TW202342753A - 狂犬病核酸疫苗 - Google Patents

Abstract

本文提供了用於控制、預防和/或治療由狂犬病病毒或由感染狂犬病病毒引起的疾病或病症，例如狂犬病的治療性核酸分子。本文還提供了包含所述治療性核酸的治療性組合物，包括疫苗和脂質納米顆粒，以及相關的治療方法和用途。

Description

狂犬病核酸疫苗

本公開總體上涉及可用於控制、預防和治療由狂犬病病毒(RABV或RV)或由感染狂犬病病毒引起的疾病或病症(例如，狂犬病)的核酸分子。本公開還涉及所述核酸分子的含脂質組合物(包括疫苗)。

(1) 病因學 狂犬病是一種由(單分子負鏈RNA病毒目(Mononegavirales)的彈狀病毒科(Rhabdoviridae)中的)狂犬病病毒屬病毒引起的動物性傳染病，其首次在西元前4世紀描述 ¹。狂犬病病毒(RABV或RV)是狂犬病病毒屬的原型病毒 ¹，是目前最常見的狂犬病病原體。RABV最容易通過受感染哺乳動物的咬傷傳播，並且由受感染犬引起的病例佔有比例高達＞99% ²。 RABV可通過破損皮膚暴露於受感染動物的唾液而識別並附著於細胞受體(例如，硫酸乙醯肝素 ³、煙鹼型乙醯膽鹼受體(nAchR) ⁴、神經細胞黏附分子 ⁵、神經營養因數受體p75NTR ⁶和促代謝型谷氨酸受體亞型2)，之後，病毒感染中樞神經系統並在中樞神經系統中複製，隨後導致嚴重神經系統疾病如發熱、瘙癢、感覺異常、恐水症等 ^7,8。 RABV含有編碼五種結構蛋白的單鏈負義RNA基因組：核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)、糖蛋白(G)和RNA依賴性RNA聚合酶(L) ⁹。在這些病毒蛋白質中，RABV的糖蛋白(RABV-G)通過介導病毒識別和附著於細胞受體以及病毒粒子內吞和內體腔酸化後病毒包膜與細胞膜的融合，從而起始病毒顆粒進入宿主細胞而在病毒的發病機制中發揮關鍵作用 ¹⁰。作為存在於病毒表面的唯一蛋白質，RABV-G是中和抗體的主要標靶 ^11-13，因此選擇G蛋白作為疫苗設計的主要標靶。 (2) 流行病學 RABV在世界大部分地區由中食肉動物(mesocarnivores) (飲食由50%-70%肉組成的動物)維持，包括犬、狐狸、貉、浣熊、貓鼬和臭鼬 ¹⁴。犬傳播的狂犬病導致＞99%的人類報告病例。該病毒在世界許多地區仍是地方性動物病(即動物中的地方病)，並且人類狂犬病仍是最嚴重且最令人痛苦的疾病之一，且是對公共衛生的重大威脅 ¹⁵。事實上，當患有狂犬病的個體出現症狀時，該疾病幾乎總是致命的 ¹⁶。 在全球範圍內，人類狂犬病被認為是被忽視的動物傳染病，尤其是在非洲和亞洲資源有限的國家，疾病負擔不成比例地下降且死亡率很高 ¹⁷。全世界每年估計的60,000人死亡並沒有反映出這種疾病的真正負擔 ^14,18。研究結果表明，僅在印度每年就有多達20,000人喪生 ¹⁸。 允許犬接種疫苗、改善公共衛生策略，WHO、世界動物衛生組織(OIE)和聯合國糧食及農業組織(FAO)制定了到2030年在流行國家消除犬傳播的人類狂犬病的目標。 (3) 疫苗 自19世紀以來，有效的人用狂犬病疫苗被用於預防暴露前或暴露後感染。目前市場上的疫苗主要是由Vero或人二倍體細胞培養的滅活疫苗。並且免疫接種程式是暴露後5劑或4劑，和暴露前3劑。 目前市場上的疫苗主要有三大擔憂。一是漫長的疫苗接種方案。二是成本高。目前，市場上的狂犬病疫苗主要是滅活疫苗。由Vero細胞和人二倍體細胞增殖的狂犬病病毒滴度較低，而每劑需要比病毒培養物更高的滴度，從而導致需要濃縮病毒滴度，這使得生產工藝複雜且昂貴。第三個擔憂是病毒培養涉及的生產工藝存在一定潛在安全風險。 傳統的滅活疫苗不能誘導穩健細胞反應和顯著高體液反應。相反，與滅活疫苗相比，mRNA疫苗能夠誘導更高的細胞和體液反應，因為LNP可起到佐劑的作用。此外，由於mRNA生產過程不涉及特徵病毒，因此不需要擔心安全性和成本，並且生產週期比傳統疫苗短。

在一個方面，本文提供了可用於預防、控制和治療由RV或由感染RV引起的疾病或病症(例如，狂犬病)的非天然存在的核酸分子。 在一些實施方案中，非天然存在的核酸包含編碼RV的糖蛋白(G) (G蛋白)或其片段的編碼核苷酸序列。在一些實施方案中，G蛋白或其片段由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：與SEQ ID NO:1-3中任一個中所列的氨基酸序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，G蛋白或其片段由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：與SEQ ID NO:1中所列的氨基酸序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，G蛋白或其片段由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：SEQ ID NO:1中所列的氨基酸序列。在一些實施方案中，編碼核苷酸序列由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：與SEQ ID NO:7或8中所列的核苷酸序列具有至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的核苷酸序列。在一些實施方案中，編碼核苷酸序列由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：SEQ ID NO:7或8中所列的核苷酸序列。在一些實施方案中，G蛋白或其片段由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：與SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，G蛋白或其片段由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列。在一些實施方案中，編碼核苷酸序列由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：與SEQ ID NO:9中所列的核苷酸序列具有至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的核苷酸序列。在一些實施方案中，編碼核苷酸序列由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：SEQ ID NO:9中所列的核苷酸序列。在一些實施方案中，G蛋白或其片段由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：與SEQ ID NO:3中所列的氨基酸序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，G蛋白或其片段由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：SEQ ID NO:3中所列的氨基酸序列。在一些實施方案中，編碼核苷酸序列由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：與SEQ ID NO:10中所列的核苷酸序列具有至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的核苷酸序列。在一些實施方案中，編碼核苷酸序列由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：SEQ ID NO:10中所列的核苷酸序列。在一些實施方案中，編碼核苷酸序列已進行了密碼子優化以在受試者細胞中表達。在一些實施方案中，受試者是非人哺乳動物，例如，犬科動物。在一些實施方案中，受試者是人。在一些實施方案中，G蛋白或其片段與天然信號肽融合。在一些實施方案中，信號肽由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：與SEQ ID NO:4-6中任一個中所列的氨基酸序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，信號肽由編碼核苷酸序列編碼，所述編碼核苷酸序列由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：與SEQ ID NO:11-13中任一個中所列的核苷酸序列具有至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的核苷酸序列。在一些實施方案中，G蛋白或其片段與異源多肽融合。在一些實施方案中，異源多肽選自人免疫球蛋白的Fc區、信號肽和促進融合蛋白多聚化的肽。在一些實施方案中，信號肽是來自IgE的信號肽。在一些實施方案中，信號肽由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：與SEQ ID NO:14中所列的氨基酸序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，信號肽由編碼核苷酸序列編碼，所述編碼核苷酸序列由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：與SEQ ID NO:15中所列的核苷酸序列具有至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的核苷酸序列。在一些實施方案中，多聚化是二聚化或三聚化。在一些實施方案中，非天然存在的核酸分子還包含5’非翻譯區(5’-UTR)，其中5’-UTR包含SEQ ID NO: 24-33中任一個中所列的序列。在一些實施方案中，非天然存在的核酸分子還包含3’非翻譯區(3’-UTR)，其中3’-UTR包含SEQ ID NO: 34-39中任一個中所列的序列。在一些實施方案中，3’-UTR還包含poly-A尾或聚腺苷酸化信號。在一些實施方案中，非天然存在的核酸包含選自假尿苷(psd)、1-甲基-假尿苷(m1)和5-甲基胞嘧啶的一種或多種功能性核苷酸類似物。在一些實施方案中，核酸是DNA或mRNA。 在一些實施方案中，本文公開了包含如本文所述的非天然存在的核酸分子的載體或細胞。優選地，載體是IVT質粒。在一些實施方案中，本文公開了包含如本文所述的非天然存在的核酸分子的組合物。 在本文所述的組合物的一些實施方案中，組合物還包含至少一種本文所述的脂質。在本文所述的組合物的一些實施方案中，組合物還包含至少本文所述的第一脂質(例如，陽離子脂質)和任選的本文所述的第二脂質(例如，聚合物結合的脂質)。 在一些實施方案中，第一脂質是根據式01-I或式01-II的化合物；或表01-1中所列的化合物；或根據式02-I的化合物；或表02-1中所列的化合物；或根據式03-I的化合物；或表03-1中所列的化合物；或根據式04-I的化合物；或表04-1中所列的化合物。 在一些實施方案中，組合物被配製為將核酸包封在脂質殼中的脂質納米顆粒。在一些實施方案中，組合物是藥物組合物。在一些實施方案中，組合物是疫苗。 在一個方面，本文提供了用於控制、預防或治療受試者中由RV或由感染RV引起的疾病或病症的方法，所述方法包括向受試者施用治療有效量的本文所述的非天然存在的核酸或治療有效量的如本文所述的藥物組合物。 在本文所述的方法的一些實施方案中，受試者是人或非人哺乳動物，例如犬科動物。在一些實施方案中，受試者是人類成人、人類兒童或人類幼兒。在一些實施方案中，受試者是老年人。在一些實施方案中，受試者患有疾病或病症。在一些實施方案中，受試者處於RV感染的風險中或對RV感染易感。在一些實施方案中，受試者已被診斷為RV感染陽性。在一些實施方案中，受試者是無症狀的。 在本文所述的方法的一些實施方案中，所述方法包括向受試者施用包封核酸的脂質納米顆粒，並且其中脂質納米顆粒被受試者中的細胞內吞。在一些實施方案中，核酸由受試者中的細胞表達。 在本文所述的方法的一些實施方案中，在受試者中引發針對RV的免疫反應。在一些實施方案中，免疫反應包括在淋巴細胞中產生細胞因數。在一些實施方案中，淋巴細胞是CD4 ⁺T細胞和/或CD8 ⁺T細胞。在一些實施方案中，細胞因數是IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6中的一種或多種。在一些實施方案中，表達細胞因數的淋巴細胞的比例增加。在一些實施方案中，淋巴細胞中細胞因數的產生增加。在一些實施方案中，免疫反應包括產生與由核酸編碼的病毒G蛋白特異性結合的抗體。在一些實施方案中，抗體是針對RV或被RV感染的細胞的中和抗體。在一些實施方案中，在受試者中抗體的血清滴度增加。 在本文所述的方法的一些實施方案中，抗體結合至病毒顆粒或被感染的細胞，並且標記被感染細胞的病毒顆粒，以被受試者的免疫系統破壞。在一些實施方案中，誘導或增強由抗體結合的病毒顆粒的內吞作用。在一些實施方案中，誘導或增強受試者中針對被感染細胞的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)。在一些實施方案中，誘導或增強受試者中針對被感染細胞的抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。在一些實施方案中，誘導或增強受試者中針對被感染細胞的補體依賴性細胞毒性(CDC)。 在本文所述的方法的一些實施方案中，由RV引起的疾病或病症是狂犬病。

本文提供了可用於預防、控制和治療由RV或由感染RV引起的疾病或病症的治療性核酸分子。本文還提供了包含治療性核酸分子的藥物組合物，包括被配製為脂質納米顆粒的藥物組合物，以及用於預防、控制和治療由RV或由感染RV引起的疾病或病症的相關治療方法和用途。在考慮特定實施方案的以下詳細描述後，本公開的另外特徵對於本領域技術人員將變得顯而易見。 一般技 術本文所描述或引用的技術和程式包括本領域技術人員一般充分理解和/或使用常規方法通常採用的技術和程式，例如Sambrook等人， Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第3版，2001)； Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人編，2003)中所描述的廣泛使用的方法。 術語除非另有描述，否則本文中使用的所有技術和科學術語具有與本領域普通技術人員通常所理解相同的含義。出於解釋本說明書的目的，將應用以下術語描述，並且在適當時，以單數形式使用的術語還將包括複數形式，反之亦然。所有專利、申請、公佈的申請和其它出版物均以引用的方式整體併入。如果對所陳述的術語的任何描述與以引用的方式併入本文中的任何檔相衝突，則應以下文對所陳述的術語的描述為準。 如本文所用並且除非另有說明，否則術語“脂質”是指一組有機化合物，其包括但不限於脂肪酸酯，並且一般以難溶於水但可溶於許多非極性有機溶劑中為特徵。儘管脂質一般具有弱水溶性，但是某些類別的脂質(例如經極性基團改性的脂質，例如DMG-PEG2000)具有有限的水溶性並且在某些條件下可溶於水。已知的脂質類型包括生物分子，諸如脂肪酸、蠟、固醇、脂溶性維生素、單酸甘油酯、二酸甘油酯、三酸甘油酯和磷脂。脂質至少可分為三類：(1) “簡單脂質”，包括脂肪和油，以及蠟；(2) “複合脂質”，包括磷脂和糖脂(例如DMPE-PEG2000)；以及(3) “衍生脂質”，諸如類固醇。此外，如本文所用，脂質還包括類脂質化合物。術語“類脂質化合物”又簡稱為“類脂質”，是指脂質樣化合物(例如具有脂質樣物理性質的兩親性化合物)。 術語“脂質納米顆粒”或“LNP”是指具有至少一個納米(nm)級尺寸(例如1至1,000 nm)的顆粒，其含有一種或多種類型的脂質分子。本文所提供的LNP可進一步含有至少一種非脂質有效負載分子(例如一種或多種核酸分子)。在一些實施方案中，LNP包含部分或完全包封於脂質殼內的非脂質有效負載分子。特定來說，在一些實施方案中，其中有效負載是帶負電荷的分子(例如編碼病毒蛋白的mRNA)，並且LNP的脂質組分包含至少一種陽離子脂質。不受理論束縛，預期陽離子脂質可與帶負電荷的有效負載分子相互作用，並且在LNP形成期間促進有效負載併入和/或包封至LNP中。可形成如本文所提供的LNP的一部分的其它脂質包括但不限於中性脂質和帶電脂質，諸如類固醇、聚合物結合的脂質和各種兩性離子性脂質。在某些實施方案中，根據本公開的LNP包含一種或多種如本文所述的式01-I、01-II、02-I、03-I、04-I和05-I (及其子式)的脂質。 術語“陽離子脂質”是指在其環境的任何pH值或氫離子活性下帶正電荷，或能夠響應於其環境(例如其預定使用的環境)的pH值或氫離子活性而帶正電荷的脂質。因此，術語“陽離子”涵蓋“永久性陽離子”和“可陽離子化”。在某些實施方案中，陽離子脂質中的正電荷由季氮原子的存在引起。在某些實施方案中，陽離子脂質包含兩性離子性脂質，所述兩性離子性脂質在其預定使用的環境中(例如在生理pH值下)帶正電荷。在某些實施方案中，陽離子脂質是一種或多種如本文所述的式01-I、01-II、02-I、03-I和04-I (及其子式)的脂質。 術語“聚合物結合的脂質”是指既包含脂質部分又包含聚合物部分的分子。聚合物結合的脂質的實例是聚乙二醇化脂質(PEG-脂質)，其中聚合物部分包含聚乙二醇。在某些實施方案中，聚合物結合的脂質是一種或多種如本文所述的式05-I (及其子式)的脂質。 術語“中性脂質”涵蓋在所選pH值下或在所選pH值範圍內以不帶電形式或以中性兩性離子形式存在的任何脂質分子。在一些實施方案中，所選的有用pH值或範圍對應於預定脂質用途的環境中的pH條件，諸如生理pH值。作為非限制性實例，可與本公開結合使用的中性脂質包括但不限於磷脂醯膽鹼，諸如1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DMPC)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)；磷脂醯乙醇胺，諸如1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、2-((2,3-雙(油醯氧基)丙基)二甲基銨基)磷酸氫乙酯(DOCP)；鞘磷脂(SM)；神經醯胺；類固醇，諸如固醇和其衍生物。本文所提供的中性脂質可為合成的或者衍生自天然來源或化合物(從其分離或改性)。 術語“帶電脂質”涵蓋在所選pH值下或在所選pH值範圍內以帶正電荷或帶負電荷形式存在的任何脂質分子。在一些實施方案中，所選pH值或範圍對應於預定脂質用途的環境中的pH條件，諸如生理pH值。作為非限制性實例，可與本公開結合使用的帶電脂質包括但不限於磷脂醯絲氨酸、磷脂酸、磷脂醯甘油、磷脂醯肌醇、固醇半琥珀酸酯、二烷基三甲基銨-丙烷(例如DOTAP、DOTMA)、二烷基二甲基氨基丙烷、乙基磷酸膽鹼、二甲基氨基乙烷氨基甲醯基固醇(例如DC-Chol)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸-L-絲氨酸鈉鹽(DOPS-Na)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-外消旋-甘油)鈉鹽(DOPG-Na)和1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸鈉鹽(DOPA-Na)。本文所提供的帶電脂質可為合成的或者衍生自天然來源或化合物(從其分離或改性)。 如本文所用並且除非另有說明，否則術語“烷基”是指僅由碳和氫原子組成的飽和直鏈或支鏈烴鏈基團。在一個實施方案中，烷基具有例如1至24個碳原子(C ₁-C ₂₄烷基)、4至20個碳原子(C ₄-C ₂₀烷基)、6至16個碳原子(C ₆-C ₁₆烷基)、6至9個碳原子(C ₆-C ₉烷基)、1至15個碳原子(C ₁-C ₁₅烷基)、1至12個碳原子(C ₁-C ₁₂烷基)、1至8個碳原子(C ₁-C ₈烷基)或1至6個碳原子(C ₁-C ₆烷基)，並且通過單鍵連接至分子其餘部分。烷基的實例包括但不限於甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(異丙基)、正丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基等。除非另有說明，否則烷基任選地經取代。 如本文所用並且除非另有說明，否則術語“烯基”是指僅由碳和氫原子組成的直鏈或支鏈烴鏈基團，其含有一個或多個碳-碳雙鍵。如本領域普通技術人員所理解，術語“烯基”還涵蓋具有“順式”和“反式”構型或替代地，“E”和“Z”構型的基團。在一個實施方案中，烯基具有例如2至24個碳原子(C ₂-C ₂₄烯基)、4至20個碳原子(C ₄-C ₂₀烯基)、6至16個碳原子(C ₆-C ₁₆烯基)、6至9個碳原子(C ₆-C ₉烯基)、2至15個碳原子(C ₂-C ₁₅烯基)、2至12個碳原子(C ₂-C ₁₂烯基)、2至8個碳原子(C ₂-C ₈烯基)或2至6個碳原子(C ₂-C ₆烯基)，並且通過單鍵連接至分子其餘部分。烯基的實例包括但不限於乙烯基、丙-1-烯基、丁-1-烯基、戊-1-烯基、戊-1,4-二烯基等。除非另有說明，否則烯基任選地經取代。 如本文所用並且除非另有說明，否則術語“炔基”是指僅由碳和氫原子組成的直鏈或支鏈烴鏈基團，其含有一個或多個碳-碳三鍵。在一個實施方案中，炔基具有例如2至24個碳原子(C ₂-C ₂₄炔基)、4至20個碳原子(C ₄-C ₂₀炔基)、6至16個碳原子(C ₆-C ₁₆炔基)、6至9個碳原子(C ₆-C ₉炔基)、2至15個碳原子(C ₂-C ₁₅炔基)、2至12個碳原子(C ₂-C ₁₂炔基)、2至8個碳原子(C ₂-C ₈炔基)或2至6個碳原子(C ₂-C ₆炔基)，並且通過單鍵連接至分子其餘部分。炔基的實例包括但不限於乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基等。除非另有說明，否則炔基任選地經取代。 如本文所用並且除非另有說明，否則術語“亞烷基”或“亞烷基鏈”是指將分子其餘部分連接至基團的直鏈或支鏈二價烴鏈，其僅由碳和氫組成並且為飽和的。在一個實施方案中，亞烷基具有例如1至24個碳原子(C ₁-C ₂₄亞烷基)、1至15個碳原子(C ₁-C ₁₅亞烷基)、1至12個碳原子(C ₁-C ₁₂亞烷基)、1至8個碳原子(C ₁-C ₈亞烷基)、1至6個碳原子(C ₁-C ₆亞烷基)、2至4個碳原子(C ₂-C ₄亞烷基)、1至2個碳原子(C ₁-C ₂亞烷基)。亞烷基的實例包括但不限於亞甲基、亞乙基、亞丙基、亞正丁基等。亞烷基鏈通過單鍵連接至分子其餘部分，並且通過單鍵連接至基團。亞烷基鏈與分子其餘部分和與基團的連接點可通過鏈內的一個碳或任何兩個碳。除非另有說明，否則亞烷基鏈任選地經取代。 如本文所用並且除非另有說明，否則術語“亞烯基”是指將分子其餘部分連接至基團的直鏈或支鏈二價烴鏈，其僅由碳和氫組成並且含有一個或多個碳-碳雙鍵。在一個實施方案中，亞烯基具有例如2至24個碳原子(C ₂-C ₂₄亞烯基)、2至15個碳原子(C ₂-C ₁₅亞烯基)、2至12個碳原子(C ₂-C ₁₂亞烯基)、2至8個碳原子(C ₂-C ₈亞烯基)、2至6個碳原子(C ₂-C ₆亞烯基)或2至4個碳原子(C ₂-C ₄亞烯基)。亞烯基的實例包括但不限於亞乙烯基、亞丙烯基、亞正丁烯基等。亞烯基通過單鍵或雙鍵連接至分子其餘部分，並且通過單鍵或雙鍵連接至基團。亞烯基與分子其餘部分和與基團的連接點可通過鏈內的一個碳或任何兩個碳。除非另有說明，否則亞烯基任選地經取代。 如本文所用並且除非另有說明，否則術語“環烷基”是指僅由碳和氫原子組成的非芳族飽和單環或多環烴基。環烷基可包括稠合或橋連環系統。在一個實施方案中，環烷基具有例如3至15個環碳原子(C ₃-C ₁₅環烷基)、3至10個環碳原子(C ₃-C ₁₀環烷基)或3至8個環碳原子(C ₃-C ₈環烷基)。環烷基通過單鍵連接至分子其餘部分。單環環烷基的實例包括但不限於環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基和環辛基。多環環烷基的實例包括但不限於金剛烷基、降冰片基、十氫萘基、7,7-二甲基-雙環[2.2.1]庚基等。除非另有說明，否則環烷基任選地經取代。 如本文所用並且除非另有說明，否則術語“亞環烷基”是二價環烷基。除非另有說明，否則亞環烷基任選地經取代。 如本文所用並且除非另有說明，否則術語“環烯基”是指僅由碳和氫原子組成並且包括一個或多個碳-碳雙鍵的非芳族單環或多環烴基。環烯基可包括稠合或橋連環系統。在一個實施方案中，環烯基具有例如3至15個環碳原子(C ₃-C ₁₅環烯基)、3至10個環碳原子(C ₃-C ₁₀環烯基)或3至8個環碳原子(C ₃-C ₈環烯基)。環烯基通過單鍵連接至分子其餘部分。單環環烯基的實例包括但不限於環丙烯基、環丁烯基、環戊烯基、環己烯基、環庚烯基、環辛烯基等。除非另有說明，否則環烯基任選地經取代。 如本文所用並且除非另有說明，否則術語“亞環烯基”是二價環烯基。除非另有說明，否則亞環烯基任選地經取代。 如本文所用並且除非另有說明，否則術語“雜環基”是指含有一個或多個(例如一個、一個或兩個、一個至三個、或一個至四個)獨立地選自氮、氧、磷和硫的雜原子的非芳族基團單環或多環部分。雜環基可在任何雜原子或碳原子處連接至主結構。雜環基可為單環、雙環、三環、四環或其它多環系統，其中多環系統可為稠合、橋連或螺環系統。雜環基多環系統可在一個或多個環中包含一個或多個雜原子。雜環基可為飽和或部分不飽和的。飽和雜環烷基可稱為“雜環烷基”。部分不飽和的雜環烷基在雜環基含有至少一個雙鍵時可稱為“雜環烯基”，或在雜環基含有至少一個三鍵時可稱為“雜環炔基”。在一個實施方案中，雜環基具有例如3至18個環原子(3元至18元雜環基)、4至18個環原子(4元至18元雜環基)、5至18個環原子(3元至18元雜環基)、4至8個環原子(4元至8元雜環基)或5至8個環原子(5元至8元雜環基)。當在本文中出現時，數字範圍，諸如“3至18”是指給定範圍中的每個整數；例如，“3至18個環原子”意指雜環基可由3個環原子、4個環原子、5個環原子、6個環原子、7個環原子、8個環原子、9個環原子、10個環原子等(至多並且包括18個環原子)組成。雜環基的實例包括但不限於咪唑基、咪唑烷基、噁唑基、噁唑烷基、噻唑基、噻唑烷基、吡唑烷基、吡唑基、異噁唑烷基、異噁唑基、異噻唑烷基、異噻唑基、嗎啉基、吡咯基、吡咯烷基、呋喃基、四氫呋喃基、噻吩基、吡啶基、呱啶基、喹啉基和異喹啉基。除非另有說明，否則雜環基任選地經取代。 如本文所用並且除非另有說明，否則術語“亞雜環基”是二價雜環基。除非另有說明，否則亞雜環基任選地經取代。 如本文所用並且除非另有說明，否則術語“芳基”是指含有至少一個芳族烴環的單環芳族基團和/或多環單價芳族基團。在某些實施方案中，芳基具有6至18個環碳原子(C ₆-C ₁₈芳基)、6至14個環碳原子(C ₆-C ₁₄芳基)或6至10個環碳原子(C ₆-C ₁₀芳基)。芳基的實例包括但不限於苯基、萘基、芴基、薁基、蒽基、菲基、芘基、聯苯基和聯三苯基。術語“芳基”還指雙環、三環或其它多環烴環，其中至少一個環是芳族環，並且其它環可為飽和、部分不飽和或芳族環，例如二氫萘基、茚基、二氫茚基或四氫萘基(tetrahydronaphthyl/tetralinyl)。除非另有說明，否則芳基任選地經取代。 如本文所用並且除非另有說明，否則術語“亞芳基”是二價芳基。除非另有說明，否則亞芳基任選地經取代。 如本文所用並且除非另有說明，否則術語“雜芳基”是指含有至少一個芳族環的單環芳族基團和/或多環芳族基團，其中至少一個芳族環含有一個或多個(例如一個、一個或兩個、一個至三個、或一個至四個)獨立地選自O、S和N的雜原子。雜芳基可在任何雜原子或碳原子處連接至主結構。在某些實施方案中，雜芳基具有5至20個、5至15個或5至10個環原子。術語“雜芳基”還指雙環、三環或其它多環，其中至少一個環是芳族環，並且其它環可為飽和、部分不飽和或芳族環，其中至少一個芳族環含有一個或多個獨立地選自O、S和N的雜原子。單環雜芳基的實例包括但不限於吡咯基、吡唑基、吡唑啉基、咪唑基、噁唑基、異噁唑基、噻唑基、噻二唑基、異噻唑基、呋喃基、噻吩基、噁二唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基和三嗪基。雙環雜芳基的實例包括但不限於吲哚基、苯並噻唑基、苯並噁唑基、苯並噻吩基、喹啉基、四氫異喹啉基、異喹啉基、苯並咪唑基、苯並吡喃基、吲哚嗪基、苯並呋喃基、異苯並呋喃基、色酮基、香豆素基、噌啉基、喹噁啉基、吲唑基、嘌呤基、吡咯並吡啶基、呋喃並吡啶基、噻吩並吡啶基、二氫異吲哚基和四氫喹啉基。三環雜芳基的實例包括但不限於哢唑基、苯並吲哚基、菲咯啉基、吖啶基、菲啶基和呫噸基。除非另有說明，否則雜芳基任選地經取代。 如本文所用並且除非另有說明，否則術語“亞雜芳基”是二價雜芳基。除非另有說明，否則亞雜芳基任選地經取代。 當本文所述的基團被稱為“經取代”時，其可經一個或多個任何適當的取代基取代。取代基的說明性實例包括但不限於本文所提供的示例性化合物和實施方案中可見的那些，以及：鹵素原子，諸如F、Cl、Br或I；氰基；氧代基(=O)；羥基(-OH)；烷基；烯基；炔基；環烷基；芳基；-(C=O)OR’；-O(C=O)R’；-C(=O)R’；-OR’；-S(O) _xR’；-S-SR’；       -C(=O)SR’；-SC(=O)R’；-NR’R’；-NR’C(=O)R’；      -C(=O)NR’R’；-NR’C(=O)NR’R’；-OC(=O)NR’R’；     -NR’C(=O)OR’；-NR’S(O) _xNR’R’；-NR’S(O) _xR’；以及   -S(O) _xNR’R’，其中：R’在每次出現時獨立地是H、C ₁-C ₁₅烷基或環烷基，並且x是0、1或2。在一些實施方案中，取代基是C ₁-C ₁₂烷基。在其它實施方案中，取代基是環烷基。在其它實施方案中，取代基是鹵基，諸如氟基。在其它實施方案中，取代基是氧代基。在其它實施方案中，取代基是羥基。在其它實施方案中，取代基是烷氧基(-OR’)。在其它實施方案中，取代基是羧基。在其它實施方案中，取代基是氨基(-NR’R’)。 如本文所用並且除非另有說明，否則術語“任選存在的”或“任選地”(例如任選地經取代)意指隨後描述的事件或情況可能會發生或可能不會發生，並且該描述包括所述事件或情況發生的情況和其不發生的情況。舉例來說，“任選地經取代的烷基”意指烷基可經取代或可不經取代，並且該描述包括經取代的烷基和不具有取代的烷基二者。 如本文所用並且除非另有說明，否則術語生物活性化合物的“前藥”是指可在生理條件下或通過溶劑分解而轉化為生物活性化合物的化合物。在一個實施方案中，術語“前藥”是指生物活性化合物的藥學上可接受的代謝前體。前藥在施用至有需要的受試者時可為無活性的，但在體內轉化為生物活性化合物。前藥通常在體內迅速轉型以產生母體生物活性化合物，例如通過在血液中水解而轉型。前藥化合物在哺乳動物生物體中通常提供溶解性、組織相容性或延遲釋放的優點(參見Bundgard, H., Design of Prodrugs (1985)，第7-9頁，第21-24頁(Elsevier, Amsterdam))。關於前藥的論述提供於Higuchi, T.等人，A.C.S. Symposium Series，第14卷；以及Bioreversible Carriers in Drug Design, Edward B. Roche編輯，American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987中。 在一個實施方案中，術語“前藥”還意圖包括任何共價鍵結的載體，當將此類前藥施用哺乳動物受試者時，其在體內釋放活性化合物。化合物的前藥可通過修飾化合物中存在的官能團來製備，其方式是使得修飾可在常規操作中或在體內裂解而得到母體化合物。前藥包括羥基、氨基或巰基鍵結至任何基團的化合物，當將化合物的前藥施用哺乳動物受試者時，所述基團裂解而分別形成游離羥基、游離氨基或游離巰基。 前藥的實例包括但不限於本文所提供化合物中的醇官能團的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物或胺官能團的醯胺衍生物。 如本文所用並且除非另有說明，否則術語“藥學上可接受的鹽”包括酸加成鹽和鹼加成鹽二者。 藥學上可接受的酸加成鹽的實例包括但不限於鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；以及有機酸，諸如但不限於乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、褐藻酸、抗壞血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙醯胺基苯甲酸、樟腦酸、樟腦-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、檸檬酸、環拉酸(cyclamic acid)、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙烷磺酸、2-羥基乙烷磺酸、甲酸、延胡索酸、半乳糖二酸、龍膽酸、葡庚糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、馬尿酸、異丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、馬來酸、蘋果酸、丙二酸、扁桃酸、甲烷磺酸、黏液酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羥基-2-萘甲酸、煙酸、油酸、乳清酸、草酸、棕櫚酸、帕莫酸(pamoic acid)、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水楊酸、4-氨基水楊酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、對甲苯磺酸、三氟乙酸、十一碳烯酸等。 藥學上可接受的鹼加成鹽的實例包括但不限於通過將無機鹼或有機鹼添加至游離酸化合物而製備的鹽。衍生自無機鹼的鹽包括但不限於鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、錳鹽、鋁鹽等。在一個實施方案中，無機鹽是銨鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽和鎂鹽。衍生自有機鹼的鹽包括但不限於以下的鹽：伯胺、仲胺和叔胺；經取代胺，包括天然存在的經取代胺；環胺和鹼性離子交換樹脂，諸如氨、異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇(deanol)、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二環己胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、咖啡因、普魯卡因(procaine)、哈胺(hydrabamine)、膽鹼、甜菜鹼、苯乙苄胺(benethamine)、苄星(benzathine)、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可哥鹼(theobromine)、三乙醇胺、氨基丁三醇、嘌呤、呱嗪、呱啶、N-乙基呱啶、聚胺樹脂等。在一個實施方案中，有機鹼是異丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二環己胺、膽鹼和咖啡因。 本文所提供的化合物可含有一個或多個不對稱中心，因此可產生對映異構體、非對映異構體和其它立體異構形式，所述形式可根據絕對立體化學定義為(R)-或(S)-或對於氨基酸可定義為(D)-或(L)-。除非另有說明，否則本文所提供的化合物意圖包括所有此類可能的異構體，以及它們的外消旋和光學純形式。光學活性(+)與(-)、(R)-與(S)-或(D)-與(L)-異構體可使用手性合成子或手性試劑製備，或使用常規技術，例如色譜法和分步結晶法拆分。用於製備/分離個別對映異構體的常規技術包括從適合的光學純前體手性合成或使用例如手性高壓液相色譜法(HPLC)拆分外消旋物(或鹽或衍生物的外消旋物)。當本文所述化合物含有烯屬雙鍵或其它幾何不對稱中心時，除非另有說明，否則所述化合物意圖包括E和Z幾何異構體。同樣，還意圖包括所有互變異構形式。 如本文所用並且除非另有說明，否則術語“異構體”是指具有相同分子式的不同化合物。“立體異構體”是僅原子在空間中的排列方式不同的異構體。“阻轉異構體”是由圍繞單鍵的受阻旋轉得到的立體異構體。“對映異構體”是一對互為不可重疊的鏡像的立體異構體。一對對映異構體的任何比例的混合物可稱為“外消旋”混合物。“非對映異構體”是具有至少兩個不對稱原子但不互為鏡像的立體異構體。 “立體異構體”還可包括E和Z異構體或其混合物，以及順式和反式異構體或其混合物。在某些實施方案中，本文所述的化合物經分離為E或Z異構體。在其它實施方案中，本文所述的化合物是E和Z異構體的混合物。 “互變異構體”是指化合物的彼此平衡的異構形式。異構形式的濃度將取決於化合物所處的環境，並且可根據例如化合物是固體還是在有機溶液或水溶液中而有所不同。 還應注意，本文所述的化合物可在一個或多個原子處含有非天然比例的原子同位素。舉例來說，化合物可用放射性同位素，諸如氚( ³H)、碘-125 ( ¹²⁵I)、硫-35 ( ³⁵S)或碳-14 ( ¹⁴C)進行放射性標記，或者可為同位素富集的，諸如氘( ²H)、碳-13 ( ¹³C)或氮-15 ( ¹⁵N)。如本文所用，“同位素體”是同位素富集的化合物。術語“同位素富集”是指原子的同位素組成不同於該原子的天然同位素組成。“同位素富集”還可指化合物含有的至少一個原子的同位素組成不同於該原子的天然同位素組成。術語“同位素組成”是指給定原子存在的每種同位素的量。經放射性標記和同位素富集的化合物可用作治療劑，例如癌症治療劑；研究試劑，例如結合分析試劑；以及診斷劑，例如體內成像劑。本文所述化合物的所有同位素變化形式，無論是否具有放射性，都意圖涵蓋在本文所提供的實施方案的範圍內。在一些實施方案中，提供本文所述化合物的同位素體，例如同位素體是氘、碳-13和/或氮-15富集的。如本文所用，“氘代”是指化合物中的至少一個氫(H)已經氘(以D或 ²H表示)置換，即，化合物在至少一個位置處富含氘。 應注意，如果所描繪的結構與該結構的名稱之間存在差異，則應以所描繪的結構為準。 如本文所用並且除非另有說明，否則術語“藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑”包括但不限於被美國食品與藥物管理局(United States Food and Drug Administration)批准可接受用於人類或家畜的任何佐劑、載體、賦形劑、助流劑、甜味劑、稀釋劑、防腐劑、染料/著色劑、風味增強劑、表面活性劑、潤濕劑、分散劑、助懸劑、穩定劑、等滲劑、溶劑或乳化劑。 術語“組合物”意圖涵蓋含有任選地選用的指定量的指定成分(例如本文所提供的mRNA分子)的產品。 如本文可互換使用，術語“聚核苷酸”或“核酸”是指任何長度的核苷酸聚合物，並且包括例如DNA和RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾的核苷酸或鹼基和/或其類似物，或可通過DNA或RNA聚合酶或通過合成反應併入聚合物中的任何底物。聚核苷酸可包含經修飾的核苷酸，諸如甲基化核苷酸和其類似物。核酸可為單鏈或雙鏈形式。如本文所用並且除非另有說明，否則“核酸”還包括核酸模擬物，諸如鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和嗎啉核酸。如本文所用，“寡核苷酸”是指短的合成聚核苷酸，其長度一般但未必少於約200個核苷酸。術語“寡核苷酸”與“聚核苷酸”不是互相排斥的。以上關於聚核苷酸的描述同樣完全適用於寡核苷酸。除非另有說明，否則本文所公開的任何單鏈聚核苷酸序列的左手端為5’端；雙鏈聚核苷酸序列的左手方向稱為5’方向。新生RNA轉錄物的5’至3’添加方向稱為轉錄方向；DNA鏈上具有與RNA轉錄物相同的序列並且相對於RNA轉錄物的5’端而位於5’處的序列區域稱為“上游序列”；DNA鏈上具有與RNA轉錄物相同的序列並且相對於RNA轉錄物的3’端而位於3’處的序列區域稱為“下游序列”。 如本文所用，術語“非天然存在的”當參考如本文所述的核酸分子使用時意圖指所述核酸分子在自然界中不存在。編碼病毒肽或蛋白質的非天然存在的核酸含有至少一種通常不存在於病毒的天然存在的毒株(包括病毒的野生型毒株)中的遺傳改變或化學修飾。遺傳改變包括例如引入編碼病毒的異源肽或多肽的可表達核酸序列的修飾、其它核酸添加、核酸缺失、核酸取代和/或對病毒的遺傳物質的其它功能破壞。此類修飾包括例如對病毒物種的異源、同源、或異源和同源多肽的編碼區和其功能片段的修飾。額外修飾包括例如對非編碼調節區的修飾，其中所述修飾改變基因或操縱子的表達。額外修飾還包括例如將核酸序列併入諸如質粒或人工染色體的載體中。化學修飾包括例如一種或多種如本文所述的功能性核苷酸類似物。 “分離的核酸”是指與天然地伴隨原生序列的其它基因組DNA序列以及蛋白質或複合物(諸如核糖體和聚合酶)基本上分離的核酸，例如RNA、DNA或混合核酸。“分離”的核酸分子是與存在於核酸分子的天然來源中的其它核酸分子分離的核酸分子。此外，當通過重組技術製造時，“分離”的核酸分子，諸如mRNA分子，可基本上不含其它細胞材料或培養基，或者當化學合成時，其可基本上不含化學前體或其它化學品。在具體實施方案中，本文所述的編碼抗原的一種或多種核酸分子是分離或純化的。該術語包括已從其天然存在的環境移出的核酸序列，並且包括重組或克隆的DNA或RNA分離物以及化學合成的類似物或由異源系統生物合成的類似物。基本上純的分子可包括分子的分離形式。 術語“編碼核酸”或其語法等效物當用於指核酸分子時包括：(a)處於原生狀態或通過本領域技術人員熟知的方法操作時可轉錄產生mRNA並且接著翻譯成肽和/或多肽的核酸分子；以及(b) mRNA分子本身。反義鏈是此類核酸分子的互補序列，並且可由其推斷出編碼序列。術語“編碼區”是指編碼核酸序列中翻譯成肽或多肽的部分。術語“非翻譯區”或“UTR”是指編碼核酸中不翻譯成肽或多肽的部分。取決於UTR相對於核酸分子的編碼區的取向，UTR如果位於編碼區5’端，則稱為5’-UTR，並且UTR如果位於編碼區3’端，則稱為3’-UTR。 如本文所用，術語“mRNA”是指包含一個或多個開放閱讀框(ORF)的信使RNA分子，其可經具有該mRNA的細胞或生物體翻譯以產生一種或多種肽或蛋白質產物。含有一個或多個ORF的區域稱為mRNA分子的編碼區。在某些實施方案中，mRNA分子還包含一個或多個非翻譯區(UTR)。 在某些實施方案中，mRNA是僅包含一個ORF的單順反子mRNA。在某些實施方案中，單順反子mRNA編碼包含選定抗原(例如致病性抗原或腫瘤相關抗原)的至少一個表位的肽或蛋白質。在其它實施方案中，mRNA是包含兩個或更多個ORF的多順反子mRNA。在某些實施方案中，多順反子mRNA編碼可彼此相同或不同的兩種或更多種肽或蛋白質。在某些實施方案中，由多順反子mRNA編碼的每種肽或蛋白質包含選定抗原的至少一個表位。在某些實施方案中，由多順反子mRNA編碼的不同肽或蛋白質各自包含不同抗原的至少一個表位。在本文所述任一實施方案中，所述至少一個表位可為抗原的至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或至少10個表位。 術語“核鹼基”涵蓋嘌呤和嘧啶，包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷以及其天然或合成類似物或衍生物。 如本文所用，術語“功能性核苷酸類似物”是指經典核苷酸A、G、C、U或T的經修飾型式，所述型式(a)保留對應經典核苷酸的鹼基配對特性，並且(b)含有至少一種對對應天然核苷酸的(i)核鹼基、(ii)糖基、(iii)磷酸酯基或(iv) (i)至(iii)的任何組合的化學修飾。如本文所用，鹼基配對不僅涵蓋經典沃森-克裡克(Watson-Crick)腺嘌呤-胸腺嘧啶、腺嘌呤-尿嘧啶或鳥嘌呤-胞嘧啶鹼基對，而且還涵蓋在經典核苷酸與功能性核苷酸類似物之間或在一對功能性核苷酸類似物之間形成的鹼基對，其中氫鍵供體與氫鍵受體的佈置允許在經修飾的核鹼基與經典核鹼基之間或在兩個互補的經修飾核鹼基結構之間形成氫鍵。舉例來說，鳥苷(G)的功能性類似物保留與胞嘧啶(C)或胞嘧啶的功能性類似物鹼基配對的能力。此類非經典鹼基配對的一個實例是經修飾核苷酸肌苷與腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之間的鹼基配對。如本文所述，功能性核苷酸類似物可為天然存在或非天然存在的。因此，含有功能性核苷酸類似物的核酸分子可具有至少一個經修飾的核鹼基、糖基和/或核苷間鍵聯。本文提供對核酸分子的核鹼基、糖基或核苷間鍵聯的示例性化學修飾。 如本文所用，術語“翻譯增強子元件”、“TEE”和“翻譯增強子”是指核酸分子中用於促進核酸的編碼序列翻譯成蛋白質或肽產物，諸如通過帽依賴性或非帽依賴性翻譯而翻譯成蛋白質或肽產物的區域。TEE通常位於核酸分子(例如mRNA)的UTR區，並且增強位於上游或下游的編碼序列的翻譯水準。舉例來說，核酸分子的5’-UTR中的TEE可位於核酸分子的啟動子與起始密碼子之間。各種TEE序列為此項技術中已知的(Wellensiek等人，Genome-wide profiling of human cap-independent translation-enhancing elements, Nature Methods, 2013年8月; 10(8): 747-750；Chappell等人，PNAS，2004年6月29日，101 (26) 9590-9594)。已知一些TEE在多個物種之間保守(Pánek等人，Nucleic Acids Research ，第41卷，第16期，2013年9月1日，第7625-7634頁)。 如本文所用，術語“莖-環序列”是指具有至少兩個區域的單鏈聚核苷酸序列，當以相反方向閱讀時，所述兩個區域彼此互補或基本上互補，並且因此能夠彼此鹼基配對形成至少一個雙螺旋和未配對的環。所得到的結構稱為莖-環結構、髮夾或髮夾環，其為在許多RNA分子中發現的二級結構。 如本文所用，術語“肽”是指含有二至五十(2-50)個經一個或多個共價肽鍵連接的氨基酸殘基的聚合物。該術語適用於天然存在的氨基酸聚合物以及一個或多個氨基酸殘基是非天然存在的氨基酸(例如氨基酸類似物或非天然氨基酸)的氨基酸聚合物。 術語“多肽”與“蛋白質”在本文中可互換使用，指具有超過五十(50)個由共價肽鍵連接的氨基酸殘基的聚合物。即，針對多肽的描述同樣適用於針對蛋白質的描述，反之亦然。該術語適用於天然存在的氨基酸聚合物以及一個或多個氨基酸殘基是非天然存在的氨基酸(例如氨基酸類似物)的氨基酸聚合物。如本文所用，該術語涵蓋任何長度的氨基酸鏈，包括全長蛋白質(例如抗原)。 在肽或多肽的情況下，如本文所用，術語“衍生物”是指包含病毒肽或蛋白質的氨基酸序列或病毒肽或蛋白質的片段的肽或多肽，其已通過引入氨基酸殘基取代、缺失或添加而發生改變。如本文所用，術語“衍生物”還指病毒肽或蛋白質，或者病毒肽或蛋白質的片段，其已例如通過使任何類型的分子共價連接至多肽而經化學修飾。例如但非限制，病毒肽或蛋白質或者病毒肽或蛋白質的片段可例如通過糖基化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、通過已知保護基/阻斷基衍生化、蛋白水解裂解、化學裂解、配製、衣黴素代謝合成、與細胞配體或其它蛋白質連接等而經化學修飾。衍生物以在所連接分子的類型或位置方面不同於天然存在或起始肽或多肽的方式經修飾。衍生物還包括一個或多個天然存在於病毒肽或蛋白質上的化學基團的缺失。此外，病毒肽或蛋白質或者病毒肽或蛋白質的片段的衍生物可含有一種或多種非經典氨基酸。在具體實施方案中，衍生物是衍生出所述衍生物的原生或未經修飾的肽或多肽的功能衍生物。 術語“功能衍生物”是指保留衍生出所述衍生物的天然存在或起始肽或多肽的一種或多種功能或活性的衍生物。例如，RV G蛋白的功能衍生物可保留結合宿主細胞上的一種或多種其受體的能力。 術語“同一性”是指兩個或更多個多肽分子或兩個或更多個核酸分子的序列之間的關係，如通過比對和比較序列所確定。相對於參考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(%)”定義為在比對序列並且必要時為了實現最大序列同一性百分比而引入間隙之後，候選序列中與參考多肽序列中的氨基酸殘基一致的氨基酸殘基的百分比，並且不考慮將任何保守取代視為序列同一性的一部分。出於確定氨基酸序列同一性百分比的目的而進行的比對可以本領域技術內的多種方式，例如使用公開可得的電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN (DNAStar, Inc.)軟體來實現。本領域技術人員可確定用於比對序列的適當參數，包括在所比較的序列的全長內實現最大比對所需的任何演算法。 對氨基酸殘基/位置的“修飾”是指如與起始氨基酸序列相比一級氨基酸序列的變化，其中該變化是由涉及所述氨基酸殘基/位置的序列改變引起的。例如，典型修飾包括用另一氨基酸取代殘基(例如，保守或非保守取代)、緊鄰所述殘基/位置插入一個或多個(例如，通常少於5、4或3個)氨基酸和/或缺失所述殘基/位置。 在肽或多肽的情況下，如本文所用，術語“片段”是指包含少於全長的氨基酸序列的肽或多肽。此類片段可例如來自於氨基末端的截短、羧基末端的截短和/或氨基酸序列中殘基的內部缺失。片段可例如由選擇性RNA剪接或由體內蛋白酶活性產生。在某些實施方案中，片段是指包含多肽的氨基酸序列的至少5個連續氨基酸殘基、至少10個連續氨基酸殘基、至少15個連續氨基酸殘基、至少20個連續氨基酸殘基、至少25個連續氨基酸殘基、至少30個連續氨基酸殘基、至少40個連續氨基酸殘基、至少50個連續氨基酸殘基、至少60個連續氨基酸殘基、至少70個連續氨基酸殘基、至少80個連續氨基酸殘基、至少90個連續氨基酸殘基、至少100個連續氨基酸殘基、至少125個連續氨基酸殘基、至少150個連續氨基酸殘基、至少175個連續氨基酸殘基、至少200個連續氨基酸殘基、至少250個、至少300個、至少350個、至少400個、至少450個、至少500個、至少550個、至少600個、至少650個、至少700個、至少750個、至少800個、至少850個、至少900個或至少950個連續氨基酸殘基的氨基酸序列的多肽。在具體實施方案中，多肽的片段保留多肽的至少1種、至少2種、至少3種或更多種功能。 如本文在肽或多肽(例如，蛋白質)的上下文中所使用的，術語“免疫原性片段”是指肽或多肽的片段，其保留肽或多肽在與哺乳動物免疫系統接觸時引發免疫反應(包括先天性免疫反應和/或適應性免疫反應)的能力。在一些實施方案中，肽或多肽的免疫原性片段可以是表位。 術語“抗原”是指能夠被受試者的免疫系統(包括適應性免疫系統)識別並且能夠在使受試者與抗原接觸後觸發免疫反應(包括抗原特異性免疫反應)的物質。在某些實施方案中，抗原是與患病細胞(諸如被病原體感染的細胞)或贅生性細胞相關的蛋白質(例如，腫瘤相關抗原(TAA))。 “表位”是抗原分子表面上的與單個抗體分子結合的位點，諸如抗原表面上能夠與抗體的一個或多個抗原結合區結合並且在動物，諸如哺乳動物(例如人類)中具有能夠引發免疫反應的抗原性或免疫原性活性的局部區域。具有免疫原性活性的表位是在動物中引發抗體反應的多肽的一部分。具有抗原活性的表位是抗體所結合的多肽的一部分，如通過本領域中熟知的任何方法(包括例如通過免疫分析)所測定。抗原表位不一定是免疫原性的。表位元通常由分子的化學活性表面基團諸如氨基酸或糖側鏈組成，並且具有特定的三維結構特徵以及特定的電荷特徵。抗體表位元可以是線性表位元或構象表位。線性表位元由蛋白質中連續的氨基酸序列形成。構象表位由在蛋白質序列中是不連續的，但在蛋白質折疊成其三維結構時聚集在一起的氨基酸形成。當蛋白質的三維結構處於改變的構象時，諸如在活化或結合另一種蛋白質或配體後，形成誘導的表位。在某些實施方案中，表位是多肽的三維表面特徵。在其它實施方案中，表位元是多肽的線性特徵。通常，抗原具有若干或許多不同的表位，並且可與許多不同的抗體反應。 術語“異源的”是指在自然界中未發現與天然存在的RV相關(例如由其基因組編碼和/或表達)的實體。術語“同源的”是指在自然界中發現與天然存在的RV相關(例如由其基因組編碼和/或表達)的實體。 如本文所用，術語“基因疫苗”是指包含至少一種核酸分子的治療性或預防性組合物，所述至少一種核酸分子編碼與標靶疾病(例如感染性疾病或贅生性疾病)相關的抗原。向受試者施用疫苗(“疫苗接種”)允許產生編碼的肽或蛋白質，由此在受試者體內引發針對標靶疾病的免疫反應。在某些實施方案中，免疫反應包括適應性免疫反應，諸如產生針對編碼的抗原的抗體，和/或能夠特異性消除表達該抗原的患病細胞的免疫細胞的活化和增殖。在某些實施方案中，免疫反應還包括先天性免疫反應。根據本公開，疫苗可在標靶疾病的臨床症狀發作之前或之後施用受試者。在一些實施方案中，對健康或無症狀受試者進行疫苗接種使經疫苗接種的受試者對標靶疾病的發展具有免疫性或不太敏感。在一些實施方案中，對顯示疾病症狀的受試者進行疫苗接種改善經疫苗接種的受試者的疾病狀況或治療疾病。 術語“載體”是指用於攜帶或包含核酸序列的物質，包括例如編碼本文所述的病毒肽或蛋白質的核酸序列，以便將核酸序列引入宿主細胞中，或用作轉錄範本以在無細胞系統中進行體外轉錄反應以產生mRNA。適用於使用的載體包括例如表達載體、質粒、噬菌體載體、病毒載體、附加體和人工染色體，其可包括可操作用於穩定整合到宿主細胞的染色體中的選擇序列或標記。另外，載體可包括一種或多種選擇性標記基因和適當的轉錄或翻譯控制序列。例如，可包括的選擇性標記基因提供對抗生素或毒素的抗性、補充營養缺陷型缺乏或提供不在培養基中的關鍵營養物。轉錄或翻譯控制序列可包括本領域中熟知的組成型和誘導型啟動子、轉錄增強子、轉錄終止子等。當兩個或更多個核酸分子(例如，編碼兩種或更多種不同病毒肽或蛋白質的核酸分子)被共轉錄或共翻譯時，兩個核酸分子可被插入例如同一表達載體中或單獨的表達載體中。對於單一載體轉錄和/或翻譯，可將編碼核酸可操作地連接至一個共同的轉錄或翻譯控制序列，或連接至不同的轉錄或翻譯控制序列，諸如一種誘導型啟動子和一種組成型啟動子。可使用本領域中熟知的方法確認核酸分子引入宿主細胞中。此類方法包括例如核酸分析，諸如RNA印跡(Northern blot)或mRNA的聚合酶鏈反應(PCR)擴增；用於基因產物的表達的免疫印跡；或測試所引入核酸序列或其對應基因產物的表達的其它合適的分析方法。本領域技術人員應理解，核酸分子以足夠的量表達以產生所需產物(例如，如本文所述的核酸的mRNA轉錄物)，並且應進一步理解，可以使用本領域中熟知的方法優化表達水準以獲得足夠的表達。 術語“先天性免疫反應”和“先天性免疫”是此項技術中公認的，並且是指身體的免疫系統在識別出病原體相關分子模式時啟動的非特異性防禦機制，其涉及不同形式的細胞活動，包括通過各種路徑的細胞因數產生和細胞死亡。如本文所用，先天性免疫反應包括但不限於炎症細胞因數的產生(例如I型干擾素或IL-10產生)增加；NFκB路徑的活化；免疫細胞的增殖、成熟、分化和/或存活增加，以及在一些情況下細胞凋亡的誘導。先天性免疫的活化可使用此項技術中已知的方法檢測，諸如測量(NF)-κB活化情況。 術語“適應性免疫反應”和“適應性免疫”是此項技術中公認的，並且是指身體的免疫系統在識別出特定抗原時啟動的抗原特異性防禦機制，包括體液反應和細胞介導的反應。如本文所用，適應性免疫反應包括由疫苗組合物，諸如本文所述的遺傳組合物觸發和/或增強的細胞反應。在一些實施方案中，疫苗組合物包含作為抗原特異性適應性免疫反應的標靶的抗原。在其它實施方案中，疫苗組合物在施用後允許在經免疫的受試者中產生抗原，所述抗原是抗原特異性適應性免疫反應的標靶。適應性免疫反應的活化可使用此項技術中已知的方法檢測，諸如測量抗原特異性抗體的產生或抗原特異性細胞介導的細胞毒性的水準。 “抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”或“ADCC”是指細胞毒性的一種形式，其中結合至存在於某些細胞毒性細胞(例如，天然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)上的Fc受體(FcR)上的分泌的免疫球蛋白使得這些細胞毒性效應細胞能夠特異性地結合至帶有抗原的標靶細胞並且隨後用細胞毒素殺傷標靶細胞。抗體“武裝”細胞毒性細胞並且絕對是這種殺傷所需要的。NK細胞(用於介導ADCC的主要細胞)僅表達FcγRIII，而單核細胞表達FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血細胞上的FcR表達是已知的(參見例如Ravetch和Kinet, 1991, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92)。為評估目標分子的ADCC活性，可進行體外ADCC分析(參見例如美國專利號5,500,362和5,821,337)。用於此類分析的有用效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞。或者或另外，目標分子的ADCC活性可例如在動物模型中進行體內評估(參見例如Clynes等人，1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-56)。可選擇具有很少或沒有ADCC活性的抗體用於使用。 “抗體依賴性細胞吞噬作用”或“ADCP”是指當免疫球蛋白結合至某些吞噬細胞(例如，嗜中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞)上存在的Fc受體(FcR)使得這些吞噬細胞能夠特異性地結合至攜帶抗原的標靶細胞並且隨後殺傷標靶細胞時，經由單核細胞或巨噬細胞介導的吞噬作用破壞標靶細胞。為了評估目標分子的ADCP活性，可進行體外ADCP分析(參見例如Bracher等人，2007, J. Immunol. Methods 323:160-71)。用於此類分析的有用的吞噬細胞包括外周血單核細胞(PBMC)、來自PBMC的純化的單核細胞或分化成單核類型的U937細胞。或者或另外，目標分子的ADCP活性可例如在動物模型中進行體內評估(參見例如Wallace等人，2001, J. Immunol. Methods 248:167-82)。可選擇具有很少或沒有ADCP活性的抗體用於使用。 “Fc受體”或“FcR”描述結合至抗體的Fc區的受體。示例性FcR是天然序列人FcR。此外，示例性FcR是結合IgG抗體的受體(例如，γ受體)，並且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體和選擇性剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA (“活化受體”)和FcγRIIB (“抑制受體”)，所述受體具有主要在其細胞質結構域方面不同的類似氨基酸序列(參見例如Daëron, 1997, Annu. Rev. Immunol. 15:203-34)。各種FcR是已知的(參見例如Ravetch和Kinet, 1991, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92；Capel等人，1994, Immunomethods 4:25-34；和de Haas等人，1995, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41)。本文的術語“FcR”涵蓋其它FcR，包括有待在將來鑒別的那些FcR。該術語還包括新生兒受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒(參見例如Guyer等人，1976, J. Immunol.117:587-93；和Kim等人，1994, Eu. J. Immunol. 24:2429-34)。已經描述了具有改善的或降低的與FcR的結合的抗體變體(參見例如WO 2000/42072；美國專利號7,183,387；7,332,581；以及7,335,742；Shields等人，2001, J. Biol. Chem. 9(2):6591-604)。 “補體依賴性細胞毒性”或“CDC”是指在補體存在下標靶細胞的溶解。經典補體途徑的活化通過補體系統的第一組分(C1q)結合至與其同源抗原結合的(具有適當亞類的)抗體而起始。為了評估補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人，1996, J. Immunol. Methods 202:163)。已經描述了具有改變的Fc區氨基酸序列(具有變體Fc區的多肽)和增加或降低的C1q結合能力的多肽變體(參見例如美國專利號6,194,551；WO 1999/51642；Idusogie等人，2000, J. Immunol. 164: 4178-84)。可選擇具有很少或沒有CDC活性的抗體用於使用。 術語“抗體”意圖包括免疫球蛋白類別的多肽內的B細胞的多肽產物，所述多肽產物能夠結合至特定分子抗原並且由兩對相同的多肽鏈組成，其中每對具有一條重鏈(約50-70 kDa)和一條輕鏈(約25 kDa)，每條鏈的每個氨基末端部分包含約100至約130個或更多個氨基酸的可變區，並且每條鏈的每個羧基末端部分包含恒定區。參見例如 Antibody Engineering(Borrebaeck編輯，第2版，1995)；以及Kuby, Immunology(第3版，1997)。在具體實施方案中，特定分子抗原可被本文提供的抗體結合，包括多肽、其片段或表位。抗體還包括但不限於合成抗體、重組產生的抗體、駱駝化抗體、胞內抗體、抗獨特型(抗Id)抗體以及上述任一者的功能片段，所述功能片段是指抗體重鏈或輕鏈多肽的保留所述片段所來源的抗體的一些或全部結合活性的一部分。功能片段的非限制性實例包括單鏈Fv (scFv) (例如，包括單特異性、雙特異性等)、Fab片段、F(ab’)片段、F(ab) ₂片段、F(ab’) ₂片段、二硫鍵連接的Fv (dsFv)、Fd片段、Fv片段、雙抗體、三抗體、四抗體和微型抗體。特別地，本文提供的抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如抗原結合結構域或含有抗原結合位點的分子(例如，抗體的一個或多個CDR)。此類抗體片段可在例如Harlow和Lane, Antibodies: A Laboratory Manual(1989); Mol. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference(Myers編輯，1995)；Huston等人，1993, Cell Biophysics 22:189-224；Plückthun和Skerra, 1989, Meth. Enzymol. 178:497-515；以及Day, Advanced Immunochemistry(第2版，1990)中找到。本文提供的抗體可具有免疫球蛋白分子的任何類別(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或任何亞類(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。 術語“施用(administer/administration)”是指將存在於體外的物質(例如本文所述的脂質納米顆粒組合物)注射或以其它方式物理遞送至患者體內的操作，諸如經黏膜、真皮內、靜脈內、肌內遞送和/或本文所述或此項技術中已知的任何其它物理遞送方法遞送。當治療疾病、病症、疾患或其症狀時，通常在疾病、病症、疾患或其症狀發作之後進行物質的施用。當預防疾病、病症、疾患或其症狀時，通常在疾病、病症、疾患或其症狀發作之前進行物質的施用。 “長期”施用與急性模式相對，是指以連續模式施用一種或多種劑(例如持續一段時間，諸如數天、數周、數月或數年)，由此在較長一段時間內維持初始治療效應(活性)。“間歇性”施用是指治療不是不間斷地連續進行，而是本質上週期性的。 如本文所用，術語“靶向遞送”或動詞形式“靶向”是指相較於遞送至任何其它器官、組織、細胞或細胞內隔室(稱為非標靶位置)，促進所遞送的劑(諸如本文所述的脂質納米顆粒組合物中的治療性有效負載分子)到達特定器官、組織、細胞和/或細胞內隔室(稱為標靶位置)的過程。靶向遞送可使用此項技術中已知的方法檢測，例如通過在全身施用後將所遞送的劑在標靶細胞群體中的濃度與所遞送的劑在非標靶細胞群體處的濃度相比較來檢測。在某些實施方案中，靶向遞送使得標靶位置處的濃度為非標靶位置處的濃度的至少2倍高。 “有效量”一般是足以降低症狀的嚴重程度和/或頻率；消除症狀和/或潛在原因；防止症狀和/或其潛在原因的發生；和/或改善或補救由疾病、病症或疾患，包括例如由感染和贅瘤形成引起或與之相關的損害的量。在一些實施方案中，有效量是治療有效量或預防有效量。 如本文所用，術語“治療有效量”是指足以減少和/或改善給定疾病、病症或疾患，和/或其相關症狀(例如感染性疾病，諸如由病毒感染引起的感染性疾病，或贅生性疾病，諸如癌症)的嚴重程度和/或持續時間的劑(例如疫苗組合物)的量。本公開的物質/分子/劑(例如本文所述的脂質納米顆粒組合物)的“治療有效量”可根據諸多因素而變化，諸如個體的疾病狀態、年齡、性別和體重，以及物質/分子/劑在個體體內引發所需反應的能力。治療有效量包含物質/分子/劑的治療有益效應勝過其任何有毒或有害效應的量。在某些實施方案中，術語“治療有效量”是指有效“治療”受試者或哺乳動物的疾病、病症或疾患的如本文所述的脂質納米顆粒組合物或者其中所含治療劑或預防劑(例如治療性mRNA)的量。 “預防有效量”是當施用受試者時將具有預期預防效應，例如預防疾病、病症、疾患或相關症狀(例如感染性疾病，諸如由病毒感染引起的感染性疾病，或贅生性疾病，諸如癌症)、延遲其發作(或復發)或降低其發作(或復發)可能性的藥物組合物的量。通常但不是必須地，由於預防劑量是在疾病、病症或疾患之前或其早期階段用於受試者，因此預防有效量可能小於治療有效量。完全的治療或預防效應未必通過施用一次劑量而發生，而可能僅在施用一系列劑量後才發生。因此，治療或預防有效量可分一次或多次施用來施用。 術語“預防(prevent/preventing/prevention)”是指降低疾病、病症、疾患或相關症狀(例如感染性疾病，諸如由病毒感染引起的感染性疾病，或贅生性疾病，諸如癌症)發作(或復發)的可能性。 術語“控制(manage/managing/management)”是指受試者從療法(例如預防劑或治療劑)獲得的有益效應，其不會引起疾病的治癒。在某些實施方案中，向受試者施用一種或多種療法(例如預防劑或治療劑，諸如本文所述的脂質納米顆粒組合物)以“控制”感染性或贅生性疾病、其一種或多種症狀，由此預防疾病的進展或惡化。 術語“預防劑”是指可以完全或部分地抑制受試者的疾病和/或其相關症狀的發展、復發、發作或擴散的任何劑。 術語“治療劑”是指可用於治療、預防或緩解疾病、病症或疾患，包括用於治療、預防或緩解疾病、病症或疾患和/或其相關症狀的一種或多種症狀的任何劑。 術語“療法”是指可用於預防、控制、治療和/或改善疾病、病症或疾患的任何方案、方法和/或劑。在某些實施方案中，術語“療法(therapies/therapy)”是指本領域技術人員，諸如醫務人員已知可用於預防、控制、治療和/或改善疾病、病症或疾患的生物療法、支持療法和/或其它療法。 如本文所用，“預防有效血清滴度”是受試者(例如人類)體內完全或部分地抑制受試者的疾病、病症或疾患，和/或其相關症狀的發展、復發、發作或擴散的抗體的血清滴度。 在某些實施方案中，“治療有效血清滴度”是受試者(例如人類)體內降低受試者的與疾病、病症或疾患相關的嚴重程度、持續時間和/或症狀的抗體的血清滴度。 術語“血清滴度”是指一名受試者中來自多個樣品(例如在多個時間點)或在至少10名、至少20名、至少40名至多達約100名、1000名或更多受試者的群體中的平均血清滴度。 術語“副作用”涵蓋療法(例如預防劑或治療劑)的不想要的作用和/或不良作用。不想要的作用未必為不良作用。療法(例如預防劑或治療劑)的不良作用可能為有害的、令人不適的或有風險的。副作用的實例包括腹瀉、咳嗽、胃腸炎、喘鳴、噁心、嘔吐、厭食、腹部絞痛、發燒、疼痛、體重減輕、脫水、脫髮、呼吸困難、失眠、頭暈、黏膜炎、神經和肌肉影響、疲勞、口乾、食欲不振、施用部位出現皮疹或腫脹、諸如發燒、發冷和疲勞之類的流感樣症狀、消化道問題和過敏反應。患者經歷的其它不期望的作用眾多並且為此項技術中所知的。有許多作用描述於 Physician’s Desk Reference(第68版，2014)中。 術語“受試者”與“患者”可互換使用。如本文所用，在某些實施方案中，受試者是哺乳動物，諸如非靈長類動物(例如牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等)或靈長類動物(例如猴和人類)。在具體實施方案中，受試者是人類。在一個實施方案中，受試者是患有感染性疾病或贅生性疾病的哺乳動物(例如人類)。在另一實施方案中，受試者是有患上感染性疾病或贅生性疾病的風險的哺乳動物(例如人類)。 術語“老年人”是指65歲以上的人。術語“人類成人”是指18歲以上的人。術語“人類兒童”是指1歲至18歲的人。術語“人類幼兒”是指1歲至3歲的人。術語“人類嬰兒”是指新生兒至1歲的人。 術語“可檢測探針”是指提供可檢測信號的組合物。該術語包括但不限於通過活性提供可檢測信號的任何螢光團、生色團、放射性標記、酶、抗體或抗體片段等。 術語“可檢測劑”是指可用於確定樣品或受試者中所需分子，諸如由本文所述的mRNA分子編碼的抗原的存在(existence/presence)的物質。可檢測劑可為能夠被目測的物質或者能夠以其它方式確定和/或測量(例如通過定量)的物質。 “基本上全部”是指至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或約100%。 如本文所用並且除非另有說明，否則術語“約”或“大約”意指本領域普通技術人員所確定的特定值的可接受的誤差，其部分取決於測量或確定值的方式。在某些實施方案中，術語“約”或“大約”意指在1、2、3或4個標準差以內。在某些實施方案中，術語“約”或“大約”意指在給定值或範圍的20%以內、15%以內、10%以內、9%以內、8%以內、7%以內、6%以內、5%以內、4%以內、3%以內、2%以內、1%以內、0.5%以內、0.05%以內或更低以內。 本說明書中引用的所有出版物、專利申請、登錄號和其它參考文獻都以引用的方式整體併入本文中，其引用程度就如同特定並且單獨地指示每一個別出版物或專利申請以引用的方式併入一般。本文所論述的出版物僅為了其在本申請的申請日之前的公開內容而提供。本文中的任何內容均不應解釋為承認本發明無權憑藉在先發明而早於此類出版物。此外，提供的公佈日期可能與實際公佈日期有所不同，實際公佈日期可能需要獨立確認。 已經描述本發明的多個實施方案。然而，應理解，在不背離本發明的精神和範圍的情況下可進行各種修改。因此，實驗部分和實施例中的描述旨在說明而不是限制申請專利範圍中所描述的發明範圍。 治 療 性核酸 在一個方面，本文提供了用於控制、預防和治療RV感染的治療性核酸分子。在一些實施方案中，治療性核酸編碼肽或多肽，其在施用於有需要的受試者時，由受試者中的細胞表達以產生所編碼的肽或多肽。在一些實施方案中，治療性核酸分子是DNA分子。在其它實施方案中，治療性核酸分子是RNA分子。在特定實施方案中，治療性核酸分子是mRNA分子。 在一些實施方案中，治療性核酸分子被配製在疫苗組合物中。在一些實施方案中，疫苗組合物是如本文所述的基因疫苗。在一些實施方案中，疫苗組合物包含如本文所述的mRNA分子。 在一些實施方案中，本公開的mRNA分子編碼目標肽或多肽，包括任何天然或非天然存在的或以其它方式修飾的多肽。由mRNA編碼的肽或多肽可具有任何大小並且可具有任何二級結構或活性。在一些實施方案中，由mRNA有效負載編碼的多肽當在細胞中表達時可具有治療效應。 在一些實施方案中，本公開的mRNA分子包含至少一個編碼目標肽或多肽的編碼區(例如，開放閱讀框(ORF))。在一些實施方案中，核酸分子還包含至少一個非翻譯區(UTR)。在特定實施方案中，非翻譯區(UTR)位於編碼區的上游(5’端)，並且在本文中稱為5’-UTR。在特定實施方案中，非翻譯區(UTR)位於編碼區的下游(3’端)，並且在本文中稱為3’-UTR。在特定實施方案中，核酸分子包含5’-UTR和3’-UTR二者。在一些實施方案中，5’-UTR包含5’-帽結構。在一些實施方案中，核酸分子包含Kozak序列(例如在5’-UTR中)。在一些實施方案中，核酸分子包含poly-A區(例如在3’-UTR中)。在一些實施方案中，核酸分子包含聚腺苷酸化信號(例如在3’-UTR中)。在一些實施方案中，核酸分子包含穩定區(例如在3’-UTR中)。在一些實施方案中，核酸分子包含二級結構。在一些實施方案中，二級結構是莖-環。在一些實施方案中，核酸分子包含莖-環序列(例如在5’-UTR和/或3’-UTR中)。在一些實施方案中，核酸分子包含一個或多個能夠在剪接過程中切除的內含子區。在具體實施方案中，核酸分子包含一個或多個選自5’-UTR和編碼區的區域。在具體實施方案中，核酸分子包含一個或多個選自編碼區和3’-UTR的區域。在具體實施方案中，核酸分子包含一個或多個選自5’-UTR、編碼區和3’-UTR的區域。 編碼區在一些實施方案中，本公開的核酸分子包含至少一個編碼區。在一些實施方案中，編碼區是編碼單一肽或蛋白質的開放閱讀框(ORF)。在一些實施方案中，編碼區包含至少兩個ORF，每個ORF編碼一種肽或蛋白質。在編碼區包含多於一個ORF的實施方案中，編碼的肽和/或蛋白質可彼此相同或不同。在一些實施方案中，編碼區中的多個ORF經非編碼序列隔開。在具體實施方案中，隔開兩個ORF的非編碼序列包含內部核糖體進入位點(IRES)。 不受理論束縛，預期內部核糖體進入位點(IRES)可用作唯一的核糖體結合位點，或充當mRNA的多個核糖體結合位點之一。含有多於一個功能性核糖體結合位點的mRNA分子可編碼若干肽或蛋白質，所述肽或蛋白質獨立地由核糖體翻譯(例如多順反子mRNA)。因此，在一些實施方案中，本公開的核酸分子(例如mRNA)包含一個或多個內部核糖體進入位點(IRES)。可與本公開結合使用的IRES序列的實例包括但不限於來自小RNA病毒(例如FMDV)、瘟病毒(CFFV)、脊髓灰質炎病毒(PV)、腦心肌炎病毒(ECMV)、口蹄疫病毒(FMDV)、丙型肝炎病毒(HCV)、豬瘟病毒(CSFV)、鼠白血病病毒(MLV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)或蟋蟀麻痹病毒(CrPV)的那些IRES序列。 在各個實施方案中，本公開的核酸分子編碼至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種或多於10種肽或蛋白質。核酸分子編碼的肽和蛋白質可相同或不同。在一些實施方案中，本公開的核酸分子編碼二肽(例如肌肽和鵝肌肽)。在一些實施方案中，核酸分子編碼三肽。在一些實施方案中，核酸分子編碼四肽。在一些實施方案中，核酸分子編碼五肽。在一些實施方案中，核酸分子編碼六肽。在一些實施方案中，核酸分子編碼七肽。在一些實施方案中，核酸分子編碼八肽。在一些實施方案中，核酸分子編碼九肽。在一些實施方案中，核酸分子編碼十肽。在一些實施方案中，核酸分子編碼具有至少約15個氨基酸的肽或多肽。在一些實施方案中，核酸分子編碼具有至少約50個氨基酸的肽或多肽。在一些實施方案中，核酸分子編碼具有至少約100個氨基酸的肽或多肽。在一些實施方案中，核酸分子編碼具有至少約150個氨基酸的肽或多肽。在一些實施方案中，核酸分子編碼具有至少約300個氨基酸的肽或多肽。在一些實施方案中，核酸分子編碼具有至少約500個氨基酸的肽或多肽。在一些實施方案中，核酸分子編碼具有至少約1000個氨基酸的肽或多肽。 在一些實施方案中，本公開的核酸分子的長度是至少約30個核苷酸(nt)。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約35 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約40 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約45 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約50 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約55 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約60 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約65 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約70 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約75 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約80 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約85 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約90 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約95 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約100 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約120 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約140 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約160 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約180 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約200 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約250 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約300 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約400 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約500 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約600 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約700 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約800 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約900 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約1000 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約1100 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約1200 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約1300 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約1400 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約1500 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約1600 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約1700 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約1800 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約1900 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約2000 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約2500 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約3000 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約3500 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約4000 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約4500 nt。在一些實施方案中，核酸分子的長度是至少約5000 nt。 在具體實施方案中，本公開的治療性核酸被配製為如本文所述的疫苗組合物(例如，基因疫苗)。在一些實施方案中，治療性核酸編碼能夠引發針對一種或多種標靶疾患或疾病的免疫的肽或蛋白質。在一些實施方案中，標靶疾患與病原體感染相關或由病原體感染引起，所述病原體諸如為RV。在一些實施方案中，治療性核酸序列(例如，mRNA)編碼病原體特徵性致病性蛋白質或其免疫原性片段(例如表位)或衍生物。疫苗在施用於接種疫苗的受試者後，允許表達編碼的致病性蛋白質(或其免疫原性片段或衍生物)，由此在受試者體內引發針對病原體的免疫。 在具體實施方案中，本文提供了用於控制、預防和治療由RV或由感染RV引起的疾病或病症的治療性組合物(例如，疫苗組合物)。 不受理論束縛，預期RV或RABV (即狂犬病病毒)是單鏈負義RNA病毒，具有編碼五種結構蛋白的基因組：核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)、糖蛋白(G)和RNA依賴性RNA聚合酶(L)。在這些病毒蛋白質中，RABV的糖蛋白(RABV-G)通過介導病毒識別和附著於細胞受體以及病毒粒子內吞和內體腔酸化後病毒包膜與細胞膜的融合，從而起始病毒顆粒進入宿主細胞而在病毒的發病機制中發揮關鍵作用。作為存在於病毒表面的唯一蛋白質，RABV-G是中和抗體的主要標靶，因此選擇G蛋白作為疫苗設計的主要標靶。 因此，在一些實施方案中，本文提供了編碼源自RV的病毒肽或蛋白質的治療性核酸。在一些實施方案中，核酸編碼源自RV的病毒肽或蛋白質，其中所述病毒肽或蛋白質是選自以下的一種或多種：(a) N蛋白；(b) P蛋白；(c) M蛋白；(d) G蛋白；(e) L蛋白；(f) (a)至(e)中任一項的免疫原性片段；和(g) (a)至(f)中任一項的功能衍生物。 因此，在一些實施方案中，本公開的治療性核酸編碼RV G蛋白、或G蛋白的免疫原性片段、或G蛋白或其免疫原性片段的功能衍生物。表1顯示示例性RV G天然抗原序列。 注釋：括弧中的序列是信號肽，它們的氨基酸序列和核苷酸序列不包括在SEQ ID NO:1-3、7-10中。 在特定實施方案中，本公開的治療性核酸編碼RV的G蛋白，其中所述G蛋白具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在特定實施方案中，本公開的治療性核酸編碼RV的G蛋白，其中所述治療性核酸包含SEQ ID NO:7或8的DNA編碼序列。在特定實施方案中，本公開的治療性核酸編碼RV的G蛋白，其中所述治療性核酸包含從SEQ ID NO:7或8的DNA編碼序列轉錄的RNA序列。在特定實施方案中，本公開的治療性核酸編碼RV的G蛋白，其中所述G蛋白具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在特定實施方案中，本公開的治療性核酸編碼RV的G蛋白，其中所述治療性核酸包含SEQ ID NO:9的DNA編碼序列。在特定實施方案中，本公開的治療性核酸編碼RV的G蛋白，其中所述治療性核酸包含從SEQ ID NO:9的DNA編碼序列轉錄的RNA序列。在特定實施方案中，本公開的治療性核酸編碼RV的G蛋白，其中所述G蛋白具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在特定實施方案中，本公開的治療性核酸編碼RV的G蛋白，其中所述治療性核酸包含SEQ ID NO:10的DNA編碼序列。在特定實施方案中，本公開的治療性核酸編碼RV的G蛋白，其中所述治療性核酸包含從SEQ ID NO:10的DNA編碼序列轉錄的RNA序列。在一些實施方案中，RNA序列是體外轉錄的。在特定實施方案中，核酸分子是mRNA分子。 在特定實施方案中，本公開的治療性核酸編碼RV的G蛋白的免疫原性片段。在特定實施方案中，本公開的治療性核酸編碼RV的G蛋白的功能衍生物。在特定實施方案中，本公開的治療性核酸編碼RV的G蛋白的免疫原性片段的功能衍生物。 在特定實施方案中，RV G蛋白是突變體。 不受理論束縛，預期在一些實施方案中，本公開的治療性核酸編碼包含與三聚化肽融合的RV G蛋白或其片段的融合蛋白，使得所述融合蛋白能夠形成包含G蛋白或其片段的三個拷貝的三聚體複合物。在一些實施方案中，G蛋白或其片段通過肽連接子與三聚化肽融合。表2顯示可與本公開結合使用的示例性三聚化肽和連接子肽，以及融合蛋白的序列。 在一些實施方案中，治療性核酸編碼融合蛋白，所述融合蛋白包含與三聚化肽融合的RV的G蛋白或其功能衍生物。在一些實施方案中，G蛋白與三聚化肽之間的融合是通過肽連接子。在具體實施方案中，肽連接子包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些實施方案中，三聚化肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。 在特定實施方案中，治療性核酸編碼融合蛋白，所述融合蛋白包含與三聚化肽融合的RV的G蛋白，其中所述核酸包含DNA編碼序列。在特定實施方案中，治療性核酸編碼融合蛋白，所述融合蛋白包含與三聚化肽融合的RV的G蛋白，其中所述核酸包含從DNA編碼序列轉錄的RNA序列。在一些實施方案中，RNA序列是體外轉錄的。在特定實施方案中，核酸分子是mRNA分子。 不受理論束縛，預期包含與免疫球蛋白Fc區融合的病毒肽或多肽的融合蛋白可增強病毒肽或多肽的免疫原性。因此，在一些實施方案中，本公開的治療性核酸分子編碼融合蛋白，所述融合蛋白包含與免疫球蛋白的Fc區融合的源自RV的病毒肽或蛋白質。在特定實施方案中，病毒肽或蛋白質是選自以下的一種或多種：(a) N蛋白；(b) P蛋白；(c) M蛋白；(d) G蛋白；(e) L蛋白；(f) (a)至(e)中任一項的免疫原性片段；和(g) (a)至(f)中任一項的功能衍生物。在特定實施方案中，免疫球蛋白是人免疫球蛋白(Ig)。在特定實施方案中，免疫球蛋白是人IgG、IgA、IgD、IgE或IgM。在特定實施方案中，免疫球蛋白是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些實施方案中，免疫球蛋白Fc融合至病毒肽或多肽的N末端。在其它實施方案中，免疫球蛋白Fc融合至病毒肽或多肽的C末端。 不受理論束縛，預期信號肽可介導與其融合的多肽向細胞的特定位置的運輸。因此，在一些實施方案中，本公開的治療性核酸分子編碼包含與信號肽融合的病毒肽或蛋白質的融合蛋白。在特定實施方案中，病毒肽或蛋白質是選自以下的一種或多種：(a) N蛋白；(b) P蛋白；(c) M蛋白；(d) G蛋白；(e) L蛋白；(f) (a)至(e)中任一項的免疫原性片段；和(g) (a)至(f)中任一項的功能衍生物。在一些實施方案中，信號肽與病毒肽或多肽的N末端融合。在其它實施方案中，信號肽與病毒肽或多肽的C末端融合。表3顯示可與本公開結合使用的信號肽的示例性序列。 在特定實施方案中，信號肽由病毒肽或多肽所來源的RV的基因編碼。在特定實施方案中，由RV的基因編碼的信號肽與由RV的不同基因編碼的病毒肽或多肽融合。在其它實施方案中，由RV的基因編碼的信號肽與由RV的相同基因編碼的病毒肽或多肽融合。例如，在一些實施方案中，將具有MVPQALLFVPLLGFSLCFG (SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的信號肽融合至具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的病毒肽或多肽。在一些實施方案中，將具有MVPQALLLVPLLGFSLCFG (SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的信號肽融合至具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的病毒肽或多肽。在一些實施方案中，將具有MIPLALLFVPLLVFLCVSGNS (SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的信號肽融合至具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的病毒肽或多肽。在各個實施方案中，病毒肽或蛋白質是選自以下的一種或多種：(a) N蛋白；(b) P蛋白；(c) M蛋白；(d) G蛋白；(e) L蛋白；(f) (a)至(e)中任一項的免疫原性片段；和(g) (a)至(f)中任一項的功能衍生物。 在特定實施方案中，本公開的治療性核酸編碼無天然信號肽的RV的G蛋白或片段。在特定實施方案中，所編碼的G蛋白或片段包含具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的信號肽。在特定實施方案中，本公開的治療性核酸編碼具有信號肽的RV的G蛋白或片段，並且其中所述治療性核酸包含SEQ ID NO:15的DNA編碼序列。在特定實施方案中，本公開的治療性核酸編碼具有信號肽的RV的G蛋白或片段，並且其中所述治療性核酸包含從SEQ ID NO:15的DNA編碼序列轉錄的RNA序列。在一些實施方案中，RNA序列是體外轉錄的。在特定實施方案中，核酸分子是mRNA分子。 在特定實施方案中，本公開的治療性核酸編碼具有信號肽的RV的G蛋白的胞外結構域(ECD)。在一些實施方案中，RNA序列是體外轉錄的。在特定實施方案中，核酸分子是mRNA分子。 在其它實施方案中，信號肽由不存在於病毒肽或多肽所來源的RV中的外源基因序列編碼。在一些實施方案中，異源信號肽置換由本公開的核酸分子編碼的融合蛋白中的同源信號肽。在具體實施方案中，信號肽由哺乳動物基因編碼。在具體實施方案中，信號肽由人免疫球蛋白基因編碼。在具體實施方案中，信號肽由人IgE基因編碼。例如，在一些實施方案中，將具有MDWTWILFLVAAATRVHS (SEQ ID NO:14)的氨基酸序列的信號肽融合至由本公開的核酸分子編碼的病毒肽或多肽。在各個實施方案中，病毒肽或蛋白質是選自以下的一種或多種：(a) N蛋白；(b) P蛋白；(c) M蛋白；(d) G蛋白；(e) L蛋白；(f) (a)至(e)中任一項的免疫原性片段；和(g) (a)至(f)中任一項的功能衍生物。 5’- 帽 結構 不受理論束縛，預期聚核苷酸的5’-帽結構參與核輸出並增加聚核苷酸穩定性，並且結合mRNA帽結合蛋白(CBP)，CBP負責細胞中的聚核苷酸穩定性，並且通過CBP與poly-A結合蛋白締合形成成熟環狀mRNA物質來引起翻譯能力。5’-帽結構進一步有助於在mRNA剪接期間移除5’-近端內含子。因此，在一些實施方案中，本公開的核酸分子包含5’-帽結構。 核酸分子可在5’端經細胞內源性轉錄機構加帽，由此在聚核苷酸的末端鳥苷帽殘基與5’末端轉錄的有義核苷酸之間產生5’-ppp-5’-三磷酸鍵聯。接著，該5’-鳥苷酸帽可經甲基化以產生N7-甲基-鳥苷酸殘基。聚核苷酸5’端的末端和/或末端前(anteterminal)轉錄的核苷酸的核糖還可任選地經2’-O-甲基化。通過鳥苷酸帽結構水解和裂解進行的5’-脫帽可靶向核酸分子，例如mRNA分子以進行降解。 在一些實施方案中，本公開的核酸分子包含對由內源過程產生的天然5’-帽結構的一種或多種改變。不受理論束縛，對5’-帽的修飾可增加聚核苷酸的穩定性，增加聚核苷酸的半衰期，並且可增加聚核苷酸的翻譯效率。 對天然5’-帽結構的示例性改變包括產生不可水解的帽結構，以防止脫帽，由此增加聚核苷酸的半衰期。在一些實施方案中，由於帽結構水解需要裂解5’-ppp-5’磷酸二酯鍵聯，因此在一些實施方案中，可在加帽反應期間使用經修飾的核苷酸。舉例來說，在一些實施方案中，可根據製造商的說明書，將來自New England Biolabs (Ipswich, Mass.)的牛痘病毒加帽酶(Vaccinia Capping Enzyme)用於α-硫代鳥苷核苷酸以在5’-ppp-5’帽中產生硫代磷酸酯鍵聯。可使用額外經修飾的鳥苷核苷酸，諸如α-甲基膦酸和硒代磷酸核苷酸。 對天然5’-帽結構的額外示例性改變還包括在加帽的鳥苷三磷酸(GTP)的2’位和/或3’位的修飾、糖環氧(產生碳環的氧)替代為亞甲基部分(CH ₂)、在帽結構的三磷酸橋部分處的修飾或在核鹼基(G)部分處的修飾。 對天然5’-帽結構的額外示例性改變包括但不限於聚核苷酸5’-末端和/或5’-末端前核苷酸的核糖在糖2’-羥基上的2’-O-甲基化(如上所述)。可使用多種不同的5’-帽結構產生聚核苷酸(諸如mRNA分子)的5’-帽。可與本公開結合使用的額外示例性5’-帽結構還包括國際專利公佈第WO2008127688號、第WO 2008016473號和第WO 2011015347號中描述的那些5’-帽結構，各案的全部內容以引用的方式併入本文中。 在各個實施方案中，5’-末端帽可包括帽類似物。帽類似物在本文中又稱為合成帽類似物、化學帽、化學帽類似物、或者結構或功能性帽類似物，其化學結構不同於天然(即，內源性、野生型或生理性) 5’-帽，同時保留帽功能。帽類似物可按化學方式(即，非酶方式)或酶方式合成和/或連接至聚核苷酸。 舉例來說，抗反向帽類似物(ARCA)帽含有經5’-5’-三磷酸酯基團連接的兩個鳥苷，其中一個鳥苷含有N7-甲基以及3’-O-甲基(即，N7,3’-O-二甲基-鳥苷-5’-三磷酸-5’-鳥苷，即m ⁷G-3’mppp-G，其可等效地稱為3’ O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G)。另一未改變的鳥苷的3’-O原子與加帽聚核苷酸(例如mRNA)的5’-末端核苷酸連接。N7-和3’-O-甲基化的鳥苷提供加帽聚核苷酸(例如mRNA)的末端部分。另一示例性帽結構為mCAP，其類似於ARCA，但在鳥苷上具有2’-O-甲基(即，N7,2’-O-二甲基-鳥苷-5’-三磷酸-5’-鳥苷，即m ⁷Gm-ppp-G)。 在一些實施方案中，帽類似物可為二核苷酸帽類似物。作為非限制性實例，二核苷酸帽類似物可在不同磷酸酯位置處用硼烷磷酸酯基(boranophosphate)或硒代磷酸酯基(phophoroselenoate)進行修飾，諸如美國專利第8,519,110號中所述的二核苷酸帽類似物，該案的全部內容以引用的方式整體併入本文中。 在一些實施方案中，帽類似物可為此項技術中已知和/或本文所述的N7-(4-氯苯氧基乙基)取代的二核苷酸帽類似物。N7-(4-氯苯氧基乙基)取代的二核苷酸帽類似物的非限制性實例包括N7-(4-氯苯氧基乙基)-G(5’)ppp(5’)G和N7-(4-氯苯氧基乙基)-m3’-OG(5’)ppp(5’)G帽類似物(參見例如Kore等人，Bioorganic & Medicinal Chemistry 2013 21:4570-4574中所述的各種帽類似物和合成帽類似物的方法；該文獻的全部內容以引用的方式併入本文中)。在其它實施方案中，可與本公開的核酸分子結合使用的帽類似物是4-氯/溴苯氧基乙基類似物。 在各個實施方案中，帽類似物可包括鳥苷類似物。有用的鳥苷類似物包括但不限於肌苷、N1-甲基-鳥苷、2’-氟-鳥苷、7-脫氮-鳥苷、8-氧代-鳥苷、2-氨基-鳥苷、LNA-鳥苷和2-疊氮基-鳥苷。 不受理論束縛，預期儘管帽類似物允許在體外轉錄反應中同時進行聚核苷酸的加帽，但高達20%的轉錄物仍未加帽。這種情況以及帽類似物與細胞內源轉錄機構產生的聚核苷酸的天然5’-帽結構的結構差異可能導致翻譯能力減弱和細胞穩定性降低。 因此，在一些實施方案中，本公開的核酸分子還可使用酶在轉錄後加帽，以便產生更真實(authentic)的5’-帽結構。如本文所用，短語“更真實”是指一種特徵在結構上或功能上密切反映或模仿內源或野生型特徵。即，與現有技術的合成特徵或類似物相比，“更真實”的特徵更好地代表內源性、野生型、天然或生理細胞功能和/或結構，或者其在一個或多個方面勝過對應內源性、野生型、天然或生理特徵。可與本公開的核酸分子結合使用的更真實的5’-帽結構的非限制性實例為相較於此項技術中已知的合成5’-帽結構(或相較於野生型、天然或生理性5’-帽結構)，尤其具有增強的與帽結合蛋白的結合、增加的半衰期、降低的對5’-核酸內切酶的敏感性和/或減少的5’-脫帽的結構。舉例來說，在一些實施方案中，重組牛痘病毒加帽酶和重組2’-O-甲基轉移酶可在聚核苷酸的5’-末端核苷酸與鳥苷帽核苷酸之間產生經典的5’-5’-三磷酸酯鍵聯，其中帽鳥苷含有N7-甲基化，並且聚核苷酸的5’-末端核苷酸含有2’-O-甲基。這種結構稱為帽1結構。與例如此項技術中已知的其它5’帽類似物結構相比，這種帽引起更高的翻譯能力、細胞穩定性和減少的細胞促炎性細胞因數的活化。其它示例性帽結構包括7mG(5’)ppp(5’)N,pN2p (帽0)、7mG(5’)ppp(5’)NlmpNp (帽1)、7mG(5’)-ppp(5’)NlmpN2mp (帽2)和m(7)Gpppm(3) (6,6,2’)Apm(2’)Apm(2’)Cpm(2)(3,2’)Up (帽4)。 不受理論束縛，預期本公開的核酸分子可在轉錄後加帽，並且由於這種方法較為高效，因此幾乎100%的核酸分子可經加帽。 非翻 譯區 (UTR)在一些實施方案中，本公開的核酸分子包含一個或多個非翻譯區(UTR)。在一些實施方案中，UTR位於核酸分子中編碼區的上游，並且被稱為5’-UTR。在一些實施方案中，UTR位於核酸分子中編碼區的下游，並且被稱為3’-UTR。UTR的序列可與核酸分子中所發現的編碼區的序列同源或異源。多個UTR可包含在核酸分子中，並且可具有相同或不同的序列和/或基因起源。根據本公開，核酸分子中UTR的任何部分(包括沒有任何部分)可經密碼子優化，並且任何部分可在密碼子優化之前和/或之後獨立地含有一個或多個不同的結構或化學修飾。 在一些實施方案中，本公開的核酸分子(例如mRNA)包含相對於彼此為同源的UTR和編碼區。在其它實施方案中，本公開的核酸分子(例如mRNA)包含相對於彼此為異源的UTR和編碼區。在一些實施方案中，為了監測UTR序列的活性，可在體外(例如細胞或組織培養物)或在體內(例如向受試者)施用包含UTR和可檢測探針的編碼序列的核酸分子，並且可使用此項技術中已知的方法測量UTR序列的效應(例如調節表達水準、編碼產物的細胞定位或編碼產物的半衰期)。 在一些實施方案中，本公開的核酸分子(例如mRNA)的UTR包含至少一個翻譯增強子元件(TEE)，所述TEE起到增加由核酸分子產生的多肽或蛋白質的量的作用。在一些實施方案中，TEE位於核酸分子的5’-UTR中。在其它實施方案中，TEE位於核酸分子的3’-UTR處。在其它實施方案中，至少兩個TEE分別位於核酸分子的5’-UTR和3’-UTR處。在一些實施方案中，本公開的核酸分子(例如mRNA)可包含一個或多個拷貝的TEE序列或包含多於一個不同的TEE序列。在一些實施方案中，存在於本公開的核酸分子中的不同TEE序列可相對於彼此為同源的或異源的。 各種TEE序列是此項技術中已知的，並且可與本公開結合使用。舉例來說，在一些實施方案中，TEE可為內部核糖體進入位點(IRES)、HCV-IRES或IRES元件。Chappell等人， Proc. Natl. Acad. Sci.USA 101:9590-9594, 2004；Zhou等人， Proc. Natl. Acad. Sci.102:6273-6278, 2005。可與本公開結合使用的額外內部核糖體進入位點(IRES)包括但不限於美國專利第7,468,275號、美國專利公佈第2007/0048776號和美國專利公佈第2011/0124100號，以及國際專利公佈第WO2007/025008號和國際專利公佈第WO2001/055369號中所述的IRES，各案的內容以引用的方式整體併入本文中。在一些實施方案中，TEE可為Wellensiek等人，Genome-wide profiling of human cap-independent translation-enhancing elements, Nature Methods, 2013年8月; 10(8): 747-750的補充表1和補充表2中所述的TEE；該文獻的內容以引用的方式整體併入本文中。 可與本公開結合使用的額外示例性TEE包括但不限於美國專利第6,310,197號、美國專利第6,849,405號、美國專利第7,456,273號、美國專利第7,183,395號、美國專利公佈第2009/0226470號、美國專利公佈第2013/0177581號、美國專利公佈第2007/0048776號、美國專利公佈第2011/0124100號、美國專利公佈第2009/0093049號、國際專利公佈第WO2009/075886號、國際專利公佈第WO2012/009644號和國際專利公佈第WO1999/024595號、國際專利公佈第WO2007/025008號、國際專利公佈第WO2001/055371號、歐洲專利第2610341號、歐洲專利第2610340號中所述的TEE序列，各案的內容以引用的方式整體併入本文中。 在各個實施方案中，本公開的核酸分子(例如mRNA)包含至少一個UTR，其包含至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或超過60個TEE序列。在一些實施方案中，核酸分子UTR中的TEE序列是同一TEE序列的拷貝。在其它實施方案中，核酸分子UTR中的至少兩個TEE序列具有不同的TEE序列。在一些實施方案中，多個不同的TEE序列以一種或多種重複模式佈置於核酸分子的UTR區中。僅出於說明的目的，重複模式可為例如ABABAB、AABBAABBAABB、ABCABCABC等，其中在這些示例性模式中，每個大寫字母(A、B或C)代表不同的TEE序列。在一些實施方案中，在核酸分子的UTR中，至少兩個TEE序列彼此為連續的(即，其間無間隔子序列)。在其它實施方案中，至少兩個TEE序列由間隔子序列隔開。在一些實施方案中，UTR可包含TEE序列-間隔子序列模組，所述模組在UTR中重複至少一次、至少兩次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次或多於9次。在本段所述的任何實施方案中，UTR可為核酸分子的5’-UTR、3’-UTR或5’-UTR和3’-UTR二者。 在一些實施方案中，本公開的核酸分子(例如mRNA)的UTR包含至少一個翻譯抑制元件，所述元件起到減少由核酸分子產生的多肽或蛋白質的量的作用。在一些實施方案中，核酸分子的UTR包含由一種或多種微小RNA識別的一個或多個miR序列或其片段(例如miR種子序列(seed sequence))。在一些實施方案中，核酸分子的UTR包含下調核酸分子的翻譯活性的一個或多個莖-環結構。用於抑制與核酸分子相關的翻譯活性的其它機制是此項技術中已知的。在本段所述的任何實施方案中，UTR可為核酸分子的5’-UTR、3’-UTR或5’-UTR和3’-UTR二者。表4顯示可與本公開結合使用的示例性5’-UTR和3’-UTR序列。 在具體實施方案中，本公開的核酸分子包含選自SEQ ID NO:24-33的5’-UTR。在具體實施方案中，本公開的核酸分子包含選自SEQ ID NO:34-39的3’-UTR。在具體實施方案中，本公開的核酸分子包含選自SEQ ID NO:24-33的5’-UTR和選自SEQ ID NO:34-39的3’-UTR。在本段所述的任何實施方案中，核酸分子還可包含具有如本文所述的序列的編碼區，諸如表1至4中的任何DNA編碼序列或其等效RNA序列。在特定實施方案中，本段所述的核酸分子可以是體外轉錄的RNA分子。 聚腺苷酸化(Poly-A)區 在天然RNA加工過程中，通常將長鏈腺苷核苷酸(poly-A區)添加至信使RNA (mRNA)分子中以增加分子的穩定性。轉錄後，立即將轉錄物的3’端裂解以釋放3’-羥基。接著，poly-A聚合酶將一連串腺苷核苷酸添加至RNA中。該過程稱為聚腺苷酸化，添加一個長度在100與250個殘基之間的poly-A區。不受理論束縛，預期poly-A區可賦予本公開的核酸分子多個優點。 因此，在一些實施方案中，本公開的核酸分子(例如mRNA)包含聚腺苷酸化信號。在一些實施方案中，本公開的核酸分子(例如mRNA)包含一個或多個聚腺苷酸化(poly-A)區。在一些實施方案中，poly-A區完全由腺嘌呤核苷酸或其功能性類似物構成。在一些實施方案中，核酸分子在其3’端包含至少一個poly-A區。在一些實施方案中，核酸分子在其5’端包含至少一個poly-A區。在一些實施方案中，核酸分子在其5’端包含至少一個poly-A區並且在其3’端包含至少一個poly-A區。 根據本公開，在不同實施方案中，poly-A區可具有不同長度。特別地，在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少30個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少35個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少40個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少45個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少50個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少55個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少60個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少65個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少70個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少75個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少80個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少85個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少90個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少95個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少100個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少110個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少120個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少130個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少140個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少150個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少160個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少170個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少180個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少190個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少200個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少225個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少250個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少275個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少300個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少350個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少400個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少450個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少500個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少600個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少700個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少800個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少900個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少1000個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少1100個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少1200個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少1300個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少1400個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少1500個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少1600個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少1700個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少1800個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少1900個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少2000個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少2250個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少2500個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少2750個核苷酸。在一些實施方案中，本公開的核酸分子的poly-A區的長度是至少3000個核苷酸。 在一些實施方案中，核酸分子中poly-A區的長度可基於核酸分子的總長度或其一部分(諸如核酸分子的編碼區的長度或開放閱讀框的長度等)來選擇。舉例來說，在一些實施方案中，poly-A區占含有poly-A區的核酸分子的總長度的約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高百分比。 不受理論束縛，預期某些RNA結合蛋白可結合至位於mRNA分子3’端的poly-A區。這些poly-A結合蛋白(PABP)可調節mRNA表達，諸如與細胞中的翻譯起始機構相互作用和/或保護3’-poly-A尾免於降解。因此，在一些實施方案中，本公開的核酸分子(例如mRNA)包含poly-A結合蛋白(PABP)的至少一個結合位點。在其它實施方案中，在將核酸分子裝載至遞送媒介物(例如脂質納米顆粒)中之前，使其與PABP形成結合物或複合物。 在一些實施方案中，本公開的核酸分子(例如mRNA)包含poly-A-G四聯體。G四聯體是可由DNA和RNA中富含G的序列形成的氫鍵結的四個鳥苷核苷酸的環狀陣列。在該實施方案中，G四聯體併入poly-A區的一端。可分析所得聚核苷酸(例如mRNA)的穩定性、蛋白質產量和其它參數，包括在不同時間點的半衰期。已發現，poly-A-G四聯體結構導致蛋白質產量相當於單獨使用120個核苷酸的poly-A區所觀察到的蛋白質產量的至少75%。 在一些實施方案中，本公開的核酸分子(例如mRNA)可包含poly-A區並且可通過添加3’-穩定區來穩定。在一些實施方案中，可用於使包含poly-A或poly-A-G四聯體結構的核酸分子(例如mRNA)穩定的3’-穩定區描述於國際專利公佈第WO2013/103659號中，該案的內容以引用的方式整體併入本文中。 在其它實施方案中，可與本公開的核酸分子結合使用的3’-穩定區包括鏈終止核苷，諸如但不限於3’-去氧腺苷(蟲草素(cordycepin))；3’-去氧尿苷；3’-去氧胞嘧啶；3’-去氧鳥苷；3’-去氧胸腺嘧啶；2’,3’-雙去氧核苷，諸如2’,3’-雙去氧腺苷、2’,3’-雙去氧尿苷、2’,3’-雙去氧胞嘧啶、2’,3’-雙去氧鳥苷、2’,3’-雙去氧胸腺嘧啶；2’-去氧核苷；或O-甲基核苷；3’-去氧核苷；2’,3’-雙去氧核苷；3’-O-甲基核苷；3’-O-乙基核苷；3’-阿拉伯糖苷，以及此項技術中已知及/或本文所述的其它替代性核苷。 二 級結構不受理論束縛，預期莖-環結構可引導RNA折疊，保護核酸分子(例如mRNA)的結構穩定性，提供RNA結合蛋白的識別位點，並且用作酶反應的底物。舉例來說，miR序列和/或TEE序列的併入將改變莖-環區的形狀，由此可增加和/或減少翻譯(Kedde等人，A Pumilio-induced RNA structure switch in p27-3’UTR controls miR-221 and miR-222 accessibility. Nat Cell Biol., 2010年10月; 12(10):1014-20，其內容以引用的方式整體併入本文中)。 因此，在一些實施方案中，本文所述的核酸分子(例如mRNA)或其一部分可呈莖-環結構，諸如但不限於組蛋白莖-環。在一些實施方案中，莖-環結構由長度為約25個或約26個核苷酸的莖-環序列形成，諸如但不限於國際專利公佈第WO2013/103659號中所述的結構，該案的內容以引用的方式整體併入本文中。莖-環序列的額外實例包括國際專利公佈第WO2012/019780號和國際專利公佈第WO201502667號中所述的序列，各案的內容以引用的方式併入本文中。在一些實施方案中，莖-環序列包含如本文所述的TEE。在一些實施方案中，莖-環序列包含如本文所述的miR序列。在具體實施方案中，莖-環序列可包括miR-122種子序列。在具體實施方案中，核酸分子包含莖-環序列CAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACCA (SEQ ID NO:40)。在其它實施方案中，核酸分子包含莖-環序列CAAAGGCUCUUUUCAGAGCCACCA (SEQ ID NO:41)。 在一些實施方案中，本公開的核酸分子(例如mRNA)包含位於核酸分子中編碼區上游(在5’端)的莖-環序列。在一些實施方案中，莖-環序列位於核酸分子的5’-UTR內。在一些實施方案中，本公開的核酸分子(例如mRNA)包含位於核酸分子中編碼區下游(在3’端)的莖-環序列。在一些實施方案中，莖-環序列位於核酸分子的3’-UTR內。在一些情況下，核酸分子可含有多於一個莖-環序列。在一些實施方案中，核酸分子在5’-UTR中包含至少一個莖-環序列並且在3’-UTR中包含至少一個莖-環序列。 在一些實施方案中，包含莖-環結構的核酸分子還包含穩定區。在一些實施方案中，穩定區包含至少一個鏈終止核苷，其起到減慢降解並由此增加核酸分子的半衰期的作用。可與本公開的核酸分子結合使用的示例性鏈終止核苷包括但不限於3’-去氧腺苷(蟲草素)；3’-去氧尿苷；3’-去氧胞嘧啶；3’-去氧鳥苷；3’-去氧胸腺嘧啶；2’,3’-雙去氧核苷，諸如2’,3’-雙去氧腺苷、2’,3’-雙去氧尿苷、2’,3’-雙去氧胞嘧啶、2’,3’-雙去氧鳥苷、2’,3’-雙去氧胸腺嘧啶；2’-去氧核苷；或O-甲基核苷；3’-去氧核苷；2’,3’-雙去氧核苷；3’-O-甲基核苷；3’-O-乙基核苷；3’-阿拉伯糖苷，以及此項技術中已知和/或本文所述的其它替代性核苷。在其它實施方案中，莖-環結構可通過改變聚核苷酸的3’-區域來穩定，所述改變可防止和/或抑制寡聚(U)的添加(國際專利公佈第WO2013/103659號，其以引用的方式整體併入本文中)。 在一些實施方案中，本公開的核酸分子包含至少一個莖-環序列和poly-A區或聚腺苷酸化信號。包含至少一個莖-環序列和poly-A區或聚腺苷酸化信號的聚核苷酸序列的非限制性實例包括國際專利公佈第WO2013/120497號、國際專利公佈第WO2013/120629號、國際專利公佈第WO2013/120500號、國際專利公佈第WO2013/120627號、國際專利公佈第WO2013/120498號、國際專利公佈第WO2013/120626號、國際專利公佈第WO2013/120499號和國際專利公佈第WO2013/120628號中所述的序列，各案的內容以引用的方式整體併入本文中。 在一些實施方案中，包含莖-環序列和poly-A區或聚腺苷酸化信號的核酸分子可編碼病原體抗原或其片段，諸如國際專利公佈第WO2013/120499號和國際專利公佈第WO2013/120628號中所述的聚核苷酸序列，各案的內容以引用的方式整體併入本文中。 在一些實施方案中，包含莖-環序列和poly-A區或聚腺苷酸化信號的核酸分子可編碼治療性蛋白質，諸如國際專利公佈第WO2013/120497號和國際專利公佈第WO2013/120629號中所述的聚核苷酸序列，各案的內容以引用的方式整體併入本文中。 在一些實施方案中，包含莖-環序列和poly-A區或聚腺苷酸化信號的核酸分子可編碼腫瘤抗原或其片段，諸如國際專利公佈第WO2013/120500號和國際專利公佈第WO2013/120627號中所述的聚核苷酸序列，各案的內容以引用的方式整體併入本文中。 在一些實施方案中，包含莖-環序列和poly-A區或聚腺苷酸化信號的核酸分子可編碼致敏性抗原或自身免疫性自身抗原，諸如國際專利公佈第WO2013/120498號和國際專利公佈第WO2013/120626號中所述的聚核苷酸序列，各案的內容以引用的方式整體併入本文中。 功能性核苷酸 類 似物 在一些實施方案中，本文所述的有效負載核酸分子僅含有選自A (腺苷)、G (鳥苷)、C (胞嘧啶)、U (尿苷)和T (胸苷)的經典核苷酸。不受理論束縛，預期某些功能性核苷酸類似物可賦予核酸分子有用的特性。在本公開的上下文中，此類有用特性的實例包括但不限於核酸分子的穩定性增加、核酸分子在誘導先天性免疫反應中的免疫原性降低、由核酸分子編碼的蛋白質的產量增加、核酸分子的細胞內遞送和/或保留增加，和/或核酸分子的細胞毒性降低等。 因此，在一些實施方案中，有效負載核酸分子包含至少一種如本文所述的功能性核苷酸類似物。在一些實施方案中，功能性核苷酸類似物含有至少一個針對核鹼基、糖基和/或磷酸酯基的化學修飾。因此，包含至少一種功能性核苷酸類似物的有效負載核酸分子含有至少一個針對核鹼基、糖基和/或核苷間鍵聯的化學修飾。本文提供對核酸分子的核鹼基、糖基或核苷間鍵聯的示例性化學修飾。 如本文所述，有效負載核酸分子中所有核苷酸的0%至100%範圍的核苷酸可以為如本文所述的功能性核苷酸類似物。舉例來說，在各個實施方案中，核酸分子中的所有核苷酸中約1%至約20%、約1%至約25%、約1%至約50%、約1%至約60%、約1%至約70%、約1%至約80%、約1%至約90%、約1%至約95%、約10%至約20%、約10%至約25%、約10%至約50%、約10%至約60%、約10%至約70%、約10%至約80%、約10%至約90%、約10%至約95%、約10%至約100%、約20%至約25%、約20%至約50%、約20%至約60%、約20%至約70%、約20%至約80%、約20%至約90%、約20%至約95%、約20%至約100%、約50%至約60%、約50%至約70%、約50%至約80%、約50%至約90%、約50%至約95%、約50%至約100%、約70%至約80%、約70%至約90%、約70%至約95%、約70%至約100%、約80%至約90%、約80%至約95%、約80%至約100%、約90%至約95%、約90%至約100%、或約95%至約100%的核苷酸是本文所述的功能性核苷酸類似物。在這些實施方案中的任一個中，功能性核苷酸類似物可存在於核酸分子的任何位置處，包括5’-末端、3’-末端和/或一個或多個內部位置。在一些實施方案中，單個核酸分子可含有不同的糖修飾、不同的核鹼基修飾和/或不同類型的核苷間鍵聯(例如主鏈結構)。 如本文所述，有效負載核酸分子中一種類型的所有核苷酸(例如作為一種類型的所有含嘌呤核苷酸、或作為一種類型的所有含嘧啶核苷酸、或作為一種類型的所有A、G、C、T或U)中範圍從0%至100%的核苷酸可為本文所述的功能性核苷酸類似物。舉例來說，在各個實施方案中，核酸分子中一種類型的核苷酸中約1%至約20%、約1%至約25%、約1%至約50%、約1%至約60%、約1%至約70%、約1%至約80%、約1%至約90%、約1%至約95%、約10%至約20%、約10%至約25%、約10%至約50%、約10%至約60%、約10%至約70%、約10%至約80%、約10%至約90%、約10%至約95%、約10%至約100%、約20%至約25%、約20%至約50%、約20%至約60%、約20%至約70%、約20%至約80%、約20%至約90%、約20%至約95%、約20%至約100%、約50%至約60%、約50%至約70%、約50%至約80%、約50%至約90%、約50%至約95%、約50%至約100%、約70%至約80%、約70%至約90%、約70%至約95%、約70%至約100%、約80%至約90%、約80%至約95%、約80%至約100%、約90%至約95%、約90%至約100%、或約95%至約100%的核苷酸是本文所述的功能性核苷酸類似物。在這些實施方案中的任一個中，功能性核苷酸類似物可存在於核酸分子的任何位置處，包括5’-末端、3’-末端和/或一個或多個內部位置。在一些實施方案中，單個核酸分子可含有不同的糖修飾、不同的核鹼基修飾和/或不同類型的核苷間鍵聯(例如主鏈結構)。 核 鹼 基的修 飾在一些實施方案中，功能性核苷酸類似物含有非經典核鹼基。在一些實施方案中，核苷酸中的經典核鹼基(例如腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)可經修飾或置換以提供一種或多種功能性核苷酸類似物。核鹼基的示例性修飾包括但不限於一個或多個取代或修飾，包括但不限於烷基、芳基、鹵基、氧代基、羥基、烷氧基和/或硫代取代；一個或多個稠環或開環；氧化和/或還原。 在一些實施方案中，非經典核鹼基是經修飾的尿嘧啶。具有經修飾的尿嘧啶的示例性核鹼基和核苷包括假尿苷(ψ)、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮雜-尿嘧啶、6-氮雜-尿嘧啶、2-硫代-5-氮雜-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶(s ²U)、4-硫代尿嘧啶(s ⁴U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羥基-尿嘧啶(ho ⁵U)、5-氨基烯丙基-尿嘧啶、5-鹵基-尿嘧啶(例如，5-碘-尿嘧啶或5-溴-尿嘧啶)、3-甲基尿嘧啶(m ³U)、5-甲氧基-尿嘧啶(mo ⁵U)、尿嘧啶5-氧基乙酸(cmo ⁵U)、尿嘧啶5-氧基乙酸甲酯(mcmo ⁵U)、5-羧甲基-尿嘧啶(cm ⁵U)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羥甲基-尿嘧啶(chm ⁵U)、5-羧基羥甲基-尿嘧啶甲酯(mchm ⁵U)、5-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶(mcm ⁵U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿嘧啶(mcm ⁵s ²U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶(nm ⁵s ²U)、5-甲基氨基甲基-尿嘧啶(mnm ⁵U)、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶(mnm ⁵s ²U)、5-甲基氨基甲基-2-硒代-尿嘧啶(mnm ⁵se ²U)、5-氨甲醯基甲基-尿嘧啶(ncm ⁵U)、5-羧甲基氨基甲基-尿嘧啶(cmnm ⁵U)、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶(cmnm ⁵s ²U)、5-丙炔基-尿嘧啶、1-丙炔基-假尿嘧啶、5-牛磺酸甲基-尿嘧啶(τm ⁵U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿嘧啶(τm ⁵5s ²U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-尿嘧啶(m ⁵U，即具有核鹼基去氧胸腺嘧啶)、1-甲基-假尿苷(m ¹ψ)、1-乙基-假尿苷(Et ¹ψ)、5-甲基-2-硫代-尿嘧啶(m ⁵s ²U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m ¹s ⁴ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m ³ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脫氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脫氮-假尿苷、二氫尿嘧啶(D)、二氫假尿苷、5,6-二氫尿嘧啶、5-甲基-二氫尿嘧啶(m ⁵D)、2-硫代-二氫尿嘧啶、2-硫代-二氫假尿苷、2-甲氧基-尿嘧啶、2-甲氧基-4-硫代-尿嘧啶、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿嘧啶(acp ³U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp ³ψ)、5-(異戊烯基氨基甲基)尿嘧啶(m ⁵U)、5-(異戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿嘧啶(m ⁵s ²U)、5,2’-O-二甲基-尿苷(m ⁵Um)、2-硫代-2’-O-甲基-尿苷(s ²Um)、5-甲氧基羰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(mcm ⁵Um)、5-氨甲醯基甲基-2’-O-甲基-尿苷(ncm ⁵Um)、5-羧甲基氨基甲基-2’-O-甲基-尿苷(cmnm ⁵Um)、3,2’-O-二甲基-尿苷(m ³Um)和5-(異戊烯基氨基甲基)-2’-O-甲基-尿苷(inm ⁵Um)、1-硫代-尿嘧啶、去氧胸苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)-尿嘧啶、5-(氨甲醯基羥基甲基)-尿嘧啶、5-氨甲醯基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-羧甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-氰基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-2-硫代-尿嘧啶和5-[3-(1-E-丙烯基氨基)]尿嘧啶。 在一些實施方案中，非經典核鹼基是經修飾的胞嘧啶。具有經修飾的胞嘧啶的示例性核鹼基和核苷包括5-氮雜胞嘧啶、6-氮雜胞嘧啶、假異胞苷、3-甲基胞嘧啶(m3C)、N4-乙醯基胞嘧啶(ac4C)、5-甲醯基胞嘧啶(f5C)、N4-甲基-胞嘧啶(m4C)、5-甲基-胞嘧啶(m5C)、5-鹵基-胞嘧啶(例如5-碘-胞嘧啶)、5-羥甲基-胞嘧啶(hm5C)、1-甲基-假異胞苷、吡咯並胞嘧啶、吡咯並假異胞苷、2-硫代胞嘧啶(s2C)、2-硫代-5-甲基胞嘧啶、4-硫代假異胞苷、4-硫代-1-甲基-假異胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脫氮-假異胞苷、1-甲基-1-脫氮-假異胞苷、澤布拉林(zebularine)、5-氮雜-澤布拉林、5-甲基-澤布拉林、5-氮雜-2-硫代-澤布拉林、2-硫代-澤布拉林、2-甲氧基-胞嘧啶、2-甲氧基-5-甲基-胞嘧啶、4-甲氧基-假異胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假異胞苷、立西啶(lysidine)(k2C)、5,2’-O-二甲基-胞苷(m5Cm)、N4-乙醯基-2’-O-甲基-胞苷(ac4Cm)、N4,2’-O-二甲基-胞苷(m4Cm)、5-甲醯基-2’-O-甲基-胞苷(fSCm)、N4,N4,2’-O-三甲基-胞苷(m42Cm)、1-硫代-胞嘧啶、5-羥基-胞嘧啶、5-(3-疊氮基丙基)-胞嘧啶和5-(2-疊氮基乙基)-胞嘧啶。 在一些實施方案中，非經典核鹼基是經修飾的腺嘌呤。具有替代性腺嘌呤的示例性核鹼基和核苷包括2-氨基-嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-鹵基-嘌呤(例如2-氨基-6-氯-嘌呤)、6-鹵基-嘌呤(例如6-氯-嘌呤)、2-氨基-6-甲基-嘌呤、8-疊氮基-腺嘌呤、7-脫氮-腺嘌呤、7-脫氮-8-氮雜-腺嘌呤、7-脫氮-2-氨基-嘌呤、7-脫氮-8-氮雜-2-氨基-嘌呤、7-脫氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脫氮-8-氮雜-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-腺嘌呤(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺嘌呤(m6A)、2-甲硫基-N6-甲基-腺嘌呤(ms2m6A)、N6-異戊烯基-腺嘌呤(i6A)、2-甲硫基-N6-異戊烯基-腺嘌呤(ms2i6A)、N6-(順-羥基異戊烯基)腺嘌呤(io6A)、2-甲硫基-N6-(順-羥基異戊烯基)腺嘌呤(ms2io6A)、N6-甘氨醯基氨甲醯基-腺嘌呤(g6A)、N6-蘇氨醯基氨甲醯基-腺嘌呤(t6A)、N6-甲基-N6-蘇氨醯基氨甲醯基-腺嘌呤(m6t6A)、2-甲硫基-N6-蘇氨醯基氨甲醯基-腺嘌呤(ms2g6A)、N6,N6-二甲基-腺嘌呤(m62A)、N6-羥基正纈氨醯基氨甲醯基-腺嘌呤(hn6A)、2-甲硫基-N6-羥基正纈氨醯基氨甲醯基-腺嘌呤(ms2hn6A)、N6-乙醯基-腺嘌呤(ac6A)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、N6,2’-O-二甲基-腺苷(m6Am)、N6,N6,2’-O-三甲基-腺苷(m62Am)、1,2’-O-二甲基-腺苷(m1Am)、2-氨基-N6-甲基-嘌呤、1-硫代-腺嘌呤、8-疊氮基-腺嘌呤、N6-(19-氨基-五氧雜十九烷基)-腺嘌呤、2,8-二甲基-腺嘌呤、N6-甲醯基-腺嘌呤和N6-羥甲基-腺嘌呤。 在一些實施方案中，非經典核鹼基是經修飾的鳥嘌呤。具有經修飾的鳥嘌呤的示例性核鹼基和核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、懷俄苷(wyosine)(imG)、甲基懷俄苷(mimG)、4-脫甲基-懷俄苷(imG-14)、異懷俄苷(imG2)、懷丁苷(wybutosine)(yW)、過氧懷丁苷(o2yW)、羥基懷丁苷(OHyW)、修飾不足(undermodified)的羥基懷丁苷(OHyW*)、7-脫氮-鳥嘌呤、辮苷(queuosine)(Q)、環氧辮苷(oQ)、半乳糖基-辮苷(galQ)、甘露糖基-辮苷(manQ)、7-氰基-7-脫氮-鳥嘌呤(preQO)、7-氨基甲基-7-脫氮-鳥嘌呤(preQ1)、古嘌苷(archaeosine)(G+)、7-脫氮-8-氮雜-鳥嘌呤、6-硫代-鳥嘌呤、6-硫代-7-脫氮-鳥嘌呤、6-硫代-7-脫氮-8-氮雜-鳥嘌呤、7-甲基-鳥嘌呤(m7G)、6-硫代-7-甲基-鳥嘌呤、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鳥嘌呤、1-甲基-鳥嘌呤(m1G)、N2-甲基-鳥嘌呤(m2G)、N2,N2-二甲基-鳥嘌呤(m22G)、N2,7-二甲基-鳥嘌呤(m2,7G)、N2, N2,7-二甲基-鳥嘌呤(m2,2,7G)、8-氧代-鳥嘌呤、7-甲基-8-氧代-鳥嘌呤、1-甲基-6-硫代-鳥嘌呤、N2-甲基-6-硫代-鳥嘌呤、N2,N2-二甲基-6-硫代-鳥嘌呤、N2-甲基-2’-O-甲基-鳥苷(m2Gm)、N2,N2-二甲基-2’-O-甲基-鳥苷(m22Gm)、1-甲基-2’-O-甲基-鳥苷(m1Gm)、N2,7-二甲基-2’-O-甲基-鳥苷(m2,7Gm)、2’-O-甲基-肌苷(Im)、1,2’-O-二甲基-肌苷(m1Im)、1-硫代-鳥嘌呤和O-6-甲基-鳥嘌呤。 在一些實施方案中，功能性核苷酸類似物的非經典核鹼基可獨立地為嘌呤、嘧啶、嘌呤類似物或嘧啶類似物。舉例來說，在一些實施方案中，非經典核鹼基可為經修飾的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶或次黃嘌呤。在其它實施方案中，非經典核鹼基還可包括例如鹼基的天然存在的和合成的衍生物，包括吡唑並[3,4-d]嘧啶；5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羥甲基胞嘧啶；黃嘌呤；次黃嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物；腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物；2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫代尿嘧啶；8-鹵基(例如8-溴)、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基和其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤；5-鹵基(尤其為5-溴)、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤；8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤；脫氮鳥嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、3-脫氮鳥嘌呤；脫氮腺嘌呤、7-脫氮腺嘌呤、3-脫氮腺嘌呤；吡唑並[3,4-d]嘧啶；咪唑並[1,5-a]1,3,5-三嗪酮；9-脫氮嘌呤；咪唑並[4,5-d]吡嗪；噻唑並[4,5-d]嘧啶；吡嗪-2-酮；1,2,4-三嗪；噠嗪；或1,3,5-三嗪。 糖的修 飾在一些實施方案中，功能性核苷酸類似物含有非經典糖基。在各個實施方案中，非經典糖基可為具有一個或多個取代的5碳或6碳糖(諸如戊糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖或其去氧衍生物)，所述一個或多個取代諸如為鹵基、羥基、硫醇基、烷基、烷氧基、烯基氧基、炔基氧基、環烷基、氨基烷氧基、烷氧基烷氧基、羥基烷氧基、氨基、疊氮基、芳基、氨基烷基、氨基烯基、氨基炔基等。 一般來說，RNA分子含有核糖糖基，所述核糖糖基是含氧5元環。示例性、非限制性替代核苷酸包括置換核糖中的氧(例如，用S、Se或亞烷基，諸如亞甲基或亞乙基置換)；添加雙鍵(例如，用環戊烯基或環己烯基置換核糖)；核糖的環收縮(例如，形成環丁烷或氧雜環丁烷的4元環)；核糖的環擴展(例如，形成具有額外碳或雜原子的6元或7元環，諸如對於失水己糖醇、阿卓糖醇(altritol)、甘露糖醇、環己基、環己烯基和嗎啉基(其還具有氨基磷酸酯主鏈))；多環形式(例如三環和“未鎖定”形式，諸如二醇核酸(GNA) (例如R-GNA或S-GNA，其中核糖由連接至磷酸二酯鍵的二醇單元置換)、蘇糖核酸(TNA，其中核糖由α-L-蘇呋喃糖基-(3’‎‎à2’)置換)和肽核酸(PNA，其中2-氨基-乙基-甘氨酸鍵聯置換核糖和磷酸二酯主鏈))。 在一些實施方案中，糖基含有一個或多個碳，所述一個或多個碳具有與核糖中對應碳相反的立體化學構型。因此，核酸分子可包括含例如阿拉伯糖或L-核糖作為糖的核苷酸。在一些實施方案中，核酸分子包括至少一個其中糖是L-核糖、2’-O-甲基核糖、2’-氟核糖、阿拉伯糖、己糖醇、LNA或PNA的核苷。 核苷 間鍵聯 的修 飾 在一些實施方案中，本公開的有效負載核酸分子可含有一個或多個經修飾的核苷間鍵聯(例如磷酸酯主鏈)。主鏈磷酸酯基可通過用不同取代基置換一個或多個氧原子來改變。 在一些實施方案中，功能性核苷酸類似物可包括用本文所述的另一核苷間鍵聯置換未改變的磷酸酯部分。替代性磷酸酯基的實例包括但不限於硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸酯(boranophosphate/boranophosphate ester)、膦酸氫酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的兩個非連接氧均經硫置換。還可通過用氮(橋連的氨基磷酸酯)、硫(橋連的硫代磷酸酯)和碳(橋連的亞甲基膦酸酯)置換連接氧來改變磷酸酯連接子。 替代性核苷和核苷酸可包括一個或多個非橋連氧經甲硼烷部分(BH ₃)、硫(硫代)、甲基、乙基和/或甲氧基置換。作為非限制性實例，在同一位置(例如α (alpha)、β (beta)或γ (gamma)位置)處的兩個非橋連氧可經硫(硫代)和甲氧基置換。置換磷酸酯部分(例如α-硫代磷酸酯)位置處的一個或多個氧原子可通過非天然硫代磷酸酯主鏈鍵聯賦予RNA和DNA穩定性(諸如針對核酸外切酶和核酸內切酶的穩定性)。硫代磷酸酯DNA和RNA具有增加的核酸酶抗性，因此在細胞環境中具有較長的半衰期。 本文描述可根據本公開使用的其它核苷間鍵聯，包括不含磷原子的核苷間鍵聯。 可與本公開結合使用的核酸分子(例如mRNA)、相關組合物、製劑和/或方法的額外實例還包括WO2002/ 098443、WO2003/051401、WO2008/052770、WO2009127230、WO2006122828、WO2008/083949、WO2010088927、WO2010/037539、WO2004/004743、WO2005/016376、WO2006/024518、WO2007/095976、WO2008/014979、WO2008/077592、WO2009/030481、WO2009/095226、WO2011069586、WO2011026641、WO2011/144358、WO2012019780、WO2012013326、WO2012089338、WO2012113513、WO2012116811、WO2012116810、WO2013113502、WO2013113501、WO2013113736、WO2013143698、WO2013143699、WO2013143700、WO2013/120626、WO2013120627、WO2013120628、WO2013120629、WO2013174409、WO2014127917、WO2015/024669、WO2015/024668、WO2015/024667、WO2015/024665、WO2015/024666、WO2015/024664、WO2015101415、WO2015101414、WO2015024667、WO2015062738、WO2015101416中所述的那些，各案的內容整體併入本文中。 如本文所述的治療性核酸分子可通過使用本領域已知的方法分離或合成。在一些實施方案中，與本公開結合使用的DNA或RNA分子是化學合成的。在其它實施方案中，與本公開結合使用的DNA或RNA分子是從天然來源分離的。 在一些實施方案中，與本公開結合使用的mRNA分子是使用宿主細胞生物合成的。在特定實施方案中，mRNA是通過使用宿主細胞轉錄相應的DNA序列產生的。在一些實施方案中，使用本領域已知的方法將編碼mRNA序列的DNA序列併入表達載體中，然後將所述載體引入宿主細胞(例如，大腸桿菌)中。然後在合適的條件下培養宿主細胞以產生mRNA轉錄物。從編碼DNA產生mRNA分子的其它方法是本領域已知的。例如，在一些實施方案中，可使用包含宿主細胞的轉錄機構的酶的無細胞(體外)轉錄系統來產生mRNA轉錄物。在本公開中描述了示例性無細胞轉錄反應系統。 納 米 顆 粒 組 合物在一個方面，本文所述的核酸分子被配製用於體外和體內遞送。特別地，在一些實施方案中，核酸分子被配製成含脂質組合物。在一些實施方案中，含脂質組合物形成將核酸分子封閉在脂質殼內的脂質納米顆粒。在一些實施方案中，脂質殼保護核酸分子免於降解。在一些實施方案中，脂質納米顆粒還促進將封入的核酸分子運輸至細胞內隔室和/或機構中以發揮預期治療或預防功能。在某些實施方案中，當存在於脂質納米顆粒中時，核酸在水溶液中抵抗核酸酶的降解。包含核酸的脂質納米顆粒和其製備方法為此項技術中已知的，諸如在例如美國專利公佈第2004/0142025號、美國專利公佈第2007/0042031號、PCT公佈第WO 2017/004143號、PCT公佈第WO 2015/199952號、PCT公佈第WO 2013/016058號和PCT公佈第WO 2013/086373號中公開的那些，這些公佈中的每一者的完整公開內容出於所有目的以引用的方式整體併入本文中。 在一些實施方案中，本文所提供的納米顆粒組合物的最大尺寸為1 μm或更短(例如，≤1 µm、≤900 nm、≤800 nm、≤700 nm、≤600 nm、≤500 nm、≤400 nm、≤300 nm、≤200 nm、≤175 nm、≤150 nm、≤125 nm、≤100 nm、≤75 nm、≤50 nm或更短)，諸如當通過動態光散射(DLS)、透射電子顯微術、掃描電子顯微術或另一方法測量時。在一個實施方案中，本文所提供的脂質納米顆粒具有至少一個在約40 nm至約200 nm範圍內的尺寸。在一個實施方案中，所述至少一個尺寸在約40 nm至約100 nm範圍內。 可與本公開結合使用的納米顆粒組合物包括例如脂質納米顆粒(LNP)、納米脂蛋白顆粒、脂質體、脂質囊泡和脂質複合物(lipoplex)。在一些實施方案中，納米顆粒組合物是包括一個或多個脂質雙層的囊泡。在一些實施方案中，納米顆粒組合物包括經水性隔室隔開的兩個或更多個同心雙層。脂質雙層可經官能化和/或彼此交聯。脂質雙層可包括一種或多種配體、蛋白質或通道。 在一些實施方案中，所述的納米顆粒組合物包含脂質組分，所述脂質組分包含至少一種脂質，諸如如本文所述的脂質系列01-07 (及其子式)之一的化合物。例如，在一些實施方案中，納米顆粒組合物可包含脂質組分，所述脂質組分包括本文提供的化合物之一。納米顆粒組合物還可包含一種或多種如下所述的其它脂質或非脂質組分。 陽離 子脂 質 陽離子脂質包括以下脂質系列01-04 (及其子式)。 脂 質 系列 01 在一個實施方案中，本文提供了式(01-I)化合物： (01-I)， 或其藥學上可接受的鹽、前藥或立體異構體，其中： G ¹和G ²各自獨立地是鍵、C ₂-C ₁₂亞烷基或C ₂-C ₁₂亞烯基，其中所述亞烷基或亞烯基中的一個或多個-CH ₂-任選地經-O-替代； L ¹是-OC(=O)R ¹、-C(=O)OR ¹、-OC(=O)OR ¹、-C(=O)R ¹、-OR ¹、-S(O) _xR ¹、-S-SR ¹、-C(=O)SR ¹、-SC(=O)R ¹、    -NR ^aC(=O)R ¹、-C(=O)NR ^bR ^c、-NR ^aC(=O)NR ^bR ^c、      -OC(=O)NR ^bR ^c、-NR ^aC(=O)OR ¹、-SC(=S)R ¹、-C(=S)SR ¹、-C(=S)R ¹、-CH(OH)R ¹、-P(=O)(OR ^b)(OR ^c)、-(C ₆-C ₁₀亞芳基)-R ¹、-(6至10元亞雜芳基)-R ¹或R ¹； L ²是-OC(=O)R ²、-C(=O)OR ²、-OC(=O)OR ²、      -C(=O)R ²、-OR ²、-S(O) _xR ²、-S-SR ²、-C(=O)SR ²、-SC(=O)R ²、-NR ^dC(=O)R ²、-C(=O)NR ^eR ^f、-NR ^dC(=O)NR ^eR ^f、 -OC(=O)NR ^eR ^f、-NR ^dC(=O)OR ²、-SC(=S)R ²、 -C(=S)SR ²、-C(=S)R ²、-CH(OH)R ²、-P(=O)(OR ^e)(OR ^f)、 -(C ₆-C ₁₀亞芳基)-R ²、-(6至10元亞雜芳基)-R ²或R ²； R ¹和R ²各自獨立地是C ₆-C ₃₂烷基或C ₆-C ₃₂烯基； R ^a、R ^b、R ^d和R ^e各自獨立地是H、C ₁-C ₂₄烷基或C ₂-C ₂₄烯基； R ^c和R ^f各自獨立地是C ₁-C ₃₂烷基或C ₂-C ₃₂烯基； G ³是C ₂-C ₂₄亞烷基、C ₂-C ₂₄亞烯基、C ₃-C ₈亞環烷基或C ₃-C ₈亞環烯基； R ³是-N(R ⁴)R ⁵； R ⁴是C ₃-C ₈環烷基、C ₃-C ₈環烯基、4至8元雜環基或 C ₆-C ₁₀芳基；或R ⁴、G ³或G ³的一部分與它們所連接的氮一起形成環狀部分； R ⁵是C ₁-C ₁₂烷基或C ₃-C ₈環烷基；或R ⁴、R ⁵與它們所連接的氮一起形成環狀部分； x是0、1或2；並且 其中每個烷基、烯基、環烷基、環烯基、雜環基、芳基、亞烷基、亞烯基、亞環烷基、亞環烯基、亞芳基、亞雜芳基和環狀部分獨立地任選地經取代。 在一個實施方案中，本文提供了式(01-II)化合物： (01-II)， 或其藥學上可接受的鹽、前藥或立體異構體，其中： 是單鍵或雙鍵； G ¹和G ²各自獨立地是鍵、C ₂-C ₁₂亞烷基或C ₂-C ₁₂亞烯基，其中所述亞烷基或亞烯基中的一個或多個-CH ₂-任選地經-O-替代； L ¹是-OC(=O)R ¹、-C(=O)OR ¹、-OC(=O)OR ¹、      -C(=O)R ¹、-OR ¹、-S(O) _xR ¹、-S-SR ¹、-C(=O)SR ¹、     -SC(=O)R ¹、-NR ^aC(=O)R ¹、-C(=O)NR ^bR ^c、-NR ^aC(=O)NR ^bR ^c、-OC(=O)NR ^bR ^c、-NR ^aC(=O)OR ¹、-SC(=S)R ¹、-C(=S)SR ¹、  -C(=S)R ¹、-CH(OH)R ¹、-P(=O)(OR ^b)(OR ^c)、-(C ₆-C ₁₀亞芳基)-R ¹、-(6至10元亞雜芳基)-R ¹或R ¹； L ²是-OC(=O)R ²、-C(=O)OR ²、-OC(=O)OR ²、-C(=O)R ²、-OR ²、-S(O) _xR ²、-S-SR ²、-C(=O)SR ²、-SC(=O)R ²、    -NR ^dC(=O)R ²、-C(=O)NR ^eR ^f、-NR ^dC(=O)NR ^eR ^f、      -OC(=O)NR ^eR ^f、-NR ^dC(=O)OR ²、-SC(=S)R ²、-C(=S)SR ²、-C(=S)R ²、-CH(OH)R ²、-P(=O)(OR ^e)(OR ^f)、-(C ₆-C ₁₀亞芳基)-R ²、-(6至10元亞雜芳基)-R ²或R ²； R ¹和R ²各自獨立地是C ₆-C ₃₂烷基或C ₆-C ₃₂烯基； R ^a、R ^b、R ^d和R ^e各自獨立地是H、C ₁-C ₂₄烷基或C ₂-C ₂₄烯基； R ^c和R ^f各自獨立地是C ₁-C ₃₂烷基或C ₂-C ₃₂烯基； G ⁴是鍵、C ₁-C ₂₃亞烷基、C ₂-C ₂₃亞烯基、C ₃-C ₈亞環烷基或C ₃-C ₈亞環烯基； R ³是-N(R ⁴)R ⁵； R ⁴是C ₁-C ₁₂烷基、C ₃-C ₈環烷基、C ₃-C ₈環烯基、4至8元雜環基或C ₆-C ₁₀芳基；或R ⁴、G ³或G ³的一部分與它們所連接的氮一起形成環狀部分； R ⁵是C ₁-C ₁₂烷基或C ₃-C ₈環烷基；或R ⁴、R ⁵與它們所連接的氮一起形成環狀部分； x是0、1或2；並且 其中每個烷基、烯基、環烷基、環烯基、雜環基、芳基、亞烷基、亞烯基、亞環烷基、亞環烯基、亞芳基、亞雜芳基和環狀部分獨立地任選地經取代。 在一個實施方案中，所述化合物是表01-1中的化合物，或其藥學上可接受的鹽、前藥或立體異構體。 脂 質 系列 02 在一個實施方案中，本文提供了式(02-I)化合物： (02-I) 或其藥學上可接受的鹽、前藥或立體異構體，其中： G ¹和G ²各自獨立地是C ₂-C ₁₂亞烷基或C ₂-C ₁₂亞烯基，其中G ¹和G ²中的一個或多個-CH ₂-任選地經-O-、-C(=O)O-或-OC(=O)-替代； 每個L ¹獨立地是-OC(=O)R ¹、-C(=O)OR ¹、        -OC(=O)OR ¹、-C(=O)R ¹、-OR ¹、-S(O) _xR ¹、-S-SR ¹、    -C(=O)SR ¹、-SC(=O)R ¹、-NR ^aC(=O)R ¹、-C(=O)NR ^bR ^c、  -NR ^aC(=O)NR ^bR ^c、-OC(=O)NR ^bR ^c、-NR ^aC(=O)OR ¹、-SC(=S)R ¹、-C(=S)SR ¹、-C(=S)R ¹、-CH(OH)R ¹、-P(=O)(OR ^b)(OR ^c)、 -NR ^aP(=O)(OR ^b)(OR ^c)； 每個L ²獨立地是-OC(=O)R ²、-C(=O)OR ²、        -OC(=O)OR ²、-C(=O)R ²、-OR ²、-S(O) _xR ²、-S-SR ²、-C(=O)SR ²、-SC(=O)R ²、-NR ^dC(=O)R ²、-C(=O)NR ^eR ^f、-NR ^dC(=O)NR ^eR ^f、-OC(=O)NR ^eR ^f、-NR ^dC(=O)OR ²、-SC(=S)R ²、-C(=S)SR ²、-C(=S)R ²、-CH(OH)R ²、-P(=O)(OR ^e)(OR ^f)、-NR ^dP(=O)(OR ^e)(OR ^f)； R ¹和R ²各自獨立地是C ₆-C ₂₄烷基或C ₆-C ₂₄烯基； R ^a、R ^b、R ^d和R ^e各自獨立地是H、C ₁-C ₂₄烷基或C ₂-C ₂₄烯基； R ^c和R ^f各自獨立地是C ₁-C ₂₄烷基或C ₂-C ₂₄烯基； G ³是C ₂-C ₁₂亞烷基或C ₂-C ₁₂亞烯基，其中亞烷基或亞烯基的一部分或全部任選地經C ₃-C ₈亞環烷基或C ₃-C ₈亞環烯基替代； R ³是-N(R ⁴)R ⁵、-OR ⁶或-SR ⁶； R ⁴是C ₁-C ₁₂烷基、C ₂-C ₁₂烯基、C ₃-C ₈環烷基、C ₃-C ₈環烯基、C ₆-C ₁₀芳基或4至8元雜環烷基； R ⁵是H、C ₁-C ₁₂烷基、C ₃-C ₈環烷基、C ₃-C ₈環烯基、C ₆-C ₁₀芳基或4至8元雜環烷基； R ⁶是氫、C ₁-C ₁₂烷基、C ₃-C ₈環烷基、C ₃-C ₈環烯基或C ₆-C ₁₀芳基； x是0、1或2；並且 其中每個烷基、烯基、環烷基、環烯基、雜環烷基、芳基、亞烷基、亞烯基、亞環烷基和亞環烯基獨立地任選地經取代。 在一個實施方案中，化合物是表02-1中的化合物，或其藥學上可接受的鹽、前藥或立體異構體。 脂 質 系列 03 在一個實施方案中，本文提供了式(03-I)化合物： (03-I)， 或其藥學上可接受的鹽、前藥或立體異構體，其中： G ¹和G ²各自獨立地是鍵、C ₂-C ₁₂亞烷基或C ₂-C ₁₂亞烯基；其中G ¹和G ²中的一個或多個-CH ₂-任選地經-O-替代； 每個L ¹獨立地是-OC(=O)R ¹、-C(=O)OR ¹、-OC(=O)OR ¹、-C(=O)R ¹、-OR ¹、-S(O) _xR ¹、-S-SR ¹、-C(=O)SR ¹、     -SC(=O)R ¹、-NR ^aC(=O)R ¹、-C(=O)NR ^bR ^c、-NR ^aC(=O)NR ^bR ^c、 -OC(=O)NR ^bR ^c、-NR ^aC(=O)OR ¹、-SC(=S)R ¹、-C(=S)SR ¹、-C(=S)R ¹、-CH(OH)R ¹、-P(=O)(OR ^b)(OR ^c)、-NR ^aP(=O)(OR ^b)(OR ^c)、-(C ₆-C ₁₀亞芳基)-R ¹、-(6至10元亞雜芳基)-R ¹、-(4至8元亞雜環基)-R ¹或R ¹； 每個L ²獨立地是-OC(=O)R ²、-C(=O)OR ²、        -OC(=O)OR ²、-C(=O)R ²、-OR ²、-S(O) _xR ²、-S-SR ²、    -C(=O)SR ²、-SC(=O)R ²、-NR ^dC(=O)R ²、-C(=O)NR ^eR ^f、   -NR ^dC(=O)NR ^eR ^f、-OC(=O)NR ^eR ^f、-NR ^dC(=O)OR ²、    -SC(=S)R ²、-C(=S)SR ²、-C(=S)R ²、-CH(OH)R ²、      -P(=O)(OR ^e)(OR ^f)、-NR ^dP(=O)(OR ^e)(OR ^f)、-(C ₆-C ₁₀亞芳基)-R ²、-(6至10元亞雜芳基)-R ²、-(4至8元亞雜環基)-R ²或R ²； R ¹和R ²各自獨立地是C ₆-C ₂₄烷基或C ₆-C ₂₄烯基； R ^a、R ^b、R ^d和R ^e各自獨立地是H、C ₁-C ₂₄烷基或C ₂-C ₂₄烯基； R ^c和R ^f各自獨立地是C ₁-C ₂₄烷基或C ₂-C ₂₄烯基； G ³是C ₂-C ₁₂亞烷基或C ₂-C ₁₂亞烯基，其中亞烷基或亞烯基的一部分或全部任選地經C ₃-C ₈亞環烷基、C ₃-C ₈亞環烯基、C ₃-C ₈亞環炔基、4至8元亞雜環基、C ₆-C ₁₀亞芳基或5至10元亞雜芳基替代； R ³是氫、C ₁-C ₁₂烷基、C ₂-C ₁₂烯基、C ₂-C ₁₂炔基、C ₃-C ₈環烷基、C ₃-C ₈環烯基、C ₃-C ₈環炔基、4至8元雜環基、C ₆-C ₁₀芳基或5至10元雜芳基；或R ³、G ¹或G ¹的一部分與它們所連接的氮一起形成環狀部分；或R ³、G ³或G ³的一部分與它們所連接的氮一起形成環狀部分； R ⁴是C ₁-C ₁₂烷基或C ₃-C ₈環烷基； x是0、1或2； n是1或2； m是1或2；並且 其中每個烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、雜環基、芳基、雜芳基、亞烷基、亞烯基、亞環烷基、亞環烯基、亞環炔基、亞雜環基、亞芳基、亞雜芳基和環狀部分獨立地任選地經取代。 在一個實施方案中，所述化合物是表03-1中的化合物，或其藥學上可接受的鹽、前藥或立體異構體。 脂 質 系列 04在一個實施方案中，本文提供了式(04-I)化合物： (04-I)， 或其藥學上可接受的鹽、前藥或立體異構體，其中： G ¹和G ²各自獨立地是鍵、C ₂-C ₁₂亞烷基或C ₂-C ₁₂亞烯基； L ¹是-OC(=O)R ¹、-C(=O)OR ¹、-OC(=O)OR ¹、      -C(=O)R ¹、-OR ¹、-S(O) _xR ¹、-S-SR ¹、-C(=O)SR ¹、     -SC(=O)R ¹、-NR ^aC(=O)R ¹、-C(=O)NR ^bR ^c、-NR ^aC(=O)NR ^bR ^c、-OC(=O)NR ^bR ^c、-NR ^aC(=O)OR ¹、-SC(=S)R ¹、-C(=S)SR ¹、-C(=S)R ¹、-CH(OH)R ¹、-P(=O)(OR ^b)(OR ^c)、-(C ₆-C ₁₀亞芳基)-R ¹、-(6至10元亞雜芳基)-R ¹或R ¹； L ²是-OC(=O)R ²、-C(=O)OR ²、-OC(=O)OR ²、      -C(=O)R ²、-OR ²、-S(O) _xR ²、-S-SR ²、-C(=O)SR ²、     -SC(=O)R ²、-NR ^dC(=O)R ²、-C(=O)NR ^eR ^f、-NR ^dC(=O)NR ^eR ^f、-OC(=O)NR ^eR ^f、-NR ^dC(=O)OR ²、-SC(=S)R ²、-C(=S)SR ²、-C(=S)R ²、-CH(OH)R ²、-P(=O)(OR ^e)(OR ^f)、-(C ₆-C ₁₀亞芳基)-R ²、-(6至10元亞雜芳基)-R ²或R ²； R ¹和R ²各自獨立地是C ₅-C ₃₂烷基或C ₅-C ₃₂烯基； R ^a、R ^b、R ^d和R ^e各自獨立地是H、C ₁-C ₂₄烷基或C ₂-C ₂₄烯基； R ^c和R ^f各自獨立地是C ₁-C ₃₂烷基或C ₂-C ₃₂烯基； R ⁰是C ₁-C ₁₂烷基、C ₂-C ₁₂烯基、C ₃-C ₈環烷基、C ₃-C ₈環烯基、C ₆-C ₁₀芳基或4至8元雜環烷基； G ³是C ₂-C ₁₂亞烷基或C ₂-C ₁₂亞烯基； R ⁴是C ₁-C ₁₂烷基、C ₂-C ₁₂烯基、C ₃-C ₈環烷基、C ₃-C ₈環烯基、C ₆-C ₁₀芳基或4至8元雜環烷基； R ⁵是C ₁-C ₁₂烷基、C ₃-C ₈環烷基、C ₃-C ₈環烯基、C ₆-C ₁₀芳基或4至8元雜環烷基； x是0、1或2； s是0或1；並且 其中每個烷基、烯基、環烷基、環烯基、雜環烷基、芳基、亞烷基、亞烯基、亞芳基和亞雜芳基獨立地任選地經取代。 在一個實施方案中，所述化合物是表04-1中的化合物，或其藥學上可接受的鹽、前藥或立體異構體。 聚合物 結 合的脂 質在一些實施方案中，納米顆粒組合物的脂質組分可包含一種或多種聚合物結合的脂質，諸如聚乙二醇化脂質(PEG脂質)。不受理論束縛，預期納米顆粒組合物中的聚合物結合的脂質組分可改善膠體穩定性和/或減少納米顆粒的蛋白質吸收。可與本公開結合使用的示例性聚合物結合的脂質包括但不限於PEG改性的磷脂醯乙醇胺、PEG改性的磷脂酸、PEG改性的神經醯胺、PEG改性的二烷基胺、PEG改性的二醯基甘油、PEG改性的二烷基甘油和其混合物。舉例來說，PEG脂質可為PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、PEG-DSPE、神經醯胺-PEG2000或Chol-PEG2000。 在一個實施方案中，聚合物結合的脂質是聚乙二醇化脂質。舉例來說，一些實施方案包括聚乙二醇化二醯基甘油(PEG-DAG)，諸如1-(單甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻醯基甘油(PEG-DMG)；聚乙二醇化磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)；PEG琥珀酸酯二醯基甘油(PEG-S-DAG)，諸如4-O-(2’,3’-二(十四烷醯氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)；聚乙二醇化神經醯胺(PEG-cer)；或PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯，諸如ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-二(十四烷氧基)丙基)氨基甲酸酯或2,3-二(十四烷氧基)丙基-N-(ω-甲氧基)(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯。 在一個實施方案中，聚合物結合的脂質以在1.0 mol%至2.5 mol%範圍內的濃度存在。在一個實施方案中，聚合物結合的脂質以約1.7 mol%的濃度存在。在一個實施方案中，聚合物結合的脂質以約1.5 mol%的濃度存在。 在一個實施方案中，陽離子脂質與聚合物結合的脂質的摩爾比在約35:1至約25:1範圍內。在一個實施方案中，陽離子脂質與聚合物結合的脂質的摩爾比在約100:1至約20:1範圍內。 在一個實施方案中，陽離子脂質與聚合物結合的脂質的摩爾比在約35:1至約25:1範圍內。在一個實施方案中，陽離子脂質與聚合物結合的脂質的摩爾比在約100:1至約20:1範圍內。 在一個實施方案中，聚乙二醇化脂質具有下式： (05-I) 或其藥學上可接受的鹽、互變異構體或立體異構體，其中： R ¹²和R ¹³各自獨立地是含有10至30個碳原子的直鏈或支鏈飽和或不飽和烷基鏈，其中所述烷基鏈任選地間雜有一個或多個酯鍵；並且 w具有介於30至60範圍內的平均值。 在一個實施方案中，R ¹²和R ¹³各自獨立地是含有12至16個碳原子的直鏈飽和烷基鏈。在其它實施方案中，w平均值在42至55的範圍內，例如，w平均值是42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55。在一些具體實施方案中，w平均值是約49。 在一個實施方案中，聚乙二醇化脂質具有下式： 其中w平均值是約49。 結構 脂 質 在一些實施方案中，納米顆粒組合物的脂質組分可包含一種或多種結構脂質。不受理論束縛，預期結構脂質可使納米顆粒的兩親結構，諸如但不限於納米顆粒的脂質雙層結構穩定。可與本公開結合使用的示例性結構脂質包括但不限於膽固醇、糞固醇、穀固醇、麥角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜子固醇、番茄鹼、番茄苷、熊果酸、α-生育酚和其混合物。在某些實施方案中，結構脂質是膽固醇。在一些實施方案中，結構脂質包括膽固醇和皮質類固醇(諸如潑尼松龍(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、潑尼松(prednisone)和氫化可的松(hydrocortisone))或其組合。 在一個實施方案中，本文所提供的脂質納米顆粒包含類固醇或類固醇類似物。在一個實施方案中，類固醇或類固醇類似物是膽固醇。在一個實施方案中，類固醇以在39 mol%至49 mol%、40 mol%至46 mol%、40 mol%至44 mol%、40 mol%至42 mol%、42 mol%至44 mol%或44 mol%至46 mol%範圍內的濃度存在。在一個實施方案中，類固醇以40 mol%、41 mol%、42 mol%、43 mol%、44 mol%、45 mol%或46 mol%的濃度存在。 在一個實施方案中，陽離子脂質與類固醇的摩爾比在1.0:0.9至1.0:1.2、或1.0:1.0至1.0:1.2範圍內。在一個實施方案中，陽離子脂質與膽固醇的摩爾比在約5:1至1:1範圍內。在一個實施方案中，類固醇以在32 mol%至40 mol%類固醇範圍內的濃度存在。 在一個實施方案中，陽離子脂質與類固醇的摩爾比在1.0:0.9至1.0:1.2、或1.0:1.0至1.0:1.2範圍內。在一個實施方案中，陽離子脂質與膽固醇的摩爾比在約5:1至1:1範圍內。在一個實施方案中，類固醇以在32 mol%至40 mol%類固醇範圍內的濃度存在。 磷脂在一些實施方案中，納米顆粒組合物的脂質組分可包含一種或多種磷脂，諸如一種或多種(多)不飽和脂質。不受理論束縛，預期磷脂可組裝成一個或多個脂質雙層結構。可形成本發明納米顆粒組合物的一部分的示例性磷脂包括但不限於1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二亞油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DLPC)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-磷酸膽鹼(DMPC)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)、1,2-二(十一烷醯基)-sn-甘油-磷酸膽鹼(DUPC)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(18:0 Diether PC)、1-油醯基-2-膽固醇基半琥珀醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(C16 Lyso PC)、1,2-二亞麻醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼、1,2-二花生四烯醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼、1,2-二(二十二碳六烯醯基)-sn-甘油-3-磷酸膽鹼、1,2-二植烷醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0 PE)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亞油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亞麻醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二(二十二碳六烯醯基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)鈉鹽(DOPG)和鞘磷脂。在某些實施方案中，納米顆粒組合物包含DSPC。在某些實施方案中，納米顆粒組合物包含DOPE。在一些實施方案中，納米顆粒組合物包含DSPC和DOPE二者。 額外示例性中性脂質包括例如二棕櫚醯基磷脂醯甘油(DPPG)、棕櫚醯基油醯基磷脂醯乙醇胺(POPE)和二油醯基磷脂醯乙醇胺4-(N-馬來醯亞胺基甲基)-環己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻醯基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂醯基-磷脂醯乙醇胺(DSPE)、16-O-單甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂醯基-2-油醯基磷脂醯乙醇胺(SOPE)和1,2-二反油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)。在一個實施方案中，中性脂質為1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)。在一個實施方案中，中性脂質選自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM。 在一個實施方案中，中性脂質是磷脂醯膽鹼(PC)、磷脂醯乙醇胺(PE)、磷脂醯絲氨酸(PS)、磷脂酸(PA)或磷脂醯甘油(PG)。 此外，可形成本發明納米顆粒組合物的一部分的磷脂還包括WO2017/112865中所述的那些磷脂，該案的全部內容以引用的方式整體併入本文中。 製劑 根據本公開，本文所述的納米顆粒組合物可包含至少一種脂質組分和一種或多種額外組分，諸如治療劑和/或預防劑(例如，本文所述的治療性核酸)。可針對一種或多種特定應用或標靶來設計納米顆粒組合物。納米顆粒組合物的成分可基於特定應用或標靶，和/或基於一種或多種成分的功效、毒性、費用、易用性、可用性或其它特徵來選擇。類似地，納米顆粒組合物的特定製劑可根據例如每種成分的特定組合的功效和毒性，針對特定應用或標靶來選擇。 納米顆粒組合物的脂質組分可包含例如本文所述的根據式01-I、01-II、02-I、03-I和04-I (及其子式)之一的脂質、磷脂(諸如不飽和脂質，例如DOPE或DSPC)、PEG脂質和結構脂質。脂質組分的成分可以特定的分率提供。 在一個實施方案中，本文提供了納米顆粒組合物，所述納米顆粒組合物包含本文提供的陽離子脂質化合物、治療劑和一種或多種賦形劑。在一個實施方案中，陽離子脂質化合物包含如本文所述的根據式01-I、01-II、02-I、03-I和04-I (及其子式)之一的化合物，以及任選存在的一種或多種其它陽離子脂質化合物。在一個實施方案中，一種或多種賦形劑選自中性脂質、類固醇和聚合物結合的脂質。在一個實施方案中，治療劑被包封在脂質納米顆粒內或與脂質納米顆粒締合。 在一個實施方案中，本文提供了納米顆粒組合物(脂質納米顆粒)，所述納米顆粒組合物包含： i) 介於40 mol%與50 mol%之間的陽離子脂質(即，第一脂質)； ii) 中性脂質(例如，磷脂)； iii) 類固醇； iv) 聚合物結合的脂質(即，第二脂質)；和 v) 治療劑。 如本文所用，“mol%”是指組分相對於LNP中所有脂質組分的總摩爾數(即陽離子脂質、中性脂質、類固醇和聚合物結合的脂質的總摩爾數)的摩爾百分率。 在一個實施方案中，脂質納米顆粒包含約20 mol%至約65 mol%、約30 mol%至約60 mol%、約40 mol%至約55 mol%、45 mol%至50 mol%、50 mol%至55 mol%、55 mol%至60 mol%、60 mol%至65 mol%、40 mol%至45 mol%、35 mol%至40 mol%、30 mol%至35 mol%、25 mol%至30 mol%或20 mol%至25 mol%的陽離子脂質。在一個實施方案中，脂質納米顆粒包含約40 mol%、41 mol%、42 mol%、43 mol%、44 mol%、45 mol%、46 mol%、47 mol%、48 mol%、49 mol%、50 mol%、51 mol%、52 mol%、53 mol%、54 mol%或55 mol%的陽離子脂質。在一個實施方案中，脂質納米顆粒包含約47.5 mol%、47.6 mol%、47.7 mol%、47.8 mol%、47.9 mol%、48.0 mol%、48.1 mol%、48.2 mol%、48.3 mol%、48.4 mol%或48.5 mol%的陽離子脂質。 在一個實施方案中，脂質納米顆粒包含41 mol%至49 mol%、41 mol%至48 mol%、42 mol%至48 mol%、43 mol%至48 mol%、44 mol%至48 mol%、45 mol%至48 mol%、46 mol%至48 mol%或47.2 mol%至47.8 mol%的陽離子脂質。在一個實施方案中，脂質納米顆粒包含約47.0 mol%、47.1 mol%、47.2 mol%、47.3 mol%、47.4 mol%、47.5 mol%、47.6 mol%、47.7 mol%、47.8 mol%、47.9 mol%或48.0 mol%的陽離子脂質。 在一個實施方案中，中性脂質(例如，磷脂)以約5 mol%至約40 mol%、6 mol%至30 mol%、約7 mol%至約20 mol%或8 mol%至15 mol%範圍內的濃度存在。在一個實施方案中，中性脂質(例如，磷脂)以約5 mol%、6 mol%、7 mol%、8 mol%、9 mol%、10 mol%、11 mol%、12 mol%、13 mol%、14 mol%或15 mol%的濃度存在。在一個實施方案中，中性脂質(例如，磷脂)以約9.5 mol%、10 mol%或10.5 mol%的濃度存在。在一個實施方案中，脂質納米顆粒包含約9.5 mol%、9.6 mol%、9.7 mol%、9.8 mol%、9.9 mol%、10.0 mol%、10.1 mol%、10.2 mol%、10.3 mol%、10.4 mol%或10.5 mol%的磷脂。在一個實施方案中，脂質納米顆粒包含約10.0 mol%的磷脂。在一個實施方案中，陽離子脂質與中性脂質(例如，磷脂)的摩爾比在約13:1至約1:2、約10:1至約5:1或約7.5:1至5:1的範圍內。在一個實施方案中，陽離子脂質與中性脂質(例如，磷脂)的摩爾比是7.5:1、7.25:1、7.0:1、6.75:1、6.5:1、6.25:1、6.0:1、5.75:1、5.5:1、5.25:1或5.0:1。在一個實施方案中，陽離子脂質與中性脂質(例如，磷脂)的摩爾比在約4.1:1.0至約4.9:1.0、約4.5:1.0至約4.8:1.0或約4.7:1.0至4.8:1.0的範圍內。 在一個實施方案中，中性脂質以5 mol%至15 mol%、7 mol%至13 mol%或9 mol%至11 mol%範圍內的濃度存在。在一個實施方案中，中性脂質以約9.5 mol%、10 mol%或10.5 mol%的濃度存在。在一個實施方案中，陽離子脂質與中性脂質的摩爾比在約4.1:1.0至約4.9:1.0、約4.5:1.0至約4.8:1.0或約4.7:1.0至4.8:1.0的範圍內。 在一個實施方案中，類固醇以在約20 mol%至約50 mol%、約30 mol%至約45 mol%、約35 mol%至約43 mol%、37 mol%至42 mol%、30 mol%至35 mol%、35 mol%至40 mol%、40 mol%至45 mol%或45 mol%至50 mol%範圍內的濃度存在。在一個實施方案中，類固醇以35 mol%、36 mol%、37 mol%、38 mol%、39 mol%、40 mol%、41 mol%、42 mol%、43 mol%、44 mol%或45 mol%的濃度存在。在一個實施方案中，陽離子脂質與類固醇的摩爾比在1.0:0.9至1.0:1.2或1.0:1.0至1.0:1.2的範圍內。在一個實施方案中，脂質納米顆粒包含約40.0 mol%、40.1 mol%、40.2 mol%、40.3 mol%、40.4 mol%、40.5 mol%、40.6 mol%、40.7 mol%、40.8 mol%、40.9 mol%或41.0 mol%的類固醇。 在一個實施方案中，類固醇以在39 mol%至49 mol%、40 mol%至46 mol%、40 mol%至44 mol%、40 mol%至42 mol%、42 mol%至44 mol%或44 mol%至46 mol%範圍內的濃度存在。在一個實施方案中，類固醇以40 mol%、41 mol%、42 mol%、43 mol%、44 mol%、45 mol%或46 mol%的濃度存在。在一個實施方案中，陽離子脂質與類固醇的摩爾比在1.0:0.9至1.0:1.2或1.0:1.0至1.0:1.2的範圍內。在一個實施方案中，類固醇是膽固醇。 在一個實施方案中，聚合物結合的脂質以在約0.1 mol%至約10 mol%、約0.2 mol%至約7.5 mol%、0.3 mol%至5 mol%、0.4 mol%至2.5 mol%、0.5 mol%至2 mol%或1 mol%至2 mol%範圍內的濃度存在。在一個實施方案中，聚合物結合的脂質以0.5 mol%、0.75 mol%、1 mol%、1.25 mol%、1.5 mol%、1.75 mol%、2 mol%、2.25 mol%或2.5 mol%的濃度存在。在一個實施方案中，脂質納米顆粒包含約1.0 mol%、1.1 mol%、1.2 mol%、1.3 mol%、1.4 mol%、1.5 mol%、1.6 mol%、1.7 mol%、1.8 mol%、1.9 mol%或2.0 mol%的聚合物結合的脂質。 在一個實施方案中，LNP中的治療劑:脂質比(即，N/P，其中N代表陽離子脂質的摩爾數，並且P代表作為核酸主鏈的一部分存在的磷酸酯的摩爾數)在2:1至30:1，例如3:1至22:1的範圍內。在一個實施方案中，N/P在6:1至20:1或2:1至12:1的範圍內。示例性N/P範圍包括約3:1、約6:1、約12:1和約22:1。 在一個實施方案中，本文提供了脂質納米顆粒，所述脂質納米顆粒包含： i) 有效pKa大於6.0的陽離子脂質(即，第一脂質)； ii) 5 mol%至15 mol%的中性脂質(例如，磷脂)； iii) 1 mol%至15 mol%的陰離子脂質； iv) 30 mol%至45 mol%的類固醇； v) 聚合物結合的脂質(即，第二脂質)；和 vi) 治療劑或其藥學上可接受的鹽或前藥， 其中mol%是基於脂質納米顆粒中存在的脂質的總摩爾數確定的。 在一個實施方案中，陽離子脂質可以是在選定pH (諸如生理pH)下攜帶淨正電荷的多種脂質種類中的任一種。示例性陽離子脂質在下文描述。在一個實施方案中，陽離子脂質具有大於6.25的pKa。在一個實施方案中，陽離子脂質具有大於6.5的pKa。在一個實施方案中，陽離子脂質具有大於6.1、大於6.2、大於6.3、大於6.35、大於6.4、大於6.45、大於6.55、大於6.6、大於6.65或大於6.7的pKa。 在一個實施方案中，脂質納米顆粒包含40 mol%至45 mol%的陽離子脂質。在一個實施方案中，脂質納米顆粒包含45 mol%至50 mol%的陽離子脂質。 在一個實施方案中，陽離子脂質與中性脂質的摩爾比在約2:1至約8:1的範圍內。在一個實施方案中，脂質納米顆粒包含5 mol%至10 mol%的中性脂質。 示例性陰離子脂質包括但不限於磷脂醯甘油、二油醯磷脂醯甘油(DOPG)、二棕櫚醯磷脂醯甘油(DPPG)或1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-外消旋-甘油) (DSPG)。 在一個實施方案中，脂質納米顆粒包含1 mol%至10 mol%的陰離子脂質。在一個實施方案中，脂質納米顆粒包含1 mol%至5 mol%的陰離子脂質。在一個實施方案中，脂質納米顆粒包含1 mol%至9 mol%、1 mol%至8 mol%、1 mol%至7 mol%或1 mol%至6 mol%的陰離子脂質。在一個實施方案中，陰離子脂質與中性脂質的摩爾比在1:1至1:10的範圍內。 在一個實施方案中，類固醇是膽固醇。在一個實施方案中，陽離子脂質與膽固醇的摩爾比在約5:1至1:1的範圍內。在一個實施方案中，脂質納米顆粒包含32 mol%至40 mol%的類固醇。 在一個實施方案中，中性脂質的mol%與陰離子脂質的mol%之和在5 mol%至15 mol%的範圍內。在一個實施方案中，其中中性脂質的mol%與陰離子脂質的mol%之和在7 mol%至12 mol%的範圍內。 在一個實施方案中，陰離子脂質與中性脂質的摩爾比在1:1至1:10的範圍內。在一個實施方案中，中性脂質的mol%和類固醇的mol%之和在35 mol%至45 mol%的範圍內。 在一個實施方案中，脂質納米顆粒包含： i) 45 mol%至55 mol%的陽離子脂質； ii) 5 mol%至10 mol%的中性脂質； iii) 1 mol%至5 mol%的陰離子脂質；和 iv) 32 mol%至40 mol%的類固醇。 在一個實施方案中，脂質納米顆粒包含1.0 mol%至2.5 mol%的結合脂質。在一個實施方案中，聚合物結合的脂質以約1.5 mol%的濃度存在。 在一個實施方案中，中性脂質以5 mol%至15 mol%、7 mol%至13 mol%或9 mol%至11 mol%範圍內的濃度存在。在一個實施方案中，中性脂質以約9.5 mol%、10 mol%或10.5 mol%的濃度存在。在一個實施方案中，陽離子脂質與中性脂質的摩爾比在約4.1:1.0至約4.9:1.0、約4.5:1.0至約4.8:1.0或約4.7:1.0至4.8:1.0的範圍內。 在一個實施方案中，類固醇是膽固醇。在一些實施方案中，類固醇以在39 mol%至49 mol%、40 mol%至46 mol%、40 mol%至44 mol%、40 mol%至42 mol%、42 mol%至44 mol%或44 mol%至46 mol%範圍內的濃度存在。在一個實施方案中，類固醇以40 mol%、41 mol%、42 mol%、43 mol%、44 mol%、45 mol%或46 mol%的濃度存在。在某些實施方案中，陽離子脂質與類固醇的摩爾比在1.0:0.9至1.0:1.2或1.0:1.0至1.0:1.2的範圍內。 在一個實施方案中，陽離子脂質與類固醇的摩爾比在5:1至1:1的範圍內。 在一個實施方案中，脂質納米顆粒包含1.0 mol%至2.5 mol%的結合脂質。在一個實施方案中，聚合物結合的脂質以約1.5 mol%的濃度存在。 在一個實施方案中，陽離子脂質與聚合物結合的脂質的摩爾比在約100:1至約20:1的範圍內。在一個實施方案中，陽離子脂質與聚合物結合的脂質的摩爾比在約35:1至約25:1的範圍內。 在一個實施方案中，陽離子脂質與聚合物結合的脂質的摩爾比在約100:1至約20:1的範圍內。在一個實施方案中，陽離子脂質與聚合物結合的脂質的摩爾比在約35:1至約25:1的範圍內。 在一個實施方案中，脂質納米顆粒具有在50 nm至100 nm或60 nm至85 nm範圍內的平均直徑。在一個實施方案中，所述組合物包含本文提供的陽離子脂質、DSPC、膽固醇和PEG-脂質以及mRNA。 在一個實施方案中，所述組合物包含：約20 mol%至約65 mol%的第一脂質；約5 mol%至約40 mol%的磷脂；約20 mol%至約50 mol%的類固醇；和聚合物結合的脂質。 在一個實施方案中，所述組合物包含：約40 mol%至約55 mol%的第一脂質；(ii)約5 mol%至約15 mol%的磷脂；(iii)約35 mol%至約50 mol%的類固醇；和(iv)約2 mol%至約10 mol%的聚合物結合的脂質。 在一個實施方案中，所述組合物包含：(i)約45 mol%至約55 mol%的第一脂質；(ii)約6 mol%至約10 mol%的磷脂；(iii)約40 mol%至約48 mol%的類固醇；和(iv)約1 mol%至約2.5 mol%的聚合物結合的脂質。 在一個實施方案中，本文提供的陽離子脂質、DSPC、膽固醇和PEG-脂質處於約50:10:38.5:1.5的摩爾比。 可針對一種或多種特定應用或標靶來設計納米顆粒組合物。舉例來說，納米顆粒組合物可設計成用於將治療劑和/或預防劑，諸如RNA遞送至哺乳動物體內的特定細胞、組織、器官或系統或其群組。納米顆粒組合物的物理化學特性可經改變以增加對特定身體標靶的選擇性。舉例來說，可基於不同器官的開窗大小來調整粒徑。納米顆粒組合物中所包含的治療劑和/或預防劑還可基於一個或多個所需的遞送標靶進行選擇。舉例來說，治療劑和/或預防劑可針對特定適應症、疾患、疾病或病症和/或針對遞送至特定細胞、組織、器官或系統或其群組(例如局部或特異性遞送)進行選擇。在某些實施方案中，納米顆粒組合物可包含編碼目標多肽的mRNA，其能夠在細胞內翻譯以產生目標多肽。此類組合物可設計成特異性遞送至特定器官。在某些實施方案中，組合物可設計成特異性遞送至哺乳動物肝臟。 納米顆粒組合物中治療劑和/或預防劑的量可取決於納米顆粒組合物的大小、組成、期望標靶和/或應用，或其它特性，以及治療劑和/或預防劑的特性。舉例來說，可用於納米顆粒組合物中的RNA的量可取決於RNA的大小、序列和其它特徵。納米顆粒組合物中治療劑和/或預防劑和其它成分(例如脂質)的相對量還可變化。在一些實施方案中，納米顆粒組合物中脂質組分與治療劑和/或預防劑的wt/wt比率可為約5:1至約60:1，諸如為約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、22:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1和60:1。舉例來說，脂質組分與治療劑和/或預防劑的wt/wt比率可為約10:1至約40:1。在某些實施方案中，wt/wt比率為約20:1。納米顆粒組合物中治療劑和/或預防劑的量可例如使用吸收光譜法(例如紫外-可見光譜法)測量。 在一些實施方案中，納米顆粒組合物包含一種或多種RNA，並且可選擇一種或多種RNA、脂質和其量來提供特定N:P比。組合物的N:P比是指一種或多種脂質中的氮原子與RNA中磷酸酯基的數量的摩爾比。在一些實施方案中，選擇較低的N:P比。可選擇一種或多種RNA、脂質和其量以提供約2:1至約30:1，諸如2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、12:1、14:1、16:1、18:1、20:1、22:1、24:1、26:1、28:1或30:1的N:P比。在某些實施方案中，N:P比可為約2:1至約8:1。在其它實施方案中，N:P比為約5:1至約8:1。舉例來說，N:P比可為約5.0:1、約5.5:1、約5.67:1、約6.0:1、約6.5:1或約7.0:1。舉例來說，N:P比可為約5.67:1。 納米顆粒組合物的物理特性可取決於其組分。舉例來說，包含膽固醇作為結構脂質的納米顆粒組合物可具有與包含不同結構脂質的納米顆粒組合物不同的特徵。類似地，納米顆粒組合物的特徵可取決於其組分的絕對或相對量。舉例來說，包含較高摩爾分率的磷脂的納米顆粒組合物可具有與包含較低摩爾分率的磷脂的納米顆粒組合物不同的特徵。特徵還可根據納米顆粒組合物的製備方法和條件而變化。 納米顆粒組合物可通過多種方法表徵。舉例來說，可使用顯微術(例如透射電子顯微術或掃描電子顯微術)來檢查納米顆粒組合物的形態和大小分佈。可使用動態光散射或電位測定法(例如電位滴定法)來測量ζ電位。動態光散射還可用於確定粒徑。還可使用儀器，諸如Zetasizer Nano ZS (Malvem Instruments Ltd, Malvem, Worcestershire, UK)來測量納米顆粒組合物的多個特徵，諸如粒徑、多分散性指數和ζ電位。 在各個實施方案中，納米顆粒組合物的平均大小可在數十納米至數百納米之間。舉例來說，平均大小可為約40 nm至約150 nm，諸如約40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、105 nm、110 nm、115 nm、120 nm、125 nm、130 nm、135 nm、140 nm、145 nm或150 nm。在一些實施方案中，納米顆粒組合物的平均大小可為約50 nm至約100 nm、約50 nm至約90 nm、約50 nm至約80 nm、約50 nm至約70 nm、約50 nm至約60 nm、約60 nm至約100 nm、約60 nm至約90 nm、約60 nm至約80 nm、約60 nm至約70 nm、約70 nm至約100 nm、約70 nm至約90 nm、約70 nm至約80 nm、約80 nm至約100 nm、約80 nm至約90 nm、或約90 nm至約100 nm。在某些實施方案中，納米顆粒組合物的平均大小可為約70 nm至約100 nm。在一些實施方案中，平均大小可為約80 nm。在其它實施方案中，平均大小可為約100 nm。 納米顆粒組合物可為相對均質的。多分散性指數可用於指示納米顆粒組合物的均質性，例如納米顆粒組合物的粒徑分佈。小的(例如小於0.3)的多分散性指數一般指示窄的粒徑分佈。納米顆粒組合物的多分散性指數可為約0至約0.25，諸如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25。在一些實施方案中，納米顆粒組合物的多分散性指數可為約0.10至約0.20。 納米顆粒組合物的ζ電位可用於指示組合物的動電位。舉例來說，ζ電位可描述納米顆粒組合物的表面電荷。具有相對較低正或負電荷的納米顆粒組合物一般是期望的，這是因為帶較高電荷的物質可與體內的細胞、組織和其它成分發生不期望的相互作用。在一些實施方案中，納米顆粒組合物的ζ電位可為約-10 mV至約+20 mV、約-10 mV至約+15 mV、約-10 mV至約+10 mV、約-10 mV至約+5 mV、約-10 mV至約0 mV、約-10 mV至約-5 mV、約-5 mV至約+20 mV、約-5 mV至約+15 mV、約-5 mV至約+10 mV、約-5 mV至約+5 mV、約-5 mV至約0 mV、約0 mV至約+20 mV、約0 mV至約+15 mV、約0 mV至約+10 mV、約0 mV至約+5 mV、約+5 mV至約+20 mV、約+5 mV至約+15 mV或約+5 mV至約+10 mV。 治療劑和/或預防劑的包封效率描述相對於所提供的初始量，在製備後經納米顆粒組合物包封或以其它方式與納米顆粒組合物締合的治療劑和/或預防劑的量。包封效率期望較高(例如接近100%)。包封效率可例如通過比較在用一種或多種有機溶劑或清潔劑破壞納米顆粒組合物之前與之後含有納米顆粒組合物的溶液中治療劑和/或預防劑的量來測量。螢光可用於測量溶液中游離治療劑和/或預防劑(例如RNA)的量。對於本文所述的納米顆粒組合物，治療劑和/或預防劑的包封效率可為至少50%，例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施方案中，包封效率可為至少80%。在某些實施方案中，包封效率可為至少90%。 納米顆粒組合物可任選地包含一種或多種包衣。舉例來說，可將納米顆粒組合物配製成具有包衣的膠囊、膜片或片劑。包含本文所述組合物的膠囊、膜片或片劑可具有任何有用的大小、抗拉強度、硬度或密度。 藥 物 組 合物根據本公開，納米顆粒組合物可整體或部分地配製成藥物組合物。藥物組合物可包含一種或多種納米顆粒組合物。舉例來說，藥物組合物可包含一種或多種納米顆粒組合物，所述一種或多種納米顆粒組合物包含一種或多種不同的治療劑和/或預防劑。藥物組合物還可包含一種或多種藥學上可接受的賦形劑或輔助成分，諸如本文所述的那些。關於藥物組合物和劑的配製和製造的一般指南可例如在Remington，The Science and Practice of Pharmacy，第21版，A. R. Gennaro; Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, Md., 2006中獲得。常規賦形劑和輔助成分可用於任何藥物組合物中，除非任何常規賦形劑或輔助成分與納米顆粒組合物的一種或多種組分不相容。如果賦形劑或輔助成分與納米顆粒組合物的組分的組合會導致任何不希望的生物效應或其它有害效應，則賦形劑或輔助成分與納米顆粒組合物的組分不相容。 在一些實施方案中，一種或多種賦形劑或輔助成分可構成包含納米顆粒組合物的藥物組合物的總品質或體積的大於50%。舉例來說，一種或多種賦形劑或輔助成分可構成藥物組合物的50%、60%、70%、80%、90%或更高百分比。在一些實施方案中，藥學上可接受的賦形劑為至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%純。在一些實施方案中，賦形劑經批准用於人類和獸醫用途。在一些實施方案中，賦形劑得到美國食品與藥物管理局批准。在一些實施方案中，賦形劑是醫藥級的。在一些實施方案中，賦形劑符合美國藥典(USP)、歐洲藥典(EP)、英國藥典和/或國際藥典的標準。 根據本公開的藥物組合物中的一種或多種納米顆粒組合物、一種或多種藥學上可接受的賦形劑和/或任何額外成分的相對量將取決於所治療受試者的身份、體格和/或狀況並且進一步取決於組合物的施用途徑而變化。舉例來說，藥物組合物可包含在0.1%與100% (wt/wt)之間的一種或多種納米顆粒組合物。 在某些實施方案中，本公開的納米顆粒組合物和/或藥物組合物經冷藏或冷凍儲存和/或運輸(例如在4℃或更低溫度下，諸如在約-150℃與約0℃之間或在約-80℃與約 -20℃之間(例如約-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、  -30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、   -130℃或-150℃)的溫度下儲存)。舉例來說，包含式01-I、01-II、02-I、03-I和04-I (及其子式)中任一者的化合物的藥物組合物是在例如約-20℃、30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下冷藏儲存和/或運輸的溶液。在某些實施方案中，本公開還涉及一種增加包含式01-I、01-II、02-I、03-I和04-I (及其子式)中任一者的化合物的納米顆粒組合物和/或藥物組合物的穩定性的方法，其通過將所述納米顆粒組合物和/或藥物組合物儲存於4℃或更低溫度下，諸如在約-150℃與約0℃之間或在約-80℃與約-20℃之間的溫度，例如約-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、 -30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、   -130℃或-150℃來進行。舉例來說，本文所公開的納米顆粒組合物和/或藥物組合物在例如4℃或更低(例如約4℃與 -20℃之間)的溫度下穩定保持約至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少1個月、至少2個月、至少4個月、至少6個月、至少8個月、至少10個月、至少12個月、至少14個月、至少16個月、至少18個月、至少20個月、至少22個月或至少24個月。在一個實施方案中，製劑在約4℃下穩定保持至少4周。在某些實施方案中，本公開的藥物組合物包含本文所公開的納米顆粒組合物和藥學上可接受的載體，所述載體選自以下中的一種或多種：Tris、乙酸鹽(例如乙酸鈉)、檸檬酸鹽(例如檸檬酸鈉)、生理食鹽水、PBS和蔗糖。在某些實施方案中，本公開的藥物組合物的pH值在約7與8之間(例如6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0，或在7.5與8之間或在7與7.8之間)。舉例來說，本公開的藥物組合物包含本文所公開的納米顆粒組合物、Tris、生理食鹽水和蔗糖，並且具有約7.5-8的pH值，其適於在例如約-20℃下儲存和/或運輸。舉例來說，本公開的藥物組合物包含本文所公開的納米顆粒組合物和PBS，並且具有約7-7.8的pH值，其適於在例如約4℃或更低溫度下儲存和/或運輸。在本公開的上下文中，“穩定性”、“穩定化”和“穩定的”是指本文所公開的納米顆粒組合物和/或藥物組合物在給定製造、製備、轉運、儲存和/或使用條件下，例如當施加應力，諸如剪切力、冷凍/解凍應力等時，對化學或物理變化(例如降解、粒徑變化、聚集、包封的變化等)具有抗性。 可將納米顆粒組合物和/或包含一種或多種納米顆粒組合物的藥物組合物施用於任何患者或受試者，包括可受益於通過將治療劑和/或預防劑遞送至一種或多種特定細胞、組織、器官或系統或其群組，諸如腎臟系統所提供的治療效應的患者或受試者。儘管本文所提供的關於納米顆粒組合物和包含納米顆粒組合物的藥物組合物的描述主要針對適於施用於人類的組合物，但本領域技術人員應理解，此類組合物一般適於施用於任何其它哺乳動物。為了使組合物適於施用於各種動物而對適於施用於人類的組合物的改進是眾所周知的，並且有普通技術的獸醫藥理學家僅通過普通實驗(如果有的話)即可設計和/或進行此類改進。經考慮，施用組合物的受試者包括但不限於人類、其它靈長類動物和其它哺乳動物，包括商業上相關的哺乳動物，諸如牛、豬、馬、綿羊、貓、狗、小鼠和/或大鼠。 包含一種或多種納米顆粒組合物的藥物組合物可通過藥理學領域中已知或以後將開發的任何方法製備。一般來說，此類製備方法包括使活性成分與賦形劑和/或一種或多種其它輔助成分結合，並且接著，如果需要或必要，則將產物分成、成型成和/或包裝成所需的單劑量或多劑量單元。 根據本公開的藥物組合物可以散裝、作為單次單位劑量和/或作為多個單次單位劑量製備、包裝和/或出售。如本文所用，“單位劑量”是包含預定量的活性成分(例如納米顆粒組合物)的藥物組合物的離散量。活性成分的量一般等於將被施用受試者的活性成分的劑量和/或這個劑量的便利部分，諸如這個劑量的一半或三分之一。 藥物組合物可製備成適合多種施用途徑和方法的多種形式。舉例來說，藥物組合物可製備成液體劑型(例如乳液、微乳液、納米乳液、溶液、懸浮液、糖漿和酏劑)、可注射形式、固體劑型(例如膠囊、片劑、丸劑、粉劑和顆粒劑)、用於局部和/或經皮施用的劑型(例如軟膏、糊劑、乳膏、洗劑、凝膠劑、粉劑、溶液、噴霧劑、吸入劑和貼片)、懸浮液、粉劑和其它形式。 經口和胃腸外施用的液體劑型包括但不限於藥學上可接受的乳液、微乳液、納米乳液、溶液、懸浮液、糖漿和/或酏劑。除活性成分外，液體劑型還可包含此項技術中常用的惰性稀釋劑，例如水或其它溶劑、增溶劑和乳化劑，諸如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺、油類(尤其為棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和脫水山梨醇脂肪酸酯，以及其混合物。除惰性稀釋劑外，經口組合物還可包含額外治療劑和/或預防劑、額外劑，諸如潤濕劑、乳化劑和助懸劑、甜味劑、調味劑和/或芳香劑。在供胃腸外施用的某些實施方案中，將組合物與增溶劑混合，所述增溶劑諸如為Cremophor™、醇、油、改性油、二醇、聚山梨醇酯、環糊精、聚合物和/或其組合。 可注射製劑，例如無菌可注射水性或油性懸浮液，可根據已知技術，使用適合分散劑、潤濕劑和/或助懸劑來配製。無菌可注射製劑可為在無毒胃腸外可接受的稀釋劑和/或溶劑中的無菌可注射溶液、懸浮液和/或乳液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的媒介物和溶劑包括水、林格氏溶液(U.S.P.)和等滲氯化鈉溶液。無菌不揮發性油通常用作溶劑或懸浮介質。出於這個目的，可使用任何溫和的不揮發性油，包括合成單酸甘油酯或二酸甘油酯。諸如油酸的脂肪酸可用於製備可注射劑。 可注射製劑可經滅菌，例如通過經由細菌截留篩檢程式過濾，和/或通過摻入呈無菌固體組合物形式的滅菌劑來滅菌，所述滅菌劑可在使用前溶解或分散於無菌水或其它無菌可注射介質中。 本公開提供向哺乳動物細胞或器官遞送治療劑和/或預防劑，在哺乳動物細胞中產生目標多肽，以及治療有需要的哺乳動物的疾病或病症的方法，所述方法包括向哺乳動物施用包含治療劑和/或預防劑的納米顆粒組合物和/或使哺乳動物細胞與所述納米顆粒組合物接觸。 方法 在一個方面，本文還提供了用於控制、預防和治療受試者中由RV或由感染RV引起的疾病或病症的方法。在一些實施方案中，用本文所述的方法控制、預防或治療的疾病或病症是由RV或由感染RV引起的。 在具體實施方案中，用本文所述的方法控制、預防或治療的疾病或病症是狂犬病。 在一些實施方案中，本發明的用於控制、預防和治療受試者中由RV或由感染RV引起的疾病或病症的方法包括向所述受試者施用治療有效量的如本文所述的治療性核酸。在具體實施方案中，治療性核酸是如本文所述的mRNA分子。 在一些實施方案中，本發明的用於控制、預防和治療受試者中由RV或由感染RV引起的疾病或病症的方法包括向所述受試者施用治療有效量的包含如本文所述的治療性核酸的治療性組合物。在具體實施方案中，治療性核酸是如本文所述的mRNA分子。 在一些實施方案中，本發明的用於控制、預防和治療受試者中由RV或由感染RV引起的疾病或病症的方法包括向所述受試者施用治療有效量的包含如本文所述的治療性核酸的疫苗組合物。在具體實施方案中，治療性核酸是如本文所述的mRNA分子。 在一些實施方案中，本發明的用於控制、預防和治療受試者中由RV或由感染RV引起的疾病或病症的方法包括向所述受試者施用治療有效量的包含如本文所述的治療性核酸的含脂質組合物。在具體實施方案中，治療性核酸是如本文所述的mRNA分子。 在一些實施方案中，本發明的用於控制、預防和治療受試者中由RV或由感染RV引起的疾病或病症的方法包括向所述受試者施用治療有效量的包含如本文所述的治療性核酸的含脂質組合物，其中所述含脂質組合物被配製為將所述治療性核酸包封在脂質殼中的脂質納米顆粒。在具體實施方案中，治療性核酸是如本文所述的mRNA分子。在具體實施方案中，受試者中的細胞在施用後有效攝取本文所述的含脂質組合物(例如，脂質納米顆粒)。在具體實施方案中，本文所述的含脂質組合物(例如，脂質納米顆粒)被受試者的細胞內吞。 在一些實施方案中，在向有需要的受試者施用如本文所述的治療性核酸、包含本文所述的治療性核酸的疫苗組合物、包含本文所述的治療性核酸的含脂質組合物(例如，脂質納米顆粒)後，受試者中的細胞攝取並表達所施用的治療性核酸以產生由所述核酸編碼的肽或多肽。在一些實施方案中，所編碼的肽或多肽源自引起通過所述方法控制、預防或治療的疾病或病症的RV。 免疫反 應 在一些實施方案中，在向有需要的受試者施用如本文所述的治療性核酸、包含本文所述的治療性核酸的疫苗組合物、包含本文所述的治療性核酸的含脂質組合物(例如，脂質納米顆粒)後，在所述受試者中引發針對RV的一種或多種免疫反應。在一些實施方案中，所引發的免疫反應包括針對RV的一種或多種適應性免疫反應。在一些實施方案中，所引發的免疫反應包括針對RV的一種或多種先天性免疫反應。一種或多種免疫反應可呈例如抗體反應(體液反應)或細胞免疫反應例如細胞因數分泌(例如，干擾素-γ)、輔助活性或細胞毒性的形式。在一些實施方案中，誘導、啟動和/或增強啟動標誌物在免疫細胞上的表達、共刺激受體在免疫細胞上的表達、共刺激受體的配體的表達、細胞因數分泌、免疫細胞(例如，T淋巴細胞、B淋巴細胞和/或NK細胞)對被感染細胞的浸潤、產生特異性地識別一種或多種病毒蛋白(例如，由治療性核酸編碼的病毒肽或蛋白質)的抗體、效應子功能、T細胞啟動、T細胞分化、T細胞增殖、B細胞分化、B細胞增殖和/或NK細胞增殖。在一些實施方案中，抑制骨髓來源的抑制細胞(MDSC)和Treg細胞的啟動和增殖。 在一些實施方案中，在向有需要的受試者施用如本文所述的治療性核酸、包含本文所述的治療性核酸的疫苗組合物、包含本文所述的治療性核酸的含脂質組合物(例如，脂質納米顆粒)後。 在一些實施方案中，在向有需要的受試者施用如本文所述的治療性核酸、包含本文所述的治療性核酸的疫苗組合物、包含本文所述的治療性核酸的含脂質組合物(例如，脂質納米顆粒)後，受試者中產生細胞因數的一個或多個淋巴細胞群體增加。在一些實施方案中，淋巴細胞是CD4+ T細胞和/或CD8+ T細胞。在一些實施方案中，細胞因數是IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6中的一種或多種。在一些實施方案中，表達IFN-g和IL-2的CD4+細胞的比例增加。在一些實施方案中，表達IL-4的CD4+細胞的比例增加。在一些實施方案中，表達IFN-g和IL-2的CD8+細胞的比例增加。在一些實施方案中，表達IL-6的淋巴細胞如T細胞和巨噬細胞的比例增加。 在具體實施方案中，中和抗體特異性地結合至RV G蛋白的一個或多個表位，並抑制或降低一種或多種G蛋白的功能或活性。 在具體實施方案中，中和抗體結合至病毒顆粒或被感染細胞表面上存在的一種或多種病毒蛋白，並標記所述病毒顆粒或被感染細胞以被受試者的免疫系統破壞。在一些實施方案中，誘導或增強白細胞(例如，巨噬細胞)對病毒顆粒的內吞作用。在一些實施方案中，誘導或增強受試者中針對被感染細胞的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)。在一些實施方案中，誘導或增強受試者中針對被感染細胞的抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。在一些實施方案中，誘導或增強受試者中針對被感染細胞的補體依賴性細胞毒性(CDC)。 組 合 療 法 在一些實施方案中，本公開的組合物還可包含一種或多種額外治療劑。在一些實施方案中，額外治療劑是能夠增強組合物(例如，基因疫苗)的免疫原性的佐劑。在一些實施方案中，額外治療劑是增強受試者中的免疫反應的免疫調節劑。在一些實施方案中，組合物中的佐劑和治療性核酸可在引發受試者的免疫反應中具有協同作用。 在一些實施方案中，額外治療劑和本公開的治療性核酸可共同配製在一種組合物中。例如，可將額外治療劑配製為包含本公開的治療性核酸的組合物的一部分。或者，在一些實施方案中，額外治療劑和本公開的治療性核酸可被配製為單獨的組合物或劑量單位，以用於依序或同時向受試者共同施用。 在特定實施方案中，本公開的治療性核酸被配製為如上所述的含脂質組合物的一部分，並且額外治療劑被配製為單獨的組合物。在特定實施方案中，本公開的治療性核酸被配製為如上所述的含脂質組合物的一部分，其中額外治療劑也被配製為含脂質組合物的一部分。 在特定實施方案中，配製本公開的治療性核酸，使得治療性核酸被包封在如上所述的脂質納米顆粒的脂質殼中，並且額外治療劑被配製為單獨的組合物。在特定實施方案中，配製本公開的治療性核酸，使得治療性核酸被包封在如上所述的脂質納米顆粒的脂質殼中，其中脂質納米顆粒還包封額外治療劑分子或編碼額外治療劑分子的核酸。在特定實施方案中，配製本公開的治療性核酸，使得治療性核酸被包封在如上所述的脂質納米顆粒的脂質殼中，其中脂質納米顆粒和額外治療劑被配製為單一組合物。 在具體實施方案中，額外治療劑是佐劑。在一些實施方案中，佐劑包含在疫苗接種受試者中促進樹突細胞(DC)成熟的劑，諸如但不限於脂多糖、TNF-α或CD40配體。在一些實施方案中，佐劑是被疫苗接種受試者的免疫系統識別為“危險信號”的劑，諸如LPS、GP96等。 在一些實施方案中，佐劑包含免疫刺激性細胞因數，諸如但不限於IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、INF-α、IFN-β、INF-γ、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、LT-β或TNF-α，生長因數諸如hGH。 在一些實施方案中，佐劑包含已知為能夠引發先天性免疫反應的化合物。這種化合物的一種示例性類別是Toll樣受體配體，諸如人Toll樣受體TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10的配體，以及鼠Toll樣受體TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12或TLR13的配體。此類化合物的另一種示例性類別是免疫刺激性核酸，諸如含有CpG基序的寡核苷酸。含CpG核酸可以是DNA (CpG-DNA)或RNA (CpG-RNA)分子。CpG-RNA或CpG-DNA可以是單鏈CpG-DNA (ss CpG-DNA)、雙鏈CpG-DNA (dsDNA)、單鏈CpG-RNA (ss CpG-RNA)或雙鏈CpG-RNA (ds CpG-RNA)。在一些實施方案中，CpG核酸呈CpG-RNA的形式。在特定實施方案中，CpG核酸呈單鏈CpG-RNA (ss CpG-RNA)的形式。在一些實施方案中，CpG核酸含有至少一個或多個(促有絲分裂)胞嘧啶/鳥嘌呤二核苷酸序列(CpG基序)。在一些實施方案中，包含在這些序列中的至少一個CpG基序(即，形成CpG基序的C (胞嘧啶)和/或G (鳥嘌呤))未被甲基化。 在一些實施方案中，額外治療劑是啟動、加強或恢復正常免疫功能的免疫調節劑。在具體實施方案中，免疫調節劑是免疫細胞，諸如T淋巴細胞、NK細胞或抗原呈遞細胞(例如，樹突細胞或巨噬細胞)的共刺激信號的激動劑。在具體實施方案中，免疫調節劑是免疫細胞，諸如T淋巴細胞、NK細胞或抗原呈遞細胞(例如，樹突細胞或巨噬細胞)的抑制信號的拮抗劑。 本領域技術人員已知的各種免疫細胞刺激劑可與本公開結合使用。在某些實施方案中，共刺激信號的激動劑是在免疫細胞諸如T淋巴細胞(例如，CD4 +或CD8+ T淋巴細胞)、NK細胞和/或抗原呈遞細胞(例如，樹突細胞或巨噬細胞)上發現的共刺激分子(例如，共刺激受體)的激動劑。共刺激分子的具體實例包括糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因數受體(GITR)、誘導型T細胞共刺激物(ICOS或CD278)、OX40 (CD134)、CD27、CD28、4-IBB (CD137)、CD40、淋巴毒素α (LTα)、LIGHT (類淋巴毒素，表現出誘導型表達，並與單純皰疹病毒糖蛋白D競爭HVEM (由T淋巴細胞表達的受體))、CD226、細胞毒性和調控性T細胞分子(CRT AM)、死亡受體3 (DR3)、淋巴毒素β受體(LTBR)、跨膜啟動因數和CAML交互因數(transmembrane activator and CAML interactor，TACI)、B細胞啟動因數受體(BAFFR)和B細胞成熟蛋白(BCMA)。 在具體實施方案中，共刺激受體的激動劑是特異性地結合至所述共刺激受體的抗體或其抗原結合片段。共刺激受體的具體實例包括GITR、ICOS、OX40、CD27、CD28、4-1BB、CD40、LTα、LIGHT、CD226、CRT AM、DR3、LTBR、TACI、BAFFR和BCMA。在某些具體實施方案中，抗體是單克隆抗體。在其它具體實施方案中，抗體是sc-Fv。在一個具體實施方案中，抗體是結合至免疫細胞上的兩個受體的雙特異性抗體。在其它實施方案中，雙特異性抗體結合至免疫細胞上的受體和病毒感染的患病細胞上的另一受體。在具體實施方案中，抗體是人或人源化抗體。 在另一實施方案中，共刺激受體的激動劑是共刺激受體的配體或其功能衍生物。在某些實施方案中，配體是天然配體的片段。天然配體的具體實例包括ICOSL、B7RP1、CD137L、OX40L、CD70、皰疹病毒侵入介體(HVEM)、CD80和CD86。編碼天然配體的核苷酸序列以及天然配體的氨基酸序列是本領域已知的。 在具體實施方案中，拮抗劑是在免疫細胞例如T淋巴細胞(例如，CD4+或CD8+ T淋巴細胞)、NK細胞和/或抗原呈遞細胞(例如，樹突細胞或巨噬細胞)上發現的抑制性分子(例如，抑制性受體)的拮抗劑。抑制性分子的具體實例包括細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4 (CTLA-4或CD52)、程式性細胞死亡蛋白1 (PD1或CD279)、B和T淋巴細胞減毒劑(BTLA)、殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)、淋巴細胞啟動基因3 (LAG3)、T細胞膜蛋白3 (TIM3)、CD 160、腺苷A2a受體(A2aR)、具有免疫球蛋白和ITIM結構域的T細胞免疫受體(TIGIT)、白細胞相關的免疫球蛋白樣受體1 (LAIR1)和CD 160。 在另一實施方案中，抑制性受體的拮抗劑是與抑制性受體的天然配體特異性結合並阻止天然配體與抑制性受體結合和轉導抑制信號的抗體(或抗原結合片段)。在某些具體實施方案中，抗體是單克隆抗體。在其它具體實施方案中，抗體是sc-Fv。在一個具體實施方案中，抗體是結合至免疫細胞上的兩個受體的雙特異性抗體。在其它實施方案中，雙特異性抗體結合至免疫細胞上的受體和病毒感染的患病細胞上的另一受體。在具體實施方案中，抗體是人或人源化抗體。 在另一實施方案中，抑制性受體的拮抗劑是可溶性受體或其功能衍生物，所述可溶性受體或其功能衍生物與抑制性受體的天然配體特異性結合並阻止天然配體與抑制性受體結合和轉導抑制信號。抑制性受體的天然配體的具體實例包括PDL-1、PDL-2、B7-H3、B7-H4、HVEM、Gal9和腺苷。結合至天然配體的抑制性受體的具體實例包括CTLA-4、PD-1、BTLA、KIR、LAG3、TIM3和A2aR。 在另一實施方案中，抑制性受體的拮抗劑是與抑制性受體結合但不轉導抑制信號的抗體(或抗原結合片段)或配體。抑制性受體的具體實例包括CTLA-4、PD1、BTLA、KIR、LAG3、TIM3和A2aR。在某些具體實施方案中，抗體是單克隆抗體。在其它具體實施方案中，抗體是scFv。在特定實施方案中，抗體是人或人源化抗體。抑制性受體的抗體的具體實例是抗CTLA-4抗體(Leach DR,等人，Science 1996; 271: 1734-1736)。抑制性受體的抗體的另一個實例是抗PD-1抗體(Topalian SL, NEJM 2012; 28:3167-75)。 患者群 體 在一些實施方案中，將本文所述的治療性核酸、包含本文所述的治療性核酸的疫苗組合物、包含本文所述的治療性核酸的含脂質組合物(例如，脂質納米顆粒)或本文所述的組合療法施用於有需要的受試者。 在一些實施方案中，將本文所述的治療性核酸、包含本文所述的治療性核酸的疫苗組合物、包含本文所述的治療性核酸的含脂質組合物(例如，脂質納米顆粒)或本文所述的組合療法施用於人受試者。在一些實施方案中，施用本文所述的治療性核酸、包含本文所述的治療性核酸的疫苗組合物、包含本文所述的治療性核酸的含脂質組合物(例如，脂質納米顆粒)或本文所述的組合療法的受試者是老年人。在一些實施方案中，施用本文所述的治療性核酸、包含本文所述的治療性核酸的疫苗組合物、包含本文所述的治療性核酸的含脂質組合物(例如，脂質納米顆粒)或本文所述的組合療法的受試者是人類成人。在一些實施方案中，施用本文所述的治療性核酸、包含本文所述的治療性核酸的疫苗組合物、包含本文所述的治療性核酸的含脂質組合物(例如，脂質納米顆粒)或本文所述的組合療法的受試者是人類兒童。在一些實施方案中，施用本文所述的治療性核酸、包含本文所述的治療性核酸的疫苗組合物、包含本文所述的治療性核酸的含脂質組合物(例如，脂質納米顆粒)或本文所述的組合療法的受試者是人類幼兒。在一些實施方案中，施用本文所述的治療性核酸、包含本文所述的治療性核酸的疫苗組合物、包含本文所述的治療性核酸的含脂質組合物(例如，脂質納米顆粒)或本文所述的組合療法的受試者是人類嬰兒。 在一些實施方案中，施用本文所述的治療性核酸、包含本文所述的治療性核酸的疫苗組合物、包含本文所述的治療性核酸的含脂質組合物(例如，脂質納米顆粒)或本文所述的組合療法的受試者是非人哺乳動物。 在一些實施方案中，施用本文所述的治療性核酸、包含本文所述的治療性核酸的疫苗組合物、包含本文所述的治療性核酸的含脂質組合物(例如，脂質納米顆粒)或本文所述的組合療法的受試者是表現出至少一種與RV感染相關的症狀的受試者。在一些實施方案中，接受施用本文所述的治療性核酸、包含本文所述的治療性核酸的疫苗組合物、包含本文所述的治療性核酸的含脂質組合物(例如，脂質納米顆粒)或本文所述的組合療法的受試者表現出狂犬病的一種或多種症狀。 在一些實施方案中，將本文所述的治療性核酸、包含本文所述的治療性核酸的疫苗組合物、包含本文所述的治療性核酸的含脂質組合物(例如，脂質納米顆粒)或如本文所述的組合療法施用於無RV感染症狀的受試者。 在一些實施方案中，將本文所述的治療性核酸、包含本文所述的治療性核酸的疫苗組合物、包含本文所述的治療性核酸的含脂質組合物(例如，脂質納米顆粒)或本文所述的組合療法施用於處於RV感染風險中或對RV感染易感的受試者。在一些實施方案中，處於RV感染風險中或對RV感染易感的受試者是老年人。在一些實施方案中，處於RV感染風險中或對RV感染易感的受試者是人類成人。在一些實施方案中，處於RV感染風險中或對RV感染易感的受試者是人類兒童。在一些實施方案中，處於RV感染風險中或對RV感染易感的受試者是人類幼兒。在一些實施方案中，處於RV感染風險中或對RV感染易感的受試者是人類嬰兒。在一些實施方案中，處於RV感染風險中或對RV感染易感的受試者是具有影響受試者的免疫系統的現有健康疾患的人受試者。在一些實施方案中，處於RV感染風險中或對RV感染易感的受試者是具有影響受試者的主要器官的現有健康疾患的人受試者。在一些實施方案中，處於RV感染風險中或對RV感染易感的受試者是具有影響受試者的肺功能的現有健康疾患的人受試者。在一些實施方案中，處於RV感染風險中或對RV感染易感的受試者是具有影響受試者的免疫系統或主要器官的現有健康疾患的老年人受試者。在此段落中描述的各個實施方案中，處於RV感染風險中或對RV感染易感的受試者可以是表現出RV感染的症狀的或無RV感染症狀的受試者。 在一些實施方案中，將本文所述的治療性核酸、包含本文所述的治療性核酸的疫苗組合物、包含本文所述的治療性核酸的含脂質組合物(例如，脂質納米顆粒)或本文所述的組合療法施用於被診斷為RV感染陽性的受試者。在一些實施方案中，被診斷為RV感染陽性的受試者是無RV感染症狀的，並且所述診斷是基於從來自所述受試者的樣品中檢測到病毒核酸或蛋白質的存在。在一些實施方案中，診斷是基於患者所表現出的臨床症狀。可充當診斷依據的示例性症狀包括但不限於發熱、瘙癢、感覺異常、多涎、立毛、週期性瞳孔擴散、恐水、恐高症、吞咽困難和吸氣肌痙攣。在一些實施方案中，診斷是基於受試者所表現出的臨床症狀結合受試者與認為具有攜帶RV高風險(諸如被診斷為RV感染陽性)的宿主(例如，犬科動物)的接觸史。 在一些實施方案中，將本文所述的治療性核酸、包含本文所述的治療性核酸的疫苗組合物、包含本文所述的治療性核酸的含脂質組合物(例如，脂質納米顆粒)或本文所述的組合療法施用於先前未接受過治療性核酸、疫苗組合物、含脂質組合物(例如，脂質納米顆粒)或組合療法施用的受試者。 在一些實施方案中，將本文所述的治療性核酸、包含本文所述的治療性核酸的疫苗組合物、包含本文所述的治療性核酸的含脂質組合物(例如，脂質納米顆粒)或本文所述的組合療法施用於先前已經接受過治療性核酸、疫苗組合物、含脂質組合物(例如，脂質納米顆粒)或組合療法施用的受試者。在具體實施方案中，受試者先前已被施用本文所述的治療性核酸、包含本文所述的治療性核酸的疫苗組合物、包含本文所述的治療性核酸的含脂質組合物(例如，脂質納米顆粒)或如本文所述的組合療法一次、兩次、三次或更多次。 在一些實施方案中，將本文所述的治療性核酸、包含本文所述的治療性核酸的疫苗組合物、包含本文所述的治療性核酸的含脂質組合物(例如，脂質納米顆粒)或本文所述的組合療法施用於在施用治療性核酸、疫苗組合物、含脂質組合物(例如，脂質納米顆粒)或組合療法之前接受過療法的受試者。在一些實施方案中，施用本文所述的治療性核酸、包含本文所述的治療性核酸的疫苗組合物、包含本文所述的治療性核酸的含脂質組合物(例如，脂質納米顆粒)或本文所述的組合療法的受試者經歷了先前療法的不良副作用或由於對受試者的不可接受的毒性水準而終止了先前療法。 施用 劑 量和 頻 率 在控制、預防和/或治療感染性疾病中有效的治療性核酸或其組合物的量將取決於所治療疾病的性質、施用途徑、受試者的總體健康狀況等，並且應根據醫生的判斷決定。可任選地採用標準臨床技術，諸如體外分析來幫助鑒定最佳劑量範圍。然而，如本文所述的用於施用的治療性核酸的合適劑量範圍通常是約0.001 mg、0.005 mg、0.01 mg、0.05 mg、0.1 mg、0.5 mg、1.0 mg、2.0 mg、3.0 mg、4.0 mg、5.0 mg、10.0 mg、0.001 mg至10.0 mg、0.01 mg至1.0 mg、0.1 mg至1 mg和0.1 mg至5.0 mg。可以根據需要頻繁地以一定時間間隔將治療性核酸或其組合物一次、兩次、三次、四次或更多次地施用於受試者。可從源自體外或動物模型測試系統的劑量反應曲線中推斷有效劑量。 在某些實施方案中，將治療性核酸或其組合物以單劑量、隨後在1至6周、1至5周、1至4周、1至3周、1至2周後給以第二劑量施用於受試者。根據這些實施方案，可在第二次接種後以6至12個月的間隔向受試者施用加強接種。 在某些實施方案中，可重複施用治療性核酸或其組合物，並且所述施用可間隔至少1天、2天、3天、5天、6天、7天、10天、14天、15天、21天、28天、30天、45天、2個月、75天、3個月或至少6個月。在其它實施方案中，可重複施用治療性核酸或其組合物，並且所述施用可間隔1至14天、1至7天、7至14天、1至30天、15至30天、15至45天、15至75天、15至90天、1至3個月、3至6個月、3至12個月或6至12個月。在一些實施方案中，將第一治療性核酸或其組合物施用於受試者，隨後施用第二治療性核酸或其組合物。在某些實施方案中，第一和第二治療性核酸或其組合物可間隔至少1天、2天、3天、5天、6天、7天、10天、14天、15天、21天、28天、30天、45天、2個月、75天、3個月或至少6個月。在其它實施方案中，第一和第二治療性核酸或其組合物可間隔1至14天、1至7天、7至14天、1至30天、15至30天、15至45天、15至75天、15至90天、1至3個月、3至6個月、3至12個月或6至12個月。 在某些實施方案中，將治療性核酸或其組合物與一種或多種額外療法(諸如章節5.5.2中描述的療法)組合施用於受試者。其它一種或多種額外療法的劑量將取決於多種因素，包括例如療法、感染性疾病的性質、施用途徑、受試者的總體健康狀況等，並且應根據醫生的判斷來決定。在具體實施方案中，其它療法的劑量是對於根據本文公開的方法用作單一劑的療法所推薦使用的療法的施用劑量和/或頻率。在其它實施方案中，其它療法的劑量是比對於根據本文公開的方法用作單一劑的療法所推薦使用的更低的劑量和/或更低的頻率的療法施用。關於批准的療法的推薦劑量可在Physician’s Desk Reference中找到。 在某些實施方案中，將治療性核酸或其組合物與一種或多種額外療法同時施用於受試者。在其它實施方案中，每3至7天、1至6周、1至5周、1至4周、2至4周、1至3周或1至2周向受試者施用治療性核酸或其組合物，並且每3至7天、1至6周、1至5周、1至4周、1至3周或1至2周施用一種或多種額外療法(諸如章節5.5.2中所述)。在某些實施方案中，每1-2周向受試者施用治療性核酸或其組合物，並且每2-4周施用一種或多種額外療法(諸如章節5.5.2中所述)。在一些實施方案中，每週向受試者施用治療性核酸或其組合物，並且每2周施用一種或多種額外療法(諸如章節5.5.2中所述)。 實 施例本章節中的實施例以舉例說明而不是限制的方式提供。 一般製備型HPLC方法：HPLC純化是在配備有二極體陣列檢測器(DAD)的Waters 2767上，在Inertsil Pre-C8 OBD柱上，一般利用含0.1% TFA的水作為溶劑A且利用乙腈作為溶劑B進行。 一般LCMS方法：LCMS分析是在Shimadzu (LC-MS2020)系統上進行。色譜是在SunFire C18上，一般利用含0.1%甲酸的水作為溶劑A且利用含0.1%甲酸的乙腈作為溶劑B執行。 實施例01-1：化合物02-1 (即以下方案中的化合物1)的製備。 化合物 1 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ: 0.86-0.90 (m, 12H), 1.27-1.63 (m, 53H), 1.97-2.01 (m, 2H), 2.28-2.64 (m, 14H), 3.52-3.58 (m, 2H), 4.00-4.10 (m, 8H)。LCMS: Rt: 1.080 min; MS m/z (ESI): 826.0 [M+H] ⁺。 使用相應的起始材料以與化合物02-1類似的方式製備以下化合物。 實施例01-2：化合物02-2 (即以下方案中的化合物2)的製備。 化合物 2 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ: 0.86-0.90 (m, 12H), 1.28-1.67 (m, 54H), 1.88-2.01 (m, 7H), 2.28-2.56 (m, 18H), 3.16-3.20 (m, 1H), 3.52-3.54 (m, 2H), 4.00-4.10 (m, 8H)。LCMS: Rt: 1.060 min; MS m/z (ESI): 923.0 [M+H] ⁺。 實施例01-3：化合物02-4 (即以下方案中的化合物4)的製備。 化合物 4 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ: 0.86-0.90 (m, 9H), 1.26-1.32 (m, 34H), 1.41-1.49 (m, 4H), 1.61-1.66 (m, 15H), 2.00-2.03 (m, 1H), 2.21-2.38 (m, 8H), 2.43-2.47 (m, 4H), 2.56-2.60 (m, 2H), 3.50-3.54 (m, 2H), 4.03-4.14 (m, 8H)。LCMS: Rt: 1.030 min; MS m/z (ESI): 798.0 [M+H] ⁺。 實施例01-4：化合物02-9 (即以下方案中的化合物9)的製備。 化合物 9 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ: 0.86-0.90 (m, 12H), 1.28-1.30 (m, 33H), 1.58-2.01 (m, 18H), 2.30-2.54 (m, 18H), 3.10-3.19 (m, 1H), 3.52-3.68 (m, 8H), 4.09-4.20 (m, 8H)。LCMS: Rt: 1.677 min; MS m/z (ESI): 927.7 [M+H] ⁺。 使用相應的起始材料以與化合物02-9類似的方式製備以下化合物。 實施例01-5：化合物02-10 (即以下方案中的化合物10)的製備。 化合物 10 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ: 0.86-0.90 (m, 12H), 1.26-1.41 (m, 48H), 1.51-1.72 (m, 11H), 1.94-2.03 (m, 1H), 2.29-2.32 (m, 6H), 2.41-2.91 (m, 5H), 3.51-3.76(m, 2H), 3.96-4.10 (m, 6H)。LCMS: Rt: 1.327 min; MS m/z (ESI): 782.6 [M+H] ⁺。 使用相應的起始材料以與化合物02-10類似的方式製備以下化合物。 實施例01-6：化合物02-12 (即以下方案中的化合物12)的製備。 化合物 12 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ: 0.86-0.89 (m, 18H), 1.25-1.35 (m, 53H), 1.41-1.48 (m, 8H), 1.56-1.61 (m, 20H), 1.95-2.01 (m, 2H), 2.28-2.35 (m, 6H), 2.43-2.46 (m, 4H), 2.56-2.58 (m, 2H), 3.51-3.54 (m, 2H), 4.00-4.10 (m, 8H)。LCMS: Rt: 0.080 min; MS m/z (ESI): 1050.8 [M+H] ⁺。 實施例01-7：化合物02-20 (即以下方案中的化合物20)的製備。 化合物 20 ¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：0.86-0.90 (m, 9H), 1.25-1.36 (m, 48H), 1.41-1.48 (m, 5H), 1.60-1.62 (m, 8H), 1.97-2.00 (m, 1H), 2.27-2.32 (m, 6H), 2.43-2.46 (m, 4H), 2.56-2.59 (m, 2H), 3.52-3.54 (m, 2H), 4.01-4.10 (m, 6H)。LCMS：Rt: 0.093 min; MS m/z (ESI): 782.6 [M+H] ⁺。 實 施例 02-1 ：起始材料和中間體的製備。 化合物A的製備 化合物B的製備 化合物C的製備 化合物D的製備 化合物E的製備 化合物 E ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃): 3.97 (d, J= 6 Hz, 2H), 3.58 (s, 1H), 2.73-2.58 (m, 3H), 2.45-2.40 (m, 1H), 2.33-2.29 (m, 2H), 1.66-1.60 (m, 2H), 1.51-1.40 (m, 2H), 1.39-1.34 (m, 4H), 1.26 (s, 46H), 0.90-0.86 (m, 9H)。LCMS: Rt: 1.083 min; MS m/z (ESI): 568.5 [M+H] ⁺。 化合物F的製備 化合物G的製備 化合物H的製備 化合物K的製備 化合物L的製備 SM2的製備： LCMS: Rt: 1.427 min; MS m/z (ESI): 428.5 [M+H] ⁺。 SM4的製備： LCMS: Rt: 1.000 min; MS m/z (ESI): 442.4 [M+H] ⁺。 SM9的製備： SM10的製備： 化合物 SM10 -4LCMS: Rt: 0.830 min; MS m/z (ESI): 481.4 [M+H] ⁺。 SM10LCMS: Rt: 0.860 min; MS m/z (ESI): 499.3 [M+H] ⁺。 SM11的製備： 化合物 SM11 化合物 SM11LCMS: Rt: 0.890 min; MS m/z (ESI): 428.3 [M+H] ⁺。 SM的製備： 化合物 SM-2 ¹H NMR (400 MHz, CCl ₃D): 3.71 (s, 6H), 1.88-1.84 (m, 4H), 1.59 (s, 1H), 1.25 (s, 19H), 1.14-1.10 (m, 4H), 0.89-0.86 (m, 6H)。 化合物 SM-3 ¹H NMR (400 MHz, CCl ₃D): 0.89-0.86 (m, 6H), 1.25 (s, 22H), 1.45-1.40 (m, 2H), 1.59 (s, 4H), 2.36-2.30 (m, 1H), 3.67 (s, 3H)。 化合物 SM ¹H NMR (400 MHz, CCl ₃D): 0.90-0.86 (m, 6H), 1.27 (s, 27H), 1.43 (s, 3H), 3.54 (d, J= 5.2 Hz, 2H)。 SM15的製備： LCMS: Rt: 0.900 min; MS m/z (ESI): 442.3 [M+H] ⁺。 SM16的製備： LCMS: Rt: 0.810 min; MS m/z (ESI): 444.3 [M+H] ⁺。 SM18的製備： LCMS: Rt: 0.870 min; MS m/z (ESI): 526.5 [M+H] ⁺。 SM20的製備： 化合物 SM20-1LCMS: Rt: 0.950 min; MS m/z (ESI): 482.4 [M+H] ⁺。 化合物 SM20LCMS: Rt: 1.330min; MS m/z (ESI): 500.3 [M+H] ⁺。 SM22的製備： 化合物 SM22 ¹H NMR (400 MHz, CCl ₃D): 0.87 (t, J= 8 Hz, 6H), 1.22-1.46 (m, 24H), 1.85-1.95 (m, 2H), 2.22-2.34 (m, 1H)。 SM23的製備： 化合物 SM23LCMS: Rt: 0.898 min; MS m/z (ESI): 400.3 [M+H] ⁺。 SM24的製備： SM26的製備： SM30的製備： 化合物 SM30LCMS: Rt: 1.010 min; MS m/z (ESI): 402.4 [M+H] ⁺。 SM34的製備： 化合物 SM34LCMS: Rt: 1.620 min; MS m/z (ESI): 399.5 [M+H] ⁺。 SM38的製備： SM39的製備： 化合物SM39 LCMS: Rt: 0.880 min; MS m/z (ESI): 400.3 [M+H]。 實 施例 02-2 ： 化合物 03-1(即以下方案中的化合物1) 的 製備。 化合物 03-1 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ: 0.83-0.93 (m, 12H), 1.04-1.16 (m, 2H), 1.18-1.39 (m, 60H), 1.40-1.55 (m, 3H), 1.56-1.74 (m, 9H), 1.86 (s, 2H), 2.25-2.39 (m, 5H), 2.56 (s, 3H), 2.70 (s, 3H), 3.62 (s, 2H), 3.89-4.04 (m, 4H)。LCMS: Rt: 2.000 min; MS m/z (ESI): 863.7 [M+H] ⁺。 實 施例 02-3 ： 化合物 03-3 的 製備。 化合物 03-3 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ: 0.48-0.50 (m, 4H), 0.86-0.90 (m, 9H), 1.26-1.30 (m, 45H), 1.49-1.66 (m, 11H), 1.72-1.77 (m, 1H), 2.28-2.32 (m, 4H), 2.52-2.76 (m, 10H), 3.52-3.58 (m, 2H), 3.96-3.98 (m, 2H), 4.04-4.07 (m, 2H)。LCMS: Rt: 1.250 min; MS m/z (ESI): 751.6 [M+H] ⁺。 使用相應的起始材料以與化合物03-3類似的方式製備以下化合物。 實 施例 02-4 ： 化合物 03-10(即以下方案中的化合物10) 的 製備。 化合物 10-1LCMS: Rt: 0.942 min; MS m/z (ESI): 428.3 [M+H] ⁺。 化合物 10-2LCMS: Rt: 0.950 min; MS m/z (ESI): 482.4 [M+H] ⁺。 化合物 10-3LCMS: Rt: 1.330 min; MS m/z (ESI): 500.3 [M+H] ⁺。 化合物 10 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ: 0.86-0.89 (m, 12H), 1.26-1.32 (m, 61H), 1.41-1.65 (m, 12H), 1.85-2.02 (m, 4H), 2.28-2.61 (m, 14H), 3.00-3.12 (m, 1H), 3.53-3.55(m, 2H), 3.97 (d, J= 5.6 Hz, 4H)。LCMS: Rt: 2.520 min; MS m/z (ESI): 891.7 [M+H] ⁺。 實 施例 02-5 ： 化合物 03-11(即以下方案中的化合物11) 的 製備。 化合物 11-A ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ: 0.86-0.90 (m, 6H), 1.26-1.32 (m, 29H), 3.00 (s, 3H), 4.11-4.13 (m, 2H)。 化合物 11-1 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ: 0.85-0.88 (m, 6H), 1.24-1.29 (m, 28H), 1.82-1.89 (m, 1H), 3.56-3.58 (m, 2H), 7.72-7.72 (m, 2H), 7.83-7.85 (m, 2H)。 化合物 11-2LCMS: Rt: 1.260 min; MS m/z (ESI): 270.3 [M+H] ⁺。 化合物 11-4LCMS: Rt: 0.920 min; MS m/z (ESI): 481.4 [M+H] ⁺。 化合物 11-5LCMS: Rt: 0.980 min; MS m/z (ESI): 499.3 [M+H] ⁺。 化合物 11-6LCMS: Rt: 0.96 min; MS m/z (ESI): 427.3 [M+H] ⁺。 化合物 11 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ: 0.86-0.90 (m, 12H), 1.26-1.34 (m, 64H), 1.41-1.54 (m, 6H), 1.59-1.77 (m, 6H), 1.99-2.07 (m, 2H), 2.17-2.21 (m, 4H), 2.47-2.71 (m, 10H), 3.15-3.18 (m, 4H), 3.55-3.62 (m, 2H), 5.73-5.84 (m, 2H)。LCMS: Rt: 1.610 min; MS m/z (ESI): 889.8 [M+H] ⁺。 實 施例 02-6 ： 化合物 03-15(即以下方案中的化合物15) 的 製備。 化合物15 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ: 0.86-0.92 (m, 12H), 1.26-1.30 (m, 67H), 1.46-1.72 (m, 12H), 1.98-2.09 (m, 2H), 2.15-2.19 (m, 2H), 2.31-2.71 (m, 8H), 3.16-3.23 (m, 2H), 3.56-3.66 (m, 2H), 3.95-4.03 (m, 2H), 7.30 (s, 1H)。LCMS: Rt: 1.68 min; MS m/z (ESI): 890.7 [M+H] ⁺。 使用相應的起始材料以與化合物03-15類似的方式製備以下化合物。 實 施例 02-7 ： 化合物 03-71(即以下方案中的化合物71) 的 製備。 化合物 71-2 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ: 1.72-1.80 (m, 2H), 1.94-2.01 (m, 2H), 3.43 (t, J= 6.8 Hz, 2H), 3.50 (t, J= 6.2 Hz, 2H), 4.50 (s, 2H), 7.27-7.37 (m, 5H)。 化合物 71-4 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ: 1.20-1.24 (m, 2H), 1.36-1.44 (m, 2H), 1.57-1.68 (m, 2H), 1.72-1.75 (m, 1H), 3.33 (s, 2H), 3.45-3.49 (m, 2H), 3.57-3.61 (m, 2H), 3.73-3.76 (m, 2H), 4.49 (s, 2H), 7.27-7.34 (m, 5H)。 化合物 71-5 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ: 0.86-0.90 (m, 6H), 1.27-1.29 (m, 13H), 1.36-1.48 (m, 4H), 1.58-1.64 (m, 9H), 1.92-2.02 (m, 1H), 2.29 (t, J= 7.6 Hz, 4H), 3.46 (t, J= 6.4 Hz, 2H), 4.00-4.10 (m, 4H), 4.49 (s, 2H), 7.28-7.37 (m, 5H)。 化合物 71-6 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ: 0.86-0.90 (m, 6H), 1.27-1.39 (m, 15H), 1.41-1.51 (m, 6H), 1.58-1.65 (m, 6H), 1.96-2.05 (m, 1H), 2.30 (t, J= 7.6 Hz, 4H), 3.65(t, J= 6.4 Hz, 2H), 4.02-4.11 (m, 4H)。 化合物 71-7 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ: 0.86-0.90 (m, 6H), 1.27-1.37 (m, 14H), 1.41-1.46 (m, 4H), 1.53-1.63 (m, 6H), 1.73-1.80 (m, 2H), 1.96-2.03 (m, 1H), 2.30 (t, J= 6.2 Hz, 4H), 3.01 (s, 3H), 4.02-4.10 (m, 4H), 4.23 (t, J= 6.4 Hz, 2H)。 化合物 71-8LCMS: Rt: 0.830 min; MS m/z (ESI): 498.4 [M+H] ⁺。 化合物 71-9LCMS: Rt: 0.870 min; MS m/z (ESI): 516.3[M+H] ⁺。 化合物 71 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ:0.86-0.90 (m, 12H), 1.27-1.50 (m, 44H), 1.57-1.67 (m, 10H), 1.85-2.05 (m, 6H), 2.28-2.36 (m, 8H), 2.45-3.13 (m, 12H), 3.52-3.60 (m, 2H), 4.01-4.10 (m, 8H)。LCMS: Rt: 1.110 min; MS m/z (ESI): 923.7[M+H] ⁺。 使用相應的起始材料以與化合物03-71類似的方式製備以下化合物。 實 施例 02-8 ： 化合物 03-72(即以下方案中的化合物72) 的 製 備。 化合物 03-72 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ: 0.81-0.93 (m, 12H), 1.07-1.38 (m, 62H),1.39-1.57 (m, 9H), 1.58-1.90 (m, 11H), 1.96-2.10 (m, 3H), 2.16-2.26 (m, 2H), 2.42-2.68 (m, 8H), 3.18-3.32 (m, 2H), 3.49-3.61 (m, 2H), 3.99-4.12 (m, 2H)。LCMS: Rt: 1.510 min; MS m/z (ESI): 904.7 [M+H] ⁺。 使用相應的起始材料以與化合物03-72類似的方式製備以下化合物。 實 施例 02-9 ： 化合物 03-99(即以下方案中的化合物190) 的 製備。 化合物 99-3LCMS: Rt: 0.863 min; MS m/z (ESI): 415.3 [M+H] ⁺。 化合物 99 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ: 0.86-0.90 (m, 9H), 1.23-1.36 (m, 48H), 1.45-1.50 (m, 7H), 1.59-1.67 (m, 7H), 1.78-1.80 (m, 4H), 2.27-2.31(m, 2H), 2.49-2.60 (m, 10H), 3.18 (s, 4H), 3.54 (s, 2H), 4.03-4.06 (m, 4H)。LCMS: Rt: 1.560 min; MS m/z (ESI): 808.7 [M+H] ⁺。 實 施例 02-10 ： 化合物 03-190(即以下方案中的化合物190) 的 製備。 化合物190 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ: 0.51-0.86 (m, 12H), 1.28-1.39 (m, 48H), 1.60-1.68(m, 24H), 2.28-2.31 (m, 8H), 2.32-2.69 (m, 6H), 3.96-4.06 (m, 6H)。LCMS: Rt: 1.150 min; MS m/z (ESI): 893.7 [M+H] ⁺。 實 施例 02-11 ： 化合物 03-195(即以下方案中的化合物195) 的 製備。 化合物 195 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ: 0.36-0.45 (m, 4H), 0.86-0.90 (m, 12H), 1.26-1.35 (m, 46H), 1.40-1.55 (m, 8H), 0.60-1.77 (m, 9H), 1.97-2.00 (m, 1H), 2.15-2.19 (m, 2H), 2.29-2.32 (m, 4H), 2.43-2.59 (m, 10H), 3.16-3.19 (m, 2H), 3.51-3.54 (m, 2H), 4.00-4.10 (m, 4H), 5.50 (s, 1H)。LCMS: Rt: 0.080min; MS m/z (ESI): 892.6 [M+H] ⁺。 使用相應的起始材料以與化合物03-195類似的方式製備以下化合物。 實 施例 02-12 ： 化合物 202 的 製備 。 化合物 202-1LCMS: Rt: 0.840min; MS m/z (ESI): 495.5 [M+H] ⁺。 化合物 202 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ: 0.86-0.90 (m, 12H), 1.26-1.67 (m, 78H), 2.16-2.20 (m, 2H), 2.47-2.59 (m, 10H), 3.16-3.19 (m, 2H), 3.39-3.41 (m, 2H), 3.53-3.57 (m, 4H), 4.44-4.46 (m, 1H)。LCMS: Rt:1.770 min；MS m/z (ESI): 878.8 [M+H] ⁺。 實 施例 03-1 ： 起始材料和中 間體 的 製備 。 化合物 A 的 製備 化合物 B 的 製備 化合物 C 的 製備 化合物 D 的製備 化合物 E 的 製備 化合物 F 的 製備 化合物 G 的 製備 化合物 G-1LCMS: Rt: 0.824 min; MS m/z (ESI): 394.3 [M+H] ⁺。 化合物 GLCMS: Rt: 1.750 min; MS m/z (ESI): 732.6 [M+H] ⁺。 化合物 H 化合物 I 化合物 J LCMS: Rt: 1.070 min; MS m/z (ESI): 584.4 [M+H] ⁺。 化合物 K 的 製備 化合物 L 的 製備 化合物 M 的 製備 化合物 N 的 製備 化合物 O 的製備 化合物 P 的 製備 化合物 Q 的 製備 化合物 Q-1 ¹H NMR (400 MHz, CCl ₃D): δ: 3.70 (s, 6 H), 1.88-1.84 (m, 4 H), 1.63 (s, 1 H), 1.27 (s, 10 H), 1.13 (s, 5 H), 0.88-0.86 (m, 6 H)。 化合物 Q-2 ¹H NMR (400 MHz, CCl ₃D): δ: 3.67 (s, 3 H), 2.35-2.31 (m, 1 H), 1.61-1.54 (m, 2 H), 1.47-1.40 (m, 2 H), 1.26 (s, 16 H), 0.89-0.86 (m, 6 H)。 化合物 Q-3 ¹H NMR (400 MHz, CCl ₃D): δ: 3.54 (d, J=5.2 Hz, 2 H), 1.47-1.43 (m, 2 H), 1.28 (s, 20 H), 0.90-0.87 (m, 6 H)。 化合物 SM2 的 製備 化合物 R 的 製備 化合物 S 的 製備 化合物 SM5 的 製備 化合物 SM6 的 製備 實 施例 03-2 ： 化合物 04-1(即以下方案中的化合物1) 的 製備。 化合物 1-1LCMS: Rt: 0.750 min; MS m/z (ESI): 206.2 [M+H] ⁺。 化合物 1-2LCMS: Rt: 0.870 min; MS m/z (ESI): 448.3 [M+H] ⁺。 化合物 1-3LCMS: Rt: 1.360 min; MS m/z (ESI): 616.5 [M+H] ⁺。 化合物 1 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ：0.79-0.83 (m, 6H), 1.14-1.26 (m, 38H), 1.47-1.61 (m, 6H), 1.86-1.96 (m, 4H), 2.51-2.58 (m, 4H), 3.17 (s, 1H), 3.32-3.44 (m, 5H), 3.51-3.66 (m, 3H)。LCMS: Rt: 0.94 min; MS m/z (ESI): 526.5 [M+H] ⁺。 實 施例 03-3 ： 化合物 04-2(即以下方案中的化合物2) 的 製備。 化合物 2-1LCMS: Rt: 1.340 min; MS m/z (ESI): 630.5 [M+H] ⁺。 化合物 2 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ: 0.86-0.90 (m, 6H), 1.25-1.33 (m, 35H), 1.50-1.69 (m, 7H), 1.87-1.99 (m, 1H), 2.00-2.08 (m, 2H), 2.33 (t, J=7.6 Hz, 2H), 2.56-2.81 (m, 4H), 3.17-3.27 (m, 1H), 3.38-3.48 (m, 3H), 3.50-3.65 (m, 3H), 5.08-5.14 (m, 1H)。LCMS: Rt: 1.180 min; MS m/z (ESI): 540.4 [M+H] ⁺。 實 施例 03-4 ： 化合物 04-7(即以下方案中的化合物7) 的 製備。 化合物 7-1LCMS: Rt: 0.780 min; MS m/z (ESI): 427.4 [M+H] ⁺。 化合物 7 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ: 0.86-0.90 (m, 9H), 1.26-1.35 (m, 45H), 1.41-1.67 (m, 7H), 2.28-2.32 (m, 3H), 2.36-2.70 (m, 11H), 2.79-2.83 (m, 2H), 3.35-3.46 (m, 4H), 3.77-3.85 (m, 1H), 3.96-3.97 (m, 2H)。LCMS: Rt: 1.220 min; MS m/z (ESI): 669.6 [M+H] ⁺。 實 施例 03-5 ： 化合物 04-8(即以下方案中的化合物8) 的 製備。 化合物 8-1LCMS: Rt: 0.730 min; MS m/z (ESI): 371.3 [M+H] ⁺。 步 驟 2 ：化合物 8 的 製備 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ: 0.86-0.90 (m, 9H), 1.25-1.27 (m, 47H), 1.40-1.49 (m, 4H), 1.56-1.73 (m, 8H), 2.30 (t, J=7.6 Hz, 3H), 2.40-2.82 (m, 10H), 3.32-3.38 (m, 1H), 3.43-3.46 (m, 3H), 3.70-3.80 (m, 1H), 3.92-3.97 (m, 2H)。LCMS: Rt: 1.090 min; MS m/z (ESI): 709.6 [M+H] ⁺。 實 施例 03-6 ： 化合物 04-65(即以下方案中的化合物65) 的 製備。 化合物 65 ¹H NMR (400 MHz, CCl ₃D): δ: 0.79-0.83 (m, 12H), 1.23-1.27(m, 62H), 1.29-1.37 (m, 2H),1.51-1.61 (m, 2H), 1.76-1.93(m, 7H), 2.13-2.16 (m, 4H), 2.17-2.25 (m, 3H), 2.41-2.51 (m,7H), 3.05-3.06 (m, 1H), 3.52-3.54 (m. 2H), 3.92-4.03 (m, 4H)。LCMS: Rt: 0.588 min; MS m/z (ESI):863.6 [M+H] ⁺。 使用相應的起始材料以與化合物04-65類似的方式製備以下化合物。 實 施例 03-7 ： 化合物 04-68(即以下方案中的化合物68) 的 製備。 化合物 68-2 ¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 0.86-0.90 (m, 12H), 1.26-1.46 (m, 53H), 1.56-1.62 (m, 2H), 1.83 (s, 2H), 1.96-2.02 (m, 1H), 2.23-2.24 (m, 4H), 3.64 (s, 2H), 4.02-4.11 (m, 4H)。 化合物 68 ¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 0.83-0.92 (m, 12H), 1.17-1.37 (m, 56H), 1.38-1.45 (m, 2H), 1.64-1.67 (m, 2H), 1.70-1.86 (m, 6H), 1.92-2.04 (m, 2H), 2.19-2.26 (m, 4H), 2.40-2.49 (m, 3H), 2.57-2.65 (m, 2H), 3.41-3.51 (m, 2H), 3.97-4.12 (m, 4H)。LCMS: Rt: 0.080 min; MS m/z (ESI): 778.5 [M+H] ⁺。 實 施例 03-8 ： 化合物 04-69(即以下方案中的化合物69) 的 製備。 化合物 69-1LCMS: Rt: 1.290 min; MS m/z (ESI): 750.7 [M+H] ⁺。 化合物 69 ¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 0.83-0.92 (m, 12H), 0.98-1.06 (m, 3H), 1.17-1.47 (m, 52H), 1.54-1.72 (m, 5H), 1.78-2.06 (m, 8H), 2.20-2.27 (m, 4H), 2.37-2.46 (m, 4H), 2.49-2.66 (m, 5H), 3.01-3.12 (m, 1H), 3.52-3.59 (m, 2H), 3.98-4.11 (m, 4H)。LCMS: Rt: 0.093 min; MS m/z (ESI): 821.6 [M+H] ⁺。 使用相應的起始材料以與化合物04-69類似的方式製備以下化合物。 實 施例 04 ：脂 質納 米 顆 粒的 製備 和表徵簡言之，將陽離子脂質(化合物01-1、化合物03-15、化合物03-23、化合物03-17、化合物03-99)、DSPC、膽固醇和PEG-脂質以如本文所述的摩爾比溶解在乙醇中，並將mRNA稀釋在10-50 mM檸檬酸鹽緩衝液(pH = 4)中。可替代地，將本文提供的陽離子脂質、DSPC、膽固醇和聚合物結合的脂質以如本文所述的摩爾比溶解在乙醇中，並將mRNA稀釋在10-50 mM檸檬酸鹽緩衝液(pH = 4)中。通過使用總流速在9-30 mL/min範圍內的微流體裝置將乙醇脂質溶液與mRNA水溶液以1:3的體積比混合，以大約10:1至30:1的總脂質與mRNA重量比製備LNP。使用透析移除乙醇且以DPBS替代。最後，將脂質納米顆粒通過0.2 μm無菌篩檢程式過濾。 通過動態光散射，使用Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern UK)，使用173°反向散射檢測模式測定脂質納米顆粒大小。使用Quant-it Ribogreen RNA定量分析試劑盒(Thermo Fisher Scientific, UK)，根據製造商的說明書，測定脂質納米顆粒的包封效率。 如文獻中所報導，LNP製劑的表觀pKa與在體內LNP對於核酸的遞送效率相關。使用基於2-(對甲苯氨基)-6-萘磺酸(TNS)的螢光的分析來測定各製劑的表觀pKa。如上文所述，製備出在PBS中包含陽離子脂質/DSPC/膽固醇/DMG-PEG的LNP製劑。將TNS製備為在蒸餾水中的300 uM儲備溶液。將LNP製劑在3 mL的含有50 mM檸檬酸鈉、50 mM磷酸鈉、50 mM硼酸鈉和30 mM氯化鈉的緩衝溶液(其中pH在3至9的範圍內)中稀釋至0.1 mg/ml總脂質。添加TNS溶液的等分試樣以得到0.1 mg/ml的最終濃度，並且在渦旋混合後，在室溫下在Molecular Devices Spectramax iD3光譜儀中使用325 nm的激發波長和435 nm的發射波長來測量螢光強度。將S形曲線最佳擬合分析應用於螢光資料，並將pKa值測量為產生半數最大螢光強度的pH值。 實 施例 B1 ： mRNA 合成和 純 化 。DNA線性化。將含有編碼RV G蛋白(例如，SEQ ID NO:1-3)以及信號肽(例如，SEQ ID NO:4-6)、5’-UTR (例如，SEQ ID NO:24-33)、3’-UTR (例如，SEQ ID NO:34-39)和polyA信號的標靶序列的IVT質粒pJ241 (內部構建的，含有卡那黴素(kanamycin)抗性基因、T7啟動子序列、poly(A)標記和在poly(A)序列下游的獨特IIS型限制位點)使用IIS型限制酶消化進行線性化(構建體的全長顯示在表5中)。將每10 µg質粒與10 U的Esp3I/BsmBI混合，在37℃下孵育4小時以確保完全線性化。通過添加1/10體積的3 M乙酸鈉(pH 5.5)和2.5倍體積的乙醇終止反應，充分混合並在 -20℃冷卻1小時。將線性化的DNA通過在4℃下以13800 g離心15分鐘沉澱，用70%乙醇洗滌兩次，重懸於無核酸酶H ₂O中。 mRNA的體外轉錄。下表中示出典型20 µL反應混合物的內容物：

無核酸酶H 2O	補足至20 µL
RNA酶抑制劑(40 U/µL)	0.5 µL
rNTP混合物(各自100 mM)	8 µL (各自最終10 mM)
10X IVT反應緩衝液	2 µL
1M MgCl 2	0.8 µL
0.1M DTT	2 µL
100 U/mL無機焦磷酸酶	0.8 µL
100 mM NaCl	1 µL
線性化DNA	1 µg
T7 RNA聚合酶(50 U/µL)	2 µL

將反應混合物在37℃下孵育6小時，然後添加1 μl DNA酶I (無RNA酶，1 U/µL)以除去DNA範本，在37℃下孵育30分鐘。將合成的RNA通過添加0.5體積的7.5 M LiCl、50 mM EDTA並在-20℃下孵育45分鐘，然後在4℃下以13800 g離心15分鐘以沉澱mRNA來進行純化。然後除去上清液，並將沉澱物用500 µL的冰冷70%乙醇沖洗兩次，將mRNA重懸於無核酸酶H ₂O中，將濃度調節至1 mg/mL，並在-20℃下儲存。 mRNA加帽。將每10 µg未加帽的mRNA在65℃下加熱10分鐘，在冰上放置5分鐘，然後與10 U牛痘病毒加帽酶、50 U mRNA帽2’-O-甲基轉移酶、0.2 mM SAM、0.5 mM GTP和1U RNA酶抑制劑混合，並在37℃下孵育60分鐘以生成帽1修飾結構。如前所述將經修飾的mRNA通過LiCl沉澱，並將RNA重懸於無核酸酶H ₂O中，並在-20℃下儲存。 HPLC純化。使用C4柱(5 μm) (10 mm×250 mm柱)，通過高效液相色譜(HPLC)純化RNA。緩衝液A含有0.1 M乙酸三乙銨(TEAA) (pH = 7.0)，並且緩衝液B含有0.1 M TEAA (pH = 7.0)和25%乙腈。 如所預期，mRNA分子通過上述體外轉錄和成熟過程成功地產生，並使用HPLC從反應體系中純化。 實 施例 B2 ： 體 外 轉 染和抗原表 達 分析。將 實 施例 B1中產生的編碼RV G蛋白的不同mRNA分子(表5所示的構建體1、構建體2、構建體3、構建體4、構建體5、構建體6)轉染到表達細胞系諸如HEK293T培養細胞中，以評估mRNA分子的體外表達效率。 將HEK293T (ATCC)細胞以1×10 ⁶個細胞/孔在Costar® 6孔透明TC處理的板(Corning，#3516)中接種於含有10% FBS (Gibco # 12576029)的3 mL新鮮DMEM™培養基(Thermo # 10567014)中，並在37℃下在5% CO ₂中培養12小時。根據手冊說明，使用Lipofectamine® 2000 (Thermo fisher，#11668019)將3 μg/孔的靶mRNA轉染至HEK 293 T細胞中，同時轉染陽性對照mRNA ( gfp) (GenBank：MK387175.1)。轉染後18小時收穫細胞，然後在4℃下以200 g離心5分鐘。使用兩種不同的第一抗體以所指示稀釋度對細胞進行染色(1，抗RABV G蛋白小鼠mAb，#DMABT-Z59957，Creative Diagnostics；2，抗RABV G蛋白小鼠mAb，#Ab02097-3.0，Absolute antibody)，並在4℃下孵育0.5小時。然後用含1% FBS的PBS (180 μL x 2)洗滌細胞，然後與第二抗體(100 μL，1:1000，抗小鼠IgG (H+L)第二抗體，PE，#PA1-84395，Invitrogen)一起在4℃下孵育0.5小時。使用上述緩衝液(180 μL x 2)洗滌後，將細胞重懸於200 μL含1% FBS的PBS中。使用BD Fortessa™流式細胞儀(BD Biosciences) (FACS)採集樣品，並使用Flowjo軟體v10.6.2 (BD Biosciences)進行分析。 如圖1A和圖1B所示，除構建體4外，所有mRNA構建體均誘導HEK293T細胞表面上的標靶表達。構建體3誘導候選物中的最高表達。在圖1中，質粒是陽性對照mRNA ( gfp)，Lipo是Lipofectamine® 2000 (Thermo fisher，#11668019)，空白是DMEM™培養基(Thermo # 10567014)。 如圖1B所示，與其親本構建體：構建體1和構建體2相比，包含較短poly-A尾(110 nt)的這些mRNA構建體5和構建體6分別誘導了更高表達。 實 施例 B3. 含 mRNA 的 LNP 的 製備 根據以上實施例04中提供的程式製備含mRNA的LNP，其中脂質根據以上實施例01至03中提供的程式製備，並且mRNA根據以上實施例B1中提供的程式製備。 實 施例 B4. 用含 mRNA 的 LNP 疫苗接 種 的小鼠中抗 體 和細胞因數的產生 動 物免疫在第0天、第14天使用2 μg或10 μg用不同脂質包封的mRNA疫苗對多組6-8周齡雌性BALB/c小鼠(每組10只小鼠)進行肌內(i.m.)免疫。在第0天、第14天注射0.1人用劑量的市售滅活疫苗(HDCV ^TMKangH (Kangh, Chengdu))作為對照。在初始免疫後14天(疫苗接種前)、28天和45天收集血清樣品，並在第45天從每組5只小鼠製備脾細胞，用於使用酶聯免疫斑點測定(Elispot測定)分析T細胞反應。 G 蛋白特 異 性 IgG 滴度的 ELISA將平底、高結合、96孔板(#3590，Corning)用PBS中1 μg/ml的G ecto蛋白(由Sino Biological定制)包被至100 μL/孔的體積。將板在4℃下儲存過夜。用200 μL/孔含0.1% Tween 20的PBS (PBS-T)洗滌板5次，然後在37℃下與100 μL封閉緩衝液(含5%脫脂乳的PBS-T)一起孵育1小時。將2倍系列稀釋的滅活血清樣品添加至板中(100 μl/孔)，並且向最後一列添加陰性對照血清。將板在37℃下孵育1小時，並用PBS-T洗滌5次。然後以1:10000的稀釋度將第二抗體(過氧化物酶結合的山羊抗小鼠IgG；#715-035-151，Jackson)添加至每個孔中，達到最終體積100 μL，然後在37℃下孵育1小時。然後用PBS-T洗滌板5次。添加50 μl顯色溶液(TMB，# PR1200，Solarbio)，並在5分鐘後用50 μl終止溶液(2M H ₂SO ₄)淬滅。在Synergy H1混合多模式微板讀取儀(BioTek)上在450/620 nm下讀取板。終點截斷值是0.1。選擇檢測結果為陽性的最大稀釋因數。滴度結果是陽性最大稀釋因數的OD值/0.1*相應稀釋因數。 對於抗原特異性IgG滴度，來自免疫小鼠的血清在第一次免疫後14天顯示穩健滴度，如圖2所示。在加強免疫後，滴度與第14天的滴度相比急劇增加，如圖3和圖4所示。 中和滴度 測 定血清中的抗狂犬病病毒中和滴度(VNT)通過WHO ¹⁹推薦的快速螢光焦點抑制試驗(RFFIT)進行分析。簡言之，在8孔板中以100 μL體積以3倍系列稀釋對熱滅活血清進行一式四份測試，並以100 μL向每個孔中添加50 FFD50/0.1 mL的CVS。添加培養基而非血清作為陰性對照，並如上所述稀釋標準陽性血清(WHO)並添加至指定孔中。將混合物在37℃下孵育1.5小時。隨後，以1×10 ⁵個細胞/孔接種100 μL胰蛋白酶化BHK-21細胞，然後在37℃和5% CO ₂下孵育20-24小時。然後丟棄上清液，並用80%丙酮在室溫下固定細胞30分鐘。丟棄丙酮，並將細胞用FITC結合的抗狂犬病N蛋白在37℃下染色1小時。使用200 μL/孔PBS洗滌板兩次。然後將一滴80%甘油添加至每個孔中。在倒置螢光顯微鏡下計數每孔20個顯微鏡視野中的陽性顯微鏡視野數目(即，含有一個或多個被感染細胞)，並計算陽性視野百分比(即，感染性)。使用以下Reed-Meunch式計算測試血清的50%終點滴度： 當測試血清中抗體的滴度以IU/mL表示時，所述滴度可通過與已知IU/mL值的參考血清(標準品)的滴度進行比較來獲得。通常，將參考血清稀釋至2 IU/mL，並與測試血清並行測試。測試血清中抗體的滴度(IU/mL)可通過下式計算： 如圖5所示，與滅活疫苗相比，這些含mRNA的LNP在初次免疫後第45天可誘導顯著較高水準的針對狂犬病病毒的中和抗體。 如圖6A所示，4組小鼠用構建體5加Lip1-1進行疫苗接種，分別向所述小鼠注射5 μg、2 μg、0.5 μg和0.1 μg劑量的mRNA。與滅活疫苗免疫的小鼠相比，用不同劑量的構建體5加Lip1-1免疫的這些小鼠在所述時間點表現出較高水準的針對狂犬病病毒的中和抗體。 如圖6B所示，4組小鼠用構建體6加Lip1-1進行疫苗接種，分別向所述小鼠注射5 μg、2 μg、0.5 μg和0.1 μg劑量的mRNA。與滅活疫苗免疫的小鼠相比，用5 μg、2 μg和0.5 μg劑量的構建體6加Lip1-1免疫的這些小鼠在所述時間點表現出較高水準的針對狂犬病病毒的中和抗體。 T 細 胞反 應酶聯免疫斑點(ELISPOT)測定如所描述進行，進行了微小修改 ²⁰。簡言之，將預包被板(對於IFN-γ，MabTech #3321-4HST-2；對於IL-4，MabTech #3311-4APW-2；對於IL-6，MabTech #3361-4APW-2；對於IL-2，MabTech #3441-4APW-2)使用含有10% FBS的RPMI 1640 (# 22400-089 Gibco)封閉，並在37℃下孵育30分鐘。然後將來自免疫小鼠的脾細胞以300,000個細胞/孔鋪板，用G蛋白的肽庫(每種肽2 μg/mL，Genscript)、作為陽性對照的伴刀豆球蛋白A (#C2010, Sigma)或作為陰性對照的RPMI 1640培養基進行刺激。在37℃、5% CO ₂下孵育36小時後，用200 μL/孔PBS洗滌板，並向各孔中添加生物素化抗小鼠IFN-γ、IL-2、IL-4或IL-6抗體，然後在室溫下孵育2小時。添加100 μL AEC底物溶液(MabTech #3311-4APW-2)後，使用自動化ELISPOT讀取儀AID ELISPOT (AID)讀取風乾板。計算並顯示每1,000,000個細胞的斑點形成細胞(SFC)數量。 如圖7A-圖7F所示，所述構建體可誘導穩健的Th1偏向性細胞反應。 實 施例 B5. 小鼠中含 mRNA 的 LNP 的攻毒研究 在第0天，分別用含mRNA的LNP和滅活疫苗對多組6-8周齡雌性BALB/c小鼠(每組10只小鼠)進行免疫。14天后，再次用含mRNA的LNP對這些組的小鼠進行免疫。初次免疫後第21天，所有小鼠通過大腦內注射感染100×LD ₅₀狂犬病病毒CVS強毒株。感染後，連續觀察所有小鼠21天，記錄小鼠的死亡事件和神經學體征，神經學體征明顯的這些小鼠也被視為死亡事件。 如圖8A和圖8B所示，與用滅活疫苗(Vero細胞，Chengda Sucheng (Chengda Bio, Liaoning))免疫的小鼠相比，用構建體5和構建體6免疫的這些組小鼠表現出更高的存活率。 實 施例 B6. 在小鼠中用含 mRNA 的 LNP 疫苗接 種 後抗 體 反 應 的持 續時間 在第0天、第14天使用2 μg或0.5 μg用不同脂質包封的mRNA疫苗對多組6-8周齡雌性BALB/c小鼠(每組10只小鼠)進行肌內(i.m.)免疫。在第0天、第14天注射0.1人用劑量的市售滅活疫苗(HDCV ^TMKangH (Kangh, Chengdu))作為對照。在初次免疫後13天(疫苗接種前)、21天、35天、91天和175天收集血清樣品。通過ELISA分析所有血清樣品的G蛋白特異性IgG滴度和中和滴度測定。 與滅活疫苗相比，在相同時間點，含mRNA的LNP可在小鼠中誘導較高水準的抗體。如圖9A和圖9B所示，與用滅活疫苗免疫的小鼠相比，用含mRNA的LNP免疫的小鼠中抗體的持續時間更長。 參考文獻 1 Johnston, D. 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[ 圖 1A] 和[ 圖 1B]示出 通 過 FACS測定的細胞膜上的G蛋白的體外表達。 [ 圖 2]示出在初免後第14天， 通 過 ELISA測定的由針對G蛋白的不同候選物誘導的IgG滴度。 [ 圖 3]示出在初免後第28天， 通 過 ELISA測定的由針對G蛋白的不同候選物誘導的IgG滴度。 [ 圖 4]示出在初免後第45天， 通 過 ELISA測定的由針對G蛋白的不同候選物誘導的IgG滴度。 [ 圖 5]示出在初免後第45天， 通 過 RFFIT測定的由針對G蛋白的不同候選物誘導的中和滴度。 [ 圖 6A] 和[ 圖 6B]示出在初免後第21、28和42天， 通 過 RFFIT測定的由針對G蛋白的不同候選物誘導的中和滴度。 [ 圖 7A] -[ 圖 7F]示出在初免後第45天， 通 過 Elispot測定的由G蛋白肽庫刺激的脾T細胞反應。 [ 圖 8A] 和[ 圖 8B]示出攻毒(challenge)後小鼠的存活率。 [ 圖 9A 和[ 圖 9B]示出在初免後第13天、第21天、第35天、第91天和第175天，G蛋白特異性IgG滴度和中和滴度。

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Claims (50)

1. 一種非天然存在的核酸，所述非天然存在的核酸包含編碼狂犬病病毒(RV)的糖蛋白(G)或其片段的編碼核苷酸序列。
2. 如請求項1所述的非天然存在的核酸，其中所述G蛋白由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：與SEQ ID NO:1-3中任一個中所列的氨基酸序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列。
3. 如請求項2所述的非天然存在的核酸，其中所述編碼核苷酸序列由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：與SEQ ID NO:7-10中任一個中所列的核苷酸序列具有至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的核苷酸序列。
4. 如請求項1所述的非天然存在的核酸，其中所述編碼核苷酸序列已進行了密碼子優化以在受試者細胞中表達。
5. 如請求項4所述的非天然存在的核酸，其中所述受試者是非人哺乳動物；優選地，所述非人哺乳動物是犬科動物，或人。
6. 如請求項1至5中任一項所述的非天然存在的核酸，其中所述G蛋白或片段與天然信號肽融合；優選地，所述天然信號肽包含SEQ ID NO:4-6中任一個中所列的氨基酸序列。
7. 如請求項1至5中任一項所述的非天然存在的核酸，其中所述G蛋白或片段與異源多肽融合。
8. 如請求項7所述的非天然存在的核酸，其中所述異源多肽選自人免疫球蛋白的Fc區、信號肽和促進所述融合蛋白多聚化的肽。
9. 如請求項8所述的非天然存在的核酸，其中所述信號肽是來自IgE的信號肽；優選地，來自IgE的所述信號肽包含SEQ ID NO:14中所列的氨基酸序列。
10. 如請求項1至9中任一項所述的非天然存在的核酸，所述非天然存在的核酸還包含5’非翻譯區(5’-UTR)，其中所述5’-UTR包含SEQ ID NO: 24-33中任一個中所列的序列。
11. 如請求項1至10中任一項所述的非天然存在的核酸，所述非天然存在的核酸還包含3’非翻譯區(3’-UTR)，其中所述3’-UTR包含SEQ ID NO: 34-39中任一個中所列的序列。
12. 如請求項11所述的非天然存在的核酸，其中所述3’-UTR還包含poly-A尾或聚腺苷酸化信號。
13. 如請求項12所述的非天然存在的核酸，其中所述核酸由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：與SEQ ID NO:16-19中任一個中所列的核苷酸序列具有至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的核苷酸序列；優選地，所述核酸的所述poly-A尾被截短至110 nt。
14. 如請求項1至13中任一項所述的非天然存在的核酸，所述非天然存在的核酸包含選自假尿苷、1-甲基-假尿苷和5-甲基胞嘧啶的一種或多種功能性核苷酸類似物。
15. 如請求項1至14中任一項所述的非天然存在的核酸，其中所述核酸是DNA或mRNA。
16. 一種載體，所述載體包含如請求項1至15中任一項所述的非天然存在的核酸；優選地，所述載體是IVT質粒。
17. 一種細胞，所述細胞包含如請求項1至15中任一項所述的非天然存在的核酸。
18. 一種細胞，所述細胞包含如請求項16所述的載體。
19. 一種組合物，所述組合物包含如請求項1至15中任一項所述的非天然存在的核酸和至少第一脂質。
20. 如請求項19所述的組合物，其中所述第一脂質是根據式01-I或式01-II的化合物；或表01-1中所列的化合物；或根據式02-I的化合物；或表02-1中所列的化合物；或根據式03-I的化合物；或表03-1中所列的化合物；或根據式04-I的化合物；或表04-1中所列的化合物。
21. 如請求項19或20所述的組合物，所述組合物還包含第二脂質。
22. 如請求項21所述的組合物，其中所述第二脂質是根據式05-I的化合物。
23. 如請求項19至22中任一項所述的組合物，所述組合物被配製為將所述核酸包封在脂質殼中的脂質納米顆粒。
24. 如請求項19至23中任一項所述的組合物，其中所述組合物是藥物組合物。
25. 如請求項19至23中任一項所述的組合物，其中所述組合物是疫苗。
26. 一種用於控制、預防或治療受試者中由RV或由感染RV引起的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的如請求項1至15中任一項所述的非天然存在的核酸或如請求項19至25中任一項所述的組合物。
27. 如請求項26所述的方法，其中所述受試者是人或非人哺乳動物；優選地，所述非人哺乳動物是犬科動物。
28. 如請求項27所述的方法，其中所述受試者是人類成人、人類兒童或人類幼兒。
29. 如請求項27所述的方法，其中所述受試者是老年人。
30. 如請求項26至29中任一項所述的方法，其中所述受試者患有所述疾病或病症。
31. 如請求項26至29中任一項所述的方法，其中所述受試者處於RV感染的風險中或對RV感染易感。
32. 如請求項26至29中任一項所述的方法，其中所述受試者已被診斷為RV感染陽性。
33. 如請求項26至32中任一項所述的方法，其中所述受試者是無症狀的。
34. 如請求項26至33中任一項所述的方法，其中所述方法包括向所述受試者施用包封所述核酸的脂質納米顆粒，並且其中所述脂質納米顆粒被所述受試者中的細胞內吞。
35. 如請求項26至34中任一項所述的方法，其中所述核酸由所述受試者中的細胞表達。
36. 如請求項26至35中任一項所述的方法，其中在所述受試者中引發針對所述RV的免疫反應。
37. 如請求項36所述的方法，其中所述免疫反應包括在淋巴細胞中產生細胞因數。
38. 如請求項37所述的方法，其中所述淋巴細胞是CD4 ⁺T細胞和/或CD8 ⁺T細胞。
39. 如請求項37或38所述的方法，其中所述細胞因數是IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6中的一種或多種。
40. 如請求項37至39中任一項所述的方法，其中表達細胞因數的淋巴細胞的比例增加。
41. 如請求項37至40中任一項所述的方法，其中淋巴細胞中細胞因數的產生增加。
42. 如請求項36至41中任一項所述的方法，其中所述免疫反應包括產生與由所述核酸編碼的病毒G蛋白特異性結合的抗體。
43. 如請求項42所述的方法，其中所述抗體是針對RV或被RV感染的細胞的中和抗體。
44. 如請求項42或43所述的方法，其中在所述受試者中所述抗體的血清滴度增加。
45. 如請求項42至44中任一項所述的方法，其中所述抗體結合至病毒顆粒或被感染的細胞，並且標記被感染細胞的病毒顆粒，以被所述受試者的免疫系統破壞。
46. 如請求項42至45中任一項所述的方法，其中誘導或增強由所述抗體結合的病毒顆粒的內吞作用。
47. 如請求項42至46中任一項所述的方法，其中誘導或增強所述受試者中針對被感染細胞的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)。
48. 如請求項42至47中任一項所述的方法，其中誘導或增強所述受試者中針對被感染細胞的抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。
49. 如請求項42至48中任一項所述的方法，其中誘導或增強所述受試者中針對被感染細胞的補體依賴性細胞毒性(CDC)。
50. 如請求項26至49中任一項所述的方法，其中由RV引起的所述疾病或病症是狂犬病。