TW202204622A - 針對冠狀病毒之核酸疫苗 - Google Patents

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Abstract

本文提供用於管理、預防及/或治療由冠狀病毒引起之感染性疾病的治療性核酸分子。本文亦提供包含該等治療性核酸之治療組成物，包括疫苗及脂質奈米粒子，以及相關治療方法及用途。

Description

針對冠狀病毒之核酸疫苗
本揭示案大體上係關於可用於管理、預防及治療冠狀病毒感染之核酸分子。本揭示案亦關於該等核酸分子之含脂質組成物，包括疫苗，以及相關遞送方法。
冠狀病毒為人類及其他動物帶來嚴重的健康威脅。自2002年至2003年，嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒(SARS-CoV)感染了8,000人，且死亡率達到約9%。自2012年以來，中東呼吸症候群冠狀病毒(MERS-CoV)已感染超過1,700人，且死亡率達約36%。自2013年以來，豬流行性腹瀉冠狀病毒(PEDV)席捲整個美國，造成仔豬的死亡率幾乎達到100%，並在不到一年的時間裏消滅美國超過10%的豬群。2020年3月，世界衛生組織(WHO)宣佈了由2019年冠狀病毒病(COVID-19)爆發引起的大流行，該病席捲180多個國家，並在爆發的前幾個月裡殺死超過80,000人。大體而言，該疾病係由新發現的冠狀病毒SARS-CoV-2引起，在人類及其他動物中顯示出廣泛的呼吸道、胃腸道及中樞神經系統疾病症狀，威脅到人類健康並造成經濟損失。因此，迫切需要有效的治療，包括用於抑制冠狀病毒感染之疫苗。本揭示案滿足了此需求。
在一個態樣中，本文提供可用於預防、管理及治療感染性疾病的非天然存在之核酸分子。在一些實施例中，該等非天然存在之核酸編碼源自於冠狀病毒 SARS-CoV-2之病毒肽或蛋白質。在一些實施例中，該非天然存在之核酸編碼源自於包含基因體之冠狀病毒的病毒肽或蛋白質，其中該基因體包含SEQ ID NO: 1中所示之核酸序列。
在一些實施例中，該非天然存在之核酸分子包含編碼區，其中該編碼區包含一或多個開放閱讀框(ORF)，且其中至少一個ORF編碼該病毒肽或蛋白質。在一些實施例中，至少一個ORF編碼異源肽或多肽。在一些實施例中，該異源肽或多肽係免疫刺激肽或蛋白質。在一些實施例中，ORF編碼包含該病毒肽或蛋白質與異源肽或多肽融合之融合蛋白。在一些實施例中，該異源肽或多肽選自人免疫球蛋白Fc區、信號肽及促進該融合蛋白多聚化之肽。
在一些實施例中，該一或多個ORF由表1至4中所示之編碼序列組成。在一些實施例中，該一或多個ORF由選自SEQ ID NO: 3、5、7、9、11、13、15、17、19、27、29、31、33、35、37、39、41、43及45之編碼序列，或其轉錄之RNA序列組成。在一些實施例中，該一或多個ORF編碼選自SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20-26、28、30、32、34、36、38、40、42及44之肽或蛋白質。
在一些實施例中，該非天然存在之核酸分子進一步包含5'非轉譯區(5'-UTR)，其中該5'-UTR包含SEQ ID NO: 46-51中所示之序列。在一些實施例中，該非天然存在之核酸分子進一步包含3’非轉譯區(3’-UTR)，其中該3’-UTR包含SEQ ID NO: 52-57中所示之序列。在一些實施例中，該3’-UTR進一步包含聚A尾或聚腺苷酸化信號。
在一些實施例中，該非天然存在之核酸分子進一步包含一或多種功能性核苷酸類似物，該等核苷酸類似物選自假尿苷、1-甲基-假尿苷及5-甲基胞嘧啶。在一些實施例中，該非天然存在之核酸分子進一步包含核酸，該核酸係DNA或mRNA。
在一些實施例中，本文揭示包含如本文所描述的天然存在之核酸分子的載體或細胞。在一些實施例中，本文揭示包含本文所描述的天然存在之核酸分子的組成物。在一些實施例中，該組成物係調配為將核酸包封在脂質殼中之脂質奈米粒子形式。在一些實施例中，該組成物係醫藥組成物。
在一個態樣中，本文提供醫藥組成物，其包含至少一個編碼源自冠狀病毒SARS-CoV-2之病毒肽或蛋白質的核酸。在一些實施例中，本文提供醫藥組成物，其包含至少一個編碼源自包含基因體之冠狀病毒之病毒肽或蛋白質的核酸，其中該基因體包含SEQ ID NO: 1中所示之核酸序列。
在本文所描述之醫藥組成物的一些實施例中，該病毒肽或蛋白質係選自：(a)冠狀病毒之刺突(S)蛋白；(b)冠狀病毒之基質(M)蛋白；(c)冠狀病毒之核衣殼(N)蛋白；(d)冠狀病毒之包膜(E)蛋白；(e)血球凝集素-酯酶(HE)蛋白；(f) (a)至(e)中之任一種之免疫原性片段；及(g) (a)至(f)中之任一種之功能性衍生物。
在一些實施例中，該病毒肽或蛋白質係該S蛋白、該S蛋白之免疫原性片段或該S蛋白或其免疫原性片段的功能性衍生物。在一些實施例中，該S蛋白之免疫原性片段選自胞外結構域(ECD)、S1次單元、受體結合結構域(RBD)及受體結合模體(RBM)。
在本文所描述之醫藥組成物的一些實施例中，該病毒肽或蛋白質係RBD之功能性衍生物。在一些實施例中，RBD之功能性衍生物包含在RBD中之一或多個胺基酸取代，該一或多個取代能夠增加該RBD對宿主細胞中之受體的結合親和力。在一些實施例中，該受體係ACE2。在一些實施例中，該胺基酸取代包含N501T。
在本文所描述之醫藥組成物的一些實施例中，該病毒肽或蛋白質包含SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20-26、32、34、40、42及44中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，該核酸包含如SEQ ID NO: 3、5、7、9、11、13、15、17、19、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、46、48、50、52、54、56中所示之序列或其轉錄之RNA序列。
在本文所描述之醫藥組成物的一些實施例中，RBD之功能性衍生物包含與人免疫球蛋白Fc區融合之RBD。在一些實施例中，該免疫球蛋白係IgG1。
在本文所描述之醫藥組成物的一些實施例中，RBD之功能性衍生物包含與促進融合蛋白多聚化之肽融合的RBD。在一些實施例中，S-RBD之功能性衍生物經構形以形成三聚體複合物。
在本文所描述之醫藥組成物的一些實施例中，該病毒肽或蛋白質係N蛋白。在一些實施例中，該N蛋白包含SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，該核酸包含SEQ ID NO: 19中所示之序列或自其轉錄之RNA序列。
在本文所描述之醫藥組成物的一些實施例中，該核酸進一步包含5'非轉譯區及/或3'非轉譯區。在一些實施例中，該5'非轉譯區包含選自SEQ ID NO: 46-51之序列。在一些實施例中，該3'非轉譯區包含聚A尾或聚腺苷酸化信號。在一些實施例中，該3'非轉譯區包含選自SEQ ID NO: 52-57之序列。
在本文所描述之醫藥組成物的一些實施例中，該核酸包含一或多種選自假尿苷、1-甲基-假尿苷及5-甲基胞嘧啶之功能性核苷酸類似物。
在本文所描述之醫藥組成物的一些實施例中，該組成物進一步包含至少一種脂質。在一些實施例中，該脂質係根據式(I)至(IV)之化合物。在一些實施例中，該脂質係根據式(I-A)、(I-B)、(IB’)、(I-B”)、(I-C)、(I-D)、(I-E)、(I-F)、(I-F’)、(I-F”)、(I-G)、(I-H)、(I-I)、(I-J)、(I-J’)、(I-J’’)、(I-K)、(I-L)、(I-M)、(I-N)、(I-N’)、(I-N”)、(I-O)、(I-P)、(I-Q)、(I-R)、(I-R’)、(I-R”)、(I-S)、(I-T)、(I-U)、(II-A)、(II-B)、(II-B’)、(II-B”)、(II-C)、(II-D)、(II-E)、(II-F)、(II-F’)、(II-F”)、(II-G)、(II-H)、(II-I)、(II-J)、(II-J’)、(II-J”)、(II-K)、(II-L)、(II-M)、(II-N)、(II-N’)、(II-N”)、(II-O)、(II-P)、(II-Q)、(II -R)、(II –R’)、(II –R”)、(II-S)、(II-T)、(II-U)、(III-A)、(III-B)、(III-B’)、(III-B”)、(III-C)、(III-D)、(III-E)、(III-F)、(III-F’)、(III-F”)、(III-G)、(III-H)、(III-I)、(III-J)、(III-J’)、(III-J”)、(III-K)、(III-L)、(III-M)、(III-N)、(III-N’)、(III-N”)、(III-O)、(III-P)、(III-Q)、(III-R)、(III-R’)、(III-R”)、(III-S)、(III-T)、(III-U)、(IV-A)、(IV-B)、(IV-B’)、(IV-B”)、(IV-C)、(IV-D)、(IV-E)、(IV-F)、(IV-F’)、(IV-F”)、(IV-G)、(IV-H)、(IV-I)、(IV-J)、(IV-J’)、(IV-J”)、(IV-K)、(IV-L)、(IV-M)、(IV-N)、(IV-N’)、(IV-N”)、(IV-O)、(IV-P)、(IV-Q)、(IV-R)、(IV-R’)、(IV-R”)、(IV-S)、(IV-T)或(IV-U)之化合物。在一些實施例中，該脂質係表1中所列之化合物。在一些實施例中，該組成物係調配為將核酸包封在脂質殼中的脂質奈米粒子形式。在一些實施例中，該組成物係疫苗。
在一個態樣中，本文提供用於管理、預防或治療個體的由冠狀病毒引起之感染性疾病的方法，其包括向該個體投與治療有效量的本文所述之非天然存在之核酸，或治療有效量的本文所述之醫藥組成物。
在本文所描述之方法的一些實施例中，該個體係人類或非人類哺乳動物。在一些實施例中，該個體係成人、兒童或幼兒。在一些實施例中，該個體患有感染性疾病。在一些實施例中，該個體有感染冠狀病毒之風險或易感染冠狀病毒。在一些實施例中，該個體係老年人。在一些實施例中，個體已被診斷為對冠狀病毒感染呈陽性。在一些實施例中，個體係無症狀的。
在本文所描述之方法的一些實施例中，該方法包括向該個體投與包封核酸之脂質奈米粒子，且其中該等脂質奈米粒子經該個體之細胞胞吞。在一些實施例中，該核酸係由該個體之細胞表現。
在本文所描述之方法的一些實施例中，在該個體中引起針對冠狀病毒之免疫反應。在一些實施例中，該免疫反應包含產生特異性結合至由該核酸編碼之病毒肽或蛋白質的抗體。在一些實施例中，該抗體係針對冠狀病毒或感染冠狀病毒之細胞的中和抗體。在一些實施例中，該抗體之血清力價在該個體中增加。
在一些實施例中，該抗體特異性結合至S蛋白之一或多個抗原決定基。在本文所描述之方法的一些實施例中，S蛋白之一或多種功能或活性減弱。在一些實施例中，S蛋白功能或活性之減弱係藉由以下量測：(a) S蛋白與宿主細胞受體之結合減少；(b)冠狀病毒對宿主細胞之附著減少；(c)由冠狀病毒誘導之宿主細胞膜融合減少；或(d)個體體內感染冠狀病毒之細胞數量減少。在一些實施例中，宿主受體選自血管緊張素轉化酶2 (ACE2)、胺基肽酶N (APN)、二肽基肽酶4 (DPP4)、癌胚抗原相關細胞黏附分子1 (CEACAM1)及糖。在一些實施例中，S蛋白功能或活性降低10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%。
在本文所描述之方法的一些實施例中，抗體特異性結合至N蛋白之一或多個抗原決定基。在一些實施例中，N蛋白之一或多種功能或活性減弱。在一些實施例中，N蛋白功能或活性之減弱係藉由以下量測：(a) N蛋白與冠狀病毒之經複製基因體序列的結合減少；(b)包裝至功能性病毒衣殼中的冠狀病毒之經複製基因體序列減少；或(c)個體體內經複製之病毒粒子的數量減少。在一些實施例中，N蛋白功能或活性降低10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%。
在本文所描述之方法的一些實施例中，抗體結合至病毒粒子或受感染細胞並標記病毒粒子或受感染細胞以被個體之免疫系統破壞。在一些實施例中，抗體所結合之病毒粒子的胞吞作用得到誘導或增強。在一些實施例中，針對個體體內受感染細胞之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)得到誘導或增強。在一些實施例中，針對個體體內受感染細胞之抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)得到誘導或增強。在一些實施例中，針對個體體內受感染細胞之補體依賴性細胞毒性(CDC)得到誘導或增強。
在本文所描述之方法的一些實施例中，感染性疾病係呼吸道感染、肺感染、腎感染、肝感染、腸感染、神經系統感染、呼吸道症候群、支氣管炎、肺炎、腸胃炎、腦脊髓炎、腦炎、類肉瘤病、腹瀉、肝炎及脫髓鞘疾病。在一些實施例中，感染性疾病係呼吸道感染。在一些實施例中，感染性疾病係肺感染。在一些實施例中，感染性疾病係呼吸道症候群。在一些實施例中，感染性疾病係肺炎。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2020年4月9日申請之中國專利申請案第202010276288.0號、2020年4月16日申請之美國臨時申請案第63/011,116號及2021年3月19日申請之中國專利申請案第202110293284.8號之優先權益，各案內容以引用之方式併入。
本文提供可用於預防、管理及治療由冠狀病毒引起之感染性疾病或疾患的治療性核酸分子。本文亦提供包含該等治療性核酸分子之醫藥組成物，包括調配為脂質奈米粒子形式之醫藥組成物，以及用於預防、管理及治療由冠狀病毒，包括由引起稱為COVID-19之大流行的病原體所引起之感染性疾病或疾患的相關治療方法及用途。熟習此項技術者在考慮以下特定實施例之詳細描述之後將對本揭示案之額外特徵顯而易見。6.1 一般 技術
本文所描述或引用的技術及程序包括熟習此項技術者一般使用習知方法很好地理解及/或通常採用的該等技術及程序，諸如Sambrook等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第3版, 2001)；Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等人編, 2003)中所描述之廣泛使用之方法。6.2 術語
除非另有描述，否則本文中使用的所有技術及科學術語具有與熟習此項技術者通常所理解相同的含義。出於解釋本說明書之目的，將應用以下術語描述，且在適當時，以單數形式使用之術語亦將包括複數形式，且反之亦然。所有專利、申請案、公開之申請案及其他出版物均以全文引用之方式併入。若所闡述的關於術語之任何描述與以引用之方式併入本文的任何文件相衝突，則以下文闡述的術語描述為準。
如本文所使用且除非另有說明，否則術語「脂質」係指一組有機化合物，其包括但不限於脂肪酸酯，且一般以難溶於水但可溶於許多非極性溶劑中為特徵。儘管脂質一般具有弱水溶性，但是某些類別之脂質(例如經極性基團改質之脂質，例如DMG-PEG2000)具有有限的水溶性且在某些條件下可溶於水。已知之脂質類型包括生物分子，諸如脂肪酸、蠟、固醇、脂溶性維生素、甘油單酸酯、甘油二酸酯、甘油三酸酯及磷脂。脂質可分為至少三類：(1)「簡單脂質」，包括脂肪及油，以及蠟；(2)「化合物脂質」，包括磷脂及醣脂(例如DMPE-PEG2000)；及(3)「衍生化脂質」，諸如類固醇。此外，如本文所使用，脂質亦包括類脂質化合物。術語「類脂質化合物」，又簡稱為「類脂質」，係指類脂質化合物(例如具有類脂質物理性質之兩親性化合物)。
術語「脂質奈米粒子」或「LNP」係指具有至少一個奈米(nm)級尺寸(例如1至1,000 nm)之粒子，其含有一或多種類型之脂質分子。本文所提供之LNP可進一步含有至少一個非脂質有效負載分子(例如一或多個核酸分子)。在一些實施例中，LNP包含部分或完全包封在脂質殼內的非脂質有效負載分子。具體言之，在一些實施例中，其中有效負載係帶負電分子(例如編碼病毒蛋白之mRNA)，且LNP之脂質組分包含至少一種陽離子脂質。不受理論束縛，經審慎考慮，陽離子脂質可與帶負電的有效負載分子相互作用，並在LNP形成期間促進有效負載併入及/或包封至LNP中。可形成如本文所提供之LNP之一部分的其他脂質包括但不限於中性脂質及帶電脂質，諸如類固醇、聚合物結合之脂質及各種兩性離子性脂質。在某些實施例中，根據本揭示案之LNP包含如本文所描述的一或多種式(I)至(IV) (及其子式)之脂質。
術語「陽離子脂質」係指在其環境之任何pH值或氫離子活性下帶正電，或能夠回應於其環境(例如其預定用途之環境)之pH值或氫離子活性而帶正電的脂質。因此，術語「陽離子」涵蓋「永久性陽離子」和「可陽離子化」。在某些實施例中，陽離子脂質中之正電荷源自四級氮原子之存在。在某些實施例中，陽離子脂質包含兩性離子性脂質，該兩性離子性脂質在其預定用途之環境中(例如在生理pH值下)帶正電荷。在某些實施例中，陽離子脂質係如本文所描述的一或多種式(I)至(IV) (及其子式)之脂質。
術語「聚合物結合之脂質」係指既包含脂質部分又包含聚合物部分的分子。聚合物結合之脂質的實例有聚乙二醇化脂質(PEG-脂質)，其中聚合物部分包含聚乙二醇。
術語「中性脂質」涵蓋在所選pH值下或在所選pH值範圍內以不帶電形式或以中性兩性離子形式存在的任何脂質分子。在一些實施例中，所選的有用pH值或範圍對應於預定脂質用途之環境中的pH條件，諸如生理pH值。作為非限制性實例，可結合本揭示案使用的中性脂質包括但不限於磷脂醯膽鹼，諸如1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)、1,2-二肉荳蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DMPC)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)；磷脂醯乙醇胺，諸如1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、磷酸氫2-((2,3-雙(油醯氧基)丙基))二甲基銨基)乙酯(DOCP)；鞘磷脂(SM)；神經醯胺；類固醇，諸如固醇及其衍生物。本文所提供之中性脂質可為合成的或衍生自天然來源或化合物(自其分離或改質)。
術語「帶電脂質」涵蓋在所選pH值下或所選pH值範圍內以帶正電或帶負電形式存在的任何脂質分子。在一些實施例中，所選pH值或範圍對應於預定脂質用途之環境中的pH條件，諸如生理pH值。作為非限制性實例，可與本揭示案結合使用之中性脂質包括但不限於磷脂醯絲胺酸、磷脂酸、磷脂醯甘油、磷脂醯肌醇、固醇半琥珀酸酯、二烷基三甲基銨-丙烷(例如DOTAP、DOTMA)、二烷基二甲基胺基丙烷、乙基磷酸膽鹼、二甲基胺基乙烷胺基甲醯基固醇(例如DC-Chol)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸-L-絲胺酸鈉鹽(DOPS-Na)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油)鈉鹽(DOPG-Na)及1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸鈉鹽(DOPA-Na)。本文所提供之帶電脂質可為合成的或衍生自天然來源或化合物(自其分離或改質)。
如本文所使用且除非另有說明，否則術語「烷基」係指僅由碳及氫原子組成的飽和直鏈或支鏈烴鏈基團。在一個實施例中，烷基具有例如一至二十四個碳原子(C1 -C24 烷基)、四至二十個碳原子(C4 -C20 烷基)、六至十六個碳原子(C6 -C16 烷基)、六至九個碳原子(C6 -C9 烷基)、一至十五個碳原子(C1 -C15 烷基)、一至十二個碳原子(C1 -C12 烷基)、一至八個碳原子(C1 -C8 烷基)或一至六個碳原子(C1 -C6 烷基)且其藉由單鍵連接至分子其餘部分。烷基之實例包括但不限於甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(異丙基)、正丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(三級丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基及類似基團。除非另有說明，否則烷基視情況經取代。
如本文所使用且除非另有說明，否則術語「烯基」係指僅由碳及氫原子組成的直鏈或支鏈烴鏈基團，其含有一或多個碳-碳雙鍵。熟習此項技術者應瞭解，術語「烯基」亦包含具有「順式 」及「反式 」構形，或者具有「E」及「Z」構形的基團。在一個實施例中，烯基具有例如二至二十四個碳原子(C2 -C24 烯基)、四至二十個碳原子(C4 -C20 烯基)、六至十六個碳原子(C6 -C16 烯基)、六至九個碳原子(C6 -C9 烯基)、二至十五個碳原子(C2 -C15 烯基)、二至十二個碳原子(C2 -C12 烯基)、二至八個碳原子(C2 -C8 烯基)或二至六個碳原子(C2 -C6 烯基)且其藉由單鍵連接至分子其餘部分。烯基之實例包括但不限於乙烯基、丙-1-烯基、丁-1-烯基、戊-1-烯基、戊-1,4-二烯基及類似基團。除非另有說明，否則烯基視情況經取代。
如本文所使用且除非另有說明，否則術語「炔基」係指僅由碳及氫原子組成的直鏈或支鏈烴鏈基團，其含有一或多個碳-碳參鍵。在一個實施例中，炔基具有例如二至二十四個碳原子(C2 -C24 炔基)、四至二十個碳原子(C4 -C20 炔基)、六至十六個碳原子(C6 -C16 炔基)、六至九個碳原子(C6 -C9 炔基)、二至十五個碳原子(C2 -C15 炔基)、二至十二個碳原子(C2 -C12 炔基)、二至八個碳原子(C2 -C8 炔基)或二至六個碳原子(C2 -C6 炔基)且其藉由單鍵連接至分子其餘部分。炔基之實例包括但不限於乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基及類似基團。除非另有說明，否則炔基視情況經取代。
如本文所使用且除非另有說明，否則術語「伸烷基」或「伸烷基鏈」係指將分子其餘部分連接至基團之直鏈或支鏈二價烴鏈，其僅由碳及氫組成且為飽和的。在一個實施例中，伸烷基具有例如一至二十四個碳原子(C1 -C24 伸烷基)、一至十五個碳原子(C1 -C15 伸烷基)、一至十二個碳原子(C1 -C12 伸烷基)、一至八個碳原子(C1 -C8 伸烷基)、一至六個碳原子(C1 -C6 伸烷基)、二至四個碳原子(C2 -C4 伸烷基)、一至二個碳原子(C1 -C2 伸烷基)。伸烷基之實例包括但不限於亞甲基、伸乙基、伸丙基、伸正丁基及類似基團。伸烷基鏈經由單鍵連接至分子其餘部分，並經由單鍵連接至基團。伸烷基鏈與分子其餘部分及與基團之連接點可經由該鏈內的一個碳或任何兩個碳進行。除非另有說明，否則伸烷基鏈視情況經取代。
如本文所使用且除非另有說明，否則術語「伸烯基」係指將分子其餘部分連接至基團之直鏈或支鏈二價烴鏈，其僅由碳及氫組成且含有一或多個碳-碳雙鍵。在一個實施例中，伸烯基具有例如二至二十四個碳原子(C2 -C24 伸烯基)、二至十五個碳原子(C2 -C15 伸烯基)、二至十二個碳原子(C2 -C12 伸烯基)、二至八個碳原子(C2 -C8 伸烯基)、二至六個碳原子(C2 -C6 伸烯基)或二至四個碳原子(C2 -C4 伸烯基)。伸烯基之實例包括但不限於伸乙烯基、伸丙烯基、伸正丁烯基及類似基團。伸烯基經由單鍵或雙鍵連接至分子其餘部分，並經由單鍵或雙鍵連接至基團。伸烯基與分子其餘部分及與基團之連接點可經由該鏈內之一個碳或任何兩個碳進行。除非另有說明，否則伸烯基視情況經取代。
如本文所使用且除非另有說明，否則術語「環烷基」係指僅由碳及氫原子組成的非芳族飽和單環或多環烴基。環烷基可包括稠合或橋連環系統。在一個實施例中，環烷基具有例如3至15個環碳原子(C3 -C15 環烷基)、3至10個環碳原子(C3 -C10 環烷基)或3至8個環碳原子(C3 -C8 環烷基)。環烷基藉由單鍵連接至分子其餘部分。單環環烷基之實例包括但不限於環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基及環辛基。多環環烷基之實例包括但不限於金剛烷基、降莰基、十氫萘基、7,7-二甲基-雙環[2.2.1]庚基及類似基團。除非另有說明，否則環烷基視情況經取代。
如本文所使用且除非另有說明，否則術語「伸環烷基」係二價環烷基。除非另有說明，否則伸環烷基視情況經取代。
如本文所使用且除非另有說明，否則術語「環烯基」係指僅由碳及氫原子組成且包括一或多個碳-碳雙鍵之非芳族單環或多環烴基。環烯基可包括稠合或橋連環系統。在一個實施例中，環烯基具有例如3至15個環碳原子(C3 -C15 環烯基)、3至10個環碳原子(C3 -C10 環烯基)或3至8個環碳原子(C3 -C8 環烯基)。環烯基藉由單鍵連接至分子其餘部分。單環環烯基之實例包括但不限於環丙烯基、環丁烯基、環戊烯基、環己烯基、環庚烯基、環辛烯基及類似基團。除非另有說明，否則環烯基視情況經取代。
如本文所使用且除非另有說明，否則術語「伸環烯基」係二價環烯基。除非另有說明，否則伸環烯基視情況經取代。
如本文所使用且除非另有說明，否則術語「雜環基」係指含有一或多個(例如一個、一個或兩個、一個至三個、或一個至四個)獨立地選自氮、氧、磷及硫之雜原子的非芳族基團單環或多環部分。該雜環基可在任何雜原子或碳原子處連接至主結構。雜環基可為單環、雙環、三環、四環或其他多環系統，其中該等多環系統可為稠合、橋連或螺環系統。雜環基多環系統可在一或多個環中包括一或多個雜原子。雜環基可為飽和或部分不飽和的。飽和雜環烷基可稱為「雜環烷基」。部分不飽和之雜環烷基在雜環基含有至少一個雙鍵時可稱為「雜環烯基」，或在雜環基含有至少一個參鍵時稱為「雜環炔基」。在一個實施例中，雜環基具有例如3至18個環原子(3至18員雜環基)、4至18個環原子(4至18員雜環基)、5至18個環原子(3至18員雜環基)、4至8個環原子(4至8員雜環基)或5至8個環原子(5至8員雜環基)。當在本文中出現時，數字範圍，諸如「3至18」係指該給定範圍中之每個整數；例如「3至18個環原子」意思指雜環基可由3個環原子、4個環原子、5個環原子、6個環原子、7個環原子、8個環原子、9個環原子、10個環原子等，至多且包括18個環原子。雜環基之實例包括但不限於咪唑基、咪唑啶基、㗁唑基、㗁唑啶基、噻唑基、噻唑啶基、吡唑啶基、吡唑基、異㗁唑啶基、異㗁唑基、異噻唑啶基、異噻唑基、𠰌啉基、吡咯基、吡咯啶基、呋喃基、四氫呋喃基、噻吩基、吡啶基、哌啶基、喹啉基及異喹啉基。除非另有說明，否則雜環基視情況經取代。
如本文所使用且除非另有說明，否則術語「伸雜環基」係二價雜環基。除非另有說明，否則伸雜環基視情況經取代。
如本文所使用且除非另有說明，否則術語「芳基」係指含有至少一個芳族烴環的單環芳族基團及/或多環單價芳族基團。在某些實施例中，芳基具有6至18個環碳原子(C6 -C18 芳基)、6至14個環碳原子(C6 -C14 芳基)或6至10個環碳原子(C6 -C10 芳基)。芳基之實例包括但不限於苯基、萘基、茀基、薁基、蒽基、菲基、芘基、聯苯基及聯三苯基。術語「芳基」亦指雙環、三環或其他多環烴環，其中至少一個環係芳族環，且其他環可為飽和、部分不飽和或芳族環，例如二氫萘基、茚基、二氫茚基或四氫萘基(tetrahydronaphthyl/tetralinyl)。除非另有說明，否則芳基視情況經取代。
如本文所使用且除非另有說明，否則術語「伸芳基」係二價芳基。除非另有說明，否則伸芳基視情況經取代。
如本文所使用且除非另有說明，否則術語「雜芳基」係指含有至少一個芳族環之單環芳族基團及/或多環芳族基團，其中至少一個芳族環含有一或多個(例如一個、一個或兩個、一個或三個、或一個或四個)獨立地選自O，S及N之雜原子。雜芳基可在任何雜原子或碳原子處連接至主結構。在某些實施例中，雜芳基具有5至20個、5至15個或5至10個環原子。術語「雜芳基」亦指雙環、三環或其他多環，其中至少一個環係芳族環，且其他環可為飽和、部分不飽和或芳族環，其中至少一個芳族環含有一或多個獨立地選自O、S及N之雜原子。單環雜芳基之實例包括但不限於吡咯基、吡唑基、吡唑啉基、咪唑基、㗁唑基、異㗁唑基、噻唑基、噻二唑基、異噻唑基、呋喃基、噻吩基、㗁二唑基、吡啶基、吡𠯤基、嘧啶基、嗒𠯤基及三𠯤基。雙環雜芳基之實例包括但不限於吲哚基、苯并噻唑基、苯并㗁唑基、苯并噻吩基、喹啉基、四氫異喹啉基、異喹啉基、苯并咪唑基、苯并哌喃基、吲哚𠯤基、苯并呋喃基、異苯并呋喃基、色酮基、香豆素基、㖕啉基、喹㗁啉基、吲唑基、嘌呤基、吡咯并吡啶基、呋喃并吡啶基、噻吩并吡啶基、二氫異吲哚基及四氫喹啉基。三環雜芳基之實例包括但不限於咔唑基、苯并吲哚基、啡啉基、吖啶基、啡啶基及二苯并哌喃基。除非另有說明，否則雜芳基視情況經取代。
如本文所使用且除非另有說明，否則術語「伸雜芳基」係二價雜芳基。除非另有說明，否則伸雜芳基視情況經取代。
當本文所描述之基團被稱為「經取代」時，其可經一或多個任何適當之取代基取代。取代基之說明性實例包括但不限於在本文所提供之示例性化合物及實施例中發現的取代基，以及：鹵素原子，諸如F、Cl、Br或I；氰基；側氧基(=O)；羥基(-OH)；烷基；烯基；炔基；環烷基；芳基；-(C=O)OR’；-O(C=O)R’；-C(=O)R’；-OR’；-S(O)x R’；-S-SR’；-C(=O)SR’；-SC(=O)R’；-NR’R’；-NR’C(=O)R’；-C(=O)NR’R’；-NR’C(=O)NR’R’；-OC(=O)NR’R’；-NR’C(=O)OR’；-NR’S(O)x NR’R’；-NR’S(O)x R'；及-S(O)x NR’R’，其中：R’在每次出現時獨立地為H、C1 -C15 烷基或環烷基，且x係0、1或2。在一些實施例中，取代基係C1 -C12 烷基。在其他實施例中，取代基係環烷基。在其他實施例中，取代基係鹵基，諸如氟基。在其他實施例中，取代基係側氧基。在其他實施例中，取代基係羥基。在其他實施例中，取代基係烷氧基(-OR’)。在其他實施例中，取代基係羧基。在其他實施例中，取代基係胺基(-NR’R’)。
如本文所使用且除非另有說明，否則術語「視情況選用之」或「視情況」(例如視情況經取代)係指隨後描述之事件或情況可能會發生或可能不會發生，且該描述包括該事件或情況發生之情形及其不發生之情形。舉例而言，「視情況經取代之烷基」係指烷基可經取代或可不經取代，且該描述包括經取代之烷基及不具有取代之烷基。
如本文所使用且除非另有說明，否則術語生物活性化合物之「前藥」係指可在生理條件下或藉由溶劑分解而轉化為生物活性化合物的化合物。在一個實施例中，術語「前藥」係指醫藥學上可接受的生物活性化合物之代謝前驅物。當將前藥投與有需要之個體時，該前藥可能為無活性的，但在活體內轉化為生物活性化合物。前藥典型地在活體內迅速轉型以產生母體生物活性化合物，例如藉由在血液中水解而轉型。前藥化合物在哺乳動物生物體中通常提供溶解性、組織相容性或延遲釋放之優點(參見Bundgard, H., Design of Prodrugs (1985), 第7-9頁, 第21-24頁 (Elsevier, Amsterdam))。關於前藥之論述提供於Higuchi, T.等人, A.C.S. Symposium Series, 第14卷；及Bioreversible Carriers in Drug Design, Edward B. Roche編輯, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987中。
在一個實施例中，術語「前藥」亦意圖包括任何共價鍵接之載劑，當將此類前藥投與哺乳動物個體時，其在活體內釋放活性化合物。化合物之前藥可藉由修飾化合物中存在之官能基來製備，其方式係使得該等修飾可在常規操作中或在活體內裂解而得到母體化合物。前藥包括羥基、胺基或巰基鍵接至任何基團之化合物，當將化合物之前藥投與哺乳動物個體時，該基團裂解而分別形成游離羥基、游離胺基或游離巰基。
前藥之實例包括但不限於本文所提供化合物中之醇的乙酸酯、甲酸酯及苯甲酸酯衍生物或胺官能基之醯胺衍生物。
如本文所使用且除非另有說明，否則術語「醫藥學上可接受之鹽」包括酸及鹼加成鹽。
醫藥學上可接受之酸加成鹽的實例包括但不限於鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及類似酸；以及有機酸，諸如但不限於乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、褐藻酸、抗壞血酸、天冬胺酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙醯胺基苯甲酸、樟腦酸、樟腦-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、檸檬酸、環拉酸(cyclamic acid)、十二烷基磺酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙烷磺酸、2-羥基乙烷磺酸、甲酸、富馬酸、半乳糖二酸、龍膽酸、葡庚糖酸、葡糖酸、葡醣醛酸，麩胺酸、戊二酸、2-側氧基戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、馬尿酸、異丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、馬來酸、蘋果酸、丙二酸、扁桃酸、甲烷磺酸、黏液酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羥基-2-萘甲酸、菸鹼酸、油酸、乳清酸、草酸、棕櫚酸、帕莫酸(pamoic acid)、丙酸、焦麩胺酸、丙酮酸、水楊酸、4-胺基水楊酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、對甲苯磺酸、三氟乙酸、十一碳烯酸及類似酸。
醫藥學上可接受之鹼加成鹽的實例包括但不限於藉由將無機鹼或有機鹼添加至游離酸化合物而製備的鹽。衍生自無機鹼之鹽包括但不限於鈉、鉀、鋰、銨、鈣、鎂、鐵、鋅、銅、錳、鋁鹽及類似鹽。在一個實施例中，無機鹽係銨鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽及鎂鹽。衍生自有機鹼之鹽包括但不限於以下之鹽：一級胺、二級胺及三級胺；經取代胺，包括天然存在之經取代胺；環胺及鹼性離子交換樹脂，諸如氨、異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇(deanol)、2-二甲基胺基乙醇、2-二乙基胺基乙醇、二環己胺、離胺酸、精胺酸、組胺酸、咖啡因(caffeine)、普魯卡因(procaine)、哈胺(hydrabamine)、膽鹼、甜菜鹼、苯乙芐胺(benethamine)、芐星(benzathine)、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可鹼(theobromine)、三乙醇胺、胺丁三醇(tromethamine)、嘌呤、哌𠯤、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺樹脂及類似物。在一個實施例中，有機鹼係異丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二環己胺、膽鹼及咖啡因。
本文所提供之化合物可含有一或多個不對稱中心且因此可產生鏡像異構物、非鏡像異構物及其他立體異構形式，該等形式可根據絕對立體化學定義為(R)-或(S)-或對於胺基酸可定義為(D)-或(L)-。除非另有說明，否則本文所提供之化合物意圖包括所有此等可能之異構物，以及其外消旋及光學純形式。光學活性(+)與(-)、(R)-與(S)-或(D)-與(L)-異構物可使用對掌性合成子或對掌性試劑製備，或使用習知技術，例如層析法及分步結晶法解析。用於製備/分離個別鏡像異構物之習知技術包括自適合的光學純前驅物對掌性合成或使用例如對掌性高壓液相層析法(HPLC)解析外消旋體(或鹽或衍生物之外消旋體)。當本文所述中化合物含有烯屬雙鍵或其他幾何不對稱中心時，且除非另有說明，否則該等化合物意欲包括E及Z幾何異構物。同樣，亦意欲包括所有互變異構形式。
如本文所使用且除非另有說明，否則術語「異構物」係指具有相同分子式之不同化合物。「立體異構物」係僅原子在空間中之排列方式不同的異構物。「阻轉異構物」係由繞單鍵之受阻旋轉得到的立體異構物。「鏡像異構物」係一對互為不可重疊之鏡像的立體異構物。一對鏡像異構物的任何比例之混合物可稱為「外消旋」混合物。「非鏡像異構物」係具有至少兩個不對稱原子但不互為鏡像的立體異構物。
「立體異構物」亦可包括E及Z異構物或其混合物，以及順式及反式異構物或其混合物。在某些實施例中，本文所述之化合物係分離為E或Z異構物。在其他實施例中，本文所述之化合物係E及Z異構物之混合物。
「互變異構物」係指彼此平衡的化合物之異構形式。異構形式之濃度將取決於發現該化合物之環境，且可取決於例如該化合物係固體抑或在有機或水溶液中而不同。
亦應注意，本文所述之化合物可在一或多個原子處含有非天然比例之原子同位素。舉例而言，化合物可用放射性同位素進行放射性標記，諸如氚(3 H)、碘-125(125 I)、硫-35(35 S)或碳-14(14 C)，或者可為同位素富集的，諸如氘(2 H)、碳-13 (13 C)或氮-15 (15 N)。如本文所使用，「同位素」係同位素富集之化合物。術語「同位素富集」係指原子之同位素組成不為該原子之天然同位素組成。「同位素富集」亦可指化合物含有的至少一個原子之同位素組成不同於該原子之天然同位素組成。術語「同位素組成」係指給定原子存在之每種同位素的量。經放射性標記且同位素富集之化合物可用作治療劑，例如癌症治療劑；研究試劑，例如結合分析試劑；及診斷劑，例如活體內成像劑。本文所述化合物之所有同位素變異體，無論是否具有放射性，皆意欲涵蓋在本文所提供之實施例的範圍內。在一些實施例中，提供本文所述化合物之同位素，例如同位素係氘、碳-13及/或氮-15富集的。如本文所使用，「氘代」係指化合物中之至少一個氫(H)已經氘(以D或2 H表示)置換，亦即，該化合物在至少一個位置處富含氘。
應注意，若所描繪之結構與該結構之名稱之間存在差異，則應以所描繪之結構為準。
如本文所使用且除非另有說明，否則術語「醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑」包括但不限於被美國食品與藥品管理局批准可接受用於人類或家畜的任何佐劑、載劑、賦形劑、助流劑、甜味劑、稀釋劑、防腐劑、染料/著色劑、風味增強劑、表面活性劑、潤濕劑、分散劑、助懸劑、穩定劑、等滲劑、溶劑或乳化劑。
術語「組成物」意欲涵蓋含有視情況之指定量的指定成分(例如本文所提供之mRNA分子)的產品。
如本文可互換使用的，術語「聚核苷酸」或「核酸」係指任何長度的核苷酸聚合物，且包括例如DNA及RNA。核苷酸可為脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基及/或其類似物，或可藉由DNA或RNA聚合酶或藉由合成反應併入聚合物中的任何受質。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。核酸可為單股或雙股形式。如本文所使用且除非另有說明，否則「核酸」亦包括核酸模擬物，諸如鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)及𠰌啉核酸(morpholinos)。如本文所使用，「寡核苷酸」係指短的合成聚核苷酸，其長度一般但未必少於約200個核苷酸。術語「寡核苷酸」與「聚核苷酸」並非互相排斥的。以上關於聚核苷酸之描述同樣且完全適用於寡核苷酸。除非另有說明，否則本文所揭示之任何單股聚核苷酸序列的左手端為5'端；雙股聚核苷酸序列之左手方向稱為5'方向。新生RNA轉錄物之5'至3'添加方向稱為轉錄方向；DNA股上具有與RNA轉錄物相同之序列且相對於RNA轉錄物之5'端而位於5'端的序列區域稱為「上游序列」；DNA股上具有與RNA轉錄物相同之序列且相對於RNA轉錄物3'端而位於3'端的序列區域稱為「下游序列」。
如本文所使用，術語「非天然存在」當用於本文所描述之核酸分子時，意欲意謂該核酸分子在自然界中不存在。編碼病毒肽或蛋白質的非天然存在之核酸含有至少一個通常在該病毒的天然存在之病毒株(包括該病毒之野生型病毒株)中未發現的基因改變或化學修飾。基因改變包括例如引入編碼病毒異源肽或多肽之可表現核酸序列的修飾、其他核酸添加、核酸缺失、核酸取代及/或病毒遺傳物質之其他功能破壞。此類修飾包括例如對於病毒物種之異源、同源或異源及同源多肽之編碼區及其功能片段的修飾。額外修飾包括例如非編碼調控區中之修飾，其中該等修飾改變基因或操縱子之表現。額外修飾還包括例如將核酸序列併入載體中，諸如併入質體或人工染色體中。化學修飾包括例如本文所述之一或多種功能性核苷酸類似物。
「分離之核酸」係指與天然地伴隨天然序列之其他基因體DNA序列以及蛋白質或複合物(諸如核糖體及聚合酶)實質上分離的核酸，例如RNA、DNA或混合核酸。「分離」之核酸分子係與存在於核酸分子之天然來源中的其他核酸分子分離的核酸分子。此外，當藉由重組技術製造時，「分離」之核酸分子，諸如mRNA分子，可實質上不含其他細胞材料或培養基，或者當化學合成時，其可實質上不含化學前驅物或其他化學品。在一個特定實施例中，編碼本文所述抗原之一或多個核酸分子係分離或純化的。該術語包括已自其天然存在之環境移除之核酸序列，且包括重組或選殖之DNA或RNA分離物以及化學合成之類似物或由異源系統生物合成之類似物。實質上純的分子可包括該分子之經分離形式。
術語「編碼核酸」或其語法等效物當用於核酸分子時包括(a)處於天然狀態或藉由熟習此項技術者熟知之方法操作時可轉錄產生mRNA且接著轉譯成肽及/或多肽的核酸分子；及(b) mRNA分子本身。反義股係此類核酸分子之補體，且可由其推斷出編碼序列。術語「編碼區」係指編碼核酸序列中轉譯成肽或多肽之部分。術語「非轉譯區」或「UTR」係指編碼核酸中不轉譯成肽或多肽之部分。取決於UTR相對於核酸分子之編碼區的取向，UTR若位於編碼區5'端，則稱為5'-UTR，且UTR若位於編碼區3'端，則稱為3'-UTR。
如本文所使用，術語「mRNA」係指包含一或多個開放閱讀框(ORF)之信使RNA分子，其可經細胞或生物體轉譯，只要該mRNA產生一或多種肽或蛋白質產物即可。含有一或多個ORF之區域稱為mRNA分子之編碼區。在某些實施例中，mRNA分子進一步包含一或多個非轉譯區(UTR)。
在某些實施例中，mRNA係僅包含一個ORF的單順反子mRNA。在某些實施例中，單順反子mRNA編碼包含選定抗原(例如致病性抗原或腫瘤相關抗原)之至少一個抗原決定基的肽或蛋白質。在其他實施例中，mRNA係包含兩個或更多個ORF之多順反子mRNA。在某些實施例中，多順反子mRNA編碼彼此相同或不同的兩種或更多種肽或蛋白質。在某些實施例中，由多順反子mRNA編碼之每種肽或蛋白質包含選定抗原之至少一個抗原決定基。在某些實施例中，由多順反子mRNA編碼的不同肽或蛋白質各自包含不同抗原之至少一個抗原決定基。在本文所述實施例中之任一個中，該至少一個抗原決定基可為抗原之至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或至少10個抗原決定基。
術語「核鹼基」涵蓋嘌呤及嘧啶，包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷及其天然或合成類似物或衍生物。
如本文所使用，術語「功能性核苷酸類似物」係指經典核苷酸A、G、C、U或T之經修飾型式，該型式(a)保留相應經典核苷酸之鹼基配對特性，且(b)含有至少一種對相應天然核苷酸之(i)核鹼基、(ii)糖基、(iii)磷酸酯基或(iv) (i)至(iii)之任何組合的化學修飾。如本文所使用，鹼基配對不僅涵蓋經典沃森-克里克(Watson-Crick)腺嘌呤-胸腺嘧啶、腺嘌呤-尿嘧啶或鳥嘌呤-胞嘧啶鹼基對，而且亦涵蓋在經典核苷酸與功能性核苷酸類似物之間或在一對功能性核苷酸類似物之間形成的鹼基對，其中氫鍵供體與氫鍵受體之佈置允許在經修飾之核鹼基與經典核鹼基之間或在兩個互補的經修飾核鹼基結構之間形成氫鍵。舉例而言，鳥苷(G)之功能性類似物保留與胞嘧啶(C)或胞嘧啶之功能性類似物鹼基配對的能力。此類非經典鹼基配對的一個實例係經修飾核苷酸肌苷與腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之間的鹼基配對。如本文所述，功能性核苷酸類似物可為天然存在或非天然存在的。因此，含有功能性核苷酸類似物之核酸分子可具有至少一個經修飾之核鹼基、糖基及/或核苷間鍵聯。本文提供對核酸分子之核鹼基、糖基或核苷間鍵聯之示例性化學修飾。
如本文所使用，術語「轉譯強化子元件」、「TEE」及「轉譯強化子」係指核酸分子中用於促進核酸之編碼序列轉譯成蛋白質或肽產物，諸如經由戴帽依賴性或不依賴於戴帽之轉譯而轉譯成蛋白質或肽產物的區域。TEE典型地位於核酸分子(例如mRNA)之UTR區，並增強位於上游或下游之編碼序列的轉譯水準。舉例而言，核酸分子之5'-UTR中的TEE可位於核酸分子之啟動子與起始密碼子之間。各種TEE序列係此項技術中已知的(Wellensiek等人, Genome-wide profiling of human cap-independent translation-enhancing elements,Nature Methods , 2013年8月; 10(8): 747–750；Chappell等人, PNAS, 2004年6月29日, 101 (26) 9590-9594)。已知一些TEE在多個物種中係保守的(Páneket等人, Nucleic Acids Research, 第41卷, 第16期, 2013年9月1日, 第7625–7634頁)。
如本文所使用，術語「莖-環序列」係指具有至少兩個區域之單股聚核苷酸序列，當以相反方向閱讀時，該兩個區域彼此互補或實質上互補，且因此能夠彼此鹼基配對形成至少一個雙螺旋及一個未配對之環。由此得到的結構稱為莖-環結構、髮夾或髮夾環，此係在許多RNA分子中發現之二級結構。
如本文所使用，術語「肽」係指含有二至五十(2-50)個經一或多個共價肽鍵連接之胺基酸殘基的聚合物。該等術語適用於天然存在之胺基酸聚合物以及一或多個胺基酸殘基係非天然存在之胺基酸(例如胺基酸類似物或非天然胺基酸)之胺基酸聚合物。
術語「多肽」與「蛋白質」在本文中可互換使用，指具有超過五十(50)個由共價肽鍵連接之胺基酸殘基的聚合物。亦即，針對多肽之描述同樣適用於針對蛋白質之描述，且反之亦然。該等術語適用於天然存在之胺基酸聚合物以及一或多個胺基酸殘基係非天然存在之胺基酸(例如胺基酸類似物)之胺基酸聚合物。如本文所使用，該等術語涵蓋任何長度之胺基酸鏈，包括全長蛋白質(例如抗原)。
在肽或多肽之情形中，本文所使用之術語「衍生物」係指包含已藉由引入胺基酸殘基取代、缺失或添加而改變的病毒肽或蛋白質之胺基酸序列或病毒肽或蛋白質之片段的肽或多肽。如本文所使用，術語「衍生物」亦指已例如藉由將任何類型之分子共價連接至多肽進行化學修飾的病毒肽或蛋白質，或病毒肽或蛋白質之片段。舉例而言但不限於，病毒肽或蛋白質、或該病毒肽或蛋白質之片段可經化學修飾，例如藉由糖基化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、經已知保護基團/封端基團衍生化、蛋白水解裂解、化學裂解、調配、衣黴素(tunicamycin)之代謝合成、與細胞配體或其他蛋白質連接等進行化學修飾。該等衍生物在連接分子之類型或在位置上係以與天然存在或起始之肽或多肽不同的方式修飾。衍生物進一步包括缺失病毒肽或蛋白質上天然存在之一或多個化學基團。此外，病毒肽或蛋白質、或病毒肽或蛋白質之片段的衍生物可含有一或多個非經典胺基酸。在特定實施例中，衍生物係作為其來源之天然或未修飾之肽或多肽的功能性衍生物。
術語「功能性衍生物」係指保留作為其來源的天然存在或起始之肽或多肽之一或多種功能或活性的衍生物。舉例而言，冠狀病毒S蛋白之功能性衍生物可保留結合宿主細胞上其一或多個受體之能力。舉例而言，冠狀病毒N蛋白之功能性衍生物可保留結合RNA或包裝病毒基因體之能力。
術語「一致性」係指藉由對準並比較序列而確定的兩個或更多個多肽分子或者兩個或更多個核酸分子之序列之間的關係。相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對序列且必要時引入空位以達成最大序列一致性百分比之後，且在不考慮任何保守取代作為序列一致性之一部分的情況下，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基相同的胺基酸殘基之百分比。用於確定胺基酸序列一致性百分比之比對可藉由在此項技術之技能範圍內的各種方式實現，例如使用公開可用之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN (DNAStar, Inc.)軟體實現。熟習此項技術者可確定用於比對序列之適合參數，包括在所比較序列之全長內實現最大比對所需的任何演算法。
胺基酸殘基/位置之「修飾」係指一級胺基酸序列相較於起始胺基酸序列之變化，其中該變化係由涉及該胺基酸殘基/位置之序列改變引起的。舉例而言，典型修飾包括用另一個胺基酸取代該殘基(例如保守或非保守取代)、在該殘基/位置附近插入一或多個(例如一般少於5、4或3個)胺基酸及/或缺失該殘基/位置。
在肽或多肽之情形中，如本文所使用，術語「片段」係指包含少於全長之胺基酸序列的肽或多肽。此類片段可例如來自於胺基末端之截短、羧基末端之截短及/或胺基酸序列中殘基之內部缺失。片段可例如由替代性RNA剪接或由活體內蛋白酶活性產生。在某些實施例中，片段係指包括含多肽之胺基酸序列的至少5個連續胺基酸殘基、至少10個連續胺基酸殘基、至少15個連續胺基酸殘基、至少20個連續胺基酸殘基、至少25個連續胺基酸殘基、至少30個連續胺基酸殘基、至少40個連續胺基酸殘基、至少50個連續胺基酸殘基、至少60個連續胺基酸殘基、至少70個連續胺基酸殘基、至少80個連續胺基酸殘基、至少90個連續胺基酸殘基、至少連續100個胺基酸殘基、至少125個連續胺基酸殘基、至少150個連續胺基酸殘基、至少175個連續胺基酸殘基、至少200個連續胺基酸殘基、至少250個、至少300個、至少350個、至少400個、至少450個、至少500個、至少550個、至少600個、至少650個、至少700個、至少750個、至少800個、至少850個、至少900個或至少950個連續胺基酸殘基之胺基酸序列的多肽。在一個特定實施例中，多肽之片段保留該多肽之至少1種、至少2種、至少3種或更多種功能。
如本文在肽或多肽(例如蛋白質)之上下文中所使用，術語「免疫原性片段」係指在與哺乳動物之免疫系統接觸時，保留肽或多肽引起免疫反應，包括引起先天免疫反應及/或適應性免疫反應之能力的肽或多肽之片段。在一些實施例中，肽或多肽之免疫原性片段可為抗原決定基。
術語「抗原」係指能夠被個體之免疫系統(包括適應性免疫系統)識別的物質，且在個體與該抗原接觸之後能夠觸發免疫反應(包括抗原特異性免疫反應)。在某些實施例中，抗原係與患病細胞，諸如與感染病原體之細胞或贅生性細胞相關的蛋白質(例如腫瘤相關抗原(TAA))。
「抗原決定基」係抗原分子表面上與單個抗體分子結合之位點，諸如抗原表面上能夠結合至抗體之一或多個抗原結合區的局部區域，且其在動物體內，諸如在哺乳動物體內(例如人體內)具有抗原或免疫原性活性，能夠引起免疫反應。具有免疫原性活性之抗原決定基係在動物體內引起抗體反應的多肽之一部分。具有抗原活性之抗原決定基係藉由此項技術中熟知之任何方法，包括例如藉由免疫分析確定的抗體所結合之多肽之一部分。抗原性抗原決定基未必具有免疫原性。抗原決定基通常由分子之化學活性表面基團，諸如胺基酸或糖側鏈組成，並具有特定三維結構特徵以及特定的電荷特徵。抗體抗原決定基可為線性抗原決定基或構象抗原決定基。線性抗原決定基係由蛋白質中之連續胺基酸序列形成的。構象抗原決定基係由在蛋白質序列中不連續但在蛋白質摺疊成其三維結構時結合在一起之胺基酸形成。當蛋白質之三維結構呈改變之構象時，諸如在另一種蛋白質或配體活化或結合之後，形成誘導性抗原決定基。在某些實施例中，抗原決定基係多肽之三維表面特徵。在其他實施例中，抗原決定基係多肽之線性特徵。一般而言，抗原具有若干或許多不同的抗原決定基，且可與許多不同的抗體反應。
術語「嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2」或「SARS-CoV-2」或「2019-nCoV」在本文中可互換使用，係指引起感染性疾病大流行之冠狀病毒，該疾病之首例病例係在2019年於中國武漢市發現。GenBank™寄存編號MN908947提供SARS-CoV-2之示例性基因體序列(SEQ ID NO: 1)。
術語「異源」係指在自然界中未發現與天然存在之冠狀病毒相關(例如由該冠狀病毒之基因體編碼及/或由其表現)的實體。術語「同源」係指在自然界中發現與天然存在之冠狀病毒相關(例如由該冠狀病毒之基因體編碼及/或由其表現)的實體。
如本文所使用，術語「基因疫苗」係指包含至少一個核酸分子之治療性或預防性組成物，該至少一個核酸分子編碼與目標疾病(例如感染性疾病或贅生性疾病)相關之抗原。向個體投與疫苗(「疫苗接種」)允許產生編碼之肽或蛋白質，由此在個體體內引起針對目標疾病之免疫反應。在某些實施例中，免疫反應包含適應性免疫反應，諸如產生針對編碼之抗原的抗體，及/或能夠特異性消除表現該抗原之患病細胞之免疫細胞的活化及增殖。在某些實施例中，免疫反應進一步包含先天免疫反應。根據本揭示案，疫苗可在目標疾病之臨床症狀發作之前或之後投與個體。在一些實施例中，對健康或無症狀個體進行疫苗接種使經疫苗接種之個體對目標疾病之發展具有免疫性或不太敏感。在一些實施例中，對顯示疾病症狀之個體進行疫苗接種將改善經疫苗接種之個體的疾病狀況或治療該疾病。
術語「載體」係指這樣一種物質，該物質用於載運或包括核酸序列，以便將核酸序列引入宿主細胞中，或用作轉錄模板以在無細胞系統中進行活體外轉錄反應而產生mRNA，該核酸序列包括例如編碼如本文所述之病毒肽或蛋白質的核酸序列。適用的載體包括例如表現載體、質體、噬菌體載體、病毒載體、游離基因體及人工染色體，其可包括可用於穩定整合入宿主細胞之染色體中的選擇序列或標記物。另外，載體可包括一或多個選擇性標記物基因及適當的轉錄或轉譯控制序列。可包括之選擇性標記物基因例如提供對抗生素或毒素之抗性、補充營養缺陷或提供培養基中沒有的關鍵養分。轉錄或轉譯控制序列可包括此項技術中熟知之組成型及誘導型啟動子、轉錄強化子、轉錄終止子及類似序列。當意圖共轉錄或共轉譯兩個或更多個核酸分子(例如編碼兩種或更多種不同病毒肽或蛋白質之核酸分子)時，可將兩個核酸分子例如插入單一表現載體或分開之表現載體中。對於單載體轉錄及/或轉譯，可將編碼核酸可操作地連接至一個共同的轉錄或轉譯控制序列或連接至不同的轉錄或轉譯控制序列，諸如一個誘導型啟動子及一個組成型啟動子。將核酸分子引入宿主細胞可使用此項技術熟知之方法確認。此類方法包括例如核酸分析，諸如關於mRNA之北方墨點法(Northern blots)或聚合酶鏈反應(PCR)擴增、關於基因產物表現之免疫墨點法，或其他適合的測試所引入之核酸序列或其相應基因產物之表現的分析方法。熟習此項技術者應理解，核酸分子係以足量表現以產生所希望之產物(例如本文所述之核酸之mRNA轉錄物)，且還應理解，表現量可使用此項技術中熟知之方法優化以獲得充分表現。
術語「先天免疫反應」及「先天免疫」係此項技術中公認的，且係指身體之免疫系統在識別出病原體相關分子模式時啟動的非特異性防禦機制，其涉及不同形式之細胞活動，包括經由各種路徑的細胞介素產生及細胞死亡。如本文所使用，先天免疫反應包括但不限於炎症細胞介素之產生(例如I型干擾素或IL-10產生)增加；NFκB路徑之活化；免疫細胞之增殖、成熟、分化及/或存活增加，以及在某些情況下細胞凋亡之誘導。先天免疫之活化可使用此項技術中已知之方法偵測，諸如量測(NF)-κB活化情況。
術語「適應性免疫反應」及「適應性免疫」係此項技術中公認的，且係指身體之免疫系統在識別出特定抗原時啟動的抗原特異性防禦機制，包括體液反應及細胞介導之反應。如本文所使用，適應性免疫反應包括由疫苗組成物，諸如本文所述之遺傳組成物觸發及/或增強的細胞反應。在一些實施例中，疫苗組成物包含作為抗原特異性適應性免疫反應之目標的抗原。在其他實施例中，疫苗組成物在投與後允許在經免疫接種之個體中產生抗原，該抗原係抗原特異性適應性免疫反應之目標。適應性免疫反應之活化可使用此項技術中已知之方法偵測，諸如量測抗原特異性抗體之產生或抗原特異性細胞介導之細胞毒性水準。
「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或「ADCC」係指細胞毒性之一種形式，其中分泌之免疫球蛋白結合至某些細胞毒性細胞(例如自然殺手(NK)細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞)上存在之Fc受體(FcR)上使此等細胞毒性效應細胞能夠特異性結合至帶有抗原之目標細胞，且隨後用細胞毒素殺死目標細胞。抗體「武裝」細胞毒性細胞且係此類殺死特別需要的。NK細胞作為介導ADCC之主要細胞，僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。已知FcR在造血細胞上表現(參見例如Ravetch及Kinet, 1991, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92)。為了評估感興趣分子之ADCC活性，可執行活體外ADCC分析(參見例如美國專利第5,500,362號及第5,821,337號)。用於此類分析之有用效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。替代地或另外地，可例如在動物模型中，在活體內評估感興趣分子之ADCC活性(參見例如Clynes等人, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-56)。可選擇使用具有極低或沒有ADCC活性之抗體。
「抗體依賴性細胞吞噬作用」或「ADCP」係指當免疫球蛋白結合至某些吞噬細胞(例如嗜中性白血球、單核球及巨噬細胞)上存在之Fc受體(FcR)上使得此等吞噬細胞特異性結合至帶有抗原之目標細胞時，經由單核球或巨噬細胞介導之吞噬作用破壞目標細胞，且隨後殺死目標細胞。為了評估感興趣分子之ADCP活性，可執行活體外ADCP分析(參見例如Bracher等人 , 2007, J. Immunol. Methods 323:160-71)。用於此類分析之有用吞噬細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)、自PBMC純化之單核球或分化為單核類型之U937細胞。替代地或另外地，可例如在動物模型中，在活體內評估感興趣分子之ADCP活性(參見例如Wallace等人 , 2001, J. Immunol. Methods 248:167-82)。可選擇使用具有極低或沒有ADCP活性之抗體。
「Fc受體」或「FcR」描述結合至抗體Fc區的受體。示例性FcR係天然序列人FcR。此外，示例性FcR係結合IgG抗體(例如γ受體)之FcR，且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII亞類之受體，包括此等受體之對偶基因變異體及替代性剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA(「活化受體」)及FcγRIIB(「抑制受體」)，其具有類似的胺基酸序列，其主要區別在於其胞質結構域(參見例如Daëron, 1997, Annu. Rev. Immunol. 15:203-34)。已知多種FcR(參見例如Ravetch及Kinet, 1991, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92；Capel等人 , 1994, Immunomethods 4:25-34；及de Haas等人 , 1995, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41)。術語「FcR」在本文中涵蓋其他FcR，包括將來會鑑別之該等FcR。該術語亦包括新生兒受體FcRn，該受體負責將母體IgG轉移至胎兒(參見例如Guyer等人 , 1976, J. Immunol. 117:587-93；及Kim等人 , 1994, Eu. J. Immunol. 24:2429-34)。已描述與FcR之結合改善或減少的抗體變異體(參見例如WO 2000/42072；美國專利第7,183,387號、第7,332,581號及第7.335,742號；Shields等人 , 2001, J. Biol. Chem. 9(2):6591-604)。
「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指在補體存在下目標細胞之溶解。經典補體途徑之活化係由補體系統之第一組分(C1q)與結合至同源抗原之抗體(適當亞類之抗體)結合而起始。為了評估補體活化，可執行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人 , 1996, J. Immunol. Methods 202:163)。已經描述具有改變之Fc區胺基酸序列(具有變異Fc區之多肽)且C1q結合能力增加或降低的多肽變異體(參見例如美國專利第6,194,551號；WO 1999/51642；Idusogie等人 , 2000, J. Immunol. 164: 4178-84)。可選擇使用具有極低或沒有CDC活性之抗體。
術語「抗體」意欲包括在免疫球蛋白類多肽範圍內的B細胞之多肽產物，其能夠與特定分子抗原結合並由兩對相同的多肽鏈構成，其中每一對具有一條重鏈(約50-70 kDa)及一條輕鏈(約25 kDa)，每條鏈之每個胺基末端部分包括含約100至約130個或更多個胺基酸之可變區，且每條鏈之每個羧基末端部分包括一個恆定區。參見例如Antibody Engineering (Borrebaeck編, 第2版, 1995)；及Kuby,Immunology (第3版, 1997)。在特定實施例中，特定分子抗原可由本文所提供之抗體結合，包括多肽、其片段或抗原決定基。抗體亦包括但不限於合成抗體、重組產生之抗體、駱駝化抗體、內抗體、抗獨特型(抗Id)抗體及以上任一種之功能片段，功能片段係指抗體重鏈或輕鏈多肽的保留作為該片段來源之抗體之部分或全部結合活性的一部分。功能片段之非限制性實例包括單鏈Fv (scFv) (例如包括單特異性、雙特異性等)、Fab片段、F(ab')片段、F(ab)2 片段、F(ab')2 片段、二硫鍵連接之Fv (dsFv)、Fd片段、Fv片段、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體及微型抗體。具體言之，本文所提供之抗體包括免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分，例如抗原結合結構域或含有抗原結合位點之分子(例如抗體之一或多個CDR)。此類抗體片段可見於例如Harlow及Lane,Antibodies: A Laboratory Manual (1989)；Mol. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers編, 1995)；Huston等人 , 1993, Cell Biophysics 22:189-224；Plückthun及Skerra, 1989, Meth. Enzymol. 178:497-515；及Day,Advanced Immunochemistry (第2版, 1990)。本文所提供之抗體可為免疫球蛋白分子之任何類別(例如IgG、IgE、IgM、IgD及IgA)或任何亞類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。
術語「投與(administer/administration)」係指將存在於體外之物質(例如本文所述之脂質奈米粒子組成物)注射或另外以物理方式遞送至患者體內的操作，諸如經黏膜、真皮內、靜脈內、肌肉內遞送及/或本文所描述或此項技術中已知的任何其他物理遞送方法遞送。當治療疾病、病症、疾患或其症狀時，典型地在該疾病、病症、疾患或其症狀發作之後進行該物質之投與。當預防疾病、病症、疾患或其症狀時，典型地在該疾病、病症、疾患或其症狀發作之前進行該物質之投與。
「長期」投與係與急性模式相對，係指以連續模式投與一或多劑(例如持續一段時間，諸如數天、數週、數月或數年)，由此在一段較長時間內維持初始治療效果(活性)。「間歇性」投與係並非連續而無中斷地進行的治療，其本質上係週期性的。
如本文所使用，術語「靶向遞送」或動詞形式「靶向」係指相較於遞送至任何其他器官、組織、細胞或細胞內隔室(稱為非目標位置)，促進所遞送之劑(諸如本文所述之脂質奈米粒子組成物中的治療有效負載分子)到達特定器官、組織、細胞及/或細胞內隔室(稱為目標位置)的過程。靶向遞送可使用此項技術中已知之方法偵測，例如藉由將所遞送之劑在目標細胞群體中之濃度與在全身投與後該所遞送之劑在非目標細胞群體處之濃度相比較來偵測。在某些實施例中，靶向遞送使得在目標位置處之濃度比非目標位置之濃度高至少2倍。
「有效量」一般係足以降低症狀之嚴重程度及/或頻率；消除症狀及/或潛在原因；防止症狀及/或其潛在原因之發生；及/或改善或補救由疾病、病症或疾患，包括例如由感染及贅瘤形成引起或與之相關之損害的量。在一些實施例中，有效量係治療有效量或預防有效量。
如本文所使用，術語「治療有效量」係指足以減少及/或改善給定疾病、病症或疾患，及/或其相關症狀(例如感染性疾病，諸如由病毒感染引起之感染性疾病，或贅生性疾病，諸如癌症)之嚴重程度及/或持續時間的劑(例如疫苗組成物)的量。本揭示案之物質/分子/劑(例如本文所述之脂質奈米粒子組成物)的「治療有效量」可根據諸多因素而變化，諸如個體之疾病狀態、年齡、性別及體重，以及該物質/分子/劑在個體體內引起所希望反應的能力。治療有效量包含該物質/分子/劑之治療有益作用勝過其任何有毒或有害作用的量。在某些實施例中，術語「治療有效量」係指有效「治療」個體或哺乳動物之疾病、病症或疾患的如本文所述之脂質奈米粒子組成物或其中所含治療劑或預防劑(例如治療性mRNA)的量。
「預防有效量」係當投與個體時將具有預期預防作用，例如預防疾病、病症、疾患或相關症狀(例如感染性疾病，諸如由病毒感染引起之感染性疾病，或贅生性疾病，諸如癌症)、延遲其發作(或復發)或降低其發作(或復發)可能性的醫藥組成物之量。典型地但非必須的，由於預防劑量係在疾病、病症或疾患之前或其早期階段用於個體，故預防有效量可能小於治療有效量。完全的治療或預防作用未必藉由投與一次劑量而發生，而可能僅在投與一系列劑量後才發生。因此，治療或預防有效量可分一或多次投與來投與。
術語「預防(prevent/preventing/prevention)」係指降低疾病、病症、疾患或相關症狀(例如感染性疾病，諸如由病毒感染引起之感染性疾病，或贅生性疾病，諸如癌症)發作(或復發)的可能性。
術語「管理(manage/managing/management)」係指個體自療法(例如預防劑或治療劑)獲得的有益作用，其不會引起疾病之治癒。在某些實施例中，向個體投與一或多種療法(例如預防劑或治療劑，諸如本文所述之脂質奈米粒子組成物)以「管理」感染性或贅生性疾病、其一或多種症狀，由此預防疾病之進展或惡化。
術語「預防劑」係指可以完全或部分地抑制個體之疾病及/或其相關症狀之發展、復發、發作或擴散的任何劑。
術語「治療劑」係指可用於治療、預防或減輕疾病、病症或疾患，包括用於治療、預防或減輕疾病、病症或疾患及/或其相關症狀之一或多種症狀的任何劑。
術語「療法」係指可用於預防、管理、治療及/或改善疾病、病症或疾患的任何方案、方法及/或劑。在某些實施例中，術語「療法」係指熟習此項技術者，諸如醫務人員已知可用於預防、管理、治療及/或改善疾病、病症或疾患之生物療法、支持療法及/或其他療法。
如本文所使用，「預防有效血清力價」係個體(例如人類)體內完全或部分地抑制該個體之疾病、病症或疾患，及/或其相關症狀之發展、復發、發作或擴散的抗體之血清力價。
在某些實施例中，「治療有效血清力價」係個體(例如人類)體內降低該個體的疾病、病症或疾患的嚴重程度、持續時間及/或其相關症狀的抗體之血清力價。
術語「血清力價」係指一名個體中來自多個樣品(例如在多個時間點)或在至少10名、至少20名、至少40名至約100名、1000名或更多個體之群體中的平均血清力價。
術語「副作用」涵蓋療法(例如預防劑或治療劑)的不想要及/或不良作用。不想要之作用未必為不良的。療法(例如預防劑或治療劑)之不良作用可能為有害的、令人不適的或有風險的。副作用之實例包括腹瀉、咳嗽、腸胃炎、喘鳴、噁心、嘔吐、厭食、腹部絞痛、發燒、疼痛、體重減輕、脫水、脫髮、呼吸困難、失眠、頭暈、黏膜炎、神經及肌肉影響、疲勞、口乾、食慾不振、投與部位出現皮疹或腫脹、諸如發燒、發冷及疲勞之類的類似流感之症狀、消化道問題及過敏反應。患者經歷之其他不期望的作用眾多且為此項技術中所知的。有許多作用描述於Physician’s Desk Reference (第68版, 2014)中。
術語「個體」與「患者」可互換使用。如本文所使用，在某些實施例中，個體係哺乳動物，諸如非靈長類動物(例如牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等)或靈長類動物(例如猴及人類)。在特定實施例中，個體係人類。在一個實施例中，個體係患有感染性疾病或贅生性疾病之哺乳動物(例如人類)。在另一個實施例中，個體係有發展感染性疾病或贅生性疾病之風險的哺乳動物(例如人類)。
術語「老年人」係指65歲或以上的人。術語「成人」係指18歲或以上的人。術語「兒童」係指1歲至18歲的人。術語「幼童」係指1歲至3歲的人。術語「嬰兒」係指新生兒至1歲的人。
術語「可偵測探針」係指提供可偵測信號之組成物。該術語包括但不限於經由活性提供可偵測信號的任何螢光團、發色團、放射性標記、酶、抗體或抗體片段及類似物。
術語「可偵測劑」係指可用於確定樣品或個體中所希望分子，諸如由本文所述之mRNA分子編碼之抗原之持續存在或存在的物質。可偵測劑可為能夠被目測之物質或者能夠以其他方式確定及/或量測(例如藉由定量)之物質。
「實質上全部」係指至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或約100%。
如本文所使用且除非另有說明，否則術語「約」或「大約」意思指普通熟習此項技術者所測定之特定值的可接受之誤差，其部分取決於量測或測定該值之方式。在某些實施例中，術語「約」或「大約」意思指在1、2、3或4個標準差範圍內。在某些實施例中，術語「約」及「大約」意思指在給定值或範圍之20%之內、15%之內、10%之內、9%之內、8%之內、7%之內、6%之內、5%之內、4%之內、3%之內、2%之內、1%之內、0.5%之內、0.05%之內或更低。
除非上下文另外明確指出，否則本文所使用之單數形式術語「一個(種) (a/an)」及「該」包括複數個(種)參考物。
本說明書中引用之所有出版物、專利申請案、寄存編號及其他參考文獻皆以全文引用之方式併入本文，其引用程度就如同特定且單獨地指示每一個別出版物或專利申請案係以引用之方式併入一般。本文所論述之出版物僅僅提供在本申請案之申請日之前的揭示內容。本文中任何內容均不應解釋為承認本發明無權憑藉在先發明而早於此類出版物。此外，提供的公開日期可能與實際公開日期有所不同，實際公開日期可能需要獨立確認。
已經描述本發明之多個實施例。然而，應理解，在不脫離本發明之精神及範圍的情況下，可進行各種修改。因此，實驗部分及實例中的描述旨在說明而非限制申請專利範圍中所描述的發明範圍。6.3 治療性核酸
在一個態樣中，本文提供用於管理、預防及治療冠狀病毒感染之治療性核酸分子。在一些實施例中，該治療性核酸編碼肽或多肽，其在投與有需要之個體後，由該個體體內之細胞表現以產生編碼之肽或多肽。在一些實施例中，該治療性核酸分子係DNA分子。在一些實施例中，該治療性核酸分子係RNA分子。在一些實施例中，該治療性核酸分子係mRNA分子。
在一些實施例中，該治療性核酸分子係調配於疫苗組成物中。在一些實施例中，該疫苗組成物係本文所述之基因疫苗。在一些實施例中，該疫苗組成物包含本文所述之mRNA分子。
在一些實施例中，本揭示案之mRNA分子編碼感興趣肽或多肽，包括任何天然或非天然存在的或以其他方式修飾的多肽。由mRNA編碼之肽或多肽可具有任何大小，且可具有任何二級結構或活性。在一些實施例中，當在細胞中表現時，由mRNA有效負載編碼之多肽可具有治療作用。
在一些實施例中，本揭示案之mRNA分子包含至少一個編碼感興趣肽或多肽(例如開放閱讀框(ORF))之編碼區。在一些實施例中，核酸分子還包含至少一個非轉譯區(UTR)。在特定實施例中，非轉譯區(UTR)位於編碼區之上游(5'端)，且在本文中稱為5'-UTR。在特定實施例中，非轉譯區(UTR)位於編碼區之下游(3'端)，且在本文中稱為3'-UTR。在特定實施例中，核酸分子同時包含5'-UTR及3'-UTR。在一些實施例中，5'-UTR包含5'-帽結構。在一些實施例中，核酸分子包含Kozak序列(例如在5'-UTR中)。在一些實施例中，核酸分子包含聚A區(例如在3'-UTR中)。在一些實施例中，核酸分子包含聚腺苷酸化信號(例如在3'-UTR中)。在一些實施例中，核酸分子包含穩定區(例如在3'-UTR中)。在一些實施例中，核酸分子包含二級結構。在一些實施例中，二級結構係莖-環。在一些實施例中，核酸分子包含莖-環序列(例如在5'-UTR及/或3'-UTR中)。在一些實施例中，核酸分子包含一或多個能夠在剪接過程中切除的內含子區。在一個特定實施例中，核酸分子包含一或多個選自5'-UTR及編碼區之區域。在一個特定實施例中，核酸分子包含一或多個選自編碼區及3'-UTR之區域。在一個特定實施例中，核酸分子包含一或多個選自5'-UTR、編碼區及3’-UTR之區域。6.3.1 編碼區
在一些實施例中，本揭示案之核酸分子包含至少一個編碼區。在一些實施例中，編碼區係編碼單個肽或蛋白質之開放閱讀框(ORF)。在一些實施例中，編碼區包含至少兩個ORF，每個ORF編碼一種肽或蛋白質。在編碼區包含多於一個ORF之實施例中，編碼之肽及/或蛋白質可彼此相同或不同。在一些實施例中，編碼區中之多個ORF經非編碼序列隔開。在特定實施例中，隔開兩個ORF之非編碼序列包含內部核糖體進入位點(IRES)。
不受理論束縛，經審慎考慮，內部核糖體進入位點(IRES)可用作唯一的核糖體結合位點，或充當mRNA之多個核糖體結合位點之一。包含多於一個功能性核糖體結合位點的mRNA分子可編碼若干肽或蛋白質，該等肽或蛋白質獨立地由核糖體轉譯(例如多順反子mRNA)。因此，在一些實施例中，本揭示案之核酸分子(例如mRNA)包含一或多個內部核糖體進入位點(IRES)。可以與本揭示案結合使用之IRES序列的實例包括但不限於來自小RNA病毒(例如FMDV)、害蟲病毒(CFFV)、脊髓灰質炎病毒(PV)、腦心肌炎病毒(ECMV)、口蹄疫病毒(FMDV)、C型肝炎病毒(HCV)、豬瘟病毒(CSFV)、鼠白血病病毒(MLV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)或蟋蟀麻痺病毒(CrPV)。
在各個實施例中，本揭示案之核酸分子編碼至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種或更多種肽或蛋白質。核酸分子編碼之肽及蛋白質可相同或不同。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子編碼二肽(例如肌肽及鵝肌肽)。在一些實施例中，核酸分子編碼三肽。在一些實施例中，核酸分子編碼四肽。在一些實施例中，核酸分子編碼五肽。在一些實施例中，核酸分子編碼六肽。在一些實施例中，核酸分子編碼七肽。在一些實施例中，核酸分子編碼八肽。在一些實施例中，核酸分子編碼九肽。在一些實施例中，核酸分子編碼十肽。在一些實施例中，核酸分子編碼具有至少約15個胺基酸之肽或多肽。在一些實施例中，核酸分子編碼具有至少約50個胺基酸之肽或多肽。在一些實施例中，核酸分子編碼具有至少約100個胺基酸之肽或多肽。在一些實施例中，核酸分子編碼具有至少約150個胺基酸之肽或多肽。在一些實施例中，核酸分子編碼具有至少約300個胺基酸之肽或多肽。在一些實施例中，核酸分子編碼具有至少約500個胺基酸之肽或多肽。在一些實施例中，核酸分子編碼具有至少約1000個胺基酸之肽或多肽。
在一些實施例中，本揭示案之核酸分子的長度為至少約30個核苷酸(nt)。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約35 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約40 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約45 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約50 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約55 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約60 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約65 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約70 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約75 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約80 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約85 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約90 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約95 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約100 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約120 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約140 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約160 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約180 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約200 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約250 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約300 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約400 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約500 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約600 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約700 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約800 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約900 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約1000 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約1100 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約1200 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約1300 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約1400 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約1500 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約1600 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約1700 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約1800 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約1900 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約2000 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約2500 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約3000 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約3500 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約4000 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約4500 nt。在一些實施例中，核酸分子之長度為至少約5000 nt。
在特定實施例中，將本揭示案之治療性核酸調配為本文所述之疫苗組成物(例如基因疫苗)。在一些實施例中，治療性核酸編碼能夠引發針對一或多種目標疾患或疾病之免疫的肽或蛋白質。在一些實施例中，目標疾患與病原體感染相關或由病原體感染引起，該病原體諸如為冠狀病毒(例如COVID-19)、流感病毒、麻疹病毒、人乳頭瘤病毒(HPV)、狂犬病病毒、腦膜炎病毒、百日咳病毒、破傷風病毒、鼠疫病毒、肝炎病毒及結核病病毒。在一些實施例中，治療性核酸序列(例如mRNA)編碼病原體特有之致病性蛋白質或其免疫原性片段(例如抗原決定基)或衍生物。疫苗在投與接種疫苗之個體後，允許表現編碼之致病性蛋白質(或其免疫原性片段或衍生物)，由此在該個體體內引發針對病原體之免疫。
在特定實施例中，本文提供用於管理、預防及治療由冠狀病毒引起之感染性疾病或疾患的治療性組成物(例如疫苗組成物)。冠狀病毒屬於套式病毒目(Nidoviralesn)中的冠狀病毒(Coronaviridae )科，並分為四個屬： α冠狀病毒(Alphacoronavirus)、β冠狀病毒(Betacoronavirus )、γ冠狀病毒(Gammacoronavirus )及δ冠狀病毒(Deltacoronavirus)。 其中，α冠狀病毒及β冠狀病毒感染哺乳動物，γ冠狀病毒感染禽類物種，而δ冠狀病毒感染哺乳動物及禽類物種。代表性α冠狀病毒包括人冠狀病毒NL63 (HCoV-NL63)、豬傳染性胃腸炎冠狀病毒(TGEV)、PEDV及豬呼吸道冠狀病毒(PRCV)。代表性β冠狀病毒包括SARS-CoV、MERS-CoV、蝙蝠冠狀病毒HKU4、小鼠肝炎冠狀病毒(MHV)、牛冠狀病毒(BCoV)及人冠狀病毒OC43。代表性γ-冠狀病毒及δ-冠狀病毒分別包括禽類感染性支氣管炎冠狀病毒(IBV)及豬δ-冠狀病毒(PdCV)。Li等人 , Annu Rev Virol. 2016 3(1):237-261。
不受理論束縛，經審慎考慮，冠狀病毒係帶包膜的正股RNA病毒。該等病毒具有較大基因體，典型地在27至32 kb範圍內。基因體包裝於由核衣殼(N)蛋白形成之螺旋衣殼內部且再經包膜包圍。與病毒包膜相關的有至少三種結構蛋白：膜(M)蛋白及包膜(E)蛋白參與病毒組裝，而刺突(S)蛋白介導病毒進入宿主細胞。一些冠狀病毒亦編碼與包膜相關之血球凝集素-酯酶(HE)蛋白。在此等結構蛋白中，刺突自病毒表面形成較大突起，使冠狀病毒呈現冠狀外觀。又，經審慎考慮，除介導病毒進入外，刺突蛋白亦可在確定病毒宿主範圍及組織趨性方面發揮作用，且為宿主免疫反應之主要誘導劑。Li等人 , Annu Rev Virol. 2016 3(1):237-261。
因此，在一些實施例中，本文提供編碼源自於冠狀病毒之病毒肽或蛋白質的治療性核酸。在一些實施例中，該核酸編碼源自於冠狀病毒之病毒肽或蛋白質，其中該病毒肽或蛋白質係選自以下之一或多種：(a) N蛋白、(b) M蛋白、(c) E蛋白、(d) S蛋白、(e) HE蛋白、(f) (a)至(e)中任一種之免疫原性片段以及(g) (a)至(f)中任一種之功能性衍生物。
不受理論束縛，經審慎考慮，冠狀病毒S蛋白含有三個區段：胞外結構域、單次跨膜錨及細胞內尾。又，經審慎考慮，胞外結構域包含受體結合次單元S1及膜融合次單元S2。S1次單元進一步包含兩個主要結構域：N末端結構域(S1-NTD)及C末端結構域(S1-CTD)。又，經審慎考慮，S1次單元中此等結構域中之一個或兩個可與宿主細胞上之受體結合，並起到受體結合結構域(RBD)之作用。確切地說，又經審慎考慮，S1次單元中任一結構域識別的宿主受體包括血管緊張素轉化酶2 (ACE2)、胺基肽酶N (APN)、二肽基肽酶4 (DPP4)、癌胚抗原相關細胞黏附分子1 (CEACAM1)及糖。又經審慎考慮，S1-CTD含有兩個子結構域：核心結構及受體結合模體(RBM)。RBM與宿主細胞上之ACE2受體結合。
因此，在一些實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼冠狀病毒S蛋白，或S蛋白之免疫原性片段，或S蛋白之功能性衍生物或其免疫原性片段。在特定實施例中，S蛋白之免疫原性片段選自胞外結構域、S1次單元、受體結合結構域(RBD)及受體結合模體(RBM)。在其他實施例中，S蛋白之免疫原性片段選自跨膜結構域、細胞內尾、S2次單元、S1-NTD結構域及S1-CTD結構域。表 1 顯示出示例性SARS-CoV-2天然抗原序列。表 1 ： SARS-CoV-2 抗原的示例性天然序列 .
序列名稱(SEQ ID NO:) 胺基酸或核酸序列
具有天然信號肽胺基酸序列之SARS-CoV-2刺突蛋白(SEQ ID NO: 2) MFVFLVLLPLVSS QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
具有天然信號肽編碼序列之SARS-CoV-2刺突蛋白(SEQ ID NO: 3) ATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCATTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACCACAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACACCATGTTCTTTTGGTGGTGTCAGTGTTATAACACCAGGAACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGGATGTTAACTGCACAGAAGTCCCTGTTGCTATTCATGCAGATCAACTTACTCCTACTTGGCGTGTTTATTCTACAGGTTCTAATGTTTTTCAAACACGTGCAGGCTGTTTAATAGGGGCTGAACATGTCAACAACTCATATGAGTGTGACATACCCATTGGTGCAGGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCTCCTCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGTCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTTGGTGCAGAAAATTCAGTTGCTTACTCTAATAACTCTATTGCCATACCCACAAATTTTACTATTAGTGTTACCACAGAAATTCTACCAGTGTCTATGACCAAGACATCAGTAGATTGTACAATGTACATTTGTGGTGATTCAACTGAATGCAGCAATCTTTTGTTGCAATATGGCAGTTTTTGTACACAATTAAACCGTGCTTTAACTGGAATAGCTGTTGAACAAGACAAAAACACCCAAGAAGTTTTTGCACAAGTCAAACAAATTTACAAAACACCACCAATTAAAGATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTACCAGATCCATCAAAACCAAGCAAGAGGTCATTTATTGAAGATCTACTTTTCAACAAAGTGACACTTGCAGATGCTGGCTTCATCAAACAATATGGTGATTGCCTTGGTGATATTGCTGCTAGAGACCTCATTTGTGCACAAAAGTTTAACGGCCTTACTGTTTTGCCACCTTTGCTCACAGATGAAATGATTGCTCAATACACTTCTGCACTGTTAGCGGGTACAATCACTTCTGGTTGGACCTTTGGTGCAGGTGCTGCATTACAAATACCATTTGCTATGCAAATGGCTTATAGGTTTAATGGTATTGGAGTTACACAGAATGTTCTCTATGAGAACCAAAAATTGATTGCCAACCAATTTAATAGTGCTATTGGCAAAATTCAAGACTCACTTTCTTCCACAGCAAGTGCACTTGGAAAACTTCAAGATGTGGTCAACCAAAATGCACAAGCTTTAAACACGCTTGTTAAACAACTTAGCTCCAATTTTGGTGCAATTTCAAGTGTTTTAAATGATATCCTTTCACGTCTTGACAAAGTTGAGGCTGAAGTGCAAATTGATAGGTTGATCACAGGCAGACTTCAAAGTTTGCAGACATATGTGACTCAACAATTAATTAGAGCTGCAGAAATCAGAGCTTCTGCTAATCTTGCTGCTACTAAAATGTCAGAGTGTGTACTTGGACAATCAAAAAGAGTTGATTTTTGTGGAAAGGGCTATCATCTTATGTCCTTCCCTCAGTCAGCACCTCATGGTGTAGTCTTCTTGCATGTGACTTATGTCCCTGCACAAGAAAAGAACTTCACAACTGCTCCTGCCATTTGTCATGATGGAAAAGCACACTTTCCTCGTGAAGGTGTCTTTGTTTCAAATGGCACACACTGGTTTGTAACACAAAGGAATTTTTATGAACCACAAATCATTACTACAGACAACACATTTGTGTCTGGTAACTGTGATGTTGTAATAGGAATTGTCAACAACACAGTTTATGATCCTTTGCAACCTGAATTAGACTCATTCAAGGAGGAGTTAGATAAATATTTTAAGAATCATACATCACCAGATGTTGATTTAGGTGACATCTCTGGCATTAATGCTTCAGTTGTAAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAATGAGGTTGCCAAGAATTTAAATGAATCTCTCATCGATCTCCAAGAACTTGGAAAGTATGAGCAGTATATAAAATGGCCATGGTACATTTGGCTAGGTTTTATAGCTGGCTTGATTGCCATAGTAATGGTGACAATTATGCTTTGCTGTATGACCAGTTGCTGTAGTTGTCTCAAGGGCTGTTGTTCTTGTGGATCCTGCTGCAAATTTGATGAAGACGACTCTGAGCCAGTGCTCAAAGGAGTCAAATTACATTACACA
SARS-CoV-2刺突蛋白胞外結構域(ECD)胺基酸序列(SEQ ID NO: 4) QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIK
SARS-CoV-2刺突蛋白ECD編碼序列(SEQ ID NO: 5) CAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACCACAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAACTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACACCATGTTCTTTTGGTGGTGTCAGTGTTATAACACCAGGAACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGGATGTTAACTGCACAGAAGTCCCTGTTGCTATTCATGCAGATCAACTTACTCCTACTTGGCGTGTTTATTCTACAGGTTCTAATGTTTTTCAAACACGTGCAGGCTGTTTAATAGGGGCTGAACATGTCAACAACTCATATGAGTGTGACATACCCATTGGTGCAGGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCTCCTCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGTCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTTGGTGCAGAAAATTCAGTTGCTTACTCTAATAACTCTATTGCCATACCCACAAATTTTACTATTAGTGTTACCACAGAAATTCTACCAGTGTCTATGACCAAGACATCAGTAGATTGTACAATGTACATTTGTGGTGATTCAACTGAATGCAGCAATCTTTTGTTGCAATATGGCAGTTTTTGTACACAATTAAACCGTGCTTTAACTGGAATAGCTGTTGAACAAGACAAAAACACCCAAGAAGTTTTTGCACAAGTCAAACAAATTTACAAAACACCACCAATTAAAGATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTACCAGATCCATCAAAACCAAGCAAGAGGTCATTTATTGAAGATCTACTTTTCAACAAAGTGACACTTGCAGATGCTGGCTTCATCAAACAATATGGTGATTGCCTTGGTGATATTGCTGCTAGAGACCTCATTTGTGCACAAAAGTTTAACGGCCTTACTGTTTTGCCACCTTTGCTCACAGATGAAATGATTGCTCAATACACTTCTGCACTGTTAGCGGGTACAATCACTTCTGGTTGGACCTTTGGTGCAGGTGCTGCATTACAAATACCATTTGCTATGCAAATGGCTTATAGGTTTAATGGTATTGGAGTTACACAGAATGTTCTCTATGAGAACCAAAAATTGATTGCCAACCAATTTAATAGTGCTATTGGCAAAATTCAAGACTCACTTTCTTCCACAGCAAGTGCACTTGGAAAACTTCAAGATGTGGTCAACCAAAATGCACAAGCTTTAAACACGCTTGTTAAACAACTTAGCTCCAATTTTGGTGCAATTTCAAGTGTTTTAAATGATATCCTTTCACGTCTTGACAAAGTTGAGGCTGAAGTGCAAATTGATAGGTTGATCACAGGCAGACTTCAAAGTTTGCAGACATATGTGACTCAACAATTAATTAGAGCTGCAGAAATCAGAGCTTCTGCTAATCTTGCTGCTACTAAAATGTCAGAGTGTGTACTTGGACAATCAAAAAGAGTTGATTTTTGTGGAAAGGGCTATCATCTTATGTCCTTCCCTCAGTCAGCACCTCATGGTGTAGTCTTCTTGCATGTGACTTATGTCCCTGCACAAGAAAAGAACTTCACAACTGCTCCTGCCATTTGTCATGATGGAAAAGCACACTTTCCTCGTGAAGGTGTCTTTGTTTCAAATGGCACACACTGGTTTGTAACACAAAGGAATTTTTATGAACCACAAATCATTACTACAGACAACACATTTGTGTCTGGTAACTGTGATGTTGTAATAGGAATTGTCAACAACACAGTTTATGATCCTTTGCAACCTGAATTAGACTCATTCAAGGAGGAGTTAGATAAATATTTTAAGAATCATACATCACCAGATGTTGATTTAGGTGACATCTCTGGCATTAATGCTTCAGTTGTAAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAATGAGGTTGCCAAGAATTTAAATGAATCTCTCATCGATCTCCAAGAACTTGGAAAGTATGAGCAGTATATAAAA
SARS-CoV-2刺突蛋白S1次單元胺基酸序列(SEQ ID NO: 6) QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRAR
SARS-CoV-2刺突蛋白S1次單元編碼序列(SEQ ID NO: 7) CAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACCACAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACACCATGTTCTTTTGGTGGTGTCAGTGTTATAACACCAGGAACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGGATGTTAACTGCACAGAAGTCCCTGTTGCTATTCATGCAGATCAACTTACTCCTACTTGGCGTGTTTATTCTACAGGTTCTAATGTTTTTCAAACACGTGCAGGCTGTTTAATAGGGGCTGAACATGTCAACAACTCATATGAGTGTGACATACCCATTGGTGCAGGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCTCCTCGGCGGGCACGT
跨越位置319-541(RBD-1)胺基酸序列之SARS-CoV-2刺突蛋白受體結合結構域(RBD) (SEQ ID NO: 8) RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPT N GVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF
SARS-CoV-2刺突蛋白RBD-1編碼序列(SEQ ID NO:9) AGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAACTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTC
跨越位置331-529 (RBD-2)胺基酸序列之SARS-CoV-2刺突蛋白RBD (SEQ ID NO: 10) NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKK
SARS-CoV-2刺突蛋白RBD-2編碼序列(SEQ ID NO:11) AATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAACTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAG
跨越位置331-524 (RBD-3)胺基酸序列之SARS-CoV-2刺突蛋白RBD (SEQ ID NO: 12) NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV
SARS-CoV-2刺突蛋白RBD-3編碼序列(SEQ ID NO:13) AATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAACTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTT
跨越位置319-529 (RBD-4)胺基酸序列之SARS-CoV-2刺突蛋白RBD (SEQ ID NO: 14) RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKK
SARS-CoV-2刺突蛋白RBD-4編碼序列(SEQ ID NO:15) AGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAACTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAG
SARS-CoV-2刺突蛋白受體結合模體(RBM)胺基酸序列(SEQ ID NO:16) VGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPT
SARS-CoV-2刺突蛋白RBM編碼序列(SEQ ID NO:17) GTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACT
SARS-CoV-2核衣殼蛋白胺基酸序列(SEQ ID NO:18) MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTAAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA
SARS-CoV-2核衣殼蛋白編碼序列(SEQ ID NO:19) ATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCCGCATTACGTTTGGTGGACCCTCAGATTCAACTGGCAGTAACCAGAATGGAGAACGCAGTGGGGCGCGATCAAAACAACGTCGGCCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACCGCTCTCACTCAACATGGCAAGGAAGACCTTAAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTCCAATTAACACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTGGTGGTGACGGTAAAATGAAAGATCTCAGTCCAAGATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGCTAACAAAGACGGCATCATATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGCACCCGCAATCCTGCTAACAATGCTGCAATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGCTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATTTCAAAGATCAAGTCATTTTGCTGAATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAGAAGGCTGATGAAACTCAAGCCTTACCGCAGAGACAGAAGAAACAGCAAACTGTGACTCTTCTTCCTGCTGCAGATTTGGATGATTTCTCCAAACAATTGCAACAATCCATGAGCAGTGCTGACTCAACTCAGGCC
在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白，其中該S蛋白具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白，且其中該治療性核酸包含SEQ ID NO: 3之DNA編碼序列。在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白，且其中該治療性核酸包含自SEQ ID NO: 3之DNA編碼序列轉錄的RNA序列。在特定實施例中，核酸分子係mRNA分子。
在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白的胞外結構域(ECD)，且其中該胞外結構域具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白的ECD，且其中該治療性核酸包含SEQ ID NO: 5之DNA編碼序列。在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白的ECD，且其中該治療性核酸包含自SEQ ID NO: 5之DNA編碼序列轉錄的RNA序列。在一些實施例中，該RNA序列係在活體外轉錄的。在特定實施例中，核酸分子係mRNA分子。
在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白的S1次單元，且其中該S1次單元具有SEQ ID NO: 6之胺基酸序列。在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白的S1次單元，且其中該治療性核酸包含SEQ ID NO: 7之DNA編碼序列。在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白的S1次單元，且其中該治療性核酸包含自SEQ ID NO: 7之DNA編碼序列轉錄的RNA序列。在一些實施例中，該RNA序列係在活體外轉錄的。在特定實施例中，核酸分子係mRNA分子。
在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白的免疫原性片段。在一些實施例中，免疫原性片段係冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白的受體結合結構域(RBD)。在一些實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼位於S蛋白之殘基319-541處的RBD序列，且具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白的RBD序列，且其中該治療性核酸包含SEQ ID NO: 9之DNA編碼序列。在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白的RBD序列，且其中該治療性核酸包含自SEQ ID NO: 9之DNA編碼序列轉錄的RNA序列。在一些實施例中，該RNA序列係在活體外轉錄的。在特定實施例中，核酸分子係mRNA分子。
在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼位於冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白之殘基331-529處的RBD序列，且具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列。在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白的RBD序列，且其中該治療性核酸包含SEQ ID NO: 11之DNA編碼序列。在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白的RBD序列，且其中該治療性核酸包含自SEQ ID NO: 11之DNA編碼序列轉錄之RNA序列。在一些實施例中，RNA序列係在活體外轉錄的。在特定實施例中，核酸分子係mRNA分子。
在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白的RBD序列，且其中該RBD序列位於該S蛋白之殘基331-524處，且具有SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白的RBD序列，且其中該治療性核酸包含SEQ ID NO: 13之DNA編碼序列。在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白的RBD序列，且其中該治療性核酸包含自SEQ ID NO: 13之DNA編碼序列轉錄之RNA序列。在一些實施例中，RNA序列係在活體外轉錄的。在特定實施例中，核酸分子係mRNA分子。
在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白的RBD序列，且其中該RBD序列位於該S蛋白之殘基319-529處，且具有SEQ ID NO: 14之胺基酸序列。在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白的RBD序列，且其中該治療性核酸包含SEQ ID NO: 15之DNA編碼序列。在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白的RBD序列，且其中該治療性核酸包含自SEQ ID NO: 15之DNA編碼序列轉錄之RNA序列。在一些實施例中，RNA序列係在活體外轉錄的。在特定實施例中，核酸分子係mRNA分子。
在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白的受體結合模體(RBM)序列，且其中該RBM具有SEQ ID NO: 16之胺基酸序列。在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白的RBM，且其中該治療性核酸包含SEQ ID NO: 17之DNA編碼序列。在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白的RBM，且其中該治療性核酸包含自SEQ ID NO: 17之DNA編碼序列轉錄的RNA序列。在一些實施例中，RNA序列係在活體外轉錄的。在特定實施例中，核酸分子係mRNA分子。
在一些實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼RBD之功能性衍生物。在特定實施例中，RBD之功能性衍生物包含一或多個突變，該一或多個突變使RBD與宿主受體之結合親和力相較於無此類突變之RBD增加。在特定實施例中，冠狀病毒係SARS-CoV，且其中突變係K479N及/或S487T。
在特定實施例中，冠狀病毒係SARS-CoV-2，且其中突變係N501T。表 2 顯示出具有N501T突變的冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白或其抗原片段的示例性序列。表 2 ： SARS-CoV-2 抗原之示例性突變序列 .
序列名稱(SEQ ID NO:) 胺基酸或核酸序列
具有天然信號肽及 N501T 取代 胺基酸序列之SARS-CoV-2刺突蛋白(SEQ ID NO: 20) MFVFLVLLPLVSS QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPT T GVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
具有 N501T 取代 胺基酸序列之SARS-CoV-2刺突蛋白ECD (SEQ ID NO: 21) QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPT T GVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIK
具有 N501T 取代 胺基酸序列之SARS-CoV-2刺突蛋白S1次單元(SEQ ID NO: 22) QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPT T GVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRAR
具有 N501T 取代 (RBD-5)胺基酸序列之SARS-CoV-2刺突蛋白RBD-1(SEQ ID NO: 23) RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPT T GVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF
具有 N501T 取代 (RBD-6)胺基酸序列之SARS-CoV-2刺突蛋白RBD-2 (SEQ ID NO: 24) ITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPT T GVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKK
具有 N501T 取代 (RBD-7)胺基酸序列之SARS-CoV-2刺突蛋白RBD-3 (SEQ ID NO: 25) NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPT T GVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV
具有 N501T 取代 (RBD-8)胺基酸序列之SARS-CoV-2刺突蛋白RBD-4 (SEQ ID NO: 26) RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPT T GVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKK
SARS-CoV-2刺突蛋白RBD-8編碼序列(SEQ ID NO:27) AGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAACTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTACTGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAG
在特定實施例中，該治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白的功能性衍生物。在特定實施例中，編碼的S蛋白之功能性衍生物包含胺基酸取代N501T。在特定實施例中，編碼的S蛋白之功能性衍生物包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。
在特定實施例中，該治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白之胞外結構域的功能性衍生物。在特定實施例中，編碼的S蛋白胞外結構域之功能性衍生物包含胺基酸取代N501T。在特定實施例中，編碼的S蛋白胞外結構域之功能性衍生物包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列。
在特定實施例中，該治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白之S1次單元的功能性衍生物。在特定實施例中，編碼的S蛋白S1次單元之功能性衍生物包含胺基酸取代N501T。在特定實施例中，編碼的S蛋白S1次單元之功能性衍生物包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列。
在特定實施例中，該治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白之受體結合結構域(RBD)序列的功能性衍生物。在特定實施例中，編碼的S蛋白RBD序列之功能性衍生物包含胺基酸取代N501T。在特定實施例中，編碼的S蛋白RBD序列之功能性衍生物包含SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO: 26之胺基酸序列。在特定實施例中，編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白之RBD序列之功能性衍生物的治療性核酸包含SEQ ID NO: 27之DNA編碼序列。在特定實施例中，編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白之RBD序列之功能性衍生物的治療性核酸包含SEQ ID NO: 27之DNA編碼序列。在一些實施例中，RNA序列係在活體外轉錄的。在特定實施例中，治療性核酸係mRNA分子。
不受理論束縛，經審慎考慮，在冠狀病毒刺突結構中，三個S1頭位於三聚S2莖(stalk)之頂部。在兩個重要的S1結構域之間，S1-CTD位於刺突之最頂部，而S1-NTD直接地接觸並在結構上約束S2。因此，在一些實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼S蛋白之功能性衍生物。在一些實施例中，該治療性核酸編碼包含與三聚化肽融合之S蛋白或其片段的融合蛋白，使得該融合蛋白能夠形成包含三個拷貝之S蛋白或其片段的三聚體複合物。在一些實施例中，該治療性核酸編碼包含與三聚化肽融合之S蛋白之胞外結構域的融合蛋白，其中該融合蛋白能夠形成包含三個拷貝之胞外結構域的三聚體複合物。在一些實施例中，該治療性核酸編碼包含與三聚化肽融合之S蛋白之RBD的融合蛋白，其中該融合蛋白能夠形成包含三個拷貝之RBD的三聚體複合物。在一些實施例中，該治療性核酸編碼包含與三聚化肽融合之S蛋白之S1-CTD的融合蛋白，其中該融合蛋白能夠形成包含三個拷貝之S1-CTD的三聚體複合物。在一些實施例中，S蛋白或其片段經由肽連接子與三聚化肽融合。表 3 顯示出可與本揭示案結合使用之示例性三聚化肽及連接子肽，以及融合蛋白之序列。表 3 ：連接子肽、三聚化肽及 SARS-CoV-2 抗原之示例性序列 .
序列名稱 (SEQ ID NO:) 胺基酸或核酸序列
(G3S)2連接子肽胺基酸序列(SEQ ID NO: 28) GGGSGGGS
(G3S)2連接子肽編碼序列(SEQ ID NO: 29) GGAGGAGGAAGTGGAGGAGGAAGT
三聚化肽胺基酸序列(SEQ ID NO: 30) GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLG
三聚化肽編碼序列(SEQ ID NO: 31) GGCTATATTCCGGAAGCGCCGCGCGATGGCCAGGCGTATGTGCGCAAAGATGGCGAATGGGTGCTGCTGAGCACCTTTCTGGGC
C末端融合(G3S)2連接子及三聚化肽 胺基酸序列之SARS-CoV-2刺突蛋白ECD (SEQ ID NO: 32) QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKGGGSGGGS GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLG
C末端融合(G3S)2連接子及三聚化肽編碼序列之SARS-CoV-2刺突蛋白ECD (SEQ ID NO: 33) CAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACCACAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAACTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACACCATGTTCTTTTGGTGGTGTCAGTGTTATAACACCAGGAACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGGATGTTAACTGCACAGAAGTCCCTGTTGCTATTCATGCAGATCAACTTACTCCTACTTGGCGTGTTTATTCTACAGGTTCTAATGTTTTTCAAACACGTGCAGGCTGTTTAATAGGGGCTGAACATGTCAACAACTCATATGAGTGTGACATACCCATTGGTGCAGGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCTCCTCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGTCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTTGGTGCAGAAAATTCAGTTGCTTACTCTAATAACTCTATTGCCATACCCACAAATTTTACTATTAGTGTTACCACAGAAATTCTACCAGTGTCTATGACCAAGACATCAGTAGATTGTACAATGTACATTTGTGGTGATTCAACTGAATGCAGCAATCTTTTGTTGCAATATGGCAGTTTTTGTACACAATTAAACCGTGCTTTAACTGGAATAGCTGTTGAACAAGACAAAAACACCCAAGAAGTTTTTGCACAAGTCAAACAAATTTACAAAACACCACCAATTAAAGATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTACCAGATCCATCAAAACCAAGCAAGAGGTCATTTATTGAAGATCTACTTTTCAACAAAGTGACACTTGCAGATGCTGGCTTCATCAAACAATATGGTGATTGCCTTGGTGATATTGCTGCTAGAGACCTCATTTGTGCACAAAAGTTTAACGGCCTTACTGTTTTGCCACCTTTGCTCACAGATGAAATGATTGCTCAATACACTTCTGCACTGTTAGCGGGTACAATCACTTCTGGTTGGACCTTTGGTGCAGGTGCTGCATTACAAATACCATTTGCTATGCAAATGGCTTATAGGTTTAATGGTATTGGAGTTACACAGAATGTTCTCTATGAGAACCAAAAATTGATTGCCAACCAATTTAATAGTGCTATTGGCAAAATTCAAGACTCACTTTCTTCCACAGCAAGTGCACTTGGAAAACTTCAAGATGTGGTCAACCAAAATGCACAAGCTTTAAACACGCTTGTTAAACAACTTAGCTCCAATTTTGGTGCAATTTCAAGTGTTTTAAATGATATCCTTTCACGTCTTGACAAAGTTGAGGCTGAAGTGCAAATTGATAGGTTGATCACAGGCAGACTTCAAAGTTTGCAGACATATGTGACTCAACAATTAATTAGAGCTGCAGAAATCAGAGCTTCTGCTAATCTTGCTGCTACTAAAATGTCAGAGTGTGTACTTGGACAATCAAAAAGAGTTGATTTTTGTGGAAAGGGCTATCATCTTATGTCCTTCCCTCAGTCAGCACCTCATGGTGTAGTCTTCTTGCATGTGACTTATGTCCCTGCACAAGAAAAGAACTTCACAACTGCTCCTGCCATTTGTCATGATGGAAAAGCACACTTTCCTCGTGAAGGTGTCTTTGTTTCAAATGGCACACACTGGTTTGTAACACAAAGGAATTTTTATGAACCACAAATCATTACTACAGACAACACATTTGTGTCTGGTAACTGTGATGTTGTAATAGGAATTGTCAACAACACAGTTTATGATCCTTTGCAACCTGAATTAGACTCATTCAAGGAGGAGTTAGATAAATATTTTAAGAATCATACATCACCAGATGTTGATTTAGGTGACATCTCTGGCATTAATGCTTCAGTTGTAAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAATGAGGTTGCCAAGAATTTAAATGAATCTCTCATCGATCTCCAAGAACTTGGAAAGTATGAGCAGTATATAAAAGGAGGAGGAAGTGGAGGAGGAAGTGGCTATATTCCGGAAGCGCCGCGCGATGGCCAGGCGTATGTGCGCAAAGATGGCGAATGGGTGCTGCTGAGCACCTTTCTGGGC
C末端融合(G3S)2連接子及三聚化肽 胺基酸序列之SARS-CoV-2刺突蛋白RBD-2 (SEQ ID NO: 34) NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKGGGSGGGS GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLG
C末端融合(G3S)2連接子及三聚化肽編碼序列之SARS-CoV-2刺突蛋白RBD-2 (SEQ ID NO: 35) AATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAACTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGGGAGGAGGAAGTGGAGGAGGAAGTGGCTATATTCCGGAAGCGCCGCGCGATGGCCAGGCGTATGTGCGCAAAGATGGCGAATGGGTGCTGCTGAGCACCTTTCTGGGC
在一些實施例中，該治療性核酸編碼包含與三聚化肽融合的冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白或其功能性衍生物的融合蛋白。在一些實施例中，S蛋白與三聚化肽之間的融合係經由肽連接子實現。在特定實施例中，S蛋白或其功能性衍生物包含SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。在具體實施例中，肽連接子包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列。在一些實施例中，三聚化肽包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。
在一些實施例中，該治療性核酸編碼包含與三聚化肽融合的冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白之胞外結構域(ECD)或其功能性衍生物的融合蛋白。在一些實施例中，S蛋白之胞外結構域與三聚化肽之間的融合係經由肽連接子實現。在特定實施例中，S蛋白或其功能性衍生物包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 21之胺基酸序列。在具體實施例中，肽連接子包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列。在一些實施例中，三聚化肽包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。
在一些實施例中，該治療性核酸編碼包含與三聚化肽融合的冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白之胞外結構域或其功能性衍生物的融合蛋白。在特定實施例中，融合蛋白具有SEQ ID NO: 32之胺基酸序列。在特定實施例中，該治療性核酸編碼包含與三聚化肽融合的SARS-CoV-2之S蛋白之胞外結構域的融合蛋白，其中該核酸包含SEQ ID NO: 33之DNA編碼序列。在特定實施例中，該治療性核酸編碼包含與三聚化肽融合的SARS-CoV-2之S蛋白之胞外結構域的融合蛋白，其中該核酸包含自SEQ ID NO: 33之DNA編碼序列轉錄的RNA序列。在一些實施例中，RNA序列係在活體外轉錄的。在特定實施例中，核酸分子係mRNA分子。
在一些實施例中，該治療性核酸編碼包含與三聚化肽融合的冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白之S1次單元或其功能性衍生物的融合蛋白。在一些實施例中，S蛋白之胞外結構域與三聚化肽之間的融合係經由肽連接子實現。在特定實施例中，S蛋白之S1次單元或其功能性衍生物包含SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 22之胺基酸序列。在特定實施例中，肽連接子包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列。在一些實施例中，三聚化肽包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。
在一些實施例中，該治療性核酸編碼包含與三聚化肽融合的冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白之受體結合結構域(RBD)或其功能性衍生物的融合蛋白。在一些實施例中，S蛋白之RBD序列與三聚化肽之間的融合係經由肽連接子實現。在特定實施例中，S蛋白之RBD序列或其功能性衍生物包含選自SEQ ID NO: 8、10、12、14、23、24、25及26之胺基酸序列。在特定實施例中，肽連接子包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列。在一些實施例中，三聚化肽包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。
在特定實施例中，該治療性核酸編碼包含與三聚化肽融合的SARS-CoV-2之S蛋白之RBD序列的融合蛋白，其中該融合蛋白具有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列。在特定實施例中，該治療性核酸編碼包含與三聚化肽融合的SARS-CoV-2之S蛋白之RBD的融合蛋白，其中該核酸包含SEQ ID NO: 35之DNA編碼序列。在特定實施例中，該治療性核酸編碼包含與三聚化肽融合的SARS-CoV-2之S蛋白之RBD的融合蛋白，其中該核酸包含自SEQ ID NO: 35之DNA編碼序列轉錄的RNA序列。在一些實施例中，RNA序列係在活體外轉錄的。在特定實施例中，核酸分子係mRNA分子。
在一些實施例中，該治療性核酸編碼包含與三聚化肽融合的冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白之受體結合模體(RBM)序列或其功能性衍生物的融合蛋白。在一些實施例中，S蛋白之RBM序列與三聚化肽之間的融合係經由肽連接子實現。在特定實施例中，S蛋白之RBM序列或其功能性衍生物包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列。在特定實施例中，肽連接子包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列。在一些實施例中，三聚化肽包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。
不受理論束縛，經審慎考慮，冠狀病毒之N蛋白包含N末端結構域(N-NTD)及C末端結構域(N-CTD)，其間散佈有若干固有無序區(IDR)。舉例而言，SARS-CoV N蛋白分別在殘基1-44、182-247及366-422處具有三個IDR，及位於殘基45-181處之N-NTD，及位於殘基248-365處之N-CTD。
因此，在一些實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼冠狀病毒N蛋白，或N蛋白之免疫原性片段，或N蛋白之功能性衍生物或其免疫原性片段。在特定實施例中，該治療性核酸編碼全長N蛋白。在特定實施例中，該治療性核酸編碼選自N-NTD、N-CTD及IDR的N蛋白之一或多個免疫原性片段。
在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之核衣殼(N)蛋白，且其中該N蛋白具有SEQ ID NO: 18之胺基酸序列。在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之N蛋白，且其中該治療性核酸包含SEQ ID NO: 19之DNA編碼序列。在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼冠狀病毒SARS-CoV-2之N蛋白，且其中該治療性核酸包含自SEQ ID NO: 19之DNA編碼序列轉錄的RNA序列。在一些實施例中，RNA序列係在活體外轉錄的。在特定實施例中，核酸分子係mRNA分子。
不受理論束縛，經審慎考慮，包含與免疫球蛋白Fc區融合之病毒肽或多肽的融合蛋白可增強病毒肽或多肽之免疫原性。因此，在一些實施例中，本揭示案之治療性核酸分子編碼融合蛋白，該融合蛋白包含與免疫球蛋白Fc區融合的源自於冠狀病毒之病毒肽或蛋白質。在特定實施例中，病毒肽或蛋白質係選自以下之一或多種：(a) N蛋白、(b) M蛋白、(c) E蛋白、(d) S蛋白、(e) HE蛋白、(f) (a)至(e)中任一種之免疫原性片段以及(g) (a)至(f)中任一種之功能性衍生物。在特定實施例中，免疫球蛋白係人免疫球蛋白(Ig)。在特定實施例中，免疫球蛋白係人IgG、IgA、IgD、IgE或IgM。在特定實施例中，免疫球蛋白係人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些實施例中，免疫球蛋白Fc與病毒肽或多肽之N末端融合。在其他實施例中，免疫球蛋白Fc與病毒肽或多肽之C末端融合。
不受理論束縛，經審慎考慮，信號肽可介導與其融合之多肽向細胞特定位置之轉運。因此，在一些實施例中，本揭示案之治療性核酸分子編碼包含與信號肽融合之病毒肽或蛋白質的融合蛋白。在特定實施例中，病毒肽或蛋白質係選自以下之一或多種：(a) N蛋白、(b) M蛋白、(c) E蛋白、(d) S蛋白、(e) HE蛋白、(f) (a)至(e)中任一種之免疫原性片段以及(g) (a)至(f)中任一種之功能性衍生物。在一些實施例中，信號肽與病毒肽或多肽之N末端融合。在其他實施例中，信號肽與病毒肽或多肽之C末端融合。表 4 顯示出可與本揭示案結合使用的信號肽之示例性序列，以及包含信號肽之示例性SARS-CoV-2抗原序列。表 4 ：信號肽及 SARS-CoV-2 抗原之示例性序列 .
序列名稱 (SEQ ID NO:) 胺基酸或核酸序列
SARS-CoV-2刺突蛋白天然信號肽胺基酸序列(SEQ ID NO: 36) MFVFLVLLPLVSS
SARS-CoV-2刺突蛋白天然信號肽編碼序列(SEQ ID NO: 37) ATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCATTAGTCTCTAGT
人IgE信號肽胺基酸序列(SEQ ID NO: 38) MDWTWILFLVAAATRVHS
人IgE信號肽編碼序列(SEQ ID NO: 39) ATGGACTGGACCTGGATTCTCTTCTTGGTGGCAGCAGCCACGCGAGTCCACTCC
不含天然信號肽胺基酸序列之SARS-CoV-2刺突蛋白(SEQ ID NO: 40) QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
不含天然信號肽編碼序列之SARS-CoV-2刺突蛋白(SEQ ID NO: 41) ATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCATTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACCACAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAACTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACACCATGTTCTTTTGGTGGTGTCAGTGTTATAACACCAGGAACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGGATGTTAACTGCACAGAAGTCCCTGTTGCTATTCATGCAGATCAACTTACTCCTACTTGGCGTGTTTATTCTACAGGTTCTAATGTTTTTCAAACACGTGCAGGCTGTTTAATAGGGGCTGAACATGTCAACAACTCATATGAGTGTGACATACCCATTGGTGCAGGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCTCCTCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGTCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTTGGTGCAGAAAATTCAGTTGCTTACTCTAATAACTCTATTGCCATACCCACAAATTTTACTATTAGTGTTACCACAGAAATTCTACCAGTGTCTATGACCAAGACATCAGTAGATTGTACAATGTACATTTGTGGTGATTCAACTGAATGCAGCAATCTTTTGTTGCAATATGGCAGTTTTTGTACACAATTAAACCGTGCTTTAACTGGAATAGCTGTTGAACAAGACAAAAACACCCAAGAAGTTTTTGCACAAGTCAAACAAATTTACAAAACACCACCAATTAAAGATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTACCAGATCCATCAAAACCAAGCAAGAGGTCATTTATTGAAGATCTACTTTTCAACAAAGTGACACTTGCAGATGCTGGCTTCATCAAACAATATGGTGATTGCCTTGGTGATATTGCTGCTAGAGACCTCATTTGTGCACAAAAGTTTAACGGCCTTACTGTTTTGCCACCTTTGCTCACAGATGAAATGATTGCTCAATACACTTCTGCACTGTTAGCGGGTACAATCACTTCTGGTTGGACCTTTGGTGCAGGTGCTGCATTACAAATACCATTTGCTATGCAAATGGCTTATAGGTTTAATGGTATTGGAGTTACACAGAATGTTCTCTATGAGAACCAAAAATTGATTGCCAACCAATTTAATAGTGCTATTGGCAAAATTCAAGACTCACTTTCTTCCACAGCAAGTGCACTTGGAAAACTTCAAGATGTGGTCAACCAAAATGCACAAGCTTTAAACACGCTTGTTAAACAACTTAGCTCCAATTTTGGTGCAATTTCAAGTGTTTTAAATGATATCCTTTCACGTCTTGACAAAGTTGAGGCTGAAGTGCAAATTGATAGGTTGATCACAGGCAGACTTCAAAGTTTGCAGACATATGTGACTCAACAATTAATTAGAGCTGCAGAAATCAGAGCTTCTGCTAATCTTGCTGCTACTAAAATGTCAGAGTGTGTACTTGGACAATCAAAAAGAGTTGATTTTTGTGGAAAGGGCTATCATCTTATGTCCTTCCCTCAGTCAGCACCTCATGGTGTAGTCTTCTTGCATGTGACTTATGTCCCTGCACAAGAAAAGAACTTCACAACTGCTCCTGCCATTTGTCATGATGGAAAAGCACACTTTCCTCGTGAAGGTGTCTTTGTTTCAAATGGCACACACTGGTTTGTAACACAAAGGAATTTTTATGAACCACAAATCATTACTACAGACAACACATTTGTGTCTGGTAACTGTGATGTTGTAATAGGAATTGTCAACAACACAGTTTATGATCCTTTGCAACCTGAATTAGACTCATTCAAGGAGGAGTTAGATAAATATTTTAAGAATCATACATCACCAGATGTTGATTTAGGTGACATCTCTGGCATTAATGCTTCAGTTGTAAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAATGAGGTTGCCAAGAATTTAAATGAATCTCTCATCGATCTCCAAGAACTTGGAAAGTATGAGCAGTATATAAAA
具有天然信號肽胺基酸序列之SARS-CoV-2刺突蛋白胞外結構域(SEQ ID NO: 42) MFVFLVLLPLVSS QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIK
具有天然信號肽編碼序列之SARS-CoV-2刺突蛋白胞外結構域(ECD) (SEQ ID NO: 43) ATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCATTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACCACAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAACTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACACCATGTTCTTTTGGTGGTGTCAGTGTTATAACACCAGGAACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGGATGTTAACTGCACAGAAGTCCCTGTTGCTATTCATGCAGATCAACTTACTCCTACTTGGCGTGTTTATTCTACAGGTTCTAATGTTTTTCAAACACGTGCAGGCTGTTTAATAGGGGCTGAACATGTCAACAACTCATATGAGTGTGACATACCCATTGGTGCAGGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCTCCTCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGTCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTTGGTGCAGAAAATTCAGTTGCTTACTCTAATAACTCTATTGCCATACCCACAAATTTTACTATTAGTGTTACCACAGAAATTCTACCAGTGTCTATGACCAAGACATCAGTAGATTGTACAATGTACATTTGTGGTGATTCAACTGAATGCAGCAATCTTTTGTTGCAATATGGCAGTTTTTGTACACAATTAAACCGTGCTTTAACTGGAATAGCTGTTGAACAAGACAAAAACACCCAAGAAGTTTTTGCACAAGTCAAACAAATTTACAAAACACCACCAATTAAAGATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTACCAGATCCATCAAAACCAAGCAAGAGGTCATTTATTGAAGATCTACTTTTCAACAAAGTGACACTTGCAGATGCTGGCTTCATCAAACAATATGGTGATTGCCTTGGTGATATTGCTGCTAGAGACCTCATTTGTGCACAAAAGTTTAACGGCCTTACTGTTTTGCCACCTTTGCTCACAGATGAAATGATTGCTCAATACACTTCTGCACTGTTAGCGGGTACAATCACTTCTGGTTGGACCTTTGGTGCAGGTGCTGCATTACAAATACCATTTGCTATGCAAATGGCTTATAGGTTTAATGGTATTGGAGTTACACAGAATGTTCTCTATGAGAACCAAAAATTGATTGCCAACCAATTTAATAGTGCTATTGGCAAAATTCAAGACTCACTTTCTTCCACAGCAAGTGCACTTGGAAAACTTCAAGATGTGGTCAACCAAAATGCACAAGCTTTAAACACGCTTGTTAAACAACTTAGCTCCAATTTTGGTGCAATTTCAAGTGTTTTAAATGATATCCTTTCACGTCTTGACAAAGTTGAGGCTGAAGTGCAAATTGATAGGTTGATCACAGGCAGACTTCAAAGTTTGCAGACATATGTGACTCAACAATTAATTAGAGCTGCAGAAATCAGAGCTTCTGCTAATCTTGCTGCTACTAAAATGTCAGAGTGTGTACTTGGACAATCAAAAAGAGTTGATTTTTGTGGAAAGGGCTATCATCTTATGTCCTTCCCTCAGTCAGCACCTCATGGTGTAGTCTTCTTGCATGTGACTTATGTCCCTGCACAAGAAAAGAACTTCACAACTGCTCCTGCCATTTGTCATGATGGAAAAGCACACTTTCCTCGTGAAGGTGTCTTTGTTTCAAATGGCACACACTGGTTTGTAACACAAAGGAATTTTTATGAACCACAAATCATTACTACAGACAACACATTTGTGTCTGGTAACTGTGATGTTGTAATAGGAATTGTCAACAACACAGTTTATGATCCTTTGCAACCTGAATTAGACTCATTCAAGGAGGAGTTAGATAAATATTTTAAGAATCATACATCACCAGATGTTGATTTAGGTGACATCTCTGGCATTAATGCTTCAGTTGTAAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAATGAGGTTGCCAAGAATTTAAATGAATCTCTCATCGATCTCCAAGAACTTGGAAAGTATGAGCAGTATATAAAA
具有天然信號肽胺基酸序列之SARS-CoV-2刺突蛋白S1次單元(SEQ ID NO: 44) MFVFLVLLPLVSS QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRAR
具有天然信號肽編碼序列之SARS-CoV-2刺突蛋白S1次單元(SEQ ID NO: 45) ATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCATTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACCACAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACACCATGTTCTTTTGGTGGTGTCAGTGTTATAACACCAGGAACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGGATGTTAACTGCACAGAAGTCCCTGTTGCTATTCATGCAGATCAACTTACTCCTACTTGGCGTGTTTATTCTACAGGTTCTAATGTTTTTCAAACACGTGCAGGCTGTTTAATAGGGGCTGAACATGTCAACAACTCATATGAGTGTGACATACCCATTGGTGCAGGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCTCCTCGGCGGGCACGT
在特定實施例中，信號肽係由作為病毒肽或多肽來源的冠狀病毒之基因編碼。在特定實施例中，由冠狀病毒之基因編碼的信號肽與由冠狀病毒之不同基因編碼的病毒肽或多肽融合。在其他實施例中，由冠狀病毒之基因編碼的信號肽與由冠狀病毒之相同基因編碼的病毒肽或多肽融合。舉例而言，在一些實施例中，具有MFVFLVLLPLVSS之胺基酸序列(SEQ ID NO: 36)的信號肽與由本揭示案之核酸分子編碼的病毒肽或多肽融合。在各個實施例中，病毒肽或蛋白質係選自以下之一或多種：(a) N蛋白、(b) M蛋白、(c) E蛋白、(d) S蛋白、(e) HE蛋白、(f) (a)至(e)中任一種之免疫原性片段以及(g) (a)至(f)中任一種之功能性衍生物。
在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼不含天然信號肽的冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白。在特定實施例中，編碼的S蛋白包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列。在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼具有信號肽的冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白，且其中該治療性核酸包含SEQ ID NO: 41之DNA編碼序列。在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼具有信號肽的冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白，且其中該治療性核酸包含自SEQ ID NO: 41之DNA編碼序列轉錄之RNA序列。在一些實施例中，RNA序列係在活體外轉錄的。在特定實施例中，核酸分子係mRNA分子。
在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼具有信號肽的冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白的胞外結構域(ECD)。在特定實施例中，編碼的S蛋白胞外結構域包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列。在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼具有信號肽的冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白的胞外結構域，且其中該治療性核酸包含SEQ ID NO: 43之DNA編碼序列。在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼具有信號肽的冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白的胞外結構域，且其中該治療性核酸包含自SEQ ID NO: 43之DNA編碼序列轉錄之RNA序列。在一些實施例中，RNA序列係在活體外轉錄的。在特定實施例中，核酸分子係mRNA分子。
在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼具有信號肽的冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白的S1次單元。在特定實施例中，編碼的S蛋白S1次單元包含SEQ ID NO: 44之胺基酸序列。在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼具有信號肽的冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白的S1次單元，且其中該治療性核酸包含SEQ ID NO: 45之DNA編碼序列。在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸編碼具有信號肽的冠狀病毒SARS-CoV-2之S蛋白的S1次單元，且其中該治療性核酸包含自SEQ ID NO: 45之DNA編碼序列轉錄之RNA序列。在一些實施例中，RNA序列係在活體外轉錄的。在特定實施例中，核酸分子係mRNA分子。
在其他實施例中，信號肽係由不存在於作為病毒肽或多肽來源之冠狀病毒中的外源基因序列編碼。在一些實施例中，異源信號肽替代由本揭示案之核酸分子編碼之融合蛋白中的同源信號肽。在特定實施例中，信號肽係由哺乳動物基因編碼。在特定實施例中，信號肽係由人免疫球蛋白基因編碼。在特定實施例中，信號肽係由人IgE基因編碼。舉例而言，在一些實施例中，具有MDWTWILFLVAAATRVHS之胺基酸序列(SEQ ID NO: 38)的信號肽與由本揭示案之核酸分子編碼的病毒肽或多肽融合。在各種實施例中，病毒肽或蛋白質係選自以下之一或多種：(a) N蛋白、(b) M蛋白、(c) E蛋白、(d) S蛋白、(e) HE蛋白、(f) (a)至(e)中任一種之免疫原性片段以及(g) (a)至(f)中任一種之功能性衍生物。6.3.25' 帽結構
不受理論束縛，經審慎考慮，聚核苷酸之5'-帽結構參與核輸出並增加聚核苷酸穩定性，且結合mRNA帽結合蛋白(CBP)，CBP負責細胞中之聚核苷酸穩定性，且經由CBP與聚A結合蛋白締合形成成熟環狀mRNA物種來引起轉譯能力。5'-帽結構進一步有助於mRNA剪接期間5'-近端內含子之移除。因此，在一些實施例中，本揭示案之核酸分子包含5'-帽結構。
核酸分子可在5'端經細胞內源性轉錄機構戴帽，由此在聚核苷酸的末端鳥苷帽殘基與5'末端轉錄之有義核苷酸之間產生5'-ppp-5'-三磷酸鍵聯。接著，此5'-鳥苷酸帽可經甲基化以產生N7-甲基-鳥苷酸殘基。聚核苷酸5'端之末端及/或末端前(anteterminal)轉錄之核苷酸的核糖亦可視情況經2'-O-甲基化。經由鳥苷酸帽結構水解及裂解進行的5'-脫帽可靶向降解的核酸分子，諸如mRNA分子。
在一些實施例中，本揭示案之核酸分子包含對由內源過程產生的天然5'-帽結構的一或多個改變。不受理論束縛，對5'-帽之修飾可增加聚核苷酸之穩定性，增加聚核苷酸之半衰期，且可增加聚核苷酸之轉譯效率。
對天然5'-帽結構之示例性改變包括產生不可水解之帽結構，以防止脫帽，並由此增加聚核苷酸之半衰期。在一些實施例中，因為帽結構水解需要裂解5'-ppp-5'磷酸二酯鍵，所以在一些實施例中，可在戴帽反應期間使用經修飾之核苷酸。舉例而言，在一些實施例中，可根據製造商之說明書，將來自New England Biolabs (Ipswich, Mass.)之牛痘病毒戴帽酶(Vaccinia Capping Enzyme)用於α-硫代鳥苷核苷酸以在5'-ppp-5'帽中產生硫代磷酸酯鍵聯。可使用額外經修飾之鳥苷核苷酸，諸如α-甲基膦酸及硒代磷酸核苷酸。
對於天然5'-帽結構之額外示例性改變亦包括在戴帽之鳥苷三磷酸(GTP)的2'位及/或3'位的修飾、糖環氧(產生碳環之氧)替代為亞甲基部分(CH2 )、在帽結構之三磷酸橋部分處的修飾或在核鹼基(G)部分處之修飾。
對於天然5'-帽結構之額外示例性改變包括但不限於聚核苷酸5'-末端及/或5'-末端前核苷酸之核糖在糖2'-羥基上的2'-O-甲基化(如上所述)。可使用多個不同的5'-帽結構產生聚核苷酸(諸如mRNA分子)之5'-帽。可與本揭示案結合使用的額外示例性5'-帽結構進一步包括國際專利公開案第WO2008127688號、第WO 2008016473號及第WO 2011015347號中描述者，各案之全部內容以引用之方式併入本文。
在各個實施例中，5'-末端帽可包括帽類似物。帽類似物，在本文中又稱為合成帽類似物、化學帽、化學帽類似物、或結構或功能性帽類似物，在其化學上不同於天然(亦即，內源性、野生型或生理性) 5'-帽結構，同時保留帽功能。帽類似物可按化學方式(亦即，非酶方式)或酶方式合成及/或連接至聚核苷酸。
舉例而言，抗反向帽類似物(ARCA)帽含有經5'-5'-三磷酸酯基團連接之兩個鳥苷，其中一個鳥苷含有N7-甲基以及3'-O-甲基(亦即，N7,3'-O-二甲基-鳥苷-5'-三磷酸-5'-鳥苷、m7 G-3'mppp-G，其可等效地稱為3'O-Me-m7G(5')ppp(5')G)。另一個未改變之鳥苷的3'-O原子與戴帽聚核苷酸(例如mRNA)之5'-末端核苷酸連接。N7-及3'-O-甲基化之鳥苷提供戴帽聚核苷酸(例如mRNA)之末端部分。另一個示例性的帽結構為mCAP，其類似於ARCA，但在鳥苷上具有2'-O-甲基(即 ，N7,2'-O-二甲基-鳥苷-5'-三磷酸-5'-鳥苷，m7 Gm-ppp-G)。
在一些實施例中，帽類似物可為二核苷酸帽類似物。作為非限制性實例，二核苷酸帽類似物可在不同磷酸酯位置處用硼烷磷酸酯基(boranophosphate)或硒代磷酸酯基(phophoroselenoate)進行修飾，諸如美國專利第8,519,110號中所描述之二核苷酸帽類似物，該案全部內容以全文引用的方式併入本文。
在一些實施例中，帽類似物可為此項技術中已知及/或本文所描述的N7-(4-氯苯氧基乙基)取代之二核苷酸帽類似物。N7-(4-氯苯氧基乙基)取代之二核苷酸帽類似物的非限制性實例包括N7-(4-氯苯氧基乙基)-G(5')ppp(5')G及N7-(4-氯苯氧基乙基)-m3'-OG(5')ppp(5')G帽類似物(參見例如Kore等人 , Bioorganic & Medicinal Chemistry 2013 21:4570-4574中所述之各種帽類似物及合成帽類似物之方法；該文獻之完整內容以引用之方式併入本文中)。在其他實施例中，可與本揭示案之核酸分子結合使用的帽類似物係4-氯/溴苯氧基乙基類似物。
在各個實施例中，帽類似物可包括鳥苷類似物。有用的鳥苷類似物包括但不限於肌苷、N1-甲基-鳥苷、2'-氟-鳥苷、7-脫氮-鳥苷、8-側氧基-鳥苷、2-胺基-鳥苷、LNA-鳥苷及2-疊氮基-鳥苷。
不受理論束縛，經審慎考慮，儘管帽類似物允許在活體外轉錄反應中同時進行聚核苷酸之戴帽，但高達20%之轉錄物仍未戴帽。此情形以及帽類似物與細胞內源轉錄機構產生之聚核苷酸之天然5'-帽結構的結構差異可能導致轉譯能力減弱及細胞穩定性降低。
因此，在一些實施例中，本揭示案之核酸分子亦可使用酶在轉錄後戴帽，以便產生更真實(authentic)之5'-帽結構。如本文所使用，短語「更真實」係指一種特徵在結構上或功能上密切反映或模仿內源或野生型特徵。亦即，與先前技術之合成特徵或類似物相比，「更真實」之特徵更好地代表內源性、野生型、天然或生理細胞功能及/或結構，或者其在一或多個方面勝過相應內源性、野生型、天然或生理特徵。可與本揭示案之核酸分子結合使用的更真實之5'-帽結構的非限制性實例為相較於此項技術中已知之合成5'-帽結構(或相較於野生型、天然或生理性5'-帽結構)，尤其具有增強的與帽結合蛋白之結合、增加之半衰期、降低的對5'-核酸內切酶之敏感性及/或減少之5'-脫帽的結構。舉例而言，在一些實施例中，重組牛痘病毒戴帽酶及重組2'-O-甲基轉移酶可在聚核苷酸之5'-末端核苷酸與鳥苷帽核苷酸之間產生經典的5'-5'-三磷酸酯鍵聯，其中帽鳥苷含有N7-甲基化，且聚核苷酸之5'-末端核苷酸含有2'-O-甲基。此類結構稱為帽1結構。與例如此項技術中已知之其他5'帽類似物結構相比，此帽引起更高之轉譯能力、細胞穩定性及減少的細胞促炎性細胞介素之活化。其他示例性帽結構包括7mG(5’)ppp(5’)N,pN2p (帽0)、7mG(5’)ppp(5’)NlmpNp (帽1)、7mG(5’)-ppp(5’)NlmpN2mp (帽2)及m(7)Gpppm(3)(6,6,2’)Apm(2’)Apm(2’)Cpm(2)(3,2’)Up (帽4)。
不受理論束縛，經審慎考慮，本揭示案之核酸分子可在轉錄後戴帽，且由於此方法較為高效，故幾乎100%之核酸分子可經戴帽。6.3.3 非轉譯區 (UTR)
在一些實施例中，本揭示案之核酸分子包含一或多個非轉譯區(UTR)。在一些實施例中，UTR位於核酸分子中編碼區之上游，並被稱為5'-UTR。在一些實施例中，UTR位於核酸分子中編碼區之下游，並被稱為3'-UTR。UTR之序列可與核酸分子中所發現之編碼區的序列同源或異源。多個UTR可包括在核酸分子中，且可具有相同或不同的序列及/或基因起源。根據本揭示案，核酸分子中UTR之任何部分(不包括任何部分)可經密碼子優化，且任何部分可在密碼子優化之前及之後獨立地含有一或多個不同的結構或化學修飾。
在一些實施例中，本揭示案之核酸分子(例如mRNA)包含相對於彼此同源的UTR及編碼區。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子(例如mRNA)包含相對於彼此為異源的UTR及編碼區。在一些實施例中，為了監測UTR序列之活性，可在活體外(例如細胞或組織培養物)或在活體內(例如向個體)投與包含UTR及可偵測探針之編碼序列的核酸分子，且可使用此項技術中已知之方法量測UTR序列之作用(例如調節表現量、編碼產物之細胞定位或編碼產物之半衰期)。
在一些實施例中，本揭示案之核酸分子(例如mRNA)的UTR包含至少一個轉譯強化子元件(TEE)，該TEE起到增加由該核酸分子產生之多肽或蛋白質之量的作用。在一些實施例中，TEE位於核酸分子之5'-UTR中。在其他實施例中，TEE位於核酸分子之3'-UTR處。在又其他實施例中，至少兩個TEE分別位於核酸分子之5'-UTR及3'-UTR處。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子(例如mRNA)可包含一或多個拷貝之TEE序列或包含多於一個不同的TEE序列。在一些實施例中，存在於本揭示案之核酸分子中的不同TEE序列可相對於彼此為同源的或異源的。
各種TEE序列係此項技術中已知的且可與本揭示案結合使用。舉例而言，在一些實施例中，TEE可為內部核糖體進入位點(IRES)、HCV-IRES或IRES元件。Chappell等人 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:9590-9594, 2004；Zhou等人 ,Proc. Natl. Acad. Sci. 102:6273-6278, 2005。可與本揭示案結合使用的額外內部核糖體進入位點(IRES)包括但不限於美國專利第7,468,275號、美國專利公開案第2007/0048776號及美國專利公開案第2011/0124100號，以及國際專利公開案第 WO2007/025008號及國際專利公開案第WO2001/055369號中所述之IRES，各案之內容以全文引用之方式併入本文。在一些實施例中，TEE可為Wellensiek等人, Genome-wide profiling of human cap-independent translation-enhancing elements,Nature Methods , 2013年8月; 10(8): 747–750之補充表1及補充表2中所述之TEE；各文獻之內容以全文引用之方式併入本文中。
可與本揭示案結合使用的額外示例性TEE包括但不限於美國專利第6,310,197號、美國專利第6,849,405號、美國專利第7,456,273號、美國專利第7,183,395號、美國專利公開案第2009/0226470號、美國專利公開案第2013/0177581號、美國專利公開案第2007/0048776號、美國專利公開案第2011/0124100號、美國專利公開案第2009/0093049號、國際專利公開案第WO2009/075886號、國際專利公開案第WO2012/009644號及國際專利公開案第WO1999/024595號、國際專利公開案第WO2007/025008號、國際專利公開案第WO2001/055371號、歐洲專利第2610341號、歐洲專利第2610340號中所述之TEE序列，各案之內容以全文引用之方式併入本文中。
在各種實施例中，本揭示案之核酸分子(例如mRNA)包含至少一個UTR，其包含至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或超過60個TEE序列。在一些實施例中，核酸分子UTR中之TEE序列係該TEE序列之拷貝。在其他實施例中，核酸分子UTR中之至少兩個TEE序列具有不同的TEE序列。在一些實施例中，多個不同的TEE序列以一或多種重複模式佈置於核酸分子之UTR區中。僅出於說明之目的，重複模式可為例如ABABAB、AABBAABBAABB、ABCABCABC或類似物，其中在此等示例性模式中，每個大寫字母(A、B或C)代表不同的TEE序列。在一些實施例中，在核酸分子之UTR中，至少兩個TEE序列彼此為連續的(亦即，其間無間隔子序列)。在其他實施例中，至少兩個TEE序列藉由間隔子序列隔開。在一些實施例中，UTR可包含TEE序列-間隔子序列模組，該模組在UTR中重複至少一次、至少兩次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次或更多次。在本段中描述之任何實施例中，UTR可為核酸分子之5'-UTR、3'-UTR或5'-UTR及3'-UTR兩者。
在一些實施例中，本揭示案之核酸分子(例如mRNA)的UTR包含至少一個轉譯抑制元件，該元件起到減少由該核酸分子產生之多肽或蛋白質之量的作用。在一些實施例中，核酸分子之UTR包含經一或多個小RNA識別的一或多個miR序列或其片段(例如miR種子序列)。在一些實施例中，核酸分子之UTR包含下調核酸分子之轉譯活性的一或多個莖-環結構。用於抑制與核酸分子相關之轉譯活性的其他機制係此項技術中已知的。在本段中描述之任何實施例中，UTR可為核酸分子之5'-UTR、3'-UTR或5'-UTR及3'-UTR兩者。表 5 顯示出可與本揭示案結合使用的示例性5'-UTR及3'-UTR序列。表 5 示例性非轉譯區 (UTR) 序列 .
序列名稱(SEQ ID NO:) 胺基酸或核酸序列
5'-UTR DNA序列(SEQ ID NO: 46) GAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGA
5'-UTR RNA序列(SEQ ID NO: 47) GAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGA
5'-UTR DNA序列(SEQ ID NO: 48) CTTGTTCTTTTTGCAGAAGCTCAGAATAAACGCTCAACTTTGG
5'-UTR RNA序列(SEQ ID NO: 49) CUUGUUCUUUUUGCAGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGG
5'-UTR DNA序列(SEQ ID NO: 50) GCAGGAGCCAGGGCTGGGCATAAAAGTCAGGGCAGAGCCATCTATTGCTTACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACC
5'-UTR RNA序列(SEQ ID NO: 51) GCAGGAGCCAGGGCUGGGCAUAAAAGUCAGGGCAGAGCCAUCUAUUGCUUACAUUUGCUUCUGACACAACUGUGUUCACUAGCAACCUCAAACAGACACC
3'-UTR DNA序列(SEQ ID NO: 52) TAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC
3'-UTR RNA序列(SEQ ID NO: 53) UAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC
3'-UTR DNA序列(SEQ ID NO: 54) GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGC
3'-UTR RNA序列(SEQ ID NO: 55) GCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCCUUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUUGAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGC
3'-UTR DNA序列(SEQ ID NO: 56) CTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCCCAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACC
3'-UTR RNA序列(SEQ ID NO: 57) CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACC
在特定實施例中，本揭示案之核酸分子包含選自SEQ ID NO: 46-51之5'-UTR。在特定實施例中，本揭示案之核酸分子包含選自SEQ ID NO: 52-57之3'-UTR。在特定實施例中，本揭示案之核酸分子包含選自SEQ ID NO: 46-51之5'-UTR及選自SEQ ID NO: 52-57之3'-UTR。在本段中描述之任何實施例中，核酸分子可進一步包含具有如第 6.3.1 節 中所述之序列的編碼區，諸如表1至4中之任何DNA編碼序列或其等效RNA序列。在特定實施例中，本段中描述之核酸分子可為活體外轉錄之RNA分子。6.3.4 聚腺苷酸化 ( 聚 A) 區
在天然RNA加工過程中，通常將長鏈腺苷核苷酸(聚A區)添加至信使RNA (mRNA)分子中以增加該分子之穩定性。轉錄後，立即將轉錄物之3'-端裂解以釋放3'-羥基。接著，聚A聚合酶將一連串腺苷核苷酸添加至RNA中。該過程稱為聚腺苷酸化，添加一個長度在100與250個殘基之間之的聚A區。不受理論束縛，經審慎考慮，聚A區可賦予本揭示案之核酸分子多個優點。
因此，在一些實施例中，本揭示案之核酸分子(例如mRNA)包含聚腺苷酸化信號。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子(例如mRNA)包含一或多個聚腺苷酸化(聚A)區。在一些實施例中，聚A區完全由腺嘌呤核苷酸或其功能性類似物構成。在一些實施例中，核酸分子在其3'端包含至少一個聚A區。在一些實施例中，核酸分子在其5'端包含至少一個聚A區。在一些實施例中，核酸分子在其5'末端包含至少一個聚A區且在其3'端包含至少一個聚A區。
根據本揭示案，在不同實施例中，聚A區可具有不同長度。詳言之，在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少30個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少35個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少40個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少45個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少50個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少55個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少60個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少65個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少70個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少75個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少80個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少85個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少90個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少95個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少100個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少110個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少120個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少130個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少140個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少150個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少160個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少170個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少180個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少190個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少200個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少225個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少250個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少275個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少300個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少350個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少400個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少450個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少500個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少600個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少700個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少800個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少900個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少1000個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少1100個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少1200個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少1300個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少1400個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少1500個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少1600個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少1700個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少1800個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少1900個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少2000個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少2250個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少2500個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少2750個核苷酸。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子之聚A區的長度為至少3000個核苷酸。
在一些實施例中，核酸分子中聚A區之長度可基於核酸分子或其部分之總體長度(諸如核酸分子的編碼區之長度或開放閱讀框之長度等)選擇。舉例而言，在一些實施例中，聚A區佔含有聚A區之核酸分子之總長度的約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高百分比。
不受理論束縛，經審慎考慮，某些RNA結合蛋白可結合至位於mRNA分子3'端之聚A區。此等聚A結合蛋白(PABP)可調節mRNA表現，諸如與細胞中之轉譯起始機構相互作用及/或保護3'-聚A尾免於降解。因此，在一些實施例中，本揭示案之核酸分子(例如mRNA)包含聚A結合蛋白(PABP)之至少一個結合位點。在其他實施例中，在將核酸分子裝載至遞送媒劑(例如脂質奈米粒子)中之前，使其與PABP形成結合物或複合物。
在一些實施例中，本揭示案之核酸分子(例如mRNA)包含聚A-G四聯體。G四聯體係DNA及RNA中可由富含G之序列形成的氫鍵接之四個鳥苷核苷酸之環狀陣列。在此實施例中，將G四聯體併入聚A區之一端。可分析所得聚核苷酸(例如mRNA)之穩定性、蛋白質產生及其他參數，包括在不同時間點之半衰期。已發現，聚A-G四聯體結構之蛋白質產量等於僅使用含120個核苷酸之聚A區所觀察到的蛋白質產量之至少75%。
在一些實施例中，本揭示案之核酸分子(例如mRNA)可包括聚A區且可藉由添加3'-穩定區來穩定。在一些實施例中，可用於使核酸分子(例如mRNA)穩定之3'-穩定區包括國際專利公開案第WO2013/103659號中所述之聚A或聚A-G四聯體結構，該公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。
在其他實施例中，可與本揭示案之核酸分子結合使用的3'-穩定區包括鏈終止核苷，諸如但不限於3'-脫氧腺苷(蟲草素(cordycepin))；3'-脫氧尿苷；3'-脫氧胞嘧啶；3'-脫氧鳥苷；3'-脫氧胸腺嘧啶；2’,3’-雙脫氧核苷，諸如2’,3’-雙脫氧腺苷、2’,3’-雙脫氧尿苷、2’,3’-雙脫氧胞嘧啶、2’,3’-雙脫氧鳥苷、2’,3’-雙脫氧胸腺嘧啶；2'-脫氧核苷；或O-甲基核苷；3'-脫氧核苷；2’,3’-雙脫氧核苷；3'-O-甲基核苷；3'-O-乙基核苷；3'-阿拉伯糖苷，及此項技術中已知及/或本文所描述的其他替代性核苷。6.3.5 二級結構
不受理論束縛，經審慎考慮，莖-環結構可引導RNA摺疊，保護核酸分子(例如mRNA)之結構穩定性，提供RNA結合蛋白之識別位點，並用作酶反應之受質。舉例而言，miR序列及/或TEE序列之併入將改變莖-環區之形狀，由此可增加及/或減少轉譯(Kedde等人 , A Pumilio-induced RNA structure switch in p27-3’UTR controls miR-221 and miR-222 accessibility.Nat Cell Biol. , 2010年10月; 12(10):1014-20，該文獻之內容以全文引用之方式併入本文中)。
因此，在一些實施例中，本文所述之核酸分子(例如mRNA)或其一部分可呈莖-環結構，諸如但不限於組蛋白莖-環。在一些實施例中，莖-環結構由長度為約25個或約26個核苷酸之莖-環序列形成，諸如但不限於國際專利公開案第WO2013/103659號中所述之結構，該案內容以全文引用之方式併入本文中。莖-環序列之額外實例包括國際專利公開案第WO2012/019780號及國際專利公開案第WO201502667號中所述之序列，各案內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，莖-環序列包含如本文所述之TEE。在一些實施例中，莖-環序列包含如本文所述之miR序列。在特定實施例中，莖環序列可包括miR-122種子序列(seed sequence)。在特定實施例中，核酸分子包含莖-環序列CAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACCA (SEQ ID NO:58)。在其他實施例中，核酸分子包含莖-環序列CAAAGGCUCUUUUCAGAGCCACCA (SEQ ID NO:59)。
在一些實施例中，本揭示案之核酸分子(例如mRNA)包含位於核酸分子中編碼區上游(在5'端)之莖-環序列。在一些實施例中，莖-環序列位於核酸分子5'-UTR內。在一些實施例中，本揭示案之核酸分子(例如mRNA)包含位於核酸分子中編碼區下游(在3'端)之莖-環序列。在一些實施例中，莖-環序列位於核酸分子3'-UTR內。在一些情況下，核酸分子可含有多於一個莖-環序列。在一些實施例中，核酸分子在5'-UTR中包含至少一個莖-環序列且在3'-UTR中包含至少一個莖-環序列。
在一些實施例中，包含莖-環結構之核酸分子進一步包含穩定區。在一些實施例中，穩定區包含至少一個鏈終止核苷，其起到減慢降解並由此增加核酸分子之半衰期的作用。可與本揭示案之核酸分子結合使用的示例性鏈終止核苷包括但不限於3'-脫氧腺苷(蟲草素)；3'-脫氧尿苷；3'-脫氧胞嘧啶；3'-脫氧鳥苷；3'-脫氧胸腺嘧啶；2’,3’-雙脫氧核苷，諸如2’,3’-雙脫氧腺苷、2’,3’-雙脫氧尿苷、2’,3’-雙脫氧胞嘧啶、2’,3’-雙脫氧鳥苷、2’,3’-雙脫氧胸腺嘧啶；2'-脫氧核苷；或O-甲基核苷；3'-脫氧核苷；2’,3’-雙脫氧核苷；3'-O-甲基核苷；3'-O -乙基核苷；3'-阿拉伯糖苷，及此項技術中已知及/或本文所描述的其他替代性核苷。在其他實施例中，莖-環結構可藉由改變聚核苷酸之3'-區域來穩定，該改變可防止及/或抑制寡聚(U)之添加(國際專利公開案第WO2013/103659號，以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，本揭示案之核酸分子包含至少一個莖-環序列及聚A區或聚腺苷酸化信號。包含至少一個莖-環序列及聚A區或聚腺苷酸化信號之聚核苷酸序列的非限制性實例包括國際專利公開案第WO2013/120497號、國際專利公開案第WO2013/120629號、國際專利公開案第WO2013/120500號、國際專利公開案第WO2013/120627號、國際專利公開案第WO2013/120498號、國際專利公開案第WO2013/120626號、國際專利公開案第WO2013/120499號及國際專利公開案第WO2013/120628號中所述之序列，各案內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，包含莖-環序列及聚A區或聚腺苷酸化信號之核酸分子可編碼病原體抗原或其片段，諸如國際專利公開案第WO2013/120499號及國際專利公開案第WO2013/120628號中所述之聚核苷酸序列，各案內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，包含莖-環序列及聚A區或聚腺苷酸化信號之核酸分子可編碼治療性蛋白質，諸如國際專利公開案第WO2013/120497號及國際專利公開案第WO2013/120629號中所述之聚核苷酸序列，各案內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，包含莖-環序列及聚A區或聚腺苷酸化信號之核酸分子可編碼腫瘤抗原或其片段，諸如國際專利公開案第WO2013/120500號及國際專利公開案第WO2013/120627號中所述之聚核苷酸序列，各案內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，包含莖-環序列及聚A區或聚腺苷酸化信號之核酸分子可編碼致敏性抗原或自體免疫性自體抗原，諸如國際專利公開案第WO2013/120498號及國際專利公開案第WO2013/120626號中所述之聚核苷酸序列，各案內容以全文引用之方式併入本文中。6.3.6 功能性核苷酸類似物
在一些實施例中，本文所述之有效負載核酸分子僅含有選自A (腺苷)、G (鳥苷)、C (胞嘧啶)、U (尿苷)及T (胸苷)之經典核苷酸。不受理論束縛，經審慎考慮，某些功能性核苷酸類似物可賦予核酸分子有用的特性。在本揭示案之上下文中，此類有用特性之實例包括但不限於核酸分子之穩定性增加、核酸分子在誘導先天免疫反應中之免疫原性降低、由核酸分子編碼之蛋白質的產量增加、核酸分子之細胞內遞送及/或保留增加，及/或核酸分子之細胞毒性降低等。
因此，在一些實施例中，有效負載核酸分子包含至少一種如本文所述之功能性核苷酸類似物。在一些實施例中，功能性核苷酸類似物含有至少一個針對核鹼基、糖基及/或磷酸酯基的化學修飾。因此，包含至少一種功能性核苷酸類似物的有效負載核酸分子含有至少一個針對核鹼基、糖基及/或核苷間鍵聯的化學修飾。本文提供對核酸分子之核鹼基、糖基或核苷間鍵聯之示例性化學修飾。
如本文所述，有效負載核酸分子中所有核苷酸的0%至100%範圍之核苷酸可以為如本文所述之功能性核苷酸類似物。舉例而言，在各個實施例中，核酸分子中之所有核苷酸中約1%至約20%、約1%至約25%、約1%至約50%、約1%至約60%、約1%至約70%、約1%至約80%、約1%至約90%、約1%至約95%、約10%至約20%、約10%至約25%、約10%至約50%、約10%至約60%、約10%至約70%、約10%至約80%、約10%至約90%、約10%至約95%、約10%至約100%、約20%至約25%、約20%至約50%、約20%至約60%、約20%至約70%、約20%至約80%、約20%至約90%、約20%至約95%、約20%至約100%、約50%至約60%、約50%至約70%、約50%至約80%、約50%至約90%、約50%至約95%、約50%至約100%、約70%至約80%、約70%至約90%、約70%至約95%、約70%至約100%、約80%至約90%、約80%至約95%、約80%至約100%、約90%至約95%、約90%至約100%、或約95%至約100%的核苷酸係本文所述之功能性核苷酸類似物。在該等實施例中之任一個中，功能性核苷酸類似物可存在於核酸分子之任何位置處，包括5'-末端、3'-末端及/或一或多個內部位置。在一些實施例中，單個核酸分子可含有不同的糖修飾、不同的核鹼基修飾及/或不同類型的核苷間鍵聯(例如主鏈結構)。
如本文所述，有效負載核酸分子中一種類型之所有核苷酸(例如作為一種類型的所有含嘌呤核苷酸、或作為一種類型的所有含嘧啶核苷酸、或作為一種類型的所有A、G、C、T或U)中範圍自0%至100%之核苷酸可為本文所述之功能性核苷酸類似物。舉例而言，在各個實施例中，核酸分子中一種類型之所有核苷酸中約1%至約20%、約1%至約25%、約1%至約50%、約1%至約60%、約1%至約70%、約1%至約80%、約1%至約90%、約1%至約95%、約 10%至約20%、約10%至約25%、約10%至約50%、約10%至約60%、約10%至約70%、約10%至約80%、約10%至約90%、約10%至約95%、約10%至約100%、約20%至約25%、約20%至約50%、約20%至約60%、約20%至約70%、約20%至約80%、約20%至約90%、約20%至約95%、約20%至約100%、約50%至約60%、約50%至約70%、約50%至約80%、約50%至約90%、約50%至約95%、約50%至約100%、約70%至約80%、約70%至約90%、約70%至約95%、約70%至約100%、約80%至約90%、約80%至約95%、約80%至約100%、約90%至約95%、約90%至約100%、或約95%至約100%的核苷酸係本文所述之功能性核苷酸類似物。在該等實施例中之任一個中，功能性核苷酸類似物可存在於核酸分子之任何位置處，包括5'-末端、3'-末端及/或一或多個內部位置。在一些實施例中，單個核酸分子可含有不同的糖修飾、不同的核鹼基修飾及/或不同類型的核苷間鍵聯(例如主鏈結構)。6.3.7 核鹼基之修飾
在一些實施例中，功能性核苷酸類似物含有非經典核鹼基。在一些實施例中，核苷酸中之經典核鹼基(例如腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶及胞嘧啶)可經修飾或置換以提供該核苷酸之一或多種功能性類似物。核鹼基之示例性修飾包括但不限於一或多個取代或修飾，包括但不限於烷基、芳基、鹵基、側氧基、羥基、烷氧基及/或硫代取代；一或多個稠環或開環、氧化及/或還原。
在一些實施例中，非經典核鹼基係經修飾之尿嘧啶。具有經修飾之尿嘧啶的示例性核鹼基及核苷包括假尿苷(ψ)、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮雜尿嘧啶、6-氮雜尿嘧啶、2-硫代-5-氮雜尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶(s2 U)、4-硫代-尿嘧啶(s4 U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羥基-尿嘧啶(ho5 U)、5-胺基烯丙基-尿嘧啶、5-鹵代尿嘧啶(例如5-碘尿嘧啶或5-溴尿嘧啶)、3-甲基尿嘧啶(m3 U)、5-甲氧基尿嘧啶(mo5 U)、尿嘧啶5-氧乙酸(cmo5 U)、尿嘧啶5-氧乙酸甲酯(mcmo5 U)、5-羧甲基-尿嘧啶(cm5 U)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羥甲基-尿嘧啶(chm5 U)、5-羧基羥甲基-尿嘧啶甲酯(mchm5 U)、5-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶(mcm5 U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿嘧啶(mcm5 s2 U)、5-胺基甲基-2-硫代尿嘧啶(nm5 s2 U)、5-甲基胺基甲基尿嘧啶(mnm5 U)、5-甲基胺基甲基-2-硫代尿嘧啶(mnm5 s2 U)、5-甲基胺基甲基-2-硒代尿嘧啶(mnm5 se2 U)、5-胺甲醯基甲基尿嘧啶(ncm5 U)、5-羧甲基胺基甲基-尿嘧啶(cmnm5 U)、5-羧甲基胺基甲基-2-硫代尿嘧啶(cmnm5 s2 U)、5-丙炔基-尿嘧啶、1-丙炔基-假尿嘧啶、5-牛磺酸甲基-尿嘧啶(τm5 U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿嘧啶(τm5 5s2 U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-尿嘧啶(m5 U，亦即，具有核鹼基脫氧胸腺嘧啶)、1-甲基-假尿苷(m1 ψ)、1-乙基-假尿苷(Et1 ψ)、5-甲基-2-硫代-尿嘧啶(m5 s2 U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1 s4 ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3 ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脫氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脫氮-假尿苷、二氫尿嘧啶(D)、二氫假尿苷, 5,6-二氫尿嘧啶、5-甲基-二氫尿嘧啶(m5 D)、2-硫代-二氫尿嘧啶、2-硫代-二氫假尿苷、2-甲氧基-尿嘧啶、2-甲氧基-4-硫代-尿嘧啶、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-胺基-3-羧基丙基)尿嘧啶(acp3 U)、1-甲基-3-(3-胺基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3 ψ)、5-(異戊烯基胺基甲基)尿嘧啶(m5 U)、5-(異戊烯基胺基甲基)-2-硫代-尿嘧啶(m5 s2 U)、5,2’-O-二甲基-尿嘧啶 (m5 Um)、2-硫代-2’-O-甲基-尿嘧啶(s2 Um)、5-甲氧基羰甲基-2’-O-甲基-尿嘧啶(mcm5 Um)、5-胺甲醯基甲基-2’-O-甲基-尿嘧啶(ncm5 Um)、5-羧甲基胺基甲基-2’-O-甲基-尿嘧啶(cmnm5 Um)、3,2’-O-二甲基-尿嘧啶(m3 Um)及5-(異戊烯基胺基甲基)-2’-O-甲基-尿嘧啶(inm5 Um)、1-硫代-尿嘧啶、脫氧胸苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)-尿嘧啶、5-(胺甲醯基羥甲基)-尿嘧啶、5-胺甲醯基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-羧甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-氰基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-2-硫代-尿嘧啶及5-[3-(1-E-丙烯基胺基)]尿嘧啶。
在一些實施例中，非經典核鹼基係經修飾之胞嘧啶。具有經修飾之胞嘧啶的示例性核鹼基及核苷包括5-氮雜胞嘧啶、6-氮雜胞嘧啶、假異胞苷、3-甲基胞嘧啶(m3C)、N4-乙醯基胞嘧啶(ac4C)、5-甲醯基胞嘧啶(f5C)、N4-甲基-胞嘧啶(m4C)、5-甲基-胞嘧啶(m5C)、5-鹵代-胞嘧啶(例如 5-碘-胞嘧啶)、5-羥甲基-胞嘧啶(hm5C)、1-甲基-假異胞苷、吡咯并胞嘧啶、吡咯并假異胞苷、2-硫代胞嘧啶(s2C)、2-硫代-5-甲基胞嘧啶、4-硫代假異胞苷、4-硫代-1-甲基-假異胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脫氮-假異胞苷、1-甲基-1-脫氮-假異胞苷、澤布他林(zebularine)、5-氮雜-澤布他林、5-甲基-澤布他林、5-氮雜-2-硫代-澤布他林、2-硫代-澤布他林、2-甲氧基-胞嘧啶、2-甲氧基-5-甲基-胞嘧啶、4-甲氧基-假異胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假異胞苷、賴西丁(lysidine) (k2C)、5,2’-O-二甲基-胞苷(m5Cm)、N4-乙醯基-2’-O-甲基-胞苷(ac4Cm)、N4,2’-O-二甲基-胞苷(m4Cm)、5-甲醯基-2’-O-甲基-胞苷(fSCm)、N4,N4,2’-O-三甲基-胞苷(m42Cm)、1-硫代-胞嘧啶、5-羥基-胞嘧啶、5-(3-疊氮基丙基)-胞嘧啶及5-(2-疊氮基乙基)-胞嘧啶。
在一些實施例中，非經典核鹼基係經修飾之腺嘌呤。具有替代性腺嘌呤之示例性核鹼基及核苷包括2-胺基-嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、2-胺基-6-鹵代-嘌呤(例如2-胺基-6-氯-嘌呤)、6-鹵代-嘌呤(例如6-氯-嘌呤)、2-胺基-6-甲基-嘌呤、8-疊氮基-腺嘌呤、7-脫氮-腺嘌呤、7-脫氮-8-氮雜-腺嘌呤、7-脫氮-2-胺基-嘌呤、7-脫氮-8-氮雜-2-胺基-嘌呤、7-脫氮-2,6-二胺基嘌呤、7-脫氮-8-氮雜-2,6-二胺基嘌呤、1-甲基-腺嘌呤(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺嘌呤(m6A)、2-甲硫基-N6-甲基-腺嘌呤(ms2m6A)、N6-異戊烯基-腺嘌呤(i6A)、2-甲硫基-N6-異戊烯基-腺嘌呤(ms2i6A)、N6-(順-羥基異戊烯基)腺嘌呤(io6A)、2-甲硫基-N6-(順-羥基異戊烯基)腺嘌呤(ms2io6A)、N6-甘胺醯基胺甲醯基-腺嘌呤(g6A)、N6-蘇胺醯基胺甲醯基-腺嘌呤(t6A)、N6-甲基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基-腺嘌呤(m6t6A)、2-甲硫基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基-腺嘌呤(ms2g6A)、N6,N6-二甲基-腺嘌呤(m62A)、N6-羥基正纈胺醯基胺甲醯基-腺嘌呤(hn6A)、2-甲硫基-N6-羥基正纈胺醯基胺甲醯基-腺嘌呤(ms2hn6A)、N6-乙醯基-腺嘌呤(ac6A)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、N6,2’-O-二甲基-腺苷(m6Am)、N6,N6,2’-O-三甲基-腺苷(m62Am)、1,2’-O-二甲基-腺苷(m1Am)、2-胺基-N6-甲基-嘌呤、1-硫代-腺嘌呤、8-疊氮基-腺嘌呤、N6-(19-胺基-五氧雜十九烷基)-腺嘌呤、2,8-二甲基-腺嘌呤、N6-甲醯基-腺嘌呤及N6-羥甲基-腺嘌呤。
在一些實施例中，非經典核鹼基係經修飾之鳥嘌呤。具有經修飾之鳥嘌呤的示例性核鹼基及核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、懷俄苷(wyosine) (imG)、甲基懷俄苷(mimG)、4-脫甲基-懷俄苷(imG-14)、異懷俄苷(imG2)、懷丁苷(wybutosine) (yW)、戊氧基懷丁苷(o2yW)、羥基懷丁苷(OHyW)、未修飾之羥基懷丁苷(OHyW*)、7-脫氮-鳥嘌呤、Q苷(queuosine) (Q)、環氧Q苷(oQ)、半乳糖基-Q苷(galQ)、甘露糖基-Q苷(manQ)、7-氰基-7-脫氮-鳥嘌呤(preQO)、7-胺基甲基-7-脫氮-鳥嘌呤(preQ1)、古嘌苷(archaeosine) (G+)、7-脫氮-8-氮雜-鳥嘌呤、6-硫代-鳥嘌呤、6-硫代-7-脫氮-鳥嘌呤、6-硫代-7-脫氮-8-氮雜-鳥嘌呤、7-甲基-鳥嘌呤 (m7G)、6-硫代-7-甲基-鳥嘌呤、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鳥嘌呤、1-甲基-鳥嘌呤(m1G)、N2-甲基-鳥嘌呤(m2G)、N2,N2-二甲基-鳥嘌呤(m22G)、N2,7-二甲基-鳥嘌呤(m2,7G)、N2, N2,7-二甲基-鳥嘌呤(m2,2,7G)、8-側氧基-鳥嘌呤、7-甲基-8-側氧基-鳥嘌呤、1-甲基-6-硫代-鳥嘌呤、N2-甲基-6-硫代-鳥嘌呤、N2,N2-二甲基-6-硫代-鳥嘌呤、N2-甲基-2’-O-甲基-鳥苷(m2Gm)、N2,N2-二甲基-2’-O-甲基-鳥苷(m22Gm)、1-甲基-2’-O-甲基-鳥苷(m1Gm)、N2,7-二甲基-2’-O-甲基-鳥苷(m2,7Gm)、2’-O-甲基-肌苷(Im)、1,2’-O-二甲基-肌苷(m1Im)、1-硫代-鳥嘌呤及O-6-甲基-鳥嘌呤。
在一些實施例中，功能性核苷酸類似物之非經典核鹼基可獨立地為嘌呤、嘧啶、嘌呤或嘧啶類似物。舉例而言，在一些實施例中，非經典核鹼基可為經修飾之腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶或次黃嘌呤。在其他實施例中，非經典核鹼基亦可包括例如鹼基之天然存在的及合成的衍生物，包括吡唑并[3,4-d]嘧啶；5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羥甲基胞嘧啶；黃嘌呤；次黃嘌呤；2-胺基腺嘌呤；腺嘌呤及鳥嘌呤之6-甲基及其他烷基衍生物；腺嘌呤及鳥嘌呤之2-丙基及其他烷基衍生物；2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶及2-硫代胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶及胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫代尿嘧啶；8-鹵代(例如8-溴)、8-胺基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基及其他8-取代之腺嘌呤及鳥嘌呤；5-鹵代，尤其是5-溴、5-三氟甲基及其他5-取代之尿嘧啶及胞嘧啶；7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤；8-氮雜鳥嘌呤及8-氮雜腺嘌呤；脫氮鳥嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、3-脫氮鳥嘌呤；脫氮腺嘌呤、7-脫氮腺嘌呤、3-脫氮腺嘌呤；吡唑并[3,4-d]嘧啶；咪唑并[1,5-a] 1,3,5三𠯤酮；9-脫氮雜嘌呤；咪唑并[4,5- d ]吡𠯤；噻唑并[4,5-d]嘧啶；吡𠯤-2-酮；1,2,4-三𠯤；嗒𠯤；或1,3,5三𠯤。6.3.8 糖之修飾
在一些實施例中，功能性核苷酸類似物含有非經典糖基。在各個實施例中，非經典糖基可為具有一或多個取代之5-碳或6-碳糖(諸如戊糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖或其脫氧衍生物)，該一或多個取代諸如為鹵素、羥基、硫醇基、烷基、烷氧基、烯基氧基、炔基氧基、環烷基、胺基烷氧基、烷氧基烷氧基、羥基烷氧基、胺基、疊氮基、芳基、胺基烷基、胺基烯基、胺基炔基等。
一般而言，RNA分子含有核糖基，該核糖基係含氧5員環。示例性非限制性替代核苷酸包括核糖中之氧置換(例如用S、Se或伸烷基，諸如亞甲基或伸乙基置換)；雙鍵之添加(例如用環戊烯基或環己烯基置換核糖)；核糖之縮環(例如用於形成環丁烷或氧雜環丁烷之4員環)；核糖之擴環(例如用於形成具有額外碳或雜原子之6員或7員環，諸如對於失水己醣醇、阿卓糖醇(altritol)、甘露糖醇，環己烷基、環己烯基及N-𠰌啉基(其亦具有胺基磷酸酯主鏈))；多環形式(例如三環及「未鎖定」形式，諸如二醇核酸(GNA) (例如R-GNA或S-GNA，其中核糖經連接至磷酸二酯鍵之二醇單元置換)、蘇糖核酸(TNA，其中核糖經α-L-呋喃蘇糖基-(3’‎‎‎‎à2’)置換)及肽核酸(PNA，其中2-胺基-乙基-甘胺酸鍵聯置換核糖及磷酸二酯主鏈)。
在一些實施例中，糖基含有一或多個碳，該一或多個碳具有與核糖中相應碳相反之立體化學構形。因此，核酸分子可包括含例如阿拉伯糖或L-核糖作為糖之核苷酸。在一些實施例中，核酸分子包括至少一個核苷，其中糖係L-核糖、2'-O-甲基核糖、2'-氟核糖、阿拉伯糖、己糖醇、LNA或PNA。6.3.9 核苷間鍵聯之修飾
在一些實施例中，本揭示案之有效負載核酸分子可含有一或多個經修飾之核苷間鍵聯(例如磷酸酯主鏈)。主鏈磷酸酯基可藉由用不同取代基取代一或多個氧原子來改變。
在一些實施例中，功能性核苷酸類似物可包括用本文所述之另一個核苷間鍵聯置換未改變之磷酸酯部分。替代性磷酸酯基的實例包括但不限於硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸鹽、硼烷磷酸酯、膦酸氫酯、胺基磷酸酯、二胺基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯及磷酸三酯。二硫代磷酸酯的兩個非連接氧均經硫置換。亦可藉由用氮(橋連之胺基磷酸酯)、硫(橋連之硫代磷酸酯)及碳(橋連之亞甲基膦酸酯)置換連接氧來改變磷酸酯連接基。
替代性核苷及核苷酸可包括一或多個非橋連氧被甲硼烷部分(BH3 )、硫(硫代)、甲基、乙基及/或甲氧基置換。作為非限制性實例，在同一位置(例如alpha (α)、beta (β)或gamma (γ)位置)處的兩個非橋連氧可經硫(硫代)及甲氧基置換。置換磷酸酯部分(例如α-硫代磷酸酯)位置處之一或多個氧原子可經由非天然硫代磷酸酯主鏈鍵聯賦予RNA及DNA穩定性(諸如針對核酸外切酶及核酸內切酶的穩定性)。硫代磷酸酯DNA及RNA具有增加之核酸酶抗性，並因此在細胞環境中具有較長的半衰期。
本文描述可根據本揭示案使用的其他核苷間鍵聯，包括不含磷原子之核苷間鍵聯。
可結合本揭示案使用的核酸分子(例如mRNA)、相關組成物、調配物及/或方法的額外實例進一步包括WO2002/098443、WO2003/051401、WO2008/052770、WO2009127230、WO2006122828、WO2008/083949、WO2010088927、WO2010/037539、WO2004/004743、WO2005/016376、WO2006/024518、WO2007/095976、WO2008/014979、WO2008/077592、WO2009/030481、WO2009/095226、WO2011069586、WO2011026641、WO2011/144358、WO2012019780、WO2012013326、WO2012089338、WO2012113513、WO2012116811、WO2012116810、WO2013113502、WO2013113501、WO2013113736、WO2013143698、WO2013143699、WO2013143700、WO2013/120626、WO2013120627、WO2013120628、WO2013120629、WO2013174409、WO2014127917、WO2015/024669、WO2015/024668、WO2015/024667、WO2015/024665、WO2015/024666、WO2015/024664、WO2015101415、WO2015101414、WO2015024667、WO2015062738、WO2015101416中所述者，各案之內容以全文併入本文中。
本文所述之治療性核酸分子可藉由使用此項技術中已知之方法分離或合成。在一些實施例中，結合本揭示案使用之DNA或RNA分子係化學合成的。在其他實施例中，結合本揭示案使用之DNA或RNA分子係自天然來源分離。
在一些實施例中，結合本揭示案使用之mRNA分子係使用宿主細胞生物合成的。在特定實施例中，mRNA係藉由使用宿主細胞轉錄相應DNA序列產生。在一些實施例中，將編碼mRNA序列之DNA序列併入表現載體中，接著使用此項技術中已知之方法將該載體引入宿主細胞(例如大腸桿菌(E.coli ))中。接著，在適合條件下培養宿主細胞以產生mRNA轉錄物。由編碼DNA產生mRNA分子的其他方法係此項技術中已知的。舉例而言，在一些實施例中，可使用包含宿主細胞轉錄機構之酶的無細胞(活體外)轉錄系統產生mRNA轉錄物。示例性無細胞轉錄反應系統描述於本揭示案之實例 1 中。6.4 奈米粒子組成物
在一個態樣中，將本文所述之核酸分子調配成用於活體外及活體內遞送。具體言之，在一些實施例中，將核酸分子調配成含脂質組成物。在一些實施例中，該含脂質組成物形成將核酸分子封入脂質殼內的脂質奈米粒子。在一些實施例中，脂質殼保護核酸分子免於降解。在一些實施例中，脂質奈米粒子亦促進將封入之核酸分子轉運至細胞內隔室及/或機構中以發揮預定的治療或預防功能。在某些實施例中，核酸當存在於脂質奈米粒子中時，在水溶液中對核酸酶降解具有抗性。包含核酸之脂質奈米粒子及其製備方法係此項技術中已知的，諸如以下各案中所揭示者：例如美國專利公開案第2004/0142025號、美國專利公開案第2007/0042031號、PCT公開案第WO 2017/004143號、PCT公開案第WO 2015/199952號、PCT公開案第WO 2013/016058號及PCT公開案第WO 2013/086373號，各案全部揭示內容以全文引用之方式併入本文中用於所有目的。
在一些實施例中，當諸如藉由動態光散射(DLS)、透射電子顯微鏡檢查、掃描電子顯微鏡檢查或另一種方法量測時，本文提供之奈米粒子組成物的最大尺寸係1 μm或更短(例如≤1 μm、≤900 nm、≤800 nm、≤700 nm、≤600 nm、≤500 nm、≤400 nm、≤300 nm、≤200 nm、≤175 nm、≤150 nm、≤125 nm、≤100 nm、≤75 nm、≤50 nm或更短)。在一個實施例中，本文提供之脂質奈米粒子具有在約40至約200 nm範圍內的至少一個尺寸。在一個實施例中，該至少一個尺寸在約40至約100 nm範圍內。
可結合本揭示案使用之奈米粒子組成物包括例如脂質奈米粒子(LNP)、奈米脂蛋白粒子、脂質體、脂質囊泡及脂質複合物(lipoplex)。在一些實施例中，奈米粒子組成物係包括一或多個脂質雙層之囊泡。在一些實施例中，奈米粒子組成物包括經水性隔室隔開的兩個或更多個同心雙層。脂質雙層可經官能化及/或彼此交聯。脂質雙層可包括一或多種配體、蛋白質或通道。
在一些實施例中，所述奈米粒子組成物包含脂質組分，該脂質組分包括至少一種脂質，諸如本文所述的根據式(I)至(IV) (及其子式)之一的化合物。舉例而言，在一些實施例中，奈米粒子組成物可包括脂質組分，該脂質組分包括一種本文所提供之化合物。奈米粒子組成物亦可包括一或多種如下所述之其他脂質或非脂質組分。6.4.1 陽離子脂質
在一些實施例中，含脂質組成物包含至少一種根據式(I)之脂質化合物：
Figure 02_image001
(I)， 或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物，其中： G1 及G2 各自獨立地為鍵、C2 -C12 伸烷基或C2 -C12 伸烯基，其中該伸烷基或伸烯基中之一或多個-CH2 -視情況經-O-置換； L1 係–OC(=O)R1 、-C(=O)OR1 、-OC(=O)OR1 、-C(=O)R1 、-OR1 、-S(O)x R1 、-S-SR1 、-C(=O)SR1 、-SC(=O)R1 、-NRa C(=O)R1 、-C(=O)NRb Rc 、-NRa C(=O)NRb Rc 、-OC(=O)NRb Rc 、-NRa C(=O)OR1 、-SC(=S)R1 、-C(=S)SR1 、-C(=S)R1 、-CH(OH)R1 、-P(=O)(ORb )(ORc )、-(C6 -C10 伸芳基)-R1 、-(6至10員伸雜芳基)-R1 或R1 ； L2 係–OC(=O)R2 、-C(=O)OR2 、-OC(=O)OR2 、-C(=O)R2 、-OR2 、-S(O)x R2 、-S-SR2 、-C(=O)SR2 、-SC(=O)R2 、-NRd C(=O)R2 、-C(=O)NRe Rf 、-NRd C(=O)NRe Rf 、-OC(=O)NRe Rf 、-NRd C(=O)OR2 、-SC(=S)R2 、-C(=S)SR2 、-C(=S)R2 、-CH(OH)R2 、-P(=O)(ORe )(ORf )、-(C6 -C10 伸芳基)-R2 、-(6至10員伸雜芳基)-R2 或R2 ； R1 及R2 各自獨立地為C6 -C32 烷基或C6 -C32 烯基； Ra 、Rb 、Rd 及Re 各自獨立地為H、C1 -C24 烷基或C2 -C24 烯基； Rc 及Rf 各自獨立地為C1 -C32 烷基或C2 -C32 烯基； G3 係C2 -C24 伸烷基、C2 -C24 伸烯基、C3 -C8 伸環烷基或C3 -C8 伸環烯基； R3 係-N(R4 )R5 ； R4 係C3 -C8 環烷基、C3 -C8 環烯基、4至8員雜環基或C6 -C10 芳基；或R4 、G3 或G3 之一部分，連同其所連接之氮一起形成環狀部分； R5 係C1 -C12 烷基或C3 -C8 環烷基；或R4 、R5 連同其所連接之氮一起形成環狀部分； x係0、1或2；且 其中各烷基、烯基、環烷基、環烯基、雜環基、芳基、伸烷基、伸烯基、伸環烷基、伸環烯基、伸芳基、伸雜芳基及環狀部分獨立地視情況經取代。
在一個實施例中，本文提供一種式(I)之化合物：
Figure 02_image001
(I)， 或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物，其中： G1 及G2 各自獨立地為鍵、C2 -C12 伸烷基或C2 -C12 伸烯基； L1 係–OC(=O)R1 、-C(=O)OR1 、-OC(=O)OR1 、-C(=O)R1 、-OR1 、-S(O)x R1 、-S-SR1 、-C(=O)SR1 、-SC(=O)R1 、-NRa C(=O)R1 、-C(=O)NRb Rc 、-NRa C(=O)NRb Rc 、-OC(=O)NRb Rc 、-NRa C(=O)OR1 、-SC(=S)R1 、-C(=S)SR1 、-C(=S)R1 、-CH(OH)R1 、-P(=O)(ORb )(ORc )、-(C6 -C10 伸芳基)-R1 、-(6至10員伸雜芳基)-R1 或R1 ； L2 係–OC(=O)R2 、-C(=O)OR2 、-OC(=O)OR2 、-C(=O)R2 、-OR2 、-S(O)x R2 、-S-SR2 、-C(=O)SR2 、-SC(=O)R2 、-NRd C(=O)R2 、-C(=O)NRe Rf 、-NRd C(=O)NRe Rf 、-OC(=O)NRe Rf 、-NRd C(=O)OR2 、-SC(=S)R2 、-C(=S)SR2 、-C(=S)R2 、-CH(OH)R2 、-P(=O)(ORe )(ORf )、-(C6 -C10 伸芳基)-R2 、-(6至10員伸雜芳基)-R2 或R2 ； R1 及R2 各自獨立地為C6 -C24 烷基或C6 -C24 烯基； Ra 、Rb 、Rd 及Re 各自獨立地為H、C1 -C12 烷基或C2 -C12 烯基； Rc 及Rf 各自獨立地為C1 -C12 烷基或C2 -C12 烯基； G3 係C2 -C24 伸烷基、C2 -C24 伸烯基、C3 -C8 伸環烷基或C3 -C8 伸環烯基； R3 係-N(R4 )R5 ； R4 係C3 -C8 環烷基、C3 -C8 環烯基或C6 -C10 芳基； R5 係C1 -C12 烷基； x係0、1或2；且 其中各烷基、烯基、環烷基、環烯基、芳基、伸烷基、伸烯基、伸環烷基、伸環烯基、伸芳基及伸雜芳基獨立地視情況經取代。
在一個實施例中，本文提供一種式(II)之化合物：
Figure 02_image004
(II)， 或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物，其中：
Figure 02_image006
係單鍵或雙鍵； G1 及G2 各自獨立地為鍵、C2 -C12 伸烷基或C2 -C12 伸烯基，其中該伸烷基或伸烯基中之一或多個-CH2 -視情況經-O-置換； L1 係–OC(=O)R1 、-C(=O)OR1 、-OC(=O)OR1 、-C(=O)R1 、-OR1 、-S(O)x R1 、-S-SR1 、-C(=O)SR1 、-SC(=O)R1 、-NRa C(=O)R1 、-C(=O)NRb Rc 、-NRa C(=O)NRb Rc 、-OC(=O)NRb Rc 、-NRa C(=O)OR1 、-SC(=S)R1 、-C(=S)SR1 、-C(=S)R1 、-CH(OH)R1 、-P(=O)(ORb )(ORc )、-(C6 -C10 伸芳基)-R1 、-(6至10員伸雜芳基)-R1 或R1 ； L2 係–OC(=O)R2 、-C(=O)OR2 、-OC(=O)OR2 、-C(=O)R2 、-OR2 、-S(O)x R2 、-S-SR2 、-C(=O)SR2 、-SC(=O)R2 、-NRd C(=O)R2 、-C(=O)NRe Rf 、-NRd C(=O)NRe Rf 、-OC(=O)NRe Rf 、-NRd C(=O)OR2 、-SC(=S)R2 、-C(=S)SR2 、-C(=S)R2 、-CH(OH)R2 、-P(=O)(ORe )(ORf )、-(C6 -C10 伸芳基)-R2 、-(6至10員伸雜芳基)-R2 或R2 ； R1 及R2 各自獨立地為C6 -C32 烷基或C6 -C32 烯基； Ra 、Rb 、Rd 及Re 各自獨立地為H、C1 -C24 烷基或C2 -C24 烯基； Rc 及Rf 各自獨立地為C1 -C32 烷基或C2 -C32 烯基； G4 係鍵、C1 -C23 伸烷基、C2 -C23 伸烯基、C3 -C8 伸環烷基或C3 -C8 伸環烯基； R3 係-N(R4 )R5 ； R4 係C1 -C12 烷基、C3 -C8 環烷基、C3 -C8 環烯基、4至8員雜環基或C6 -C10 芳基；或R4 、G3 或G3 之一部分，連同其所連接之氮一起形成環狀部分； R5 係C1 -C12 烷基或C3 -C8 環烷基；或R4 、R5 連同其所連接之氮一起形成環狀部分； x係0、1或2；且 其中各烷基、烯基、環烷基、環烯基、雜環基、芳基、伸烷基、伸烯基、伸環烷基、伸環烯基、伸芳基、伸雜芳基及環狀部分獨立地視情況經取代。
在一個實施例中，本文提供一種式(II)之化合物：
Figure 02_image004
(II)， 或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物，其中：
Figure 02_image006
係單鍵或雙鍵； G1 及G2 各自獨立地為鍵、C2 -C12 伸烷基或C2 -C12 伸烯基； L1 係–OC(=O)R1 、-C(=O)OR1 、-OC(=O)OR1 、-C(=O)R1 、-OR1 、-S(O)x R1 、-S-SR1 、-C(=O)SR1 、-SC(=O)R1 、-NRa C(=O)R1 、-C(=O)NRb Rc 、-NRa C(=O)NRb Rc 、-OC(=O)NRb Rc 、-NRa C(=O)OR1 、-SC(=S)R1 、-C(=S)SR1 、-C(=S)R1 、-CH(OH)R1 、-P(=O)(ORb )(ORc )、-(C6 -C10 伸芳基)-R1 、-(6至10員伸雜芳基)-R1 或R1 ； L2 係–OC(=O)R2 、-C(=O)OR2 、-OC(=O)OR2 、-C(=O)R2 、-OR2 、-S(O)x R2 、-S-SR2 、-C(=O)SR2 、-SC(=O)R2 、-NRd C(=O)R2 、-C(=O)NRe Rf 、-NRd C(=O)NRe Rf 、-OC(=O)NRe Rf 、-NRd C(=O)OR2 、-SC(=S)R2 、-C(=S)SR2 、-C(=S)R2 、-CH(OH)R2 、-P(=O)(ORe )(ORf )、-(C6 -C10 伸芳基)-R2 、-(6至10員伸雜芳基)-R2 或R2 ； R1 及R2 各自獨立地為C6 -C24 烷基或C6 -C24 烯基； Ra 、Rb 、Rd 及Re 各自獨立地為H、C1 -C12 烷基或C2 -C12 烯基； Rc 及Rf 各自獨立地為C1 -C12 烷基或C2 -C12 烯基； G4 係鍵、C1 -C23 伸烷基、C2 -C23 伸烯基、C3 -C8 伸環烷基或C3 -C8 伸環烯基； R3 係-N(R4 )R5 ； R4 係C1 -C12 烷基、C3 -C8 環烷基、C3 -C8 環烯基或C6 -C10 芳基； R5 係C1 -C12 烷基； x係0、1或2；且 其中各烷基、烯基、環烷基、環烯基、芳基、伸烷基、伸烯基、伸環烷基、伸環烯基、伸芳基及伸雜芳基獨立地視情況經取代。
在一個實施例中，
Figure 02_image006
係單鍵。在一個實施例中，
Figure 02_image006
係雙鍵。在一個實施例中，
Figure 02_image006
係雙鍵，且該化合物具有(Z)-構形。在一個實施例中，
Figure 02_image006
係雙鍵，且該化合物具有(E)-構形。
在一個實施例中，本文提供一種式(III)之化合物：
Figure 02_image009
(III)， 或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物。
在一個實施例中，本文提供一種式(IV)之化合物：
Figure 02_image011
(IV)， 或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物。
在一個實施例中，G1 係鍵。在一個實施例中，G2 係鍵。在一個實施例中，G1 及G2 均為鍵。
在一個實施例中，G1 及G2 各自獨立地為C2 -C12 伸烷基或C2 -C12 伸烯基。在一個實施例中，G1 及G2 各自獨立地為C2 -C12 伸烷基。在一個實施例中，G1 及G2 各自獨立地為C2 -C12 伸烯基。在一個實施例中，G1 及G2 各自獨立地為C3 -C7 伸烷基。在一個實施例中，G1 及G2 各自獨立地為C5 伸烷基。
在一個實施例中，G1 未經取代。在一個實施例中，G1 經取代。在一個實施例中，G1 經–OH取代。在一個實施例中，G1 經(另一個) L1 取代 (亦即，G1 連接至兩個L1 )。在一個實施例中，G1 經-O-(C6 -C24 烷基)取代。在一個實施例中，G1 經-O-(C6 -C24 烯基)取代。在一個實施例中，G1 經–C(=O)-(C6 -C24 烷基)取代。在一個實施例中，G1 經–C(=O)-(C6 -C24 烯基)取代。
在一個實施例中，G2 未經取代。在一個實施例中，G2 經取代。在一個實施例中，G2 經–OH取代。在一個實施例中，G2 經(另一個) L2 取代(亦即，G2 連接至兩個L2 )。在一個實施例中，G2 經-O-(C6 -C24 烷基)取代。在一個實施例中，G2 經-O-(C6 -C24 烯基)取代。在一個實施例中，G2 經–C(=O)-(C6 -C24 烷基)取代。在一個實施例中，G2 經–C(=O)-(C6 -C24 烯基)取代。
在一個實施例中，G1 及/或G2 中該伸烷基或伸烯基中的一或多個-CH2 -視情況經-O-置換。在一個實施例中，G1 及G2 各自獨立地為C5 -C9 伸烷基，其中該伸烷基中之一或多個-CH2 -視情況經-O-置換。在一個實施例中，G1 及G2 各自獨立地為C5 -C7 伸烷基，其中該伸烷基中之一或多個-CH2 -視情況經-O-置換。在一個實施例中，G1 及G2 均為-CH2 -CH2 -O-CH2 -CH2 -。在一個實施例中，G1 及G2 均為-CH2 -CH2 -O-CH2 -CH2 -O-CH2 -。
在一個實施例中，該化合物係式(I-A)之化合物：
Figure 02_image013
(I-A)， 其中y及z各自獨立地為2至12之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物。
在一個實施例中，化合物係式(II-A)之化合物：
Figure 02_image015
(II-A)， 其中y及z各自獨立地為2至12之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物。
在一個實施例中，化合物係式(III-A)之化合物：
Figure 02_image017
(III-A)， 其中y及z各自獨立地為2至12之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物。
在一個實施例中，化合物係式(IV-A)之化合物：
Figure 02_image019
(IV-A)， 其中y及z各自獨立地為2至12之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物。
在一個實施例中，y及z各自獨立地為2至10之整數。在一個實施例中，y及z各自獨立地為2至6之整數。在一個實施例中，y及z各自獨立地為4至10之整數。
在一個實施例中，y與z不同。在一個實施例中，y與z相同。在一個實施例中，y與z相同且選自4、5、6、7、8及9。在一個實施例中，y係5且z係5。
在一個實施例中，L1 係–OC(=O)R1 、-C(=O)OR1 、-OC(=O)OR1 、-C(=O)R1 、-OR1 、-S(O)x R1 、-S-SR1 、-C(=O)SR1 、-SC(=O)R1 、-NRa C(=O)R1 、-C(=O)NRb Rc 、-NRa C(=O)NRb Rc 、-OC(=O)NRb Rc 、-NRa C(=O)OR1 、-SC(=S)R1 、-C(=S)SR1 、-C(=S)R1 、-CH(OH)R1 或-P(=O)(ORb )(ORc )。在一個實施例中，L1 係-(C6 -C10 伸芳基)-R1 。在一個實施例中，L1 係-(6至10員伸雜芳基)-R1 。在一個實施例中，L1 係R1 。
在一個實施例中，L1 係–OC(=O)R1 、-C(=O)OR1 、-C(=O)SR1 、-SC(=O)R1 、-NRa C(=O)R1 或-C(=O)NRb Rc 。在一個實施例中，L1 係–OC(=O)R1 、-C(=O)OR1 、-NRa C(=O)R1 或-C(=O)NRb Rc 。在一個實施例中，L1 係–OC(=O)R1 。在一個實施例中，L1 係-C(=O)OR1 。在一個實施例中，L1 係-NRa C(=O)R1 。在一個實施例中，L1 係-C(=O)NRb Rc 。在一個實施例中，L1 係-NRa C(=O)NRb Rc 。在一個實施例中，L1 係-OC(=O)NRb Rc 。在一個實施例中，L1 係-NRa C(=O)OR1 。
在一個實施例中，L2 係–OC(=O)R2 、-C(=O)OR2 、-OC(=O)OR2 、-C(=O)R2 、-OR2 、-S(O)x R2 、-S-SR2 、-C(=O)SR2 、-SC(=O)R2 、-NRd C(=O)R2 、-C(=O)NRe Rf 、-NRd C(=O)NRe Rf 、-OC(=O)NRe Rf 、-NRd C(=O)OR2 、-SC(=S)R2 、-C(=S)SR2 、-C(=S)R2 、-CH(OH)R2 或-P(=O)(ORe )(ORf )。在一個實施例中，L2 係-(C6 -C10 伸芳基)-R2 。在一個實施例中，L2 係-(6至10員伸雜芳基)-R2 。在一個實施例中，L2 係R2 。
在一個實施例中，L2 係–OC(=O)R2 、-C(=O)OR2 、-C(=O)SR2 、-SC(=O)R2 、-NRd C(=O)R2 或-C(=O)NRe Rf 。在一個實施例中，L2 係–OC(=O)R2 、-C(=O)OR2 、-NRd C(=O)R2 或-C(=O)NRe Rf 。在一個實施例中，L2 係–OC(=O)R2 。在一個實施例中，L2 係-C(=O)OR2 。在一個實施例中，L2 係-NRd C(=O)R2 。在一個實施例中，L2 係-C(=O)NRe Rf 。在一個實施例中，L2 係-NRd C(=O)NRe Rf 。在一個實施例中，L2 係-OC(=O)NRe Rf 。在一個實施例中，L2 係-NRd C(=O)OR2 。
在一個實施例中，L1 係–OC(=O)R1 、-NRa C(=O)R1 、-C(=O)OR1 或-C(=O)NRb Rc 且L2 係–OC(=O)R2 、-NRd C(=O)R2 、-C(=O)OR2 或-C(=O)NRe Rf 。在一個實施例中，L1 係–OC(=O)R1 、-C(=O)OR1 或-C(=O)NRb Rc 且L2 係–OC(=O)R2 、-C(=O)OR2 或-C(=O)NRe Rf 。在一個實施例中，L1 係–OC(=O)R1 且L2 係–OC(=O)R2 。在一個實施例中，L1 係–OC(=O)R1 且L2 係-NRd C(=O)R2 。在一個實施例中，L1 係-NRa C(=O)R1 且L2 係-NRd C(=O)R2 。在一個實施例中，L1 係-C(=O)OR1 且L2 係-C(=O)OR2 。在一個實施例中，L1 係-C(=O)OR1 且L2 係-C(=O)NRe Rf 。在一個實施例中，L1 係-C(=O)NRb Rc 且L2 係-C(=O)NRe Rf 。
在一個實施例中，L1 係-NRa C(=O)NRb Rc 且L2 係-NRd C(=O)NRe Rf 。在一個實施例中，L1 係-OC(=O)NRb Rc 且L2 係-OC(=O)NRe Rf 。在一個實施例中，L1 係-NRa C(=O)OR1 且L2 係-NRd C(=O)OR2 。
在一個實施例中，化合物係式(I-B)、(I-B’)、(I-B”)、(I-C)、(I-D)或(I-E)之化合物：
Figure 02_image021
(I-B)、
Figure 02_image023
(I-B’)、
Figure 02_image025
(I-B”)、
Figure 02_image027
(I-C)、
Figure 02_image029
(I-D)或
Figure 02_image031
(I-E)，
或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物。
在一個實施例中，化合物係式(II-B)、(II-B’)、(II-B”)、(II-C)、(II-D)或(II-E)之化合物：
Figure 02_image033
(II-B)、
Figure 02_image035
(II-B’)、
Figure 02_image037
(II-B”)、
Figure 02_image039
(II-C)、
Figure 02_image041
(II-D)或
Figure 02_image043
(II-E)，
或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物。
在一個實施例中，化合物係式(III-B)、(III-B’)、(III-B”)、(III-C)、(III-D)或(III-E)之化合物：
Figure 02_image045
(III-B)、
Figure 02_image047
(III-B’)、
Figure 02_image049
(III-B”)、
Figure 02_image051
(III-C)、
Figure 02_image053
(III-D)或
Figure 02_image055
(III-E)，
或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物。
在一個實施例中，化合物係式(IV-B)、(IV-B’)、(IV-B”)、(IV-C)、(IV-D)或(IV-E)之化合物：
Figure 02_image057
(IV-B)、
Figure 02_image059
(IV-B’)、
Figure 02_image061
(IV-B”)、
Figure 02_image063
(IV-C)、
Figure 02_image065
(IV-D)或
Figure 02_image067
(IV-E)，
或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物。
在一個實施例中，化合物係式(I-F)、(I-F’)、(I-F”)、(I-G)、(I-H)或(I-I)之化合物：
Figure 02_image069
(I-F)、
Figure 02_image071
(I-F’)、
Figure 02_image073
(I-F”)、
Figure 02_image075
(I-G)、
Figure 02_image077
(I-H)或
Figure 02_image079
(I-I)，
其中y及z各自獨立地為2至12之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物。
在一個實施例中，化合物係式(II-F)、(II-F’)、(II-F”)、(II-G)、(II-H)或(II-I)之化合物：
Figure 02_image081
(II-F)、
Figure 02_image083
(II-F’)、
Figure 02_image085
(II-F”)、
Figure 02_image087
(II-G)、
Figure 02_image089
(II-H)或
Figure 02_image091
(II-I)，
其中y及z各自獨立地為2至12之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物。
在一個實施例中，化合物係式(III-F)、(III-F’)、(III-F”)、(III-G)、(III-H)或(III-I)之化合物：
Figure 02_image093
(III-F)、
Figure 02_image095
(III-F’)、
Figure 02_image097
(III-F”)、
Figure 02_image099
(III-G)、
Figure 02_image101
(III-H)或
Figure 02_image103
(III-I)，
其中y及z各自獨立地為2至12之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物。
在一個實施例中，化合物係式(IV-F)、(IV-F’)、(IV-F”)、(IV-G)、(IV-H)或(IV-I)之化合物：
Figure 02_image105
(IV-F)、
Figure 02_image107
(IV-F’)、
Figure 02_image109
(IV-F”)、
Figure 02_image111
(IV-G)、
Figure 02_image113
(IV-H)或
Figure 02_image115
(IV-I)，
其中y及z各自獨立地為2至12之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物。
在一個實施例中，y及z各自獨立地為2至10之整數。在一個實施例中，y及z各自獨立地為2至6之整數。在一個實施例中，y及z各自獨立地為4至10之整數。
在一個實施例中，y與z不同。在一個實施例中，y與z相同。在一個實施例中，y與z相同且選自4、5、6、7、8及9。在一個實施例中，y係5且z係5。
在一個實施例中，G3 係C2 -C24 伸烷基。在一個實施例中，G3 係C2 -C12 伸烷基。在一個實施例中，G3 為C2 -C8 伸烷基。在一個實施例中，G3 係C2 -C6 伸烷基。在一個實施例中，G3 係C2 -C4 伸烷基。在一個實施例中，G3 係C2 伸烷基。在一個實施例中，G3 係C4 伸烷基。
在一個實施例中，G3 經一或多個側氧基取代。在一個實施例中，G3 係-(C1 -C23 伸烷基)-C(=O)-。在一個實施例中，G3 係-(C1 -C11 伸烷基)-C(=O)-。在一個實施例中，G3 係-(C1 -C7 伸烷基)-C(=O)-。在一個實施例中，G3 係-(C1 -C5 伸烷基)-C(=O)-。在一個實施例中，G3 係-(C1 -C3 伸烷基)-C(=O)-。在一個實施例中，G3 係-CH2 -C(=O)-。在一個實施例中，G3 係–CH2 -CH2 -CH2 -C(=O)-。在一個實施例中，–C(=O)-連接至氮原子，且伸烷基連接至R3 。
在一個實施例中，化合物係式(I-J)、(I-J’)、(I-J”)、(I-K)、(I-L)或(I-M)之化合物：
Figure 02_image117
(I-J)、
Figure 02_image119
(I-J’)、
Figure 02_image121
(I-J”)、
Figure 02_image123
(I-K)、
Figure 02_image125
(I-L)或
Figure 02_image127
(I-M)，
其中y及z各自獨立地為2至12之整數，且 s係2至24之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物。
在一個實施例中，y及z各自獨立地為2至10之整數。在一個實施例中，y及z各自獨立地為2至6之整數。在一個實施例中，y及z各自獨立地為4至10之整數。
在一個實施例中，y與z不同。在一個實施例中，y與z相同。在一個實施例中，y與z相同且選自4、5、6、7、8及9。在一個實施例中，y係5且z係5。
在一個實施例中，s係2至12之整數。在一個實施例中，s係2至8之整數。在一個實施例中，s係2至6之整數。在一個實施例中，s係2至4之整數。在一個實施例中，s係2。在一個實施例中，s係4。
在一個實施例中，y係5，z係5，且s係2。
在一個實施例中，y係5，z係5，且s係4。
在一個實施例中，G3 係C2 -C24 伸烯基。在一個實施例中，G3 係C2 -C12 伸烯基。在一個實施例中，G3 係C2 -C8 伸烯基。在一個實施例中，G3 係C2 -C6 伸烯基。在一個實施例中，G3 係C2 -C4 伸烯基。
在一個實施例中，G3 係C3 -C8 伸環烷基。在一個實施例中，G3 係C5 -C6 伸環烷基。
在一個實施例中，G3 係C3 -C8 伸環烯基。在一個實施例中，G3 係C5 -C6 伸環烯基。
在一個實施例中，G4 係鍵。
在一個實施例中，G4 係C1 -C23 伸烷基。在一個實施例中，G4 係C1 -C11 伸烷基。在一個實施例中，G4 係C1 -C7 伸烷基。在一個實施例中，G4 係C1 -C5 伸烷基。在一個實施例中，G4 係C1 -C3 伸烷基。在一個實施例中，G4 係C1 伸烷基。在一個實施例中，G4 係C2 伸烷基。在一個實施例中，G4 係C3 伸烷基。在一個實施例中，G4 係C4 伸烷基。
在一個實施例中，化合物係式(II-J)、(II-J’)、(II-J”)、(II-K)、(II-L)或(II-M)之化合物：
Figure 02_image129
(II-J)、
Figure 02_image131
(II-J’)、
Figure 02_image133
(II-J”)、
Figure 02_image135
(II-K)、
Figure 02_image137
(II-L)或
Figure 02_image139
(II-M)，
其中y及z各自獨立地為2至12之整數，且 u係0至23之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物。
在一個實施例中，化合物係式(III-J)、(III-J’)、(III-J”)、(III-K)、(III-L)或(III-M)之化合物：
Figure 02_image141
(III-J)、
Figure 02_image143
(III-J’)、
Figure 02_image145
(III-J”)、
Figure 02_image147
(III-K)、
Figure 02_image149
(III-L)或
Figure 02_image151
(III-M)，
其中y及z各自獨立地為2至12之整數，且 u係0至23之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物。
在一個實施例中，化合物係式(IV-J)、(IV-J’)、(IV-J”)、(IV-K)、(IV-L)或(IV-M)之化合物：
Figure 02_image153
(IV-J)、
Figure 02_image155
(IV-J’)、
Figure 02_image157
(IV-J”)、
Figure 02_image159
(IV-K)、
Figure 02_image161
(IV-L)或
Figure 02_image163
(IV-M)，
其中y及z各自獨立地為2至12之整數，且 u係0至23之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物。
在一個實施例中，y及z各自獨立地為2至10之整數。在一個實施例中，y及z各自獨立地為2至6之整數。在一個實施例中，y及z各自獨立地為4至10之整數。
在一個實施例中，y與z不同。在一個實施例中，y與z相同。在一個實施例中，y與z相同且選自4、5、6、7、8及9。在一個實施例中，y係5且z係5。
在一個實施例中，u係0至12之整數。在一個實施例中，u係0至8之整數。在一個實施例中，u係0至6之整數。在一個實施例中，u係0至4之整數。在一個實施例中，u係0。在一個實施例中，u係1。在一個實施例中，u係2。在一個實施例中，u係3。在一個實施例中，u係4。
在一個實施例中，y係5，z係5，且u係0。
在一個實施例中，y係5，z係5，且u係2。
在一個實施例中，G4 係C2 -C23 伸烯基。在一個實施例中，G4 係C2 -C12 伸烯基。在一個實施例中，G4 係C2 -C8 伸烯基。在一個實施例中，G4 係C2 -C6 伸烯基。在一個實施例中，G4 係C2 -C4 伸烯基。
在一個實施例中，G4 係C3 -C8 伸環烷基。在一個實施例中，G4 係C5 -C6 伸環烷基。
在一個實施例中，G4 係C3 -C8 伸環烯基。在一個實施例中，G4 係C5 -C6 伸環烯基。
在一個實施例中，R5 係C1 -C12 烷基。在一個實施例中，R5 係C1 -C10 烷基。在一個實施例中，R5 係C1 -C8 烷基。在一個實施例中，R5 係C1 -C6 烷基。在一個實施例中，R5 係C1 -C4 烷基。在一個實施例中，R5 係C1 -C2 烷基。在一個實施例中，R5 係甲基。在一個實施例中，R5 係乙基。在一個實施例中，R5 係丙基。在一個實施例中，R5 係正丁基。在一個實施例中，R5 係正己基。在一個實施例中，R5 係正辛基。在一個實施例中，R5 係正壬基。
在一個實施例中，R5 係C3 -C8 環烷基。在一個實施例中，R5 係環丙基。在一個實施例中，R5 係環丁基。在一個實施例中，R5 係環戊基。在一個實施例中，R5 係環己基。在一個實施例中，R5 係環庚基。在一個實施例中，R5 係環辛基。
在一個實施例中，R4 、R5 連同其所連接之氮一起形成環狀部分。
在一個實施例中，該環狀部分(由R4 及R5 連同其所連接之氮形成)係雜環基。在一個實施例中，該環狀部分係雜環烷基。在一個實施例中，該環狀部分係4至8員雜環烷基。在一個實施例中，該環狀部分係4員雜環烷基。在一個實施例中，該環狀部分係5員雜環烷基。在一個實施例中，該環狀部分係6員雜環烷基。在一個實施例中，該環狀部分係7員雜環烷基。在一個實施例中，該環狀部分係8員雜環烷基。
在一個實施例中，該環狀部分(由R4 及R5 連同其所連接之氮形成)係氮雜環丁烷-1-基。在一個實施例中，該環狀部分係吡咯啶-1-基。在一個實施例中，該環狀部分係哌啶-1-基。在一個實施例中，該環狀部分係氮𠰢-1-基。在一個實施例中，該環狀部分係氮雜環辛烷-1-基。在一個實施例中，該環狀部分係𠰌啉基。在一個實施例中，該環狀部分係哌𠯤-1-基。此等基團中之連接點係連至G3 。
如本文所述且除非另有說明，否則R5 之取代模式亦適用於由R4 及R5 連同其所連接之氮形成的環狀部分。
在一個實施例中，R5 未經取代。
在一個實施例中，R5 經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代：側氧基、–ORg 、-NRg C(=O)Rh 、-C(=O)NRg Rh 、-C(=O)Rh 、- OC(=O)Rh 、-C(=O)ORh 及–O-Ri -OH，其中： Rg 在每次出現時獨立地為H或C1 -C6 烷基； Rh 在每次出現時獨立地為C1 -C6 烷基；且 Ri 在每次出現時獨立地為C1 -C6 伸烷基。
在一個實施例中，R5 經一或多個羥基取代。在一個實施例中，R5 經一個羥基取代。
在一個實施例中，R5 經一或多個羥基及一或多個側氧基取代。在一個實施例中，R5 經一或多個羥基及一個側氧基取代。在一個實施例中，R5 係–CH2 CH2 OH。
在一個實施例中，R5 係-(CH2 )p Q、-(CH2 )p CHQR、-CHQR或-CQ(R)2 ，其中Q係C3 -C8 環烷基、C3 -C8 環烯基、C3 -C8 環炔基、4至8員雜環基、C6 -C10 芳基、5至10員雜芳基、-OR、-O(CH2 )p N(R)2 、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3 、-CX2 H、-CXH2 、-CN、-N(R)2 、-C(O)N(R)2 、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2 R、-N(R)C(O)N(R)2 、-N(R)C(S)N(R)2 、-N(R)R22 、-O(CH2 )p OR、-N(R)C(=NR23 )N(R)2 、-N(R)C(=CHR23 )N(R)2 、-OC(O)N(R)2 、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2 R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2 、-N(OR)C(S)N(R)2 、-N(OR)C(=NR23 )N(R)2 、-N(OR)C(=CHR23 )N(R)2 、-C(=NR23 )N(R)2 、-C(=NR23 )R、-C(O)N(R)OR或-C(R)N(R)2 C(O)OR，且各p獨立地為1、2、3、4或5； R22 係C3 -C8 環烷基、C3 -C8 環烯基、C3 -C8 環炔基、4至8員雜環基、C6 -C10 芳基或5至10員雜芳基； R23 係H、-CN、-NO2 、C1 -C6 烷基、-OR、-S(O)2 R、-S(O)2 N(R)2 、C2 -C6 烯基、C3 -C8 環烷基、C3 -C8 環烯基、C3 -C8 環炔基、4至8員雜環基、C6 -C10 芳基或5至10員雜芳基； 各R獨立地為H、C1 -C3 烷基或C2 -C3 烯基；或N(R)2 部分中之兩個R連同其所連接之氮一起形成環狀部分；且 各X獨立地為F、CI、Br或I。
在一個實施例中，化合物係式(I-N)、(I-N’)、(I-N”)、(I-O)、(I-P)或(I-Q)之化合物：
Figure 02_image165
(I-N)、
Figure 02_image167
(I-N’)、
Figure 02_image169
(I-N”)、
Figure 02_image171
(I-O)、
Figure 02_image173
(I-P)或
Figure 02_image175
(I-Q)，
其中y及z各自獨立地為2至12之整數， s係2至24之整數， t係1至12之整數，且 R6 係氫或羥基， 或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物。
在一個實施例中，化合物係式(II-N)、(II-N’)、(II-N”)、(II-O)、(II-P)或(II-Q)之化合物：
Figure 02_image177
(II-N)、
Figure 02_image179
(II-N’)、
Figure 02_image181
(II-N”)、
Figure 02_image183
(II-O)、
Figure 02_image185
(II-P)或
Figure 02_image187
(II-Q)，
其中y及z各自獨立地為2至12之整數， u係0至23之整數， t係1至12之整數，且 R6 係氫或羥基， 或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物。
在一個實施例中，化合物係式(III-N)、(III-N’)、(III-N”)、(III-O)、(III-P)或(III-Q)之化合物：
Figure 02_image189
(III-N)、
Figure 02_image191
(III-N’)、
Figure 02_image193
(III-N”)、
Figure 02_image195
(III-O)、
Figure 02_image197
(III-P)或
Figure 02_image199
(III-Q)，
其中y及z各自獨立地為2至12之整數， u係0至23之整數， t係1至12之整數，且 R6 係氫或羥基， 或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物。
在一個實施例中，化合物係式(IV-N)、(IV-N’)、(IV-N”)、(IV-O)、(IV-P)或(IV-Q)之化合物：
Figure 02_image201
(IV-N)、
Figure 02_image203
(IV-N’)、   
Figure 02_image205
(IV-N”)、
Figure 02_image207
(IV-O)、
Figure 02_image209
(IV-P)或
Figure 02_image211
(IV-Q)，
其中y及z各自獨立地為2至12之整數， u係0至23之整數， t係1至12之整數，且 R6 係氫或羥基， 或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物。
在一個實施例中，化合物係式(I-R)、(I-R’)、(I-R”)、(I-S)、(I-T)或(I-U)之化合物：
Figure 02_image213
(I-R)、
Figure 02_image215
(I-R’)、
Figure 02_image217
(I-R”)、
Figure 02_image219
(I-S)、
Figure 02_image221
(I-T)或
Figure 02_image223
(I-U)，
其中y及z各自獨立地為2至12之整數， s係2至24之整數， t係1至12之整數，且 R6 係氫或羥基， 或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物。
在一個實施例中，化合物係式(II-R)、(II-R’)、(II-R”)、(II-S)、(II-T)或(II-U)之化合物：
Figure 02_image225
(II-R)、
Figure 02_image227
(II-R’)、
Figure 02_image229
(II-R”)、
Figure 02_image231
(II-S)、
Figure 02_image233
(II-T)或
Figure 02_image235
(II-U)，
其中y及z各自獨立地為2至12之整數， u係0至23之整數， t係1至12之整數，且 R6 係氫或羥基， 或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物。
在一個實施例中，化合物係式(III-R)、(III-R’)、(III-R”)、(III-S)、(III-T)或(III-U)之化合物：
Figure 02_image237
(III-R)、
Figure 02_image239
(III-R’)、
Figure 02_image241
(III-R”)、
Figure 02_image243
(III-S)、
Figure 02_image245
(III-T)或
Figure 02_image247
(III-U)，
其中y及z各自獨立地為2至12之整數， u係0至23之整數， t係1至12之整數，且 R6 係氫或羥基， 或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物。
在一個實施例中，化合物係式(IV-R)、(IV-R’)、(IV-R”)、(IV-S)、(IV-T)或(IV-U)之化合物：
Figure 02_image249
(IV-R)、
Figure 02_image251
(IV-R’)、
Figure 02_image253
(IV-R”)、
Figure 02_image255
(IV-S)、
Figure 02_image257
(IV-T)或
Figure 02_image259
(IV-U)，
其中y及z各自獨立地為2至12之整數， u係0至23之整數， t係1至12之整數，且 R6 係氫或羥基， 或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物。
在一個實施例中，y及z各自獨立地為2至10之整數。在一個實施例中，y及z各自獨立地為2至6之整數。在一個實施例中，y及z各自獨立地為4至10之整數。
在一個實施例中，y與z不同。在一個實施例中，y與z相同。在一個實施例中，y與z相同且選自4、5、6、7、8及9。在一個實施例中，y係5且z係5。
在一個實施例中，s係2至12之整數。在一個實施例中，s係2至8之整數。在一個實施例中，s係2至6之整數。在一個實施例中，s係2至4之整數。在一個實施例中，s係2。在一個實施例中，s係4。
在一個實施例中，y係5，z係5，且s係2。
在一個實施例中，y係5，z係5，且s係4。
在一個實施例中，u係0至12之整數。在一個實施例中，u係0至8之整數。在一個實施例中，u係0至6之整數。在一個實施例中，u係0至4之整數。在一個實施例中，u係0。在一個實施例中，u係1。在一個實施例中，u係2。在一個實施例中，u係3。在一個實施例中，u係4。
在一個實施例中，y係5，z係5，且u係0。
在一個實施例中，y係5，z係5，且u係2。
在一個實施例中，t係1至10之整數。在一個實施例中，t係1至8之整數。在一個實施例中，t係1至6之整數。在一個實施例中，t係1至4之整數。在一個實施例中，t係1至3之整數。在一個實施例中，t係1至2之整數。在一個實施例中，t係1。在一個實施例中，t係2。在一個實施例中，t係3。在一個實施例中，t係4。在一個實施例中，t係5。在一個實施例中，t係6。在一個實施例中，t係7。
在一個實施例中，R4 係C1 -C12 烷基。在一個實施例中，R4 係C1 -C8 烷基。在一個實施例中，R4 係C1 -C6 烷基。在一個實施例中，R4 係C1 -C4 烷基。在一個實施例中，R4 係甲基。在一個實施例中，R4 係乙基。在一個實施例中，R4 係正丙基。在一個實施例中，R4 係正丁基。在一個實施例中，R4 係正戊基。在一個實施例中，R4 係正己基。在一個實施例中，R4 係正辛基。在一個實施例中，R4 係正壬基。
在一個實施例中，R4 係C3 -C8 伸烷基。在一個實施例中，R4 係正丙基。在一個實施例中，R4 係正丁基。在一個實施例中，R4 係正戊基。在一個實施例中，R4 係正己基。在一個實施例中，R4 係正庚基。在一個實施例中，R4 係正辛基。
在一個實施例中，R4 係C3 -C8 伸環烯基。在一個實施例中，R4 係環丙烯基。在一個實施例中，R4 係環丁烯基。在一個實施例中，R4 係環戊烯基。在一個實施例中，R4 係環己烯基。在一個實施例中，R4 係環庚烯基。在一個實施例中，R4 係環辛烯基。
在一個實施例中，R4 係C6 -C10 芳基。在一個實施例中，R4 係苯基。
在一個實施例中，R4 係4至8員雜環基。在一個實施例中，R4 係4至8員雜環烷基。在一個實施例中，R4 係氧雜環丁烷基。在一個實施例中，R4 係四氫呋喃基。在一個實施例中，R4 係四氫哌喃基。在一個實施例中，R4 係四氫硫代哌喃基。在一個實施例中，R4 係N-甲基哌啶基。
在一個實施例中，R4 、G3 或G3 之一部分連同其所連接之氮一起形成環狀部分。
在一個實施例中，該環狀部分(由R4 、G3 或G3 之一部分連同其所連接之氮一起形成)係雜環基。在一個實施例中，該環狀部分係雜環烷基。在一個實施例中，該環狀部分係4至8員雜環烷基。在一個實施例中，該環狀部分係4員雜環烷基。在一個實施例中，該環狀部分係5員雜環烷基。在一個實施例中，該環狀部分係6員雜環烷基。在一個實施例中，該環狀部分係7員雜環烷基。在一個實施例中，該環狀部分係8員雜環烷基。
在一個實施例中，該環狀部分(由R4 、G3 或G3 之一部分連同其所連接之氮形成)係氮雜環丁烷-3-基。在一個實施例中，該環狀部分係吡咯啶-3-基。在一個實施例中，該環狀部分係哌啶-4-基。在一個實施例中，該環狀部分係氮𠰢-4-基。在一個實施例中，該環狀部分係氮雜環辛烷-5-基。此等基團之連接點係連至與G1 及G2 連接之氮的方向。
如本文所述且除非另有說明，否則R4 之取代模式亦適用於由R4 、G3 或G3 之一部分連同其所連接之氮形成的環狀部分。
在一個實施例中，R4 未經取代。
在一個實施例中，R4 經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代：側氧基、–ORg 、-NRg C(=O)Rh 、-C(=O)NRg Rh 、-C(=O)Rh 、- OC(=O)Rh 、-C(=O)ORh 及–O-Ri -OH，其中： Rg 在每次出現時獨立地為H或C1 -C6 烷基； Rh 在每次出現時獨立地為C1 -C6 烷基；且 Ri 在每次出現時獨立地為C1 -C6 伸烷基。
在一個實施例中，R4 經一或多個羥基取代。在一個實施例中，R4 經一個羥基取代。
在一個實施例中，R4 經一或多個羥基及一或多個側氧基取代。在一個實施例中，R4 經一或多個羥基及一個側氧基取代。
在一個實施例中，R3 具有以下結構之一：
Figure 02_image261
、
Figure 02_image263
、
Figure 02_image265
、
Figure 02_image267
、
Figure 02_image269
、
Figure 02_image271
、
Figure 02_image273
、
Figure 02_image275
、
Figure 02_image277
、
Figure 02_image279
、
Figure 02_image281
或
Figure 02_image283
。
在一個實施例中，R3 具有
Figure 02_image285
之結構。
在一個實施例中，R3 具有
Figure 02_image287
之結構。
在一個實施例中，R1 及R2 各自獨立地為支鏈C6 -C32 烷基或支鏈C6 -C32 烯基。在一個實施例中，R1 及R2 各自獨立地為支鏈C6 -C24 烷基或支鏈C6 -C24 烯基。
在一個實施例中，R1 及R2 各自獨立地為-R7 -CH(R8 )(R9 )，其中R7 係C1 -C5 伸烷基，且R8 及R9 獨立地為C2 -C10 烷基或C2 -C10 烯基。
在一個實施例中，R1 係直鏈C6 -C32 烷基。在一個實施例中，R1 係直鏈C6 -C24 烷基。在一個實施例中，R1 係直鏈C7 -C15 烷基。在一個實施例中，R1 係直鏈C7 烷基。在一個實施例中，R1 係直鏈C8 烷基。在一個實施例中，R1 係直鏈C9 烷基。在一個實施例中，R1 係直鏈C10 烷基。在一個實施例中，R1 係直鏈C11 烷基。在一個實施例中，R1 係直鏈C12 烷基。在一個實施例中，R1 係直鏈C13 烷基。在一個實施例中，R1 係直鏈C14 烷基。在一個實施例中，R1 係直鏈C15 烷基。
在一個實施例中，R1 係直鏈C6 -C32 烯基。在一個實施例中，R1 係直鏈C6 -C24 烯基。在一個實施例中，R1 係直鏈C7 -C17 烯基。在一個實施例中，R1 係直鏈C7 烯基。在一個實施例中，R1 係直鏈C8 烯基。在一個實施例中，R1 係直鏈C9 烯基。在一個實施例中，R1 係直鏈C10 烯基。在一個實施例中，R1 係直鏈C11 烯基。在一個實施例中，R1 係直鏈C12 烯基。在一個實施例中，R1 係直鏈C13 烯基。在一個實施例中，R1 係直鏈C14 烯基。在一個實施例中，R1 係直鏈C15 烯基。在一個實施例中，R1 係直鏈C16 烯基。在一個實施例中，R1 係直鏈C17 烯基。
在一個實施例中，R1 係支鏈C6 -C32 烷基。在一個實施例中，R1 係支鏈C6 -C24 烷基。在一個實施例中，R1 係-R7 -CH(R8 )(R9 )，其中R7 係C0 -C5 伸烷基，且R8 及R9 獨立地為C2 -C10 烷基。在一個實施例中，R1 係-R7 -CH(R8 )(R9 )，其中R7 係C0 -C1 伸烷基，且R8 及R9 獨立地為C4 -C8 烷基。
在一個實施例中，R1 係支鏈C6 -C32 烯基。在一個實施例中，R1 係支鏈C6 -C24 烯基。在一個實施例中，R1 係-R7 -CH(R8 )(R9 )，其中R7 係C0 -C5 伸烷基，且R8 及R9 獨立地為C2 -C10 烯基。在一個實施例中，R1 係-R7 -CH(R8 )(R9 )，其中R7 係C0 -C1 伸烷基，且R8 及R9 獨立地為C6 -C10 烯基。
在一個實施例中，R2 係直鏈C6 -C32 烷基。在一個實施例中，R2 係直鏈C6 -C24 烷基。在一個實施例中，R2 係直鏈C7 -C15 烷基。在一個實施例中，R2 係直鏈C7 烷基。在一個實施例中，R2 係直鏈C8 烷基。在一個實施例中，R2 係直鏈C9 烷基。在一個實施例中，R2 係直鏈C10 烷基。在一個實施例中，R2 係直鏈C11 烷基。在一個實施例中，R2 係直鏈C12 烷基。在一個實施例中，R2 係直鏈C13 烷基。在一個實施例中，R2 係直鏈C14 烷基。在一個實施例中，R2 係直鏈C15 烷基。
在一個實施例中，R2 係直鏈C6 -C32 烯基。在一個實施例中，R2 係直鏈C6 -C24 烯基。在一個實施例中，R2 係直鏈C7 -C17 烯基。在一個實施例中，R2 係直鏈C7 烯基。在一個實施例中，R2 係直鏈C8 烯基。在一個實施例中，R2 係直鏈C9 烯基。在一個實施例中，R2 係直鏈C10 烯基。在一個實施例中，R2 係直鏈C11 烯基。在一個實施例中，R2 係直鏈C12 烯基。在一個實施例中，R2 係直鏈C13 烯基。在一個實施例中，R2 係直鏈C14 烯基。在一個實施例中，R2 係直鏈C15 烯基。在一個實施例中，R2 係直鏈C16 烯基。在一個實施例中，R2 係直鏈C17 烯基。
在一個實施例中，R2 係支鏈C6 -C32 烷基。在一個實施例中，R2 係支鏈C6 -C24 烷基。在一個實施例中，R2 係-R7 -CH(R8 )(R9 )，其中R7 係C0 -C5 伸烷基，且R8 及R9 獨立地為C2 -C10 烷基。在一個實施例中，R2 係-R7 -CH(R8 )(R9 )，其中R7 係C0 -C1 伸烷基，且R8 及R9 獨立地為C4 -C8 烷基。
在一個實施例中，R2 係支鏈C6 -C32 烯基。在一個實施例中，R2 係支鏈C6 -C24 烯基。在一個實施例中，R2 係-R7 -CH(R8 )(R9 )，其中R7 係C0 -C5 伸烷基，且R8 及R9 獨立地為C2 -C10 烯基。在一個實施例中，R2 係-R7 -CH(R8 )(R9 )，其中R7 係C0 -C1 伸烷基，且R8 及R9 獨立地為C6 -C10 烯基。
在一個實施例中，Rc 係直鏈C6 -C32 烷基。在一個實施例中，Rc 係直鏈C6 -C24 烷基。在一個實施例中，Rc 係直鏈C7 -C15 烷基。在一個實施例中，Rc 係直鏈C7 烷基。在一個實施例中，Rc 係直鏈C8 烷基。在一個實施例中，Rc 係直鏈C9 烷基。在一個實施例中，Rc 係直鏈C10 烷基。在一個實施例中，Rc 係直鏈C11 烷基。在一個實施例中，Rc 係直鏈C12 烷基。在一個實施例中，Rc 係直鏈C13 烷基。在一個實施例中，Rc 係直鏈C14 烷基。在一個實施例中，Rc 係直鏈C15 烷基。
在一個實施例中，Rc 係直鏈C6 -C32 烯基。在一個實施例中，Rc 係直鏈C6 -C24 烯基。在一個實施例中，Rc 係直鏈C7 -C17 烯基。在一個實施例中，Rc 係直鏈C7 烯基。在一個實施例中，Rc 係直鏈C8 烯基。在一個實施例中，Rc 係直鏈C9 烯基。在一個實施例中，Rc 係直鏈C10 烯基。在一個實施例中，Rc 係直鏈C11 烯基。在一個實施例中，Rc 係直鏈C12 烯基。在一個實施例中，Rc 係直鏈C13 烯基。在一個實施例中，Rc 係直鏈C14 烯基。在一個實施例中，Rc 係直鏈C15 烯基。在一個實施例中，Rc 係直鏈C16 烯基。在一個實施例中，Rc 係直鏈C17 烯基。
在一個實施例中，Rc 係支鏈C6 -C32 烷基。在一個實施例中，Rc 係支鏈C6 -C24 烷基。在一個實施例中，Rc 係-R7 -CH(R8 )(R9 )，其中R7 係C0 -C5 伸烷基，且R8 及R9 獨立地為C2 -C10 烷基。在一個實施例中，Rc 係-R7 -CH(R8 )(R9 )，其中R7 係C0 -C1 伸烷基，且R8 及R9 獨立地為C4 -C8 烷基。
在一個實施例中，Rc 係支鏈C6 -C32 烯基。在一個實施例中，Rc 係支鏈C6 -C24 烯基。在一個實施例中，Rc 係-R7 -CH(R8 )(R9 )，其中R7 係C0 -C5 伸烷基，且R8 及R9 獨立地為C2 -C10 烯基。在一個實施例中，Rc 係-R7 -CH(R8 )(R9 )，其中R7 係C0 -C1 伸烷基，且R8 及R9 獨立地為C6 -C10 烯基。
在一個實施例中，Rf 係直鏈C6 -C32 烷基。在一個實施例中，Rf 係直鏈C6 -C24 烷基。在一個實施例中，Rf 係直鏈C7 -C15 烷基。在一個實施例中，Rf 係直鏈C7 烷基。在一個實施例中，Rf 係直鏈C8 烷基。在一個實施例中，Rf 係直鏈C9 烷基。在一個實施例中，Rf 係直鏈C10 烷基。在一個實施例中，Rf 係直鏈C11 烷基。在一個實施例中，Rf 係直鏈C12 烷基。在一個實施例中，Rf 係直鏈C13 烷基。在一個實施例中，Rf 係直鏈C14 烷基。在一個實施例中，Rf 係直鏈C15 烷基。
在一個實施例中，Rf 係直鏈C6 -C32 烯基。在一個實施例中，Rf 係直鏈C6 -C24 烯基。在一個實施例中，Rf 係直鏈C7 -C17 烯基。在一個實施例中，Rf 係直鏈C7 烯基。在一個實施例中，Rf 係直鏈C8 烯基。在一個實施例中，Rf 係直鏈C9 烯基。在一個實施例中，Rf 係直鏈C10 烯基。在一個實施例中，Rf 係直鏈C11 烯基。在一個實施例中，Rf 係直鏈C12 烯基。在一個實施例中，Rf 係直鏈C13 烯基。在一個實施例中，Rf 係直鏈C14 烯基。在一個實施例中，Rf 係直鏈C15 烯基。在一個實施例中，Rf 係直鏈C16 烯基。在一個實施例中，Rf 係直鏈C17 烯基。
在一個實施例中，Rf 係支鏈C6 -C32 烷基。在一個實施例中，Rf 係支鏈C6 -C24 烷基。在一個實施例中，Rf 係-R7 -CH(R8 )(R9 )，其中R7 係C0 -C5 伸烷基，且R8 及R9 獨立地為C2 -C10 烷基。在一個實施例中，Rf 係-R7 -CH(R8 )(R9 )，其中R7 係C0 -C1 伸烷基，且R8 及R9 獨立地為C4 -C8 烷基。
在一個實施例中，Rf 係支鏈C6 -C32 烯基。在一個實施例中，Rf 係支鏈C6 -C24 烯基。在一個實施例中，Rf 係-R7 -CH(R8 )(R9 )，其中R7 係C0 -C5 伸烷基，且R8 及R9 獨立地為C2 -C10 烯基。在一個實施例中，Rf 係-R7 -CH(R8 )(R9 )，其中R7 係C0 -C1 伸烷基，且R8 及R9 獨立地為C6 -C10 烯基。
在一個實施例中，R1 、R2 、Rc 及Rf 各自獨立地為直鏈C6 -C18 烷基、直鏈C6 -C18 烯基或-R7 -CH(R8 )(R9 )，其中R7 係C0 -C5 伸烷基，且R8 及R9 獨立地為C2 -C10 烷基或C2 -C10 烯基。
在一個實施例中，R1 、R2 、Rc 及Rf 各自獨立地為直鏈C7 -C15 烷基、直鏈C7 -C15 烯基或-R7 -CH(R8 )(R9 )，其中R7 係C0 -C1 伸烷基，且R8 及R9 獨立地為C4 -C8 烷基或C6 -C10 烯基。
在一個實施例中，R1 、R2 、Rc 及Rf 各自獨立地為以下結構之一：
Figure 02_image289
、
Figure 02_image291
、
Figure 02_image293
、
Figure 02_image295
、
Figure 02_image297
、
Figure 02_image299
、
Figure 02_image301
、
Figure 02_image303
、
Figure 02_image305
、
Figure 02_image307
、
Figure 02_image309
、
Figure 02_image311
、
Figure 02_image313
、
Figure 02_image315
、
Figure 02_image317
、
Figure 02_image319
、
Figure 02_image321
、
Figure 02_image323
、
Figure 02_image325
、
Figure 02_image327
或
Figure 02_image329
。
在一個實施例中，R1 、R2 、Rc 及Rf 各自獨立地視情況經取代。在一個實施例中，視情況存在之取代基係-O-(C6 -C24 烷基)。在一個實施例中，視情況存在之取代基係-O-(C6 -C24 烯基)。在一個實施例中，視情況存在之取代基係–C(=O)-(C6 -C24 烷基)。在一個實施例中，視情況存在之取代基係–C(=O)-(C6 -C24 烯基)。
在一個實施例中，Ra 及Rd 各自獨立地為H。在一個實施例中，Ra 、Rb 、Rd 及Re 各自獨立地為H。在一個實施例中，Ra 及Rd 各自獨立地為C1 -C24 烷基。在一個實施例中，Ra 及Rd 各自獨立地為C1 -C18 烷基。在一個實施例中，Ra 及Rd 各自獨立地為C1 -C12 烷基。在一個實施例中，Ra 及Rd 各自獨立地為C1 -C6 烷基。
在一個實施例中，Rb 、Rc 、Re 及Rf 各自獨立地為正己基或正辛基。
在一個實施例中，Rc 及Rf 各自獨立地為支鏈C6 -C24 烷基或支鏈C6 -C24 烯基。在一個實施例中，Rc 及Rf 各自獨立地為-R7 -CH(R8 )(R9 )，其中R7 係C1 -C5 伸烷基，且R8 及R9 各自獨立地為C2 -C10 烷基或C2 -C10 烯基。在一個實施例中，化合物係如表1中之化合物或其醫藥學上可接受的鹽、前藥或立體異構物。表 1.
Figure 02_image331
化合物1
Figure 02_image333
化合物2
Figure 02_image335
化合物3
Figure 02_image337
化合物4
Figure 02_image339
化合物5
Figure 02_image341
化合物6
Figure 02_image343
化合物7
Figure 02_image345
化合物8
Figure 02_image347
化合物9
Figure 02_image349
化合物10
Figure 02_image351
化合物11
Figure 02_image353
化合物12
Figure 02_image355
化合物13
Figure 02_image357
化合物14
Figure 02_image359
化合物15
Figure 02_image361
化合物16
Figure 02_image363
化合物17
Figure 02_image365
化合物18
Figure 02_image367
化合物20
Figure 02_image369
化合物21
Figure 02_image371
化合物22
Figure 02_image373
化合物23
Figure 02_image375
化合物24
Figure 02_image377
化合物25
Figure 02_image379
化合物26
Figure 02_image381
化合物27
Figure 02_image383
化合物28
Figure 02_image385
化合物29
Figure 02_image387
化合物30
Figure 02_image389
化合物31
Figure 02_image391
化合物32
Figure 02_image393
化合物33
Figure 02_image395
化合物34
Figure 02_image397
化合物35
Figure 02_image399
化合物36
Figure 02_image401
化合物37
Figure 02_image403
化合物38
Figure 02_image405
化合物39
Figure 02_image407
化合物40
Figure 02_image409
化合物41
Figure 02_image411
化合物42
Figure 02_image413
化合物43
Figure 02_image415
化合物44
Figure 02_image417
化合物45
Figure 02_image419
化合物46
Figure 02_image421
化合物47
Figure 02_image423
化合物48
Figure 02_image425
化合物49
Figure 02_image427
化合物50
Figure 02_image429
化合物51
Figure 02_image431
化合物52
Figure 02_image433
化合物54
Figure 02_image435
化合物55
Figure 02_image437
化合物56
Figure 02_image439
化合物57
Figure 02_image441
化合物58
Figure 02_image443
化合物59
Figure 02_image445
化合物60
Figure 02_image447
化合物61
Figure 02_image449
化合物62
Figure 02_image451
化合物63
Figure 02_image453
化合物64
Figure 02_image455
化合物65
Figure 02_image457
化合物66
Figure 02_image459
化合物67
Figure 02_image461
化合物68
Figure 02_image463
化合物69
Figure 02_image465
化合物70
Figure 02_image467
化合物71
Figure 02_image469
化合物72
Figure 02_image471
化合物73
Figure 02_image473
化合物74
Figure 02_image475
化合物75
Figure 02_image477
化合物76
Figure 02_image479
化合物77
Figure 02_image481
化合物78
Figure 02_image483
化合物79
Figure 02_image485
化合物80
Figure 02_image487
化合物81
Figure 02_image489
化合物82
Figure 02_image491
化合物83
Figure 02_image493
化合物84
Figure 02_image495
化合物85
Figure 02_image497
化合物86
Figure 02_image499
化合物87
Figure 02_image501
化合物88
Figure 02_image503
化合物89
Figure 02_image505
化合物90
Figure 02_image507
化合物91
Figure 02_image509
化合物92
Figure 02_image511
化合物93
Figure 02_image513
化合物94
Figure 02_image515
化合物95
Figure 02_image517
化合物96
Figure 02_image519
化合物97
Figure 02_image521
化合物98
Figure 02_image523
化合物99
Figure 02_image525
化合物101
Figure 02_image527
化合物102
Figure 02_image529
化合物103
Figure 02_image531
化合物104
Figure 02_image533
化合物105
Figure 02_image535
化合物106
Figure 02_image537
化合物107
Figure 02_image539
化合物108
Figure 02_image541
化合物109
Figure 02_image543
化合物110
Figure 02_image545
化合物111
Figure 02_image547
化合物112
Figure 02_image549
化合物113
Figure 02_image551
化合物114
Figure 02_image553
化合物115
Figure 02_image555
化合物116
Figure 02_image557
化合物117
Figure 02_image559
化合物118
Figure 02_image561
化合物119
Figure 02_image563
化合物120
Figure 02_image565
化合物121
Figure 02_image567
化合物122
Figure 02_image569
化合物123
Figure 02_image571
化合物124
Figure 02_image573
化合物125
Figure 02_image575
化合物126
Figure 02_image577
化合物127
Figure 02_image579
化合物128
Figure 02_image581
化合物129
Figure 02_image583
化合物130
Figure 02_image585
化合物131
Figure 02_image587
化合物132
Figure 02_image589
化合物133
Figure 02_image591
化合物134
Figure 02_image593
化合物135
Figure 02_image595
化合物136
Figure 02_image597
化合物137
Figure 02_image599
化合物138
Figure 02_image601
化合物139
Figure 02_image603
化合物140
Figure 02_image605
化合物141
Figure 02_image607
化合物142
Figure 02_image609
化合物143
Figure 02_image611
化合物144
Figure 02_image613
化合物145
Figure 02_image615
化合物146
Figure 02_image617
化合物147
Figure 02_image619
化合物148
Figure 02_image621
化合物149
Figure 02_image623
化合物150
Figure 02_image625
化合物151
Figure 02_image627
化合物152
Figure 02_image629
化合物153
Figure 02_image631
化合物154
Figure 02_image633
化合物155
應理解，如上所示的本文所提供之化合物的任何實施例，以及如上所示的本文所提供之化合物的任何特定取代基及/或變量可獨立地與該等化合物之其他實施例及/或取代基及/或變量組合以形成以上未具體闡述之實施例。另外，在列出任何特定基團或變數之取代基及/或變量之清單的情況下，應理解，可自特定實施例及/或技術方案中刪除每一個別取代基及/或變量，且其餘的取代基及/或變量清單將被認為在本文所提供之實施例的範圍內。
應理解，在本說明書中，所描繪各式之取代基及/或變量的組合只有在此類貢獻產生穩定化合物時才為容許的。6.4.2 其他可電離之脂質
如本文所述，在一些實施例中，本文所提供之奈米粒子組成物除包含根據式(I)至(IV) (及其子式)之脂質以外，亦包含一或多種帶電或可電離之脂質。不受理論束縛，經審慎考慮，奈米粒子組成物之某些帶電或兩性離子脂質組分類似於細胞膜中之脂質組分，由此可改善奈米粒子之細胞攝取。可形成本發明奈米粒子組成物之一部分的示例性帶電或可電離之脂質包括但不限於3-(雙十二烷基胺基)-N1,N1,4-三(十二烷基)-1-哌𠯤乙胺(KL10)、N1-[2-(雙十二烷基胺基)乙基]-N1,N4,N4-三(十二烷基)-1,4-哌𠯤二乙胺(KL22)、14,25-雙十三烷基-15,18,21,24-四氮雜-八(三十烷)(KL25)、1,2-二亞油基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLinDMA)、2,2-二亞油基-4-二甲基胺基甲基-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-DMA)、4-(二甲基胺基)丁酸七(三十碳)-6,9,28,31-四烯-19-基酯(DLin-MC3-DMA)、2,2-二亞油基-4-(2-二甲基胺基乙基)-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-KC2-DMA)、1,2-二油基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DODMA)、2-({8-[(3β)-膽固-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3 [(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(Octyl-CLinDMA)、(2R)-2-({8-[(3β)-膽固-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(Octyl-CLinDMA (2R))、(2S)-2-({8-[(3β)-膽固-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z- ,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(Octyl-CLinDMA (2S))、(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一碳-12,15-二烯-1-胺、N,N-二甲基-1-{(1S,2R)-2-辛基環丙基}十七烷-8-胺。可形成本發明奈米粒子組成物之一部分的額外示例性帶電或可電離之脂質包括在Sabnis等人, 「A Novel Amino Lipid Series for mRNA Delivery: Improved Endosomal Escape and Sustained Pharmacology and Safety in Non-human Primates」,  Molecular Therapy第26卷, 第6期, 2018年中所述之脂質(例如脂質5)，該文獻全部以引用之方式併入本文。
在一些實施例中，適合陽離子脂質包括氯化N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基銨(DOTMA)；氯化N-[1-(2,3-二油醯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基銨(DOTAP)；1,2-二油醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(DOEPC)；1,2-二月桂醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(DLEPC)；1,2-二肉荳蔻醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(DMEPC)；1,2-二肉荳蔻油醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(14:1)；N1-[2-((1S)-1-[(3-胺基丙基)胺基]-4-[二(3-胺基-丙基)胺基]丁基甲醯胺基)乙基]-3,4-二[油基氧基]-苯甲醯胺(MVL5)；雙十八烷基醯胺基-甘胺醯基精四胺(DOGS)；3b-[N-(N',N'-二甲基胺基乙基)胺甲醯基]膽固醇(DC-Chol)；溴化雙十八烷基二甲基銨(DDAB)；SAINT-2, N-甲基-4-(二油基)甲基吡錠；溴化1,2-二肉荳蔻基氧基丙基-3-二甲基羥乙基銨(DMRIE)；溴化1,2-二油醯基-3-二甲基-羥乙基銨(DORIE)；氯化1,2-二油醯基氧基丙基-3-二甲基羥乙基銨(DORI)；二烷基化胺基酸(DILA2 ) (例如C18:1-norArg-C16)；氯化二油基二甲基銨(DODAC)；1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(POEPC)；1,2-二肉荳蔻油醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(MOEPC)；二油酸(R)-5-(二甲基胺基)戊烷-1,2-二基酯鹽酸鹽(DODAPen-Cl)；二油酸(R)-5-胍基戊烷-1,2-二基酯鹽酸鹽(DOPen-G)；及氯化(R)-N,N,N-三甲基-4,5-雙(油醯基氧基)戊-1-胺鎓鹽(DOTAPen)。具有在生理pH值下帶電荷之頭基的陽離子脂質亦係適合的，諸如一級胺(例如DODAG N',N'-雙十八烷基-N-4,8-二氮雜-10-胺基癸醯基甘胺酸醯胺)及胍鎓頭基(例如雙-胍鎓-精三胺-膽固醇(BGSC)、雙-胍鎓-cholesterol (BGTC)、PONA及二油酸(R)-5-胍基戊烷-1,2-二基酯鹽酸鹽(DOPen-G))。又另一適合的陽離子脂質係二油酸(R)-5-(二甲基胺基)戊烷-1,2-二基酯鹽酸鹽(DODAPen-Cl)。在某些實施例中，陽離子脂質係特定鏡像異構物或外消旋形式，且包括上述陽離子脂質之各種鹽形式(例如氯化物或硫酸鹽)。舉例而言，在一些實施例中，陽離子脂質係氯化N-[1-(2,3-二油醯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基銨(DOTAP-Cl)或硫酸N-[1-(2,3-二油醯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基銨(DOTAP-Sulfate)。在一些實施例中，陽離子脂質係可電離陽離子脂質，諸如溴化雙十八烷基二甲基銨(DDAB)；1,2-二亞油基氧基-3-二甲基胺基丙烷(DLinDMA)；2,2-二亞油基-4-(2二甲基胺基乙基)-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-KC2-DMA)；4-(二甲基胺基)丁酸三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯(DLin-MC3-DMA)；1,2-二油醯基氧基-3-二甲基胺基丙烷(DODAP)；1,2-二油基氧基-3-二甲基胺基丙烷(DODMA)；及N-𠰌啉基膽固醇(Mo-CHOL)。在某些實施例中，脂質奈米粒子包括兩種或多於兩種陽離子脂質(例如兩種或多於兩種上述陽離子脂質)之組合。
另外，在一些實施例中，可形成本發明奈米粒子組成物之一部分的帶電或可電離之脂質係包括環胺基之脂質。適用於本文所揭示之調配物及方法的額外陽離子脂質包括WO2015199952、WO2016176330及WO2015011633中所描述者，各案全部內容以全文引用之方式併入本文中。另外，在一些實施例中，可形成本發明奈米粒子組成物之一部分的帶電或可電離之脂質係包括環胺基之脂質。適用於本文所揭示之調配物及方法的額外陽離子脂質包括WO2015199952、WO2016176330及WO2015011633中所描述者，各案全部內容以全文引用之方式併入本文中。6.4.3 聚合物結合之脂質
在一些實施例中，奈米粒子組成物中之脂質組分可包括一或多種聚合物結合之脂質，諸如聚乙二醇化脂質(PEG脂質)。不受理論束縛，經審慎考慮，奈米粒子組成物中之聚合物結合之脂質組分可改善膠體穩定性及/或減少奈米粒子之蛋白質吸收。可結合本揭示案使用之示例性陽離子脂質包括但不限於PEG改質之磷脂醯乙醇胺、PEG改質之磷脂酸、PEG改質之神經醯胺、PEG改質之二烷基胺、PEG改質之二醯基甘油、PEG改質之二烷基甘油及其混合物。舉例而言，PEG脂質可為PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、PEG-DSPE、神經醯胺-PEG2000或Chol-PEG2000。
在一個實施例中，聚合物結合之脂質係聚乙二醇化脂質。舉例而言，一些實施例包括聚乙二醇化二醯基甘油(PEG-DAG)，諸如1-(單甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉荳蔻基甘油(PEG-DMG)；聚乙二醇化磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)；PEG琥珀酸酯二醯基甘油(PEG-S-DAG)，諸如4-O-(2’,3’-二(十四烷醯氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)；聚乙二醇化神經醯胺(PEG-cer)；或PEG二烷氧基丙基胺基甲酸酯，諸如ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-二(十四烷氧基)丙基)胺基甲酸酯或2,3-二(十四烷氧基)丙基-N-(ω-甲氧基)(聚乙氧基)乙基)胺基甲酸酯。
在一個實施例中，聚合物結合之脂質係以1.0至2.5莫耳%之濃度存在。在一個實施例中，聚合物結合之脂質係以約1.7莫耳%之濃度存在。在一個實施例中，聚合物結合之脂質係以約1.5莫耳%之濃度存在。
在一個實施例中，陽離子脂質與聚合物結合之脂質的莫耳比在約35:1至約25:1範圍內。在一個實施例中，陽離子脂質與聚合物結合之脂質的莫耳比在約100:1至約20:1範圍內。
在一個實施例中，陽離子脂質與聚合物結合之脂質的莫耳比在約35:1至約25:1範圍內。在一個實施例中，陽離子脂質與聚合物結合之脂質的莫耳比在約100:1至約20:1範圍內。
在一個實施例中，聚乙二醇化脂質具有下式：
Figure 02_image635
或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物，其中： R12 及R13 各自獨立地為含有10至30個碳原子之直鏈或支鏈飽和或不飽和烷基鏈，其中該烷基鏈視情況間雜有一或多個酯鍵；且 w具有在30至60範圍內之平均值。
在一個實施例中，R12 及R13 各自獨立地為含有12至16個碳原子之直鏈飽和烷基鏈。在其他實施例中，平均w在42至55之範圍內，例如平均w係42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55。在一些特定實施例中，平均w係約49。
在一個實施例中，聚乙二醇化脂質具有下式：
Figure 02_image637
其中平均w係約49。6.4.4 結構脂質
在一些實施例中，奈米粒子組成物之脂質組分可包括一或多種結構脂質。不受理論束縛，經審慎考慮，結構脂質可使奈米粒子之兩親結構，諸如但不限於奈米粒子之脂質雙層結構穩定。可結合本揭示案使用之示例性結構脂質包括但不限於膽固醇、糞固醇、穀固醇、麥角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜子固醇、番茄鹼、番茄苷、熊果酸、α-生育酚及其混合物。在某些實施例中，結構脂質係膽固醇。在一些實施例中，結構脂質包括膽固醇及皮質類固醇(諸如普賴蘇穠(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、普賴松(prednisone)及氫化可體松(hydrocortisone))或其組合。
在一個實施例中，本文所提供之脂質奈米粒子包含類固醇或類固醇類似物。在一個實施例中，類固醇或類固醇類似物係膽固醇。在一個實施例中，類固醇以在39至49莫耳%、40至46莫耳%、40至44莫耳%、40至42莫耳%、42至44莫耳%或44至46莫耳%範圍內之濃度存在。在一個實施例中，類固醇以40、41、42、43、44、45或46莫耳%之濃度存在。
在一個實施例中，陽離子脂質與類固醇之莫耳比在1.0:0.9至1.0:1.2、或1.0:1.0至1.0:1.2範圍內。在一個實施例中，陽離子脂質與膽固醇之莫耳比在約5:1至1:1範圍內。在一個實施例中，類固醇以在32至40莫耳%類固醇範圍內之濃度存在。
在一個實施例中，陽離子脂質與類固醇之莫耳比在1.0:0.9至1.0:1.2、或1.0:1.0至1.0:1.2範圍內。在一個實施例中，陽離子脂質與膽固醇之莫耳比在約5:1至1:1範圍內。在一個實施例中，類固醇以在32至40莫耳%類固醇範圍內之濃度存在。6.4.5 磷脂
在一些實施例中，奈米粒子組成物中之脂質組分可包括一或多種磷脂，諸如一或多種(多)不飽和脂質。不受理論束縛，經審慎考慮，磷脂可組裝成一或多個脂質雙層結構。可形成本發明奈米粒子組成物之一部分的示例性磷脂包括但不限於1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二亞油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DLPC)、1,2-二肉荳蔻醯基-sn-甘油磷酸膽鹼(DMPC)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)、1,2-二(十一烷醯基)-sn-甘油磷酸膽鹼(DUPC)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(18:0 Diether PC)、1-油醯基-2-膽固醇基半琥珀醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(C16 Lyso PC)、1,2-二亞油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼、1,2-二花生四烯醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼、1,2-二十二碳六烯醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼、1,2-二植烷醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0 PE)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亞油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亞油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二十二碳六烯醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)鈉鹽(DOPG)及鞘磷脂。在某些實施例中，奈米粒子組成物包括DSPC。在某些實施例中，奈米粒子組成物包括DOPE。在一些實施例中，奈米粒子組成物包括DSPC及DOPE兩者。
另外的示例性中性脂質包括例如二棕櫚醯基磷脂醯甘油(DPPG)、棕櫚醯基油醯基磷脂醯乙醇胺(POPE)及二油醯基磷脂醯乙醇胺4-(N-馬來醯亞胺基甲基)-環己烷-1甲酸酯(DOPE-mal)、二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二肉荳蔻醯基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂醯基-磷脂醯乙醇胺(DSPE)、16-O-單甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂醯基-2-油醯基磷脂醯乙醇胺(SOPE)及1,2-二反油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(transDOPE)。在一個實施例中，中性脂質係1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3磷酸膽鹼(DSPC)。在一個實施例中，中性脂質選自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE及SM。
在一個實施例中，中性脂質係磷脂醯膽鹼(PC)、磷脂醯乙醇胺(PE)、磷脂醯絲胺酸(PS)、磷脂酸(PA)或磷脂醯甘油(PG)。
可形成本發明奈米粒子組成物之一部分的額外磷脂亦包括WO2017/112865中所描述者，其全部內容以全文引用之方式併入本文中。6.4.6 調配物
根據本揭示案，本文所描述之奈米粒子組成物可包括至少一種脂質組分及一或多種額外組分，諸如治療劑及/或預防劑(例如本文所描述之治療性核酸)。奈米粒子組成物可設計成用於一或多種特定應用或目標。奈米粒子組成物之成分可基於特定應用或目標，及/或基於一或多種成分之功效、毒性、費用、易用性、可用性或其他特徵來選擇。類似地，奈米粒子組成物之特定配方可根據例如各成分之特定組合的功效及毒性，針對特定應用或目標來選擇。
奈米粒子組成物之脂質組分可包括例如本文所述的根據式(I)至(IV) (及其子式)之一的脂質、磷脂(諸如不飽和脂質，例如DOPE或DSPC)、PEG脂質及結構脂質。脂質組分各成分可以特定百分率提供。
在一個實施例中，本文提供一種奈米粒子組成物，其包含本文所提供的陽離子或可電離之脂質化合物、治療劑及一或多種賦形劑。在一個實施例中，陽離子或可電離之脂質化合物包含如本文所述的根據式(I)至(IV) (及其子式)之一的化合物，以及視情況選用的一或多種額外可電離之脂質化合物。在一個實施例中，該一或多種賦形劑選自中性脂質、類固醇及聚合物結合之脂質。在一個實施例中，治療劑係包封於脂質奈米粒子內或與脂質奈米粒子締合。
在一個實施例中，本文提供一種奈米粒子組成物(脂質奈米粒子)，其包含： i) 在40至50莫耳%的陽離子脂質； ii) 中性脂質； iii) 類固醇； iv) 聚合物結合之脂質；及 v) 治療劑。
如本文所使用，「莫耳百分比」係指一種組分相對於LNP中所有脂質組分之總莫耳數(亦即，陽離子脂質、中性脂質、類固醇及聚合物結合之脂質的總莫耳數)的莫耳百分比。
在一個實施例中，脂質奈米粒子包含41至49莫耳%、41至48莫耳%、42至48莫耳%、43至48莫耳%、44至48莫耳%、45至48莫耳%、46至48莫耳%或47.2至47.8莫耳%的陽離子脂質。在一個實施例中，脂質奈米粒子包含約47.0、47.1、47.2、47.3、47.4、47.5、47.6、47.7、47.8、47.9或48.0莫耳%的陽離子脂質。
在一個實施例中，中性脂質以在5至15莫耳%、7至13莫耳%或9至11莫耳%範圍內之濃度存在。在一個實施例中，中性脂質以約9.5、10或10.5莫耳%之濃度存在。在一個實施例中，陽離子脂質與中性脂質之莫耳比在約4.1:1.0至約4.9:1.0、約4.5:1.0至約4.8:1.0、或約4.7:1.0至4.8:1.0範圍內。
在一個實施例中，類固醇以在39至49莫耳%、40至46莫耳%、40至44莫耳%、40至42莫耳%、42至44莫耳%或44至46莫耳%範圍內之濃度存在。在一個實施例中，類固醇以40、41、42、43、44、45或46莫耳%之濃度存在。在一個實施例中，陽離子脂質與類固醇之莫耳比在1.0:0.9至1.0:1.2、或1.0:1.0至1.0:1.2範圍內。在一個實施例中，類固醇係膽固醇。
在一個實施例中，LNP中治療劑與脂質的比率(亦即，N/P，其中N表示陽離子脂質之莫耳數，P表示作為核酸主鏈之一部分存在的磷酸酯之莫耳數)在2:1至30:1範圍內，例如在3:1到22:1範圍內。在一個實施例中，N/P在6:1至20:1或2:1至12:1範圍內。示例性N/P範圍包括約3:1、約6:1、約12:1及約22:1。
在一個實施例中，本文提供一種脂質奈米粒子，其包含： i) 有效pKa大於6.0之陽離子脂質；ii) 5至15莫耳%之中性脂質； iii) 1至15莫耳%之陰離子脂質； iv) 30至45莫耳%之類固醇； v) 聚合物結合之脂質；以及 vi) 治療劑，或其醫藥學上可接受之鹽或前藥， 其中莫耳百分比係基於脂質奈米粒子中存在之脂質的總莫耳數確定。
在一個實施例中，陽離子脂質可為在選定pH值，諸如生理pH值下帶有淨正電荷之多種脂質物種中之任一種。示例性陽離子脂質在下文描述。在一個實施例中，陽離子脂質之pKa大於6.25。在一個實施例中，陽離子脂質之pKa大於6.5。在一個實施例中，陽離子脂質之pKa大於6.1，大於6.2，大於6.3，大於6.35，大於6.4，大於6.45，大於6.55，大於6.6，大於6.65或大於6.7。
在一個實施例中，脂質奈米粒子包含40至45莫耳%之陽離子脂質。在一個實施例中，脂質奈米粒子包含45至50莫耳%之陽離子脂質。
在一個實施例中，陽離子脂質與中性脂質之莫耳比在約2:1至約8:1範圍內。在一個實施例中，脂質奈米粒子包含5至10莫耳%之中性脂質。
示例性陰離子脂質包括但不限於磷脂醯甘油、二油醯基磷脂醯甘油(DOPG)、二棕櫚醯基磷脂醯甘油(DPPG)或1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油) (DSPG)。
在一個實施例中，脂質奈米粒子包含1至10莫耳%之陰離子脂質。在一個實施例中，脂質奈米粒子包含1至5莫耳%之陰離子脂質。在一個實施例中，脂質奈米粒子包含1至9莫耳%、1至8莫耳%、1至7莫耳%或1至6莫耳%之陰離子脂質。在一個實施例中，陰離子脂質與中性脂質之莫耳比在1:1至1:10範圍內。
在一個實施例中，類固醇係膽固醇。在一個實施例中，陽離子脂質與膽固醇之莫耳比在約5:1至1:1範圍內。在一個實施例中，脂質奈米粒子包含32至40莫耳%之類固醇。
在一個實施例中，中性脂質之莫耳百分比與陰離子脂質之莫耳百分比的總和在5至15莫耳%範圍內。在一個實施例中，中性脂質之莫耳百分比及陰離子脂質之莫耳百分比的總和在7至12莫耳%範圍內。
在一個實施例中，陰離子脂質與中性脂質之莫耳比在1:1至1:10範圍內。在一個實施例中，中性脂質之莫耳百分比與類固醇之莫耳百分比的總和在35至45莫耳%範圍內。
在一個實施例中，脂質奈米粒子包含： i) 45至55莫耳%之陽離子脂質； ii) 5至10莫耳%之中性脂質； iii) 1至5莫耳%之陰離子脂質；以及 iv) 32至40莫耳%之類固醇。
在一個實施例中，脂質奈米粒子包含1.0至2.5莫耳%的經結合脂質。在一個實施例中，聚合物結合之脂質係以約1.5莫耳%之濃度存在。
在一個實施例中，中性脂質以在5至15莫耳%、7至13莫耳%或9至11莫耳%範圍內之濃度存在。在一個實施例中，中性脂質以約9.5、10或10.5莫耳%之濃度存在。在一個實施例中，陽離子脂質與中性脂質之莫耳比在約4.1:1.0至約4.9:1.0、約4.5:1.0至約4.8:1.0、或約4.7:1.0至4.8:1.0範圍內。
在一個實施例中，類固醇係膽固醇。在一個實施例中，類固醇以在39至49莫耳%、40至46莫耳%、40至44莫耳%、40至42莫耳%、42至44莫耳%或44至46莫耳%範圍內之濃度存在。在一個實施例中，類固醇以40、41、42、43、44、45或46莫耳%之濃度存在。在一個實施例中，陽離子脂質與類固醇之莫耳比在1.0:0.9至1.0:1.2、或1.0:1.0至1.0:1.2範圍內。
在一個實施例中，陽離子脂質與類固醇之莫耳比在5:1至1:1範圍內。
在一個實施例中，脂質奈米粒子包含1.0至2.5莫耳%的經結合脂質。在一個實施例中，聚合物結合之脂質係以約1.5莫耳%之濃度存在。
在一個實施例中，陽離子脂質與聚合物結合之脂質的莫耳比在約100:1至約20:1範圍內。在一個實施例中，陽離子脂質與聚合物結合之脂質的莫耳比在約35:1至約25:1範圍內。
在一個實施例中，陽離子脂質與聚合物結合之脂質的莫耳比在約100:1至約20:1範圍內。在一個實施例中，陽離子脂質與聚合物結合之脂質的莫耳比在約35:1至約25:1範圍內。
在一個實施例中，脂質奈米粒子之平均直徑在50 nm至100 nm，或60 nm至85 nm範圍內。
在一個實施例中，該組成物包含本文所提供之陽離子脂質、DSPC、膽固醇及PEG-脂質，以及mRNA。在一個實施例中，本文所提供之陽離子脂質、DSPC、膽固醇及PEG-脂質的莫耳比為約50:10:38.5:1.5。
奈米粒子組成物可設計成用於一或多種特定應用或目標。舉例而言，奈米粒子組成物可設計成用於將治療劑及/或預防劑，諸如RNA遞送至哺乳動物體內之特定細胞、組織、器官或系統或其群組。奈米粒子組成物之物理化學特性可經改變以增加對特定身體目標之選擇性。舉例而言，可基於不同器官之開窗大小來調整粒度。奈米粒子組成物中所包括的治療劑及/或預防劑亦可基於一或多個所希望之遞送目標進行選擇。舉例而言，治療劑及/或預防劑可針對特定適應症、疾患、疾病或病症及/或針對遞送至特定細胞、組織、器官或系統或其群組(例如局部或特異性遞送)進行選擇。在某些實施例中，奈米粒子組成物可包括編碼能夠在細胞內轉譯產生感興趣多肽之感興趣多肽的mRNA。此類組成物可設計成特異性遞送至特定器官。在某些實施例中，組成物可設計成特異性遞送至哺乳動物肝臟。
奈米粒子組成物中治療劑及/或預防劑之量可取決於奈米粒子組成物之大小、組成、期望目標及/或應用，或其他特性，以及治療劑及/或預防劑之特性。舉例而言，可用於奈米粒子組成物中的RNA之量可取決於RNA之大小、序列及其他特徵。奈米粒子組成物中治療劑及/或預防劑及其他成分(例如脂質)之相對量亦可變化。在一些實施例中，奈米粒子組成物中脂質組分與治療劑及/或預防劑之wt/wt比率可為約5:1至約60:1，諸如為約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、22:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1及60:1。舉例而言，脂質組分與治療劑及/或預防劑之wt/wt比率可為約10:1至約40:1。在某些實施例中，wt/wt比率為約20:1。奈米粒子組成物中治療劑及/或預防劑之量可例如使用吸收光譜法(例如紫外-可見光譜法)量測。
在一些實施例中，奈米粒子組成物包括一或多種RNA，且可選擇一或多種RNA、脂質及其量來提供特定N:P比。組成物之N:P比係指一或多種脂質中之氮原子與RNA中磷酸酯基之數量的莫耳比。在一些實施例中，選擇較低的N:P比。可選擇一或多種RNA、脂質及其量以提供約2:1至約30:1，諸如2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、12:1、14:1、16:1、18:1、20:1、22:1、24:1、26:1、28:1或30:1之N:P比。在某些實施例中，N:P比可為約2:1至約8:1。在其他實施例中，N:P比為約5:1至約8:1。舉例而言，N:P比可為約5.0:1、約5.5:1、約5.67:1、約6.0:1、約6.5:1或約7.0:1。舉例而言，N:P比可為約5.67:1。
奈米粒子組成物之物理特性可取決於其組分。舉例而言，包括膽固醇作為結構脂質之奈米粒子組成物可具有與包括不同結構脂質之奈米粒子組成物不同的特徵。類似地，奈米粒子組成物之特徵可取決於其組分之絕對或相對量。舉例而言，包括較高莫耳分率之磷脂的奈米粒子組成物可具有與包括較低莫耳分率之磷脂之奈米粒子組成物不同的特徵。特性亦可取決於奈米粒子組成物之製備方法及條件而變化。
奈米粒子組成物可藉由多種方法表徵。舉例而言，可使用顯微鏡檢查(例如透射電子顯微鏡檢查或掃描電子顯微鏡檢查)來檢查奈米粒子組成物之形態及大小分佈。可使用動態光散射或電位測定法(例如電位滴定法)量測ζ電位。動態光散射亦可用於確定粒度。亦可使用儀器，諸如Zetasizer Nano ZS (Malvem Instruments Ltd, Malvem, Worcestershire, UK)量測奈米粒子組成物之多個特徵，諸如粒度、多分散指數及ζ電位。
在各個實施例中，奈米粒子組成物之平均大小可在數十奈米至數百奈米之間。舉例而言，平均大小可為約40 nm至約150 nm，諸如約40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、105 nm、110 nm、115 nm、120 nm、125 nm、130 nm、135 nm、140 nm、145 nm或150 nm。在一些實施例中，奈米粒子組成物之平均大小可為約50 nm至約100 nm、約50 nm至約90 nm、約50 nm至約80 nm、約50 nm至約70 nm、約50 nm至約60 nm、約60 nm至約100 nm、約60 nm至約90 nm、約60 nm至約80 nm、約60 nm至約70 nm、約70 nm至約100 nm、約70 nm至約90 nm、約70 nm至約80 nm、約80 nm至約100 nm、約80 nm至約90 nm、或約90 nm至約100 nm。在某些實施例中，奈米粒子組成物之平均大小可為約70 nm至約100 nm。在一些實施例中，平均大小可為約80 nm。在其他實施例中，平均大小可為約100 nm。
奈米粒子組成物可為相對均質的。多分散指數可用於指示奈米粒子組成物之均勻性，例如奈米粒子組成物之粒度分佈。較小(例如小於0.3)的多分散指數一般指示較窄的粒度分佈。奈米粒子組成物之多分散指數可為約0至約0.25，例如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25。在一些實施例中，奈米粒子組成物之多分散指數可為約0.10至約0.20。
奈米粒子組成物之ζ電位可用於指示該組成物之動電位。舉例而言，ζ電位可描述奈米粒子組成物之表面電荷。具有相對較低正或負電荷之奈米粒子組成物一般係合意的，因為帶較高電荷之物質可與體內之細胞、組織及其他成分發生不合意之相互作用。在一些實施例中，奈米粒子組成物之ζ電位可為約-10 mV至約+20 mV、約-10 mV至約+15 mV、約-10 mV至約+10 mV、約-10 mV至約+5 mV、約-10 mV至約 0 mV、約-10 mV 至約-5 mV、約-5 mV至約+20 mV、約-5 mV至約+15 mV、約-5 mV至約+10 mV、約-5 mV至約+5 mV、約-5 mV 至約 0 mV、約 0 mV至約+20 mV、約 0 mV至約+15 mV、約 0 mV至約+10 mV、約 0 mV至約+5 mV、約 +5 mV至約+20 mV、約 +5 mV至約+15 mV、或約+5 mV至約+10 mV。
治療劑及/或預防劑之包封效率描述相對於所提供之初始量，在製備後經奈米粒子組成物包封或以其他方式與奈米粒子組成物締合的治療劑及/或預防劑之量。包封效率合意地較高(例如接近100%)。包封效率可例如藉由比較在用一或多種有機溶劑或清潔劑破壞奈米粒子組成物之前與之後含有奈米粒子組成物之溶液中治療劑及/或預防劑之量來量測。螢光可用於量測溶液中游離治療劑及/或預防劑(例如RNA)之量。對於本文所述之奈米粒子組成物，治療劑及/或預防劑之包封效率可為至少50%，例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，包封效率可為至少80%。在某些實施例中，包封效率可為至少90%。
奈米粒子組成物可視情況包含一或多種包覆劑。舉例而言，可將奈米粒子組成物調配成具有包覆劑之膠囊、膜片或錠劑。包括本文所述組成物之膠囊、膜片或錠劑可具有任何有用的大小、抗拉強度、硬度或密度。6.4.7 醫藥 組成物
根據本揭示案，奈米粒子組成物可整體或部分地調配成醫藥組成物。醫藥組成物可包括一或多種奈米粒子組成物。舉例而言，醫藥組成物可包括一或多種奈米粒子組成物，該一或多種奈米粒子組成物包括一或多種不同的治療劑及/或預防劑。醫藥組成物可進一步包括一或多種醫藥學上可接受之賦形劑或輔助成分，諸如本文所述者。關於醫藥組成物及各劑之調配及製造的一般準則可見於例如Remington’s The Science and Practice of Pharmacy, 第21版, A. R. Gennaro；Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, Md., 2006。習知賦形劑及輔助成分可用於任何醫藥組成物中，除非任何習知賦形劑或輔助成分不可與奈米粒子組成物之一或多種組分相容。若賦形劑或輔助成分與奈米粒子組成物之組分不相容，則其與該組分之組合會導致任何不希望之生物作用或其他有害作用。
在一些實施例中，該一或多種賦形劑或輔助成分可構成包括奈米粒子組成物之醫藥組成物之總質量或體積的超過50%。舉例而言，該一或多種賦形劑或輔助成分可構成醫藥慣例(pharmaceutical convention)之50%、60%、70%、80%、90%或跟高百分比。在一些實施例中，醫藥學上可接受之賦形劑為至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%純。在一些實施例中，賦形劑經批准用於人類及獸醫用途。在一些實施例中，賦形劑得到美國食品與藥物管理局批准。在一些實施例中，賦形劑係醫藥級的。在一些實施例中，賦形劑符合美國藥典(USP)、歐洲藥典(EP)、英國藥典及/或國際藥典之標準。
根據本揭示案之醫藥組成物中的一或多種奈米粒子組成物、一或多種醫藥學上可接受之賦形劑及/或任何額外成分的相對量將取決於所治療個體之身分、體格及/或狀況且進一步取決於投與組成物之途徑而變化。舉例而言，醫藥組成物可包含在0.1%與100% (wt/wt)之間的一或多種奈米粒子組成物。
在某些實施例中，本揭示案之奈米粒子組成物及/或醫藥組成物經冷藏或冷凍儲存及/或運輸(例如在4℃或更低溫度下，諸如在約-150℃與約0℃之間或在約-80℃與約-20℃之間(例如約-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-130℃或-150℃溫度下儲存)。舉例而言，包含式(I)至(IV) (及其子式)中任一個之化合物的醫藥組成物係在例如約-20℃、30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下冷藏儲存及/或運輸之溶液。在某些實施例中，本揭示案亦關於一種藉由在4℃或更低溫度下，諸如在約-150℃與約0℃之間或在約-80℃與約-20℃之間之溫度下，例如在約-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-130℃或-150℃溫度下儲存包含式(I)至(IV) (及其子式)中任一個之化合物的奈米粒子組成物及/或醫藥組成物來增加該等奈米粒子組成物及/或醫藥組成物之穩定性的方法。舉例而言，本文所揭示之奈米粒子組成物及/或醫藥組成物在例如4℃或更低(例如約4℃與-20℃之間)之溫度下穩定保持約至少1週、至少2週、至少3週、至少4週、至少5週、至少6週、至少1個月、至少2個月、至少4個月、至少6個月、至少8個月、至少10個月、至少12個月、至少14個月、至少16個月、至少18個月、至少20個月、至少22個月或至少24個月。在一個實施例中，調配物在約4℃下穩定保持至少4週。在某些實施例中，本揭示案之醫藥組成物包含本文所揭示之奈米粒子組成物及醫藥學上可接受之載劑，該載劑選自以下中之一或多種：Tris、乙酸鹽(例如乙酸鈉)、檸檬酸鹽(例如檸檬酸鈉)、鹽水、PBS及蔗糖。在某些實施例中，本揭示案之醫藥組成物的pH值在約7與8之間(例如6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0，或在7.5與8之間或在7與7.8之間)。舉例而言，本揭示案之醫藥組成物包含本文所揭示之奈米粒子組成物、Tris、鹽水及蔗糖，且具有約7.5-8之pH值，其適於在例如約-20℃下儲存及/或運輸。舉例而言，本揭示案之醫藥組成物包含本文所揭示之奈米粒子組成物及PBS，且具有約7-7.8之pH值，適合於在例如約4℃或更低溫度下儲存及/或運輸。在本揭示案之上下文中，「穩定性」、「穩定化」及「穩定的」係指本文所揭示之奈米粒子組成物及/或醫藥組成物在給定製造、製備、轉運、儲存及/或使用條件下，例如當施加壓力，諸如剪切力、冷凍/解凍壓力等時，對化學或物理變化(例如降解、粒度變化、聚集、包封之變化等)具有抗性。
可將奈米粒子組成物及/或包括一或多種奈米粒子組成物之醫藥組成物投與任何患者或個體，包括可受益於藉由將治療劑及/或預防劑遞送至一或多個特定細胞、組織、器官或系統或其群組，諸如腎臟系統所提供之治療作用的患者或個體。儘管本文所提供的關於奈米粒子組成物及包括奈米粒子組成物之醫藥組成物的描述主要針對適合於投與人類之組成物，但熟習此項技術者應理解，此類組成物一般適合於投與任何其他哺乳動物。為了使該等組成物適合於投與各種動物而對適於投與人類之組成物的改進係眾所周知的，且有普通技術之獸醫藥理學家僅藉由普通實驗(若有的話)即可設計及/或進行此類改進。經考慮，投與該等組成物之個體包括但不限於人類、其他靈長類動物及其他哺乳動物，包括商業上相關之哺乳動物，諸如牛、豬、馬、綿羊、貓、犬、小鼠及/或大鼠。
包括一或多種奈米粒子組成物之醫藥組成物可藉由藥理學領域中已知或以後將開發之任何方法製備。一般而言，此類製備方法包括使活性成分與賦形劑及/或一或多種其他輔助成分結合，且接著，若需要或必要，則將產物分成、成型成及/或包裝成所希望之單劑量或多劑量單元形式。
根據本揭示案之醫藥組成物可作為單次單位劑量及/或作為多個單次單位劑量製備、包裝及/或出售。如本文所使用，「單位劑量」係包含預定量之活性成分(例如奈米粒子組成物)之醫藥組成物的離散量。活性成分之量一般等於將被投與個體之活性成分的劑量及/或此類劑量之便利部分，諸如此類劑量之一半或三分之一。
醫藥組成物可製備成適合多種投與途徑及方法之多種形式。舉例而言，醫藥組成物可製備成液體劑型(例如乳液、微乳液、奈米級乳液、溶液、懸浮液、糖漿及酏劑)、可注射形式、固體劑型(例如膠囊、錠劑、丸劑、粉劑及顆粒劑)、用於表面及/或經皮投與之劑型(例如軟膏劑、糊劑、乳膏劑、洗劑、凝膠劑、粉劑、溶液、噴霧劑、吸入劑及貼片)、懸浮液、粉劑及其他形式。
經口及不經腸投與之液體劑型包括但不限於醫藥學上可接受之乳液、微乳液、奈米級乳液、溶液、懸浮液、糖漿及/或酏劑。除活性成分外，液體劑型亦可包含此項技術中常用之惰性稀釋劑，諸如水或其他溶劑、增溶劑及乳化劑，諸如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺、油類(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油及芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇及脫水山梨糖醇脂肪酸酯，以及其混合物。除惰性稀釋劑外，口服組成物亦可包括額外治療劑及/或預防劑、額外劑，諸如濕潤劑、乳化劑及懸浮劑、甜味劑、調味劑及/或加香劑。在供非經腸投與之某些實施例中，將組成物與增溶劑混合，該等增溶劑諸如為CremophorTM 、醇、油、改質油、二醇、聚山梨醇酯、環糊精、聚合物及/或其組合。
可注射製劑，例如無菌可注射水性或油性懸浮液，可根據已知技術，使用適合分散劑、濕潤劑及/或助懸劑來調配。無菌注射製劑可為在無毒非經腸可接受之稀釋劑及/或溶劑中之無菌注射溶液、懸浮液及/或乳液，例如在1,3-丁二醇中之溶液。可以使用的可接受之媒劑及溶劑為水、林格氏溶液(Ringer’s solution)、U.S.P.及等張氯化鈉溶液。無菌不揮發性油通常用作溶劑或懸浮介質。為此，可以使用任何溫和的不揮發性油，包括合成甘油單酯或甘油二酯。脂肪酸如油酸可用於製備註射劑。
可注射調配物可經滅菌，例如藉由濾過細菌截留過濾器過濾，及/或藉由併入呈無菌固體組成物形式之滅菌劑來滅菌，該滅菌劑可在使用前溶解或分散於無菌水或其他無菌可注射介質中。
本揭示案之特徵在於向哺乳動物細胞或器官遞送治療劑及/或預防劑，在哺乳動物細胞中產生感興趣多肽，以及治療有需要之哺乳動物之疾病或病症的方法，該等方法包括向哺乳動物投與包括治療劑及/或預防劑之奈米粒子組成物及/或使哺乳動物細胞與該奈米粒子組成物接觸。6.5 方法
在一個態樣中，本文亦提供用於管理、預防及治療個體的由冠狀病毒感染引起之感染性疾病的方法。在一些實施例中，用本文所述之方法管理、預防或治療的感染性疾病係由感染冠狀病毒引起，該冠狀病毒選自SARS-CoV-2、嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒(SARS-CoV)、中東呼吸症候群冠狀病毒(MERS-CoV)、人冠狀病毒NL63 (HCoV-NL63)、人冠狀病毒OC43、豬流行性腹瀉冠狀病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎冠狀病毒(TGEV)、豬呼吸道冠狀病毒(PRCV)、蝙蝠冠狀病毒HKU4、小鼠肝炎冠狀病毒(MHV)、牛冠狀病毒(BCoV)、禽類感染性支氣管炎冠狀病毒(IBV)、豬δ冠狀病毒(PdCV)。
在特定實施例中，用本文所述之方法管理、預防或治療的感染性疾病係由冠狀病毒感染個體之呼吸系統、神經系統、免疫系統、消化系統及/或主要器官引起(例如人類或非人類哺乳動物)。在本文所描述之方法的一些實施例中，感染性疾病係呼吸道感染、肺感染、腎感染、肝感染、腸感染、神經系統感染、呼吸道症候群、支氣管炎、肺炎、腸胃炎、腦脊髓炎、腦炎、類肉瘤病、腹瀉、肝炎及脫髓鞘疾病。在特定實施例中，感染性疾病係由SARS-CoV-2感染引起的呼吸道感染、肺感染、肺炎或呼吸道症候群。
在一些實施例中，用於管理、預防及治療個體的由冠狀病毒感染引起之感染性疾病的本發明方法包括向個體投與治療有效量的本文所述之治療性核酸。在特定實施例中，治療性核酸係如本文所述之mRNA分子。
在一些實施例中，用於管理、預防及治療由冠狀病毒感染引起之感染性疾病的本發明方法包括向個體投與治療有效量的包含本文所述之治療性核酸的治療性組成物。在特定實施例中，治療性核酸係如本文所述之mRNA分子。
在一些實施例中，用於管理、預防及治療個體的由冠狀病毒感染引起之感染性疾病的本發明方法包括向個體投與治療有效量的包含本文所述之治療性核酸的疫苗組成物。在特定實施例中，治療性核酸係如本文所述之mRNA分子。
在一些實施例中，用於管理、預防及治療個體的由冠狀病毒感染引起之感染性疾病的本發明方法包括向個體投與治療有效量的包含本文所述之治療性核酸的含脂質組成物。在特定實施例中，治療性核酸係如本文所述之mRNA分子。
在一些實施例中，用於管理、預防及治療個體的由冠狀病毒感染引起之感染性疾病的本發明方法包括向個體投與治療有效量的包含本文所述之治療性核酸的含脂質組成物，其中該含脂質組成物係調配為將治療性核酸包封在脂質殼中之脂質奈米粒子。在特定實施例中，治療性核酸係如本文所述之mRNA分子。在特定實施例中，在投與後，個體之細胞有效攝取本文所述之含脂質組成物(例如脂質奈米粒子)。在特定實施例中，本文所述之含脂質組成物(例如脂質奈米粒子)經個體之細胞胞吞。
在一些實施例中，在向有需要之個體投與如本文所述之治療性核酸、包含本文所述之治療性核酸的疫苗組成物、包含本文所述之治療性核酸的含脂質組成物(例如脂質奈米粒子)時，個體之細胞攝取並表現所投與之治療性核酸以產生由該核酸編碼的肽或多肽。在一些實施例中，編碼之肽或多肽來源於引起藉由該方法管理、預防或治療之感染性疾病的冠狀病毒。6.5.1 免疫反應
在一些實施例中，在向有需要之個體投與如本文所述之治療性核酸、包含本文所述之治療性核酸的疫苗組成物、包含本文所述之治療性核酸的含脂質組成物(例如脂質奈米粒子)時，在個體中引起針對冠狀病毒之一或多種免疫反應。在一些實施例中，引起之免疫反應包含針對冠狀病毒的一或多種適應性免疫反應。在一些實施例中，引起之免疫反應包含針對冠狀病毒的一或多種先天性免疫反應。該一或多種免疫反應可呈例如抗體反應(體液反應)，或細胞免疫反應，例如細胞介素分泌(例如干擾素-γ)、輔助細胞活性或細胞毒性形式。在一些實施例中，免疫細胞上活化標記物之表現、免疫細胞上共刺激受體之表現、共刺激受體之配體的表現、細胞介素分泌，免疫細胞(例如T淋巴細胞、B淋巴細胞及/或NK細胞)浸潤至感染細胞中、產生特異性識別一或多種病毒蛋白(例如治療性核酸編碼之病毒肽或蛋白質)之抗體、效應功能、T細胞活化、T細胞分化、T細胞增殖、B細胞分化、B細胞增殖及/或NK細胞增殖經誘導、活化及/或增強。在一些實施例中，骨髓源性抑制細胞(MDSC)及Treg細胞之活化及增殖受到抑制。
在一些實施例中，在向有需要之個體投與如本文所述之治療性核酸、包含本文所述之治療性核酸的疫苗組成物、包含本文所述之治療性核酸的含脂質組成物(例如脂質奈米粒子)時，在個體體內產生針對冠狀病毒或感染冠狀病毒之細胞的一或多種中和抗體。
在特定實施例中，中和抗體特異性結合冠狀病毒S蛋白之一或多個抗原決定基，並抑制或降低一或多種S蛋白功能或活性。在特定實施例中，S蛋白與其細胞受體之結合減少或受抑制。在特定實施例中，冠狀病毒S蛋白與宿主細胞表面上血管緊張素轉化酶2 (ACE2)、胺基肽酶N (APN)、二肽基肽酶4 (DPP4)、癌胚抗原相關細胞黏附分子1 (CEACAM1)及/或糖之結合減少或受抑制。在特定實施例中，冠狀病毒與個體宿主細胞的附著減少或受抑制。在特定實施例中，冠狀病毒誘導之宿主細胞膜融合減少或受抑制。在特定實施例中，冠狀病毒對個體宿主細胞之感染(例如進入)減少或受抑制。在一些實施例中，中和抗體使S蛋白功能或活性降低10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%。
在另一個實施例中，在個體體內產生針對冠狀病毒或感染冠狀病毒之細胞的中和抗體。在特定實施例中，中和抗體特異性結合至冠狀病毒N蛋白之一或多個抗原決定基，並抑制或降低一或多種N蛋白功能或活性。在特定實施例中，冠狀病毒N蛋白與複製之病毒基因體序列之結合減少或受抑制。在特定實施例中，繁殖之病毒基因體序列包裝到功能性病毒衣殼中。在特定實施例中，冠狀病毒存活子代之繁殖減少或受抑制。在一些實施例中，中和抗體使S蛋白功能或活性降低10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%。
在特定實施例中，中和抗體結合至存在於病毒粒子或感染細胞表面上的一或多種病毒蛋白，並標記病毒粒子或感染細胞以由個體之免疫系統破壞。在一些實施例中，白細胞(例如巨噬細胞)對病毒粒子之胞吞作用經誘導或增強。在一些實施例中，針對個體之感染細胞的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)經誘導或增強。在一些實施例中，針對個體之感染細胞的抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)經誘導或增強。在一些實施例中，針對個體之感染細胞之補體依賴性細胞毒性(CDC)經誘導或增強。6.5.2 組合療法
在一些實施例中，本揭示案之組成物可進一步包含一或多種額外治療劑。在一些實施例中，該額外治療劑係能夠增強組成物之免疫原性的佐劑(例如基因疫苗)。在一些實施例中，該額外治療劑係增強個體之免疫反應的免疫調節劑。在一些實施例中，組成物中之佐劑及治療性核酸可在引發個體之免疫反應中具有協同作用。
在一些實施例中，本揭示案之額外治療劑及治療核酸可共調配成一種組成物。舉例而言，該額外治療劑可調配作為包含本揭示案之治療性核酸之組成物的一部分。或者，在一些實施例中，本揭示案之額外治療劑及治療性核酸可調配成單獨的組成物或劑量單元，以依序或同時共投與個體。
在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸係調配作為如第 6.4 節 所述之含脂質組成物的一部分，且該額外治療劑係調配為單獨的組成物。在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸係調配為如第 6.4 節 所述之含脂質組成物的一部分，其中該額外治療劑亦調配為含脂質組成物的一部分。
在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸係調配成使得治療性核酸包封於如第 6.4 節 中所述之脂質奈米粒子的脂質殼中，且該額外治療劑係調配為單獨的組成物。在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸係調配成使得治療性核酸包封在如第 6.4 節 中所述之脂質奈米粒子的脂質殼中，其中該等脂質奈米粒子亦包封該額外治療劑分子或編碼該額外治療劑分子之核酸。在特定實施例中，本揭示案之治療性核酸係調配成使得治療性核酸包封於如第 6.4 節 中所述之脂質奈米粒子的脂質殼中，且該等脂質奈米粒子及該額外治療劑係調配成單獨的組成物。
在特定實施例中，該額外治療劑係佐劑。在一些實施例中，佐劑包含促進接種疫苗之個體中樹突狀細胞(DC)之成熟的劑，諸如但不限於脂多醣、TNF-α或CD40配體。在一些實施例中，佐劑係被接種疫苗之個體的免疫系統識別為「危險信號」的劑，諸如LPS、GP96等。
在一些實施例中，佐劑包含免疫刺激性細胞介素，諸如但不限於IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、INF-α、IFN- β、INF-γ、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、LT-β或TNF-α、生長因子，諸如hGH。
在一些實施例中，佐劑包含已知能夠引起先天免疫反應之化合物。此化合物之一個示例性類別係鐸樣受體(Toll-like receptor)配體，諸如人鐸樣受體TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10之配體，及鼠類鐸樣受體TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12或TLR13之配體。此類化合物之另一個示例性類別係免疫刺激性核酸，諸如含有CpG模體之寡核苷酸。含CpG之核酸可為DNA (CpG-DNA)或RNA (CpG-RNA)分子。CpG-RNA或CpG-DNA可為單股CpG-DNA (ss CpG-DNA)、雙股CpG-DNA (dsDNA)、單股CpG-RNA (ss CpG-RNA)或雙股CpG-RNA (ds CpG-RNA)。在一些實施例中，CpG核酸呈CpG-RNA形式。在特定實施例中，CpG核酸係呈單股CpG-RNA (ss CpG-RNA)形式。在一些實施例中，CpG核酸含有至少一個或多個(促有絲分裂)胞嘧啶/鳥嘌呤二核苷酸序列(CpG模體)。在一些實施例中，包含在此等序列中之至少一個CpG模體(亦即，形成CpG模體之C (胞嘧啶)及/或G (鳥嘌呤))未經甲基化。
在一些實施例中，該額外治療劑係活化、增強或恢復正常免疫功能之免疫調節劑。在特定實施例中，免疫調節劑係免疫細胞，諸如T淋巴細胞、NK細胞或抗原呈現細胞(例如樹突狀細胞或巨噬細胞)之共刺激信號的促效劑。在特定實施例中，免疫調節劑係免疫細胞，諸如T淋巴細胞、NK細胞或抗原呈現細胞(例如樹突狀細胞或巨噬細胞)之抑制信號的拮抗劑。
各種免疫細胞刺激劑係熟習此項技術者已知的，且可與本揭示案結合使用。在某些實施例中，共刺激信號之促效劑係在免疫細胞，諸如T淋巴細胞(例如CD4 +或CD8 + T淋巴細胞)、NK細胞及/或抗原呈現細胞(例如樹突狀細胞或巨噬細胞)上發現的共刺激分子(例如共刺激受體)之促效劑。共刺激分子之具體實例包括糖皮質激素誘導之腫瘤壞死因子受體(GITR)、誘導型T細胞共刺激物(ICOS或CD278)、OX40 (CD134)、CD27、CD28、4-IBB (CD137)、CD40、淋巴毒素α (LT α)、LIGHT (類淋巴毒素，展現可誘導之表現，並與單純疱疹病毒糖蛋白D競爭HVEM，HVEM係一種由T淋巴細胞表現之受體)、CD226、細胞毒性及調節性T細胞分子(CRT AM)、死亡受體3 (DR3)、淋巴毒素-β受體(LTBR)、跨膜活化物與CAML相互作用分子(TACI)、B細胞活化因子受體(BAFFR)及B細胞成熟蛋白(BCMA)。
在特定實施例中，共刺激受體之促效劑係特異性結合至該共刺激受體的抗體或其抗原結合片段。共刺激受體之具體實例包括GITR、ICOS、OX40、CD27、CD28、4-1BB、CD40、LT α、LIGHT、CD226、CRT AM、DR3、LTBR、TACI、BAFFR及BCMA。在某些特定實施例中，該抗體係單株抗體。在其他特定實施例中，抗體係sc-Fv。在一個特定實施例中，該抗體係結合至免疫細胞上之兩個受體的雙特異性抗體。在其他實施例中，雙特異性抗體結合至免疫細胞上之受體以及感染病毒之患病細胞上的另一受體。在特定實施例中，抗體係人抗體或人類化抗體。
在另一個實施例中，共刺激受體之促效劑係共刺激受體之配體或其功能性衍生物。在某些實施例中，該配體係天然配體之片段。天然配體之具體實例包括ICOSL、B7RP1、CD137L、OX40L、CD70、疱疹病毒進入介體(HVEM)、CD80及CD86。編碼天然配體之核苷酸序列以及天然配體之胺基酸序列係此項技術中已知的。
在特定實施例中，拮抗劑係在免疫細胞，諸如T淋巴細胞(例如CD4 +或CD8+ T淋巴細胞)、NK細胞及/或抗原呈現細胞(例如樹突狀細胞或巨噬細胞)上發現之抑制性分子(例如抑制性受體)的拮抗劑。抑制性分子之具體實例包括細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4 (CTLA-4或CD52)、計劃性細胞死亡蛋白1 (PD1或CD279)、B及T淋巴細胞衰減因子(BTLA)、殺手細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)、淋巴細胞活化基因3 (LAG3)、T細胞膜蛋白3 (TIM3)、CD 160、腺苷A2a受體(A2aR)、具有免疫球蛋白及ITIM結構域之T細胞免疫受體(TIGIT)、白細胞相關免疫球蛋白樣受體1 (LAIR1)及CD 160。
在另一個實施例中，抑制性受體之拮抗劑係特異性結合至抑制性受體之天然配體並封閉天然配體以免結合抑制性受體及轉導抑制信號的抗體(或抗原結合片段)。在某些特定實施例中，該抗體係單株抗體。在其他特定實施例中，抗體係sc-Fv。在一個特定實施例中，該抗體係結合至免疫細胞上之兩個受體的雙特異性抗體。在其他實施例中，雙特異性抗體結合至免疫細胞上之受體以及感染病毒之患病細胞上的另一受體。在特定實施例中，抗體係人抗體或人類化抗體。
在另一個實施例中，抑制性受體之拮抗劑係特異性結合至抑制性受體之天然配體並封閉天然配體以免結合抑制性受體及轉導抑制信號的可溶性受體或其功能性衍生物。抑制性受體之天然配體的具體實例包括PDL-1、PDL-2、B7-H3、B7-H4、HVEM、Gal9及腺苷。結合至天然配體之抑制性受體的具體實例包括CTLA-4、PD-1、BTLA、KIR、LAG3、TIM3及A2aR。
在另一個實施例中，抑制性受體之拮抗劑係結合至抑制性受體但不轉導抑制信號的抗體(或抗原結合片段)或配體。抑制性受體之具體實例包括CTLA-4、PD1、BTLA、KIR、LAG3、TIM3及A2aR。在某些特定實施例中，該抗體係單株抗體。在其他特定實施例中，抗體係scFv。在特定實施例中，抗體係人抗體或人類化抗體。針對抑制性受體之抗體的具體實例係抗CTLA-4抗體(Leach DR等人, Science 1996；271: 1734-1736)。針對抑制性受體之抗體的另一個實例係抗PD-1抗體(Topalian SL, NEJM 2012；28:3167-75)。6.5.3 患者群
在一些實施例中，將本文所述之治療性核酸、包含本文所述之治療性核酸的疫苗組成物、包含本文所述之治療性核酸的含脂質組成物(例如脂質奈米粒子)或本文所述之組合療法投與有需要之個體。
在一些實施例中，將本文所述之治療性核酸、包含本文所述之治療性核酸的疫苗組成物、包含本文所述之治療性核酸的含脂質組成物(例如脂質奈米粒子)或本文所述之組合療法投與人類個體。在一些實施例中，投與本文所述之治療性核酸、包含本文所述之治療性核酸的疫苗組成物、包含本文所述之治療性核酸的含脂質組成物(例如脂質奈米粒子)或本文所述之組合療法的個體係老年人。在一些實施例中，投與本文所述之治療性核酸、包含本文所述之治療性核酸的疫苗組成物、包含本文所述之治療性核酸的含脂質組成物(例如脂質奈米粒子)或本文所述之組合療法的個體係成年人。在一些實施例中，投與本文所述之治療性核酸、包含本文所述之治療性核酸的疫苗組成物、包含本文所述之治療性核酸的含脂質組成物(例如脂質奈米粒子)或本文所述之組合療法的個體係兒童。在一些實施例中，投與本文所述之治療性核酸、包含本文所述之治療性核酸的疫苗組成物、包含本文所述之治療性核酸的含脂質組成物(例如脂質奈米粒子)或本文所述之組合療法的個體係幼童。在一些實施例中，投與本文所述之治療性核酸、包含本文所述之治療性核酸的疫苗組成物、包含本文所述之治療性核酸的含脂質組成物(例如脂質奈米粒子)或本文所述之組合療法的個體係嬰兒。
在一些實施例中，投與本文所述之治療性核酸、包含本文所述之治療性核酸的疫苗組成物、包含本文所述之治療性核酸的含脂質組成物(例如脂質奈米粒子)或本文所述之組合療法的個體係投與非人類哺乳動物。
在一些實施例中，投與本文所述之治療性核酸、包含本文所述之治療性核酸的疫苗組成物、包含本文所述之治療性核酸的含脂質組成物(例如脂質奈米粒子)或本文所述之組合療法的個體係投與展現至少一種與冠狀病毒感染相關之症狀的個體。在一些實施例中，接受本文所述之治療性核酸、包含本文所述之治療性核酸的疫苗組成物、包含本文所述之治療性核酸的含脂質組成物(例如脂質奈米粒子)或本文所述之組合療法之投與的個體展現以下一或多種症狀：上呼吸道感染、下呼吸道感染、肺感染、腎感染、肝感染、腸感染、肝感染、神經系統感染、呼吸道症候群、肺炎、腸胃炎、腦脊髓炎、腦炎、類肉瘤病、腹瀉、肝炎及脫髓鞘疾病。
在一些實施例中，將本文所述之治療性核酸、包含本文所述之治療性核酸的疫苗組成物、包含本文所述之治療性核酸的含脂質組成物(例如脂質奈米粒子)或本文所述之組合療法投與無冠狀病毒感染之症狀的個體。
在一些實施例中，將本文所述之治療性核酸、包含本文所述之治療性核酸的疫苗組成物、包含本文所述之治療性核酸的含脂質組成物(例如脂質奈米粒子)或本文所述之組合療法投與有感染冠狀病毒風險或易感染冠狀病毒之個體。在一些實施例中，有感染冠狀病毒風險或易感染冠狀病毒之個體係老年人。在一些實施例中，有感染冠狀病毒風險或易感染冠狀病毒之個體係成年人。在一些實施例中，有感染冠狀病毒風險或易感染冠狀病毒之個體係兒童。在一些實施例中，有感染冠狀病毒風險或易感染冠狀病毒之個體係幼童。在一些實施例中，有感染冠狀病毒風險或易感染冠狀病毒之個體係嬰兒。在一些實施例中，有感染冠狀病毒風險或易感染冠狀病毒之個體係有影響個體免疫系統之現有健康狀況的人類個體。在一些實施例中，有感染冠狀病毒風險或易感染冠狀病毒之個體係具有影響個體主要器官之現有健康狀況的人類個體。在一些實施例中，有感染冠狀病毒風險或易感染冠狀病毒之個體係具有影響個體肺功能之現有健康狀況的人類個體。在一些實施例中，有感染冠狀病毒風險或易感染冠狀病毒之個體係具有影響個體免疫系統或主要器官，諸如肺功能之現有健康狀況的人類個體。在本段中描述之各個實施例中，有感染冠狀病毒風險或易感染冠狀病毒之個體可展現冠狀病毒感染之症狀或未展現冠狀病毒感染之症狀。
在一些實施例中，將本文所述之治療性核酸、包含本文所述之治療性核酸的疫苗組成物、包含本文所述之治療性核酸的含脂質組成物(例如脂質奈米粒子)或本文所述之組合療法投與經診斷對冠狀病毒感染呈陽性之個體。在一些實施例中，經診斷對冠狀病毒感染呈陽性之個體無冠狀病毒感染症狀，且該診斷係基於在獲自個體之樣品中偵測到病毒核酸或蛋白質之存在。在一些實施例中，診斷係基於患者所展現之臨床症狀。可用作診斷依據之示例性症狀包括但不限於上呼吸道感染、下呼吸道感染、肺感染、腎感染、肝感染(liver infection)、腸感染、肝臟感染(hepatic infection)、神經系統感染、呼吸道症候群、肺炎、腸胃炎、腦脊髓炎、腦炎、類肉瘤病、腹瀉、肝炎及脫髓鞘疾病。在一些實施例中，診斷係基於個體展現之臨床症狀以及個體與被認為有較高攜帶冠狀病毒風險之地理位置、群體及/或個體(諸如經診斷對冠狀病毒感染呈陽性之另一個體)之接觸史。
在一些實施例中，將本文所述之治療性核酸、包含本文所述之治療性核酸的疫苗組成物、包含本文所述之治療性核酸的含脂質組成物(例如脂質奈米粒子)或本文所述之組合療法投與先前未接受該治療性核酸、該疫苗組成物、該含脂質組成物(例如脂質奈米粒子)或該組合療法之投與的個體。
在一些實施例中，將本文所述之治療性核酸、包含本文所述之治療性核酸的疫苗組成物、包含本文所述之治療性核酸的含脂質組成物(例如脂質奈米粒子)或本文所述之組合療法投與先前曾接受該治療性核酸、該疫苗組成物、該含脂質組成物(例如脂質奈米粒子)或該組合療法之投與的個體。在特定實施例中，個體先前已被投與本文所述之治療性核酸、包含本文所述之治療性核酸的疫苗組成物、包含本文所述之治療性核酸的含脂質組成物(例如脂質奈米粒子)或如本文所述之組合療法一次、兩次、三次或更多次。
在一些實施例中，將本文所述之治療性核酸、包含本文所述之治療性核酸的疫苗組成物、包含本文所述之治療性核酸的含脂質組成物(例如脂質奈米粒子)或本文所述之組合療法投與個體，該個體在投與該治療性核酸、該疫苗組成物、該含脂質組成物(例如脂質奈米粒子)或該組合療法之前已接受療法。在一些實施例中，投與本文所述之治療性核酸、包含本文所述之治療性核酸的疫苗組成物、包含本文所述之治療性核酸的含脂質組成物(例如脂質奈米粒子)或本文所述之組合療法的個體經歷先前療法之不良副作用，或先前療法因對個體之不可接受之毒性水準而終止。6.5.4 投與劑量及頻率
有效管理、預防及/或治療感染性疾病的治療性核酸或其組成物之量將取決於所治療疾病之性質、投與途徑、個體之總體健康狀況等，且應根據醫療從業人員之判斷決定。可視情況採用標準臨床技術，諸如活體外分析法，以幫助鑑別最佳劑量範圍。然而，投與的本文所述之治療性核酸的適合劑量範圍一般為約0.001 mg、0.005 mg、0.01 mg、0.05 mg、0.1 mg、0.5 mg、1.0 mg、2.0 mg、3.0 mg、4.0 mg、5.0 mg、10.0 mg、0.001 mg至10.0 mg、0.01 mg至1.0 mg、0.1 mg至1 mg及0.1 mg至5.0 mg。該治療性核酸或其組成物可根據需要，以一定間隔向個體投與一次、兩次、三次、四次或更多次。有效劑量可由自活體外或動物模型測試系統得到的劑量反應曲線中外推得到。
在某些實施例中，將治療性核酸或其組成物作為單次劑量投與個體，隨後在1至6週、1至5週、1至4週、1至3週、1至2週後投與第二次劑量。根據此等實施例，可在第二次接種後，間隔6至12個月向個體投與加強接種。
在某些實施例中，治療性核酸或其組成物可重複投與，且該等投與可間隔至少1天、2天、3天、5天、6天、7天、10天、14天、15天、21天、28天、30天、45天、2個月、75天、3個月或至少6個月。在其他實施例中，治療性核酸或其組成物可重複投與，且該等投與可間隔1至14天、1至7天、7至14天、1至30天、15至30天、15至45天、15至75天、15至90天、1至3個月、3至6個月、3至12個月或6至12個月。在一些實施例中，將第一治療性核酸或其組成物投與個體，隨後投與第二治療性核酸或其組成物。在某些實施例中，第一及第二治療性核酸或其組成物可間隔至少1天、2天、3天、5天、6天、7天、10天、14天、15天、21天、28天、30天、45天、2個月、75天、3個月或至少6個月。在其他實施例中，第一及第二治療性核酸或其組成物可間隔1至14天、1至7天、7至14天、1至30天、15至30天、15至45天、15至75天、15至90天、1至3個月、3至6個月、3至12個月或6至12個月。
在某些實施例中，將治療性核酸或其組成物與一或多種額外療法，諸如第 6.5.2 節 中所描述之療法組合投與個體。該其他一或多種額外療法之劑量將取決於各種因素，包括例如療法、感染性疾病之性質、投與途徑、個體之總體健康狀況等，且應根據醫療從業人員之判斷決定。在特定實施例中，該其他療法之劑量係療法作為單一藥劑使用時推薦的該療法之投與劑量及/或頻率，該療法係根據本文所揭示之方法使用。在其他實施例中，該其他療法之劑量的劑量及/或頻率低於療法作為單一藥劑使用時推薦的該療法之劑量及/或頻率，該療法係根據本文所揭示之方法使用。批准療法之推薦劑量可見於Physician’s Desk Reference。
在某些實施例中，將治療性核酸或其組成物係與一或多種額外療法之投與同時投與個體。在其他實施例中，每3至7天、1至6週、1至5週、1至4週、2至4週、1至3週或1至2周向個體投與治療性核酸或其組成物，且每3至7天、1至6週、1至5週、1至4週、1至3週或1至2週投與一或多種額外療法(諸如第 6.5.2 節 中所述)。在某些實施例中，每1至2週向個體投與治療性核酸或其組成物，且每2至4週投與一或多種額外療法(諸如第 6.5.2 節 中所述)。在一些實施例中，每週向個體投與治療性核酸或其組成物，且每2週投與一或多種額外療法(諸如第 6.5.2 節 中所述)。7. 實例
本節(亦即，第7節)中之實例僅作為示例提供，而不是作為限制。7.1 實例 1 ： mRNA 之合成及純化 .
DNA線性化. 使用限制酶消化將DNA質體模板線性化，該模板含有編碼冠狀病毒SARS-CoV-2刺突(S)蛋白之S1次單元、受體結合結構域(RBD)或受體結合模體(RBM)之幾種不同型式、5'及3'-UTR以及聚A信號。每10 µg質體與10 U Esp3I/BsmBI混合，在37℃下培育4小時以確保完全線性化。藉由1/10體積之3 M乙酸鈉(pH 5.5)及2.5體積乙醇終止反應，充分混合並在–20℃冷卻1小時。線性化之DNA藉由在4℃下以13800 g離心15分鐘而沈澱，用70%乙醇洗滌兩次，再懸浮於無核酸酶之H2 O中。
mRNA之活體外轉錄. 典型20 μL反應混合物之內含物示於下表中：
無核酸酶之H2 O 至多20 µL
核糖核酸酶抑制劑(40 U/µL) 0.5 µL
rNTP混合物(各100 mM) 8 µL (各自最終10 mM)
10X IVT反應緩衝液 2 µL
1M MgCl2 0.8 µL
0.1M DTT 2 µL
100 U/mL無機焦磷酸酶 0.8 µL
100 mM NaCl 1 µL
線性化DNA 1 µg
T7 RNA聚合酶(50 U/µL) 2 µL
在37℃下，將反應混合物培育6小時，隨後添加1μl DNase I (不含RNase，1 U/µL)以移除DNA模板，在37℃下培育30分鐘。藉由添加0.5體積之7.5 M LiCl、7.5 M LiCl、50 mM EDTA純化合成之RNA，並在–20℃下培育45分鐘，隨後在4℃下以13800 g離心15分鐘以使mRNA沈澱。接著，移除上清液，並用500 µL冰冷之70%乙醇沖洗沈澱兩次，使mRNA再懸浮於無核酸酶之H2 O中，將濃度調至1 mg/mL，並在–20℃下儲存。
mRNA戴帽. 在65℃下，將各10 µg未戴帽之mRNA加熱10分鐘，在冰上置放5分鐘，並與10 U牛痘病毒戴帽酶、50 U mRNA帽2′-O-甲基轉移酶、0.2 mM SAM、0.5 mM GTP及1U RNase抑制劑混合，並在37℃下培育60分鐘以產生帽1修飾結構。如先前所述，經修飾之mRNA藉由LiCl沈澱，並將RNA再懸浮於無核酸酶之H2 O中，並在–20℃下儲存。
HPLC純化. RNA藉由高效液相層析法(HPLC)，使用C4管柱(5 μm) (10 mm×250 mm管柱)進行純化。緩衝液A含有0.1M乙酸三乙銨(TEAA)，pH ＝ 7.0，且緩衝液B含有0.1M TEAA，pH ＝ 7.0，及25%乙腈。
圖 1 顯示活體外轉錄之mRNA的示例性HPLC純化。如圖 1 所示，mRNA分子係藉由上述活體外轉錄及成熟過程成功產生，並使用HPLC自反應系統純化。7.2 實例 2 ： 活體外轉染及抗原表現分析 .
將實例 1 中產生的編碼SARS-CoV-2 S蛋白抗原之不同mRNA分子轉染至諸如HEK293F及Hela培養細胞之類表現細胞株中以評價mRNA分子之活體外表現效率。
為了組裝mRNA-脂質複合物，在兩個獨立試管中分別裝入混有30 µL Opti-MEM之1 μL Lipofectamine及混有30 μL Opti-MEM之1 µg mRNA。將兩個樣品混合並在室溫下培育5分鐘。使用五十微升此類複合物轉染24孔盤之1個孔中存在的細胞，並將細胞在潮濕的37℃/5% CO2培育箱中培育直至分析。
表現分析 . 自轉染後24小時培養物轉移細胞，並在室溫下以200 RCF離心5分鐘。接下來，將細胞用4% (v/v)三聚甲醛處理30分鐘，並用PBS洗滌。接下來，將細胞用0.2% (v/v) Triton X-100處理10分鐘，並用PBS洗滌。接下來，將細胞用5% (w/v)牛血清白蛋白封閉1小時，並用PBS洗滌。接下來，將細胞與幾種兔抗SARS-CoV-2 S蛋白抗體一起在4℃下培育1小時，並用FITC標記之抗兔抗體(1:200)作為二次抗體標記30分鐘，且用PBS洗滌並用DAPI對比染色。藉由共聚焦鐳射掃描顯微鏡檢查信號。
詳言之，圖 2 顯示用編碼SARS-CoV-2 S蛋白RBD序列之mRNA構築體(RBD樣品1)轉染之Hela細胞的示例性共聚焦螢光顯微鏡檢查圖像。將細胞與識別SARS-CoV-2之S蛋白RBD的3種不同單株抗體一起培育，該等抗體分別識別SARS-2-H014、SARS-2-mh001及SARS-2-mh219。
如圖 2 中所示，編碼SARS-CoV-2 S蛋白RBD的活體外轉錄之mRNA分子有效地轉染Hela細胞。轉染之Hela細胞以令人滿意之量表現編碼之病毒抗原，正如本研究中使用之三種單株抗體所能識別的那樣。轉染之Hela細胞維持正常的細胞形態，指示缺乏由編碼之病毒抗原表現引起的細胞毒性。
西方墨點法. 對於分泌之蛋白質，諸如SARS-CoV-2 S蛋白或其片段，收集用實例 1 中產生之mRNA分子轉染的細胞之培養物並在轉染後24小時，藉由西方墨點法進行分析。在SDS-PAGE之後，將蛋白質轉印至墨點膜上。用PBS短暫沖洗墨點且接著，在室溫下與添加的兔抗刺突RBD抗體一起培育2小時。在PBS中充分洗滌墨點。添加HRP結合之抗兔抗體，並在室溫下，在輕柔攪動下培育1小時。用PBS洗滌膜，並與添加的適當酶受質溶液一起培育以觀測蛋白質譜帶。
圖 3 顯示用編碼SARS-CoV-2 S蛋白RBD序列之mRNA分子轉染的Hela細胞之培養物上清液的示例性西方墨點分析。詳言之，向標記為「RBD樣品1」及「RBD樣品2」之泳道分別裝載用編碼本文所述之不同SARS-CoV-2 S蛋白RBD序列之mRNA構築體轉染的Hela細胞之培養物上清液。標記為「rRBD-His」之泳道裝載C末端融合His標籤的重組產生之SARS-CoV-2 S蛋白RBD序列。標記為「NT」之泳道裝載用不相關mRNA構築體轉染之Hela細胞的細胞培養物上清液作為陰性對照組。
如圖 3 中所示，編碼SARS-CoV-2 S蛋白RBD的活體外轉錄之mRNA分子有效地轉染Hela細胞。轉染之Hela細胞以令人滿意之量表現及分泌編碼之病毒抗原。在約30 kD附近之譜帶對應於呈單體形式的分泌之病毒抗原。在約60 kD附近之譜帶對應於呈二聚體形式的分泌之病毒抗原。不受理論束縛，經審慎考慮，與單體形式相比，呈多聚形式的分泌之病毒抗原在投與接種疫苗之個體時可具有較高免疫原性且更有效地誘導體液免疫反應。如圖 3 所示，由mRNA構築體編碼之病毒抗原可在表現後進行多聚化，指示mRNA構築體在投與個體後可有效引起針對病毒之免疫反應。
ELISA. 藉由ELISA確定在細胞培養物上清液中表現的mRNA編碼之病毒肽或蛋白質的量。詳言之，為了執行ELISA分析，用100 µl含5 µg/ml SARS-CoV-2 S蛋白RBD之溶液塗覆微量滴定盤各孔，並在4℃下在封盤膜存在下培育12小時。接下來，將該盤在洗滌緩衝液中洗滌3次。接下來，將300 μl含5% BSA之PBST添加至各孔中，並在37℃下培育60分鐘。接下來，將該盤在洗滌緩衝液中洗滌4次。接下來，將培養物上清液樣品及SARS-CoV-2 S蛋白RBD標準品在洗滌緩衝液中稀釋，並一式三份，將100 µl適當稀釋之樣品及標準品添加至相關孔中。接下來，將孔在37℃下培育60分鐘，並在洗滌緩衝液中洗滌3次。接下來，將100 μL兔抗SARS-CoV-2 S蛋白抗體添加至盤各孔中。接下來，覆蓋該盤並在37℃下培育60分鐘，並在洗滌緩衝液中洗滌3次。接下來，將100 μl稀釋的HRP結合之抗兔抗體添加至各孔中，並在37℃下培育1小時，並在洗滌緩衝液中洗滌3次。接下來，將100 µl TMB受質溶液添加至各孔中，在室溫下(且必要時在暗處)培育約10分鐘。接下來，將100 μL終止溶液添加至各孔中，並輕柔地澈底混合。接下來，使用Molecular Devices讀盤儀讀取在450/620 nm下的OD值，減去後進行偵測。
圖 4 顯示出示例性ELISA分析，量測了分別用稱為「RBD樣品1」及「RBD樣品2」之兩種mRNA構築體轉染之細胞培養物上清液中mRNA編碼之SARS-CoV-2 S蛋白RBD的蛋白質濃度(ng/mL)。使用BSA作為ELISA之陰性對照。本研究進一步展示，如藉由ELISA定量，用mRNA構築體轉染之細胞以令人滿意之量表現及分泌編碼之病毒抗原。7.3 實例 3. 用含 LNP 之 mRNA 進行疫苗接種之小鼠產生中和抗體
藉由肌肉內注射100 µL含10 µg編碼SARS-CoV-2 S蛋白RBD之mRNA (RBD樣品1)的LNP調配物對BALB/c小鼠進行疫苗接種，且在疫苗接種後第7天、第14天、第21天及第28天，自尾靜脈收集血液。一組接種疫苗之小鼠在第一次注射後第14天，藉由接受第二次肌肉內注射相同劑量的含有mRNA之LNP調配物進行加強免疫，並第二次加強注射後第7天、第14天、第21天及第28天，自尾靜脈收集血液。確定收集之小鼠血清的50%空斑減少中和力價(PRNT 50)值以評價接種疫苗之動物之中和抗體產生情況。
PRNT分析. 為了執行空斑減少中和力價(PRNT)分析，將血清樣品或待測抗體之溶液稀釋並與病毒懸浮液混合。接著，培育混合物以使抗體與病毒反應。接下來，將混合物傾倒於宿主細胞之匯合單層上。細胞層之表面覆蓋一層瓊脂糖或羧甲基纖維素，以防止病毒肆意擴散。空斑形成單位(PFU)之濃度可藉由幾天後形成的空斑(感染細胞之區域)數量來估計。取決於病毒，可藉由顯微鏡觀察、與感染細胞反應之螢光抗體或特定染料來量測空斑形成單位。使空斑數量相較於無血清病毒減少50%的血清濃度提供對抗體存在量或抗體有效性之量度。此量度係以PRNT 50值表示。
詳言之，在本研究中，將如上所述收集之小鼠血清在55℃熱滅活30分鐘，且接著在PBS中連續稀釋至1:50、1:100、1:200、1:400及1:800。將等體積的含有100 PFU SARS-CoV-2假病毒之PBS添加至各血清稀釋液中。將各混合物在37℃下培育30分鐘，添加至Vero E6單層之匯合培養物中，並使其在37℃下培育60分鐘。用在標準Vero E6細胞培養基中融化的4 ml 0.8%瓊脂糖覆蓋細胞單層，並在2天後用中性紅染色液解析空斑。接著，計算PRNT 50值並將其繪製於圖 5 中。詳言之，Y軸顯示PRNT 50值之倒數(亦即，1/PRNT 50)。X軸顯示如下動物組：「RBD」表示僅接受第一次注射之小鼠，「RBD-B」表示接受第一次及加強注射之小鼠。「對照」表示一組小鼠接受肌肉內注射的100 µl不含mRNA之LNP調配物及在14天後用相同劑量之空白LNP進行的加強免疫。
如圖 5 所示，用含治療性mRNA之LNP進行疫苗接種之動物產生中和抗體，由此顯著減少SARS-CoV-2對細胞之感染。本研究展示，本發明的含治療性mRNA之LNP組成物可用於治療、管理或預防冠狀病毒SARS-CoV-2之感染。7.4 實例 4 ： 關於小鼠體內之 RBD 表現與 mRNA- LNP 樣品之 mRNA 含量之間相關性的研究
執行以下實驗以確立用於偵測動物回應於最終冠狀病毒SARS-CoV-2 mRNA疫苗產品之RBD表現的方法，以便探究RBD表現與最終產品中mRNA含量之間之相關性。
動物分組及給藥資訊如下所示：
組編號 實驗組 動物數量 給藥濃度(μg/mL) 給藥體積(μL) 給藥量(μg) 投與途徑
1 空白對照組 10 - - - -
2 疫苗樣品組E 4 10 100 1 iv.，一次
3 疫苗樣品組D 4 20 100 2 iv.，一次
4 疫苗樣品組C 4 30 100 3 iv.，一次
5 疫苗樣品組B 4 40 100 4 iv.，一次
6 疫苗樣品組A 4 50 100 5 iv.，一次
根據上表，藉由靜脈內注射對實驗動物，即ICH小鼠投與不同測試物。在投與後6小時，在深度二氧化碳麻醉後，自心臟收集血液。在室溫下靜置約30分鐘後，分離出血清(4℃，8000 rpm (5724 g)，10 min)，分裝(一式三份，各自大於110 μl；若無法保證全部三份等分試樣皆滿足要求，則其中至少兩份應滿足，且標出每個管之血液體積)，並在冰箱中於-80℃下儲存。自其餘10隻空白小鼠收集血液樣品，充分混合且接著施配至小管中。
藉由ELISA方法偵測血清樣品中之RBD表現如下： 所有樣品及試劑在使用前均恢復成室溫。 1)   將100 µL之ACE2包覆儲備液添加至ELISA盤中，並用密封膜密封該盤，且在4℃下培育15小時。 2)   將各孔中之液體丟棄，並用每孔300 μL洗滌緩衝液洗滌該盤3次，且每次浸泡2分鐘。 3)   添加每孔300 μL封閉溶液，並用密封膜密封該盤，且在37℃下培育1小時。 4)   將各孔中之液體丟棄，並用每孔300 μL洗滌緩衝液洗滌該盤3次，且每次浸泡2分鐘。 5)   將100 µL稀釋之待測試樣品及標準物添加至ELISA盤中，並用密封膜密封該盤，且在37℃下培育1小時。 6)   將各孔中之液體丟棄，並用每孔300 μL洗滌緩衝液洗滌該盤3次，且每次浸泡2分鐘。 7)   將100 μL一次抗體儲備液添加至該盤各孔中，並用密封膜覆蓋該盤，且在37℃下培育1小時。 8)   將各孔中之液體丟棄，並用每孔300 μL洗滌緩衝液洗滌該盤3次，且每次浸泡2分鐘。 9)   將100 μL HRP二次抗體儲備液添加至該盤各孔中，並用密封膜覆蓋該盤，且在37℃下培育1小時。 10) 將各孔中之液體丟棄，並用每孔300 μL洗滌緩衝液洗滌該盤3次，且每次浸泡2分鐘。 11) 將100 μL TMB受質添加至各微量孔中，並在室溫下避光培育該盤約5分鐘。 12) 將100 μL ELISA終止溶液添加至各微量孔中。 13) 藉由使用多功能微量盤讀取器測定結果，其中偵測波長設定為450 nm及620 nm，將Curve Fit/5參數回歸模型設定用於標準曲線，且測試樣品之稀釋因數設定為2，同時執行標準曲線及樣品設置(模板設置可在開始讀取之前設定)，且在此情況下測定吸收值。 14) 藉由使用蛋白質標準物之蛋白質濃度(X)及其相應螢光值(Y)的5參數回歸模型，經由軟體自動計算結果，以便計算並獲得樣品中之蛋白質濃度(Unk-dilution/AdjResult)。
實驗動物之血清樣品中RBD含量的偵測結果顯示於圖 6 及表 6 中。在所有小鼠血清樣品中，在「空白血清」樣品中未偵測到RBD濃度。據觀察，在1 μg與5 μg mRNA之間存在顯著劑量依賴性，且表現的RBD含量為0.14-2.18 ng/mL。表 6
樣品 值 結果(ng/mL) 稀釋度 AdjResult (ng/mL) 平均值(ng/mL)
空白對照組1 0.101 ND 2 ND ND
空白對照組2 0.130 ND 2 ND
空白對照組3 0.118 ND 2 ND
空白對照組4 0.131 ND 2 ND
疫苗樣品組E-1 0.163 0.079 2 0.158 0.14
疫苗樣品組E-2 0.146 0.022 2 0.044
疫苗樣品組E-3 0.176 0.109 2 0.218
疫苗樣品組E-4 0.157 0.063 2 0.126
疫苗樣品組D-1 0.15 0.038 2 0.076 0.29
疫苗樣品組D-2 0.237 0.217 2 0.434
疫苗樣品組D-3 0.308 0.321 2 0.642
疫苗樣品組D-4 0.145 0.014 2 0.027
疫苗樣品組C-1 0.44 0.501 2 1.002 0.83
疫苗樣品組C-2 0.372 0.409 2 0.818
疫苗樣品組C-3 0.405 0.454 2 0.908
疫苗樣品組C-4 0.286 0.29 2 0.579
疫苗樣品組B-1 0.453 0.519 2 1.038 1.21
疫苗樣品組B-2 0.464 0.534 2 1.067
疫苗樣品組B-3 0.611 0.743 2 1.486
疫苗樣品組B-4 0.524 0.618 2 1.236
疫苗樣品組A-1 1.029 1.499 2 2.998 2.18
疫苗樣品組A-2 0.691 0.865 2 1.73
疫苗樣品組A-3 0.715 0.902 2 1.805
疫苗樣品組A-4 0.825 1.089 2 2.178
7.5 實例 5 ：抗原免疫原性分析
以下實驗之目的係評價本發明的裝載有SARS-CoV-2冠狀病毒S-RBD蛋白之mRNA分子脂質體(RBD mRNA-LNP)的免疫原性。
各組中動物之數量及具體免疫途徑、劑量及時程顯示於下表中。實驗動物，即BALB/c小鼠在第0天接受經由在右後肢上單點肌肉內注射投與之測試抗原(每隻小鼠10 μg/50 μL)。再在第14天用相同劑量之疫苗進行疫苗接種。具體投與方法、給藥量及投與途徑如下：
組 動物數量 測試抗原 劑量 注射體積 免疫方法 免疫週期a
1 8 RBD mRNA-LNP 每隻動物10 μg 每隻動物50 μL i.m. 第0天及第14天
2 4 空脂質體 每隻動物10 μg 每隻動物50 μL i.m. 第0天及第14天
3 4 1×PBS N/A 每隻動物50 μL i.m. 第0天及第14天
註釋：a：第一次免疫接種日定義為第0天。
在第一次免疫接種之前，隨機選出4隻小鼠收集血液，以製備血清樣品(超過150 μL)，並在無抗凝劑存在下收集血清樣品進行監測，如下表中所示。
組 時間點 樣品收集及處理方法
RBD mRNA-LNP 組 第14天 在第二次免疫接種之前，收集全血以製備血清樣品，血清量＞ 150 μL/隻動物
第21天 收集全血以製備血清樣品，血清量＞ 150 μL/隻動物
第28天 收集全血以製備血清樣品，血清量＞ 150 μL/隻動物及 自4隻動物收集脾臟以製備單細胞懸浮液
空脂質體組 第14天 在第二次免疫接種之前，收集全血以製備血清樣品，血清量＞ 150 μL/隻動物
第21天 收集全血以製備血清樣品，血清量＞ 150 μL/隻動物
第28天 收集全血以製備血清樣品，血清量＞ 150 μL/隻動物及 自1隻動物收集脾臟以製備單細胞懸浮液
1×PBS 組 第14天 在第二次免疫接種之前，收集全血以製備血清樣品，血清量＞ 150 μL/隻動物
第21天 收集全血以製備血清樣品，血清量＞ 150 μL/隻動物
第28天 收集全血以製備血清樣品，血清量＞ 150 μL/隻動物及 自1隻動物收集脾臟以製備單細胞懸浮液
總計存在如下52份樣品：分別為在第一次免疫接種之前收集的4份血清樣品；在第一次免疫接種之後14天收集的16份血清樣品；在第一次免疫接種之後21天收集的16份血清樣品；及在第一次免疫接種之後28天收集的16份血清樣品。在完成血清收集之後，一起偵測冠狀病毒RBD IgG。在本實驗中，使用Wantai BioPharm研製的「小鼠抗新冠狀病毒(2019-nCoV) S-RBD蛋白IgG抗體偵測套組(Mouse Anti-New Coronavirus (2019-nCoV) S-RBD Protein IgG Antibody Detection Kit)」偵測IgG力價。用樣品稀釋劑，自1:10開始，以10倍梯度稀釋測試血清樣品，並輕柔振盪以充分混合。將經稀釋之樣品、陰性對照及陽性對照各100 μL添加至各孔中。用密封膜密封該盤。在37℃下阻斷密封膜30分鐘，並將該盤洗滌5次，每次300 μL，並在最後一次洗滌時乾燥。將100 μL ELISA試劑添加至除空白孔外的各孔中。在37℃下阻斷密封膜30分鐘，並將該盤洗滌5次，每次300 μL。將顯色劑A及B各50 mL添加至各孔中，輕柔地振盪並在37℃下避光顯色15分鐘。將50 μL終止溶液添加至各孔中，並輕柔地充分混合。在10分鐘內量測結果。微量盤讀取器之波長設定在450 nm。選出使偵測結果呈陽性之最大稀釋因數，且力價結果係陽性最大稀釋因數之OD值/0.1*相應稀釋因數。
詳言之，在第0天，用單次劑量(10 μg)之mRNA疫苗對小鼠進行免疫接種，並在第14天給予加強劑量(10 μg)。在免疫接種後14天、21天及29天，偵測小鼠血清中之抗S-RBD IgG抗體含量。結果顯示於圖7中。在用mRNA-LNP進行疫苗接種之小鼠組中，在第二次免疫接種後一週，特異性IgG力價自第14天之約1/900增加至第29天之1/70,000，並在第29天維持在相同水準。相比之下，空脂質體及PBS對照組皆不具有RBD特異性IgG表現。此結果清楚地顯示，本發明中所述之疫苗產品具有強免疫原性且可特異性誘導相關抗體之產生以實現控制或預防冠狀病毒SARS-CoV-2感染之作用。8. 序列表
本說明書係與序列表之電腦可讀形式(CRF)複本一起提交。CRF題為14639-009-228_Sequence_Listing.txt，於2021年4月2日創建，且大小為199,381位元組，且以全文引用之方式併入本文中。
圖 1 顯示根據本揭示案的活體外轉錄之mRNA構築體的示例性HPLC分析及純化。主峰(b)代表活體外轉錄之mRNA分子，且次峰(a)代表雜質實體。圖 2 顯示用根據本揭示案之mRNA構築體轉染之Hela細胞的共聚焦螢光顯微圖像。RBD-FITC通道顯示分別使用識別SARS-CoV-2 S蛋白RBD之3種不同單株抗體(H014、mh001及mh219)對細胞進行染色。DAPI通道顯示用藍色螢光DNA染色劑DAPI (4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)對細胞進行染色。Bright通道顯示細胞之明視場圖像。包括未轉染之Hela細胞(模擬)作為陰性對照。比例尺係50 mm。圖 3 顯示用根據本揭示案的編碼SARS-CoV-2 S蛋白抗原之mRNA構築體轉染之HeLa細胞的培養物清液之西方墨點分析(Western blot analysis)。具體言之，該分析中包括編碼SARS-CoV-2 S蛋白RBD之不同抗原片段的三種不同mRNA構築體(RBD樣品-1、RBD樣品2及rRBD-His)。亦包括不相關的mRNA對照。編碼之RBD片段的單體及二聚體以墨點顯示。圖 4 顯示藉由ELISA測定的細胞培養物上清液中mRNA編碼之SARS-CoV-2 S蛋白抗原濃度(ng/mL)的示例性定量。圖 5 顯示自小鼠收集的血清中之中和抗體力價，該等小鼠用含編碼SARS-CoV-2抗原之mRNA的脂質奈米粒子(LNP)疫苗接種。具體言之，中和抗體力價係以PRNT50值量測。圖 6 顯示五組接受1 ug-5 ug給藥量之實驗小鼠之血清中的RBD表現量。圖 7 顯示藉由ELISA量測的在第14天、第21天及第29天經免疫接種之小鼠體內的RBD特異性IgG抗體力價之偵測結果。
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Claims (83)

  1. 一種編碼源自於冠狀病毒SARS-CoV-2之病毒肽或蛋白質的非天然存在之核酸。
  2. 一種編碼源自於包含基因體之冠狀病毒之病毒肽或蛋白質的非天然存在之核酸，其中該基因體包含SEQ ID NO: 1中所示之核酸序列。
  3. 如請求項1或2之非天然存在之核酸，其包含編碼區，其中該編碼區包含一或多個開放閱讀框(ORF)，且其中至少一個ORF編碼該病毒肽或蛋白質。
  4. 如請求項3之非天然存在之核酸，其中至少一個ORF編碼異源肽或多肽。
  5. 如請求項4之非天然存在之核酸，其中該異源肽或多肽係免疫刺激肽或蛋白質。
  6. 如請求項3之非天然存在之核酸，其中該ORF編碼包含與異源肽或多肽融合之該病毒肽或蛋白質之融合蛋白。
  7. 如請求項6之非天然存在之核酸，其中該異源肽或多肽選自人免疫球蛋白之Fc區、信號肽及促進該融合蛋白多聚化之肽。
  8. 如請求項3至7中任一項之非天然存在之核酸，其中該一或多個ORF由表1至4中所示之編碼序列組成。
  9. 如請求項3至8中任一項之非天然存在之核酸，其中該一或多個ORF由選自SEQ ID NO: 3、5、7、9、11、13、15、17、19、27、29、31、33、35、37、39、41、43及45之編碼序列，或其轉錄之RNA序列組成。
  10. 如請求項3至9中任一項之非天然存在之核酸，其中該一或多個ORF編碼選自SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20-26、28、30、32、34、36、38、40、42及44之肽或蛋白質。
  11. 如請求項1至10中任一項之非天然存在之核酸，其進一步包含5'非轉譯區(5'-UTR)，其中該5'-UTR包含SEQ ID NO: 46-51中所示之序列。
  12. 如請求項1至11中任一項之非天然存在之核酸，其進一步包含3'非轉譯區(3'-UTR)，其中該3'-UTR包含SEQ ID NO: 52-57中所示之序列。
  13. 如請求項12之非天然存在之核酸，其中該3'-UTR進一步包含聚A尾或聚腺苷酸化信號。
  14. 如請求項1至13中任一項之非天然存在之核酸，其包含一或多種選自假尿苷、1-甲基假尿苷及5-甲基胞嘧啶之功能性核苷酸類似物。
  15. 如請求項1至14中任一項之非天然存在之核酸，其中該核酸係DNA或mRNA。
  16. 一種載體，其包含如請求項1至15中任一項之非天然存在之核酸。
  17. 一種細胞，其包含如請求項1至15中任一項之非天然存在之核酸。
  18. 一種細胞，其包含如請求項16之載體。
  19. 一種組成物，其包含如請求項1至15中任一項之非天然存在之核酸及至少一種脂質。
  20. 如請求項19之組成物，其係調配為將該核酸包封於脂質殼中之脂質奈米粒子。
  21. 如請求項19或20之組成物，其中該組成物係醫藥組成物。
  22. 一種醫藥組成物，其包含至少一個編碼源自於冠狀病毒SARS-CoV-2之病毒肽或蛋白質的核酸。
  23. 一種醫藥組成物，其包含至少一個編碼源自於包含基因體之冠狀病毒之病毒肽或蛋白質的核酸，其中該基因體包含SEQ ID NO: 1中所示之核酸序列。
  24. 如請求項22或23之醫藥組成物，其中該病毒肽或蛋白質選自： (a)     該冠狀病毒之刺突(S)蛋白， (b)     該冠狀病毒之基質(M)蛋白， (c)     該冠狀病毒之核衣殼(N)蛋白， (d)     該冠狀病毒之包膜(E)蛋白， (e)     血球凝集素-酯酶(HE)蛋白， (f)     (a)至(e)中任一項之免疫原性片段；以及 (g)     (a)至(f)中任一項之功能性衍生物。
  25. 如請求項22至24中任一項之醫藥組成物，其中該病毒肽或蛋白質係該S蛋白、該S蛋白之免疫原性片段，或該S蛋白或其免疫原性片段之功能性衍生物。
  26. 如請求項25之醫藥組成物，其中該S蛋白之免疫原性片段選自胞外結構域(ECD)、S1次單元、受體結合結構域(RBD)及受體結合模體(RBM)。
  27. 如請求項26之醫藥組成物，其中該病毒肽或蛋白質係RBD之功能性衍生物。
  28. 如請求項27之醫藥組成物，其中RBD之該功能性衍生物在該RBD中包含一或多個能夠增加該RBD與宿主細胞中之受體之結合親和力的胺基酸取代。
  29. 如請求項28之醫藥組成物，其中該受體係ACE2。
  30. 如請求項28或29之醫藥組成物，其中該胺基酸取代係N501T。
  31. 如請求項25至30中任一項之醫藥組成物，其中該病毒肽或蛋白質包含SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、20-26、32、34、40、42及44中所示之胺基酸序列。
  32. 如請求項25至30中任一項之醫藥組成物，其中該核酸包含如SEQ ID NO: 3、5、7、9、11、13、15、17、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、46、48、50、52、54、56中所示之序列或其轉錄之RNA序列。
  33. 如請求項27之醫藥組成物，其中該RBD之功能性衍生物包含與人免疫球蛋白Fc區融合之該RBD。
  34. 如請求項33之醫藥組成物，其中該免疫球蛋白係IgG1。
  35. 如請求項27之醫藥組成物，其中該RBD之功能性衍生物包含與促進該融合蛋白多聚化之肽融合的該RBD。
  36. 如請求項35之醫藥組成物，其中該S-RBD之功能性衍生物係組態成形成三聚體複合物。
  37. 如請求項22至24中任一項之醫藥組成物，其中該病毒肽或蛋白質係該N蛋白。
  38. 如請求項37之醫藥組成物，其中該N蛋白包含SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列。
  39. 如請求項38之醫藥組成物，其中該核酸包含SEQ ID NO: 19中所示之序列或自其轉錄之RNA序列。
  40. 如請求項22至39中任一項之醫藥組成物，其中該核酸進一步包含5'非轉譯區及/或3'非轉譯區。
  41. 如請求項40之醫藥組成物，其中該5'非轉譯區包含選自SEQ ID NO:46-51之序列。
  42. 如請求項40或41之醫藥組成物，其中該3'非轉譯區包含聚A尾或聚腺苷酸化信號。
  43. 如請求項40至42中任一項之醫藥組成物，其中該3'非轉譯區包含選自SEQ ID NO: 52-57之序列。
  44. 如請求項22至43中任一項之醫藥組成物，其中該核酸包含一或多種選自假尿苷、1-甲基假尿苷及5-甲基胞嘧啶之功能性核苷酸類似物。
  45. 如請求項22至44中任一項之醫藥組成物，其進一步包含至少一種脂質。
  46. 如請求項45之醫藥組成物，其中該脂質係根據式(I)至(IV)之化合物。
  47. 如請求項45或46之醫藥組成物，其中該脂質係根據式(I-A)、(I-B)、(IB’)、(I-B”)、(I-C)、(I-D)、(I-E)、(I-F)、(I-F’)、(I-F”)、(I-G)、(I-H)、(I-I)、(I-J)、(I-J’)、(I-J’’)、(I-K)、(I-L)、(I-M)、(I-N)、(I-N’)、(I-N”)、(I-O)、(I-P)、(I-Q)、(I-R)、(I-R’)、(I-R”)、(I-S)、(I-T)、(I-U)、(II-A)、(II-B)、(II-B’)、(II-B”)、(II-C)、(II-D)、(II-E)、(II-F)、(II-F’)、(II-F”)、(II-G)、(II-H)、(II-I)、(II-J)、(II-J’)、(II-J”)、(II-K)、(II-L)、(II-M)、(II-N)、(II-N’)、(II-N”)、(II-O)、(II-P)、(II-Q)、(II-R)、(II-R’)、(II-R”)、(II-S)、(II-T)、(II-U)、(III-A)、(III-B)、(III-B’)、(III-B”)、(III-C)、(III-D)、(III-E)、(III-F)、(III-F’)、(III-F”)、(III-G)、(III-H)、(III-I)、(III-J)、(III-J’)、(III-J”)、(III-K)、(III-L)、(III-M)、(III-N)、(III-N’)、(III-N”)、(III-O)、(III-P)、(III-Q)、(III-R)、(III-R’)、(III-R”)、(III-S)、(III-T)、(III-U)、(IV-A)、(IV-B)、(IV-B’)、(IV-B”)、(IV-C)、(IV-D)、(IV-E)、(IV-F)、(IV-F’)、(IV-F”)、(IV-G)、(IV-H)、(IV-I)、(IV-J)、(IV-J’)、(IV-J”)、(IV-K)、(IV-L)、(IV-M)、(IV-N)、(IV-N’)、(IV-N”)、(IV-O)、(IV-P)、(IV-Q)、(IV-R)、(IV-R’)、(IV-R”)、(IV-S)、(IV-T)或(IV-U)之化合物。
  48. 如請求項45至47中任一項之醫藥組成物，其中該脂質係表1中所列之化合物。
  49. 如請求項45至48中任一項之醫藥組成物，其中該組成物係調配為將該核酸包封於脂質殼中之脂質奈米粒子。
  50. 如請求項22至49中任一項之醫藥組成物，其中該組成物係疫苗。
  51. 一種用於管理、預防或治療個體之由冠狀病毒引起之感染性疾病的方法，其包括向該個體投與治療有效量的如請求項1至15中任一項之非天然存在之核酸或如請求項21至50中任一項之醫藥組成物。
  52. 如請求項51之方法，其中該個體係人類或非人類哺乳動物。
  53. 如請求項52之方法，其中該個體係成人、兒童或幼童。
  54. 如請求項51至53中任一項之方法，其中該個體患有該感染性疾病。
  55. 如請求項51至53中任一項之方法，其中該個體有感染該冠狀病毒之風險或易於感染該冠狀病毒。
  56. 如請求項55之方法，其中該個體係老年人。
  57. 如請求項51至54中任一項之方法，其中該個體已經診斷為對該冠狀病毒感染呈陽性。
  58. 如請求項51至57中任一項之方法，其中該個體係無症狀的。
  59. 如請求項51至58中任一項之方法，其中方法包括向該個體投與包封該核酸之脂質奈米粒子，且其中該等脂質奈米粒子經該個體之細胞胞吞。
  60. 如請求項51至59之方法，其中該核酸係由該個體之細胞表現。
  61. 如請求項51至60中任一項之方法，其中在該個體中引起針對該冠狀病毒之免疫反應。
  62. 如請求項61之方法，其中該免疫反應包含產生特異性結合至由該核酸編碼之病毒肽或蛋白質的抗體。
  63. 如請求項62之方法，其中該抗體係針對該冠狀病毒或感染該冠狀病毒之細胞的中和抗體。
  64. 如請求項62或63之方法，其中該個體體內該抗體之血清力價增加。
  65. 如請求項62至64中任一項之方法，其中該抗體特異性結合至該S蛋白之一或多個抗原決定基。
  66. 如請求項65之方法，其中該S蛋白之一或多種功能或活性減退。
  67. 如請求項66之方法，其中該S蛋白功能或活性之減退係藉由以下量測： (a)     該S蛋白與宿主細胞受體之結合減少； (b)     該冠狀病毒與宿主細胞之附著減少； (c)     由該冠狀病毒誘發之宿主細胞膜融合減少；或 (d)     該個體體內感染該冠狀病毒之細胞的數量減少。
  68. 如請求項67之方法，其中該宿主受體選自血管緊張素轉化酶2 (ACE2)、胺基肽酶N (APN)、二肽基肽酶4 (DPP4)、癌胚抗原相關細胞黏附分子1 (CEACAM1)及糖。
  69. 如請求項66至68中任一項之方法，其中該S蛋白功能或活性降低10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%。
  70. 如請求項62至64中任一項之方法，其中該抗體特異性結合至該N蛋白之一或多個抗原決定基。
  71. 如請求項70之方法，其中該N蛋白之一或多種功能或活性減退。
  72. 如請求項71之方法，其中該N蛋白功能或活性之減退係藉由以下量測：  (a)     該N蛋白與該冠狀病毒之複製之基因體序列的結合減少； (b)     包裝於功能性病毒衣殼中的該冠狀病毒之複製之基因體序列減少；或 (c)     該個體體內複製之病毒粒子的數量減少。
  73. 如請求項72之方法，其中該N蛋白功能或活性降低10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%。
  74. 如請求項62至73中任一項之方法，其中該抗體結合至病毒粒子或受感染細胞並標記受感染細胞之病毒粒子以被該個體之免疫系統破壞。
  75. 如請求項74之方法，其中由該抗體結合之病毒粒子的胞吞作用得到誘導或增強。
  76. 如請求項74或75之方法，其中針對該個體體內受感染細胞的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)得到誘導或增強。
  77. 如請求項74至76中任一項之方法，其中針對該個體體內受感染細胞的抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)得到誘導或增強。
  78. 如請求項74至77中任一項之方法，其中針對該個體體內受感染細胞的補體依賴性細胞毒性(CDC)得到誘導或增強。
  79. 如請求項51至78中任一項之方法，其中該感染性疾病係呼吸道感染、肺感染、腎感染、肝感染、腸感染、神經系統感染、呼吸道症候群、支氣管炎、肺炎、腸胃炎、腦脊髓炎、腦炎、類肉瘤病、腹瀉、肝炎及脫髓鞘疾病。
  80. 如請求項79之方法，其中該感染性疾病係呼吸道感染。
  81. 如請求項79之方法，其中該感染性疾病係肺感染。
  82. 如請求項79之方法，其中該感染性疾病係呼吸道症候群。
  83. 如請求項79之方法，其中該感染性疾病係肺炎。
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113521268A (zh) 2020-04-22 2021-10-22 生物技术Rna制药有限公司 冠状病毒疫苗
WO2021249116A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 Sichuan Clover Biopharmaceuticals, Inc. Coronavirus vaccine compositions, methods, and uses thereof
WO2023023055A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Renagade Therapeutics Management Inc. Compositions and methods for optimizing tropism of delivery systems for rna
TW202325263A (zh) 2021-09-14 2023-07-01 美商雷納嘉德醫療管理公司 非環狀脂質及其使用方法
TW202328067A (zh) 2021-09-14 2023-07-16 美商雷納嘉德醫療管理公司 環狀脂質及其使用方法
WO2023081756A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Precise genome editing using retrons
RU2761904C1 (ru) * 2021-11-26 2021-12-13 федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации Применение средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у детей
WO2023122752A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 Renagade Therapeutics Management Inc. Constrained lipids and methods of use thereof
CN116332830A (zh) * 2021-12-23 2023-06-27 苏州艾博生物科技有限公司 脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物
WO2023141602A2 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
CN117460827A (zh) * 2022-02-09 2024-01-26 苏州艾博生物科技有限公司 狂犬病核酸疫苗
WO2023196931A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 Renagade Therapeutics Management Inc. Cyclic lipids and lipid nanoparticles (lnp) for the delivery of nucleic acids or peptides for use in vaccinating against infectious agents
US11878055B1 (en) 2022-06-26 2024-01-23 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2024020346A2 (en) 2022-07-18 2024-01-25 Renagade Therapeutics Management Inc. Gene editing components, systems, and methods of use
WO2024044723A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
CN116854784B (zh) * 2023-09-05 2023-11-17 北京纳百生物科技有限公司 犬冠状病毒n蛋白抗原截短体及其应用

Family Cites Families (120)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
JP2588339B2 (ja) 1992-06-02 1997-03-05 花王株式会社 新規ジアミノジエステル及びその製造法
US7097854B2 (en) 1996-09-12 2006-08-29 Medigene Oncology Gmbh Amino alcohol derivatives, process for their production and pharmaceutical preparations and reagents containing these compounds
DE19637043A1 (de) 1996-09-12 1998-03-19 Boehringer Mannheim Gmbh Neue Aminoalkoholderivate, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel und Reagenzien
JP2001521759A (ja) 1997-11-12 2001-11-13 ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル，インコーポレイテッド ヒトアミロイド前駆体タンパク質遺伝子の翻訳エンハンサーエレメント
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ATE375365T1 (de) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc Antikörper varianten und fragmente davon
HUP0104865A3 (en) 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US7468275B2 (en) 2000-01-28 2008-12-23 The Scripps Research Institute Synthetic internal ribosome entry sites and methods of identifying same
WO2001055369A1 (en) 2000-01-28 2001-08-02 The Scripps Research Institute Synthetic internal ribosome entry sites and methods of identifying same
ES2340532T3 (es) 2001-06-05 2010-06-04 Curevac Gmbh Arnm con un contenido g/c aumentado que codifica para un antigeno bacteriano y utilizacion del mismo.
DE10162480A1 (de) 2001-12-19 2003-08-07 Ingmar Hoerr Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen
WO2004002453A1 (en) 2002-06-28 2004-01-08 Protiva Biotherapeutics Ltd. Method and apparatus for producing liposomes
DE10229872A1 (de) 2002-07-03 2004-01-29 Curevac Gmbh Immunstimulation durch chemisch modifizierte RNA
DE10335833A1 (de) 2003-08-05 2005-03-03 Curevac Gmbh Transfektion von Blutzellen mit mRNA zur Immunstimulation und Gentherapie
DE102004042546A1 (de) 2004-09-02 2006-03-09 Curevac Gmbh Kombinationstherapie zur Immunstimulation
DE102005023170A1 (de) 2005-05-19 2006-11-23 Curevac Gmbh Optimierte Formulierung für mRNA
CA2616877C (en) 2005-07-27 2014-01-28 Protiva Biotherapeutics, Inc. Systems and methods for manufacturing liposomes
WO2007025008A2 (en) 2005-08-24 2007-03-01 The Scripps Research Institute Translation enhancer-element dependent vector systems
DE102006007433A1 (de) 2006-02-17 2007-08-23 Curevac Gmbh Adjuvanz in Form einer Lipid-modifizierten Nukleinsäure
JP2009544754A (ja) 2006-07-28 2009-12-17 アプライド バイオシステムズ， エルエルシー ジヌクレオチドｍｒｎａキャップアナログ
AU2007280690C1 (en) 2006-07-31 2012-08-23 Curevac Gmbh Nucleic acid of formula (I): GIXmGn, or (II): CIXmCn, in particular as an immune-stimulating agent/adjuvant
DE102006051516A1 (de) 2006-10-31 2008-05-08 Curevac Gmbh (Basen-)modifizierte RNA zur Expressionssteigerung eines Proteins
DE102006061015A1 (de) 2006-12-22 2008-06-26 Curevac Gmbh Verfahren zur Reinigung von RNA im präparativen Maßstab mittels HPLC
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
WO2008127688A1 (en) 2007-04-13 2008-10-23 Hart Communication Foundation Synchronizing timeslots in a wireless communication protocol
WO2009030254A1 (en) 2007-09-04 2009-03-12 Curevac Gmbh Complexes of rna and cationic peptides for transfection and for immunostimulation
EP2610340B1 (en) 2007-12-11 2014-10-01 The Scripps Research Institute Compositions and methods related to mRNA translational enhancer elements
CA2710534C (en) 2008-01-31 2018-09-04 Curevac Gmbh Nucleic acids of formula (i) (nuglxmgnnv)a and derivatives thereof as an immunostimulating agent/adjuvant
WO2009127230A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Curevac Gmbh MODIFIED (m)RNA FOR SUPPRESSING OR AVOIDING AN IMMUNOSTIMULATORY RESPONSE AND IMMUNOSUPPRESSIVE COMPOSITION
PL215513B1 (pl) 2008-06-06 2013-12-31 Univ Warszawski Nowe boranofosforanowe analogi dinukleotydów, ich zastosowanie, czasteczka RNA, sposób otrzymywania RNA oraz sposób otrzymywania peptydów lub bialka
WO2010037408A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
WO2010088927A1 (en) 2009-02-09 2010-08-12 Curevac Gmbh Use of pei for the improvement of endosomal release and expression of transfected nucleic acids, complexed with cationic or polycationic compounds
EP2281579A1 (en) 2009-08-05 2011-02-09 BioNTech AG Vaccine composition comprising 5'-Cap modified RNA
US20110053829A1 (en) 2009-09-03 2011-03-03 Curevac Gmbh Disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates for the transfection of nucleic acids
US9296698B2 (en) 2009-11-23 2016-03-29 Amgen Inc. Amino heteroaryl compounds as beta-secretase modulators and methods of use
WO2011069529A1 (en) 2009-12-09 2011-06-16 Curevac Gmbh Mannose-containing solution for lyophilization, transfection and/or injection of nucleic acids
EP2387999A1 (en) 2010-05-21 2011-11-23 CureVac GmbH Histidine-containing solution for transfection and/or injection of nucleic acids and uses thereof
US20130230884A1 (en) 2010-07-16 2013-09-05 John Chaput Methods to Identify Synthetic and Natural RNA Elements that Enhance Protein Translation
EP2449113B8 (en) 2010-07-30 2015-11-25 CureVac AG Complexation of nucleic acids with disulfide-crosslinked cationic components for transfection and immunostimulation
WO2012019630A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded protein
WO2012089225A1 (en) 2010-12-29 2012-07-05 Curevac Gmbh Combination of vaccination and inhibition of mhc class i restricted antigen presentation
WO2012116715A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Curevac Gmbh Vaccination in newborns and infants
WO2012113413A1 (en) 2011-02-21 2012-08-30 Curevac Gmbh Vaccine composition comprising complexed immunostimulatory nucleic acids and antigens packaged with disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates
WO2012116714A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Curevac Gmbh Vaccination in elderly patients
US9011903B2 (en) 2011-06-08 2015-04-21 Nitto Denko Corporation Cationic lipids for therapeutic agent delivery formulations
WO2013016058A1 (en) 2011-07-22 2013-01-31 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel bis-nitrogen containing cationic lipids for oligonucleotide delivery
US9579338B2 (en) 2011-11-04 2017-02-28 Nitto Denko Corporation Method of producing lipid nanoparticles for drug delivery
WO2013086373A1 (en) 2011-12-07 2013-06-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipids for the delivery of active agents
WO2013103659A1 (en) 2012-01-04 2013-07-11 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Stabilizing rna by incorporating chain-terminating nucleosides at the 3'-terminus
WO2013113325A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Curevac Gmbh Negatively charged nucleic acid comprising complexes for immunostimulation
EP2623121A1 (en) 2012-01-31 2013-08-07 Bayer Innovation GmbH Pharmaceutical composition comprising a polymeric carrier cargo complex and an antigen
WO2013113326A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Curevac Gmbh Pharmaceutical composition comprising a polymeric carrier cargo complex and at least one protein or peptide antigen
WO2013120497A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded therapeutic protein
WO2013120499A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly (a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded pathogenic antigen
WO2013120500A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded tumour antigen
WO2013120498A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded allergenic antigen or an autoimmune self-antigen
CN104321432B (zh) 2012-03-27 2018-08-10 库瑞瓦格股份公司 包含5′top utr的人工核酸分子
ES2660459T3 (es) 2012-03-27 2018-03-22 Curevac Ag Moléculas de ácido nucleico artificiales
AU2013242404B2 (en) 2012-03-27 2018-08-30 CureVac SE Artificial nucleic acid molecules for improved protein or peptide expression
US20150306249A1 (en) 2012-05-25 2015-10-29 Curevac Gmbh Reversible immobilization and/or controlled release of nucleic acid containing nanoparticles by (biodegradable) polymer coatings
WO2014028487A1 (en) 2012-08-13 2014-02-20 Massachusetts Institute Of Technology Amine-containing lipidoids and uses thereof
CN109045289A (zh) 2013-02-22 2018-12-21 库瑞瓦格股份公司 疫苗接种和抑制pd-1途径的组合
WO2015002667A1 (en) 2013-07-01 2015-01-08 Myq, Inc. A location regulated point-of-sale system and enhancements
JP6620093B2 (ja) 2013-07-23 2019-12-11 アービュートゥス バイオファーマ コーポレイションＡｒｂｕｔｕｓ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ メッセンジャーｒｎａを送達するための組成物及び方法
CA2915730A1 (en) 2013-08-21 2015-02-26 Karl-Josef Kallen A combination rsv/influenza a vaccine
WO2015024667A1 (en) 2013-08-21 2015-02-26 Curevac Gmbh Method for increasing expression of rna-encoded proteins
SG11201510748PA (en) 2013-08-21 2016-03-30 Curevac Ag Composition and vaccine for treating lung cancer
JP6896421B2 (ja) 2013-08-21 2021-06-30 キュアバック アーゲー 呼吸器合胞体ウイルス（ｒｓｖ）ワクチン
RU2016109938A (ru) 2013-08-21 2017-09-26 Куревак Аг Композиция и вакцина для лечения рака предстательной железы
CA2915712A1 (en) 2013-08-21 2015-02-26 Margit SCHNEE Rabies vaccine
ES2806575T3 (es) 2013-11-01 2021-02-18 Curevac Ag ARN modificado con propiedades inmunoestimuladoras disminuidas
AU2014348212C1 (en) 2013-11-18 2018-11-29 Arcturus Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipid for RNA delivery
AU2014375404C1 (en) 2013-12-30 2020-11-19 CureVac Manufacturing GmbH Methods for RNA analysis
SG11201603144QA (en) 2013-12-30 2016-07-28 Curevac Ag Artificial nucleic acid molecules
WO2015101415A1 (en) 2013-12-30 2015-07-09 Curevac Gmbh Artificial nucleic acid molecules
SI3766916T1 (sl) 2014-06-25 2023-01-31 Acuitas Therapeutics Inc. Formulacije novih lipidov in lipidnih nanodelcev za dostavo nukleinskih kislin
CA2984125A1 (en) 2015-04-27 2016-11-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleoside-modified rna for inducing an adaptive immune response
PT3313449T (pt) 2015-06-24 2020-10-30 Nitto Denko Corp Compostos ionizáveis e composições e suas utilizações
WO2017004143A1 (en) 2015-06-29 2017-01-05 Acuitas Therapeutics Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
AU2016324310B2 (en) 2015-09-17 2021-04-08 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
PL3718565T3 (pl) * 2015-10-22 2022-09-19 Modernatx, Inc. Szczepionki przeciwko wirusom układu oddechowego
AU2016369612B2 (en) 2015-12-17 2023-06-01 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-CoA mutase
PL3394030T3 (pl) 2015-12-22 2022-04-11 Modernatx, Inc. Związki i kompozycje do wewnątrzkomórkowego dostarczania środków
WO2017180917A2 (en) 2016-04-13 2017-10-19 Modernatx, Inc. Lipid compositions and their uses for intratumoral polynucleotide delivery
MA45032A (fr) 2016-05-18 2019-03-27 Fundacion Para La Investig Medica Aplicada Polynucléotides codant pour la porphobilinogène désaminase destinés au traitement de la porphyrie intermittente aiguë
MA45053A (fr) 2016-05-18 2019-03-27 Modernatx Inc Polynucléotides codant pour un régulateur de conductance transmembranaire de fibrose kystique pour le traitement de la fibrose kystique
JP7210287B2 (ja) 2016-05-18 2023-01-23 モダーナティエックス・インコーポレイテッド Ｉｉ型シトルリン血症の治療のためのシトリンをコードするポリヌクレオチド
US20190382774A1 (en) 2016-05-18 2019-12-19 Modernatx, Inc. Polyribonucleotides containing reduced uracil content and uses thereof
WO2017201348A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding galactose-1-phosphate uridylyltransferase for the treatment of galactosemia type 1
US20190275170A1 (en) 2016-05-18 2019-09-12 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding jagged1 for the treatment of alagille syndrome
EP3458590B9 (en) 2016-05-18 2021-08-18 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding -galactosidase a for the treatment of fabry disease
EP4137509A1 (en) 2016-05-18 2023-02-22 ModernaTX, Inc. Combinations of mrnas encoding immune modulating polypeptides and uses thereof
US20190390181A1 (en) 2016-05-18 2019-12-26 Modernatx, Inc. Polynucleotides Encoding Lipoprotein Lipase for the Treatment of Hyperlipidemia
CA3024624A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding porphobilinogen deaminase for the treatment of acute intermittent porphyria
KR102469450B1 (ko) 2016-05-18 2022-11-22 모더나티엑스, 인크. 인터류킨-12 (il12)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 그의 용도
BR112019008481A2 (pt) 2016-10-26 2020-03-03 Curevac Ag Vacinas de mrna de nanopartículas lipídicas
US11851389B2 (en) 2016-11-08 2023-12-26 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Cationic lipids for nucleic acid delivery and preparation thereof
US20180185516A1 (en) 2016-12-09 2018-07-05 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery of target specific nucleases
US10526284B2 (en) 2016-12-21 2020-01-07 Arcturus Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipid for RNA delivery
KR20190110612A (ko) * 2017-02-01 2019-09-30 모더나티엑스, 인크. 활성화 종양유전자 돌연변이 펩티드를 인코드하는 면역조절 치료 mrna 조성물
US11045540B2 (en) 2017-03-15 2021-06-29 Modernatx, Inc. Varicella zoster virus (VZV) vaccine
MA52262A (fr) 2017-03-15 2020-02-19 Modernatx Inc Vaccin à large spectre contre le virus de la grippe
WO2018170260A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Respiratory syncytial virus vaccine
HUE060693T2 (hu) 2017-03-15 2023-04-28 Modernatx Inc Vegyület és készítmények terápiás szerek intracelluláris bejuttatására
WO2018170256A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
US11357856B2 (en) 2017-04-13 2022-06-14 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for delivery of active agents
CN110799492B (zh) 2017-04-28 2023-06-27 爱康泰生治疗公司 用于递送核酸的新型羰基脂质和脂质纳米颗粒制剂
US20200131498A1 (en) 2017-06-14 2020-04-30 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase
BR112019028280A2 (pt) * 2017-07-04 2020-07-14 Curevac Ag moléculas de ácido nucleico
EP3668833A1 (en) 2017-08-16 2020-06-24 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
CA3073018A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
WO2019089828A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Acuitas Therapeutics, Inc. Lamellar lipid nanoparticles
CN111164068B (zh) 2018-08-21 2023-11-14 株式会社东芝 生物降解性化合物、脂质粒子、含有脂质粒子的组合物、及试剂盒
WO2020047201A1 (en) * 2018-09-02 2020-03-05 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding very long-chain acyl-coa dehydrogenase for the treatment of very long-chain acyl-coa dehydrogenase deficiency
CA3113436A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
EP3908568A1 (en) 2019-01-11 2021-11-17 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents

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