać w postaci pełnej długości przeciwciał lub fragmentów przeciwciał (np. przeciwciała o podwójnej swoistości F(ab')2).

Metody otrzymywania przeciwciał o podwójnej swoistości są znane w dziedzinie. Tradycyjne wytwarzanie pełnej długości przeciwciał o podwójnej swoistości opiera się na koekspresji dwóch par łańcucha ciężkiego-łańcucha lekkiego immunoglobulin, w których dwa łańcuchy posiadają różną swoistość (Millstein i wsp., Nature, 305: 537-539 (1983)). Z powodu losowego doboru łańcuchów ciężkich i lekkich hybrydomy te (kwadromy) wytwarzają potencjalnie mieszaninę 10 różnych cząsteczek przeciwciał, z których jedynie jedna posiada właściwą strukturę o podwójnej swoistości. Oczyszczenie tej właściwej cząsteczki, zazwyczaj drogą chromatografii powinowactwa, jest niewygodne, a wydajność procesu jest niska. Podobne procedury opisano w WO 93/08829 i w Traunecker i wsp., EM30 J., 10:3655-3659 (1991).

Zgodnie z innym podejściem, domeny zmienne przeciwciała o pożądanej swoistości wiązania (miejsca połączenia przeciwciało-antygen) poddaje się fuzji z sekwencjami domeny stałej immunoglobuliny. Fuzja ta dogodnie zachodzi z domeną stałą łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, zawierającą przynajmniej część regionu zawiasowego, regionów CH2 i CH3. Dogodnie przynajmniej jeden z produktów fuzji obejmuje pierwszy region stały z łańcucha ciężkiego (CH1), zawierający miejsce niezbędne do wiązania łańcucha lekkiego. DNA kodujące fuzje łańcuchów ciężkich immunoglobuliny oraz, w razie potrzeby, łańcuchów lekkich immunoglobuliny, wstawia się do oddzielnych wektorów ekspresyjnych, którymi następnie kotransfekuje się odpowiednie komórki gospodarza. Pozwala to na dużą elastyczność dostosowywania wzajemnych proporcji trzech fragmentów polipeptydów w przypadku rozwiązań, w których stosuje się nierówne proporcje trzech łańcuchów polipeptydowych, celem zapewnienia optymalnej wydajności. Możliwe jest, jednakże, wstawienie sekwencji kodujących dwa lub trzy łańcuchy polipeptydowe w jednym wektorze ekspresyjnym, gdy ekspresja przynajmniej dwóch łańcuchów polipeptydowych w równych proporcjach zapewnia wysoką wydajność, lub gdy proporcje te nie mają żadnego szczególnego znaczenia.

W zalecanym tego rodzaju rozwiązaniu, przeciwciała o podwójnej swoistości składają się z hybrydowego łańcucha ciężkiego immunoglobuliny o pierwszej swoistości wiązania w obszarze jednego ramienia, i pary hybrydowych łańcuchów, ciężkiego i lekkiego immunoglobuliny (dostarczającej drugą swoistość wiązania) na drugim ramieniu. Zaobserwowano, że taka asymetryczna struktura ułatwia rozdzielanie pożądanego składnika o podwójnej swoistości od niepożądanych połączeń łańcuchów immunoglobulin, ponieważ oddzielanie cząsteczek jest łatwiejsze, gdy łańcuch lekki immunoglobuliny obecny jest jedynie w połowie struktury cząsteczki o podwójnej swoistości. Obserwację tę ujawniono w WO 94/04690. Więcej szczegółów na temat otrzymywania przeciwciał o podwójnej swoistości można znaleźć, na przykład, w Suresh i wsp., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986). Zgodnie z innym podejściem zaprezentowanym w WO96/27011, powierzchnia pomiędzy parą cząsteczek przeciwciał może zostać zaprojektowana tak, by procent heterodimerów odzyskiwanych z hodowli komórek rekombinowanych był maksymalny. Zalecana powierzchnia obejmuje przynajmniej część domeny CH3 domeny stałej przeciwciała. W prezentowanym sposobie, jeden, lub więcej małych, aminokwasowych łańcuchów bocznych z powierzchni pierwszej cząsteczki przeciwciała zastępuje się większymi łańcuchami bocznymi (np. tyrozyną lub tryptofanem). Kompensujące „jamy, o rozmiarach identycznych lub zbliżonych do rozmiarów większego łańcucha lub łańcuchów bocznych tworzy się na powierzchni drugiej cząsteczki przeciwciała poprzez zastąpienie dużych aminokwasowych łańcuchów bocznych mniejszymi (np. alaniny lub treoniny). Sposób ten zapewnia wzrost wydajności otrzymywania heterodimerów w stosunku do niepożądanych produktów końcowych, takich jak homodimery.

Przeciwciała o podwójnej swoistości obejmują przeciwciała sieciowane lub „heterokoniugatowe. Na przykład, jedno z przeciwciał heterokoniugatu może być sprzęgnięte z awidyną, drugie z biotyną. Zastosowanie takich przeciwciał zaproponowano do nakierowywania, na przykład, komórek układu immunologicznego na komórki niepożądane (Patent USA nr 4,676,980) oraz do leczenia infekcji HIV (WO 91/00360, WO 92/200373 oraz EP 03089). Przeciwciała heterokoniugatowe można

PL 209 786 B1 otrzymać za pomocą jakiejkolwiek metody sieciowania. Odpowiednie czynniki umożliwiające takie sieciowanie są znane w dziedzinie i ujawnione w Patencie USA nr 4,676,930, wraz z licznymi technikami sieciowania.

Bierze się również pod uwagę przeciwciała o więcej niż dwóch swoistościach. Na przykład, można otrzymywać przeciwciała o potrójnej swoistości. Tutt i wsp., J.Immunol.147: 60 (1991).

Chociaż polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania stanowi dogodnie przeciwciało, to bierze się tu również pod uwagę inne polipeptydy zawierające region Fc, które można modyfikować, zgodnie z opisanymi tu sposobami. Przykładem takiej cząsteczki jest immunoadhezyna.

C. Otrzymywanie immunoadhezyny.

Najprostsza immunoadhezyna zawiera domenę lub domeny wiążące adhezyny (np. zewnątrzkomórkową domenę receptora (EDC)) wraz z regionem Fc łańcucha ciężkiego immunoglobuliny. Zwykle, w celu otrzymania immunoadhezyny według wynalazku, kwas nukleinowy, kodujący domenę wiążącą tej adhezyny jest poddawany fuzji od strony C-końca z kwasem nukleinowym kodującym N-koniec sekwencji domeny stałej immunoglobuliny, możliwe są, jednakże, również fuzje od strony N-końca.

Zazwyczaj w takich fuzjach kodowany chimerowy polipeptyd zachowuje przynajmniej funkcjonalnie aktywny zawias, domeny CH2 i CH3 regionu stałego łańcucha ciężkiego immunoglobuliny. Fuzje przeprowadza się także od strony C-końca fragmentu Fc domeny stałej, lub bezpośrednio, od N-końca CH1 łańcucha ciężkiego lub odpowiadającego temu obszarowi regionu łańcucha lekkiego. Dokładne miejsce przeprowadzenia fuzji nie jest krytyczne; poszczególne miejsca są dobrze znane i można je tak wybrać, żeby zoptymalizować aktywność biologiczną, wydzielanie lub właściwości wiązania immunoadhezyny.

W zalecanym rozwiązaniu sekwencja adhezyny poddawana jest fuzji z N-końcem regionu Fc immunoglobuliny G1 (IgG1). Możliwa jest przy tym fuzja całego regionu stałego łańcucha ciężkiego z sekwencją adhezyny. Jednakże, dogodniej fuzji poddaje się sekwencję rozpoczynającą się w regionie zawiasowym, tuż powyżej miejsca cięcia papainą, które określa chemicznie Fc IgG (np. reszta 216, przyjmując resztę 114 za pierwszą resztę regionu stałego łańcucha ciężkiego), lub w analogicznych miejscach innych immunoglobulin. W szczególnie zalecanym rozwiązaniu sekwencję aminokwasową adhezyny poddaje się fuzji z (a) regionem zawiasowym oraz CH2 i CH3 lub (b) CH1, regionem zawiasowym, domeną CH2 oraz CH3 łańcucha ciężkiego IgG.

W przypadku immunoadhezyn o podwójnej swoistości, immunoadhezyny tworzą multimery, a w szczególności heterodimery lub heterotetramery. Ogólnie, takie multimetryczne immunoglobuliny będą w postaci znanych jednostek strukturalnych. Podstawowa, czterołańcuchowa, jednostka strukturalna jest postacią, w jakiej występuje IgG, IgD oraz IgE. Jednostka czterołańcuchowa powtarzana jest w immunoglobulinach o wyższej masie cząsteczkowej; IgM ogólnie występuje w postaci pentameru, składającego się z czterech podstawowych jednostek połączonych ze sobą wiązaniami disiarczkowymi. W postaci multimeru w surowicy może występować również globulina IgA i czasem, globulina IgG. W przypadku postaci multimetru, każda z czterech jednostek może być taka sama lub inna.

Poniżej, przedstawiono schematycznie różne przykłady złożonych immunoadhezyn, według wynalazku:

(a) ACL-ACL;

(b) AC_H-(AC_H, AC_L-AC_H, AC_L-V_HC_H lub V_LC_L-AC_H);

(c) AC_L-AC_H-(AC_L-AC_H, AC_L-V_HC_H, V_LC_L-AC_H lub V_LC_L-V_HC_H);

(d) AC_L-V_HC_H-(AC_H lub AC_L-V_HC_H lub V_LC_L-AC_H);

(e) V_LC_L-AC_H-(AC_L-V_HC_H lub V_LC_L-AC_H); oraz (f) (A-Y)n-(VLCL-VHCH)2, gdzie każda litera A oznacza identyczne lub różne sekwencje aminokwasowe adhezyn;

VL oznacza domeną zmienną łańcucha lekkiego immunoglobuliny;

VH oznacza domeną zmienną łańcucha ciężkiego immunoglobuliny;

CL oznacza domeną stałą łańcucha lekkiego immunoglobuliny;

CH oznacza domeną stałą łańcucha ciężkiego immunoglobuliny; n oznacza liczbę całkowitą większą niż 1;

Y oznacza resztę czynnika sieciującego.

Dla zwięzłości w powyższych strukturach zaznaczono jedynie kluczowe cechy; nie wskazano w nich ani domeny łączącej (J) lub innych domen immunoglobulin, ani też wiązań disiarczkowych.

PL 209 786 B1

Jednakże, gdy domeny te wymagane są do przejawienia aktywności biologicznej, należy przyjąć, że występują one w typowych lokalizacjach występowania w cząsteczkach immunoglobulin.

Alternatywnie, sekwencje adhezyn można wstawić pomiędzy sekwencje łańcucha ciężkiego i lekkiego immunoglobuliny, w taki sposób, że immunoglobulina zawiera chimerowy łańcuch ciężki. W takim rozwiązaniu sekwencje adhezyny poddaje się fuzji z 3' końcem łańcucha ciężkiego immunoglobuliny w każdym ramieniu, albo pomiędzy regionem zawiasowym a domeną CH2, albo pomiędzy domenami CH2 a CH3. Podobne struktury opisane zostały przez Hoogenboom i wsp., Mol.Immunol. 28: 1027-1037 (1991).

Chociaż w immunoadhezynach według niniejszego wynalazku nie jest wymagana obecność łańcucha lekkiego immunoglobuliny, to łańcuch ten może być obecny w strukturze, albo w postaci kowalencyjnie związanej z polipeptydem fuzyjnym adhezyna-łańcuch ciężki immunoglobuliny, albo w postaci fuzji bezpośrednio z adhezyną. W ostatnim przypadku, DNA kodujący łańcuch lekki immunoglobuliny ulega zazwyczaj koekspresji z DNA kodującym białko fuzyjne adhezyna-łańcuch ciężki immunoglobuliny. Po wydzieleniu hybrydowy łańcuch ciężki i łańcuch lekki będą miały postać kowalencyjnie związaną celem uzyskania struktury immunoglobulino-podobnej, zawierającej dwie połączone za pomocą wiązań disiarczkowych pary łańcuchów: ciężkich i lekkich. Odpowiednie sposoby, pozwalające na otrzymanie takich struktur ujawniono, na przykład, w Patencie USA nr 4,816,567, wydanym 23 marca 1989 r.

Immunoadhezyny zazwyczaj otrzymuje się poprzez fuzję sekwencji cDNA kodującej fragment adhezyny w ramce odczytu z sekwencją cDNA immunoglobuliny. Jednakże, zastosować można również fuzję z genomowymi fragmentami immunoglobuliny (patrz, np. Aruffo i wsp., Cell 61: 1303-1313 (1990) oraz Stamenkovic i wsp., Cell 66: 1133-1144 (1991)). W przypadku ostatniego typu fuzji do ekspresji wymagana jest obecność sekwencji regulatorowych Ig. cDNA kodujące regiony stałe łańcucha ciężkiego IgG można wyizolować w oparciu o opublikowane sekwencje pochodzące z bibliotek cDNA pochodzących z limfocytów ze śledziony lub krwi obwodowej, z zastosowaniem technik hybrydyzacji lub łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR). cDNA kodujący części „adhezyny i immunoglobuliny cząsteczki immunoadhezyny wstawia się razem do wektora plazmidowego, wywołującego wydajną ekspresję w wybranych komórkach gospodarza.

C. Wektory, komórki gospodarza i sposoby rekombinacji

Zgodnie z wynalazkiem opisano wyizolowany kwas nukleinowy kodujący ujawniony tu wariant polipeptydu, wektory i komórki gospodarza oraz techniki rekombinacji, pozwalające na otrzymanie wariantu polipeptydu.

W celu otrzymania wariantu polipeptydu za pomocą techniki rekombinacji kodujący go kwas nukleinowy izoluje się, a następnie wstawia do odpowiedniego wektora do replikacji w celu dalszego klonowania (amplifikacji DNA) lub ekspresji. DNA kodujący wariant polipeptydu łatwo izoluje się i sekwencjonuje za pomocą konwencjonalnych procedur (np. z zastosowaniem sond oligonukleinowych zdolnych do specyficznego wiązania genów kodujących wariant polipeptydu). Dostępnych jest wiele wektorów. Wektor składa się, ogólnie, lecz bez ograniczenia, z jednego lub więcej spośród następujących elementów: sekwencji sygnałowej, miejsca początku replikacji, jednego lub więcej genów markerowych, elementu wzmacniającego (enhancer), promotora i sekwencji terminacji transkrypcji.

(i) Element sekwencji sygnałowej

Opisany tu wariant polipeptydu może być otrzymany drogą rekombinacji, nie tylko bezpośrednio, ale również jako polipeptyd fuzyjny z polipeptydem heterologicznym, który dogodnie jest sekwencją sygnałową lub innym polipeptydem posiadającym specyficzne miejsce cięcia na N-końcu dojrzałego białka lub polipeptydu. Dogodnie wybraną sekwencją sygnałową jest sekwencja rozpoznawana i przekształcana przez komórki gospodarza (tj. cięta przez peptydazę sygnałową). W przypadku prokariotycznych komórek gospodarza, nie rozpoznających i nie przekształcających natywnej sekwencji sygnałowej wariantu polipeptydu, sekwencją tą zastąpuje się odpowiednią prokariotyczną sekwencją sygnałową wybraną, na przykład, z grupy sekwencji liderowych alkalicznej fosfatazy, penicylinazy, lpp lub termostabilnej enterotoksyny II. W przypadku wydzielania przez komórki drożdży natywną sekwencję sygnałową można podstawić, np. drożdżową sekwencją liderową inwertazy, czynnika α (włączając sekwencje liderowe czynników α Saccharomyces i Kluyveromyces) lub kwaśnej fosfatazy, glukoamylazy z C.albicans lub sekwencji sygnałowych opisanych w WO 90/13646. W przypadku ekspresji w komórkach ssaczych dostępne są ssacze sekwencje sygnałowe, jak również wirusowe wydzielnicze sekwencje liderowe, na przykład, sekwencja sygnałowa gD wirusa opryszczki.

PL 209 786 B1

DNA takiego regionu prekursorowego poddaje się ligacji w ramce odczytu z DNA kodującym wariant polipeptydu.

(II) Element miejsca początku replikacji

Zarówno wektory ekspresyjne, jak i wektory do klonowania, zawierają sekwencję kwasu nukleinowego, pozwalającą na replikację wektora w jednej lub więcej wybranych komórkach gospodarza. Ogólnie, w wektorach do klonowania sekwencją tą jest sekwencja, która umożliwia niezależną od chromosowego DNA gospodarza replikację wektora oraz zawiera miejsce początku replikacji lub autonomicznie replikujące sekwencje. Sekwencje te są dobrze znane dla wielu bakterii, drożdży i wirusów. Miejsce początku replikacji plazmidu pBR322 jest odpowiednie dla większości bakterii Gram-ujemnych, miejsce początku replikacji plazmidu 2 μ jest odpowiednie dla drożdży, natomiast dla wektorów do klonowania w komórkach ssaczych odpowiednie są miejsca początku replikacji różnych wirusów (SV40, polioma, adenowirus, VSV lub BPV). Ogólnie, element miejsca początku replikacji nie jest niezbędny w ssaczych wektorach ekspresyjnych (miejsce początku replikacji z SV40 stosowane jest zazwyczaj jedynie z tego powodu, że zawiera wczesny promotor).

(iii) Element genu selekcyjnego

Wektory do klonowania i wektory ekspresyjne mogą zawierać gen selekcji, zwany również markerem selekcyjnym. Zazwyczaj geny selekcyjne kodują białka, które (a) nadają oporność na antybiotyki lub inne toksyny, np. ampicylinę, metotreksat lub tetracyklinę, (b) uzupełniają auksotroficzne niedobory, lub (c) dostarczają istotnych składników odżywczych, niedostępnych w pożywkach złożonych, np. gen kodujący racemazę D-alaniny dla Bacilli.

W jednym z przykładów schematu selekcji w celu zahamowania wzrostu komórek gospodarza wykorzystuje się lek. Te komórki, które zostały skutecznie transformowane heterologicznym genem, wytwarzają białko nadające oporność na lek, i przeżywają zatem w warunkach schematu selekcji. Przykładem takiej selekcji dominującej jest zastosowanie leków, takich jak neomycyna, kwas mykofenolowy i higromycyna.

Innym przykładem odpowiednich markerów selekcyjnych dla komórek ssaczych są markery, które pozwalają na identyfikację komórek, które są kompetentne do pobrania kwasu nukleinowego kodującego wariant polipeptydu, takie jak DHFR, kinaza tymidynowa, metalotioneina I i II, zwłaszcza geny metalotioneiny naczelnych, deaminazy adenozynowej, dekarboksylazy ornitynowej, itp.

Na przykład, komórki transformowane genem selekcyjnym DHFR najpierw identyfikuje się poprzez hodowlę wszystkich transformantów w pożywce hodowlanej zawierającej metotreksat (Mtx), antagonistę kompetycyjnego DHFR. W przypadku dzikiego typu DHFR odpowiednią komórką gospodarza jest linia komórkowa komórek jajnika chomika chińskiego (CHO), bez aktywności DHFR.

Alternatywnie, komórki gospodarza (szczególnie dzikiego typu zawierające endogenną DHFR), transformowane lub kotransformowane sekwencjami DNA kodującymi wariant polipeptydu, białka DHFR dzikiego typu i inny marker selekcyjny, taki jak 3'-fosfotransferaza aminoglikozydowa (APH), mogą być poddawane selekcji poprzez wzrost komórek w pożywce zawierającej czynnik selekcyjny dla markera selekcyjnego, taki jak antybiotyk aminoglikozydowy, np. kanamycyna, neomycyna lub G418. Patrz Patent USA nr 4,965,199.

Odpowiednim genem selekcyjnym do zastosowania w przypadku drożdży jest gen trp1 obecny w plazmidzie drożdżowym Yrp7 (Stinchcomb i wsp., Nature, 282:39 (1979)). Gen trp1 dostarcza markera selekcyjnego dla zmutowanego szczepu drożdży, pozbawionego zdolności do wzrostu na tryptofanie, na przykład, ATCC Nr 44076 lub PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). Obecność uszkodzonego trp1 w genomie drożdżowych komórek gospodarza zapewnia skuteczne warunki do wykrywania transformacji poprzez hodowlę bez tryptofanu. Podobnie, zdolność do wzrostu szczepów drożdży nie posiadających Leu2 (ATCC 20,622 lub 38,626) jest uzupełniana za pomocą plazmidów dostarczających gen Leu2.

Ponadto, wektory pochodzące z 1,6 μm, kolistego plazmidu pKD1 mogą być wykorzystane do transformacji drożdży Kluyveromyces. Alternatywnie, dla K.lactis opisano system ekspresji do wytwarzania na dużą skalę rekombinowanej chymozyny cielęcej. Van den Berg, Bio/Technology, 8: 135 (1990). Ujawniono również stabilne, wielokopijne wektory ekspresyjne służące do wydzielania dojrzałej, rekombinowanej, ludzkiej albuminy przez szczepy drożdży przemysłowych Kluyveromyces. Fleer i wsp., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991).

(iv) Element promotora

Wektory ekspresyjne i wektory do klonowania zazwyczaj posiadają rozpoznawany przez organizm gospodarza promotor, operacyjnie przyłączony do kwasu nukleinowego wariantu polipeptydu.

PL 209 786 B1

Odpowiednie do zastosowania w prokariotycznych komórkach gospodarza promotory obejmują układy promotora phoA, β-laktamazy i laktozy, układ promotora alkalicznej fosfatazy, tryptofanu (trp) oraz promotory hybrydowe, takie jak promotor tac. Jednakże, odpowiednie są również inne znane promoto -ry bakteryjne. Promotory do zastosowania w układach bakteryjnych zawierają także sekwencję Shine-Dalgarno, połączoną operacyjnie z DNA kodującym wariant polipeptydu.

Znane są sekwencje promotorowe dla Eukariotów. Prawie wszystkie geny eukariotyczne posiadają region bogaty w reszty AT, zlokalizowany w przybliżeniu 25 do 30 reszt powyżej miejsca, gdzie rozpoczyna się transkrypcja. Inną sekwencją występującą w wielu genach 70 do 80 reszt powyżej miejsca rozpoczęcia transkrypcji jest region CNCAAT, gdzie N jest dowolnym nukleotydem. Przy 3'-końcu większości genów eukariotycznych znajduje się sekwencja AATAAA, która może stanowić sygnał do dodania ogona poli-A do 3'-końca sekwencji kodującej. Wszystkie te sekwencje odpowiednio wstawia się do eukariotycznych wektorów ekspresyjnych.

Przykładami odpowiednich sekwencji promotorowych do zastosowania w drożdżowych komórkach gospodarza są kinaza 3-fosfoglicerynianowa lub inne enzymy glikolityczne, takie jak enolaza, dehydrogenaza gliceroaldehyd-3-fosforanowa, heksokinaza, dekarboksylaza pirogronianowa, fosfofruktokinaza, izomeraza glukozo-6-fosforanowa, mutaza 3-fosfoglicerynianowa, kinaza pirogronianowa, izomeraza triozofosforanowa, izomeraza fosfoglukozowa i glukokinaza.

Innymi promotorami drożdżowymi są promotory indukowalne, pozwalające na dogodną kontrolę transkrypcji poprzez warunki wzrostu, takie jak regiony promotorowe dla dehydrogenazy alkoholowej 2, izocytochromu C, kwaśnej fosfatazy, enzymów degradacyjnych związanych z metabolizmem azotu, metalotioneiny, dehydrogenazy gliceroaldehyd-3-fosforanowej oraz enzymów odpowiedzialnych za wykorzystanie maltozy i galaktozy. Odpowiednie wektory i promotory do zastosowania w przypadku ekspresji u drożdży opisano ponadto w EP 73,657. Wraz z promotorami drożdżowymi dogodnie stosuje się drożdżowe sekwencje wzmacniające.

Transkrypcja wariantu polipeptydu z wektorów w ssaczych komórkach gospodarza jest kontrolowana, na przykład, przez promotory otrzymane z genomu wirusów, takich jak wirus polioma, wirus ospy ptasiej, adenowirus (taki jak Adenowirus 2), wirus brodawczaka wołowego, wirus mięsaka ptaków, cytomegalowirus, retrowirus, wirus zapalenia wątroby typu B i w szczególności, Małpi Wirus 40 (SV40), z heterologicznych promotorów ssaczych, np. promotor aktyny lub promotor immunoglobuliny, z promotorów genów szoku cieplnego, pod warunkiem że, promotory te są kompatybilne z układem komórek gospodarza.

Wczesne i późne promotory wirusa SV40 otrzymuje się zazwyczaj z fragmentu restrykcyjnego SV40, zawierającego również miejsce początku replikacji wirusa SV40. Bardzo wczesny promotor ludzkiego cytomegalowirusa dogodnie otrzymuje się w postaci fragmentu restrykcyjnego HindlllE. Układ do ekspresji DNA w ssaczych komórkach gospodarza wykorzystujący jako wektor wirus brodawczaka wołowego ujawniono w Patencie USA nr 4,601,978. Patrz również Reyes i wsp., Nature 297: 598-601 (1982), gdzie omówiono ekspresję cDNA ludzkiego interferonu β w mysich komórkach pod kontrolą promotora kinazy tymidynowej z wirusa opryszczki. Alternatywnie, w funkcji promotora może być zastosowane długie końcowe powtórzenie z wirusa mięsaka Rous'a.

(v) Element wzmacniający

Transkrypcję DNA kodującego opisany tu wariant polipeptydu u wyższych Eukariotów często zwiększa się poprzez wstawienie sekwencji wzmacniających do wektora. Znanych jest wiele sekwencji wzmacniających, pochodzących z genów ssaczych (globina, elastaza, albumina, α-fetoproteina oraz insulina). Jednakże zazwyczaj możliwe jest zastosowanie sekwencji wzmacniającej pochodzącej z wirusa komórek eukariotycznych. Przykłady obejmują sekwencje wzmacniające SV40, po stronie późnej miejsca początku replikacji (100-270 pz), sekwencje wzmacniające wczesnego promotora cytomegalowirusa, sekwencje wzmacniające wirusa polioma po stronie późnej miejsca początku replikacji i sekwencje wzmacniające adenowirusa. Patrz również, Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982), gdzie opisano elementy wzmacniające aktywację promotorów eukariotycznych. Sekwencja wzmacniająca może być wstawiona do wektora w pozycji 5' lub 3' względem sekwencji kodującej wariant polipeptydu, lecz zalecaną lokalizacją jest położenie 5' od promotora.

(vi) Element terminacji transkrypcji

Wektory ekspresyjne stosowane w eukariotycznych komórkach gospodarza (drożdże, grzyby, owady, rośliny, zwierzęta, ludzie lub komórki jądrowe innych organizmów wielokomórkowych) obejmują również sekwencje niezbędne do terminacji transkrypcji i stabilizacji mRNA. Sekwencje te powszechnie występują od 5' końca, czasami końca 3', niepodlegających translacji regionów DNA lub

PL 209 786 B1 cDNA eukariotycznego lub wirusowego. Regiony te zawierają segmenty nukleotydowe transkrybowane w postaci poliadenylowanych fragmentów w niepodlegającym translacji regionie mRNA kodującego wariant polipeptydu. Jednym z użytecznych elementów terminacji transkrypcji jest region poliadenylacji wołowego hormonu wzrostu. Patrz WO94/11026 i zawarty tam opis wektora ekspresyjnego.

(vii) Selekcja i transformacja komórek gospodarza

Odpowiednimi komórkami gospodarza do klonowania lub ekspresji DNA w wektorach są opisane powyżej komórki prokariotyczne, drożdżowe lub komórki wyższych Eukariotów. Odpowiednie do tego celu komórki prokariotyczne obejmują eubacteria, takie jak mikroorganizmy Gram-ujemne lub Gram-dodatnie, na przykład, Enterobacteriaceae, takie jak Escherichia, np. E.coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, np. Salmonella typhimurium, Serratia, np. Serratia marcescans oraz Shigella, jak również Bacillus, np. B. subtilis i B. lichaniformis (np. B. lichaniformis 41P, zawarty w DD 266,710, opublikowany 12 kwietnia 1989), Pseudomonas, np. P. aeruginosa i Streptomyces. Jednymi z zalecanych komórek gospodarza E.coli do klonowania są komórki E.coli29A (ATCC 31,446), jednak odpowiednie są również inne szczepy, takie jak E.coliB, E.coliX1776 (ATCC 31,537) i E.coliW3110 (ATCC 27,325). Wymienione tu szczepy nie służą ograniczeniu, ale podane zostały jedynie przykładowo.

Oprócz mikroorganizmów prokariotycznych, również mikroorganizmy eukariotyczne, takie jak grzyby strzępkowate lub drożdże, są odpowiednie do klonowania i ekspresji gospodarzami dla wektorów kodujących wariant polipeptydu. Spośród niższych Eukariotów najpowszechniej stosowanymi mikroorganizmami gospodarza są drożdże Saccharomyces cerevisiaa, lub powszechnie znane drożdże piekarskie. Jednakże, powszechnie dostępne są i użyteczne w niniejszym wynalazku liczne inne rodzaje, gatunki i szczepy, takie jak Schizosaccharomyces pombe: Kluyveromyces, tak jak np., K.lactis, K.fragilis (ATCC 12,424), K.bulgaricus (ATCC 16,045), K.wickeramii (ATCC 24,178), K.waltii (ATCC 56,500), K.drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans i K.marxianus; Yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, tak jak Schwanniomyces occidentalis i grzyby strzępkowe, takie jak, np., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium oraz Aspergillus, takie jak A.nidulans i A.niger.

Odpowiednie komórki gospodarza do ekspresji glikozylowanego wariantu polipeptydu pochodzą, z organizmów wielokomórkowych. Przykłady komórek bezkręgowców obejmują komórki roślinne i owadzie. Zidentyfikowano liczne szczepy i warianty bakulowirusowe oraz odpowiednie permisywne owadzie komórki gospodarza, z gospodarzy takich jak Spodoptera frugiperda (gąsienica), Aades aegypti (komar), Aadas albopictus (komar), Drosophila melanogaster (muszka owocowa) oraz Bombyx mori. Dostępnych jest wiele szczepów wirusowych do transfekcji, np. wariant L-1 Autographa californica NPV oraz szczep Bm-5 Bombyx mori NPV i wirusy te mogą być stosowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem, w szczególności do transfekcji komórek Spodoptara frugiparda.

Jako organizmy gospodarza mogą być również wykorzystane hodowle komórek roślinnych bawełny, kukurydzy, ziemniaka, soi, petunii, pomidora i tytoniu.

Jednakże, bardziej interesujące były komórki kręgowców, i dlatego namnażanie komórek kręgowców w hodowli (hodowle tkankowe) stało się powszechnie stosowaną procedurą. Przykładami użytecznych ssaczych linii komórek gospodarza są linia komórek nerki małpy transformowana SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linia komórek embrionalnych nerki człowieka (komórki 293 lub 293 subklonowane do wzrostu w zawiesinie, Graham i wsp., J.Gen Virol. 36:59 (1977); komórki nerki młodego chomika (BHK, ATCC CCL10); komórki jajnika chomika chińskiego/-DHFR (CHO, Urlaub i wsp., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 77: 4216 (1980)); komórki Sertoliego myszy (TM4, Mather, Biol.Reprod. 23: 243-251 (1980)); komórki nerki małpy (CV1 ATCC CCL 70); komórki nerki afrykańskiej małpy zielonej (VERO-76, ATCC CRL-1587); ludzkie komórki raka szyjki macicy (HELA, ATCC CCL2); komórki nerki psa (MDCK, ATCC CCL 34); komórki wątroby szczura (Buffalo) (3RL 3A, ATCC CRL 1442); komórki płuca człowieka (W138, ATCC CCL 75); komórki wątroby człowieka (Hep G2, HB 8065); komórki raka sutka myszy (MMT 060562, ATCC CCL51); komórki TRI (Mather i wsp., Annals N. Y.Acad.Sci. 383:44-68 (1932)); komórki MRC5; komórki FS4 oraz linia komórek ludzkiego wątrobiaka (Hep G2).

W celu otrzymania wariantu polipeptydu komórki gospodarza poddaje się transformacji za pomocą wyżej wymienionych wektorów ekspresyjnych lub do klonowania, i hodowli w konwencjonalnych pożywkach odżywczych, zmodyfikowanych odpowiednio do indukcji promotorów, selekcji transformantów lub amplifikacji genów kodujących pożądane sekwencje.

PL 209 786 B1 (viii) Hodowla komórek gospodarza

Komórki gospodarza stosowane do produkcji opisanego tu wariantu polipeptydu mogą być hodowane w rozmaitych pożywkach. Do hodowli takich komórek gospodarza odpowiednie są dostępne handlowo pożywki, takie jak pożywka Ham'a F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) oraz Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma). Ponadto, jako pożywki hodowlane dla komórek gospodarza może być zastosowana jakakolwiek pożywka opisana w Ham i wsp., Meth.Enz. 58: 44 (1979), Barnes i wsp., A102: 255 (1980), U.S. Patent No. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655 lub 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195 lub U.S. Patent Re. 30,985. Jakakolwiek z tych pożywek może być, w razie potrzeby, uzupełniona hormonami i/lub innymi czynnikami wzrostu (takimi jak insulina, transferyna lub naskórkowy czynnik wzrostu), solami (takimi jak chlorek sodu, wapnia, magnezu i fosforan), buforami (takimi jak HEPES), nukleotydami (takimi jak adenozyna i tymidyna), antybiotykami (takimi jak GENTAMYCYNA™), pierwiastkami śladowymi (zdefiniowanymi jako związki nieorganiczne obecne zazwyczaj w końcowych stężeniach rzędu mikromola) oraz glukozą lub równoważnym źródłem energii. Do pożywki można dodać jakiekolwiek inne dodatki w odpowiednich stężeniach, znanych specjalistom w dziedzinie. Warunki hodowli, takie jak temperatura, pH itp., są takie jak stosowano już uprzednio do selekcji komórek gospodarza do ekspresji, i są znane specjalistom w dziedzinie.

(ix) Oczyszczanie wariantu polipeptydu

W przypadku stosowania technik rekombinacyjnych wariant polipeptydu można otrzymywać wewnątrzkomórkowo, w przestrzeni peryplazmatycznej, lub w postaci bezpośrednio wydzielanej do pożywki. Jeżeli wariant polipeptydu wytwarza się wewnątrzkomórkowo, to w pierwszym etapie usuwa się szczątki, albo komórek gospodarza albo fragmentów poddanych lizie, na przykład drogą wirowania lub ultrafiltracji. Carter i wsp., Bio/Technology 10:163-167 (1992) opisali procedurę izolacji przeciwciał wydzielanych do przestrzeni peryplazmatycznej E.coli. W skrócie, pastę komórkową rozmraża się w obecności octanu sodu (pH 3,5), EDTA i fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) przez około 30 min. Szczątki można usunąć drogą wirowania. W przypadku gdy wariant polipeptydu wydzielany jest do podłoża, supernatanty z takich układów ekspresyjnych zazwyczaj zatęża się za pomocą dostępnych handlowo filtrów odpowiednich do zatężania białek, na przykład, Amicon lub Millipore Pellicon ultrafiltration unit. W celu zahamowania proteolizy na jakimkolwiek etapie można dodać inhibitor proteazy, taki jak PMSF, jak również antybiotyki, zapobiegające wzrostowi przypadkowej mikroflory zanieczyszczającej.

Kompozycja wariantu polipeptydu otrzymana z komórek może być poddana oczyszczaniu za pomocą, na przykład, chromatografii na hydroksyapatycie, elektroforezy żelowej, dializy i chromatografii powinowactwa, przy czym ta ostatnia technika jest zalecaną techniką oczyszczania. Skuteczność białka A jako liganda powinowactwa zależy od gatunku i odmiany izotypowej jakiegokolwiek regionu Fc immunoglobuliny, obecnego w wariancie polipeptydu. Białko A może być stosowane do oczyszczania wariantów polipeptydów opartych na ludzkich łańcuchach ciężkich y1, y2 lub y4 (Lidmark i wsp., J.Immunol.Meth. 62: 1-13 (1983)). Białko G jest polecane w przypadku wszystkich mysich odmian izotypowych oraz w przypadku ludzkiego y3 (Guss i wsp., EMBO J. 5:1567-1575 (1936)). W większości przypadków macierzą, do której przyłączony jest ligand jest agaroza, lecz dostępne również są inne macierze. Macierze mechanicznie stabilne, takie jak szkło o kontrolowanej porowatości lub poli(styrenodiwynylo) benzen, pozwalają osiągnąć szybszy przepływ i krótszy czas oczyszczania niż w przypadku zastosowania agarozy. W przypadku oczyszczania wariantu polipeptydu zawierającego domenę CH3 użyteczna jest żywica Bakerbond ABX™ (J.T.Baker, Phillipsburg, NJ). W zależności od oczyszczanego wariantu polipeptydu mogą być zastosowane także inne techniki oczyszczania białka, takie jak frakcjonowanie na kolumnie do chromatografii jonowymiennej, wytrącanie etanolem, HPLC z odwróconą fazą, chromatografia na krzemionce, chromatografia na SEPHAROSE™ z heparyną, chromatografia kationowymienna lub anionowymienna na żywicy (taka jak na kolumnie z kwasem poliasparaginowym), ogniskowanie chromatograficzne, SDS-PAGE oraz wytrącanie siarczanem amonu.

Po jakimkolwiek z etapów oczyszczania mieszaninę wariantu polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania i zanieczyszczeń można poddać chromatografii oddziaływań hydrofobowych w niskim pH, z wykorzystaniem buforu elucyjnego w pH 2,5-4,5, dogodnie przy niskich stężeniach soli (np. od około 0-0,25 M soli).

PL 209 786 B1

E. Preparaty farmaceutyczne

Preparaty terapeutyczne wariantu polipeptydu przygotowuje się do przechowywania poprzez wymieszanie wariantu polipeptydu o pożądanym stopniu czystości z dowolnymi, farmaceutycznie akceptowanymi, nośnikami, zaróbkami lub substancjami stabilizującymi (Remington's Pharmaceutical Sciences 16^th Ed., Osol, A.Ed. (1980)), w postaci preparatów liofilizowanych lub roztworów wodnych. Akceptowalne nośniki, zaróbki lub substancje stabilizujące są nietoksyczne dla przyjmujących lek w stosowanych dawkach i stężeniach, i obejmują bufory, takie jak fosforanowy, cytrynianowy i bufory innych kwasów organicznych; antyutleniacze, włączając kwas askorbinowy i metioninę; konserwanty (takie jak chlorek oktadecylodimetylobenzyloamonu; chlorek heksametonium; chlorek benzalkonium; chlorek benzetonium; fenol, alkohol butylowy lub benzylowy; parabeny alkilowe, takie jak paraben metylu lub propylu; katechol; rezorcynol; cykloheksanol; 3-pentanol oraz m-krezol); polipeptyd o niskiej masie cząsteczkowej (krótszy niż około 10 reszt); białka, takie jak albumina surowicy, żelatyna lub immunoglobuliny; hydrofilowe polimery, takie jak poliwinylopirolidon; aminokwasy, takie jak glicyna, glutamina, asparagina, histydyna, arginina lub lizyna; monosacharydy, dwusacharydy i inne węglowodany, włączając glukozę, mannozę lub dekstryny; czynniki chelatujące, takie jak EDTA; cukry, takie jak sacharoza, mannitol, trehaloza lub sorbitol, tworzące sole przeciwjony, takie jak sód,; kompleksy z jonami metali (np. kompleksy Zn-białko) i/iub surfaktanty niejonowe, takie jak TWEEN™, PLURONICS™ lub glikol polietylenowy (PEG).

Opisywany tu preparat może również zawierać więcej niż jeden związek czynny, jeżeli jest to niezbędne w przypadku danego wskazania terapeutycznego, dogodnie takie, które mają komplementarne aktywności, i które nie wpływają niekorzystnie na siebie. Cząsteczki te występują dogodnie w połączeniach, w ilościach odpowiednich dla zamierzonego celu.

Składniki czynne mogą również być zawarte w mikrokapsułkach otrzymanych, na przykład, techniką koacerwacji lub polimeryzacji międzyfazowej, na przykład, odpowiednio mikrokapsułkach hydroksymetylocelulozowych lub żelatynowych oraz z polimetakrylanu metylu, w koloidalnych układach dostarczania leku (na przykład liposomy, mikrosfery albuminowe, mikroemulsje, nano-cząsteczki i nanokapsułki) lub makroemulsje. Techniki te opisano w Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^th ed., Osol, A.Ed. (1980).

Preparaty do podawania in vivo muszą być sterylne. Można to łatwo uzyskać poprzez filtrację przez sterylne błony do filtracji.

Możliwe jest przygotowanie preparatów o przedłużonym uwalnianiu. Odpowiednie przykłady preparatów o przedłużonym uwalnianiu obejmują półprzepuszczalne matryce ze stałych polimerów hydrofobowych zawierających wariant polipeptydu, przy czym matryce te mają różną postać, np. warstwy lub mikrokapsułki. Przykładami matryc o przedłużonym uwalnianiu są poliestry, hydrożele (na przykład, poli(2-hydroksyetylometakrylan) lub alkohol poliwinylowy, polilaktydy (Patent USA nr 3,773,919), kopolimery kwasu L-glutaminowego i Y-etylo'L-glutaminianu, niedegradowalny octan etyleno-winylu, degradowalne kopolimery kwasu mlekowego i kwasu glikolowego, takie jak LUPRON DEPOT™ (wstrzykiwalne mikrosfery składające się z kopolimeru kwasu mlekowego i kwasu glikolowego oraz octanu leuprolidu), oraz kwas poli-D-(-)-3-hydroksymasłowy. Podczas gdy polimery, takie jak octan etyleno-winylu i kwas mlekowy-kwas glikolowy, pozwalają na uwalnianie cząsteczek przez ponad 100 dni, to pewne hydrożele uwalniają białka przez krótsze okresy czasu. W przypadku gdy znajdujące się w kapsułkach przeciwciała pozostają w organizmie przez dłuższy czas, mogą one ulegać denaturacji lub agregacji na skutek panujących warunków wilgotności w temperaturze 37°C, powodujących brak aktywności biologicznej i możliwe zmiany immunogenności. W zależności od mechanizmu działania opracować można racjonalne strategie. Na przykład, w przypadku wystąpienia procesu agregacji, przebiegającego w wyniku powstawania międzycząsteczkowych wiązań disiarczkowych S-S poprzez wymianę grup tio-disiarczkowych, stabilizację można uzyskać poprzez modyfikację reszt sulfhydrylowych, liofilizację z kwaśnych roztworów, kontrolę wilgotności, zastosowanie odpowiednich dodatków i opracowanie specyficznych kompozycji matrycy polimerowej.

F. Nieterapeutyczne zastosowania wariantu polipeptydu

Opisany tu wariant polipeptydu może być zastosowany jako czynnik do oczyszczania przez powinowactwo. W procesie tym, wariant polipeptydu immobilizuje się jest na fazie stałej, takiej jak żywica Sephadex lub papier filtracyjny, za pomocą dobrze znanych w dziedzinie metod. Immobilizowany wariant polipeptydu kontaktuje się z próbką zawierającą oczyszczany antygen, a następnie nośnik płucze się odpowiednim rozpuszczalnikiem, usuwającym zasadniczo wszystkie składniki z próbki, za wyjątkiem oczyszczanego antygenu związanego z immobilizowanym wariantem polipeptydu. Ostatecznie,

PL 209 786 B1 nośnik płucze się odpowiednim innym rozpuszczalnikiem, takim jak bufor glicynowy, pH 5,0, który uwalnia oczyszczany antygen od wariantu polipeptydu.

Wariant polipeptydu może być również użyteczny w testach diagnostycznych, np. do wykrywania ekspresji antygenu będącego przedmiotem zainteresowania w specyficznych komórkach, tkankach lub surowicy.

Do celów diagnostycznych wariant polipeptydu zazwyczaj będzie znakowany za pomocą wykrywalnych ugrupowań. Dostępne są liczne znaczniki, które ogólnie można podzielić na następujące grupy:

(a) radioizotopy, takie jak ³⁵S, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H i ¹³¹I.

Wariant polipeptydu może byc znakowany izotopowo przykładowo za pomocą technik opisanych w Current Protocols in Immunology, tom 1 i 2, Coligen i wsp., Ed. Wiley-Interscience, New York, New York Pubs. (1991), a radioaktywność można mierzyć za pomocą licznika scyntylacyjnego.

(b) znaczniki fluorescencyjne, które można zastosować to chelaty metali ziem rzadkich (chelaty europu) lub fluoresceina i jej pochodne, rodamina i jej pochodne, dansyl, lissamina, fikoerytryna i barwnik Texas Red. Znaczniki fluorescencyjne można sprzęgać z wariantem polipeptydu za pomocą technik ujawnionych, na przykład, w Current Protocols in Immunology, jak powyżej. Fluorescencję można oceniać częściowo za pomocą fluorymetru.

(c) różne znaczniki typu enzym-substrat, z których część opisano w Patencie USA nr 4,257,149. Enzym, ogólnie, katalizuje chemiczną zmianę substratu chromogennego, którą można mierzyć za pomocą różnych technik. Na przykład, enzym może katalizować zmianę koloru substratu, którą można mierzyć spektrofotometrycznie. Alternatywnie, enzym może zmieniać fluorescencję lub chemiluminescencję substratu. Techniki oceny ilościowej zmian fluorescencji opisano powyżej. Substrat chemiluminescencyjny zostaje elektronowo wzbudzony w wyniku reakcji chemicznej, i może emitować następnie światło, które można mierzyć (na przykład za pomocą chemiluminometru) lub przekazuje energię na akceptor fluorescencyjny. Przykłady znaczników enzymatycznych obejmują lucyferazy (np. lucyferazę ze świetlika i lucyferazę bakteryjną; Patent USA nr 4,737,456), lucyferynę, 2,3-dihydroftalazynodiony, dehydrogenazę jabłczanową, ureazę, peroksydazę, taką jak peroksydaza chrzanowa (HRPO), alkaliczną fosfatazę, β-galaktozydazę, glukoamylazę, lizozym, oksydazy sacharydów (np. oksydazę glukozy, oksydazę galaktozy i dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową) oraz heterocykliczne oksydazy (takie jak urykaza i oksydaza ksantynowa), laktoperoksydaza, mikroperoksydaza, itp. Techniki sprzęgania enzymów z przeciwciałami opisano w O'Sullivan i wsp., Methods for the Preparation of Enzyme-Antybody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, Methods in Enzym, (ed J.Langone&H.Van Vunakis), Academic Press, New York, 73: 147-166 (1981).

Przykłady połączeń enzym-substrat obejmują, na przykład:

(i) Peroksydazę chrzanową (HRPO) i peroksydazę wodorową jako substrat, przy czym peroksydaza wodorowa utlenia prekursor barwnika (np. diaminę ortofenylenu (OPD) lub chlorowodorek 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB));

(ii) Alkaliczną fosfatazę (AP) i fosforan paranitrofenylu jako substrat chromogenny; i (iii) β-D-galaktozydazę (β-D-Gal) i substrat chromogenny (np. p-nitrofenylo-e-D-galaktozydaza) lub substrat fluorogenny (4-metylolumbelliferylo-e-D-galaktozydaza).

Istnieją również liczne inne połączenia enzym-substrat, znane specjalistom w dziedzinie. Ogólny ich przegląd można znaleźć w Patencie USA nr 4,257,149 i 4,318,980.

Znacznik może być czasami sprzęgany z wariantem polipeptydu w sposób pośredni. Specjalistom w dziedzinie znane są liczne techniki odpowiednie do tego celu. Na przykład, wariant polipeptydu może być sprzęgany z biotyną, a jakikolwiek z trzech wymienionych powyżej grup znaczników może być sprzęgany z awidyną i odwrotnie. Biotyna ulega selektywnemu wiązaniu z awidyną, co powoduje, że znacznik może być sprzęgany z wariantem polipeptydu w sposób pośredni. Alternatywnie, w celu sprzęgania pośredniego znacznika z wariantem polipeptydu, wariant polipeptydu sprzęga się z małym haptenem (np. digoksyną), a jeden z wymienionych powyżej znaczników sprzęga się ze skierowanym przeciwko cząsteczce haptenu wariantem polipeptydu (np. przeciwciałem przeciwko digoksynie). Zatem, można przez to uzyskać pośrednie sprzęganie znacznika z wariantem polipeptydu.

W innym rozwiązaniu nie jest konieczne znakowanie wariantu polipeptydu, a jego obecność wykrywa się z użyciem znakowanego przeciwciała wiążącego się z wariantem polipeptydu.

Opisany tu wariant polipeptydu może być wykorzystany w jakiejkolwiek znanej metodzie analizy, takiej jak analiza wiązania kompetycyjnego, bezpośrednie i pośrednie analizy kanapkowe i immu38

PL 209 786 B1 noprecypitacyjne. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).

Wariant polipeptydu może być także wykorzystany w testach diagnostycznych in vivo. Ogólnie, wariant polipeptydu jest znakowany radioizotopowo (tak jak ¹¹¹ln, ⁹⁹Tc, ¹⁴C, ¹³¹I, ¹²⁵I, ³H, ³²P lub ³⁵S), co pozwala na zlokalizowanie antygenu lub eksprymującej go komórki za pomocą immunoscyntygrafii.

G. Zastosowania wariantu polipeptydu in vivo

Opisany tu wariant polipeptydu może być wykorzystany w leczeniu ssaków, np. pacjentów cierpiących na choroby lub zaburzenia lub predysponowanych do takich chorób lub zaburzeń, gazie podawanie wariantu polipeptydu mogłoby przynieść korzyść. Wiele stanów można leczyć z zastosowaniem wariantu polipeptydu i obejmują one raka (np. gdzie wariant polipeptydu wiąże się z receptorem HSR2, CD20 lub czynnik wzrostu śródłonka naczyniowego (VEGF)); alergie, takie jak astma (przeciwciało anty-IgE) oraz zaburzenia zależne od LFA1 (np. gdzie wariantem polipeptydu jest przeciwciało anty-LFA-1 lub anty-ICAM-1), itp.

W przypadku gdy przeciwciało wiąże się z receptorem HER2, zalecanym zaburzeniem jest rak z ekspresją HER2, np. łagodny lub złośliwy guz wykazujący nadekspresję receptora HER2. Raki te obejmują, lecz bez ograniczenia, raka sutka, raka płaskokomórkowego, raka drobnokomórkowego płuc, raka niedrobnokomórkowego płuc, raka przewodu żołądkowo-jelitowego, raka trzustki, glejaka, raka szyjki, raka jajników, raka pęcherza, wątrobiaka, raka okrężnicy, raka jelita grubego, raka śluzówki macicy, raka ślinianek, raka nerki, raka wątroby, raka prostaty, raka sromu, raka tarczycy, raka wątroby i różnych typów nowotworów głowy i szyi.

Zgodnie z niniejszym opisem możliwe jest otrzymanie polipeptydu zawierającego wariant regionu Fc o udoskonalonej lub zredukowanej aktywności ADCC. Cząsteczki takie znajdą zastosowanie w leczeniu różnorodnych zaburzeń.

Na przykład, wariant polipeptydu o wzmocnionej aktywności ADCC może być zastosowany do leczenia chorób lub zaburzeń, gdzie pożądane jest zniszczenie lub wyeliminowanie tkanki lub obcego mikroorganizmu. Na przykład, taki polipeptyd może znaleźć zastosowanie w leczeniu raka, zaburzeń zapalnych, zakażeń (np. bakteryjnych, wirusowych, grzybowych lub drożdżowych) lub innych stanów (takich jak wole), gdzie pożądane jest usunięcie tkanki, itp.

W przypadku gdy wariant polipeptydu wykazuje zredukowaną aktywność ADCC, może on być wykorzystany do leczenia chorób lub zaburzeń, gdzie pożądane jest zastosowanie polipeptydu zawierającego region Fc o dłuższym okresie półtrwania, przy czym dogodnie polipeptyd nie wykazuje niepożądanych funkcji efektorowych. Na przykład, polipeptyd zawierający region Fc może być przeciwciałem skierowanym przeciwko czynnikowi tkankowemu (TF); przeciwciałem skierowanym przeciwko IgE i przeciwciałem skierowanym przeciwko integrynie (np. przeciwciałem anty-a4e7). Pożądanym mechanizmem działania takich polipeptydów zawierających region Fc może być blokowanie par wiążących ligand-receptor. Ponadto, polipeptyd zawierający region Fc o zredukowanej aktywności ADCC może być agonistą przeciwciała.

Wariant polipeptydu podaje się za pomocą dowolnych w jakikolwiek możliwch środków, włączając podawanie pozajelitowe, podskórne, dootrzewnowe, dopłucne i donosowe, a w razie potrzeby miejscowego leczenia immunosupresyjnego podawanie w obrębie zmiany. Wlewy pozajelitowe obejmują podawanie domięśniowe, dożylne, dotętnicze, dootrzewnowe lub podskórne.

Ponadto, wariant polipeptydu podaje się odpowiednio drogą wlewu pulsowego, szczególnie w malejących dawkach wariantu polipeptydu. Dawkę podaje się dogodnie przez wstrzyknięcia, a w szczególności wstrzyknięcia dożylne lub podskórne, co częściowo zależy od tego czy czas podawania jest krótki czy przewlekły.

W przypadku profilaktyki lub leczenia choroby odpowiednie dawki wariantu polipeptydu bedą zależały od typu leczonej choroby, stopnia jej ciężkości i przebiegu, od tego czy podawanie wariantu polipeptydu ma charakter profilaktyczny czy terapeutyczny, poprzednio stosowanej terapii, historii choroby pacjenta i odpowiedzi na wariant polipeptydu oraz decyzji lekarza prowadzącego. Wariant polipeptydu podaje się pacjentowi jednorazowo lub w seriach.

W zależności od typu i ciężkości choroby wstępną dawkę do podania pacjentowi stanowi około 1 μg/kg do 15 mg/kg (np. 0,1-20 mg/kg) wariantu polipeptydu w zależności przykładowo od tego czy podawanie jest jednokrotne czy w kilku oddzielnych dawkach lub przez wlew ciągły. Typowa dzienna dawka wynosi w zakresie od około 1 μg/kg do 100 mg/kg lub więcej, zależnie od wymienionych powyżej czynników. W przypadku podawania wielokrotnego przez okres kilku dni lub dłuższy, w zależności od stanu, leczenie kontynuuje się aż do momentu zahamowania występowania objawów choroboPL 209 786 B1 wych. Jednakże użyteczne są również inne schematy dawkowania. Postęp terapii łatwo monitoruje się za pomocą konwencjonalnych technik i analiz.

Kompozycję wariantu polipeptydu otrzymuje się, dawkuje i podaje w zgodzie z dobrą praktyką lekarską. Czynniki, które należy rozważyć w tym kontekście to szczególnie choroba do leczenia, szczególny ssak do leczenia, stan kliniczny poszczególnego pacjenta, przyczyna zaburzenia, miejsce dostarczenia czynnika, sposób podawania, schemat podawania i inne czynniki znane lekarzom.

„Terapeutycznie skuteczna ilość wariantu polipeptydu, którą należy podać będzie ustalana ogólnie na podstawie wymienionych czynników, i stanowi minimalną ilość niezbędną do zapobiegnięcia, złagodzenia lub wyleczenia choroby lub zaburzenia. Wariant polipeptydu nie musi być, ale może być otrzymany wraz z jednym lub więcej czynnikami stosowanymi obecnie do zapobiegania lub leczenia danego zaburzenia. Skuteczna ilość takich dodatkowych czynników uzależniona będzie od ilości wariantu polipeptydu obecnego w preparacie, typu zaburzenia lub leczenia i innych dyskutowanych powyżej czynników. Stosuje się je, ogólnie, w takich samych dawkach i w taki sam sposób, jak wcześniej to opisano, lub stosuje się około od 1 do 99% opisanych powyżej dawek.

Wynalazek będzie bardziej zrozumiały w kontekście zamieszczonych poniżej przykładów. Przykładów tych nie należy jednak interpretować jako ograniczających zakres wynalazku. Wszystkie odnośniki literaturowe i odwołania do patentów włączone są tu przez odesłanie.

P r z y k ł a d 1

Analiza wiązania receptora o niskim powinowactwie

Analiza ta określa wiązanie regionu Fc IgG z rekombinowanymi podjednostkami α FcyRIIA, FcyRIIB i FcyRIIA, ekspres jonowanymi jako białko fuzyjne ze znakowaną His6 S transferazą glutationu (GST). Ze względu na to, że powinowactwo regionu Fc IgG1 względem FcyRI jest rzędu nanomoli, wiązanie wariantów Fc IgG1 można mierzyć za pomocą miareczkowania monomeru IgG i pomiaru wiązania IgG z przeciwciałem poliklonalnym anty-IgG w standardowym teście ELISA (Przykład 2, poniżej). Jednakże powinowactwo pozostałych członków rodziny FcyR, tj. FcyRIIA, FcyRIIB i FcyRIIIA względem IgG jest rzędu mikromolarnego i wiązania tych receptorów z monomerem IgG1 nie można mierzyć za pomocą testu ELISA.

W poniższej analizie wykorzystuje się warianty Fc rekombinowanego przeciwciała anty-IgE E27 (Figury 4A i 4B), które po wymieszaniu z ludzką IgE w stosunku molowym 1:1, tworzą stabilny heksamer, składający się z trzech cząsteczek anty-IgE i trzech cząsteczek IgE. Otrzymano rekombinowaną chimerową postać IgE (chimerową IgE), składającą się z regionu Fc ludzkiej IgE i Fab przeciwciała anty-VEGF, (Presta i wsp. Cancer Research 57: 4593-4599(1997)), która wiąże się z dwiema cząsteczkami VEGF na mol przeciwciała anty-VEGF. Po dodaniu ludzkiego VEGF w stosunku molowym 2:1 do chimerowych heksamerów IgE:E27, heksamery łączą się w kompleksy o większej masie cząsteczkowej poprzez oddziaływanie chimerowe IgE:VEGF. Składnik E27 tego kompleksu wiąże się z podjednostkami α FcyRIIA, FcyRIIB i FcyRIIIA z silniejszą zachłannością wiązania, co umożliwia ich wykrycie w teście ELISA.

Materiały i metody

Pokrywanie receptorem: Podjednostki α receptora Fcy eksprymowane były jako białka fuzyjne GST domen zewnątrzkomórkowych (ECD) znakowanych His6 w komórkach 293, dzięki czemu otrzymano białko fuzyjne ECD-6His-GST (Graham i wsp., J.Gen.Virol. 36: 59-74 (1977) i Gorman i wsp., DNA Prot.Eng.Tech. 2:3-10 (1990)), które oczyszczono na kolumnie chromatograficznej Ni-NTA (Qiagen, Australia) i przez wymianę buforu na buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej (PBS). Stężenia określano na podstawie absorpcji przy 280 nm, z użyciem współczynników ekstynkcji ustalonych w analizie składu aminokwasowego. Płytki Nunc F96 maxisorb pokrywano receptorami (Nr kat. 439454) w ilości 100 ng na studzienkę poprzez dodanie 100 μl białka fuzyjnego receptor-GST w stężeniu 1 μg/ml w PBS i inkubowano przez 48 godzin w 4°C. Przed analizą płytki płukano 250 μl 3x buforu do płukania (PBS, pH 7,4 zawierającego 0,5% TWEEN 20^TM) i blokowano za pomocą 250 μl buforu do analizy (50 mM buforowanego Tris roztworu soli fizjologicznej, 0,05% TWEEN 20™, 0,5% albumina wołowa klasy odpowiedniej do RIA (Sigma A7888) oraz 2 mM EDTA, pH 7,4).

Tworzenie kompleksów immunologicznych: równe molowe ilości (1:1) E27 i rekombinowanej chimerowej IgE, które wiążą dwa mole rekombinowanego ludzkiego VEGE na mol chimerowej IgE dodano do próbki polipropylenowej 12 x 75 mm w PBS i zmieszano przez obracanie przez 30 minut w temperaturze 25°C. Heksamery E27 (anty-IgE)/chimerowa IgE (IGE) powstają w czasie inkubacji. Rekombinowany ludzki VEGF (postać 165, MW 44000) dodano w ilości molowej 2:1 względem stężenia IgE i zmieszano przez obracanie przez dodatkowe 30 minut w 25°C. Wiązanie VEGF-chimerowa

PL 209 786 B1

IgE łączy heksamery E27:chimerowa IgE w kompleksy o większej masie cząsteczkowej, które wiążą podjednostki FcyR α ECD na powleczonych płytkach poprzez regiony Fc przeciwciała E27.

Kompleksy E27:chimerowa IgE:VEGF: (stosunek molowy 1:1:2) dodano do powleczonych podjednostek α FcyR płytek w stężeniu E27 wynoszącym 5 μq i 1 μg wszystkich IgG w czterech powtórzeniach w buforze do analizy i inkubowano przez 120 minut w temp. 25°C na wytrząsarce rotacyjnej.

Wykrywanie kompleksów: Płytki płucze się pięciokrotnie buforem do płukania w celu usunięcia niezwiązanych kompleksów a wiązanie IgG wykrywa się przez dodanie 100 μl koniugatu peroksydazy HRP z kozią anty-ludzką IgG (γ) specyficzną wobec łańcucha ciężkiego (Boehringer Mannheim 1814249) w stosunku 1: 10000 w buforze do analizy i inkubuje przez 90 minut w temp. 25°C na wytrząsarce rotacyjnej. Płytki płucze się pięciokrotnie buforem do płukania w celu usunięcia niezwiązanej HRP koziej anty-ludzkiej IgG, a związane anty-IgG wykrywa się przez dodanie 100 μl roztworu substratu (0,4 mg/ml dichlowodorku o-fenylenodiaminy, Sigma P6912, 6 mM H2O2 w PBS) i inkubowano przez 8 minut w temp. 25°C. Reakcję enzymatyczną zatrzymuje się przez dodanie 100 μl 4,5 N H₂SO₄ a produkty barwne mierzy się w 490 nm na 96 studzienkowym densytometrze płytkowym (Molecular Devices). Związanie kompleksów wariant-E27 przedstawiono jako procent kompleksu zawierającego E27 dzikiego typu.

P r z y k ł a d 2

Identyfikacja unikalnych miejsc wiązania C1q w ludzkim przeciwciale IgG

W prezentowanym badaniu zidentyfikowano mutacje w domenie CH2 ludzkiego przeciwciała IgG1, C2B8 (Reff i inni, Blood 83:435 (1994)), które znoszą wiązanie przeciwciała C1q, ale ani nie zmieniają konformacji przeciwciała, ani nie wpływają na wiązanie każdego z FcyR. Poprzez mutagenezę z użyciem skanowania alaniny zidentyfikowano pięć wariantów IgG1, D270K, D270V, K322A, P329A oraz P331, które nie były lityczne i które zmniejszyły wiązanie C1q. Wyniki sugerowały, że rdzeniowe miejsca wiązania C1q w ludzkiej IgG1 są różne od miejsc w mysich IgG2b. Dodatkowo stwierdzono, że K322A, P329A oraz P331A wiążą się normalnie z antygenem CD20 i czterema receptorami Fc, FcyRI, FcyRII, FcyRIII oraz FcYRn.

Materiały i metody

Tworzenie wariantów C2B8: Użyto chimerowe łańcuchy ciężkie i lekkie przeciwciała anty-CD20, C2B8, (Reff i inni, Blood 83:435 (1994)), subklonowane oddzielnie do wcześniej opisanych wektorów PRK (Gorman i inni, DNA Protein Eng. Tech. 2:3 (1990). Poprzez mutagenezę ukierunkowaną (Kunkel i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1937)) skonstruowano warianty otrzymane przez skanowanie alaniny regionów Fc w łańcuchu ciężkim. Plazmidy łańcucha ciężkiego oraz lekkiego kotransfekowano do transformowanej adenowirusem linii komórek embrionalnych nerki człowieka jak to wcześniej opisano (Werther i inni, J. Immunol. 157:4986 (1996)). Pożywki zmieniano na wolne od surowicy 24 godzinny po transfekcji, a po 5 dniach zebrano wydzielone przeciwciało. Przeciwciała oczyszczano przy użyciu Protein A-SEPHAROSE CL-4B™ (Pharmacia), zmieniono bufor i zatężono do 0,5 ml z PBS przy użyciu Centricon-30 (Amicon) i przechowywano w 4°C. Stężenie przeciwciał określono przy użyciu ELISA z wiązaniem wszystkich Ig.

ELISA z wiązaniem C1q: 96 studzienkowe płytki Costar pokrywano przez noc C2B8 w temp. 4°C w znanych stężeniach w buforze do pokrywania (0,05 M bufor z węglanem sodu), pH 9. Następnie płytki płukano trzykrotnie PBS/ 0,05% TWEEN 20™, pH 7,4 i blokowano 200 μl rozcieńczalnika do ELISA bez timerosalu (0,1 M NaPO4/0,1 M NaCl/ 0,1% żelatyna/ 0,05% Tween 20™/ 0,05% Proclin 300) przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Płytki płukano trzykrotnie buforem do płukania, do każdej studzienki dodano 100 μl z 2 μg/ml C1q (Quidel, San Diego, CA) i inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Płytkę następnie płukano sześciokrotnie buforem do płukania, do każdej studzienki dodano 100 μl rozcieńczonego 1:1000 koniugatu peroksydazy z przeciwciałem owczym przeciwko C1q (Biodesign) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Płytki ponownie sześciokrotnie płukano buforem do płukania i dodano 100 μl buforu substratu (PBS/ 0,012% H2O2) zawierającego OPD (dichlorowodorek o-fenylenodiaminy) (Sigma). Reakcja utleniania, obserwowana dzięki wystąpieniu żółtego koloru, przebiegała przez 30 minut i zatrzymano ją przez dodanie 100 μl 4,5 N H₂SO₄. Następnie odczytano absorbancję przy (492-405)nm przy użyciu czytnika mikropłytek (SPCTRA MAX 250™, Molecular Devices Corp.). Równolegle analizowano odpowiednie kontrole (tj. test ELISA przeprowadzono bez C1q dla każdego użytego stężenia C2B8 a ponadto przeprowadzono ELISA bez C233). W przypadku każdego wariantu mierzono wiązanie C1q przez naniesienie na wykres absorbancji (492-405) nm względem stężenia C2B8 w μg/ml przy użyciu

PL 209 786 B1

4-parametrowego programu do dopasowywania do krzywych (KALEIDAGRAPH™) i porównanie z wartością EC50.

Analiza cytotoksycznosci zależnej od dopełniacza (CDC). Analizę tę przeprowadzono jak opisano to wcześniej (Gazzano-Santoro i inni, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)). Różne stężenia C2B8 (0,08-20 pg/ml) rozcieńczono buforem RHB (RPMI 1640/ 20 mM HEPES (pH 7,2)/2 mM Glutamina 0,1% BSA/ 100 pg/ m. gentamycyna). Ludzki dopełniacz (Quidel) rozcieńczono w stosunku 1:3 w buforze RHB, a komórki WIL2-S (dostępne z ATCC, Manassas, VA), które eksprymują antygen CD20, rozcieńczono do gęstości 1x10⁶ komórek/ml buforem RHB. 150 pl mieszaniny zawierające równe objętości C2B8, rozcieńczonego ludzkiego dopełniacza oraz komórek WIL2-S dodano do płaskodennej 96-studzienkowej płytki do hodowli tkankowej i inkubowano przez 2 godziny w temp. 37°C i 5% CO2 w celu ułatwienia lizy komórek zależnej od dopełniacza. 50 pl barwnika alamar blue (Accumed International) dodano do każdej studzienki i inkubowano przez noc w temperaturze 37°C. Następnie zmierzono absorbancję przy użyciu 96-studzienkowego fluorometru z wzbudzeniem przy 530 nm i emisją przy 590 nm. Jak opisał to Gazzano-Santoro i inni, wyniki wyrażono we względnych jednostkach fluoroscencji (RFU). Stężenie próbek obliczano z krzywej standardowej dla C2B8 a procent aktywności w porównaniu do dzikiego typu C2B8 opisano dla każdego wariantu.

Siła wiązania CD20 wariantów C2B8: Wiązanie C2B8 oraz wariantów do antygenu CD20 testowano przy użyciu wcześniej opisanej metody (Reff i inni, (1994) supra, Gazzano - Santoro i inni, (1996), supra). Komórki WIL2-S hodowano przez 3-4 dni do gęstości komórkowej wynoszącej 1x 10⁶ kom./ml. Komórki płukano i wirowano dwa razy w buforze FACS (PBS/0,1% BSA/ 0,02% NaN3) i zawieszono ponownie do gęstości komórkowej wynoszącej 5x 10⁶ komórek/ml. 200 pl komórek (5 x 10⁶ kom/ml) oraz 20 pl rozcieńczonych próbek C2B8 dodano do 5 ml probówek i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut z wytrząsaniem. Następnie mieszaninę płukano 2 ml zimnego buforu FAC3, wirowano i powtórnie zawieszono w 200 pl zimnego buforu FACS. Do zawiesiny dodano 10 pl koziego anty-ludzkiego IgG-FITC (American Qualex Labs.) i mieszaninę inkubowano w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut z wytrząsaniem. Po inkubacji mieszaninę płukano 2 ml buforu FACS, wirowano i ponownie zawieszono w 1 ml zimnego buforu utrwalającego (1% formaldehyd w PBS). Próbki analizowano na cytometrze przepływowym a wyniki wyrażono jako względne jednostki fiuoroscencji (RFU) i przedstawiono na wykresie względem stężeń przeciwciał przy użyciu 4 parametrowego programu do dopasowywania do krzywych (KALEIDAGRAPH™). Wartości dla EC50 są wyrażone jako procent wartości dla referencyjnego materiału CD28.

Test ELISA wiązania FcyRI: fuzję GST- podjednostka α FcyRI przeniesiono na płytki Nunc F96 maxisorb (nr kat. 439454) przez dodanie 100 pl fuzji receptor-GST w stężeniu 1 pg/ml w PBS i inkubowano przez 48 godzin w temp. 4°C. Przed testem płytki trzykrotnie płukano 250 pl buforu do płukania (PBS, pH 7,4, zawierający 0,5% TWEEN 20™) i blokowano 250 pl buforu do analizy (sól fizjologiczna buforowana 50 mM Tris, 0,05% TWEEN 20™, 0,5% albumina wołowa klasy odpowiedniej do RIA (Sigma A7888) i 2 mM EDTA o pH 7,4). Próbki rozcieńczono do 10 pg/ml w 1 ml buforu do analizy i dodano do płytek pokrytych podjednostką α FcyRI i inkubowano przez 120 minut w temp. 25°C na wytrząsarce rotacyjnej. Płytki płukano pięciokrotnie buforem do płukania w celu usunięcia niezwiązanych kompleksów a wiązanie IgG wykrywano przez dodanie 100 pl peroksydazy HRP sprzęgniętej z kozim anty-ludzkim przeciwciałem IgG (γ) specyficznym dla łańcucha ciężkiego (Boehringer Mannheim 1814249) w 1:10000 w buforze do analizy i inkubowano przez 90 minut w temperaturze 25°C na wytrząsarce rotacyjnej. Płytki płukano pięciokrotnie buforem do płukania w celu usunięcia niezwiązanych HRP kozich anty-ludzkich IgG, a związane anty-IgG wykrywano przez dodanie 100 pl roztworu substratu (0,4 mg/ml o-dichlorowodorek fenylenodiaminy, Sigma P6912, 6 mM H2O2 w PBS) inkubując przez 8 minut w temperaturze 25°C. Reakcję enzymatyczną zatrzymano przez dodanie 100 pl 4,5 N H2SO4 a barwne produkty oznaczono przy 490 nm na 96-studzienkowym densytometrze płytkowym (Molecular Device). Wiązanie wariantu wyrażono jako procent cząsteczki dzikiego typu.

Analizę ELISA wiązania FcyRII oraz III przeprowadzono jak opisano w przykładzie 1 powyżej.

Aby zmierzyć zdolność wiązana FcRn wariantów IgG płytki ELISA pokryto 2 pg/ml streptawidyny (Zymed, South San Francisco) w 50 mM buforu węglanowego, pH 9,6 w temperaturze 4°C przez noc, i blokowano za pomocą PBS-0,5% BSA, pH 7,2 w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Biotynylowane FcRn (wytwarzane z użyciem biotyno-X-NHS, z Research Organics, Cleveland, OH i użyte w ilości 1-2 pg/ml) w PBS-0,5% BSA, 0,05% polisorbatu 20, pH 7,2, dodano do płytki i inkubowano przez jedną godzinę. Do płytki dodano dwukrotne rozcieńczenia seryjne standardu IgG (1,6-100 ng/ml) lub wariantów w PBS-0,5% BSA, 0,05% polisorbatu 20, pH 6,0 i inkubowano przez

PL 209 786 B1 dwie godziny. Związane IgG wykrywano za pomocą znakowanego peroksydazą koziego F(ab)' antyludzki IgG F(ab)'2 w powyższym buforze o pH 6,0 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), a następnie dodano 3,3',5,5'-tetrametylobenzydynę (Kirgaard & Perry Laboratories) jako substrat. Płytki płukano pomiędzy etapami PBS-0,05% polisorbatu 20 w pH albo 7,2 albo 6,0. Absorbancję odczytywano przy 450 nm na czytniku płytek Vmax (Molecular Devices, Menlo Park, CA). Krzywą miareczkowania dopasowano za pomocą czteroparametrowego programu do dopasowywania krzywych wykorzystującego regresję nieliniową (KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA). Obliczono stężenia wariantów IgG odpowiadające środkowemu punktowi absorbancji krzywej miareczkowania standardu a następnie podzielono przez stężenie standardu odpowiadające środkowemu punktowi absorbacji krzywej miareczkowania standardu.

Wyniki oraz dyskusja

Dzięki mutagenezie skanowania alaniny skonstruowano kilka pojedynczych mutacji punktowych w domenie CH2 C2B8, rozpoczynając od E318A, K320A i K322A. Wszystkie skonstruowane warianty normalnie wiązały się do antygenu CD20 (Tabela 3).

T a b e l a 3

	wt	E318A	K320A	K322A	P329A	P331A
FcRn	+	+	+	+
CD20	+	+	+	+	+	+
FcyRI	+	+	+	+	+	+
FcyRII	+	+	+	+	+	+
FcyRIII	+	+	+	+	+	+
*C1q	+ + +	+ +	+ + +	-	-	-
CDC	+	+	+	-	-	-

(+) oznacza wiązanie a (-) oznacza zniesione wiązanie * w przypadku wiązania C1q każ dy + jest równoważny w przybliżeniu 33% wiązania.

Tam gdzie analizowano ludzki dopełniacz względem przeciwciała z ludzkim Fc zdolność E318A oraz K320A do aktywowania dopełniacza była zasadniczo jednakowa jak w przypadku C2B8 typu dzikiego (Tabela 3). W przypadku porównania do C2B8 typu dzikiego wydaje się, iż istnieje niewielka różnica w wiązaniu E318A i K320A do C1q. Zauważono tylko 10% zmniejszenie wiązania K320A i około 30% zmniejszenie wiązania E318A do C1q (Figura 2). Wyniki te wskazują, że wpływ substytucji E318A oraz K320A na aktywację dopełniacza i wiązanie C1q jest minimalny. Ludzką IgG1 z C2B8 zastąpiono ludzką IgG2 i użyto jako kontrolę ujemną w badaniach wiązania C1q. Wariant IgG2 wydaje się posiadać o wiele mniejsze powinowactwo do C1q niż warianty E318A i K320A (Figura 2). Zatem wyniki wykazują, że E318 oraz K320A nie stanowią rdzeniowych miejsc wiązania C1q dla ludzkiej IgG1. Odwrotnie substytucja K322A znacząco wpłynęła na zarówno aktywność dopełniacza, jak i wiązanie C1q. Wariant K322A nie posiadał aktywności CDC podczas analizy w powyższym teście CDC, wykazywał ponad 100-krotnie niższe wiązanie z C1q niż C2B8 typu dzikiego (figura 2). W układzie ludzkim K322 jest jedyną resztą spośród zaproponowanych rdzeniowych miejsc wiązania C1q, która wydawała się posiadać znaczący wpływ na aktywację dopełniacza i wiązanie C1q.

Ze względu na to, że badania Duncan'a oraz Winter'a przeprowadzono przy użyciu mysiej IgG2b a powyższe rezultaty ujawniły, że K320 oraz E318 w ludzkiej IgG1 nie są zaangażowane w wiązanie C1q, nie wiążąc się przy tym z żadną teorią, powyższe wyniki sugerują, iż region wiązania C1q w mysich IgG jest inny niż w ludzkich. Aby zbadać to bardziej, a również aby zidentyfikować dodatkowe warianty, które nie wiążą z C1q a zatem nie aktywują dopełniacza, skonstruowano kilka innych mutacji punktowych w sąsiedztwie K322, co oceniono na podstawie struktury trójwymiarowej Fc C2B8. Uzyskane warianty K274A, N276A, Y278A, S324A, P329A, P331A, K334A oraz T335A oceniano pod kątem ich zdolności do wiązania z C1q, a także aktywacji dopełniacza. Wiele z tych substytucji miało mały wpływ na wiązanie C1q lub aktywację dopełniacza, lub nie miało żadnego wpływu na takie wiązanie lub aktywację. W powyższych testach warianty P329A oraz P331A nie aktywowały dopełniacza i obniżały wiązanie C1q. Wariant P331A nie aktywował dopełniacza i wykazywał około 60-krotnie

PL 209 786 B1 słabsze wiązanie z C1q (Figura 3) w porównaniu do C2B8 typu dzikiego (Figura 2). Zakres stężenia wariantów przeciwciał użyty na Figurze 3 rozszerzono do 100 μg/ml w celu zaobserwowania wysycenia wiązania C1q z wariantem P331A. Mutacja P329A powoduje, że przeciwciało nie aktywuje dopełniacza i wykazuje ponad stukrotne obniżenie wiązania z C1q (figura 3) w porównaniu do C2B8 typu dzikiego (Figura 2).

Warianty, które nie wiązały się z C1q a zatem nie aktywowały dopełniacza badano pod kątem ich zdolności do wiązania receptorów Fc: FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIIA oraz FcRn. To szczególne badanie przeprowadzono przy zastosowaniu przeciwciała humanizowanego anty-IgE, przeciwciała IgG1 z tymi mutacjami (zobacz przykład 1 powyżej). Wyniki ujawniły, że warianty K322A oraz P329A wiążą się ze wszystkimi receptorami Fc w tym samym stopniu co białko typu dzikiego (Tabela 4). Jednakże zauważono niewielkie obniżenie wiązania P331A z FcyRIIB.

Podsumowując, zidentyfikowano dwie substytucje aminokwasowe w końcowym regionie COOH domeny CH2 ludzkiej IgG1, K322A oraz P329A, które powodują ponad 100-krotne obniżenie wiązania z C1q, i które nie aktywują szlaku CDC. Te dwa warianty, K322A oraz P329A, wiążą się z wszystkimi receptorami Fc z takim samym powinowactwem jak przeciwciało typu dzikiego. Bazując na wynikach przedstawionych w Tabeli 4, i nie wiążąc się z żadną teorią, proponuje się, iż epicentrum wiązania C1q ludzkiej IgG1 jest umiejscowione wokół K322, P329 oraz P331 i jest inne niż epicentrum mysiej

IgG2b, które składa się z E318, K320 oraz K322.

T a b e l a 4

	wt	E318A	K320A	K322A	P329A	P331A
CD20	100	89	102	86	112	103
aFcyRI	100	93	102	90	104	74
aFcyRIIA	100	113	94	109	111	86
aFcyRIIB	100	106	83	101	96	58
aFcyRIII	100	104	72	90	85	73
CDC	100	108	108	brak	brak	brak

a

W przypadku wiązania z FcyR warianty utworzono z wykorzystaniem tła E27 (anty-IgE).

Wyniki przedstawiono jako procent dzikiego typu.

Przy zastosowaniu sposobów opisanych w prezentowanym przykładzie zidentyfikowano ponadto inną resztę zaangażowaną w wiązanie z ludzkim C1q. Resztę D270 zastąpiono lizyną i waliną w celu wytworzenia odpowiednio wariantów D270K i D270V. Warianty wykazywały zarówno mniejsze wiązanie z ludzkim C1q (Figura 6), jak również były nielityczne (Figura 7). Oba te warianty wiązały się z antygenem CD20 normalnie i wywoływały ADCC.

P r z y k ł a d 3

Warianty o zwiększonym wiązaniu C1q

Następujące badanie pokazuje, że substytucja reszt w pozycjach K326, A327, E333 oraz K334 skutkowała powstaniem wariantów o zwiększonym o co najmniej 30% wiązaniu z C1q w porównaniu do przeciwciała typu dzikiego. Wskazane reszty K326, A327, E333 oraz K334 są potencjalnymi miejscami do poprawy skuteczności przeciwciał ze szlaku CDC. Celem tego badania była poprawa aktywności CDC przeciwciała przez wzrost wiązania z C1q. Poprzez mutagenezę ukierunkowaną na reszty K326 oraz E333 skonstruowano kilka wariantów o zwiększonym wiązaniu z C1q. Reszty, w porządku zwiększonego wiązania w przypadku K326 to K<V<E<A<G<D<M<W, a reszty w porządku zwiększonego wiązania w przypadku E333 to E<Q<D<V<G<A<S. Skonstruowano cztery warianty K326M, K326D, K326D, K326E oraz E333S, które wykazywały co najmniej dwukrotny wzrost wiązania C1q w porównaniu do typu dzikiego. Wariant K326W wykazywał co najmniej pięciokrotny wzrost wiązania z C1q.

Warianty przeciwciała C2B8 typu dzikiego otrzymano jak opisano to w przykładzie 2. Kolejne przeciwciało kontrolne, C2B8 typu dzikiego wytworzone w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO) zasadniczo tak jak opisano w Patencie USA nr 5,736,134, zawarto w teście ELISA wiązania C1q w celu potwierdzenia czy wt CdB8 produkowane w linii komórek nerki 293 wykazują taką samą

PL 209 786 B1 aktywność wiązania C1q jak przeciwciało wytwarzane w CHO (zobacz CHO- wt- CDB8 na Figurze 8). Testy ELISA wiązania C1q, CDC oraz potencjału wiązania CD20 w tym przykładzie przeprowadzono tak jak opisano w przykładzie 2 powyżej.

Jak pokazano na Figurze 8 substytucja alaniny przy K326 i E333 w C2B8 skutkowała powstaniem wariantów, które wykazywały około 30% wzrost wiązania z C1q.

Skonstruowano kilka innych pojedynczych wariantów z mutacjami punktowymi przy K326 i E333, i przetestowano je pod kątem ich zdolności wiązania z C1q i aktywacji dopełniacza. Wszystkie skonstruowane warianty normalnie wiązały się z antygenem CD20.

W przypadku K326, inne wytworzone warianty z pojedynczymi mutacjami punktowymi to K326A, K326D, K326E, K326G, K326V, K326M oraz K326W. Jak pokazano to na Figurze 9 wszystkie te warianty wiązały się z C1q z lepszym powinowactwem niż przeciwciało typu dzikiego. K326W, K326M, K326D oraz K326E wykazywały co najmniej dwukrotny wzrost wiązania z C1q (Tabela 5). Spośród wariantów K326, wariant K326W wykazywał najlepsze powinowactwo do C1q.

T a b e l a 5

Wariant	wartość EC50
typ dziki	1,53
K326V	1,30
K326A	1,03
K326E	1,08
K326G	0,95
K326D	0,76
K326M	0,67
K326W	0,47
E333S	0,81
E333A	0,98
E333G	1,14
E333V	1,18
E333D	1,22
E333Q	1,52
K334A	1,07

Substytucje resztami hydrofobowymi, jak również resztami naładowanymi skutkują powstaniem wariantów o podwyższonym wiązaniu z C1q. Nawet substytucja glicyną, która jak wiadomo nadaje łańcuchowi elastyczności i jest dobrze konserwowana w naturze, skutkowała powstania wariantów o wyższym powinowactwie do C1q w porównaniu do typu dzikiego. Wydawałoby się, że dowolna substytucja aminokwasowa w tym rejonie będzie powodowała powstanie wariantu o wyższym powinowactwie do C1q. Na podstawie struktury trójwymiarowej stwierdzono, że K326 oraz E333 znajdują się w sąsiedztwie miejsc wiązania C1q (Figura 10).

Oprócz alaniny E333 podstawiono także innymi resztami aminokwasowymi. Warianty te, E333S, E333G, E333V, E333D, i E333Q, wykazywały zwiększone wiązanie z C1q w porównaniu do typu dzikiego (Figura 11). Jak pokazano w Tabeli 5, porządek powinowactwa wiązania z C1q przedstawiał się następująco: E3333>E333A>E333G>E333V>E333D>E333Q. Substytucja resztami aminokwasowymi z łańcuchami bocznymi o małej objętości tj. seryną, alaniną i glicyną skutkuje powstaniem wariantów o wyższym powinowactwie do C1q w porównaniu do innych wariantów, E333V, E333D oraz E333Q o łańcuchach bocznych o większej objętości. Wariant E333S wykazywał najwyższe powiPL 209 786 B1 nowactwo do C1q, i wykazał dwukrotny wzrost w porównaniu do typu dzikiego. Bez związku z jakąkolwiek teorią pokazuje to, że wpływ na wiązanie C1 w pozycji 333 może być również wynikiem po części polarności reszty.

Wytworzono także warianty podwójne. Jak pokazano na Figurach 12 oraz 13 podwójne warianty K326M-E333S oraz K326A-E333A wykazywały około trzykrotnie lepsze wiązanie z ludzkim C1q niż C2B8 typu dzikiego (Figura 12) i co najmniej dwukrotnie lepsze pośredniczenie w CDC w porównaniu do C2B8 typu dzikiego (Figura 13). Addytywność pokazuje, że są to warianty o niezależnej aktywności.

Jak pokazano na Figurze 14, skonstruowano inny wariant o poprawionym wiązaniu z C1q (50% wzrost) przez zamianę A327 w regionie stałym na glicynę. Odwrotnie, w regionie stałym ludzkiej IgG2, zamiana G327 na alaninę zmniejsza wiązanie z C1q przeciwciała IgG2.

P r z y k ł a d 4

Identyfikacja miejsc wiązania FcR ludzkich przeciwciał IgG

W prezentowanym badaniu oceniano wpływ mutacji różnych regionów reszt regionu Fc przeciwciała IgG1 pod względem wiązania z FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB oraz FcyRIIIA jak również FcRn. Zidentyfikowano warianty przeciwciał o zwiększonym, jak również o zmniejszonym wiązaniu FcR.

Materiały i metody

Konstrukcja wariantów IgG1: Rekombinowane E27 anty- IgE posiadające sekwencje łańcucha lekkiego oraz ciężkiego przedstawione na Figurach 4A oraz 4B odpowiednio użyto jako przeciwciało macierzyste w następujących eksperymentach. Przeciwciało to wiąże antygen IgE i posiada region Fc allotypu nie-A IgG1. Poprzez mutagenezę ukierunkowaną (Kunkel i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1987)) utworzono warianty regionu Fc łańcucha ciężkiego powyższego przeciwciała macierzystego. Plazmidy łańcucha ciężkiego oraz lekkiego ko-transfekowano do transformowanej adenowirusem ludzkiej zarodkowej linii komórki nerki jak to opisano wcześniej (Werther i inni, J. Immunol. 157: 4986 (1996)). Pożywkę zmieniono na wolną od surowicy 24 godziny po transfekacji, a wydzielone przeciwciało zebrano po pięciu dniach. Przeciwciała oczyszczono przy użyciu SEPHAROSE® z białkiem G (Pharmacia), bufor zmieniono i zatężono do 0,5 ml przy użyciu PBS stosując Centricon-30 (Amicon) i przechowywano w 4°C. Stężenie określono przez adsorpcję przy 280 nm przy użyciu współczynników ekstynkcji pochodzących z analizy składu aminokwasowego.

Analiza ELISA wiązania FcyRIA o wysokim stopniu powinnowactwa: FcyRIA eksprymowano jako fuzję GST ze znakowaną His6 zewnątrzkomórkową domeną w komórkach 293 i oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej Ni-NTA.

Aby oczyścić FcyRIA po trzech dniach usunięto supernatant znad transfekowanych komórek 293. Dodano inhibitory proteaz: 50 μl aprotyniny (Sigma)/ 50 ml supernatantu oraz PMSF (1 mM). Supernatanty zatężono do 10 ml w probówkach (Amicon) i dializowano przez noc w temperaturze 4°C w jednym litrze buforu kolumnowego (50 mM Tris, pH 8,0, 20 mM imidazol, 300 mM NaCl). Dodatkową dializę przeprowadzono następnego ranka wobec świeżego buforu kolumnowego przez 4 godziny w 4°C. Roztwór nałożono na 1 ml kolumny Ni⁺⁺ (NTA super flow resin, Qiagen), zrównoważone wcześniej 10 ml buforu kolumnowego. Kolumny płukano 10 ml buforu kolumnowego a białko eluowano 2,5 ml buforu elucyjnego (50 mM Tris pH 8,0, 250 mM imidazol, 300 mM NaCl). Białko zatężono do 0,5 ml oraz wymieniono bufor na PBS. Stężenia określono za pomocą adsorpcji przy 280 nm stosując współczynniki ekstynkcji pochodzące z analizy składu aminokwasowego.

Oczyszczonymi receptorami pokryto płytki Nunc F96 maxisorb (nr kat. 439545) w ilości średnio 150 ng na studzienkę przez dodanie 100 μl receptora w 1,5 μg/ml PBS i inkubowano przez 24 godziny w 4°C. Przed testem płytki płukano trzykrotnie 250 μl buforu do płukania (buforowana 50 mM Tris sól fizjologiczna, zawierająca TWEEN 20^®, 0,5% albuminy wołowej klasy RIA (Sigma A7888) i 2 mM EDTA, pH 7,4).

100 μl E27 dodano do pierwszych czterech studzienek płytek pokrytych podjednostką FCyRIA w stężeniu 10 μg/ml. 80 μl buforu do analizy dodano do następnych czterech studzienek a następnie 20 μl z 10 μg/ml IgG E27 tak, aby otrzymać końcowe stężenie 2 μg/ml. Płytki inkubowano w 25°C przez dwie godziny na wytrząsarce rotacyjnej.

Do detekcji płytki płukano pięciokrotnie buforem do płukania w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała. Wiązanie IgG do GST- FCyRIA wykrywano przez dodanie 100 μl białka G (BIORAD) sprzężonego z peroksydazą HRP, w stosunku 1: 5000. Koniugaty HRP inkubowano przez 1,5 godziny w temp. 25°C na wytrząsarce rotacyjnej. Płytki płukano pięciokrotnie buforem do płukania w celu usunięcia niezwiązanego koniugatu HRP. Wiązanie wykrywano przez dodanie 100 μl roztworu substratu

PL 209 786 B1 (0,4 mg/ml dichlorowodorku o-fenylenodiaminy, Sigma p6912, 6 mM H2O2 w PBS) i inkubację przez 10 minut w temp. 25°C. Reakcję enzymatyczną zatrzymano przez dodanie 100 μl 4,5 N H₂SO₄ a produkt barwny mierzono w 490 nm na 96-studzienkowym densytometrze (Molecular Devices).

Wiązanie wariantów E27 w stężeniu IgG wynoszącym 2 pg/l wyrażono w stosunku do E27 typu dzikiego.

Test FcyRIA THP-1: 100 μl E27 dodano do pierwszych trzech studzienek płytki typu seracluster (Costar) w ilości 20 μg/ml w buforze do analizy (1X PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN₃). 92,5 μl buforu do analizy dodano do następnych trzech studzienek a następnie po 7,5 μl z 20 μg/ml IgG E27, tak aby otrzymać końcowe stężenie 1,5 μg/ml. Do każdej studzienki dodano 100 μl komórek THP-1 w stężeniu 5 milionów komórek/ml w buforze do analizy FACS. Płytkę inkubowano na lodzie przez 30 minut.

Do detekcji komórki płukano dwukrotnie buforem do analizy w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała. Wiązanie IgG z FcyRIA wykrywano przez dodanie 100 μl sprzężonego z FITC fragmentu F(ab)' koziej IgG specyficznej przeciwko ludzkiemu łańcuchowi ciężkiemi (Jackson Immunoresearch) w stosunku 1:200. Koniugaty FITC inkubowano z komórkami przez 30 minut na lodzie. Komórki płukano trzykrotnie buforem do analizy tak, aby usunąć niezwiązany koniugat FITC. Komórki wybarwiono P.I. (SIGMA) w stężeniu 2,5 μg/ml i analizowano przez cytometrię przepływową.

Wiązanie wariantów E27 w stężeniu IgG wynoszącym 1,5 μg/ml wyrażono w stosunku do E27 typu dzikiego.

Otrzymane wyniki z testów płytkowych (FcyRIA ELISA) oraz testów komórkowych (test FcyRIA THP-1) uśredniono, aby otrzymać aktywność wiązania FcyRIA.

Test ELISA wiązania FcyR o niskim stopniu powinowactwa: testy ELISA FcyRIIA, FcyRIIB oraz FcyRIIIA przeprowadzono tak jak w przykładzie 1 powyżej, wraz z detekcją cząsteczek stabilnego heksameru (składającego się z trzech anty-IgG i trzech cząsteczek IgE).

Test ELISA wiązania FcRn: w celu zmierzenia aktywności wiązania FcRn wariantów IgG płytki ELISA pokryto 2 μg/ml sterptawidyny (Zymed, South San Francisco) w 50 mM buforu węglanowego, pH 9,6, w 4°C przez noc i blokowano przy użyciu PBS-0,5% BSA, pH 7,2 w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Biotynylowany FcRn (wytworzany z użyciem z biotyno-X-NHS z Research Organics, Cleveland, OH i użyty w stężeniu 1-2 pg/pl) w PBS-0,5% BSA, 0,05% polisorbat 20, pH 7,2 dodano do płytki i inkubowano przez godzinę. Dwukrotne seryjne rozcieńczenia standardu IgG (1,6-100 ng/ml) lub wariantów w PBS-0,5% BSA, 0,05% polisorbatu 20, pH 6,0 dodano do płytki i inkubowano przez dwie godziny. Związaną IgG wykrywano przy użyciu znakowanego perdydazą koziego F(ab)' przeciwko F(ab)' ludzkiej IgG w powyższym buforze o pH 6,0 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) a następnie dodano 3,3',5,5'-tetrametylobenzydynę (Kirgaard & Perry Laboratories) jako substrat. Płytki płukano między etapami postępowania przy użyciu PB3- 0,05% TWEEN 20^® w pH 7,2 lub 6,0. Absorbancję odczytano przy 450 nm na czytniku płytek Vmax (Molecular Devices, Menlo Park, CA). Krzywe miareczkowania dopasowano przy pomocy cztero-parametrowego programu do dopasowywania do krzywych wykorzystującego regresję nieliniową (KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA). Obliczono stężenia wariantów IgG odpowiadające środkowemu punktowi absorbancji miareczkowania dla krzywej standardu i podzielono przez stężenie standardu odpowiadającego środkowemu punktowi absorbancji krzywej miareczkowania dla standardu.

Analiza ADCC in vitro. W celu otrzymania znakowanych chromem⁵¹ komórek docelowych, linie komórek rakowych hodowano na płytkach do hodowli tkankowej i zbierano przy użyciu sterylnego 10 mM EDTA w PBS. Jako komórki docelowe we wszystkich testach zastosowano komórki SK-BR-3, ludzką linię komórkową raka sutka wykazującą nadekspresję 3+ HER2-. Komórki płukano dwukrotnie pożywką do hodowli komórkowej. Komórki (5x10⁶) znakowano 200 μ Ci chromu³¹ (New England Nuclear/ Du Pont) w temp. 37°C przez jedną godzinę z mieszaniem co pewien czas. Znakowane komórki płukano trzykrotnie pożywką do hodowli komórkowej, a następnie zawieszono ponownie do stężenia 1 x 10³ komórek/ml. Komórki stosowano bez opsonizacji lub opsonizowano je przed analizą przez inkubację z rhuMAb HSR2 dzikiego typu (HERCEPTIN^®) lub siedmioma mutantami Fc (G14, G13, G17, G36, G30, G31 oraz G34) w ilości 100 ng/ml i 1,25 ng/pl w analizie PBMC lub 20 ng/ml i 1 ng/ml w analizie NK.

Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej przygotowano przez zebranie krwi na heparynę od normalnych zdrowych dawców i rozcieńczono równą objętością buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS). Krew następnie rozwarstwiono na LYMPHOCYTE SEPARATION MEDIUM^® (LSM: Organon Teknika) i wirowano zgodnie z zaleceniami producenta. Komórki jednojądrzaste zebrano

PL 209 786 B1 z powierzchni LSM-osocza i płukano trzykrotnie PBS. Komórki efektorowe zawieszano ponownie w pożywce hodowlanej do końcowego stężenia 1 x 10⁷ komórek/ml.

Po oczyszczeniu przez LSM, z PBMC wyizolowano komórki naturalnych zabójców (NK) przez negatywną selekcję przy użyciu zestawu do izolacji komórek NK oraz kolumny magnetycznej (Miltenyi Biotech) zgodnie z instrukcjami producenta. Wizolowane komórki NK zebrano, płukano i powtórnie zawieszono w pożywce hodowlanej do stężenia 2 x 10⁶ komórek/ml. Identyfikację komórek NK potwierdzono przez analizę cytometrii przepływowej.

Przez dwukrotne seryjne rozcieńczanie komórek efektorowych (albo PBMC albo NK) wzdłuż rzędów płytki do mikromiareczkowania otrzymano różne stosunki komórek efektorowych i docelowych (100 μl objętości końcowej) w podłożu do hodowli. Stężenie komórek efektorowych wahało się od 1,0 x 10⁷/ml do 2,0 x 10⁴/ml dla PBMC i od 2,0 x 10⁵/ml do 3,9 x 10³/ml dla NK. Po miareczkowaniu komórek efektorowych do każdej studzienki płytki dodano 100 μl komórek docelowych znakowanych chromem ⁵¹ (opsonizowanych lub nie) w ilości 1 x 10⁵ komórek/ml. Dzięki temu wyjściowy stosunek komórek efektorowych: komórek docelowych wynosił 100:1 dla PBMC i 20:1 dla komórek NK. Wszystkie analizy przeprowadzono w dwóch powtórzeniach, a każda płytka zawierała kontrole dla zarówno lizy spontanicznej (bez komórek efektorowych), jak i lizy całkowitej (komórki docelowe plus 100 μl 1% dodecylu sodu, 1 N wodorotlenku sodu). Płytki inkubowano w 37°C przez 18 godzin a następnie supernatanty hodowli komórkowej zebrano przy użyciu układu do zbierania supernatantów (Skatron Instrument, Inc.) i zliczano w liczniku Minaxi auto-gamma serii 5000 gamma (Packard) przez jedną minutę. Wyniki przedstawiono następnie jako procent cytotoksyczności przy użyciu wzoru:

% cytotoksyczności = (próbka cpm - spontaniczna liza)/(całkowita liza - spontaniczna liza) x 100.

Następnie w celu analizy danych zastosowano czteroparametrowe dopasowanie do krzywych (KaleidaGraph 3.0.5).

Wyniki

Wytworzono różne warianty przeciwciał, które cechowały się inną aktywnością wiązania FcR niż przeciwciało macierzyste. Wyniki wiązania FcR dla różnych uzyskanych wariantów pokazano w Tabelach 6 i 7 poniżej. Dodatkowy wariant, T307Q, wykazywał także poprawione wiązanie FcR w porównaniu do przeciwciała macierzystego E27.

PL 209 786 B1

WARIANTY DOMENY CH2

PL 209 786 B1

Τ307Α(326) 1.81 ¢0.32) 6 0.99 {0-14) 4 1.19 (0.37) 1.35 (0.33) 1.12 (0.18) η=12

PL 209 786 B1

L309A(328) 0.63 (0.18) 4 0.93 (0.18) 6 1.13 (0.08) 1.26 (0.12) 1.07 (0.20)

(0.18)

PL 209 786 B1

PL 209 786 B1

TABELA 7

WARIANTY DOMENY CH3

<H'O)

PL 209 786 B1

Β17 A378(401)Q 1.32 (0.13) 3 1.06 (0.05) 3 1.40 (0.17} 1.45 (0.17) 1.19 (0.17)

LO

1

CD

i

cd

i

i

co

1

<h

1

CM

f

SP

i

00

1

r-ł

1

co i

UD

1

σ\

1

LO

f

<-4

*r

1

en

1 I

sp

i-H }

CM

o

1 1

O

J 1

o

i 1

o

1 1

o

1 1

o

Ϊ

O

i

O

i

o

1 1

o

1

o ·

i—ł

t

o

1

Γ-Τ

1

o j

o

ί

o

1

o

1

o j

O

o

1

o

i

o

1

o

1

o

1

o

Ϊ

o

i

o

t

o

1

o

t

o !

o

i

o

1

o

i

o }

o

i f

o

i

o

1 J

o {

O

1 |

1 |

1 l

1 1

1 1

—

1

1 i

1

1

—'

ł

*—*

I

*“*

1

i

i

ł

1

w

Sp

1

LO

s

CD

ł

o

1

sp

1

1

o

i

LO

1

o

1

o

1

rH !

co

1

o

1

co

1

o

O

1

·*τ

f

LO

i

2 !

r-

O

I I

O

I i

o

i 1

o

1 1

ł-4

1 1

r~l

1 1

o

ł

o

i

o

(

o

ł

o j

T-4

I

rH

I

r-<

r

o ;

o

i

O

I

cn

1

σ, J

<h

r-i

i

1

I—<

1 i

r—ł

1 I

«—<

1 1

r-4

1 1

«—4

f 1

<—ł

t 1

r~ł

1 1

f—ł

1 1

rH ί

ł—i

i i

ł—I

I i

<—ł

1 1

r-4

i i

ł-ł

ł 1

o

1 1

o J

o

LO S? ] Ί ί o j - i	sr : Si o J ( r-t , m ;	sp r*	.88	CM O r—ł O O Γ*·
CM j	r-ł	o	t i	O	ϊ 1	o
rt !	< i		f { i	<	1 1	*£,
	I	•O
ud i	C'	00	ł	o		sp
o	o	o	1 1	F—1	I	r—4
sp i	sp (	sp		ST	I	SP
·—· 1	—- ’	—-
o !	CM !	cd	1 I	sy	1 I	LO
00	CO	00	I	00		00
cd	CD	cd	1	CD		CD
ω j	ω ;	ω	f	Z	1	o
1 00 1	f Ch i	o	i i	t—(	1 1	CM
r-t |	τ-M (	CM	i	CM	l	CM
CD 1	CQ r	CD	i	fQ	i	ω

CM	ί 04
1	1 1 1 Λ
CM !	! ! ! °
rH J	1 *“*
O	' ! ! o

-=p	1	CD	1	r-	1	ST		τ—i
LO	1	r*	1	co	1	r—4	1	co
O	1 I	o	1 1	o	1 1	r~4	1 1	o
	1 t I	<	1 1 |	<	i l t		1 1 I	[*4
		—*	|		j	cn	|	<n
LO		r-		a>	t		|
r-4	ł	r-ί	|	r-4		sp	|	ST
sr		sr		sp			j	—-
.—,				*—·
00	1 j	UD	i i	O	1 |	Ch	1 |	σ>
00	J	oo		Ch	j	CD	|	CD
CD	|	CD		co		X1	|	><
ω	f 1	Z	1 1	z	ł !	<	1 1	CO
CD	1	«53»	f	UD	ł	LO	1	LO
CM	f	CM	1	CM	1	CM	1	CM
co	1	co	J	CQ	ί	CD	1	(Q

CM	I 00	CD	<N
	i i	λ 1
SP	! !	UL	r-
O	! ° !	O	o
«		ł ’	*
O	! ° 1	o	o
*-*	1 1	ł	—
Sp	1	O i	r-ł

Ch	J Ch		v-f	CM
O	i t	o	1 1	o	1 1	<~4	ł 1	r~4
<	l f	<	1 1	<	1 1	<	1 i
o	ί	LO	1	00	1	o	1	<3*
CM		CM		CM		CD		SP
M1	i	ΧΓ	1	sp	1	SP	1	SP
CM	1	00	I	o	i	T~ł	1	CD
Ch		en		O		O		r—4
ΓΟ		CD		sp		sr		ST
u:	i	J	1	ω	t i	Q	}	Q
Γ*	i 1	co	f 1	Ch	f i	O	1
CM	i	CM	1	CM	i	CD	i	CD
(Π	1	CQ	1	CQ	f	CD	i	CD

	1 t		1 t	1 1	<M	1 1	CM
	1		t	1		1
	1		1		CD	1	i
	1 1		1 1	1	O	1	O
	1		1	1	O	i	o
	l f		] i	1		i	—-
CM	i	sp	1	GO !	Γ*	1 |	LO
O	i	sp	1 1	O j	r-	t	c-
r—4	1 i	O	1 1	e—)	o	1 t	o
<	1 i j		1 1 |	< !		1 (	<
.—«							-—·
UD	1	LO	1	Γ'*· 1	Ch	1 1	o
ip		sp	1	1	sp	|	UD
sp		xr	1	sp	sp	|	Sp
•—·		«—·	1	1	—		—*
sp	1	in	1	LO	00	1 I	<h
«-1		»—(	l	f—ł	rH	I	T—i
Sp		sr		Sp	SP		sP
	1 1	ω	1 i	oa j	o	1 1	O
CM	1 1	fD	1 1	1 sp [	UD	1 1	LO
CD	1	CD	1	CD t	CD	1	CD
aa	1	co	1	CQ l	ffl	1	03

PL 209 786 B1

Β37 Ν421(452)Α 0.98 0.99 (0.01) 3 0.90 (0.03)

Oprócz wariantów alaninowych otrzymano różne warianty z substytucją nie-alaninową, których aktywność wiązania FcR podsumowano w kolejnej tabeli.

PL 209 786 B1

WARIANTY NIEALANINOWF,

PL 209 786 B1

I

I

I

I

I

I

I <

I (

I

I

CU

! z !

ω ]

o

! w

! z

Q

i 01!

<Z> ’

Q !

σ

ί w !

ω [

05 j

o j

! ί

o

! z

! ° !

α

-«w

-—Ι-

z-s.

-—

i t

z—.

z-**·

σ\

! ΚΠ !

un '

o

J O

! o

o

! !

en !

en

Ο'

! c- !

> !

c~

o !

en

en

a\

! o !

o

00

1

cn

o

O

o

o

θ !

o

o

O 1

o ;

O

o

o

o

r—(

CM

OJ

en

i 2

01

<n

1

en [

en i

en

en J

en

en J

en

en

I

! ί

en

·.—»

1

1

_

—*

»—·» .

*

—*

KO

! o !

o !

en

i co

!

ΓΟ

! !

KO [

KO J

o

o !

o

o !

CM

! nj !

Oj

! en i

en

00

GO

CD

f 00

<D

00

<»

<D

05

en

en

en

en

en

en

en

CM

CM

CM

OM

OM

CM

CM

CM

CM

f*

CM

CM

CM

OM

CM

CM

Z

[ Q !

O J

ω

i

! ω

ω

1 z i

Z J

Z J

&

j 1

1

*S 1

1

(Ź

! !

Oi

1 &

1 ω 1

CJ

en

1 1 1 1

1 cn f

mo

t t ο-

1 | <D

<n

1 1 1 (

t O* 1

1 CO 1

i 1 i i

1 i

1 1

1 r~ i

1 I i i

i 1

1 1 1 <r 1

on

cn

1 <T\ 1

TT f

CM

ί CM

1 04

OJ

1 en f

en i

en i

en

i lo i

r~ ł

00 1

o* t

O

i w t

CM

i m

1 1

*?

CM

i o- t

rM i

CM

i OJ

! CM

CM

1 CM 1

CM 1

CM 1

i o- i

θ' f

O- I

r-M t

00

i 00 1

00

i CO

t r-4 I

r-t

147 E293(310)K 1.13 (0.04) 1.31 ¢0.17) 0.72 (0.08)

PL 209 786 B1

PL 209 786 B1

214 S324(343)Q 0-82 0.83

PL 209 786 B1

Kolejna tabela przedstawia aktywność wiązania z FcR różnych wariantów łączonych.

PL 209 786 B1

TABELA 9

WARIANTY ŁĄCZONE

PL 209 786 B1

		1 <	< ·		<
ο	UD	1 I	o	UD	1	o	O
OO	σ.	1 1	co	CO	1	co	rM
CM	cm	1 I	CM	CM	i 1	CM	cd
		1			1	·'—*	*-«··
r-	o	1	r***	CM	1 i	r-	CD
KD	OO	t 1	<o	r-	1 i	MO	σ
CM	OJ	1 1	CM	CM	1 1	CM	CM
W	o	1 t	ω	U	1 1	cn	Łd
co		1 (	o		1 t	t-4
		I	ud		1	UD
<M		1	CM		1	CM

	} CO J
				I			ł 1
				l I	Tj.		1 I
				l 1	O		1 1	r-
				1 f	o		1 f	*—1
				i			1 I
				i t	UD		i |	<o
				I 1	UD		i |	•
				1 I	«		1 1	CM
				1 1	CO		i i	r-4
«c		*c	<	1 1 i			1 1 |	«£.
	x—w		χ·-.	i	X—s		«
o	«—ł	UD	co	1 1	UD	UD	1 1	uD
co	r-	cn	co	t *	O	VD	i 1	O
CM	CM	CM	CM	i 1			! i
	·—-		—*	1	*	**·	1	·«—-
r-	CO	o	UD	i i	o		1 f	O
C0	UD	00	UD	1 1	00	CD	1 I	00
CM	CM	CM	CM	1	CD		ł	cd
ω	ω	Q	(£	1 1	ω	z	i l	ω
*T				1 1	cn		i 1	o
co				i	co		r
CM				1	CM		1	CM

j CM j	CM
	i		1 I	.—.
	i |	i—t	1	CM
	1 i	o	i ł
	t	o	i «	O
	1 t	—'	I 1
	1	r—<	1	UD
	1 1	o	1 1	c-ł
	1 1	rH	i 1	CD
<	fi !		< !	<	<
		x—	X-,
UD	co	UD	co	UD	UD
MD	CM	O	CM ί	kO	O
XT	CD	-ęjt	CD		CD
——*				*—·
	r- !	O	σ !		00
CD	o	00	o	CD	co
VJ<	CD	CD	CD		04
Z	e-< ’	ω	u ;	Z
	1 1	r—ł	» 1	cm
	1	Γ	1	r
	1	CM	I	CM

PL 209 786 B1

Dyskusja

Badanie to obejmuje całkowite mapowanie ludzkiej IgG1 względem FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIIA oraz FcRn. Przedstawiono skanowanie alaniny dla wszystkich aminokwasów ludzkiego Fc IgG1 (CH2 i CH3 domen) eksponowanych na rozpuszczalnik, w oparciu o strukturę krystaliczną ludzkiego Fc (Deisenhofer, Biochemistry 20: 2361-2370 (1981)). Każdy eksponowany aminokwas w CH2 oraz CH3 został indywidualnie zamieniony na alaninę, a wariant IgG testowano względem wszystkich 5 ludzkich receptorów; oceniano wszystkie warianty przy użyciu humanizowanej IgG1 anty-IgE, E27, jako polipeptydu macierzystego. FcyRI oraz FcRn to receptory o wysokim powinowactwie, a monomer IgG mógł być oceniany w tych analizach dla dwóch z tych dwóch receptorów. FcyRIIA, FcyRIIB oraz FcyRIIIA to receptory o niskim powinowactwie i wymagają zastosowania kompleksu immunologicznego. Zatem w przypadku FcyRIIA, FcyRIIB oraz FcyRIIIA zastosowano test ELISA, w którym wstępnie utworzone heksamery, złożone z trzech cząsteczek E27 anty-IgE oraz trzech cząsteczek IgE, związano do FcyR, i jako reagent do detekcji użyto anty- ludzkie Fc IgG -HRP, albo lub białko G-HRP. Aby zwiększyć wiązanie heksamery te można połączyć w multimery przez dodanie ludzkiego VEGF (używając IgE anty-VEGF). Heksamery wiążą się do FcyR o niskim powinowactwie znacząco lepiej niż monomery IgG, multimery wiążą lepiej niż heksamery (Figury 15A oraz 15B). Zastosowano kompleksy heksametryczne, ponieważ zapewniały one wystarczające wiązanie i wymagały mniej IgG. Innymi reagentami, które można zastosować są kompleksy wytworzone przy użyciu innych kombinacji przeciwciało: antygen pod warunkiem, że w przypadku przeciwciała antygen będzie zawierał dwa identyczne miejsca wiązania na cząsteczkę. Przykładowo, VEGF zawiera dwa miejsca wiązania na dimer VEGF dla anty-VEGF A.4.6.1 (Kim i inni, Growth Factors 7:53(1992) oraz Kim i inni, Nature 362: 841 (1993)). Multimery VEGF: anty-VEGF wiązały się także do FcyRIIA oraz FcyRIIIA o niskim powinowactwie (Figury 16A i 16B).

Po przeprowadzeniu kompletnego skanowania alaniny stwierdzono występowanie kilku klas wariantów alaninowych. Niektóre warianty wykazywały obniżone wiązanie z wszystkimi FcyR (G14, Figura 17), podczas gdy inne warianty wykazywały zredukowane wiązanie tylko z jednym FcyR (G36, Figura 17), poprawione wiązanie tylko z jednym FcyR (G15, G54, G55, Figura 17), albo równoczesną redukcję wiązania z jednym FcyR wraz z poprawą wiązania z innym (G16, Figura 17).

Pojedyncze warianty alaninowe łączono ponadto z pojedynczymi wariantami regionu Fc, np. połączenie S298(317)A z K334(353)A poprawiało wiązanie z FcyRIIIA bardziej niż sama S298(317)A lub K334(353)A (Figury 18A oraz B, porównaj warianty 36, 55 oraz 109 w Tabeli 6 i 9) (numery reszt w nawiasie są numerami według indeksu EU zgodnie z Kabat). Podobnie, przez połączenie S298(317)A z E333(352)A poprawiono wiązanie z FcyRIIIA w porównaniu do samej S298(317)A lub E333(352) (porównaj warianty 36, 53 i 107 w Tabelach 6 i 9).

Wyselekcjownowane warianty IgG testowano także pod kątem wiązania FcyR transfekowanych do komórek ssaczych. Zewnątrzkomórkową cześć łańcucha α ludzkiego FcyRIIIA transfekowano do komórek CHO przy użyciu łącznika GPI, podczas gdy pełnej długości ludzki receptor FcyRIIB transfekowano do komórek CHO. Dla testowanych wariantów wzorzec wiązania do komórek był taki sam jak wzorzec wiązania białko: białko w analizie ELISA (Figury 18A-B i 19A-B).

Jednym z zastosowań tych wariantów jest poprawa funkcji efektorowych ADCC przeciwciała. Można to osiągniąć przez modyfikację aminokwasów regionu Fc jednej czy większej ilości reszt, prowadzącej do poprawy wiązania do FcyRIIIA. Poprawione wiązanie do FcyRIIIA doprowadziłoby do poprawy wiązania przez komórki NK, które mają tylko FcyRIIIA i mogą pośredniczyć w ADCC. Wyselekcjonowane warianty alaninowe, które miały albo zredukowane wiązanie z FcyRIIIA (warianty 17, 18, 34; Tabela 6), albo nie miały wpływu na wiązanie FcyRIIIA (odmiana 31, Tabela 6), albo które miały zwiększone wiązanie z FcyRIIIA (wariant 30, 36; Tabela 6) testowano w analizach in vitro przy użyciu ludzkich PBMC jako komórek efektorowych. Ze względu na to, że komórki docelowe były komórkami SKBR3 z nadekspresją HER2, to warianty Fc IgG użyte w tej analizie wytworzono przez substytucję domen VH/VL E27 anty-IgE odpowiednimi domenami z przeciwciała anty-HER2; HERCEPTIN® (ludzkie Ab4D5-8 w Tabeli 1 z Carter i inni, PNAS (USA) 89:4285 (1992)). Wzorzec ADCC wykazywany przez warianty był skorelowany z wzorcami wiązania z FcyRIIIA (Figury 20 oraz 21). W szczególności wariant wykazujący większą poprawę wiązania z FcyRIIIA w analizach białko:białko, wariant 36S298(317)A, wykazywał również poprawę ADCC w porównaniu do dzikiego typu HERCEPTIN^® w ilości 1,25 ng/ml (Figura 21).

PL 209 786 B1

P r z y k ł a d 5

Wiązanie wariantów Fc do polimorficznych receptorów Fc

W populacji ludzkiej stwierdzono występowanie wariantów allelicznych kilku ludzkich FcyR. Warianty te wykazywały różnice w wiązaniu ludzkiej oraz mysiej IgG, a wiele badań skorelowało wyniki z obecnością specyficznych wariantów allelicznych (dla przeglądu zobacz LehrnBecher i inni, Blood 94 (12): 4220-4232(1999)). W kilku badaniach badano dwie postaci FcyRIIA, R131 oraz H131, oraz ich związek z wynikami klinicznymi (Hatta i inni, Genes and Immunity 1:53-60 (1999); Yap i inni Lupus 8:305-310(1999); jak również Lorenz i inni European J. Immunogenetics 22:397-401 (1995)). Obecnie badane są dwie postaci alleliczne FcyRIIIA, F158 oraz V158 (Lehrebecher i inni, supra; i Wu i inni. J. Clin. Invest. 100(5):1059-1070)). W przykładzie tym wyselekcjonowane warianty IgG testowano względem tych obu postaci allelicznych FcyRIIA i FcyRIIIA. Analizy wiązania receptora Fc przeprowadzono zasadniczo tak jak w powyższych przykładach. Jednakże dla FcyRIIIA- V158 przeprowadzono zarówno (a) test wiązania receptora o niskim powinowactwie z przykładu 1 (w którym analizowano wiązanie kompleksu IgG do FcyRIIIA- V158); oraz (b) test wiązania FcyR o wysokim stopniu powinowactwa z przykładu 4 (w którym analizowano wiązanie monomeru IgG do FcyRIIIA-V158). Wyniki badań podsumowano w tabeli 10 poniżej.

PL 209 786 B1

WIĄZANIE WARIANTÓW Z RECEPTORAMI POLIMORFICZNYMI FcyRIIA I FcyRIIlA

177 K290(307)G

PL 209 786 B1

!

cO ]

CM

co

co

CM

UO

i-i

1

t-4

1 1

CM

i

•O1

1

1

i-i

|

.—-

I

|

|

Γ i

<Ti

CM

to j

co

CTi

CO

I

r-

i—ł j

-1 '

o

rH

i—1 !

o

t—1

1

1

O

1

<—i

o !

o ’

o

O

° !

o

O

1 1

1 |

O

1 f

o

|

1

1

-—

I

1

1

Ή !

»—1

Γ

T i

(O

r-

i—♦

i 1

Γ'

1 |

o

1 f

r-

CM

Γ- I

CM

θ’

UO

00

<x>

O

t

co

1

•<r

l

co

O ’

o !

o

O

o !

o

o

ł—1

i l

o

1 1

O

t ł

o

21) 3

01) 2

co i y> ! °

12) 3

ł 1 1 1 1 1

,12) 4

CM τ—1 Γ CO

1 1 1 1 1 ł

,06) 5

1 1 1 1 1 1

.05)' 4

I ł 1 i i J

! i i-l { iH J

O r-ł CM «—i

O j

O J

o J

O

1

O

o

t

O

1

O

1

O J

O

I

1

1

1

1

1

<

1

<-< i

00 !

r-{

1

CM

σ\

1

uo

1

co

i

™ i

CM

rr 1

o {

rH

c—1

1

t—1

1—1

1

i—1

1

T-l

i

i-i ;

<Fi

o !

o !

o !

»—i

1 1

i-i

r-4

1

i—<

ł

i—1

1 1

ι-l !

O

R292(309)A

bi i	s: '	Ο» [	2 !	o		Ol	1 °	1 <	I °
1	1							1	1
S? !	CD )	en !	ON	o	1 T—1	1-1	. ł_
o	O	o	o	»—1		«—i	f **	1	1
co '	co ;	co [	co j	co		CO	!		1
				•—		*-*	t
CM	cm ;	CM !	CM !	co	1		: vr	03	03
CTi	ΟΊ	σ !	οί	σ\		σι	I
CM	CM	CM !	CM	CM	<CM	CM	1 CM	04
od [	f£ 1	cd J	cd ’	ω	ί ω 1	ω	! ω	1 °°	i ω
1 i	1 1	1 1	1 1	xr	i i 1 1	co	1
O 1	<—1 1	CM 1	CO 1		! CO 1	r-	i r-	I	1 o
00 1	00 1	OO 1	GO 1	r-i	1 CO 1	i“S	1 t—·	1 co	1 Γ-

H !	2 !	> !	!	< J	o:	! !		I	I
!	„—.	-—' a	---a	—. :	y—s			1
r-	Γ**-	!				I	\o
ł~1	r-1	<”< a		CM	CM		cO
CO ]	CO j	CO	CO j	CO j	co		co		1 m
							'—’		1
O0 !	<» !	a? !	00 !	U0 ]	c-	! i	r-	! °	z
(Tl	σ>	σ\	<T\	o	o		r-4		£
CM	CM	CM	CM	CO	co	co	CO	CO
co ;	ω ]	σ> J	<O J	> !	H	! 12 !		!	i u:
1 1	l 1	1 oo I	1 |	1 1		1 1 1 ł		1 i	1 1
i-i 1	CM l	«-f 1	ι-l 1	O f	(—i	1 LT) i	<0	1 00	i xr
r- 1	r~- i	CM |	CM 1	ςτ t	ST	1 ST 1	•ST	1	1 MO

PL 209 786 B1

141 E333(352)Q 0.70 (0.05) 2 1.10 (0.03) 2 1.05 1 1.00

221 K334(353)L 1.05 1 1.38 1 0.96 1 3.59

PL 209 786 B1

PL 209 786 B1

W przypadku FcyRIIIA wzorzec wiązania wyselekcjonowanych wariantów IgG1 z FcyRIIIA-V158 o stosunkowo wysokim powinowactwie był taki sam jak do FcyRIIIA-F158 o stosunkowo niższym powinowactwie (postać F158 stosowano w analizie wszystkich wariantów). Warianty IgG1, które wykazywały poprawione wiązanie z FcyRIIIA-F158 wykazywały także poprawione wiązanie z FcyRIIIA-V158, chociaż poprawa nie była tak wyraźna. W przypadku FcyRIIA-R131 (stosowanego do analizy wszystkich wariantów) oraz FcyRIIA-H131 wzór wiązania wyselekcjonowanych wariantów IgG1 nie wykazywał wyraźnych różnic. S267(280)A, H268(231)A oraz S267(280)A/H268(281)A wykazywały poprawione wiązanie z FcyRIIA-R131 w porównaniu do natywnej IgG1, ale nie z FcyRIIA-H131. Przeciwnie S267(280)G wykazywał poprawione wiązanie z FcyRIIA-R131, ale zmniejszone wiązanie z FcyRIIA-H131 (Tabela 10). Inne warianty wiązały się podobnie z następującymi postaciami allelicznymi FcyRIIA: V305(324)A, T307(326)A, N315(324)A, K317(336)A oraz K320(339)A.

PL 209 786 B1 <1.10 <! 20 <13O>

S <141>

<150 < 151 >

”% 1 O —i <2 lfi>

<210 <212> <2l3>

<220> <22 0 <220 <223>

<400>

Lista sekwencji

Genenceeh, Inc.

Przeciwciało zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgGl.

przeciwciało wiążące czynnik wzrostu sródbłonka naczyń orazimmunoadhezyna

P1726R1PCT

2000-01-14

US 60/116,023

I999-C1-15

213

PRT $ek*«nq· «tacraa

Sekwencja srtucrHa 1-213

Sekwencja ,est w ca<ośm «syntetyzowana

Aop 1

Ile

Gi-h

Ceu Thr 5

Gin

<£?*«IC

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

20

Gly

Asp

Arg

V3l

Thr

Ile

Thr

Cys

Ar$

Ala

Ser

Lys

Fz<?

Val

Asp

20

25

30

Gly

Glu

Gly

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Glrs

Lys

Pro

Gly

33

40

45

LyYS

Ala

Pro

L/3

Leu

Leu

11®

Tyr

A i <i

Ala

Ser

Tyr

y>

GO

Ser

25

SC

55

60

Gly

val

Pro

ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

ui y

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

Thr

Leu

Thr

11«

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tvr

80

as

90

30

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

His

<.,i u

ASp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

95

100

135

Tb r

Lys

Val

'j — u

Ile

Lys

Ar g

Thr

Vai

Ala

Ala

Pro

3er

yal

Phe

110

115

120

Ile

Phe

Pro

Pro

Se r

A3p

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

35

125

13C

135

Val

Val

Cys

Lec

Leu

Asn

Asa

Phe

Tyr

Pro

Acg

L*X\2

Ala

Lys

Val

140

145

150

Gir;

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

1SS

ISO

165

43

Ser

Val

Thr

G1 u

Gin

Asp

Ser

Lys

ASp

Se r

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

170

175

190

S>3 r

Thr

Lłiti <1

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asu

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Va*

IBS

190

195

PL 209 786 B1

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 200 205 210

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 215 218 <210> 2 <211> 451 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna

Sekwencja sztuczna <221>

<222> 1-451

Sekwencja jest w całości zsyntetyzowana <400> 2

15

Glu 1 Gly Ser

Val Ser Gly

Gin Leu Tyr

Leu Val Glu

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin 10

Pro Gly 15 Ile Thr 30 Lys Gly 45

Arg Ser

5

Leu 20 Trp 35

Ser Asn

Cys Ala Val

Ser Gly Tyr Ser

Trp

Ile

Arg

25

Gly

Gin 40

Ala

Pro

20

I.eu

Glu

Trp

Val

Ala

Ser

Ile

Lys

Tyr

Ser

Gly

Glu

Thr

Lys

Tyr

50

55

60

Asn

Pro

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Ile

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asp

Ser

65

70

75

Lys

Asn

Thr

Phe

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

25

80

85

90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ser

His

Tyr

Phe

Gly

His

95

100

105

Trp

His

Phe

Ala

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

110

115

120

30

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

125

130

135

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

140

145

150

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

35

155

160

165

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

170

175

180

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

185

190

195

40

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

200

205

210

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

215

220

225

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

45

230

235

240

PL 209 786 B1

Gly Ket

Pro Ile

Ser Val

Phe Leu 245

Phe Glu

Pro Val

Pro Lys

Pro Val

Lys Asp Thr

Leu 255 Val 270

Ser

Arg

Thr

250 Cys 265

Val

Val Asp

Thr 260

Pro

5

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

275

280

285

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

290

295

300

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

10

305

310

315

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

320

325

330

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

335

340

345

15

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

350

355

360

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

365

370

375

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

20

380

385

390

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

395

400

405

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

410

415

420

25

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

425

430

4 35

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

440

445

450

Lys

30

451

<210

3

<211>

• 218

<212>

• PRT

<213>

• homo sapiens

35

<400

3

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

1

5

10

15

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

20

25

30

40

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

35

40

45

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

50

55

60

Lys

Pio

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

PL 209 786 B1

70 75

Val Lys

Leu Thr

Val Leu His Gin

Asp Trp Leu Asn Gly 85

Lys Ile

Glu Glu

Tyr 90 Lys

Cys

Lys

Val

80

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

5

95

100

105

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

110

115

120

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

125

130

135

10

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

140

145

150

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

155

160

165

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

15

170

175

180

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

185

190

195

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

200

205

210

20

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

215 218 <210 4 <211> 218 <212> PRT

25

<213> homo sapiens

<400 4

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

1

5

10

15

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val·

30

20

25

30

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

35

40

45

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

50

55

60

35

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

65

70

75

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

80

85

90

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

40

95

100

105

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

110

115

120

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

125 130 135

PL 209 786 B1

Leu Glu

Thr Cys

Leu Val

Lys Gly

Gly Phe Tyr

Pro Ser Asp Ile Ala

Val 150 Thr 165

Ser

140 Asn 155

145 Asn 160

Asn

Tyr

Lys

Thr

Trp

Glu

Gin

Pro Glu

5

Pro

Pro

Val

Leu

Asp 170

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe 175

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys 180

Leu

Thr

Val

Asp

Lys 185

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin 190

Gly

Asn

Val

Phe

Ser 195

10

Cys

Ser

Val

Met

His 200

Glu

Ala

Leu

His

Asn 205

His

Tyr

Thr

Gin

Lys 210

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

215 218 <210> 5 <211> 217

15

<212> PRT · <213> homo sapiens

Leu

Phe

Pro

Pro 15

<400> 5

Pro Pro Val 5

Ala

Gly Pro

Ser

Val 10

Phe

Pro 1

Ala

20

Lys

Pro

Lys Asp Thr

Leu

Met Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

20

25

30

Cys

Val

Val Val Asp

Val

Ser His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Gin

Phe

35

40

45

Asn

Trp

Tyr Val Asp

Gly

Val Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

25

50

55

60

Pro

Arg

Glu Glu Gin

Phe

Asn Ser

Thr

Phe

Arg

Val

Val

Ser

Val

65

70

75

Leu

Thr

Val Val His

Gin

Asp Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

80

85

90

30

Cys

Lys

Val Ser Asn

Lys

Gly Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

95

100

105

Ile

Ser

Lys Thr Lys

Gly

Gin Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

110

115

120

Leu

Pro

Pro Ser Arg

Glu

Glu Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

35

125

130

135

Thr

Cys

Leu Val Lys

Gly

Phe Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

140

145

150

Trp

Glu

Ser Asn Gly

Gin

Pro Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

155

160

165

40

Pro

Met

Leu Asp Ser

Asp

Gly Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

170

175

180

Thr

Val

Asp Lys Ser

Arg

Trp Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

185

190

195

Ser

Val

Met His Glu

Ala

Leu His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

PL 209 786 B1

200 205 210

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 215 217 <210> 6 5 <213> 218 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 6

10

Pro 1

Ala

Pro

Glu

Leu 5

Leu Gly

Gly

Pro Ser 10

Val

Phe

Leu

Phe

Pro 15

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

20

25

30

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Gin

35

40

45

15

Phe

Lys

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

50

55

60

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg

Val

Val

Ser

65

70

75

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Aap

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

20

80

85

90

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

95

100

105

Thr

Ile

Ser

Lys

Thr

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

110

115

120

25

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

125

130

135

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

140

145

150

Glu

Trp

Glu

Ser

Ser

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Asn

Thr

Thr

30

155

160

165

Pro

Pro

Met

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

170

175

180

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Ile

Phe

Ser

185

190

195

35

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

Arg

Phe

Thr

Gin

Lys

200

205

210

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

215

218

<210>

7

40

<21i>

218

<212>

PRT

<213>

homo sapiens

<400>

7

Pro

Ala

Pro

Glu

Phe

Leu

Gly

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

45

1

5

10

15

PL 209 786 B1

Pro Lys

Pro

Lys

Asp Thr 20

Leu

Met

Ile

Ser 25

Arg

Thr

Pro

Glu

Val 30

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

Gin

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Gin

35

40

45

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

50

55

60

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

65

70

75

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

80

85

90

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Leu

Pro

Ser

Ser

Ile

Glu

Lys

95

100

105

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

110

115

120

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Gin

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

125

130

135

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

140

145

150

Glu

Trp

Glx

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

155

160

165

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Arg

170

175

180

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Glu

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

185

190

195

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

200

205

210

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Leu

Gly

Lys

215 218 <210> 8 <211> 215 <212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 8

Thr

Val

Pro

Glu

Val

Ser

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

1

5

10

15

Lys

Asp

Val

Leu

Thr

Ile

Thr

Leu

Thr

Pro

Lys

Val

Thr

Cys

Val

20

25

30

Val

Val

Asp

ile

Ser

Lys

Asp

Asp

Pro

Glu

Val

Gin

Phe

Ser

Trp

35

40

45

Phe

Val

Asp

Asp

Val

Glu

Val

His

Thr

Ala

Gin

Thr

Gin

Pro

Arg

50

55

60

Glu

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg

Ser

Val

Ser

Glu

Leu

Pro

65

70

75

Ile

Met

His

Gin

Asp

Cys

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Phe

Lys

Cys

Arg

PL 209 786 B1

85 90

Val Asn

Ser

Ala

Ala 95

Phe

Pro Ala

Pro

Ile 100

Glu Lys

Thr

Ile

Ser 105

Lys

Thr

Lys

Gly

Arg

Pro

Lys

Ala

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Ile

Pro

110

115

120

Pro

Pro

Lys

Glu

Gin

Met

Ala

Lys

Asp

Lys

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

125

130

135

Met

Ile

Thr

Asp

Phe

Phe

Pro

Glu

Asp

Ile

Thr

Val

Glu

Trp

Gin

140

145

150

Trp

Asn

Gly

Gin

Pro

Ala

Glu

Asn

Tyr

Lys

Asn

Thr

Gin

Pro

Ile

155

160

165

Met

Asp

Thr

Asp

Gly

Ser

Tyr

Phe

Val

Tyr

Ser

Lys

Leu

Asn

Val

170

175

180

Gin

Lys

Ser

Asn

Trp

Glu

Ala

Gly

Asn

Thr

Phe

Thr

Cys

Ser

Val

185

190

195

Leu

His

Glu

Gly

Leu

His

Asn

His

His

Thr

Glu

Lys

Ser

Leu

Ser

200

205

210

His Ser Pro Gly Lys 215 <210> 9 <211> 218 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 9

Leu

Gly Gly Pro

Ser 10

Val

Phe

Ile

Phe

Pro 15

Pro 1

Ala

Pro

Asn

Leu 5

Pro

Lys

Ile

Lys

Asp 20

Val

Leu Met Ile

Ser 25

Leu

Ser

Pro

Ile

Val 30

Thr

Cys

Val

Val

Val 35

Asp

Val Ser Glu

Asp 40

Asp

Pro

Asp

Val

Gin 45

Ile

Ser

Trp

Phe

Val 50

Asn

Asn Val Glu

Val 55

His

Thr

Ala

Gin

Thr 60

Gin

Thr

His

Arg

Glu 65

Asp

Tyr Asn Ser

Thr 70

Leu

Arg

Val

Val

Ser 75

Ala

Leu

Pro

Ile

Gin 80

His

Gin Asp Trp

Met 85

Ser

Gly

Lys

Glu

Phe 90

Lys

Cys

Lys

Val

Asn 95

Asn

Lys Asp Leu

Pro 100

Ala

Pro

Ile

Glu

Arg 105

Thr

Ile

Ser

Lys

Pro 110

Lys

Gly Ser val

Arg 115

Ala

Pro

Gin

Val

Tyr 120

Val

Leu

Pro

Pro

Pro 125

Glu

Glu Glu Met

Thr 130

Lys

Lys

Gin

Val

Thr 135

Leu

Thr

Cys

Met

Val 140

Thr

Asp Phe Met

Pro 145

Glu

Asp

Ile

Tyr

Val 150

PL 209 786 B1

Glu	Trp	Thr	Asn	Asn 155	Gly
Glu	Pro	Val	Leu	Asp 170	Ser
Leu	Arg	Val	Glu	Lys 185	Lys
Cys	Ser	Val	Val	His 200	Glu
Ser	Phe	Ser	Arg	Thr 215	Pro

Lys	Thr	Glu	Leu	Asn	Tyr	Lys	Asn	Thr
			160					165
Asp	Gly	Ser	Tyr	Phe	Met	Tyr	Ser	Lys
			175					180
Asn	Trp	Val	Glu	Arg	Asn	Ser	Tyr	Ser
			190					195
Gly	Leu	His	Asn	His	His	Thr	Thr	Lys
			205					210
Gly	Lys

218 <210> 10 <211> 218 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10

Pro 1	Ala	Pro	Asn	Leu 5	Glu	Gly
Pro	Asn	Ile	Lys	Asp 20	Val	Leu
Thr	Cys	Val	Val	Val 35	Asp	Val
Ile	Ser	Trp	Phe	Val	Asn	Asn

Gin Thr His Arg Glu Asp Tyr

				65
His	Leu	Pro	Ile	Gin 80	His	Gin
Lys	Cys	Lys	Val	Asn 95	Asn	Lys
Thr	Ile	Ser	Lys	Pro 110	Lys	Gly
Thr	Leu	Pro	Pro	Pro 125	Ala	Glu
Leu	Thr	Cys	Leu	Val 140	Val	Gly
Glu	Trp	Thr	Ser	Asn 155	Gly	His
Ala	Pro	Val	Leu	Asp 170	Ser	Asp
Leu	Asn	Met	Lys	Thr 185	Ser	Lys
Cys	Asn	Val	Arg	His 200	Glu	Gly
Thr	Ile	Ser	Arg	Ser	Pro	Gly

Lys

Gly	Pro	Ser 10	Val	Phe	Ile	Phe	Pro 15
Met	Ile	Ser 25	Leu	Thr	Pro	Lys	Val 30
Ser	Glu	Asp 40	Asp	Pro	Asp	Val	Gin 45
Val	Glu	Val 55	His	Thr	Ala	Gin	Thr 60
Asn	Ser	Thr 70	Ile	Arg	Val	Val	Ser 75
Asp	Trp	Met	Ser	Gly	Lys	Glu	Phe

90

Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg 100 105

Leu Val Arg Ala Pro Gin Val Tyr 115 120

Gin Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser 130 135

Phe	Asn	Pro	Gly	Asp	Ile	Ser	Val
		145					150
Thr	Glu	Glu	Asn	Tyr	Lys	Asp	Thr
		160					165
Gly	Ser	Tyr	Phe	Ile	Tyr	Ser	Lys
		175					180
Trp	Glu	Lys	Thr	Asp	Ser	Phe	Ser
		190					195
Leu	Lys	Asn	Tyr	Tyr	Leu	Lys	Lys

205 210

PL 209 786 B1

215 218 <210> 11 <211> 218 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11

Pro Pro Gly Asn 1

Ile 5

Leu Gly

Gly

Pro

Ser 10

Val

Phe

Ile

Phe

Pro 15

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Ala

Leu

Met

Ile

Ser

Leu

Thr

Pro

Lys

Val

10

20

25

30

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

Glu

Asp

Asp

Pro

Asp

Val

His

35

40

45

Val

Ser

Trp

Phe

Val

Asp

Asn

Lys

Glu

Val

His

Thr

Ala

Trp

Thr

50

55

60

15

Gin

Pro

Arg

Glu

Ala

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg

Val

Val

Ser

65

70

75

Ala

Leu

Pro

Ile

Gin

His

Gin

Asp

Trp

Met

Arg

Gly

Lys

Glu

Phe

80

85

90

Lys

Cys

Lys

Val

Asn

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Arg

20

95

100

105

Thr

Ile

Ser

Lys

Pro

Lys

Gly

Arg

Ala

Gin

Thr

Pro

Gin

Val

Tyr

110

115

120

Thr

Ile

Pro

Pro

Pro

Arg

Glu

Gin

Met

Ser

Lys

Lys

Lys

Val

Ser

125

130

135

25

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Thr

Asn

Phe

Phe

Ser

Glu

Ala

Ile

Ser

Val

140

145

150

Glu

Trp

Glu

Arg

Asn

Gly

Glu

Leu

Glu

Gin

Asp

Tyr

Lys

Asn

Thr

155

160

165

Pro

Pro

Ile

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Thr

Tyr

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

30

170

175

180

Leu

Thr

Val

Asp

Thr

Asp

Ser

Trp

Leu

Gin

Gly

Glu

Ile

Phe

Thr

185

190

195

Cys

Ser

Val

Val

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

His

Thr

Gin

Lys

200

205

210

35

Asn

Leu

Ser

Arg

Ser

Pro

Gly

Lys

215

218

PL 209 786 B1

Claims (7)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Przeciwciało zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgG1 niebędący natywną sekwencją regionu Fc, i zawierające substytucję aminokwasową w pozycji aminokwasowej 434 regionu Fc, przy czym numeracja reszt w regionie Fc jest zgodna z indeksem EU według Kabat, i przy czym wariant regionu Fc wiąże ludzki noworodkowy receptor Fc (FcRn) ze zwiększonym powinowactwem wiązania w porównaniu z natywną sekwencją regionu Fc ludzkiej IgG1.
2. 2. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera substytucję aminokwasową tylko w pozycji 434 w regionie Fc.
3. 3. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera substytucję N434A.
4. 4. Przeciwciało wiążące czynnik wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF), zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgG1 niebędący natywną sekwencją regionu Fc i zawierające substytucję aminokwasową w pozycji aminokwasowej 434 regionu Fc, przy czym numeracja reszt w regionie Fc jest zgodna z indeksem EU wedł ug Kabat, i przy czym wariant regionu Fc wiąże ludzki noworodkowy receptor Fc (FcRn) ze zwiększonym powinowactwem wiązania w porównaniu z natywną sekwencją regionu Fc ludzkiej IgG1.
5. 5. Immunoadhezyna, znamienna tym, że zawiera wariant regionu Fc ludzkiej IgG1 niebędący natywną sekwencją regionu Fc i zawiera substytucję aminokwasową w pozycji aminokwasowej 434 regionu Fc, przy czym numeracja reszt w regionie Fc jest zgodna z indeksem EU według Kabat, i przy czym wariant regionu Fc wiąże ludzki noworodkowy receptor Fc (FcRn) ze zwiększonym powinowactwem wiązania w porównaniu z natywną sekwencją regionu Fc ludzkiej IgG1.
6. 6. Immunoadhezyna według zastrz. 5, znamienna tym, że zawiera substytucję aminokwasową tylko w pozycji 434 w regionie Fc.
7. 7. Immunoadhezyna według zastrz. 5, znamienna tym, że zawiera substytucję N434A.