CN117460827A - 狂犬病核酸疫苗 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于控制、预防和/或治疗由狂犬病病毒或由感染狂犬病病毒引起的疾病或病症，例如狂犬病的治疗性核酸分子。本文还提供了包含所述治疗性核酸的治疗性组合物，包括疫苗和脂质纳米颗粒，以及相关的治疗方法和用途。

Description

狂犬病核酸疫苗
技术领域
本公开总体上涉及可用于控制、预防和治疗由狂犬病病毒(RABV或RV)或由感染狂犬病病毒引起的疾病或病症(例如，狂犬病)的核酸分子。本公开还涉及所述核酸分子的含脂质组合物(包括疫苗)。
背景技术
(1)病因学
狂犬病是一种由(单分子负链RNA病毒目(Mononegavirales)的弹状病毒科(Rhabdoviridae)中的)狂犬病病毒属病毒引起的动物性传染病，其首次在公元前4世纪描述1。狂犬病病毒(RABV或RV)是狂犬病病毒属的原型病毒1，是目前最常见的狂犬病病原体。RABV最容易通过受感染哺乳动物的咬伤传播，并且由受感染犬引起的病例占有比例高达>99％2。
RABV可通过破损皮肤暴露于受感染动物的唾液而识别并附着于细胞受体(例如，硫酸乙酰肝素3、烟碱型乙酰胆碱受体(nAchR)4、神经细胞粘附分子5、神经营养因子受体p75NTR6和促代谢型谷氨酸受体亚型2)，之后，病毒感染中枢神经系统并在中枢神经系统中复制，随后导致严重神经系统疾病如发热、瘙痒、感觉异常、恐水症等7,8。
RABV含有编码五种结构蛋白的单链负义RNA基因组：核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和RNA依赖性RNA聚合酶(L)9。在这些病毒蛋白质中，RABV的糖蛋白(RABV-G)通过介导病毒识别和附着于细胞受体以及病毒粒子内吞和内体腔酸化后病毒包膜与细胞膜的融合，从而起始病毒颗粒进入宿主细胞而在病毒的发病机制中发挥关键作用10。作为存在于病毒表面的唯一蛋白质，RABV-G是中和抗体的主要标靶11-13，因此选择G蛋白作为疫苗设计的主要标靶。
(2)流行病学
RABV在世界大部分地区由中食肉动物(mesocarnivores)(饮食由50％-70％肉组成的动物)维持，包括犬、狐狸、貉、浣熊、猫鼬和臭鼬14。犬传播的狂犬病导致>99％的人类报告病例。该病毒在世界许多地区仍是地方性动物病(即动物中的地方病)，并且人类狂犬病仍是最严重且最令人痛苦的疾病之一，且是对公共卫生的重大威胁15。事实上，当患有狂犬病的个体出现症状时，该疾病几乎总是致命的16。
在全球范围内，人类狂犬病被认为是被忽视的动物传染病，尤其是在非洲和亚洲资源有限的国家，疾病负担不成比例地下降且死亡率很高17。全世界每年估计的60,000人死亡并没有反映出这种疾病的真正负担14,18。研究结果表明，仅在印度每年就有多达20,000人丧生18。
允许犬接种疫苗、改善公共卫生策略，WHO、世界动物卫生组织(OIE)和联合国粮食及农业组织(FAO)制定了到2030年在流行国家消除犬传播的人类狂犬病的目标。
(3)疫苗
自19世纪以来，有效的人用狂犬病疫苗被用于预防暴露前或暴露后感染。目前市场上的疫苗主要是由Vero或人二倍体细胞培养的灭活疫苗。并且免疫接种程序是暴露后5剂或4剂，和暴露前3剂。
目前市场上的疫苗主要有三大担忧。一是漫长的疫苗接种方案。二是成本高。目前，市场上的狂犬病疫苗主要是灭活疫苗。由Vero细胞和人二倍体细胞增殖的狂犬病病毒滴度较低，而每剂需要比病毒培养物更高的滴度，从而导致需要浓缩病毒滴度，这使得生产工艺复杂且昂贵。第三个担忧是病毒培养涉及的生产工艺存在一定潜在安全风险。
传统的灭活疫苗不能诱导稳健细胞反应和显著高体液反应。相反，与灭活疫苗相比，mRNA疫苗能够诱导更高的细胞和体液反应，因为LNP可起到佐剂的作用。此外，由于mRNA生产过程不涉及特征病毒，因此不需要担心安全性和成本，并且生产周期比传统疫苗短。
发明内容
在一个方面，本文提供了可用于预防、控制和治疗由RV或由感染RV引起的疾病或病症(例如，狂犬病)的非天然存在的核酸分子。
在一些实施方案中，非天然存在的核酸包含编码RV的糖蛋白(G)(G蛋白)或其片段的编码核苷酸序列。在一些实施方案中，G蛋白或其片段由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：与SEQ ID NO:1-3中任一个中所列的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，G蛋白或其片段由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：与SEQ ID NO:1中所列的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，G蛋白或其片段由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：SEQ ID NO:1中所列的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码核苷酸序列由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：与SEQ ID NO:7或8中所列的核苷酸序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码核苷酸序列由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：SEQ ID NO:7或8中所列的核苷酸序列。在一些实施方案中，G蛋白或其片段由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：与SEQ IDNO:2中所列的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，G蛋白或其片段由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码核苷酸序列由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：与SEQ ID NO:9中所列的核苷酸序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码核苷酸序列由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：SEQ ID NO:9中所列的核苷酸序列。在一些实施方案中，G蛋白或其片段由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：与SEQ IDNO:3中所列的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，G蛋白或其片段由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：SEQ ID NO:3中所列的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码核苷酸序列由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：与SEQ ID NO:10中所列的核苷酸序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码核苷酸序列由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：SEQ ID NO:10中所列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码核苷酸序列已进行了密码子优化以在受试者细胞中表达。在一些实施方案中，受试者是非人哺乳动物，例如，犬科动物。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，G蛋白或其片段与天然信号肽融合。在一些实施方案中，信号肽由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：与SEQ ID NO:4-6中任一个中所列的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号肽由编码核苷酸序列编码，所述编码核苷酸序列由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：与SEQ ID NO:11-13中任一个中所列的核苷酸序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，G蛋白或其片段与异源多肽融合。在一些实施方案中，异源多肽选自人免疫球蛋白的Fc区、信号肽和促进融合蛋白多聚化的肽。在一些实施方案中，信号肽是来自IgE的信号肽。在一些实施方案中，信号肽由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：与SEQ ID NO:14中所列的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号肽由编码核苷酸序列编码，所述编码核苷酸序列由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：与SEQ ID NO:15中所列的核苷酸序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，多聚化是二聚化或三聚化。在一些实施方案中，非天然存在的核酸分子还包含5’非翻译区(5’-UTR)，其中5’-UTR包含SEQ ID NO:24-33中任一个中所列的序列。在一些实施方案中，非天然存在的核酸分子还包含3’非翻译区(3’-UTR)，其中3’-UTR包含SEQ ID NO:34-39中任一个中所列的序列。在一些实施方案中，3’-UTR还包含poly-A尾或聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，非天然存在的核酸包含选自假尿苷(psd)、1-甲基-假尿苷(m1)和5-甲基胞嘧啶的一种或多种功能性核苷酸类似物。在一些实施方案中，核酸是DNA或mRNA。
在一些实施方案中，本文公开了包含如本文所述的非天然存在的核酸分子的载体或细胞。优选地，载体是IVT质粒。在一些实施方案中，本文公开了包含如本文所述的非天然存在的核酸分子的组合物。
在本文所述的组合物的一些实施方案中，组合物还包含至少一种本文所述的脂质。在本文所述的组合物的一些实施方案中，组合物还包含至少本文所述的第一脂质(例如，阳离子脂质)和任选的本文所述的第二脂质(例如，聚合物结合的脂质)。
在一些实施方案中，第一脂质是根据式01-I或式01-II的化合物；或表01-1中所列的化合物；或根据式02-I的化合物；或表02-1中所列的化合物；或根据式03-I的化合物；或表03-1中所列的化合物；或根据式04-I的化合物；或表04-1中所列的化合物。
在一些实施方案中，组合物被配制为将核酸包封在脂质壳中的脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，组合物是药物组合物。在一些实施方案中，组合物是疫苗。
在一个方面，本文提供了用于控制、预防或治疗受试者中由RV或由感染RV引起的疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的非天然存在的核酸或治疗有效量的如本文所述的药物组合物。
在本文所述的方法的一些实施方案中，受试者是人或非人哺乳动物，例如犬科动物。在一些实施方案中，受试者是人类成人、人类儿童或人类幼儿。在一些实施方案中，受试者是老年人。在一些实施方案中，受试者患有疾病或病症。在一些实施方案中，受试者处于RV感染的风险中或对RV感染易感。在一些实施方案中，受试者已被诊断为RV感染阳性。在一些实施方案中，受试者是无症状的。
在本文所述的方法的一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用包封核酸的脂质纳米颗粒，并且其中脂质纳米颗粒被受试者中的细胞内吞。在一些实施方案中，核酸由受试者中的细胞表达。
在本文所述的方法的一些实施方案中，在受试者中引发针对RV的免疫反应。在一些实施方案中，免疫反应包括在淋巴细胞中产生细胞因子。在一些实施方案中，淋巴细胞是CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。在一些实施方案中，细胞因子是IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6中的一种或多种。在一些实施方案中，表达细胞因子的淋巴细胞的比例增加。在一些实施方案中，淋巴细胞中细胞因子的产生增加。在一些实施方案中，免疫反应包括产生与由核酸编码的病毒G蛋白特异性结合的抗体。在一些实施方案中，抗体是针对RV或被RV感染的细胞的中和抗体。在一些实施方案中，在受试者中抗体的血清滴度增加。
在本文所述的方法的一些实施方案中，抗体结合至病毒颗粒或被感染的细胞，并且标记被感染细胞的病毒颗粒，以被受试者的免疫系统破坏。在一些实施方案中，诱导或增强由抗体结合的病毒颗粒的内吞作用。在一些实施方案中，诱导或增强受试者中针对被感染细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，诱导或增强受试者中针对被感染细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。在一些实施方案中，诱导或增强受试者中针对被感染细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在本文所述的方法的一些实施方案中，由RV引起的疾病或病症是狂犬病。
附图说明
图1A和图1B示出通过FACS测定的细胞膜上的G蛋白的体外表达。
图2示出在初免后第14天，通过ELISA测定的由针对G蛋白的不同候选物诱导的IgG滴度。
图3示出在初免后第28天，通过ELISA测定的由针对G蛋白的不同候选物诱导的IgG滴度。
图4示出在初免后第45天，通过ELISA测定的由针对G蛋白的不同候选物诱导的IgG滴度。
图5示出在初免后第45天，通过RFFIT测定的由针对G蛋白的不同候选物诱导的中和滴度。
图6A和图6B示出在初免后第21、28和42天，通过RFFIT测定的由针对G蛋白的不同候选物诱导的中和滴度。
图7A-图7F示出在初免后第45天，通过Elispot测定的由G蛋白肽库刺激的脾T细胞反应。
图8示出攻毒(challenge)后小鼠的存活率。
图9A和图9B示出在初免后第13天、第21天、第35天、第91天和第175天，G蛋白特异性IgG滴度和中和滴度。
具体实施方式
本文提供了可用于预防、控制和治疗由RV或由感染RV引起的疾病或病症的治疗性核酸分子。本文还提供了包含治疗性核酸分子的药物组合物，包括被配制为脂质纳米颗粒的药物组合物，以及用于预防、控制和治疗由RV或由感染RV引起的疾病或病症的相关治疗方法和用途。在考虑特定实施方案的以下详细描述后，本公开的另外特征对于本领域技术人员将变得显而易见。
一般技术
本文所描述或引用的技术和程序包括本领域技术人员一般充分理解和/或使用常规方法通常采用的技术和程序，例如Sambrook等人，Molecular Cloning:A LaboratoryManual(第3版，2001)；Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编，2003)中所描述的广泛使用的方法。
术语
除非另有描述，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解相同的含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下术语描述，并且在适当时，以单数形式使用的术语还将包括复数形式，反之亦然。所有专利、申请、公布的申请和其它出版物均以引用的方式整体并入。如果对所陈述的术语的任何描述与以引用的方式并入本文中的任何文件相冲突，则应以下文对所陈述的术语的描述为准。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“脂质”是指一组有机化合物，其包括但不限于脂肪酸酯，并且一般以难溶于水但可溶于许多非极性有机溶剂中为特征。尽管脂质一般具有弱水溶性，但是某些类别的脂质(例如经极性基团改性的脂质，例如DMG-PEG2000)具有有限的水溶性并且在某些条件下可溶于水。已知的脂质类型包括生物分子，诸如脂肪酸、蜡、固醇、脂溶性维生素、单酸甘油酯、二酸甘油酯、三酸甘油酯和磷脂。脂质至少可分为三类：(1)“简单脂质”，包括脂肪和油，以及蜡；(2)“复合脂质”，包括磷脂和糖脂(例如DMPE-PEG2000)；以及(3)“衍生脂质”，诸如类固醇。此外，如本文所用，脂质还包括类脂质化合物。术语“类脂质化合物”又简称为“类脂质”，是指脂质样化合物(例如具有脂质样物理性质的两亲性化合物)。
术语“脂质纳米颗粒”或“LNP”是指具有至少一个纳米(nm)级尺寸(例如1至1,000nm)的颗粒，其含有一种或多种类型的脂质分子。本文所提供的LNP可进一步含有至少一种非脂质有效负载分子(例如一种或多种核酸分子)。在一些实施方案中，LNP包含部分或完全包封于脂质壳内的非脂质有效负载分子。特定来说，在一些实施方案中，其中有效负载是带负电荷的分子(例如编码病毒蛋白的mRNA)，并且LNP的脂质组分包含至少一种阳离子脂质。不受理论束缚，预期阳离子脂质可与带负电荷的有效负载分子相互作用，并且在LNP形成期间促进有效负载并入和/或包封至LNP中。可形成如本文所提供的LNP的一部分的其它脂质包括但不限于中性脂质和带电脂质，诸如类固醇、聚合物结合的脂质和各种两性离子性脂质。在某些实施方案中，根据本公开的LNP包含一种或多种如本文所述的式01-I、01-II、02-I、03-I、04-I和05-I(及其子式)的脂质。
术语“阳离子脂质”是指在其环境的任何pH值或氢离子活性下带正电荷，或能够响应于其环境(例如其预定使用的环境)的pH值或氢离子活性而带正电荷的脂质。因此，术语“阳离子”涵盖“永久性阳离子”和“可阳离子化”。在某些实施方案中，阳离子脂质中的正电荷由季氮原子的存在引起。在某些实施方案中，阳离子脂质包含两性离子性脂质，所述两性离子性脂质在其预定使用的环境中(例如在生理pH值下)带正电荷。在某些实施方案中，阳离子脂质是一种或多种如本文所述的式01-I、01-II、02-I、03-I和04-I(及其子式)的脂质。
术语“聚合物结合的脂质”是指既包含脂质部分又包含聚合物部分的分子。聚合物结合的脂质的实例是聚乙二醇化脂质(PEG-脂质)，其中聚合物部分包含聚乙二醇。在某些实施方案中，聚合物结合的脂质是一种或多种如本文所述的式05-I(及其子式)的脂质。
术语“中性脂质”涵盖在所选pH值下或在所选pH值范围内以不带电形式或以中性两性离子形式存在的任何脂质分子。在一些实施方案中，所选的有用pH值或范围对应于预定脂质用途的环境中的pH条件，诸如生理pH值。作为非限制性实例，可与本公开结合使用的中性脂质包括但不限于磷脂酰胆碱，诸如1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)；磷脂酰乙醇胺，诸如1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、2-((2,3-双(油酰氧基)丙基)二甲基铵基)磷酸氢乙酯(DOCP)；鞘磷脂(SM)；神经酰胺；类固醇，诸如固醇和其衍生物。本文所提供的中性脂质可为合成的或者衍生自天然来源或化合物(从其分离或改性)。
术语“带电脂质”涵盖在所选pH值下或在所选pH值范围内以带正电荷或带负电荷形式存在的任何脂质分子。在一些实施方案中，所选pH值或范围对应于预定脂质用途的环境中的pH条件，诸如生理pH值。作为非限制性实例，可与本公开结合使用的带电脂质包括但不限于磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、固醇半琥珀酸酯、二烷基三甲基铵-丙烷(例如DOTAP、DOTMA)、二烷基二甲基氨基丙烷、乙基磷酸胆碱、二甲基氨基乙烷氨基甲酰基固醇(例如DC-Chol)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸钠盐(DOPS-Na)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-外消旋-甘油)钠盐(DOPG-Na)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸钠盐(DOPA-Na)。本文所提供的带电脂质可为合成的或者衍生自天然来源或化合物(从其分离或改性)。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“烷基”是指仅由碳和氢原子组成的饱和直链或支链烃链基团。在一个实施方案中，烷基具有例如1至24个碳原子(C1-C24烷基)、4至20个碳原子(C4-C20烷基)、6至16个碳原子(C6-C16烷基)、6至9个碳原子(C6-C9烷基)、1至15个碳原子(C1-C15烷基)、1至12个碳原子(C1-C12烷基)、1至8个碳原子(C1-C8烷基)或1至6个碳原子(C1-C6烷基)，并且通过单键连接至分子其余部分。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基等。除非另有说明，否则烷基任选地经取代。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“烯基”是指仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基团，其含有一个或多个碳-碳双键。如本领域普通技术人员所理解，术语“烯基”还涵盖具有“顺式”和“反式”构型或替代地，“E”和“Z”构型的基团。在一个实施方案中，烯基具有例如2至24个碳原子(C2-C24烯基)、4至20个碳原子(C4-C20烯基)、6至16个碳原子(C6-C16烯基)、6至9个碳原子(C6-C9烯基)、2至15个碳原子(C2-C15烯基)、2至12个碳原子(C2-C12烯基)、2至8个碳原子(C2-C8烯基)或2至6个碳原子(C2-C6烯基)，并且通过单键连接至分子其余部分。烯基的实例包括但不限于乙烯基、丙-1-烯基、丁-1-烯基、戊-1-烯基、戊-1,4-二烯基等。除非另有说明，否则烯基任选地经取代。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“炔基”是指仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基团，其含有一个或多个碳-碳三键。在一个实施方案中，炔基具有例如2至24个碳原子(C2-C24炔基)、4至20个碳原子(C4-C20炔基)、6至16个碳原子(C6-C16炔基)、6至9个碳原子(C6-C9炔基)、2至15个碳原子(C2-C15炔基)、2至12个碳原子(C2-C12炔基)、2至8个碳原子(C2-C8炔基)或2至6个碳原子(C2-C6炔基)，并且通过单键连接至分子其余部分。炔基的实例包括但不限于乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基等。除非另有说明，否则炔基任选地经取代。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“亚烷基”或“亚烷基链”是指将分子其余部分连接至基团的直链或支链二价烃链，其仅由碳和氢组成并且为饱和的。在一个实施方案中，亚烷基具有例如1至24个碳原子(C1-C24亚烷基)、1至15个碳原子(C1-C15亚烷基)、1至12个碳原子(C1-C12亚烷基)、1至8个碳原子(C1-C8亚烷基)、1至6个碳原子(C1-C6亚烷基)、2至4个碳原子(C2-C4亚烷基)、1至2个碳原子(C1-C2亚烷基)。亚烷基的实例包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚正丁基等。亚烷基链通过单键连接至分子其余部分，并且通过单键连接至基团。亚烷基链与分子其余部分和与基团的连接点可通过链内的一个碳或任何两个碳。除非另有说明，否则亚烷基链任选地经取代。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“亚烯基”是指将分子其余部分连接至基团的直链或支链二价烃链，其仅由碳和氢组成并且含有一个或多个碳-碳双键。在一个实施方案中，亚烯基具有例如2至24个碳原子(C2-C24亚烯基)、2至15个碳原子(C2-C15亚烯基)、2至12个碳原子(C2-C12亚烯基)、2至8个碳原子(C2-C8亚烯基)、2至6个碳原子(C2-C6亚烯基)或2至4个碳原子(C2-C4亚烯基)。亚烯基的实例包括但不限于亚乙烯基、亚丙烯基、亚正丁烯基等。亚烯基通过单键或双键连接至分子其余部分，并且通过单键或双键连接至基团。亚烯基与分子其余部分和与基团的连接点可通过链内的一个碳或任何两个碳。除非另有说明，否则亚烯基任选地经取代。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“环烷基”是指仅由碳和氢原子组成的非芳族饱和单环或多环烃基。环烷基可包括稠合或桥连环系统。在一个实施方案中，环烷基具有例如3至15个环碳原子(C3-C15环烷基)、3至10个环碳原子(C3-C10环烷基)或3至8个环碳原子(C3-C8环烷基)。环烷基通过单键连接至分子其余部分。单环环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。多环环烷基的实例包括但不限于金刚烷基、降冰片基、十氢萘基、7,7-二甲基-双环[2.2.1]庚基等。除非另有说明，否则环烷基任选地经取代。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“亚环烷基”是二价环烷基。除非另有说明，否则亚环烷基任选地经取代。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“环烯基”是指仅由碳和氢原子组成并且包括一个或多个碳-碳双键的非芳族单环或多环烃基。环烯基可包括稠合或桥连环系统。在一个实施方案中，环烯基具有例如3至15个环碳原子(C3-C15环烯基)、3至10个环碳原子(C3-C10环烯基)或3至8个环碳原子(C3-C8环烯基)。环烯基通过单键连接至分子其余部分。单环环烯基的实例包括但不限于环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环辛烯基等。除非另有说明，否则环烯基任选地经取代。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“亚环烯基”是二价环烯基。除非另有说明，否则亚环烯基任选地经取代。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“杂环基”是指含有一个或多个(例如一个、一个或两个、一个至三个、或一个至四个)独立地选自氮、氧、磷和硫的杂原子的非芳族基团单环或多环部分。杂环基可在任何杂原子或碳原子处连接至主结构。杂环基可为单环、双环、三环、四环或其它多环系统，其中多环系统可为稠合、桥连或螺环系统。杂环基多环系统可在一个或多个环中包含一个或多个杂原子。杂环基可为饱和或部分不饱和的。饱和杂环烷基可称为“杂环烷基”。部分不饱和的杂环烷基在杂环基含有至少一个双键时可称为“杂环烯基”，或在杂环基含有至少一个三键时可称为“杂环炔基”。在一个实施方案中，杂环基具有例如3至18个环原子(3元至18元杂环基)、4至18个环原子(4元至18元杂环基)、5至18个环原子(3元至18元杂环基)、4至8个环原子(4元至8元杂环基)或5至8个环原子(5元至8元杂环基)。当在本文中出现时，数字范围，诸如“3至18”是指给定范围中的每个整数；例如，“3至18个环原子”意指杂环基可由3个环原子、4个环原子、5个环原子、6个环原子、7个环原子、8个环原子、9个环原子、10个环原子等(至多并且包括18个环原子)组成。杂环基的实例包括但不限于咪唑基、咪唑烷基、噁唑基、噁唑烷基、噻唑基、噻唑烷基、吡唑烷基、吡唑基、异噁唑烷基、异噁唑基、异噻唑烷基、异噻唑基、吗啉基、吡咯基、吡咯烷基、呋喃基、四氢呋喃基、噻吩基、吡啶基、哌啶基、喹啉基和异喹啉基。除非另有说明，否则杂环基任选地经取代。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“亚杂环基”是二价杂环基。除非另有说明，否则亚杂环基任选地经取代。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“芳基”是指含有至少一个芳族烃环的单环芳族基团和/或多环单价芳族基团。在某些实施方案中，芳基具有6至18个环碳原子(C6-C18芳基)、6至14个环碳原子(C6-C14芳基)或6至10个环碳原子(C6-C10芳基)。芳基的实例包括但不限于苯基、萘基、芴基、薁基、蒽基、菲基、芘基、联苯基和联三苯基。术语“芳基”还指双环、三环或其它多环烃环，其中至少一个环是芳族环，并且其它环可为饱和、部分不饱和或芳族环，例如二氢萘基、茚基、二氢茚基或四氢萘基(tetrahydronaphthyl/tetralinyl)。除非另有说明，否则芳基任选地经取代。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“亚芳基”是二价芳基。除非另有说明，否则亚芳基任选地经取代。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“杂芳基”是指含有至少一个芳族环的单环芳族基团和/或多环芳族基团，其中至少一个芳族环含有一个或多个(例如一个、一个或两个、一个至三个、或一个至四个)独立地选自O、S和N的杂原子。杂芳基可在任何杂原子或碳原子处连接至主结构。在某些实施方案中，杂芳基具有5至20个、5至15个或5至10个环原子。术语“杂芳基”还指双环、三环或其它多环，其中至少一个环是芳族环，并且其它环可为饱和、部分不饱和或芳族环，其中至少一个芳族环含有一个或多个独立地选自O、S和N的杂原子。单环杂芳基的实例包括但不限于吡咯基、吡唑基、吡唑啉基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、噻二唑基、异噻唑基、呋喃基、噻吩基、噁二唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基和三嗪基。双环杂芳基的实例包括但不限于吲哚基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并噻吩基、喹啉基、四氢异喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并吡喃基、吲哚嗪基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、色酮基、香豆素基、噌啉基、喹噁啉基、吲唑基、嘌呤基、吡咯并吡啶基、呋喃并吡啶基、噻吩并吡啶基、二氢异吲哚基和四氢喹啉基。三环杂芳基的实例包括但不限于咔唑基、苯并吲哚基、菲咯啉基、吖啶基、菲啶基和呫吨基。除非另有说明，否则杂芳基任选地经取代。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“亚杂芳基”是二价杂芳基。除非另有说明，否则亚杂芳基任选地经取代。
当本文所述的基团被称为“经取代”时，其可经一个或多个任何适当的取代基取代。取代基的说明性实例包括但不限于本文所提供的示例性化合物和实施方案中可见的那些，以及：卤素原子，诸如F、Cl、Br或I；氰基；氧代基(＝O)；羟基(-OH)；烷基；烯基；炔基；环烷基；芳基；-(C＝O)OR’；-O(C＝O)R’；-C(＝O)R’；-OR’；-S(O)xR’；-S-SR’；-C(＝O)SR’；-SC(＝O)R’；-NR’R’；-NR’C(＝O)R’；-C(＝O)NR’R’；-NR’C(＝O)NR’R’；-OC(＝O)NR’R’；-NR’C(＝O)OR’；-NR’S(O)xNR’R’；-NR’S(O)xR’；以及-S(O)xNR’R’，其中：R’在每次出现时独立地是H、C1-C15烷基或环烷基，并且x是0、1或2。在一些实施方案中，取代基是C1-C12烷基。在其它实施方案中，取代基是环烷基。在其它实施方案中，取代基是卤基，诸如氟基。在其它实施方案中，取代基是氧代基。在其它实施方案中，取代基是羟基。在其它实施方案中，取代基是烷氧基(-OR’)。在其它实施方案中，取代基是羧基。在其它实施方案中，取代基是氨基(-NR’R’)。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“任选存在的”或“任选地”(例如任选地经取代)意指随后描述的事件或情况可能会发生或可能不会发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的情况和其不发生的情况。举例来说，“任选地经取代的烷基”意指烷基可经取代或可不经取代，并且该描述包括经取代的烷基和不具有取代的烷基二者。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语生物活性化合物的“前药”是指可在生理条件下或通过溶剂分解而转化为生物活性化合物的化合物。在一个实施方案中，术语“前药”是指生物活性化合物的药学上可接受的代谢前体。前药在施用至有需要的受试者时可为无活性的，但在体内转化为生物活性化合物。前药通常在体内迅速转型以产生母体生物活性化合物，例如通过在血液中水解而转型。前药化合物在哺乳动物生物体中通常提供溶解性、组织相容性或延迟释放的优点(参见Bundgard,H.,Design of Prodrugs(1985)，第7-9页，第21-24页(Elsevier,Amsterdam))。关于前药的论述提供于Higuchi,T.等人，A.C.S.Symposium Series，第14卷；以及Bioreversible Carriers in Drug Design,Edward B.Roche编辑，American Pharmaceutical Association and Pergamon Press,1987中。
在一个实施方案中，术语“前药”还意图包括任何共价键结的载体，当将此类前药施用哺乳动物受试者时，其在体内释放活性化合物。化合物的前药可通过修饰化合物中存在的官能团来制备，其方式是使得修饰可在常规操作中或在体内裂解而得到母体化合物。前药包括羟基、氨基或巯基键结至任何基团的化合物，当将化合物的前药施用哺乳动物受试者时，所述基团裂解而分别形成游离羟基、游离氨基或游离巯基。
前药的实例包括但不限于本文所提供化合物中的醇官能团的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物或胺官能团的酰胺衍生物。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“药学上可接受的盐”包括酸加成盐和碱加成盐二者。
药学上可接受的酸加成盐的实例包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；以及有机酸，诸如但不限于乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、褐藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰胺基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸(cyclamic acid)、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙烷磺酸、2-羟基乙烷磺酸、甲酸、延胡索酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲烷磺酸、粘液酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸(pamoic acid)、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一碳烯酸等。
药学上可接受的碱加成盐的实例包括但不限于通过将无机碱或有机碱添加至游离酸化合物而制备的盐。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。在一个实施方案中，无机盐是铵盐、钠盐、钾盐、钙盐和镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于以下的盐：伯胺、仲胺和叔胺；经取代胺，包括天然存在的经取代胺；环胺和碱性离子交换树脂，诸如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇(deanol)、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因(procaine)、哈胺(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺(benethamine)、苄星(benzathine)、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱(theobromine)、三乙醇胺、氨基丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等。在一个实施方案中，有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。
本文所提供的化合物可含有一个或多个不对称中心，因此可产生对映异构体、非对映异构体和其它立体异构形式，所述形式可根据绝对立体化学定义为(R)-或(S)-或对于氨基酸可定义为(D)-或(L)-。除非另有说明，否则本文所提供的化合物意图包括所有此类可能的异构体，以及它们的外消旋和光学纯形式。光学活性(+)与(-)、(R)-与(S)-或(D)-与(L)-异构体可使用手性合成子或手性试剂制备，或使用常规技术，例如色谱法和分步结晶法拆分。用于制备/分离个别对映异构体的常规技术包括从适合的光学纯前体手性合成或使用例如手性高压液相色谱法(HPLC)拆分外消旋物(或盐或衍生物的外消旋物)。当本文所述化合物含有烯属双键或其它几何不对称中心时，除非另有说明，否则所述化合物意图包括E和Z几何异构体。同样，还意图包括所有互变异构形式。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“异构体”是指具有相同分子式的不同化合物。“立体异构体”是仅原子在空间中的排列方式不同的异构体。“阻转异构体”是由围绕单键的受阻旋转得到的立体异构体。“对映异构体”是一对互为不可重叠的镜像的立体异构体。一对对映异构体的任何比例的混合物可称为“外消旋”混合物。“非对映异构体”是具有至少两个不对称原子但不互为镜像的立体异构体。
“立体异构体”还可包括E和Z异构体或其混合物，以及顺式和反式异构体或其混合物。在某些实施方案中，本文所述的化合物经分离为E或Z异构体。在其它实施方案中，本文所述的化合物是E和Z异构体的混合物。
“互变异构体”是指化合物的彼此平衡的异构形式。异构形式的浓度将取决于化合物所处的环境，并且可根据例如化合物是固体还是在有机溶液或水溶液中而有所不同。
还应注意，本文所述的化合物可在一个或多个原子处含有非天然比例的原子同位素。举例来说，化合物可用放射性同位素，诸如氚(3H)、碘-125(125I)、硫-35(35S)或碳-14(14C)进行放射性标记，或者可为同位素富集的，诸如氘(2H)、碳-13(13C)或氮-15(15N)。如本文所用，“同位素体”是同位素富集的化合物。术语“同位素富集”是指原子的同位素组成不同于该原子的天然同位素组成。“同位素富集”还可指化合物含有的至少一个原子的同位素组成不同于该原子的天然同位素组成。术语“同位素组成”是指给定原子存在的每种同位素的量。经放射性标记和同位素富集的化合物可用作治疗剂，例如癌症治疗剂；研究试剂，例如结合分析试剂；以及诊断剂，例如体内成像剂。本文所述化合物的所有同位素变化形式，无论是否具有放射性，都意图涵盖在本文所提供的实施方案的范围内。在一些实施方案中，提供本文所述化合物的同位素体，例如同位素体是氘、碳-13和/或氮-15富集的。如本文所用，“氘代”是指化合物中的至少一个氢(H)已经氘(以D或2H表示)置换，即，化合物在至少一个位置处富含氘。
应注意，如果所描绘的结构与该结构的名称之间存在差异，则应以所描绘的结构为准。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包括但不限于被美国食品与药物管理局(United States Food and DrugAdministration)批准可接受用于人类或家畜的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、风味增强剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。
术语“组合物”意图涵盖含有任选地选用的指定量的指定成分(例如本文所提供的mRNA分子)的产品。
如本文可互换使用，术语“聚核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括例如DNA和RNA。核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或可通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应并入聚合物中的任何底物。聚核苷酸可包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和其类似物。核酸可为单链或双链形式。如本文所用并且除非另有说明，否则“核酸”还包括核酸模拟物，诸如锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和吗啉核酸。如本文所用，“寡核苷酸”是指短的合成聚核苷酸，其长度一般但未必少于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”与“聚核苷酸”不是互相排斥的。以上关于聚核苷酸的描述同样完全适用于寡核苷酸。除非另有说明，否则本文所公开的任何单链聚核苷酸序列的左手端为5’端；双链聚核苷酸序列的左手方向称为5’方向。新生RNA转录物的5’至3’添加方向称为转录方向；DNA链上具有与RNA转录物相同的序列并且相对于RNA转录物的5’端而位于5’处的序列区域称为“上游序列”；DNA链上具有与RNA转录物相同的序列并且相对于RNA转录物的3’端而位于3’处的序列区域称为“下游序列”。
如本文所用，术语“非天然存在的”当参考如本文所述的核酸分子使用时意图指所述核酸分子在自然界中不存在。编码病毒肽或蛋白质的非天然存在的核酸含有至少一种通常不存在于病毒的天然存在的毒株(包括病毒的野生型毒株)中的遗传改变或化学修饰。遗传改变包括例如引入编码病毒的异源肽或多肽的可表达核酸序列的修饰、其它核酸添加、核酸缺失、核酸取代和/或对病毒的遗传物质的其它功能破坏。此类修饰包括例如对病毒物种的异源、同源、或异源和同源多肽的编码区和其功能片段的修饰。额外修饰包括例如对非编码调节区的修饰，其中所述修饰改变基因或操纵子的表达。额外修饰还包括例如将核酸序列并入诸如质粒或人工染色体的载体中。化学修饰包括例如一种或多种如本文所述的功能性核苷酸类似物。
“分离的核酸”是指与天然地伴随原生序列的其它基因组DNA序列以及蛋白质或复合物(诸如核糖体和聚合酶)基本上分离的核酸，例如RNA、DNA或混合核酸。“分离”的核酸分子是与存在于核酸分子的天然来源中的其它核酸分子分离的核酸分子。此外，当通过重组技术制造时，“分离”的核酸分子，诸如mRNA分子，可基本上不含其它细胞材料或培养基，或者当化学合成时，其可基本上不含化学前体或其它化学品。在具体实施方案中，本文所述的编码抗原的一种或多种核酸分子是分离或纯化的。该术语包括已从其天然存在的环境移出的核酸序列，并且包括重组或克隆的DNA或RNA分离物以及化学合成的类似物或由异源系统生物合成的类似物。基本上纯的分子可包括分子的分离形式。
术语“编码核酸”或其语法等效物当用于指核酸分子时包括：(a)处于原生状态或通过本领域技术人员熟知的方法操作时可转录产生mRNA并且接着翻译成肽和/或多肽的核酸分子；以及(b)mRNA分子本身。反义链是此类核酸分子的互补序列，并且可由其推断出编码序列。术语“编码区”是指编码核酸序列中翻译成肽或多肽的部分。术语“非翻译区”或“UTR”是指编码核酸中不翻译成肽或多肽的部分。取决于UTR相对于核酸分子的编码区的取向，UTR如果位于编码区5’端，则称为5’-UTR，并且UTR如果位于编码区3’端，则称为3’-UTR。
如本文所用，术语“mRNA”是指包含一个或多个开放阅读框(ORF)的信使RNA分子，其可经具有该mRNA的细胞或生物体翻译以产生一种或多种肽或蛋白质产物。含有一个或多个ORF的区域称为mRNA分子的编码区。在某些实施方案中，mRNA分子还包含一个或多个非翻译区(UTR)。
在某些实施方案中，mRNA是仅包含一个ORF的单顺反子mRNA。在某些实施方案中，单顺反子mRNA编码包含选定抗原(例如致病性抗原或肿瘤相关抗原)的至少一个表位的肽或蛋白质。在其它实施方案中，mRNA是包含两个或更多个ORF的多顺反子mRNA。在某些实施方案中，多顺反子mRNA编码可彼此相同或不同的两种或更多种肽或蛋白质。在某些实施方案中，由多顺反子mRNA编码的每种肽或蛋白质包含选定抗原的至少一个表位。在某些实施方案中，由多顺反子mRNA编码的不同肽或蛋白质各自包含不同抗原的至少一个表位。在本文所述任一实施方案中，所述至少一个表位可为抗原的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个表位。
术语“核碱基”涵盖嘌呤和嘧啶，包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷以及其天然或合成类似物或衍生物。
如本文所用，术语“功能性核苷酸类似物”是指经典核苷酸A、G、C、U或T的经修饰型式，所述型式(a)保留对应经典核苷酸的碱基配对特性，并且(b)含有至少一种对对应天然核苷酸的(i)核碱基、(ii)糖基、(iii)磷酸酯基或(iv)(i)至(iii)的任何组合的化学修饰。如本文所用，碱基配对不仅涵盖经典沃森-克里克(Watson-Crick)腺嘌呤-胸腺嘧啶、腺嘌呤-尿嘧啶或鸟嘌呤-胞嘧啶碱基对，而且还涵盖在经典核苷酸与功能性核苷酸类似物之间或在一对功能性核苷酸类似物之间形成的碱基对，其中氢键供体与氢键受体的布置允许在经修饰的核碱基与经典核碱基之间或在两个互补的经修饰核碱基结构之间形成氢键。举例来说，鸟苷(G)的功能性类似物保留与胞嘧啶(C)或胞嘧啶的功能性类似物碱基配对的能力。此类非经典碱基配对的一个实例是经修饰核苷酸肌苷与腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之间的碱基配对。如本文所述，功能性核苷酸类似物可为天然存在或非天然存在的。因此，含有功能性核苷酸类似物的核酸分子可具有至少一个经修饰的核碱基、糖基和/或核苷间键联。本文提供对核酸分子的核碱基、糖基或核苷间键联的示例性化学修饰。
如本文所用，术语“翻译增强子元件”、“TEE”和“翻译增强子”是指核酸分子中用于促进核酸的编码序列翻译成蛋白质或肽产物，诸如通过帽依赖性或非帽依赖性翻译而翻译成蛋白质或肽产物的区域。TEE通常位于核酸分子(例如mRNA)的UTR区，并且增强位于上游或下游的编码序列的翻译水平。举例来说，核酸分子的5’-UTR中的TEE可位于核酸分子的启动子与起始密码子之间。各种TEE序列为此项技术中已知的(Wellensiek等人，Genome-wideprofiling of human cap-independent translation-enhancing elements,NatureMethods,2013年8月；10(8):747-750；Chappell等人，PNAS，2004年6月29日，101(26)9590-9594)。已知一些TEE在多个物种之间保守(Pánek等人，Nucleic Acids Research，第41卷，第16期，2013年9月1日，第7625-7634页)。
如本文所用，术语“茎-环序列”是指具有至少两个区域的单链聚核苷酸序列，当以相反方向阅读时，所述两个区域彼此互补或基本上互补，并且因此能够彼此碱基配对形成至少一个双螺旋和未配对的环。所得到的结构称为茎-环结构、发夹或发夹环，其为在许多RNA分子中发现的二级结构。
如本文所用，术语“肽”是指含有二至五十(2-50)个经一个或多个共价肽键连接的氨基酸残基的聚合物。该术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及一个或多个氨基酸残基是非天然存在的氨基酸(例如氨基酸类似物或非天然氨基酸)的氨基酸聚合物。
术语“多肽”与“蛋白质”在本文中可互换使用，指具有超过五十(50)个由共价肽键连接的氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于针对蛋白质的描述，反之亦然。该术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及一个或多个氨基酸残基是非天然存在的氨基酸(例如氨基酸类似物)的氨基酸聚合物。如本文所用，该术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质(例如抗原)。
在肽或多肽的情况下，如本文所用，术语“衍生物”是指包含病毒肽或蛋白质的氨基酸序列或病毒肽或蛋白质的片段的肽或多肽，其已通过引入氨基酸残基取代、缺失或添加而发生改变。如本文所用，术语“衍生物”还指病毒肽或蛋白质，或者病毒肽或蛋白质的片段，其已例如通过使任何类型的分子共价连接至多肽而经化学修饰。例如但非限制，病毒肽或蛋白质或者病毒肽或蛋白质的片段可例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护基/阻断基衍生化、蛋白水解裂解、化学裂解、配制、衣霉素代谢合成、与细胞配体或其它蛋白质连接等而经化学修饰。衍生物以在所连接分子的类型或位置方面不同于天然存在或起始肽或多肽的方式经修饰。衍生物还包括一个或多个天然存在于病毒肽或蛋白质上的化学基团的缺失。此外，病毒肽或蛋白质或者病毒肽或蛋白质的片段的衍生物可含有一种或多种非经典氨基酸。在具体实施方案中，衍生物是衍生出所述衍生物的原生或未经修饰的肽或多肽的功能衍生物。
术语“功能衍生物”是指保留衍生出所述衍生物的天然存在或起始肽或多肽的一种或多种功能或活性的衍生物。例如，RV G蛋白的功能衍生物可保留结合宿主细胞上的一种或多种其受体的能力。
术语“同一性”是指两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系，如通过比对和比较序列所确定。相对于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列并且必要时为了实现最大序列同一性百分比而引入间隙之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基一致的氨基酸残基的百分比，并且不考虑将任何保守取代视为序列同一性的一部分。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的而进行的比对可以本领域技术内的多种方式，例如使用公开可得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNAStar,Inc.)软件来实现。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长内实现最大比对所需的任何算法。
对氨基酸残基/位置的“修饰”是指如与起始氨基酸序列相比一级氨基酸序列的变化，其中该变化是由涉及所述氨基酸残基/位置的序列改变引起的。例如，典型修饰包括用另一氨基酸取代残基(例如，保守或非保守取代)、紧邻所述残基/位置插入一个或多个(例如，通常少于5、4或3个)氨基酸和/或缺失所述残基/位置。
在肽或多肽的情况下，如本文所用，术语“片段”是指包含少于全长的氨基酸序列的肽或多肽。此类片段可例如来自于氨基末端的截短、羧基末端的截短和/或氨基酸序列中残基的内部缺失。片段可例如由选择性RNA剪接或由体内蛋白酶活性产生。在某些实施方案中，片段是指包含多肽的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少30个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个、至少550个、至少600个、至少650个、至少700个、至少750个、至少800个、至少850个、至少900个或至少950个连续氨基酸残基的氨基酸序列的多肽。在具体实施方案中，多肽的片段保留多肽的至少1种、至少2种、至少3种或更多种功能。
如本文在肽或多肽(例如，蛋白质)的上下文中所使用的，术语“免疫原性片段”是指肽或多肽的片段，其保留肽或多肽在与哺乳动物免疫系统接触时引发免疫反应(包括先天性免疫反应和/或适应性免疫反应)的能力。在一些实施方案中，肽或多肽的免疫原性片段可以是表位。
术语“抗原”是指能够被受试者的免疫系统(包括适应性免疫系统)识别并且能够在使受试者与抗原接触后触发免疫反应(包括抗原特异性免疫反应)的物质。在某些实施方案中，抗原是与患病细胞(诸如被病原体感染的细胞)或赘生性细胞相关的蛋白质(例如，肿瘤相关抗原(TAA))。
“表位”是抗原分子表面上的与单个抗体分子结合的位点，诸如抗原表面上能够与抗体的一个或多个抗原结合区结合并且在动物，诸如哺乳动物(例如人类)中具有能够引发免疫反应的抗原性或免疫原性活性的局部区域。具有免疫原性活性的表位是在动物中引发抗体反应的多肽的一部分。具有抗原活性的表位是抗体所结合的多肽的一部分，如通过本领域中熟知的任何方法(包括例如通过免疫分析)所测定。抗原表位不一定是免疫原性的。表位通常由分子的化学活性表面基团诸如氨基酸或糖侧链组成，并且具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。抗体表位可以是线性表位或构象表位。线性表位由蛋白质中连续的氨基酸序列形成。构象表位由在蛋白质序列中是不连续的，但在蛋白质折叠成其三维结构时聚集在一起的氨基酸形成。当蛋白质的三维结构处于改变的构象时，诸如在活化或结合另一种蛋白质或配体后，形成诱导的表位。在某些实施方案中，表位是多肽的三维表面特征。在其它实施方案中，表位是多肽的线性特征。通常，抗原具有若干或许多不同的表位，并且可与许多不同的抗体反应。
术语“异源的”是指在自然界中未发现与天然存在的RV相关(例如由其基因组编码和/或表达)的实体。术语“同源的”是指在自然界中发现与天然存在的RV相关(例如由其基因组编码和/或表达)的实体。
如本文所用，术语“基因疫苗”是指包含至少一种核酸分子的治疗性或预防性组合物，所述至少一种核酸分子编码与标靶疾病(例如感染性疾病或赘生性疾病)相关的抗原。向受试者施用疫苗(“疫苗接种”)允许产生编码的肽或蛋白质，由此在受试者体内引发针对标靶疾病的免疫反应。在某些实施方案中，免疫反应包括适应性免疫反应，诸如产生针对编码的抗原的抗体，和/或能够特异性消除表达该抗原的患病细胞的免疫细胞的活化和增殖。在某些实施方案中，免疫反应还包括先天性免疫反应。根据本公开，疫苗可在标靶疾病的临床症状发作之前或之后施用受试者。在一些实施方案中，对健康或无症状受试者进行疫苗接种使经疫苗接种的受试者对标靶疾病的发展具有免疫性或不太敏感。在一些实施方案中，对显示疾病症状的受试者进行疫苗接种改善经疫苗接种的受试者的疾病状况或治疗疾病。
术语“载体”是指用于携带或包含核酸序列的物质，包括例如编码本文所述的病毒肽或蛋白质的核酸序列，以便将核酸序列引入宿主细胞中，或用作转录模板以在无细胞系统中进行体外转录反应以产生mRNA。适用于使用的载体包括例如表达载体、质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体，其可包括可操作用于稳定整合到宿主细胞的染色体中的选择序列或标记。另外，载体可包括一种或多种选择性标记基因和适当的转录或翻译控制序列。例如，可包括的选择性标记基因提供对抗生素或毒素的抗性、补充营养缺陷型缺乏或提供不在培养基中的关键营养物。转录或翻译控制序列可包括本领域中熟知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。当两个或更多个核酸分子(例如，编码两种或更多种不同病毒肽或蛋白质的核酸分子)被共转录或共翻译时，两个核酸分子可被插入例如同一表达载体中或单独的表达载体中。对于单一载体转录和/或翻译，可将编码核酸可操作地连接至一个共同的转录或翻译控制序列，或连接至不同的转录或翻译控制序列，诸如一种诱导型启动子和一种组成型启动子。可使用本领域中熟知的方法确认核酸分子引入宿主细胞中。此类方法包括例如核酸分析，诸如RNA印迹(Northern blot)或mRNA的聚合酶链反应(PCR)扩增；用于基因产物的表达的免疫印迹；或测试所引入核酸序列或其对应基因产物的表达的其它合适的分析方法。本领域技术人员应理解，核酸分子以足够的量表达以产生所需产物(例如，如本文所述的核酸的mRNA转录物)，并且应进一步理解，可以使用本领域中熟知的方法优化表达水平以获得足够的表达。
术语“先天性免疫反应”和“先天性免疫”是此项技术中公认的，并且是指身体的免疫系统在识别出病原体相关分子模式时启动的非特异性防御机制，其涉及不同形式的细胞活动，包括通过各种路径的细胞因子产生和细胞死亡。如本文所用，先天性免疫反应包括但不限于炎症细胞因子的产生(例如I型干扰素或IL-10产生)增加；NFκB路径的活化；免疫细胞的增殖、成熟、分化和/或存活增加，以及在一些情况下细胞凋亡的诱导。先天性免疫的活化可使用此项技术中已知的方法检测，诸如测量(NF)-κB活化情况。
术语“适应性免疫反应”和“适应性免疫”是此项技术中公认的，并且是指身体的免疫系统在识别出特定抗原时启动的抗原特异性防御机制，包括体液反应和细胞介导的反应。如本文所用，适应性免疫反应包括由疫苗组合物，诸如本文所述的遗传组合物触发和/或增强的细胞反应。在一些实施方案中，疫苗组合物包含作为抗原特异性适应性免疫反应的标靶的抗原。在其它实施方案中，疫苗组合物在施用后允许在经免疫的受试者中产生抗原，所述抗原是抗原特异性适应性免疫反应的标靶。适应性免疫反应的活化可使用此项技术中已知的方法检测，诸如测量抗原特异性抗体的产生或抗原特异性细胞介导的细胞毒性的水平。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞毒性的一种形式，其中结合至存在于某些细胞毒性细胞(例如，天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上的Fc受体(FcR)上的分泌的免疫球蛋白使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性地结合至带有抗原的标靶细胞并且随后用细胞毒素杀伤标靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞并且绝对是这种杀伤所需要的。NK细胞(用于介导ADCC的主要细胞)仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达是已知的(参见例如Ravetch和Kinet,1991,Annu.Rev.Immunol.9:457-92)。为评估目标分子的ADCC活性，可进行体外ADCC分析(参见例如美国专利号5,500,362和5,821,337)。用于此类分析的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者或另外，目标分子的ADCC活性可例如在动物模型中进行体内评估(参见例如Clynes等人，1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:652-56)。可选择具有很少或没有ADCC活性的抗体用于使用。
“抗体依赖性细胞吞噬作用”或“ADCP”是指当免疫球蛋白结合至某些吞噬细胞(例如，嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)使得这些吞噬细胞能够特异性地结合至携带抗原的标靶细胞并且随后杀伤标靶细胞时，经由单核细胞或巨噬细胞介导的吞噬作用破坏标靶细胞。为了评估目标分子的ADCP活性，可进行体外ADCP分析(参见例如Bracher等人，2007,J.Immunol.Methods323:160-71)。用于此类分析的有用的吞噬细胞包括外周血单核细胞(PBMC)、来自PBMC的纯化的单核细胞或分化成单核类型的U937细胞。或者或另外，目标分子的ADCP活性可例如在动物模型中进行体内评估(参见例如Wallace等人，2001,J.Immunol.Methods248:167-82)。可选择具有很少或没有ADCP活性的抗体用于使用。
“Fc受体”或“FcR”描述结合至抗体的Fc区的受体。示例性FcR是天然序列人FcR。此外，示例性FcR是结合IgG抗体的受体(例如，γ受体)，并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和选择性剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，所述受体具有主要在其细胞质结构域方面不同的类似氨基酸序列(参见例如1997,Annu.Rev.Immunol.15:203-34)。各种FcR是已知的(参见例如Ravetch和Kinet,1991,Annu.Rev.Immunol.9:457-92；Capel等人，1994,Immunomethods 4:25-34；和de Haas等人，1995,J.Lab.Clin.Med.126:330-41)。本文的术语“FcR”涵盖其它FcR，包括有待在将来鉴别的那些FcR。该术语还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(参见例如Guyer等人，1976,J.Immunol.117:587-93；和Kim等人，1994,Eu.J.Immunol.24:2429-34)。已经描述了具有改善的或降低的与FcR的结合的抗体变体(参见例如WO 2000/42072；美国专利号7,183,387；7,332,581；以及7,335,742；Shields等人，2001,J.Biol.Chem.9(2):6591-604)。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下标靶细胞的溶解。经典补体途径的活化通过补体系统的第一组分(C1q)结合至与其同源抗原结合的(具有适当亚类的)抗体而起始。为了评估补体活化，可进行CDC分析(参见例如Gazzano-Santoro等人，1996,J.Immunol.Methods 202:163)。已经描述了具有改变的Fc区氨基酸序列(具有变体Fc区的多肽)和增加或降低的C1q结合能力的多肽变体(参见例如美国专利号6,194,551；WO 1999/51642；Idusogie等人，2000,J.Immunol.164:4178-84)。可选择具有很少或没有CDC活性的抗体用于使用。
术语“抗体”意图包括免疫球蛋白类别的多肽内的B细胞的多肽产物，所述多肽产物能够结合至特定分子抗原并且由两对相同的多肽链组成，其中每对具有一条重链(约50-70kDa)和一条轻链(约25kDa)，每条链的每个氨基末端部分包含约100至约130个或更多个氨基酸的可变区，并且每条链的每个羧基末端部分包含恒定区。参见例如AntibodyEngineering(Borrebaeck编辑，第2版，1995)；以及Kuby,Immunology(第3版，1997)。在具体实施方案中，特定分子抗原可被本文提供的抗体结合，包括多肽、其片段或表位。抗体还包括但不限于合成抗体、重组产生的抗体、骆驼化抗体、胞内抗体、抗独特型(抗Id)抗体以及上述任一者的功能片段，所述功能片段是指抗体重链或轻链多肽的保留所述片段所来源的抗体的一些或全部结合活性的一部分。功能片段的非限制性实例包括单链Fv(scFv)(例如，包括单特异性、双特异性等)、Fab片段、F(ab’)片段、F(ab)2片段、F(ab’)2片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fv片段、双抗体、三抗体、四抗体和微型抗体。特别地，本文提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如抗原结合结构域或含有抗原结合位点的分子(例如，抗体的一个或多个CDR)。此类抗体片段可在例如Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual(1989)；Mol.Biology and Biotechnology:AComprehensive Desk Reference(Myers编辑，1995)；Huston等人，1993,Cell Biophysics22:189-224；Plückthun和Skerra,1989,Meth.Enzymol.178:497-515；以及Day,AdvancedImmunochemistry(第2版，1990)中找到。本文提供的抗体可具有免疫球蛋白分子的任何类别(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或任何亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
术语“施用(administer/administration)”是指将存在于体外的物质(例如本文所述的脂质纳米颗粒组合物)注射或以其它方式物理递送至患者体内的操作，诸如经粘膜、真皮内、静脉内、肌内递送和/或本文所述或此项技术中已知的任何其它物理递送方法递送。当治疗疾病、病症、疾患或其症状时，通常在疾病、病症、疾患或其症状发作之后进行物质的施用。当预防疾病、病症、疾患或其症状时，通常在疾病、病症、疾患或其症状发作之前进行物质的施用。
“长期”施用与急性模式相对，是指以连续模式施用一种或多种剂(例如持续一段时间，诸如数天、数周、数月或数年)，由此在较长一段时间内维持初始治疗效应(活性)。“间歇性”施用是指治疗不是不间断地连续进行，而是本质上周期性的。
如本文所用，术语“靶向递送”或动词形式“靶向”是指相较于递送至任何其它器官、组织、细胞或细胞内隔室(称为非标靶位置)，促进所递送的剂(诸如本文所述的脂质纳米颗粒组合物中的治疗性有效负载分子)到达特定器官、组织、细胞和/或细胞内隔室(称为标靶位置)的过程。靶向递送可使用此项技术中已知的方法检测，例如通过在全身施用后将所递送的剂在标靶细胞群体中的浓度与所递送的剂在非标靶细胞群体处的浓度相比较来检测。在某些实施方案中，靶向递送使得标靶位置处的浓度为非标靶位置处的浓度的至少2倍高。
“有效量”一般是足以降低症状的严重程度和/或频率；消除症状和/或潜在原因；防止症状和/或其潜在原因的发生；和/或改善或补救由疾病、病症或疾患，包括例如由感染和赘瘤形成引起或与之相关的损害的量。在一些实施方案中，有效量是治疗有效量或预防有效量。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指足以减少和/或改善给定疾病、病症或疾患，和/或其相关症状(例如感染性疾病，诸如由病毒感染引起的感染性疾病，或赘生性疾病，诸如癌症)的严重程度和/或持续时间的剂(例如疫苗组合物)的量。本公开的物质/分子/剂(例如本文所述的脂质纳米颗粒组合物)的“治疗有效量”可根据诸多因素而变化，诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及物质/分子/剂在个体体内引发所需反应的能力。治疗有效量包含物质/分子/剂的治疗有益效应胜过其任何有毒或有害效应的量。在某些实施方案中，术语“治疗有效量”是指有效“治疗”受试者或哺乳动物的疾病、病症或疾患的如本文所述的脂质纳米颗粒组合物或者其中所含治疗剂或预防剂(例如治疗性mRNA)的量。
“预防有效量”是当施用受试者时将具有预期预防效应，例如预防疾病、病症、疾患或相关症状(例如感染性疾病，诸如由病毒感染引起的感染性疾病，或赘生性疾病，诸如癌症)、延迟其发作(或复发)或降低其发作(或复发)可能性的药物组合物的量。通常但不是必须地，由于预防剂量是在疾病、病症或疾患之前或其早期阶段用于受试者，因此预防有效量可能小于治疗有效量。完全的治疗或预防效应未必通过施用一次剂量而发生，而可能仅在施用一系列剂量后才发生。因此，治疗或预防有效量可分一次或多次施用来施用。
术语“预防(prevent/preventing/prevention)”是指降低疾病、病症、疾患或相关症状(例如感染性疾病，诸如由病毒感染引起的感染性疾病，或赘生性疾病，诸如癌症)发作(或复发)的可能性。
术语“控制(manage/managing/management)”是指受试者从疗法(例如预防剂或治疗剂)获得的有益效应，其不会引起疾病的治愈。在某些实施方案中，向受试者施用一种或多种疗法(例如预防剂或治疗剂，诸如本文所述的脂质纳米颗粒组合物)以“控制”感染性或赘生性疾病、其一种或多种症状，由此预防疾病的进展或恶化。
术语“预防剂”是指可以完全或部分地抑制受试者的疾病和/或其相关症状的发展、复发、发作或扩散的任何剂。
术语“治疗剂”是指可用于治疗、预防或缓解疾病、病症或疾患，包括用于治疗、预防或缓解疾病、病症或疾患和/或其相关症状的一种或多种症状的任何剂。
术语“疗法”是指可用于预防、控制、治疗和/或改善疾病、病症或疾患的任何方案、方法和/或剂。在某些实施方案中，术语“疗法(therapies/therapy)”是指本领域技术人员，诸如医务人员已知可用于预防、控制、治疗和/或改善疾病、病症或疾患的生物疗法、支持疗法和/或其它疗法。
如本文所用，“预防有效血清滴度”是受试者(例如人类)体内完全或部分地抑制受试者的疾病、病症或疾患，和/或其相关症状的发展、复发、发作或扩散的抗体的血清滴度。
在某些实施方案中，“治疗有效血清滴度”是受试者(例如人类)体内降低受试者的与疾病、病症或疾患相关的严重程度、持续时间和/或症状的抗体的血清滴度。
术语“血清滴度”是指一名受试者中来自多个样品(例如在多个时间点)或在至少10名、至少20名、至少40名至多达约100名、1000名或更多受试者的群体中的平均血清滴度。
术语“副作用”涵盖疗法(例如预防剂或治疗剂)的不想要的作用和/或不良作用。不想要的作用未必为不良作用。疗法(例如预防剂或治疗剂)的不良作用可能为有害的、令人不适的或有风险的。副作用的实例包括腹泻、咳嗽、胃肠炎、喘鸣、恶心、呕吐、厌食、腹部绞痛、发烧、疼痛、体重减轻、脱水、脱发、呼吸困难、失眠、头晕、粘膜炎、神经和肌肉影响、疲劳、口干、食欲不振、施用部位出现皮疹或肿胀、诸如发烧、发冷和疲劳之类的流感样症状、消化道问题和过敏反应。患者经历的其它不期望的作用众多并且为此项技术中所知的。有许多作用描述于Physician’s Desk Reference(第68版，2014)中。
术语“受试者”与“患者”可互换使用。如本文所用，在某些实施方案中，受试者是哺乳动物，诸如非灵长类动物(例如牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(例如猴和人类)。在具体实施方案中，受试者是人类。在一个实施方案中，受试者是患有感染性疾病或赘生性疾病的哺乳动物(例如人类)。在另一实施方案中，受试者是有患上感染性疾病或赘生性疾病的风险的哺乳动物(例如人类)。
术语“老年人”是指65岁以上的人。术语“人类成人”是指18岁以上的人。术语“人类儿童”是指1岁至18岁的人。术语“人类幼儿”是指1岁至3岁的人。术语“人类婴儿”是指新生儿至1岁的人。
术语“可检测探针”是指提供可检测信号的组合物。该术语包括但不限于通过活性提供可检测信号的任何荧光团、生色团、放射性标记、酶、抗体或抗体片段等。
术语“可检测剂”是指可用于确定样品或受试者中所需分子，诸如由本文所述的mRNA分子编码的抗原的存在(existence/presence)的物质。可检测剂可为能够被目测的物质或者能够以其它方式确定和/或测量(例如通过定量)的物质。
“基本上全部”是指至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或约100％。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“约”或“大约”意指本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受的误差，其部分取决于测量或确定值的方式。在某些实施方案中，术语“约”或“大约”意指在1、2、3或4个标准偏差以内。在某些实施方案中，术语“约”或“大约”意指在给定值或范围的20％以内、15％以内、10％以内、9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内、1％以内、0.5％以内、0.05％以内或更低以内。
本说明书中引用的所有出版物、专利申请、登录号和其它参考文献都以引用的方式整体并入本文中，其引用程度就如同特定并且单独地指示每一个别出版物或专利申请以引用的方式并入一般。本文所论述的出版物仅为了其在本申请的申请日之前的公开内容而提供。本文中的任何内容均不应解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于此类出版物。此外，提供的公布日期可能与实际公布日期有所不同，实际公布日期可能需要独立确认。
已经描述本发明的多个实施方案。然而，应理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下可进行各种修改。因此，实验部分和实施例中的描述旨在说明而不是限制权利要求书中所描述的发明范围。
治疗性核酸
在一个方面，本文提供了用于控制、预防和治疗RV感染的治疗性核酸分子。在一些实施方案中，治疗性核酸编码肽或多肽，其在施用于有需要的受试者时，由受试者中的细胞表达以产生所编码的肽或多肽。在一些实施方案中，治疗性核酸分子是DNA分子。在其它实施方案中，治疗性核酸分子是RNA分子。在特定实施方案中，治疗性核酸分子是mRNA分子。
在一些实施方案中，治疗性核酸分子被配制在疫苗组合物中。在一些实施方案中，疫苗组合物是如本文所述的基因疫苗。在一些实施方案中，疫苗组合物包含如本文所述的mRNA分子。
在一些实施方案中，本公开的mRNA分子编码目标肽或多肽，包括任何天然或非天然存在的或以其它方式修饰的多肽。由mRNA编码的肽或多肽可具有任何大小并且可具有任何二级结构或活性。在一些实施方案中，由mRNA有效负载编码的多肽当在细胞中表达时可具有治疗效应。
在一些实施方案中，本公开的mRNA分子包含至少一个编码目标肽或多肽的编码区(例如，开放阅读框(ORF))。在一些实施方案中，核酸分子还包含至少一个非翻译区(UTR)。在特定实施方案中，非翻译区(UTR)位于编码区的上游(5’端)，并且在本文中称为5’-UTR。在特定实施方案中，非翻译区(UTR)位于编码区的下游(3’端)，并且在本文中称为3’-UTR。在特定实施方案中，核酸分子包含5’-UTR和3’-UTR二者。在一些实施方案中，5’-UTR包含5’-帽结构。在一些实施方案中，核酸分子包含Kozak序列(例如在5’-UTR中)。在一些实施方案中，核酸分子包含poly-A区(例如在3’-UTR中)。在一些实施方案中，核酸分子包含聚腺苷酸化信号(例如在3’-UTR中)。在一些实施方案中，核酸分子包含稳定区(例如在3’-UTR中)。在一些实施方案中，核酸分子包含二级结构。在一些实施方案中，二级结构是茎-环。在一些实施方案中，核酸分子包含茎-环序列(例如在5’-UTR和/或3’-UTR中)。在一些实施方案中，核酸分子包含一个或多个能够在剪接过程中切除的内含子区。在具体实施方案中，核酸分子包含一个或多个选自5’-UTR和编码区的区域。在具体实施方案中，核酸分子包含一个或多个选自编码区和3’-UTR的区域。在具体实施方案中，核酸分子包含一个或多个选自5’-UTR、编码区和3’-UTR的区域。
编码区
在一些实施方案中，本公开的核酸分子包含至少一个编码区。在一些实施方案中，编码区是编码单一肽或蛋白质的开放阅读框(ORF)。在一些实施方案中，编码区包含至少两个ORF，每个ORF编码一种肽或蛋白质。在编码区包含多于一个ORF的实施方案中，编码的肽和/或蛋白质可彼此相同或不同。在一些实施方案中，编码区中的多个ORF经非编码序列隔开。在具体实施方案中，隔开两个ORF的非编码序列包含内部核糖体进入位点(IRES)。
不受理论束缚，预期内部核糖体进入位点(IRES)可用作唯一的核糖体结合位点，或充当mRNA的多个核糖体结合位点之一。含有多于一个功能性核糖体结合位点的mRNA分子可编码若干肽或蛋白质，所述肽或蛋白质独立地由核糖体翻译(例如多顺反子mRNA)。因此，在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)。可与本公开结合使用的IRES序列的实例包括但不限于来自小RNA病毒(例如FMDV)、瘟病毒(CFFV)、脊髓灰质炎病毒(PV)、脑心肌炎病毒(ECMV)、口蹄疫病毒(FMDV)、丙型肝炎病毒(HCV)、猪瘟病毒(CSFV)、鼠白血病病毒(MLV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)或蟋蟀麻痹病毒(CrPV)的那些IRES序列。
在各个实施方案中，本公开的核酸分子编码至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或多于10种肽或蛋白质。核酸分子编码的肽和蛋白质可相同或不同。在一些实施方案中，本公开的核酸分子编码二肽(例如肌肽和鹅肌肽)。在一些实施方案中，核酸分子编码三肽。在一些实施方案中，核酸分子编码四肽。在一些实施方案中，核酸分子编码五肽。在一些实施方案中，核酸分子编码六肽。在一些实施方案中，核酸分子编码七肽。在一些实施方案中，核酸分子编码八肽。在一些实施方案中，核酸分子编码九肽。在一些实施方案中，核酸分子编码十肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约15个氨基酸的肽或多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约50个氨基酸的肽或多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约100个氨基酸的肽或多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约150个氨基酸的肽或多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约300个氨基酸的肽或多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约500个氨基酸的肽或多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约1000个氨基酸的肽或多肽。
在一些实施方案中，本公开的核酸分子的长度是至少约30个核苷酸(nt)。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约35nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约40nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约45nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约50nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约55nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约60nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约65nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约70nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约75nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约80nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约85nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约90nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约95nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约100nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约120nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约140nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约160nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约180nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约200nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约250nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约300nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约400nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约500nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约600nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约700nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约800nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约900nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约1000nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约1100nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约1200nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约1300nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约1400nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约1500nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约1600nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约1700nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约1800nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约1900nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约2000nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约2500nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约3000nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约3500nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约4000nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约4500nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度是至少约5000nt。
在具体实施方案中，本公开的治疗性核酸被配制为如本文所述的疫苗组合物(例如，基因疫苗)。在一些实施方案中，治疗性核酸编码能够引发针对一种或多种标靶疾患或疾病的免疫的肽或蛋白质。在一些实施方案中，标靶疾患与病原体感染相关或由病原体感染引起，所述病原体诸如为RV。在一些实施方案中，治疗性核酸序列(例如，mRNA)编码病原体特征性致病性蛋白质或其免疫原性片段(例如表位)或衍生物。疫苗在施用于接种疫苗的受试者后，允许表达编码的致病性蛋白质(或其免疫原性片段或衍生物)，由此在受试者体内引发针对病原体的免疫。
在具体实施方案中，本文提供了用于控制、预防和治疗由RV或由感染RV引起的疾病或病症的治疗性组合物(例如，疫苗组合物)。
不受理论束缚，预期RV或RABV(即狂犬病病毒)是单链负义RNA病毒，具有编码五种结构蛋白的基因组：核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和RNA依赖性RNA聚合酶(L)。在这些病毒蛋白质中，RABV的糖蛋白(RABV-G)通过介导病毒识别和附着于细胞受体以及病毒粒子内吞和内体腔酸化后病毒包膜与细胞膜的融合，从而起始病毒颗粒进入宿主细胞而在病毒的发病机制中发挥关键作用。作为存在于病毒表面的唯一蛋白质，RABV-G是中和抗体的主要标靶，因此选择G蛋白作为疫苗设计的主要标靶。
因此，在一些实施方案中，本文提供了编码源自RV的病毒肽或蛋白质的治疗性核酸。在一些实施方案中，核酸编码源自RV的病毒肽或蛋白质，其中所述病毒肽或蛋白质是选自以下的一种或多种：(a)N蛋白；(b)P蛋白；(c)M蛋白；(d)G蛋白；(e)L蛋白；(f)(a)至(e)中任一项的免疫原性片段；和(g)(a)至(f)中任一项的功能衍生物。
因此，在一些实施方案中，本公开的治疗性核酸编码RV G蛋白、或G蛋白的免疫原性片段、或G蛋白或其免疫原性片段的功能衍生物。表1显示示例性RV G天然抗原序列。
表1RV G抗原的示例性序列。
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注释：括号中的序列是信号肽，它们的氨基酸序列和核苷酸序列不包括在SEQ IDNO:1-3、7-10中。
在特定实施方案中，本公开的治疗性核酸编码RV的G蛋白，其中所述G蛋白具有SEQID NO:1的氨基酸序列。在特定实施方案中，本公开的治疗性核酸编码RV的G蛋白，其中所述治疗性核酸包含SEQ ID NO:7或8的DNA编码序列。在特定实施方案中，本公开的治疗性核酸编码RV的G蛋白，其中所述治疗性核酸包含从SEQ ID NO:7或8的DNA编码序列转录的RNA序列。在特定实施方案中，本公开的治疗性核酸编码RV的G蛋白，其中所述G蛋白具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列。在特定实施方案中，本公开的治疗性核酸编码RV的G蛋白，其中所述治疗性核酸包含SEQ ID NO:9的DNA编码序列。在特定实施方案中，本公开的治疗性核酸编码RV的G蛋白，其中所述治疗性核酸包含从SEQ ID NO:9的DNA编码序列转录的RNA序列。在特定实施方案中，本公开的治疗性核酸编码RV的G蛋白，其中所述G蛋白具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在特定实施方案中，本公开的治疗性核酸编码RV的G蛋白，其中所述治疗性核酸包含SEQ ID NO:10的DNA编码序列。在特定实施方案中，本公开的治疗性核酸编码RV的G蛋白，其中所述治疗性核酸包含从SEQ ID NO:10的DNA编码序列转录的RNA序列。在一些实施方案中，RNA序列是体外转录的。在特定实施方案中，核酸分子是mRNA分子。
在特定实施方案中，本公开的治疗性核酸编码RV的G蛋白的免疫原性片段。在特定实施方案中，本公开的治疗性核酸编码RV的G蛋白的功能衍生物。在特定实施方案中，本公开的治疗性核酸编码RV的G蛋白的免疫原性片段的功能衍生物。
在特定实施方案中，RV G蛋白是突变体。
不受理论束缚，预期在一些实施方案中，本公开的治疗性核酸编码包含与三聚化肽融合的RV G蛋白或其片段的融合蛋白，使得所述融合蛋白能够形成包含G蛋白或其片段的三个拷贝的三聚体复合物。在一些实施方案中，G蛋白或其片段通过肽连接子与三聚化肽融合。表2显示可与本公开结合使用的示例性三聚化肽和连接子肽，以及融合蛋白的序列。
表2连接子肽和三聚化肽的示例性序列。
在一些实施方案中，治疗性核酸编码融合蛋白，所述融合蛋白包含与三聚化肽融合的RV的G蛋白或其功能衍生物。在一些实施方案中，G蛋白与三聚化肽之间的融合是通过肽连接子。在具体实施方案中，肽连接子包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些实施方案中，三聚化肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
在特定实施方案中，治疗性核酸编码融合蛋白，所述融合蛋白包含与三聚化肽融合的RV的G蛋白，其中所述核酸包含DNA编码序列。在特定实施方案中，治疗性核酸编码融合蛋白，所述融合蛋白包含与三聚化肽融合的RV的G蛋白，其中所述核酸包含从DNA编码序列转录的RNA序列。在一些实施方案中，RNA序列是体外转录的。在特定实施方案中，核酸分子是mRNA分子。
不受理论束缚，预期包含与免疫球蛋白Fc区融合的病毒肽或多肽的融合蛋白可增强病毒肽或多肽的免疫原性。因此，在一些实施方案中，本公开的治疗性核酸分子编码融合蛋白，所述融合蛋白包含与免疫球蛋白的Fc区融合的源自RV的病毒肽或蛋白质。在特定实施方案中，病毒肽或蛋白质是选自以下的一种或多种：(a)N蛋白；(b)P蛋白；(c)M蛋白；(d)G蛋白；(e)L蛋白；(f)(a)至(e)中任一项的免疫原性片段；和(g)(a)至(f)中任一项的功能衍生物。在特定实施方案中，免疫球蛋白是人免疫球蛋白(Ig)。在特定实施方案中，免疫球蛋白是人IgG、IgA、IgD、IgE或IgM。在特定实施方案中，免疫球蛋白是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方案中，免疫球蛋白Fc融合至病毒肽或多肽的N末端。在其它实施方案中，免疫球蛋白Fc融合至病毒肽或多肽的C末端。
不受理论束缚，预期信号肽可介导与其融合的多肽向细胞的特定位置的运输。因此，在一些实施方案中，本公开的治疗性核酸分子编码包含与信号肽融合的病毒肽或蛋白质的融合蛋白。在特定实施方案中，病毒肽或蛋白质是选自以下的一种或多种：(a)N蛋白；(b)P蛋白；(c)M蛋白；(d)G蛋白；(e)L蛋白；(f)(a)至(e)中任一项的免疫原性片段；和(g)(a)至(f)中任一项的功能衍生物。在一些实施方案中，信号肽与病毒肽或多肽的N末端融合。在其它实施方案中，信号肽与病毒肽或多肽的C末端融合。表3显示可与本公开结合使用的信号肽的示例性序列。
表3：信号肽的示例性序列。
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在特定实施方案中，信号肽由病毒肽或多肽所来源的RV的基因编码。在特定实施方案中，由RV的基因编码的信号肽与由RV的不同基因编码的病毒肽或多肽融合。在其它实施方案中，由RV的基因编码的信号肽与由RV的相同基因编码的病毒肽或多肽融合。例如，在一些实施方案中，将具有MVPQALLFVPLLGFSLCFG(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的信号肽融合至具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的病毒肽或多肽。在一些实施方案中，将具有MVPQALLLVPLLGFSLCFG(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的信号肽融合至具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的病毒肽或多肽。在一些实施方案中，将具有MIPLALLFVPLLVFLCVSGNS(SEQ IDNO:6)的氨基酸序列的信号肽融合至具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的病毒肽或多肽。在各个实施方案中，病毒肽或蛋白质是选自以下的一种或多种：(a)N蛋白；(b)P蛋白；(c)M蛋白；(d)G蛋白；(e)L蛋白；(f)(a)至(e)中任一项的免疫原性片段；和(g)(a)至(f)中任一项的功能衍生物。
在特定实施方案中，本公开的治疗性核酸编码无天然信号肽的RV的G蛋白或片段。在特定实施方案中，所编码的G蛋白或片段包含具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的信号肽。在特定实施方案中，本公开的治疗性核酸编码具有信号肽的RV的G蛋白或片段，并且其中所述治疗性核酸包含SEQ ID NO:15的DNA编码序列。在特定实施方案中，本公开的治疗性核酸编码具有信号肽的RV的G蛋白或片段，并且其中所述治疗性核酸包含从SEQ ID NO:15的DNA编码序列转录的RNA序列。在一些实施方案中，RNA序列是体外转录的。在特定实施方案中，核酸分子是mRNA分子。
在特定实施方案中，本公开的治疗性核酸编码具有信号肽的RV的G蛋白的胞外结构域(ECD)。在一些实施方案中，RNA序列是体外转录的。在特定实施方案中，核酸分子是mRNA分子。
在其它实施方案中，信号肽由不存在于病毒肽或多肽所来源的RV中的外源基因序列编码。在一些实施方案中，异源信号肽置换由本公开的核酸分子编码的融合蛋白中的同源信号肽。在具体实施方案中，信号肽由哺乳动物基因编码。在具体实施方案中，信号肽由人免疫球蛋白基因编码。在具体实施方案中，信号肽由人IgE基因编码。例如，在一些实施方案中，将具有MDWTWILFLVAAATRVHS(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列的信号肽融合至由本公开的核酸分子编码的病毒肽或多肽。在各个实施方案中，病毒肽或蛋白质是选自以下的一种或多种：(a)N蛋白；(b)P蛋白；(c)M蛋白；(d)G蛋白；(e)L蛋白；(f)(a)至(e)中任一项的免疫原性片段；和(g)(a)至(f)中任一项的功能衍生物。
5’-帽结构
不受理论束缚，预期聚核苷酸的5’-帽结构参与核输出并增加聚核苷酸稳定性，并且结合mRNA帽结合蛋白(CBP)，CBP负责细胞中的聚核苷酸稳定性，并且通过CBP与poly-A结合蛋白缔合形成成熟环状mRNA物质来引起翻译能力。5’-帽结构进一步有助于在mRNA剪接期间移除5’-近端内含子。因此，在一些实施方案中，本公开的核酸分子包含5’-帽结构。
核酸分子可在5’端经细胞内源性转录机构加帽，由此在聚核苷酸的末端鸟苷帽残基与5’末端转录的有义核苷酸之间产生5’-ppp-5’-三磷酸键联。接着，该5’-鸟苷酸帽可经甲基化以产生N7-甲基-鸟苷酸残基。聚核苷酸5’端的末端和/或末端前(anteterminal)转录的核苷酸的核糖还可任选地经2’-O-甲基化。通过鸟苷酸帽结构水解和裂解进行的5’-脱帽可靶向核酸分子，例如mRNA分子以进行降解。
在一些实施方案中，本公开的核酸分子包含对由内源过程产生的天然5'-帽结构的一种或多种改变。不受理论束缚，对5’-帽的修饰可增加聚核苷酸的稳定性，增加聚核苷酸的半衰期，并且可增加聚核苷酸的翻译效率。
对天然5’-帽结构的示例性改变包括产生不可水解的帽结构，以防止脱帽，由此增加聚核苷酸的半衰期。在一些实施方案中，由于帽结构水解需要裂解5’-ppp-5’磷酸二酯键联，因此在一些实施方案中，可在加帽反应期间使用经修饰的核苷酸。举例来说，在一些实施方案中，可根据制造商的说明书，将来自New England Biolabs(Ipswich,Mass.)的牛痘病毒加帽酶(Vaccinia Capping Enzyme)用于α-硫代鸟苷核苷酸以在5’-ppp-5’帽中产生硫代磷酸酯键联。可使用额外经修饰的鸟苷核苷酸，诸如α-甲基膦酸和硒代磷酸核苷酸。
对天然5’-帽结构的额外示例性改变还包括在加帽的鸟苷三磷酸(GTP)的2’位和/或3’位的修饰、糖环氧(产生碳环的氧)替代为亚甲基部分(CH2)、在帽结构的三磷酸桥部分处的修饰或在核碱基(G)部分处的修饰。
对天然5’-帽结构的额外示例性改变包括但不限于聚核苷酸5’-末端和/或5’-末端前核苷酸的核糖在糖2’-羟基上的2’-O-甲基化(如上所述)。可使用多种不同的5’-帽结构产生聚核苷酸(诸如mRNA分子)的5’-帽。可与本公开结合使用的额外示例性5’-帽结构还包括国际专利公布第WO2008127688号、第WO 2008016473号和第WO 2011015347号中描述的那些5’-帽结构，各案的全部内容以引用的方式并入本文中。
在各个实施方案中，5’-末端帽可包括帽类似物。帽类似物在本文中又称为合成帽类似物、化学帽、化学帽类似物、或者结构或功能性帽类似物，其化学结构不同于天然(即，内源性、野生型或生理性)5’-帽，同时保留帽功能。帽类似物可按化学方式(即，非酶方式)或酶方式合成和/或连接至聚核苷酸。
举例来说，抗反向帽类似物(ARCA)帽含有经5’-5’-三磷酸酯基团连接的两个鸟苷，其中一个鸟苷含有N7-甲基以及3’-O-甲基(即，N7,3’-O-二甲基-鸟苷-5’-三磷酸-5’-鸟苷，即m7G-3’mppp-G，其可等效地称为3’O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G)。另一未改变的鸟苷的3’-O原子与加帽聚核苷酸(例如mRNA)的5’-末端核苷酸连接。N7-和3’-O-甲基化的鸟苷提供加帽聚核苷酸(例如mRNA)的末端部分。另一示例性帽结构为mCAP，其类似于ARCA，但在鸟苷上具有2’-O-甲基(即，N7,2’-O-二甲基-鸟苷-5’-三磷酸-5’-鸟苷，即m7Gm-ppp-G)。
在一些实施方案中，帽类似物可为二核苷酸帽类似物。作为非限制性实例，二核苷酸帽类似物可在不同磷酸酯位置处用硼烷磷酸酯基(boranophosphate)或硒代磷酸酯基(phophoroselenoate)进行修饰，诸如美国专利第8,519,110号中所述的二核苷酸帽类似物，该案的全部内容以引用的方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，帽类似物可为此项技术中已知和/或本文所述的N7-(4-氯苯氧基乙基)取代的二核苷酸帽类似物。N7-(4-氯苯氧基乙基)取代的二核苷酸帽类似物的非限制性实例包括N7-(4-氯苯氧基乙基)-G(5’)ppp(5’)G和N7-(4-氯苯氧基乙基)-m3’-OG(5’)ppp(5’)G帽类似物(参见例如Kore等人，Bioorganic&Medicinal Chemistry 2013 21:4570-4574中所述的各种帽类似物和合成帽类似物的方法；该文献的全部内容以引用的方式并入本文中)。在其它实施方案中，可与本公开的核酸分子结合使用的帽类似物是4-氯/溴苯氧基乙基类似物。
在各个实施方案中，帽类似物可包括鸟苷类似物。有用的鸟苷类似物包括但不限于肌苷、N1-甲基-鸟苷、2’-氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。
不受理论束缚，预期尽管帽类似物允许在体外转录反应中同时进行聚核苷酸的加帽，但高达20％的转录物仍未加帽。这种情况以及帽类似物与细胞内源转录机构产生的聚核苷酸的天然5’-帽结构的结构差异可能导致翻译能力减弱和细胞稳定性降低。
因此，在一些实施方案中，本公开的核酸分子还可使用酶在转录后加帽，以便产生更真实(authentic)的5’-帽结构。如本文所用，短语“更真实”是指一种特征在结构上或功能上密切反映或模仿内源或野生型特征。即，与现有技术的合成特征或类似物相比，“更真实”的特征更好地代表内源性、野生型、天然或生理细胞功能和/或结构，或者其在一个或多个方面胜过对应内源性、野生型、天然或生理特征。可与本公开的核酸分子结合使用的更真实的5’-帽结构的非限制性实例为相较于此项技术中已知的合成5’-帽结构(或相较于野生型、天然或生理性5’-帽结构)，尤其具有增强的与帽结合蛋白的结合、增加的半衰期、降低的对5’-核酸内切酶的敏感性和/或减少的5’-脱帽的结构。举例来说，在一些实施方案中，重组牛痘病毒加帽酶和重组2’-O-甲基转移酶可在聚核苷酸的5’-末端核苷酸与鸟苷帽核苷酸之间产生经典的5’-5’-三磷酸酯键联，其中帽鸟苷含有N7-甲基化，并且聚核苷酸的5’-末端核苷酸含有2’-O-甲基。这种结构称为帽1结构。与例如此项技术中已知的其它5’帽类似物结构相比，这种帽引起更高的翻译能力、细胞稳定性和减少的细胞促炎性细胞因子的活化。其它示例性帽结构包括7mG(5’)ppp(5’)N,pN2p(帽0)、7mG(5’)ppp(5’)NlmpNp(帽1)、7mG(5’)-ppp(5’)NlmpN2mp(帽2)和m(7)Gpppm(3)(6,6,2’)Apm(2’)Apm(2’)Cpm(2)(3,2’)Up(帽4)。
不受理论束缚，预期本公开的核酸分子可在转录后加帽，并且由于这种方法较为高效，因此几乎100％的核酸分子可经加帽。
非翻译区(UTR)
在一些实施方案中，本公开的核酸分子包含一个或多个非翻译区(UTR)。在一些实施方案中，UTR位于核酸分子中编码区的上游，并且被称为5’-UTR。在一些实施方案中，UTR位于核酸分子中编码区的下游，并且被称为3’-UTR。UTR的序列可与核酸分子中所发现的编码区的序列同源或异源。多个UTR可包含在核酸分子中，并且可具有相同或不同的序列和/或基因起源。根据本公开，核酸分子中UTR的任何部分(包括没有任何部分)可经密码子优化，并且任何部分可在密码子优化之前和/或之后独立地含有一个或多个不同的结构或化学修饰。
在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含相对于彼此为同源的UTR和编码区。在其它实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含相对于彼此为异源的UTR和编码区。在一些实施方案中，为了监测UTR序列的活性，可在体外(例如细胞或组织培养物)或在体内(例如向受试者)施用包含UTR和可检测探针的编码序列的核酸分子，并且可使用此项技术中已知的方法测量UTR序列的效应(例如调节表达水平、编码产物的细胞定位或编码产物的半衰期)。
在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)的UTR包含至少一个翻译增强子元件(TEE)，所述TEE起到增加由核酸分子产生的多肽或蛋白质的量的作用。在一些实施方案中，TEE位于核酸分子的5’-UTR中。在其它实施方案中，TEE位于核酸分子的3’-UTR处。在其它实施方案中，至少两个TEE分别位于核酸分子的5’-UTR和3’-UTR处。在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)可包含一个或多个拷贝的TEE序列或包含多于一个不同的TEE序列。在一些实施方案中，存在于本公开的核酸分子中的不同TEE序列可相对于彼此为同源的或异源的。
各种TEE序列是此项技术中已知的，并且可与本公开结合使用。举例来说，在一些实施方案中，TEE可为内部核糖体进入位点(IRES)、HCV-IRES或IRES元件。Chappell等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:9590-9594,2004；Zhou等人，Proc.Natl.Acad.Sci.102:6273-6278,2005。可与本公开结合使用的额外内部核糖体进入位点(IRES)包括但不限于美国专利第7,468,275号、美国专利公布第2007/0048776号和美国专利公布第2011/0124100号，以及国际专利公布第WO2007/025008号和国际专利公布第WO2001/055369号中所述的IRES，各案的内容以引用的方式整体并入本文中。在一些实施方案中，TEE可为Wellensiek等人，Genome-wide profiling of human cap-independent translation-enhancingelements,Nature Methods,2013年8月；10(8):747-750的补充表1和补充表2中所述的TEE；该文献的内容以引用的方式整体并入本文中。
可与本公开结合使用的额外示例性TEE包括但不限于美国专利第6,310,197号、美国专利第6,849,405号、美国专利第7,456,273号、美国专利第7,183,395号、美国专利公布第2009/0226470号、美国专利公布第2013/0177581号、美国专利公布第2007/0048776号、美国专利公布第2011/0124100号、美国专利公布第2009/0093049号、国际专利公布第WO2009/075886号、国际专利公布第WO2012/009644号和国际专利公布第WO1999/024595号、国际专利公布第WO2007/025008号、国际专利公布第WO2001/055371号、欧洲专利第2610341号、欧洲专利第2610340号中所述的TEE序列，各案的内容以引用的方式整体并入本文中。
在各个实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含至少一个UTR，其包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个或超过60个TEE序列。在一些实施方案中，核酸分子UTR中的TEE序列是同一TEE序列的拷贝。在其它实施方案中，核酸分子UTR中的至少两个TEE序列具有不同的TEE序列。在一些实施方案中，多个不同的TEE序列以一种或多种重复模式布置于核酸分子的UTR区中。仅出于说明的目的，重复模式可为例如ABABAB、AABBAABBAABB、ABCABCABC等，其中在这些示例性模式中，每个大写字母(A、B或C)代表不同的TEE序列。在一些实施方案中，在核酸分子的UTR中，至少两个TEE序列彼此为连续的(即，其间无间隔子序列)。在其它实施方案中，至少两个TEE序列由间隔子序列隔开。在一些实施方案中，UTR可包含TEE序列-间隔子序列模块，所述模块在UTR中重复至少一次、至少两次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次或多于9次。在本段所述的任何实施方案中，UTR可为核酸分子的5’-UTR、3’-UTR或5’-UTR和3’-UTR二者。
在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)的UTR包含至少一个翻译抑制元件，所述元件起到减少由核酸分子产生的多肽或蛋白质的量的作用。在一些实施方案中，核酸分子的UTR包含由一种或多种微小RNA识别的一个或多个miR序列或其片段(例如miR种子序列(seed sequence))。在一些实施方案中，核酸分子的UTR包含下调核酸分子的翻译活性的一个或多个茎-环结构。用于抑制与核酸分子相关的翻译活性的其它机制是此项技术中已知的。在本段所述的任何实施方案中，UTR可为核酸分子的5’-UTR、3’-UTR或5’-UTR和3’-UTR二者。表4显示可与本公开结合使用的示例性5’-UTR和3’-UTR序列。
表4示例性非翻译区(UTR)序列。
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在具体实施方案中，本公开的核酸分子包含选自SEQ ID NO:24-33的5’-UTR。在具体实施方案中，本公开的核酸分子包含选自SEQ ID NO:34-39的3’-UTR。在具体实施方案中，本公开的核酸分子包含选自SEQ ID NO:24-33的5’-UTR和选自SEQ ID NO:34-39的3’-UTR。在本段所述的任何实施方案中，核酸分子还可包含具有如本文所述的序列的编码区，诸如表1至4中的任何DNA编码序列或其等效RNA序列。在特定实施方案中，本段所述的核酸分子可以是体外转录的RNA分子。
表5示例性mRNA构建体
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聚腺苷酸化(Poly-A)区
在天然RNA加工过程中，通常将长链腺苷核苷酸(poly-A区)添加至信使RNA(mRNA)分子中以增加分子的稳定性。转录后，立即将转录物的3’端裂解以释放3’-羟基。接着，poly-A聚合酶将一连串腺苷核苷酸添加至RNA中。该过程称为聚腺苷酸化，添加一个长度在100与250个残基之间的poly-A区。不受理论束缚，预期poly-A区可赋予本公开的核酸分子多个优点。
因此，在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含一个或多个聚腺苷酸化(poly-A)区。在一些实施方案中，poly-A区完全由腺嘌呤核苷酸或其功能性类似物构成。在一些实施方案中，核酸分子在其3’端包含至少一个poly-A区。在一些实施方案中，核酸分子在其5’端包含至少一个poly-A区。在一些实施方案中，核酸分子在其5’端包含至少一个poly-A区并且在其3’端包含至少一个poly-A区。
根据本公开，在不同实施方案中，poly-A区可具有不同长度。特别地，在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少30个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少35个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少40个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少45个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少50个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少55个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少60个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少65个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少70个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少75个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少80个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少85个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少90个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少95个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少100个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少110个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少120个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少130个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少140个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少150个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少160个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少170个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少180个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少190个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少200个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少225个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少250个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少275个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少300个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少350个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少400个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少450个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少500个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少600个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少700个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少800个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少900个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少1000个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少1100个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少1200个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少1300个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少1400个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少1500个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少1600个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少1700个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少1800个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少1900个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少2000个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少2250个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少2500个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少2750个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度是至少3000个核苷酸。
在一些实施方案中，核酸分子中poly-A区的长度可基于核酸分子的总长度或其一部分(诸如核酸分子的编码区的长度或开放阅读框的长度等)来选择。举例来说，在一些实施方案中，poly-A区占含有poly-A区的核酸分子的总长度的约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高百分比。
不受理论束缚，预期某些RNA结合蛋白可结合至位于mRNA分子3’端的poly-A区。这些poly-A结合蛋白(PABP)可调节mRNA表达，诸如与细胞中的翻译起始机构相互作用和/或保护3’-poly-A尾免于降解。因此，在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含poly-A结合蛋白(PABP)的至少一个结合位点。在其它实施方案中，在将核酸分子装载至递送媒介物(例如脂质纳米颗粒)中之前，使其与PABP形成结合物或复合物。
在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含poly-A-G四联体。G四联体是可由DNA和RNA中富含G的序列形成的氢键结的四个鸟苷核苷酸的环状阵列。在该实施方案中，G四联体并入poly-A区的一端。可分析所得聚核苷酸(例如mRNA)的稳定性、蛋白质产量和其它参数，包括在不同时间点的半衰期。已发现，poly-A-G四联体结构导致蛋白质产量相当于单独使用120个核苷酸的poly-A区所观察到的蛋白质产量的至少75％。
在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)可包含poly-A区并且可通过添加3’-稳定区来稳定。在一些实施方案中，可用于使包含poly-A或poly-A-G四联体结构的核酸分子(例如mRNA)稳定的3’-稳定区描述于国际专利公布第WO2013/103659号中，该案的内容以引用的方式整体并入本文中。
在其它实施方案中，可与本公开的核酸分子结合使用的3’-稳定区包括链终止核苷，诸如但不限于3’-脱氧腺苷(虫草素(cordycepin))；3’-脱氧尿苷；3’-脱氧胞嘧啶；3’-脱氧鸟苷；3’-脱氧胸腺嘧啶；2’,3’-双脱氧核苷，诸如2’,3’-双脱氧腺苷、2’,3’-双脱氧尿苷、2’,3’-双脱氧胞嘧啶、2’,3’-双脱氧鸟苷、2’,3’-双脱氧胸腺嘧啶；2’-脱氧核苷；或O-甲基核苷；3’-脱氧核苷；2’,3’-双脱氧核苷；3’-O-甲基核苷；3’-O-乙基核苷；3’-阿拉伯糖苷，以及此项技术中已知及/或本文所述的其它替代性核苷。
二级结构
不受理论束缚，预期茎-环结构可引导RNA折叠，保护核酸分子(例如mRNA)的结构稳定性，提供RNA结合蛋白的识别位点，并且用作酶反应的底物。举例来说，miR序列和/或TEE序列的并入将改变茎-环区的形状，由此可增加和/或减少翻译(Kedde等人，A Pumilio-induced RNAstructure switch in p27-3’UTR controls miR-221and miR-222accessibility.Nat Cell Biol.,2010年10月；12(10):1014-20，其内容以引用的方式整体并入本文中)。
因此，在一些实施方案中，本文所述的核酸分子(例如mRNA)或其一部分可呈茎-环结构，诸如但不限于组蛋白茎-环。在一些实施方案中，茎-环结构由长度为约25个或约26个核苷酸的茎-环序列形成，诸如但不限于国际专利公布第WO2013/103659号中所述的结构，该案的内容以引用的方式整体并入本文中。茎-环序列的额外实例包括国际专利公布第WO2012/019780号和国际专利公布第WO201502667号中所述的序列，各案的内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，茎-环序列包含如本文所述的TEE。在一些实施方案中，茎-环序列包含如本文所述的miR序列。在具体实施方案中，茎-环序列可包括miR-122种子序列。在具体实施方案中，核酸分子包含茎-环序列CAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACCA(SEQ IDNO:40)。在其它实施方案中，核酸分子包含茎-环序列CAAAGGCUCUUUUCAGAGCCACCA(SEQ IDNO:41)。
在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含位于核酸分子中编码区上游(在5’端)的茎-环序列。在一些实施方案中，茎-环序列位于核酸分子的5’-UTR内。在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含位于核酸分子中编码区下游(在3’端)的茎-环序列。在一些实施方案中，茎-环序列位于核酸分子的3’-UTR内。在一些情况下，核酸分子可含有多于一个茎-环序列。在一些实施方案中，核酸分子在5’-UTR中包含至少一个茎-环序列并且在3’-UTR中包含至少一个茎-环序列。
在一些实施方案中，包含茎-环结构的核酸分子还包含稳定区。在一些实施方案中，稳定区包含至少一个链终止核苷，其起到减慢降解并由此增加核酸分子的半衰期的作用。可与本公开的核酸分子结合使用的示例性链终止核苷包括但不限于3’-脱氧腺苷(虫草素)；3’-脱氧尿苷；3’-脱氧胞嘧啶；3’-脱氧鸟苷；3’-脱氧胸腺嘧啶；2’,3’-双脱氧核苷，诸如2’,3’-双脱氧腺苷、2’,3’-双脱氧尿苷、2’,3’-双脱氧胞嘧啶、2’,3’-双脱氧鸟苷、2’,3’-双脱氧胸腺嘧啶；2’-脱氧核苷；或O-甲基核苷；3’-脱氧核苷；2’,3’-双脱氧核苷；3’-O-甲基核苷；3’-O-乙基核苷；3’-阿拉伯糖苷，以及此项技术中已知和/或本文所述的其它替代性核苷。在其它实施方案中，茎-环结构可通过改变聚核苷酸的3’-区域来稳定，所述改变可防止和/或抑制寡聚(U)的添加(国际专利公布第WO2013/103659号，其以引用的方式整体并入本文中)。
在一些实施方案中，本公开的核酸分子包含至少一个茎-环序列和poly-A区或聚腺苷酸化信号。包含至少一个茎-环序列和poly-A区或聚腺苷酸化信号的聚核苷酸序列的非限制性实例包括国际专利公布第WO2013/120497号、国际专利公布第WO2013/120629号、国际专利公布第WO2013/120500号、国际专利公布第WO2013/120627号、国际专利公布第WO2013/120498号、国际专利公布第WO2013/120626号、国际专利公布第WO2013/120499号和国际专利公布第WO2013/120628号中所述的序列，各案的内容以引用的方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，包含茎-环序列和poly-A区或聚腺苷酸化信号的核酸分子可编码病原体抗原或其片段，诸如国际专利公布第WO2013/120499号和国际专利公布第WO2013/120628号中所述的聚核苷酸序列，各案的内容以引用的方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，包含茎-环序列和poly-A区或聚腺苷酸化信号的核酸分子可编码治疗性蛋白质，诸如国际专利公布第WO2013/120497号和国际专利公布第WO2013/120629号中所述的聚核苷酸序列，各案的内容以引用的方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，包含茎-环序列和poly-A区或聚腺苷酸化信号的核酸分子可编码肿瘤抗原或其片段，诸如国际专利公布第WO2013/120500号和国际专利公布第WO2013/120627号中所述的聚核苷酸序列，各案的内容以引用的方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，包含茎-环序列和poly-A区或聚腺苷酸化信号的核酸分子可编码致敏性抗原或自身免疫性自身抗原，诸如国际专利公布第WO2013/120498号和国际专利公布第WO2013/120626号中所述的聚核苷酸序列，各案的内容以引用的方式整体并入本文中。
功能性核苷酸类似物
在一些实施方案中，本文所述的有效负载核酸分子仅含有选自A(腺苷)、G(鸟苷)、C(胞嘧啶)、U(尿苷)和T(胸苷)的经典核苷酸。不受理论束缚，预期某些功能性核苷酸类似物可赋予核酸分子有用的特性。在本公开的上下文中，此类有用特性的实例包括但不限于核酸分子的稳定性增加、核酸分子在诱导先天性免疫反应中的免疫原性降低、由核酸分子编码的蛋白质的产量增加、核酸分子的细胞内递送和/或保留增加，和/或核酸分子的细胞毒性降低等。
因此，在一些实施方案中，有效负载核酸分子包含至少一种如本文所述的功能性核苷酸类似物。在一些实施方案中，功能性核苷酸类似物含有至少一个针对核碱基、糖基和/或磷酸酯基的化学修饰。因此，包含至少一种功能性核苷酸类似物的有效负载核酸分子含有至少一个针对核碱基、糖基和/或核苷间键联的化学修饰。本文提供对核酸分子的核碱基、糖基或核苷间键联的示例性化学修饰。
如本文所述，有效负载核酸分子中所有核苷酸的0％至100％范围的核苷酸可以为如本文所述的功能性核苷酸类似物。举例来说，在各个实施方案中，核酸分子中的所有核苷酸中约1％至约20％、约1％至约25％、约1％至约50％、约1％至约60％、约1％至约70％、约1％至约80％、约1％至约90％、约1％至约95％、约10％至约20％、约10％至约25％、约10％至约50％、约10％至约60％、约10％至约70％、约10％至约80％、约10％至约90％、约10％至约95％、约10％至约100％、约20％至约25％、约20％至约50％、约20％至约60％、约20％至约70％、约20％至约80％、约20％至约90％、约20％至约95％、约20％至约100％、约50％至约60％、约50％至约70％、约50％至约80％、约50％至约90％、约50％至约95％、约50％至约100％、约70％至约80％、约70％至约90％、约70％至约95％、约70％至约100％、约80％至约90％、约80％至约95％、约80％至约100％、约90％至约95％、约90％至约100％、或约95％至约100％的核苷酸是本文所述的功能性核苷酸类似物。在这些实施方案中的任一个中，功能性核苷酸类似物可存在于核酸分子的任何位置处，包括5’-末端、3’-末端和/或一个或多个内部位置。在一些实施方案中，单个核酸分子可含有不同的糖修饰、不同的核碱基修饰和/或不同类型的核苷间键联(例如主链结构)。
如本文所述，有效负载核酸分子中一种类型的所有核苷酸(例如作为一种类型的所有含嘌呤核苷酸、或作为一种类型的所有含嘧啶核苷酸、或作为一种类型的所有A、G、C、T或U)中范围从0％至100％的核苷酸可为本文所述的功能性核苷酸类似物。举例来说，在各个实施方案中，核酸分子中一种类型的核苷酸中约1％至约20％、约1％至约25％、约1％至约50％、约1％至约60％、约1％至约70％、约1％至约80％、约1％至约90％、约1％至约95％、约10％至约20％、约10％至约25％、约10％至约50％、约10％至约60％、约10％至约70％、约10％至约80％、约10％至约90％、约10％至约95％、约10％至约100％、约20％至约25％、约20％至约50％、约20％至约60％、约20％至约70％、约20％至约80％、约20％至约90％、约20％至约95％、约20％至约100％、约50％至约60％、约50％至约70％、约50％至约80％、约50％至约90％、约50％至约95％、约50％至约100％、约70％至约80％、约70％至约90％、约70％至约95％、约70％至约100％、约80％至约90％、约80％至约95％、约80％至约100％、约90％至约95％、约90％至约100％、或约95％至约100％的核苷酸是本文所述的功能性核苷酸类似物。在这些实施方案中的任一个中，功能性核苷酸类似物可存在于核酸分子的任何位置处，包括5’-末端、3’-末端和/或一个或多个内部位置。在一些实施方案中，单个核酸分子可含有不同的糖修饰、不同的核碱基修饰和/或不同类型的核苷间键联(例如主链结构)。
核碱基的修饰
在一些实施方案中，功能性核苷酸类似物含有非经典核碱基。在一些实施方案中，核苷酸中的经典核碱基(例如腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)可经修饰或置换以提供一种或多种功能性核苷酸类似物。核碱基的示例性修饰包括但不限于一个或多个取代或修饰，包括但不限于烷基、芳基、卤基、氧代基、羟基、烷氧基和/或硫代取代；一个或多个稠环或开环；氧化和/或还原。
在一些实施方案中，非经典核碱基是经修饰的尿嘧啶。具有经修饰的尿嘧啶的示例性核碱基和核苷包括假尿苷(ψ)、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿嘧啶、6-氮杂-尿嘧啶、2-硫代-5-氮杂-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶(s2U)、4-硫代尿嘧啶(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿嘧啶(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿嘧啶、5-卤基-尿嘧啶(例如，5-碘-尿嘧啶或5-溴-尿嘧啶)、3-甲基尿嘧啶(m3U)、5-甲氧基-尿嘧啶(mo5U)、尿嘧啶5-氧基乙酸(cmo5U)、尿嘧啶5-氧基乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧甲基-尿嘧啶(cm5U)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿嘧啶(chm5U)、5-羧基羟甲基-尿嘧啶甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿嘧啶(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基-尿嘧啶(mnm5U)、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒代-尿嘧啶(mnm5se2U)、5-氨甲酰基甲基-尿嘧啶(ncm5U)、5-羧甲基氨基甲基-尿嘧啶(cmnm5U)、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿嘧啶、1-丙炔基-假尿嘧啶、5-牛磺酸甲基-尿嘧啶(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿嘧啶(τm55s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-尿嘧啶(m5U，即具有核碱基脱氧胸腺嘧啶)、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(Et1ψ)、5-甲基-2-硫代-尿嘧啶(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿嘧啶(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基-二氢尿嘧啶(m5D)、2-硫代-二氢尿嘧啶、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿嘧啶、2-甲氧基-4-硫代-尿嘧啶、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿嘧啶(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿嘧啶(m5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿嘧啶(m5s2U)、5,2’-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2-硫代-2’-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨甲酰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧甲基氨基甲基-2'-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2’-O-二甲基-尿苷(m3Um)和5-(异戊烯基氨基甲基)-2’-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿嘧啶、脱氧胸苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)-尿嘧啶、5-(氨甲酰基羟基甲基)-尿嘧啶、5-氨甲酰基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-羧甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-氰基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-2-硫代-尿嘧啶和5-[3-(1-E-丙烯基氨基)]尿嘧啶。
在一些实施方案中，非经典核碱基是经修饰的胞嘧啶。具有经修饰的胞嘧啶的示例性核碱基和核苷包括5-氮杂胞嘧啶、6-氮杂胞嘧啶、假异胞苷、3-甲基胞嘧啶(m3C)、N4-乙酰基胞嘧啶(ac4C)、5-甲酰基胞嘧啶(f5C)、N4-甲基-胞嘧啶(m4C)、5-甲基-胞嘧啶(m5C)、5-卤基-胞嘧啶(例如5-碘-胞嘧啶)、5-羟甲基-胞嘧啶(hm5C)、1-甲基-假异胞苷、吡咯并胞嘧啶、吡咯并假异胞苷、2-硫代胞嘧啶(s2C)、2-硫代-5-甲基胞嘧啶、4-硫代假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉林(zebularine)、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫代-泽布拉林、2-硫代-泽布拉林、2-甲氧基-胞嘧啶、2-甲氧基-5-甲基-胞嘧啶、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、立西啶(lysidine)(k2C)、5,2’-O-二甲基-胞苷(m5Cm)、N4-乙酰基-2’-O-甲基-胞苷(ac4Cm)、N4,2’-O-二甲基-胞苷(m4Cm)、5-甲酰基-2’-O-甲基-胞苷(fSCm)、N4,N4,2’-O-三甲基-胞苷(m42Cm)、1-硫代-胞嘧啶、5-羟基-胞嘧啶、5-(3-叠氮基丙基)-胞嘧啶和5-(2-叠氮基乙基)-胞嘧啶。
在一些实施方案中，非经典核碱基是经修饰的腺嘌呤。具有替代性腺嘌呤的示例性核碱基和核苷包括2-氨基-嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-卤基-嘌呤(例如2-氨基-6-氯-嘌呤)、6-卤基-嘌呤(例如6-氯-嘌呤)、2-氨基-6-甲基-嘌呤、8-叠氮基-腺嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-腺嘌呤(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺嘌呤(m6A)、2-甲硫基-N6-甲基-腺嘌呤(ms2m6A)、N6-异戊烯基-腺嘌呤(i6A)、2-甲硫基-N6-异戊烯基-腺嘌呤(ms2i6A)、N6-(顺-羟基异戊烯基)腺嘌呤(io6A)、2-甲硫基-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺嘌呤(ms2io6A)、N6-甘氨酰基氨甲酰基-腺嘌呤(g6A)、N6-苏氨酰基氨甲酰基-腺嘌呤(t6A)、N6-甲基-N6-苏氨酰基氨甲酰基-腺嘌呤(m6t6A)、2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨甲酰基-腺嘌呤(ms2g6A)、N6,N6-二甲基-腺嘌呤(m62A)、N6-羟基正缬氨酰基氨甲酰基-腺嘌呤(hn6A)、2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰基氨甲酰基-腺嘌呤(ms2hn6A)、N6-乙酰基-腺嘌呤(ac6A)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、N6,2’-O-二甲基-腺苷(m6Am)、N6,N6,2’-O-三甲基-腺苷(m62Am)、1,2’-O-二甲基-腺苷(m1Am)、2-氨基-N6-甲基-嘌呤、1-硫代-腺嘌呤、8-叠氮基-腺嘌呤、N6-(19-氨基-五氧杂十九烷基)-腺嘌呤、2,8-二甲基-腺嘌呤、N6-甲酰基-腺嘌呤和N6-羟甲基-腺嘌呤。
在一些实施方案中，非经典核碱基是经修饰的鸟嘌呤。具有经修饰的鸟嘌呤的示例性核碱基和核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(wyosine)(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、4-脱甲基-怀俄苷(imG-14)、异怀俄苷(imG2)、怀丁苷(wybutosine)(yW)、过氧怀丁苷(o2yW)、羟基怀丁苷(OHyW)、修饰不足(undermodified)的羟基怀丁苷(OHyW*)、7-脱氮-鸟嘌呤、辫苷(queuosine)(Q)、环氧辫苷(oQ)、半乳糖基-辫苷(galQ)、甘露糖基-辫苷(manQ)、7-氰基-7-脱氮-鸟嘌呤(preQO)、7-氨基甲基-7-脱氮-鸟嘌呤(preQ1)、古嘌苷(archaeosine)(G+)、7-脱氮-8-氮杂-鸟嘌呤、6-硫代-鸟嘌呤、6-硫代-7-脱氮-鸟嘌呤、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟嘌呤、7-甲基-鸟嘌呤(m7G)、6-硫代-7-甲基-鸟嘌呤、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鸟嘌呤、1-甲基-鸟嘌呤(m1G)、N2-甲基-鸟嘌呤(m2G)、N2,N2-二甲基-鸟嘌呤(m22G)、N2,7-二甲基-鸟嘌呤(m2,7G)、N2,N2,7-二甲基-鸟嘌呤(m2,2,7G)、8-氧代-鸟嘌呤、7-甲基-8-氧代-鸟嘌呤、1-甲基-6-硫代-鸟嘌呤、N2-甲基-6-硫代-鸟嘌呤、N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟嘌呤、N2-甲基-2’-O-甲基-鸟苷(m2Gm)、N2,N2-二甲基-2’-O-甲基-鸟苷(m22Gm)、1-甲基-2’-O-甲基-鸟苷(m1Gm)、N2,7-二甲基-2’-O-甲基-鸟苷(m2,7Gm)、2’-O-甲基-肌苷(Im)、1,2’-O-二甲基-肌苷(m1Im)、1-硫代-鸟嘌呤和O-6-甲基-鸟嘌呤。
在一些实施方案中，功能性核苷酸类似物的非经典核碱基可独立地为嘌呤、嘧啶、嘌呤类似物或嘧啶类似物。举例来说，在一些实施方案中，非经典核碱基可为经修饰的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶或次黄嘌呤。在其它实施方案中，非经典核碱基还可包括例如碱基的天然存在的和合成的衍生物，包括吡唑并[3,4-d]嘧啶；5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物；2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫代尿嘧啶；8-卤基(例如8-溴)、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤；5-卤基(尤其为5-溴)、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤；8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤；脱氮鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤；脱氮腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮腺嘌呤；吡唑并[3,4-d]嘧啶；咪唑并[1,5-a]1,3,5-三嗪酮；9-脱氮嘌呤；咪唑并[4,5-d]吡嗪；噻唑并[4,5-d]嘧啶；吡嗪-2-酮；1,2,4-三嗪；哒嗪；或1,3,5-三嗪。
糖的修饰
在一些实施方案中，功能性核苷酸类似物含有非经典糖基。在各个实施方案中，非经典糖基可为具有一个或多个取代的5碳或6碳糖(诸如戊糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖或其脱氧衍生物)，所述一个或多个取代诸如为卤基、羟基、硫醇基、烷基、烷氧基、烯基氧基、炔基氧基、环烷基、氨基烷氧基、烷氧基烷氧基、羟基烷氧基、氨基、叠氮基、芳基、氨基烷基、氨基烯基、氨基炔基等。
一般来说，RNA分子含有核糖糖基，所述核糖糖基是含氧5元环。示例性、非限制性替代核苷酸包括置换核糖中的氧(例如，用S、Se或亚烷基，诸如亚甲基或亚乙基置换)；添加双键(例如，用环戊烯基或环己烯基置换核糖)；核糖的环收缩(例如，形成环丁烷或氧杂环丁烷的4元环)；核糖的环扩展(例如，形成具有额外碳或杂原子的6元或7元环，诸如对于失水己糖醇、阿卓糖醇(altritol)、甘露糖醇、环己基、环己烯基和吗啉基(其还具有氨基磷酸酯主链))；多环形式(例如三环和“未锁定”形式，诸如二醇核酸(GNA)(例如R-GNA或S-GNA，其中核糖由连接至磷酸二酯键的二醇单元置换)、苏糖核酸(TNA，其中核糖由α-L-苏呋喃糖基-(3’→2’)置换)和肽核酸(PNA，其中2-氨基-乙基-甘氨酸键联置换核糖和磷酸二酯主链))。
在一些实施方案中，糖基含有一个或多个碳，所述一个或多个碳具有与核糖中对应碳相反的立体化学构型。因此，核酸分子可包括含例如阿拉伯糖或L-核糖作为糖的核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子包括至少一个其中糖是L-核糖、2’-O-甲基核糖、2’-氟核糖、阿拉伯糖、己糖醇、LNA或PNA的核苷。
核苷间键联的修饰
在一些实施方案中，本公开的有效负载核酸分子可含有一个或多个经修饰的核苷间键联(例如磷酸酯主链)。主链磷酸酯基可通过用不同取代基置换一个或多个氧原子来改变。
在一些实施方案中，功能性核苷酸类似物可包括用本文所述的另一核苷间键联置换未改变的磷酸酯部分。替代性磷酸酯基的实例包括但不限于硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸酯(boranophosphate/boranophosphate ester)、膦酸氢酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的两个非连接氧均经硫置换。还可通过用氮(桥连的氨基磷酸酯)、硫(桥连的硫代磷酸酯)和碳(桥连的亚甲基膦酸酯)置换连接氧来改变磷酸酯连接子。
替代性核苷和核苷酸可包括一个或多个非桥连氧经甲硼烷部分(BH3)、硫(硫代)、甲基、乙基和/或甲氧基置换。作为非限制性实例，在同一位置(例如α(alpha)、β(beta)或γ(gamma)位置)处的两个非桥连氧可经硫(硫代)和甲氧基置换。置换磷酸酯部分(例如α-硫代磷酸酯)位置处的一个或多个氧原子可通过非天然硫代磷酸酯主链键联赋予RNA和DNA稳定性(诸如针对核酸外切酶和核酸内切酶的稳定性)。硫代磷酸酯DNA和RNA具有增加的核酸酶抗性，因此在细胞环境中具有较长的半衰期。
本文描述可根据本公开使用的其它核苷间键联，包括不含磷原子的核苷间键联。
可与本公开结合使用的核酸分子(例如mRNA)、相关组合物、制剂和/或方法的额外实例还包括WO2002/098443、WO2003/051401、WO2008/052770、WO2009127230、WO2006122828、WO2008/083949、WO2010088927、WO2010/037539、WO2004/004743、WO2005/016376、WO2006/024518、WO2007/095976、WO2008/014979、WO2008/077592、WO2009/030481、WO2009/095226、WO2011069586、WO2011026641、WO2011/144358、WO2012019780、WO2012013326、WO2012089338、WO2012113513、WO2012116811、WO2012116810、WO2013113502、WO2013113501、WO2013113736、WO2013143698、WO2013143699、WO2013143700、WO2013/120626、WO2013120627、WO2013120628、WO2013120629、WO2013174409、WO2014127917、WO2015/024669、WO2015/024668、WO2015/024667、WO2015/024665、WO2015/024666、WO2015/024664、WO2015101415、WO2015101414、WO2015024667、WO2015062738、WO2015101416中所述的那些，各案的内容整体并入本文中。
如本文所述的治疗性核酸分子可通过使用本领域已知的方法分离或合成。在一些实施方案中，与本公开结合使用的DNA或RNA分子是化学合成的。在其它实施方案中，与本公开结合使用的DNA或RNA分子是从天然来源分离的。
在一些实施方案中，与本公开结合使用的mRNA分子是使用宿主细胞生物合成的。在特定实施方案中，mRNA是通过使用宿主细胞转录相应的DNA序列产生的。在一些实施方案中，使用本领域已知的方法将编码mRNA序列的DNA序列并入表达载体中，然后将所述载体引入宿主细胞(例如，大肠杆菌)中。然后在合适的条件下培养宿主细胞以产生mRNA转录物。从编码DNA产生mRNA分子的其它方法是本领域已知的。例如，在一些实施方案中，可使用包含宿主细胞的转录机构的酶的无细胞(体外)转录系统来产生mRNA转录物。在本公开中描述了示例性无细胞转录反应系统。
纳米颗粒组合物
在一个方面，本文所述的核酸分子被配制用于体外和体内递送。特别地，在一些实施方案中，核酸分子被配制成含脂质组合物。在一些实施方案中，含脂质组合物形成将核酸分子封闭在脂质壳内的脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，脂质壳保护核酸分子免于降解。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒还促进将封入的核酸分子运输至细胞内隔室和/或机构中以发挥预期治疗或预防功能。在某些实施方案中，当存在于脂质纳米颗粒中时，核酸在水溶液中抵抗核酸酶的降解。包含核酸的脂质纳米颗粒和其制备方法为此项技术中已知的，诸如在例如美国专利公布第2004/0142025号、美国专利公布第2007/0042031号、PCT公布第WO 2017/004143号、PCT公布第WO 2015/199952号、PCT公布第WO 2013/016058号和PCT公布第WO 2013/086373号中公开的那些，这些公布中的每一者的完整公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，本文所提供的纳米颗粒组合物的最大尺寸为1μm或更短(例如，≤1μm、≤900nm、≤800nm、≤700nm、≤600nm、≤500nm、≤400nm、≤300nm、≤200nm、≤175nm、≤150nm、≤125nm、≤100nm、≤75nm、≤50nm或更短)，诸如当通过动态光散射(DLS)、透射电子显微术、扫描电子显微术或另一方法测量时。在一个实施方案中，本文所提供的脂质纳米颗粒具有至少一个在约40nm至约200nm范围内的尺寸。在一个实施方案中，所述至少一个尺寸在约40nm至约100nm范围内。
可与本公开结合使用的纳米颗粒组合物包括例如脂质纳米颗粒(LNP)、纳米脂蛋白颗粒、脂质体、脂质囊泡和脂质复合物(lipoplex)。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物是包括一个或多个脂质双层的囊泡。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包括经水性隔室隔开的两个或更多个同心双层。脂质双层可经官能化和/或彼此交联。脂质双层可包括一种或多种配体、蛋白质或通道。
在一些实施方案中，所述的纳米颗粒组合物包含脂质组分，所述脂质组分包含至少一种脂质，诸如如本文所述的脂质系列01-07(及其子式)之一的化合物。例如，在一些实施方案中，纳米颗粒组合物可包含脂质组分，所述脂质组分包括本文提供的化合物之一。纳米颗粒组合物还可包含一种或多种如下所述的其它脂质或非脂质组分。
阳离子脂质
阳离子脂质包括以下脂质系列01-04(及其子式)。
脂质系列01
在一个实施方案中，本文提供了式(01-I)化合物：
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中：
G1和G2各自独立地是键、C2-C12亚烷基或C2-C12亚烯基，其中所述亚烷基或亚烯基中的一个或多个-CH2-任选地经-O-替代；
L1是-OC(＝O)R1、-C(＝O)OR1、-OC(＝O)OR1、-C(＝O)R1、-OR1、-S(O)xR1、-S-SR1、-C(＝O)SR1、-SC(＝O)R1、-NRaC(＝O)R1、-C(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)NRbRc、-OC(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)OR1、-SC(＝S)R1、-C(＝S)SR1、-C(＝S)R1、-CH(OH)R1、-P(＝O)(ORb)(ORc)、-(C6-C10亚芳基)-R1、-(6至10元亚杂芳基)-R1或R1；
L2是-OC(＝O)R2、-C(＝O)OR2、-OC(＝O)OR2、-C(＝O)R2、-OR2、-S(O)xR2、-S-SR2、-C(＝O)SR2、-SC(＝O)R2、-NRdC(＝O)R2、-C(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)NReRf、-OC(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)OR2、-SC(＝S)R2、-C(＝S)SR2、-C(＝S)R2、-CH(OH)R2、-P(＝O)(ORe)(ORf)、-(C6-C10亚芳基)-R2、-(6至10元亚杂芳基)-R2或R2；
R1和R2各自独立地是C6-C32烷基或C6-C32烯基；
Ra、Rb、Rd和Re各自独立地是H、C1-C24烷基或C2-C24烯基；
Rc和Rf各自独立地是C1-C32烷基或C2-C32烯基；
G3是C2-C24亚烷基、C2-C24亚烯基、C3-C8亚环烷基或C3-C8亚环烯基；
R3是-N(R4)R5；
R4是C3-C8环烷基、C3-C8环烯基、4至8元杂环基或C6-C10芳基；或R4、G3或G3的一部分与它们所连接的氮一起形成环状部分；
R5是C1-C12烷基或C3-C8环烷基；或R4、R5与它们所连接的氮一起形成环状部分；
x是0、1或2；并且
其中每个烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂环基、芳基、亚烷基、亚烯基、亚环烷基、亚环烯基、亚芳基、亚杂芳基和环状部分独立地任选地经取代。
在一个实施方案中，本文提供了式(01-II)化合物：
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中：
是单键或双键；
G1和G2各自独立地是键、C2-C12亚烷基或C2-C12亚烯基，其中所述亚烷基或亚烯基中的一个或多个-CH2-任选地经-O-替代；
L1是-OC(＝O)R1、-C(＝O)OR1、-OC(＝O)OR1、-C(＝O)R1、-OR1、-S(O)xR1、-S-SR1、-C(＝O)SR1、-SC(＝O)R1、-NRaC(＝O)R1、-C(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)NRbRc、-OC(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)OR1、-SC(＝S)R1、-C(＝S)SR1、-C(＝S)R1、-CH(OH)R1、-P(＝O)(ORb)(ORc)、-(C6-C10亚芳基)-R1、-(6至10元亚杂芳基)-R1或R1；
L2是-OC(＝O)R2、-C(＝O)OR2、-OC(＝O)OR2、-C(＝O)R2、-OR2、-S(O)xR2、-S-SR2、-C(＝O)SR2、-SC(＝O)R2、-NRdC(＝O)R2、-C(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)NReRf、-OC(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)OR2、-SC(＝S)R2、-C(＝S)SR2、-C(＝S)R2、-CH(OH)R2、-P(＝O)(ORe)(ORf)、-(C6-C10亚芳基)-R2、-(6至10元亚杂芳基)-R2或R2；
R1和R2各自独立地是C6-C32烷基或C6-C32烯基；
Ra、Rb、Rd和Re各自独立地是H、C1-C24烷基或C2-C24烯基；
Rc和Rf各自独立地是C1-C32烷基或C2-C32烯基；
G4是键、C1-C23亚烷基、C2-C23亚烯基、C3-C8亚环烷基或C3-C8亚环烯基；
R3是-N(R4)R5；
R4是C1-C12烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烯基、4至8元杂环基或C6-C10芳基；或R4、G3或G3的一部分与它们所连接的氮一起形成环状部分；
R5是C1-C12烷基或C3-C8环烷基；或R4、R5与它们所连接的氮一起形成环状部分；
x是0、1或2；并且
其中每个烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂环基、芳基、亚烷基、亚烯基、亚环烷基、亚环烯基、亚芳基、亚杂芳基和环状部分独立地任选地经取代。
在一个实施方案中，所述化合物是表01-1中的化合物，或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体。
表01-1
脂质系列02
在一个实施方案中，本文提供了式(02-I)化合物：
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中：
G1和G2各自独立地是C2-C12亚烷基或C2-C12亚烯基，其中G1和G2中的一个或多个-CH2-任选地经-O-、-C(＝O)O-或-OC(＝O)-替代；
每个L1独立地是-OC(＝O)R1、-C(＝O)OR1、-OC(＝O)OR1、-C(＝O)R1、-OR1、-S(O)xR1、-S-SR1、-C(＝O)SR1、-SC(＝O)R1、-NRaC(＝O)R1、-C(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)NRbRc、-OC(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)OR1、-SC(＝S)R1、-C(＝S)SR1、-C(＝S)R1、-CH(OH)R1、-P(＝O)(ORb)(ORc)、-NRaP(＝O)(ORb)(ORc)；
每个L2独立地是-OC(＝O)R2、-C(＝O)OR2、-OC(＝O)OR2、-C(＝O)R2、-OR2、-S(O)xR2、-S-SR2、-C(＝O)SR2、-SC(＝O)R2、-NRdC(＝O)R2、-C(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)NReRf、-OC(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)OR2、-SC(＝S)R2、-C(＝S)SR2、-C(＝S)R2、-CH(OH)R2、-P(＝O)(ORe)(ORf)、-NRdP(＝O)(ORe)(ORf)；
R1和R2各自独立地是C6-C24烷基或C6-C24烯基；
Ra、Rb、Rd和Re各自独立地是H、C1-C24烷基或C2-C24烯基；
Rc和Rf各自独立地是C1-C24烷基或C2-C24烯基；
G3是C2-C12亚烷基或C2-C12亚烯基，其中亚烷基或亚烯基的一部分或全部任选地经C3-C8亚环烷基或C3-C8亚环烯基替代；
R3是-N(R4)R5、-OR6或-SR6；
R4是C1-C12烷基、C2-C12烯基、C3-C8环烷基、C3-C8环烯基、C6-C10芳基或4至8元杂环烷基；
R5是H、C1-C12烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烯基、C6-C10芳基或4至8元杂环烷基；
R6是氢、C1-C12烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烯基或C6-C10芳基；
x是0、1或2；并且
其中每个烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基、亚烷基、亚烯基、亚环烷基和亚环烯基独立地任选地经取代。
在一个实施方案中，化合物是表02-1中的化合物，或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体。
表02-1
脂质系列03在一个实施方案中，本文提供了式(03-I)化合物：
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中：
G1和G2各自独立地是键、C2-C12亚烷基或C2-C12亚烯基；其中G1和G2中的一个或多个-CH2-任选地经-O-替代；
每个L1独立地是-OC(＝O)R1、-C(＝O)OR1、-OC(＝O)OR1、-C(＝O)R1、-OR1、-S(O)xR1、-S-SR1、-C(＝O)SR1、-SC(＝O)R1、-NRaC(＝O)R1、-C(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)NRbRc、-OC(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)OR1、-SC(＝S)R1、-C(＝S)SR1、-C(＝S)R1、-CH(OH)R1、-P(＝O)(ORb)(ORc)、-NRaP(＝O)(ORb)(ORc)、-(C6-C10亚芳基)-R1、-(6至10元亚杂芳基)-R1、-(4至8元亚杂环基)-R1或R1；
每个L2独立地是-OC(＝O)R2、-C(＝O)OR2、-OC(＝O)OR2、-C(＝O)R2、-OR2、-S(O)xR2、-S-SR2、-C(＝O)SR2、-SC(＝O)R2、-NRdC(＝O)R2、-C(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)NReRf、-OC(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)OR2、-SC(＝S)R2、-C(＝S)SR2、-C(＝S)R2、-CH(OH)R2、-P(＝O)(ORe)(ORf)、-NRdP(＝O)(ORe)(ORf)、-(C6-C10亚芳基)-R2、-(6至10元亚杂芳基)-R2、-(4至8元亚杂环基)-R2或R2；
R1和R2各自独立地是C6-C24烷基或C6-C24烯基；
Ra、Rb、Rd和Re各自独立地是H、C1-C24烷基或C2-C24烯基；
Rc和Rf各自独立地是C1-C24烷基或C2-C24烯基；
G3是C2-C12亚烷基或C2-C12亚烯基，其中亚烷基或亚烯基的一部分或全部任选地经C3-C8亚环烷基、C3-C8亚环烯基、C3-C8亚环炔基、4至8元亚杂环基、C6-C10亚芳基或5至10元亚杂芳基替代；
R3是氢、C1-C12烷基、C2-C12烯基、C2-C12炔基、C3-C8环烷基、C3-C8环烯基、C3-C8环炔基、4至8元杂环基、C6-C10芳基或5至10元杂芳基；或R3、G1或G1的一部分与它们所连接的氮一起形成环状部分；或R3、G3或G3的一部分与它们所连接的氮一起形成环状部分；
R4是C1-C12烷基或C3-C8环烷基；
x是0、1或2；
n是1或2；
m是1或2；并且
其中每个烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、杂环基、芳基、杂芳基、亚烷基、亚烯基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、亚杂环基、亚芳基、亚杂芳基和环状部分独立地任选地经取代。
在一个实施方案中，所述化合物是表03-1中的化合物，或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体。
表03-1
脂质系列04
在一个实施方案中，本文提供了式(04-I)化合物：
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中：
G1和G2各自独立地是键、C2-C12亚烷基或C2-C12亚烯基；
L1是-OC(＝O)R1、-C(＝O)OR1、-OC(＝O)OR1、-C(＝O)R1、-OR1、-S(O)xR1、-S-SR1、-C(＝O)SR1、-SC(＝O)R1、-NRaC(＝O)R1、-C(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)NRbRc、-OC(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)OR1、-SC(＝S)R1、-C(＝S)SR1、-C(＝S)R1、-CH(OH)R1、-P(＝O)(ORb)(ORc)、-(C6-C10亚芳基)-R1、-(6至10元亚杂芳基)-R1或R1；
L2是-OC(＝O)R2、-C(＝O)OR2、-OC(＝O)OR2、-C(＝O)R2、-OR2、-S(O)xR2、-S-SR2、-C(＝O)SR2、-SC(＝O)R2、-NRdC(＝O)R2、-C(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)NReRf、-OC(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)OR2、-SC(＝S)R2、-C(＝S)SR2、-C(＝S)R2、-CH(OH)R2、-P(＝O)(ORe)(ORf)、-(C6-C10亚芳基)-R2、-(6至10元亚杂芳基)-R2或R2；
R1和R2各自独立地是C5-C32烷基或C5-C32烯基；
Ra、Rb、Rd和Re各自独立地是H、C1-C24烷基或C2-C24烯基；
Rc和Rf各自独立地是C1-C32烷基或C2-C32烯基；
R0是C1-C12烷基、C2-C12烯基、C3-C8环烷基、C3-C8环烯基、C6-C10芳基或4至8元杂环烷基；
G3是C2-C12亚烷基或C2-C12亚烯基；
R4是C1-C12烷基、C2-C12烯基、C3-C8环烷基、C3-C8环烯基、C6-C10芳基或4至8元杂环烷基；
R5是C1-C12烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烯基、C6-C10芳基或4至8元杂环烷基；
x是0、1或2；
s是0或1；并且
其中每个烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基、亚烷基、亚烯基、亚芳基和亚杂芳基独立地任选地经取代。
在一个实施方案中，所述化合物是表04-1中的化合物，或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体。
表04-1
聚合物结合的脂质
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的脂质组分可包含一种或多种聚合物结合的脂质，诸如聚乙二醇化脂质(PEG脂质)。不受理论束缚，预期纳米颗粒组合物中的聚合物结合的脂质组分可改善胶体稳定性和/或减少纳米颗粒的蛋白质吸收。可与本公开结合使用的示例性聚合物结合的脂质包括但不限于PEG改性的磷脂酰乙醇胺、PEG改性的磷脂酸、PEG改性的神经酰胺、PEG改性的二烷基胺、PEG改性的二酰基甘油、PEG改性的二烷基甘油和其混合物。举例来说，PEG脂质可为PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、PEG-DSPE、神经酰胺-PEG2000或Chol-PEG2000。
在一个实施方案中，聚合物结合的脂质是聚乙二醇化脂质。举例来说，一些实施方案包括聚乙二醇化二酰基甘油(PEG-DAG)，诸如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG)；聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)；PEG琥珀酸酯二酰基甘油(PEG-S-DAG)，诸如4-O-(2’,3’-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)；聚乙二醇化神经酰胺(PEG-cer)；或PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯，诸如ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-二(十四烷氧基)丙基)氨基甲酸酯或2,3-二(十四烷氧基)丙基-N-(ω-甲氧基)(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯。
在一个实施方案中，聚合物结合的脂质以在1.0mol％至2.5mol％范围内的浓度存在。在一个实施方案中，聚合物结合的脂质以约1.7mol％的浓度存在。在一个实施方案中，聚合物结合的脂质以约1.5mol％的浓度存在。
在一个实施方案中，阳离子脂质与聚合物结合的脂质的摩尔比在约35:1至约25:1范围内。在一个实施方案中，阳离子脂质与聚合物结合的脂质的摩尔比在约100:1至约20:1范围内。
在一个实施方案中，阳离子脂质与聚合物结合的脂质的摩尔比在约35:1至约25:1范围内。在一个实施方案中，阳离子脂质与聚合物结合的脂质的摩尔比在约100:1至约20:1范围内。
在一个实施方案中，聚乙二醇化脂质具有下式：
或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中：
R12和R13各自独立地是含有10至30个碳原子的直链或支链饱和或不饱和烷基链，其中所述烷基链任选地间杂有一个或多个酯键；并且
w具有介于30至60范围内的平均值。
在一个实施方案中，R12和R13各自独立地是含有12至16个碳原子的直链饱和烷基链。在其它实施方案中，w平均值在42至55的范围内，例如，w平均值是42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55。在一些具体实施方案中，w平均值是约49。
在一个实施方案中，聚乙二醇化脂质具有下式：
其中w平均值是约49。
结构脂质
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的脂质组分可包含一种或多种结构脂质。不受理论束缚，预期结构脂质可使纳米颗粒的两亲结构，诸如但不限于纳米颗粒的脂质双层结构稳定。可与本公开结合使用的示例性结构脂质包括但不限于胆固醇、粪固醇、谷固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜子固醇、番茄碱、番茄苷、熊果酸、α-生育酚和其混合物。在某些实施方案中，结构脂质是胆固醇。在一些实施方案中，结构脂质包括胆固醇和皮质类固醇(诸如泼尼松龙(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、泼尼松(prednisone)和氢化可的松(hydrocortisone))或其组合。
在一个实施方案中，本文所提供的脂质纳米颗粒包含类固醇或类固醇类似物。在一个实施方案中，类固醇或类固醇类似物是胆固醇。在一个实施方案中，类固醇以在39mol％至49mol％、40mol％至46mol％、40mol％至44mol％、40mol％至42mol％、42mol％至44mol％或44mol％至46mol％范围内的浓度存在。在一个实施方案中，类固醇以40mol％、41mol％、42mol％、43mol％、44mol％、45mol％或46mol％的浓度存在。
在一个实施方案中，阳离子脂质与类固醇的摩尔比在1.0:0.9至1.0:1.2、或1.0:1.0至1.0:1.2范围内。在一个实施方案中，阳离子脂质与胆固醇的摩尔比在约5:1至1:1范围内。在一个实施方案中，类固醇以在32mol％至40mol％类固醇范围内的浓度存在。
在一个实施方案中，阳离子脂质与类固醇的摩尔比在1.0:0.9至1.0:1.2、或1.0:1.0至1.0:1.2范围内。在一个实施方案中，阳离子脂质与胆固醇的摩尔比在约5:1至1:1范围内。在一个实施方案中，类固醇以在32mol％至40mol％类固醇范围内的浓度存在。
磷脂
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的脂质组分可包含一种或多种磷脂，诸如一种或多种(多)不饱和脂质。不受理论束缚，预期磷脂可组装成一个或多个脂质双层结构。可形成本发明纳米颗粒组合物的一部分的示例性磷脂包括但不限于1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二(十一烷酰基)-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二(二十二碳六烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二(二十二碳六烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)和鞘磷脂。在某些实施方案中，纳米颗粒组合物包含DSPC。在某些实施方案中，纳米颗粒组合物包含DOPE。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含DSPC和DOPE二者。
额外示例性中性脂质包括例如二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰基磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1,2-二反油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)。在一个实施方案中，中性脂质为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。在一个实施方案中，中性脂质选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM。
在一个实施方案中，中性脂质是磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酸(PA)或磷脂酰甘油(PG)。
此外，可形成本发明纳米颗粒组合物的一部分的磷脂还包括WO2017/112865中所述的那些磷脂，该案的全部内容以引用的方式整体并入本文中。
制剂
根据本公开，本文所述的纳米颗粒组合物可包含至少一种脂质组分和一种或多种额外组分，诸如治疗剂和/或预防剂(例如，本文所述的治疗性核酸)。可针对一种或多种特定应用或标靶来设计纳米颗粒组合物。纳米颗粒组合物的成分可基于特定应用或标靶，和/或基于一种或多种成分的功效、毒性、费用、易用性、可用性或其它特征来选择。类似地，纳米颗粒组合物的特定制剂可根据例如每种成分的特定组合的功效和毒性，针对特定应用或标靶来选择。
纳米颗粒组合物的脂质组分可包含例如本文所述的根据式01-I、01-II、02-I、03-I和04-I(及其子式)之一的脂质、磷脂(诸如不饱和脂质，例如DOPE或DSPC)、PEG脂质和结构脂质。脂质组分的成分可以特定的分率提供。
在一个实施方案中，本文提供了纳米颗粒组合物，所述纳米颗粒组合物包含本文提供的阳离子脂质化合物、治疗剂和一种或多种赋形剂。在一个实施方案中，阳离子脂质化合物包含如本文所述的根据式01-I、01-II、02-I、03-I和04-I(及其子式)之一的化合物，以及任选存在的一种或多种其它阳离子脂质化合物。在一个实施方案中，一种或多种赋形剂选自中性脂质、类固醇和聚合物结合的脂质。在一个实施方案中，治疗剂被包封在脂质纳米颗粒内或与脂质纳米颗粒缔合。
在一个实施方案中，本文提供了纳米颗粒组合物(脂质纳米颗粒)，所述纳米颗粒组合物包含：
i)介于40mol％与50mol％之间的阳离子脂质(即，第一脂质)；
ii)中性脂质(例如，磷脂)；
iii)类固醇；
iv)聚合物结合的脂质(即，第二脂质)；和
v)治疗剂。
如本文所用，“mol％”是指组分相对于LNP中所有脂质组分的总摩尔数(即阳离子脂质、中性脂质、类固醇和聚合物结合的脂质的总摩尔数)的摩尔百分率。
在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含约20mol％至约65mol％、约30mol％至约60mol％、约40mol％至约55mol％、45mol％至50mol％、50mol％至55mol％、55mol％至60mol％、60mol％至65mol％、40mol％至45mol％、35mol％至40mol％、30mol％至35mol％、25mol％至30mol％或20mol％至25mol％的阳离子脂质。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含约40mol％、41mol％、42mol％、43mol％、44mol％、45mol％、46mol％、47mol％、48mol％、49mol％、50mol％、51mol％、52mol％、53mol％、54mol％或55mol％的阳离子脂质。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含约47.5mol％、47.6mol％、47.7mol％、47.8mol％、47.9mol％、48.0mol％、48.1mol％、48.2mol％、48.3mol％、48.4mol％或48.5mol％的阳离子脂质。
在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含41mol％至49mol％、41mol％至48mol％、42mol％至48mol％、43mol％至48mol％、44mol％至48mol％、45mol％至48mol％、46mol％至48mol％或47.2mol％至47.8mol％的阳离子脂质。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含约47.0mol％、47.1mol％、47.2mol％、47.3mol％、47.4mol％、47.5mol％、47.6mol％、47.7mol％、47.8mol％、47.9mol％或48.0mol％的阳离子脂质。
在一个实施方案中，中性脂质(例如，磷脂)以约5mol％至约40mol％、6mol％至30mol％、约7mol％至约20mol％或8mol％至15mol％范围内的浓度存在。在一个实施方案中，中性脂质(例如，磷脂)以约5mol％、6mol％、7mol％、8mol％、9mol％、10mol％、11mol％、12mol％、13mol％、14mol％或15mol％的浓度存在。在一个实施方案中，中性脂质(例如，磷脂)以约9.5mol％、10mol％或10.5mol％的浓度存在。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含约9.5mol％、9.6mol％、9.7mol％、9.8mol％、9.9mol％、10.0mol％、10.1mol％、10.2mol％、10.3mol％、10.4mol％或10.5mol％的磷脂。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含约10.0mol％的磷脂。在一个实施方案中，阳离子脂质与中性脂质(例如，磷脂)的摩尔比在约13:1至约1:2、约10:1至约5:1或约7.5:1至5:1的范围内。在一个实施方案中，阳离子脂质与中性脂质(例如，磷脂)的摩尔比是7.5:1、7.25:1、7.0:1、6.75:1、6.5:1、6.25:1、6.0:1、5.75:1、5.5:1、5.25:1或5.0:1。在一个实施方案中，阳离子脂质与中性脂质(例如，磷脂)的摩尔比在约4.1:1.0至约4.9:1.0、约4.5:1.0至约4.8:1.0或约4.7:1.0至4.8:1.0的范围内。
在一个实施方案中，中性脂质以5mol％至15mol％、7mol％至13mol％或9mol％至11mol％范围内的浓度存在。在一个实施方案中，中性脂质以约9.5mol％、10mol％或10.5mol％的浓度存在。在一个实施方案中，阳离子脂质与中性脂质的摩尔比在约4.1:1.0至约4.9:1.0、约4.5:1.0至约4.8:1.0或约4.7:1.0至4.8:1.0的范围内。
在一个实施方案中，类固醇以在约20mol％至约50mol％、约30mol％至约45mol％、约35mol％至约43mol％、37mol％至42mol％、30mol％至35mol％、35mol％至40mol％、40mol％至45mol％或45mol％至50mol％范围内的浓度存在。在一个实施方案中，类固醇以35mol％、36mol％、37mol％、38mol％、39mol％、40mol％、41mol％、42mol％、43mol％、44mol％或45mol％的浓度存在。在一个实施方案中，阳离子脂质与类固醇的摩尔比在1.0:0.9至1.0:1.2或1.0:1.0至1.0:1.2的范围内。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含约40.0mol％、40.1mol％、40.2mol％、40.3mol％、40.4mol％、40.5mol％、40.6mol％、40.7mol％、40.8mol％、40.9mol％或41.0mol％的类固醇。
在一个实施方案中，类固醇以在39mol％至49mol％、40mol％至46mol％、40mol％至44mol％、40mol％至42mol％、42mol％至44mol％或44mol％至46mol％范围内的浓度存在。在一个实施方案中，类固醇以40mol％、41mol％、42mol％、43mol％、44mol％、45mol％或46mol％的浓度存在。在一个实施方案中，阳离子脂质与类固醇的摩尔比在1.0:0.9至1.0:1.2或1.0:1.0至1.0:1.2的范围内。在一个实施方案中，类固醇是胆固醇。
在一个实施方案中，聚合物结合的脂质以在约0.1mol％至约10mol％、约0.2mol％至约7.5mol％、0.3mol％至5mol％、0.4mol％至2.5mol％、0.5mol％至2mol％或1mol％至2mol％范围内的浓度存在。在一个实施方案中，聚合物结合的脂质以0.5mol％、0.75mol％、1mol％、1.25mol％、1.5mol％、1.75mol％、2mol％、2.25mol％或2.5mol％的浓度存在。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含约1.0mol％、1.1mol％、1.2mol％、1.3mol％、1.4mol％、1.5mol％、1.6mol％、1.7mol％、1.8mol％、1.9mol％或2.0mol％的聚合物结合的脂质。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含约1.5mol％的聚合物结合的脂质。
在一个实施方案中，LNP中的治疗剂:脂质比(即，N/P，其中N代表阳离子脂质的摩尔数，并且P代表作为核酸主链的一部分存在的磷酸酯的摩尔数)在2:1至30:1，例如3:1至22:1的范围内。在一个实施方案中，N/P在6:1至20:1或2:1至12:1的范围内。示例性N/P范围包括约3:1、约6:1、约12:1和约22:1。
在一个实施方案中，本文提供了脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含：
i)有效pKa大于6.0的阳离子脂质(即，第一脂质)；
ii)5mol％至15mol％的中性脂质(例如，磷脂)；
iii)1mol％至15mol％的阴离子脂质；
iv)30mol％至45mol％的类固醇；
v)聚合物结合的脂质(即，第二脂质)；和
vi)治疗剂或其药学上可接受的盐或前药，
其中mol％是基于脂质纳米颗粒中存在的脂质的总摩尔数确定的。
在一个实施方案中，阳离子脂质可以是在选定pH(诸如生理pH)下携带净正电荷的多种脂质种类中的任一种。示例性阳离子脂质在下文描述。在一个实施方案中，阳离子脂质具有大于6.25的pKa。在一个实施方案中，阳离子脂质具有大于6.5的pKa。在一个实施方案中，阳离子脂质具有大于6.1、大于6.2、大于6.3、大于6.35、大于6.4、大于6.45、大于6.55、大于6.6、大于6.65或大于6.7的pKa。
在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含40mol％至45mol％的阳离子脂质。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含45mol％至50mol％的阳离子脂质。
在一个实施方案中，阳离子脂质与中性脂质的摩尔比在约2:1至约8:1的范围内。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含5mol％至10mol％的中性脂质。
示例性阴离子脂质包括但不限于磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)或1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油)(DSPG)。
在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含1mol％至10mol％的阴离子脂质。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含1mol％至5mol％的阴离子脂质。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含1mol％至9mol％、1mol％至8mol％、1mol％至7mol％或1mol％至6mol％的阴离子脂质。在一个实施方案中，阴离子脂质与中性脂质的摩尔比在1:1至1:10的范围内。
在一个实施方案中，类固醇是胆固醇。在一个实施方案中，阳离子脂质与胆固醇的摩尔比在约5:1至1:1的范围内。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含32mol％至40mol％的类固醇。
在一个实施方案中，中性脂质的mol％与阴离子脂质的mol％之和在5mol％至15mol％的范围内。在一个实施方案中，其中中性脂质的mol％与阴离子脂质的mol％之和在7mol％至12mol％的范围内。
在一个实施方案中，阴离子脂质与中性脂质的摩尔比在1:1至1:10的范围内。在一个实施方案中，中性脂质的mol％和类固醇的mol％之和在35mol％至45mol％的范围内。
在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含：
i)45mol％至55mol％的阳离子脂质；
ii)5mol％至10mol％的中性脂质；
iii)1mol％至5mol％的阴离子脂质；和
iv)32mol％至40mol％的类固醇。
在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含1.0mol％至2.5mol％的结合脂质。在一个实施方案中，聚合物结合的脂质以约1.5mol％的浓度存在。
在一个实施方案中，中性脂质以5mol％至15mol％、7mol％至13mol％或9mol％至11mol％范围内的浓度存在。在一个实施方案中，中性脂质以约9.5mol％、10mol％或10.5mol％的浓度存在。在一个实施方案中，阳离子脂质与中性脂质的摩尔比在约4.1:1.0至约4.9:1.0、约4.5:1.0至约4.8:1.0或约4.7:1.0至4.8:1.0的范围内。
在一个实施方案中，类固醇是胆固醇。在一些实施方案中，类固醇以在39mol％至49mol％、40mol％至46mol％、40mol％至44mol％、40mol％至42mol％、42mol％至44mol％或44mol％至46mol％范围内的浓度存在。在一个实施方案中，类固醇以40mol％、41mol％、42mol％、43mol％、44mol％、45mol％或46mol％的浓度存在。在某些实施方案中，阳离子脂质与类固醇的摩尔比在1.0:0.9至1.0:1.2或1.0:1.0至1.0:1.2的范围内。
在一个实施方案中，阳离子脂质与类固醇的摩尔比在5:1至1:1的范围内。
在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含1.0mol％至2.5mol％的结合脂质。在一个实施方案中，聚合物结合的脂质以约1.5mol％的浓度存在。
在一个实施方案中，阳离子脂质与聚合物结合的脂质的摩尔比在约100:1至约20:1的范围内。在一个实施方案中，阳离子脂质与聚合物结合的脂质的摩尔比在约35:1至约25:1的范围内。
在一个实施方案中，阳离子脂质与聚合物结合的脂质的摩尔比在约100:1至约20:1的范围内。在一个实施方案中，阳离子脂质与聚合物结合的脂质的摩尔比在约35:1至约25:1的范围内。
在一个实施方案中，脂质纳米颗粒具有在50nm至100nm或60nm至85nm范围内的平均直径。在一个实施方案中，所述组合物包含本文提供的阳离子脂质、DSPC、胆固醇和PEG-脂质以及mRNA。
在一个实施方案中，所述组合物包含：约20mol％至约65mol％的第一脂质；约5mol％至约40mol％的磷脂；约20mol％至约50mol％的类固醇；和聚合物结合的脂质。
在一个实施方案中，所述组合物包含：约40mol％至约55mol％的第一脂质；(ii)约5mol％至约15mol％的磷脂；(iii)约35mol％至约50mol％的类固醇；和(iv)约2mol％至约10mol％的聚合物结合的脂质。
在一个实施方案中，所述组合物包含：(i)约45mol％至约55mol％的第一脂质；(ii)约6mol％至约10mol％的磷脂；(iii)约40mol％至约48mol％的类固醇；和(iv)约1mol％至约2.5mol％的聚合物结合的脂质。
在一个实施方案中，本文提供的阳离子脂质、DSPC、胆固醇和PEG-脂质处于约50:10:38.5:1.5的摩尔比。
可针对一种或多种特定应用或标靶来设计纳米颗粒组合物。举例来说，纳米颗粒组合物可设计成用于将治疗剂和/或预防剂，诸如RNA递送至哺乳动物体内的特定细胞、组织、器官或系统或其群组。纳米颗粒组合物的物理化学特性可经改变以增加对特定身体标靶的选择性。举例来说，可基于不同器官的开窗大小来调整粒径。纳米颗粒组合物中所包含的治疗剂和/或预防剂还可基于一个或多个所需的递送标靶进行选择。举例来说，治疗剂和/或预防剂可针对特定适应症、疾患、疾病或病症和/或针对递送至特定细胞、组织、器官或系统或其群组(例如局部或特异性递送)进行选择。在某些实施方案中，纳米颗粒组合物可包含编码目标多肽的mRNA，其能够在细胞内翻译以产生目标多肽。此类组合物可设计成特异性递送至特定器官。在某些实施方案中，组合物可设计成特异性递送至哺乳动物肝脏。
纳米颗粒组合物中治疗剂和/或预防剂的量可取决于纳米颗粒组合物的大小、组成、期望标靶和/或应用，或其它特性，以及治疗剂和/或预防剂的特性。举例来说，可用于纳米颗粒组合物中的RNA的量可取决于RNA的大小、序列和其它特征。纳米颗粒组合物中治疗剂和/或预防剂和其它成分(例如脂质)的相对量还可变化。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物中脂质组分与治疗剂和/或预防剂的wt/wt比率可为约5:1至约60:1，诸如为约5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、22:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1和60:1。举例来说，脂质组分与治疗剂和/或预防剂的wt/wt比率可为约10:1至约40:1。在某些实施方案中，wt/wt比率为约20:1。纳米颗粒组合物中治疗剂和/或预防剂的量可例如使用吸收光谱法(例如紫外-可见光谱法)测量。
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含一种或多种RNA，并且可选择一种或多种RNA、脂质和其量来提供特定N:P比。组合物的N:P比是指一种或多种脂质中的氮原子与RNA中磷酸酯基的数量的摩尔比。在一些实施方案中，选择较低的N:P比。可选择一种或多种RNA、脂质和其量以提供约2:1至约30:1，诸如2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、12:1、14:1、16:1、18:1、20:1、22:1、24:1、26:1、28:1或30:1的N:P比。在某些实施方案中，N:P比可为约2:1至约8:1。在其它实施方案中，N:P比为约5:1至约8:1。举例来说，N:P比可为约5.0:1、约5.5:1、约5.67:1、约6.0:1、约6.5:1或约7.0:1。举例来说，N:P比可为约5.67:1。
纳米颗粒组合物的物理特性可取决于其组分。举例来说，包含胆固醇作为结构脂质的纳米颗粒组合物可具有与包含不同结构脂质的纳米颗粒组合物不同的特征。类似地，纳米颗粒组合物的特征可取决于其组分的绝对或相对量。举例来说，包含较高摩尔分率的磷脂的纳米颗粒组合物可具有与包含较低摩尔分率的磷脂的纳米颗粒组合物不同的特征。特征还可根据纳米颗粒组合物的制备方法和条件而变化。
纳米颗粒组合物可通过多种方法表征。举例来说，可使用显微术(例如透射电子显微术或扫描电子显微术)来检查纳米颗粒组合物的形态和大小分布。可使用动态光散射或电位测定法(例如电位滴定法)来测量ζ电位。动态光散射还可用于确定粒径。还可使用仪器，诸如Zetasizer Nano ZS(Malvem Instruments Ltd,Malvem,Worcestershire,UK)来测量纳米颗粒组合物的多个特征，诸如粒径、多分散性指数和ζ电位。
在各个实施方案中，纳米颗粒组合物的平均大小可在数十纳米至数百纳米之间。举例来说，平均大小可为约40nm至约150nm，诸如约40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的平均大小可为约50nm至约100nm、约50nm至约90nm、约50nm至约80nm、约50nm至约70nm、约50nm至约60nm、约60nm至约100nm、约60nm至约90nm、约60nm至约80nm、约60nm至约70nm、约70nm至约100nm、约70nm至约90nm、约70nm至约80nm、约80nm至约100nm、约80nm至约90nm、或约90nm至约100nm。在某些实施方案中，纳米颗粒组合物的平均大小可为约70nm至约100nm。在一些实施方案中，平均大小可为约80nm。在其它实施方案中，平均大小可为约100nm。
纳米颗粒组合物可为相对均质的。多分散性指数可用于指示纳米颗粒组合物的均质性，例如纳米颗粒组合物的粒径分布。小的(例如小于0.3)的多分散性指数一般指示窄的粒径分布。纳米颗粒组合物的多分散性指数可为约0至约0.25，诸如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的多分散性指数可为约0.10至约0.20。
纳米颗粒组合物的ζ电位可用于指示组合物的动电位。举例来说，ζ电位可描述纳米颗粒组合物的表面电荷。具有相对较低正或负电荷的纳米颗粒组合物一般是期望的，这是因为带较高电荷的物质可与体内的细胞、组织和其它成分发生不期望的相互作用。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的ζ电位可为约-10mV至约+20mV、约-10mV至约+15mV、约-10mV至约+10mV、约-10mV至约+5mV、约-10mV至约0mV、约-10mV至约-5mV、约-5mV至约+20mV、约-5mV至约+15mV、约-5mV至约+10mV、约-5mV至约+5mV、约-5mV至约0mV、约0mV至约+20mV、约0mV至约+15mV、约0mV至约+10mV、约0mV至约+5mV、约+5mV至约+20mV、约+5mV至约+15mV或约+5mV至约+10mV。
治疗剂和/或预防剂的包封效率描述相对于所提供的初始量，在制备后经纳米颗粒组合物包封或以其它方式与纳米颗粒组合物缔合的治疗剂和/或预防剂的量。包封效率期望较高(例如接近100％)。包封效率可例如通过比较在用一种或多种有机溶剂或清洁剂破坏纳米颗粒组合物之前与之后含有纳米颗粒组合物的溶液中治疗剂和/或预防剂的量来测量。荧光可用于测量溶液中游离治疗剂和/或预防剂(例如RNA)的量。对于本文所述的纳米颗粒组合物，治疗剂和/或预防剂的包封效率可为至少50％，例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，包封效率可为至少80％。在某些实施方案中，包封效率可为至少90％。
纳米颗粒组合物可任选地包含一种或多种包衣。举例来说，可将纳米颗粒组合物配制成具有包衣的胶囊、膜片或片剂。包含本文所述组合物的胶囊、膜片或片剂可具有任何有用的大小、抗拉强度、硬度或密度。
药物组合物
根据本公开，纳米颗粒组合物可整体或部分地配制成药物组合物。药物组合物可包含一种或多种纳米颗粒组合物。举例来说，药物组合物可包含一种或多种纳米颗粒组合物，所述一种或多种纳米颗粒组合物包含一种或多种不同的治疗剂和/或预防剂。药物组合物还可包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或辅助成分，诸如本文所述的那些。关于药物组合物和剂的配制和制造的一般指南可例如在Remington，The Science and Practiceof Pharmacy，第21版，A.R.Gennaro；Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,Md.,2006中获得。常规赋形剂和辅助成分可用于任何药物组合物中，除非任何常规赋形剂或辅助成分与纳米颗粒组合物的一种或多种组分不相容。如果赋形剂或辅助成分与纳米颗粒组合物的组分的组合会导致任何不希望的生物效应或其它有害效应，则赋形剂或辅助成分与纳米颗粒组合物的组分不相容。
在一些实施方案中，一种或多种赋形剂或辅助成分可构成包含纳米颗粒组合物的药物组合物的总质量或体积的大于50％。举例来说，一种或多种赋形剂或辅助成分可构成药物组合物的50％、60％、70％、80％、90％或更高百分比。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂为至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯。在一些实施方案中，赋形剂经批准用于人类和兽医用途。在一些实施方案中，赋形剂得到美国食品与药物管理局批准。在一些实施方案中，赋形剂是医药级的。在一些实施方案中，赋形剂符合美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。
根据本公开的药物组合物中的一种或多种纳米颗粒组合物、一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或任何额外成分的相对量将取决于所治疗受试者的身份、体格和/或状况并且进一步取决于组合物的施用途径而变化。举例来说，药物组合物可包含在0.1％与100％(wt/wt)之间的一种或多种纳米颗粒组合物。
在某些实施方案中，本公开的纳米颗粒组合物和/或药物组合物经冷藏或冷冻储存和/或运输(例如在4℃或更低温度下，诸如在约-150℃与约0℃之间或在约-80℃与约-20℃之间(例如约-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-130℃或-150℃)的温度下储存)。举例来说，包含式01-I、01-II、02-I、03-I和04-I(及其子式)中任一者的化合物的药物组合物是在例如约-20℃、30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下冷藏储存和/或运输的溶液。在某些实施方案中，本公开还涉及一种增加包含式01-I、01-II、02-I、03-I和04-I(及其子式)中任一者的化合物的纳米颗粒组合物和/或药物组合物的稳定性的方法，其通过将所述纳米颗粒组合物和/或药物组合物储存于4℃或更低温度下，诸如在约-150℃与约0℃之间或在约-80℃与约-20℃之间的温度，例如约-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-130℃或-150℃来进行。举例来说，本文所公开的纳米颗粒组合物和/或药物组合物在例如4℃或更低(例如约4℃与-20℃之间)的温度下稳定保持约至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少1个月、至少2个月、至少4个月、至少6个月、至少8个月、至少10个月、至少12个月、至少14个月、至少16个月、至少18个月、至少20个月、至少22个月或至少24个月。在一个实施方案中，制剂在约4℃下稳定保持至少4周。在某些实施方案中，本公开的药物组合物包含本文所公开的纳米颗粒组合物和药学上可接受的载体，所述载体选自以下中的一种或多种：Tris、乙酸盐(例如乙酸钠)、柠檬酸盐(例如柠檬酸钠)、生理食盐水、PBS和蔗糖。在某些实施方案中，本公开的药物组合物的pH值在约7与8之间(例如6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0，或在7.5与8之间或在7与7.8之间)。举例来说，本公开的药物组合物包含本文所公开的纳米颗粒组合物、Tris、生理食盐水和蔗糖，并且具有约7.5-8的pH值，其适于在例如约-20℃下储存和/或运输。举例来说，本公开的药物组合物包含本文所公开的纳米颗粒组合物和PBS，并且具有约7-7.8的pH值，其适于在例如约4℃或更低温度下储存和/或运输。在本公开的上下文中，“稳定性”、“稳定化”和“稳定的”是指本文所公开的纳米颗粒组合物和/或药物组合物在给定制造、制备、转运、储存和/或使用条件下，例如当施加应力，诸如剪切力、冷冻/解冻应力等时，对化学或物理变化(例如降解、粒径变化、聚集、包封的变化等)具有抗性。
可将纳米颗粒组合物和/或包含一种或多种纳米颗粒组合物的药物组合物施用于任何患者或受试者，包括可受益于通过将治疗剂和/或预防剂递送至一种或多种特定细胞、组织、器官或系统或其群组，诸如肾脏系统所提供的治疗效应的患者或受试者。尽管本文所提供的关于纳米颗粒组合物和包含纳米颗粒组合物的药物组合物的描述主要针对适于施用于人类的组合物，但本领域技术人员应理解，此类组合物一般适于施用于任何其它哺乳动物。为了使组合物适于施用于各种动物而对适于施用于人类的组合物的改进是众所周知的，并且有普通技术的兽医药理学家仅通过普通实验(如果有的话)即可设计和/或进行此类改进。经考虑，施用组合物的受试者包括但不限于人类、其它灵长类动物和其它哺乳动物，包括商业上相关的哺乳动物，诸如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠。
包含一种或多种纳米颗粒组合物的药物组合物可通过药理学领域中已知或以后将开发的任何方法制备。一般来说，此类制备方法包括使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其它辅助成分结合，并且接着，如果需要或必要，则将产物分成、成型成和/或包装成所需的单剂量或多剂量单元。
根据本公开的药物组合物可以散装、作为单次单位剂量和/或作为多个单次单位剂量制备、包装和/或出售。如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分(例如纳米颗粒组合物)的药物组合物的离散量。活性成分的量一般等于将被施用受试者的活性成分的剂量和/或这个剂量的便利部分，诸如这个剂量的一半或三分之一。
药物组合物可制备成适合多种施用途径和方法的多种形式。举例来说，药物组合物可制备成液体剂型(例如乳液、微乳液、纳米乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂)、可注射形式、固体剂型(例如胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂)、用于局部和/或经皮施用的剂型(例如软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶剂、粉剂、溶液、喷雾剂、吸入剂和贴片)、悬浮液、粉剂和其它形式。
经口和胃肠外施用的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳液、微乳液、纳米乳液、溶液、悬浮液、糖浆和/或酏剂。除活性成分外，液体剂型还可包含此项技术中常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(尤其为棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨醇脂肪酸酯，以及其混合物。除惰性稀释剂外，经口组合物还可包含额外治疗剂和/或预防剂、额外剂，诸如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂。在供胃肠外施用的某些实施方案中，将组合物与增溶剂混合，所述增溶剂诸如为CremophorTM、醇、油、改性油、二醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物和/或其组合。
可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液，可根据已知技术，使用适合分散剂、润湿剂和/或助悬剂来配制。无菌可注射制剂可为在无毒胃肠外可接受的稀释剂和/或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液和/或乳液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的媒介物和溶剂包括水、林格氏溶液(U.S.P.)和等渗氯化钠溶液。无菌不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。出于这个目的，可使用任何温和的不挥发性油，包括合成单酸甘油酯或二酸甘油酯。诸如油酸的脂肪酸可用于制备可注射剂。
可注射制剂可经灭菌，例如通过经由细菌截留过滤器过滤，和/或通过掺入呈无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，所述灭菌剂可在使用前溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中。
本公开提供向哺乳动物细胞或器官递送治疗剂和/或预防剂，在哺乳动物细胞中产生目标多肽，以及治疗有需要的哺乳动物的疾病或病症的方法，所述方法包括向哺乳动物施用包含治疗剂和/或预防剂的纳米颗粒组合物和/或使哺乳动物细胞与所述纳米颗粒组合物接触。
方法
在一个方面，本文还提供了用于控制、预防和治疗受试者中由RV或由感染RV引起的疾病或病症的方法。在一些实施方案中，用本文所述的方法控制、预防或治疗的疾病或病症是由RV或由感染RV引起的。
在具体实施方案中，用本文所述的方法控制、预防或治疗的疾病或病症是狂犬病。
在一些实施方案中，本发明的用于控制、预防和治疗受试者中由RV或由感染RV引起的疾病或病症的方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如本文所述的治疗性核酸。在具体实施方案中，治疗性核酸是如本文所述的mRNA分子。
在一些实施方案中，本发明的用于控制、预防和治疗受试者中由RV或由感染RV引起的疾病或病症的方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含如本文所述的治疗性核酸的治疗性组合物。在具体实施方案中，治疗性核酸是如本文所述的mRNA分子。
在一些实施方案中，本发明的用于控制、预防和治疗受试者中由RV或由感染RV引起的疾病或病症的方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含如本文所述的治疗性核酸的疫苗组合物。在具体实施方案中，治疗性核酸是如本文所述的mRNA分子。
在一些实施方案中，本发明的用于控制、预防和治疗受试者中由RV或由感染RV引起的疾病或病症的方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含如本文所述的治疗性核酸的含脂质组合物。在具体实施方案中，治疗性核酸是如本文所述的mRNA分子。
在一些实施方案中，本发明的用于控制、预防和治疗受试者中由RV或由感染RV引起的疾病或病症的方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含如本文所述的治疗性核酸的含脂质组合物，其中所述含脂质组合物被配制为将所述治疗性核酸包封在脂质壳中的脂质纳米颗粒。在具体实施方案中，治疗性核酸是如本文所述的mRNA分子。在具体实施方案中，受试者中的细胞在施用后有效摄取本文所述的含脂质组合物(例如，脂质纳米颗粒)。在具体实施方案中，本文所述的含脂质组合物(例如，脂质纳米颗粒)被受试者的细胞内吞。
在一些实施方案中，在向有需要的受试者施用如本文所述的治疗性核酸、包含本文所述的治疗性核酸的疫苗组合物、包含本文所述的治疗性核酸的含脂质组合物(例如，脂质纳米颗粒)后，受试者中的细胞摄取并表达所施用的治疗性核酸以产生由所述核酸编码的肽或多肽。在一些实施方案中，所编码的肽或多肽源自引起通过所述方法控制、预防或治疗的疾病或病症的RV。
免疫反应
在一些实施方案中，在向有需要的受试者施用如本文所述的治疗性核酸、包含本文所述的治疗性核酸的疫苗组合物、包含本文所述的治疗性核酸的含脂质组合物(例如，脂质纳米颗粒)后，在所述受试者中引发针对RV的一种或多种免疫反应。在一些实施方案中，所引发的免疫反应包括针对RV的一种或多种适应性免疫反应。在一些实施方案中，所引发的免疫反应包括针对RV的一种或多种先天性免疫反应。一种或多种免疫反应可呈例如抗体反应(体液反应)或细胞免疫反应例如细胞因子分泌(例如，干扰素-γ)、辅助活性或细胞毒性的形式。在一些实施方案中，诱导、激活和/或增强激活标志物在免疫细胞上的表达、共刺激受体在免疫细胞上的表达、共刺激受体的配体的表达、细胞因子分泌、免疫细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞和/或NK细胞)对被感染细胞的浸润、产生特异性地识别一种或多种病毒蛋白(例如，由治疗性核酸编码的病毒肽或蛋白质)的抗体、效应子功能、T细胞激活、T细胞分化、T细胞增殖、B细胞分化、B细胞增殖和/或NK细胞增殖。在一些实施方案中，抑制骨髓来源的抑制细胞(MDSC)和Treg细胞的激活和增殖。
在一些实施方案中，在向有需要的受试者施用如本文所述的治疗性核酸、包含本文所述的治疗性核酸的疫苗组合物、包含本文所述的治疗性核酸的含脂质组合物(例如，脂质纳米颗粒)后。
在一些实施方案中，在向有需要的受试者施用如本文所述的治疗性核酸、包含本文所述的治疗性核酸的疫苗组合物、包含本文所述的治疗性核酸的含脂质组合物(例如，脂质纳米颗粒)后，受试者中产生细胞因子的一个或多个淋巴细胞群体增加。在一些实施方案中，淋巴细胞是CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。在一些实施方案中，细胞因子是IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6中的一种或多种。在一些实施方案中，表达IFN-g和IL-2的CD4+细胞的比例增加。在一些实施方案中，表达IL-4的CD4+细胞的比例增加。在一些实施方案中，表达IFN-g和IL-2的CD8+细胞的比例增加。在一些实施方案中，表达IL-6的淋巴细胞如T细胞和巨噬细胞的比例增加。
在具体实施方案中，中和抗体特异性地结合至RV G蛋白的一个或多个表位，并抑制或降低一种或多种G蛋白的功能或活性。
在具体实施方案中，中和抗体结合至病毒颗粒或被感染细胞表面上存在的一种或多种病毒蛋白，并标记所述病毒颗粒或被感染细胞以被受试者的免疫系统破坏。在一些实施方案中，诱导或增强白细胞(例如，巨噬细胞)对病毒颗粒的内吞作用。在一些实施方案中，诱导或增强受试者中针对被感染细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，诱导或增强受试者中针对被感染细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。在一些实施方案中，诱导或增强受试者中针对被感染细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)。
组合疗法
在一些实施方案中，本公开的组合物还可包含一种或多种额外治疗剂。在一些实施方案中，额外治疗剂是能够增强组合物(例如，基因疫苗)的免疫原性的佐剂。在一些实施方案中，额外治疗剂是增强受试者中的免疫反应的免疫调节剂。在一些实施方案中，组合物中的佐剂和治疗性核酸可在引发受试者的免疫反应中具有协同作用。
在一些实施方案中，额外治疗剂和本公开的治疗性核酸可共同配制在一种组合物中。例如，可将额外治疗剂配制为包含本公开的治疗性核酸的组合物的一部分。或者，在一些实施方案中，额外治疗剂和本公开的治疗性核酸可被配制为单独的组合物或剂量单位，以用于依序或同时向受试者共同施用。
在特定实施方案中，本公开的治疗性核酸被配制为如上所述的含脂质组合物的一部分，并且额外治疗剂被配制为单独的组合物。在特定实施方案中，本公开的治疗性核酸被配制为如上所述的含脂质组合物的一部分，其中额外治疗剂也被配制为含脂质组合物的一部分。
在特定实施方案中，配制本公开的治疗性核酸，使得治疗性核酸被包封在如上所述的脂质纳米颗粒的脂质壳中，并且额外治疗剂被配制为单独的组合物。在特定实施方案中，配制本公开的治疗性核酸，使得治疗性核酸被包封在如上所述的脂质纳米颗粒的脂质壳中，其中脂质纳米颗粒还包封额外治疗剂分子或编码额外治疗剂分子的核酸。在特定实施方案中，配制本公开的治疗性核酸，使得治疗性核酸被包封在如上所述的脂质纳米颗粒的脂质壳中，其中脂质纳米颗粒和额外治疗剂被配制为单一组合物。
在具体实施方案中，额外治疗剂是佐剂。在一些实施方案中，佐剂包含在疫苗接种受试者中促进树突细胞(DC)成熟的剂，诸如但不限于脂多糖、TNF-α或CD40配体。在一些实施方案中，佐剂是被疫苗接种受试者的免疫系统识别为“危险信号”的剂，诸如LPS、GP96等。
在一些实施方案中，佐剂包含免疫刺激性细胞因子，诸如但不限于IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、INF-α、IFN-β、INF-γ、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、LT-β或TNF-α，生长因子诸如hGH。
在一些实施方案中，佐剂包含已知为能够引发先天性免疫反应的化合物。这种化合物的一种示例性类别是Toll样受体配体，诸如人Toll样受体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10的配体，以及鼠Toll样受体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12或TLR13的配体。此类化合物的另一种示例性类别是免疫刺激性核酸，诸如含有CpG基序的寡核苷酸。含CpG核酸可以是DNA(CpG-DNA)或RNA(CpG-RNA)分子。CpG-RNA或CpG-DNA可以是单链CpG-DNA(ss CpG-DNA)、双链CpG-DNA(dsDNA)、单链CpG-RNA(ss CpG-RNA)或双链CpG-RNA(ds CpG-RNA)。在一些实施方案中，CpG核酸呈CpG-RNA的形式。在特定实施方案中，CpG核酸呈单链CpG-RNA(ss CpG-RNA)的形式。在一些实施方案中，CpG核酸含有至少一个或多个(促有丝分裂)胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸序列(CpG基序)。在一些实施方案中，包含在这些序列中的至少一个CpG基序(即，形成CpG基序的C(胞嘧啶)和/或G(鸟嘌呤))未被甲基化。
在一些实施方案中，额外治疗剂是激活、加强或恢复正常免疫功能的免疫调节剂。在具体实施方案中，免疫调节剂是免疫细胞，诸如T淋巴细胞、NK细胞或抗原呈递细胞(例如，树突细胞或巨噬细胞)的共刺激信号的激动剂。在具体实施方案中，免疫调节剂是免疫细胞，诸如T淋巴细胞、NK细胞或抗原呈递细胞(例如，树突细胞或巨噬细胞)的抑制信号的拮抗剂。
本领域技术人员已知的各种免疫细胞刺激剂可与本公开结合使用。在某些实施方案中，共刺激信号的激动剂是在免疫细胞诸如T淋巴细胞(例如，CD4+或CD8+T淋巴细胞)、NK细胞和/或抗原呈递细胞(例如，树突细胞或巨噬细胞)上发现的共刺激分子(例如，共刺激受体)的激动剂。共刺激分子的具体实例包括糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)、诱导型T细胞共刺激物(ICOS或CD278)、OX40(CD134)、CD27、CD28、4-IBB(CD137)、CD40、淋巴毒素α(LTα)、LIGHT(类淋巴毒素，表现出诱导型表达，并与单纯疱疹病毒糖蛋白D竞争HVEM(由T淋巴细胞表达的受体))、CD226、细胞毒性和调控性T细胞分子(CRT AM)、死亡受体3(DR3)、淋巴毒素β受体(LTBR)、跨膜激活因子和CAML交互因子(transmembrane activatorand CAML interactor，TACI)、B细胞激活因子受体(BAFFR)和B细胞成熟蛋白(BCMA)。
在具体实施方案中，共刺激受体的激动剂是特异性地结合至所述共刺激受体的抗体或其抗原结合片段。共刺激受体的具体实例包括GITR、ICOS、OX40、CD27、CD28、4-1BB、CD40、LTα、LIGHT、CD226、CRT AM、DR3、LTBR、TACI、BAFFR和BCMA。在某些具体实施方案中，抗体是单克隆抗体。在其它具体实施方案中，抗体是sc-Fv。在一个具体实施方案中，抗体是结合至免疫细胞上的两个受体的双特异性抗体。在其它实施方案中，双特异性抗体结合至免疫细胞上的受体和病毒感染的患病细胞上的另一受体。在具体实施方案中，抗体是人或人源化抗体。
在另一实施方案中，共刺激受体的激动剂是共刺激受体的配体或其功能衍生物。在某些实施方案中，配体是天然配体的片段。天然配体的具体实例包括ICOSL、B7RP1、CD137L、OX40L、CD70、疱疹病毒侵入介体(HVEM)、CD80和CD86。编码天然配体的核苷酸序列以及天然配体的氨基酸序列是本领域已知的。
在具体实施方案中，拮抗剂是在免疫细胞例如T淋巴细胞(例如，CD4+或CD8+T淋巴细胞)、NK细胞和/或抗原呈递细胞(例如，树突细胞或巨噬细胞)上发现的抑制性分子(例如，抑制性受体)的拮抗剂。抑制性分子的具体实例包括细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4或CD52)、程序性细胞死亡蛋白1(PD1或CD279)、B和T淋巴细胞减毒剂(BTLA)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、淋巴细胞激活基因3(LAG3)、T细胞膜蛋白3(TIM3)、CD 160、腺苷A2a受体(A2aR)、具有免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)和CD 160。
在另一实施方案中，抑制性受体的拮抗剂是与抑制性受体的天然配体特异性结合并阻止天然配体与抑制性受体结合和转导抑制信号的抗体(或抗原结合片段)。在某些具体实施方案中，抗体是单克隆抗体。在其它具体实施方案中，抗体是sc-Fv。在一个具体实施方案中，抗体是结合至免疫细胞上的两个受体的双特异性抗体。在其它实施方案中，双特异性抗体结合至免疫细胞上的受体和病毒感染的患病细胞上的另一受体。在具体实施方案中，抗体是人或人源化抗体。
在另一实施方案中，抑制性受体的拮抗剂是可溶性受体或其功能衍生物，所述可溶性受体或其功能衍生物与抑制性受体的天然配体特异性结合并阻止天然配体与抑制性受体结合和转导抑制信号。抑制性受体的天然配体的具体实例包括PDL-1、PDL-2、B7-H3、B7-H4、HVEM、Gal9和腺苷。结合至天然配体的抑制性受体的具体实例包括CTLA-4、PD-1、BTLA、KIR、LAG3、TIM3和A2aR。
在另一实施方案中，抑制性受体的拮抗剂是与抑制性受体结合但不转导抑制信号的抗体(或抗原结合片段)或配体。抑制性受体的具体实例包括CTLA-4、PD1、BTLA、KIR、LAG3、TIM3和A2aR。在某些具体实施方案中，抗体是单克隆抗体。在其它具体实施方案中，抗体是scFv。在特定实施方案中，抗体是人或人源化抗体。抑制性受体的抗体的具体实例是抗CTLA-4抗体(Leach DR,等人，Science 1996；271:1734-1736)。抑制性受体的抗体的另一个实例是抗PD-1抗体(Topalian SL,NEJM 2012；28:3167-75)。
患者群体
在一些实施方案中，将本文所述的治疗性核酸、包含本文所述的治疗性核酸的疫苗组合物、包含本文所述的治疗性核酸的含脂质组合物(例如，脂质纳米颗粒)或本文所述的组合疗法施用于有需要的受试者。
在一些实施方案中，将本文所述的治疗性核酸、包含本文所述的治疗性核酸的疫苗组合物、包含本文所述的治疗性核酸的含脂质组合物(例如，脂质纳米颗粒)或本文所述的组合疗法施用于人受试者。在一些实施方案中，施用本文所述的治疗性核酸、包含本文所述的治疗性核酸的疫苗组合物、包含本文所述的治疗性核酸的含脂质组合物(例如，脂质纳米颗粒)或本文所述的组合疗法的受试者是老年人。在一些实施方案中，施用本文所述的治疗性核酸、包含本文所述的治疗性核酸的疫苗组合物、包含本文所述的治疗性核酸的含脂质组合物(例如，脂质纳米颗粒)或本文所述的组合疗法的受试者是人类成人。在一些实施方案中，施用本文所述的治疗性核酸、包含本文所述的治疗性核酸的疫苗组合物、包含本文所述的治疗性核酸的含脂质组合物(例如，脂质纳米颗粒)或本文所述的组合疗法的受试者是人类儿童。在一些实施方案中，施用本文所述的治疗性核酸、包含本文所述的治疗性核酸的疫苗组合物、包含本文所述的治疗性核酸的含脂质组合物(例如，脂质纳米颗粒)或本文所述的组合疗法的受试者是人类幼儿。在一些实施方案中，施用本文所述的治疗性核酸、包含本文所述的治疗性核酸的疫苗组合物、包含本文所述的治疗性核酸的含脂质组合物(例如，脂质纳米颗粒)或本文所述的组合疗法的受试者是人类婴儿。
在一些实施方案中，施用本文所述的治疗性核酸、包含本文所述的治疗性核酸的疫苗组合物、包含本文所述的治疗性核酸的含脂质组合物(例如，脂质纳米颗粒)或本文所述的组合疗法的受试者是非人哺乳动物。
在一些实施方案中，施用本文所述的治疗性核酸、包含本文所述的治疗性核酸的疫苗组合物、包含本文所述的治疗性核酸的含脂质组合物(例如，脂质纳米颗粒)或本文所述的组合疗法的受试者是表现出至少一种与RV感染相关的症状的受试者。在一些实施方案中，接受施用本文所述的治疗性核酸、包含本文所述的治疗性核酸的疫苗组合物、包含本文所述的治疗性核酸的含脂质组合物(例如，脂质纳米颗粒)或本文所述的组合疗法的受试者表现出狂犬病的一种或多种症状。
在一些实施方案中，将本文所述的治疗性核酸、包含本文所述的治疗性核酸的疫苗组合物、包含本文所述的治疗性核酸的含脂质组合物(例如，脂质纳米颗粒)或如本文所述的组合疗法施用于无RV感染症状的受试者。
在一些实施方案中，将本文所述的治疗性核酸、包含本文所述的治疗性核酸的疫苗组合物、包含本文所述的治疗性核酸的含脂质组合物(例如，脂质纳米颗粒)或本文所述的组合疗法施用于处于RV感染风险中或对RV感染易感的受试者。在一些实施方案中，处于RV感染风险中或对RV感染易感的受试者是老年人。在一些实施方案中，处于RV感染风险中或对RV感染易感的受试者是人类成人。在一些实施方案中，处于RV感染风险中或对RV感染易感的受试者是人类儿童。在一些实施方案中，处于RV感染风险中或对RV感染易感的受试者是人类幼儿。在一些实施方案中，处于RV感染风险中或对RV感染易感的受试者是人类婴儿。在一些实施方案中，处于RV感染风险中或对RV感染易感的受试者是具有影响受试者的免疫系统的现有健康疾患的人受试者。在一些实施方案中，处于RV感染风险中或对RV感染易感的受试者是具有影响受试者的主要器官的现有健康疾患的人受试者。在一些实施方案中，处于RV感染风险中或对RV感染易感的受试者是具有影响受试者的肺功能的现有健康疾患的人受试者。在一些实施方案中，处于RV感染风险中或对RV感染易感的受试者是具有影响受试者的免疫系统或主要器官的现有健康疾患的老年人受试者。在此段落中描述的各个实施方案中，处于RV感染风险中或对RV感染易感的受试者可以是表现出RV感染的症状的或无RV感染症状的受试者。
在一些实施方案中，将本文所述的治疗性核酸、包含本文所述的治疗性核酸的疫苗组合物、包含本文所述的治疗性核酸的含脂质组合物(例如，脂质纳米颗粒)或本文所述的组合疗法施用于被诊断为RV感染阳性的受试者。在一些实施方案中，被诊断为RV感染阳性的受试者是无RV感染症状的，并且所述诊断是基于从来自所述受试者的样品中检测到病毒核酸或蛋白质的存在。在一些实施方案中，诊断是基于患者所表现出的临床症状。可充当诊断依据的示例性症状包括但不限于发热、瘙痒、感觉异常、多涎、立毛、周期性瞳孔扩散、恐水、恐高症、吞咽困难和吸气肌痉挛。在一些实施方案中，诊断是基于受试者所表现出的临床症状结合受试者与认为具有携带RV高风险(诸如被诊断为RV感染阳性)的宿主(例如，犬科动物)的接触史。
在一些实施方案中，将本文所述的治疗性核酸、包含本文所述的治疗性核酸的疫苗组合物、包含本文所述的治疗性核酸的含脂质组合物(例如，脂质纳米颗粒)或本文所述的组合疗法施用于先前未接受过治疗性核酸、疫苗组合物、含脂质组合物(例如，脂质纳米颗粒)或组合疗法施用的受试者。
在一些实施方案中，将本文所述的治疗性核酸、包含本文所述的治疗性核酸的疫苗组合物、包含本文所述的治疗性核酸的含脂质组合物(例如，脂质纳米颗粒)或本文所述的组合疗法施用于先前已经接受过治疗性核酸、疫苗组合物、含脂质组合物(例如，脂质纳米颗粒)或组合疗法施用的受试者。在具体实施方案中，受试者先前已被施用本文所述的治疗性核酸、包含本文所述的治疗性核酸的疫苗组合物、包含本文所述的治疗性核酸的含脂质组合物(例如，脂质纳米颗粒)或如本文所述的组合疗法一次、两次、三次或更多次。
在一些实施方案中，将本文所述的治疗性核酸、包含本文所述的治疗性核酸的疫苗组合物、包含本文所述的治疗性核酸的含脂质组合物(例如，脂质纳米颗粒)或本文所述的组合疗法施用于在施用治疗性核酸、疫苗组合物、含脂质组合物(例如，脂质纳米颗粒)或组合疗法之前接受过疗法的受试者。在一些实施方案中，施用本文所述的治疗性核酸、包含本文所述的治疗性核酸的疫苗组合物、包含本文所述的治疗性核酸的含脂质组合物(例如，脂质纳米颗粒)或本文所述的组合疗法的受试者经历了先前疗法的不良副作用或由于对受试者的不可接受的毒性水平而终止了先前疗法。
施用剂量和频率
在控制、预防和/或治疗感染性疾病中有效的治疗性核酸或其组合物的量将取决于所治疗疾病的性质、施用途径、受试者的总体健康状况等，并且应根据医生的判断决定。可任选地采用标准临床技术，诸如体外分析来帮助鉴定最佳剂量范围。然而，如本文所述的用于施用的治疗性核酸的合适剂量范围通常是约0.001mg、0.005mg、0.01mg、0.05mg、0.1mg、0.5mg、1.0mg、2.0mg、3.0mg、4.0mg、5.0mg、10.0mg、0.001mg至10.0mg、0.01mg至1.0mg、0.1mg至1mg和0.1mg至5.0mg。可以根据需要频繁地以一定时间间隔将治疗性核酸或其组合物一次、两次、三次、四次或更多次地施用于受试者。可从源自体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线中推断有效剂量。
在某些实施方案中，将治疗性核酸或其组合物以单剂量、随后在1至6周、1至5周、1至4周、1至3周、1至2周后给以第二剂量施用于受试者。根据这些实施方案，可在第二次接种后以6至12个月的间隔向受试者施用加强接种。
在某些实施方案中，可重复施用治疗性核酸或其组合物，并且所述施用可间隔至少1天、2天、3天、5天、6天、7天、10天、14天、15天、21天、28天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。在其它实施方案中，可重复施用治疗性核酸或其组合物，并且所述施用可间隔1至14天、1至7天、7至14天、1至30天、15至30天、15至45天、15至75天、15至90天、1至3个月、3至6个月、3至12个月或6至12个月。在一些实施方案中，将第一治疗性核酸或其组合物施用于受试者，随后施用第二治疗性核酸或其组合物。在某些实施方案中，第一和第二治疗性核酸或其组合物可间隔至少1天、2天、3天、5天、6天、7天、10天、14天、15天、21天、28天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。在其它实施方案中，第一和第二治疗性核酸或其组合物可间隔1至14天、1至7天、7至14天、1至30天、15至30天、15至45天、15至75天、15至90天、1至3个月、3至6个月、3至12个月或6至12个月。
在某些实施方案中，将治疗性核酸或其组合物与一种或多种额外疗法(诸如章节5.5.2中描述的疗法)组合施用于受试者。其它一种或多种额外疗法的剂量将取决于多种因素，包括例如疗法、感染性疾病的性质、施用途径、受试者的总体健康状况等，并且应根据医生的判断来决定。在具体实施方案中，其它疗法的剂量是对于根据本文公开的方法用作单一剂的疗法所推荐使用的疗法的施用剂量和/或频率。在其它实施方案中，其它疗法的剂量是比对于根据本文公开的方法用作单一剂的疗法所推荐使用的更低的剂量和/或更低的频率的疗法施用。关于批准的疗法的推荐剂量可在Physician’s Desk Reference中找到。
在某些实施方案中，将治疗性核酸或其组合物与一种或多种额外疗法同时施用于受试者。在其它实施方案中，每3至7天、1至6周、1至5周、1至4周、2至4周、1至3周或1至2周向受试者施用治疗性核酸或其组合物，并且每3至7天、1至6周、1至5周、1至4周、1至3周或1至2周施用一种或多种额外疗法(诸如章节5.5.2中所述)。在某些实施方案中，每1-2周向受试者施用治疗性核酸或其组合物，并且每2-4周施用一种或多种额外疗法(诸如章节5.5.2中所述)。在一些实施方案中，每周向受试者施用治疗性核酸或其组合物，并且每2周施用一种或多种额外疗法(诸如章节5.5.2中所述)。
实施例
本章节中的实施例以举例说明而不是限制的方式提供。
一般制备型HPLC方法：HPLC纯化是在配备有二极管阵列检测器(DAD)的Waters2767上，在Inertsil Pre-C8 OBD柱上，一般利用含0.1％TFA的水作为溶剂A且利用乙腈作为溶剂B进行。
一般LCMS方法：LCMS分析是在Shimadzu(LC-MS2020)系统上进行。色谱是在SunFire C18上，一般利用含0.1％甲酸的水作为溶剂A且利用含0.1％甲酸的乙腈作为溶剂B执行。
实施例01-1：化合物02-1(即以下方案中的化合物1)的制备。
化合物1
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.86-0.90(m,12H),1.27-1.63(m,53H),1.97-2.01(m,2H),2.28-2.64(m,14H),3.52-3.58(m,2H),4.00-4.10(m,8H)。LCMS:Rt:1.080min；MS m/z(ESI):826.0[M+H]+。
使用相应的起始材料以与化合物02-1类似的方式制备以下化合物。
实施例01-2：化合物02-2(即以下方案中的化合物2)的制备。
化合物2
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.86-0.90(m,12H),1.28-1.67(m,54H),1.88-2.01(m,7H),2.28-2.56(m,18H),3.16-3.20(m,1H),3.52-3.54(m,2H),4.00-4.10(m,8H)。LCMS:Rt:1.060min；MS m/z(ESI):923.0[M+H]+。
实施例01-3：化合物02-4(即以下方案中的化合物4)的制备。
化合物4
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.86-0.90(m,9H),1.26-1.32(m,34H),1.41-1.49(m,4H),1.61-1.66(m,15H),2.00-2.03(m,1H),2.21-2.38(m,8H),2.43-2.47(m,4H),2.56-2.60(m,2H),3.50-3.54(m,2H),4.03-4.14(m,8H)。LCMS:Rt:1.030min；MS m/z(ESI):798.0[M+H]+。
实施例01-4：化合物02-9(即以下方案中的化合物9)的制备。
化合物9
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.86-0.90(m,12H),1.28-1.30(m,33H),1.58-2.01(m,18H),2.30-2.54(m,18H),3.10-3.19(m,1H),3.52-3.68(m,8H),4.09-4.20(m,8H)。LCMS:Rt:1.677min；MS m/z(ESI):927.7[M+H]+。
使用相应的起始材料以与化合物02-9类似的方式制备以下化合物。
实施例01-5：化合物02-10(即以下方案中的化合物10)的制备。
化合物10
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.86-0.90(m,12H),1.26-1.41(m,48H),1.51-1.72(m,11H),1.94-2.03(m,1H),2.29-2.32(m,6H),2.41-2.91(m,5H),3.51-3.76(m,2H),3.96-4.10(m,6H)。LCMS:Rt:1.327min；MS m/z(ESI):782.6[M+H]+。
使用相应的起始材料以与化合物02-10类似的方式制备以下化合物。
/>
实施例01-6：化合物02-12(即以下方案中的化合物12)的制备。
化合物12
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.86-0.89(m,18H),1.25-1.35(m,53H),1.41-1.48(m,8H),1.56-1.61(m,20H),1.95-2.01(m,2H),2.28-2.35(m,6H),2.43-2.46(m,4H),2.56-2.58(m,2H),3.51-3.54(m,2H),4.00-4.10(m,8H)。LCMS:Rt:0.080min；MS m/z(ESI):1050.8[M+H]+。
实施例01-7：化合物02-20(即以下方案中的化合物20)的制备。
化合物20
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.86-0.90(m,9H),1.25-1.36(m,48H),1.41-1.48(m,5H),1.60-1.62(m,8H),1.97-2.00(m,1H),2.27-2.32(m,6H),2.43-2.46(m,4H),2.56-2.59(m,2H),3.52-3.54(m,2H),4.01-4.10(m,6H)。LCMS：Rt:0.093min；MS m/z(ESI):782.6[M+H]+。
实施例02-1：起始材料和中间体的制备。
化合物A的制备
化合物B的制备
/>
化合物C的制备
化合物D的制备
化合物E的制备
化合物E
1H NMR(400MHz,CDCl3):3.97(d,J＝6Hz,2H),3.58(s,1H),2.73-2.58(m,3H),2.45-2.40(m,1H),2.33-2.29(m,2H),1.66-1.60(m,2H),1.51-1.40(m,2H),1.39-1.34(m,4H),1.26(s,46H),0.90-0.86(m,9H)。LCMS:Rt:1.083min；MS m/z(ESI):568.5[M+H]+。
化合物F的制备
化合物G的制备
化合物H的制备
化合物K的制备
/>
化合物L的制备
SM2的制备：
LCMS:Rt:1.427min；MS m/z(ESI):428.5[M+H]+。
SM4的制备：
LCMS:Rt:1.000min；MS m/z(ESI):442.4[M+H]+。
SM9的制备：
SM10的制备：
化合物SM10-4
LCMS:Rt:0.830min；MS m/z(ESI):481.4[M+H]+。
SM10
LCMS:Rt:0.860min；MS m/z(ESI):499.3[M+H]+。
SM11的制备：
化合物SM11化合物SM11
LCMS:Rt:0.890min；MS m/z(ESI):428.3[M+H]+。
SM的制备：
化合物SM-2
1H NMR(400MHz,CCl3D):3.71(s,6H),1.88-1.84(m,4H),1.59(s,1H),1.25(s,19H),1.14-1.10(m,4H),0.89-0.86(m,6H)。
化合物SM-3
1H NMR(400MHz,CCl3D):0.89-0.86(m,6H),1.25(s,22H),1.45-1.40(m,2H),1.59(s,4H),2.36-2.30(m,1H),3.67(s,3H)。
化合物SM
1H NMR(400MHz,CCl3D):0.90-0.86(m,6H),1.27(s,27H),1.43(s,3H),3.54(d,J＝5.2Hz,2H)。
SM15的制备：
LCMS:Rt:0.900min；MS m/z(ESI):442.3[M+H]+。
SM16的制备：
LCMS:Rt:0.810min；MS m/z(ESI):444.3[M+H]+。
SM18的制备：
LCMS:Rt:0.870min；MS m/z(ESI):526.5[M+H]+。
SM20的制备：
化合物SM20-1
LCMS:Rt:0.950min；MS m/z(ESI):482.4[M+H]+。
化合物SM20
LCMS:Rt:1.330min；MS m/z(ESI):500.3[M+H]+。
SM22的制备：
化合物SM22
1H NMR(400MHz,CCl3D):0.87(t,J＝8Hz,6H),1.22-1.46(m,24H),1.85-1.95(m,2H),2.22-2.34(m,1H)。
SM23的制备：
化合物SM23
LCMS:Rt:0.898min；MS m/z(ESI):400.3[M+H]+。
SM24的制备：
SM26的制备：
SM30的制备：
化合物SM30
LCMS:Rt:1.010min；MS m/z(ESI):402.4[M+H]+。
SM34的制备：
化合物SM34
LCMS:Rt:1.620min；MS m/z(ESI):399.5[M+H]+。
SM38的制备：
SM39的制备：
化合物SM39
LCMS:Rt:0.880min；MS m/z(ESI):400.3[M+H]。
实施例02-2：化合物03-1(即以下方案中的化合物1)的制备。
化合物03-1
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.83-0.93(m,12H),1.04-1.16(m,2H),1.18-1.39(m,60H),1.40-1.55(m,3H),1.56-1.74(m,9H),1.86(s,2H),2.25-2.39(m,5H),2.56(s,3H),2.70(s,3H),3.62(s,2H),3.89-4.04(m,4H)。LCMS:Rt:2.000min；MS m/z(ESI):863.7[M+H]+。
实施例02-3：化合物03-3的制备。
化合物03-3
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.48-0.50(m,4H),0.86-0.90(m,9H),1.26-1.30(m,45H),1.49-1.66(m,11H),1.72-1.77(m,1H),2.28-2.32(m,4H),2.52-2.76(m,10H),3.52-3.58(m,2H),3.96-3.98(m,2H),4.04-4.07(m,2H)。LCMS:Rt:1.250min；MS m/z(ESI):751.6[M+H]+。
使用相应的起始材料以与化合物03-3类似的方式制备以下化合物。
实施例02-4：化合物03-10(即以下方案中的化合物10)的制备。
化合物10-1
LCMS:Rt:0.942min；MS m/z(ESI):428.3[M+H]+。
化合物10-2
LCMS:Rt:0.950min；MS m/z(ESI):482.4[M+H]+。
化合物10-3
LCMS:Rt:1.330min；MS m/z(ESI):500.3[M+H]+。
化合物10
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.86-0.89(m,12H),1.26-1.32(m,61H),1.41-1.65(m,12H),1.85-2.02(m,4H),2.28-2.61(m,14H),3.00-3.12(m,1H),3.53-3.55(m,2H),3.97(d,J＝5.6Hz,4H)。LCMS:Rt:2.520min；MS m/z(ESI):891.7[M+H]+。
实施例02-5：化合物03-11(即以下方案中的化合物11)的制备。
化合物11-A
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.86-0.90(m,6H),1.26-1.32(m,29H),3.00(s,3H),4.11-4.13(m,2H)。
化合物11-1
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.85-0.88(m,6H),1.24-1.29(m,28H),1.82-1.89(m,1H),3.56-3.58(m,2H),7.72-7.72(m,2H),7.83-7.85(m,2H)。
化合物11-2
LCMS:Rt:1.260min；MS m/z(ESI):270.3[M+H]+。
化合物11-4
LCMS:Rt:0.920min；MS m/z(ESI):481.4[M+H]+。
化合物11-5
LCMS:Rt:0.980min；MS m/z(ESI):499.3[M+H]+。
化合物11-6
LCMS:Rt:0.96min；MS m/z(ESI):427.3[M+H]+。
化合物11
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.86-0.90(m,12H),1.26-1.34(m,64H),1.41-1.54(m,6H),1.59-1.77(m,6H),1.99-2.07(m,2H),2.17-2.21(m,4H),2.47-2.71(m,10H),3.15-3.18(m,4H),3.55-3.62(m,2H),5.73-5.84(m,2H)。LCMS:Rt:1.610min；MS m/z(ESI):889.8[M+H]+。
实施例02-6：化合物03-15(即以下方案中的化合物15)的制备。
化合物15
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.86-0.92(m,12H),1.26-1.30(m,67H),1.46-1.72(m,12H),1.98-2.09(m,2H),2.15-2.19(m,2H),2.31-2.71(m,8H),3.16-3.23(m,2H),3.56-3.66(m,2H),3.95-4.03(m,2H),7.30(s,1H)。LCMS:Rt:1.68min；MS m/z(ESI):890.7[M+H]+。
使用相应的起始材料以与化合物03-15类似的方式制备以下化合物。
实施例02-7：化合物03-71(即以下方案中的化合物71)的制备。
化合物71-2
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.72-1.80(m,2H),1.94-2.01(m,2H),3.43(t,J＝6.8Hz,2H),3.50(t,J＝6.2Hz,2H),4.50(s,2H),7.27-7.37(m,5H)。
化合物71-4
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.20-1.24(m,2H),1.36-1.44(m,2H),1.57-1.68(m,2H),1.72-1.75(m,1H),3.33(s,2H),3.45-3.49(m,2H),3.57-3.61(m,2H),3.73-3.76(m,2H),4.49(s,2H),7.27-7.34(m,5H)。
化合物71-5
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.86-0.90(m,6H),1.27-1.29(m,13H),1.36-1.48(m,4H),1.58-1.64(m,9H),1.92-2.02(m,1H),2.29(t,J＝7.6Hz,4H),3.46(t,J＝6.4Hz,2H),4.00-4.10(m,4H),4.49(s,2H),7.28-7.37(m,5H)。
化合物71-6
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.86-0.90(m,6H),1.27-1.39(m,15H),1.41-1.51(m,6H),1.58-1.65(m,6H),1.96-2.05(m,1H),2.30(t,J＝7.6Hz,4H),3.65(t,J＝6.4Hz,2H),4.02-4.11(m,4H)。
化合物71-7
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.86-0.90(m,6H),1.27-1.37(m,14H),1.41-1.46(m,4H),1.53-1.63(m,6H),1.73-1.80(m,2H),1.96-2.03(m,1H),2.30(t,J＝6.2Hz,4H),3.01(s,3H),4.02-4.10(m,4H),4.23(t,J＝6.4Hz,2H)。
化合物71-8
LCMS:Rt:0.830min；MS m/z(ESI):498.4[M+H]+。
化合物71-9
LCMS:Rt:0.870min；MS m/z(ESI):516.3[M+H]+。
化合物71
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.86-0.90(m,12H),1.27-1.50(m,44H),1.57-1.67(m,10H),1.85-2.05(m,6H),2.28-2.36(m,8H),2.45-3.13(m,12H),3.52-3.60(m,2H),4.01-4.10(m,8H)。LCMS:Rt:1.110min；MS m/z(ESI):923.7[M+H]+。
使用相应的起始材料以与化合物03-71类似的方式制备以下化合物。
实施例02-8：化合物03-72(即以下方案中的化合物72)的制备。
化合物03-72
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.81-0.93(m,12H),1.07-1.38(m,62H),1.39-1.57(m,9H),1.58-1.90(m,11H),1.96-2.10(m,3H),2.16-2.26(m,2H),2.42-2.68(m,8H),3.18-3.32(m,2H),3.49-3.61(m,2H),3.99-4.12(m,2H)。LCMS:Rt:1.510min；MS m/z(ESI):904.7[M+H]+。
使用相应的起始材料以与化合物03-72类似的方式制备以下化合物。
实施例02-9：化合物03-99(即以下方案中的化合物190)的制备。
化合物99-3
LCMS:Rt:0.863min；MS m/z(ESI):415.3[M+H]+。
化合物99
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.86-0.90(m,9H),1.23-1.36(m,48H),1.45-1.50(m,7H),1.59-1.67(m,7H),1.78-1.80(m,4H),2.27-2.31(m,2H),2.49-2.60(m,10H),3.18(s,4H),3.54(s,2H),4.03-4.06(m,4H)。LCMS:Rt:1.560min；MS m/z(ESI):808.7[M+H]+。
实施例02-10：化合物03-190(即以下方案中的化合物190)的制备。
化合物190
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.51-0.86(m,12H),1.28-1.39(m,48H),1.60-1.68(m,24H),2.28-2.31(m,8H),2.32-2.69(m,6H),3.96-4.06(m,6H)。LCMS:Rt:1.150min；MS m/z(ESI):893.7[M+H]+。
实施例02-11：化合物03-195(即以下方案中的化合物195)的制备。
化合物195
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.36-0.45(m,4H),0.86-0.90(m,12H),1.26-1.35(m,46H),1.40-1.55(m,8H),0.60-1.77(m,9H),1.97-2.00(m,1H),2.15-2.19(m,2H),2.29-2.32(m,4H),2.43-2.59(m,10H),3.16-3.19(m,2H),3.51-3.54(m,2H),4.00-4.10(m,4H),5.50(s,1H)。LCMS:Rt:0.080min；MS m/z(ESI):892.6[M+H]+。
使用相应的起始材料以与化合物03-195类似的方式制备以下化合物。
实施例02-12：化合物202的制备。
化合物202-1
LCMS:Rt:0.840min；MS m/z(ESI):495.5[M+H]+。
化合物202
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.86-0.90(m,12H),1.26-1.67(m,78H),2.16-2.20(m,2H),2.47-2.59(m,10H),3.16-3.19(m,2H),3.39-3.41(m,2H),3.53-3.57(m,4H),4.44-4.46(m,1H)。LCMS:Rt:1.770min；MS m/z(ESI):878.8[M+H]+。
实施例03-1：起始材料和中间体的制备。
化合物A的制备
化合物B的制备
化合物C的制备
化合物D的制备
化合物E的制备
化合物F的制备
化合物G的制备
化合物G-1
LCMS:Rt:0.824min；MS m/z(ESI):394.3[M+H]+。
化合物G
LCMS:Rt:1.750min；MS m/z(ESI):732.6[M+H]+。
化合物H
化合物I
化合物J
LCMS:Rt:1.070min；MS m/z(ESI):584.4[M+H]+。
化合物K的制备
化合物L的制备
化合物M的制备
化合物N的制备
化合物O的制备
化合物P的制备
化合物Q的制备
化合物Q-1
1H NMR(400MHz,CCl3D):δ:3.70(s,6H),1.88-1.84(m,4H),1.63(s,1H),1.27(s,10H),1.13(s,5H),0.88-0.86(m,6H)。
化合物Q-2
1H NMR(400MHz,CCl3D):δ:3.67(s,3H),2.35-2.31(m,1H),1.61-1.54(m,2H),1.47-1.40(m,2H),1.26(s,16H),0.89-0.86(m,6H)。
化合物Q-3
1H NMR(400MHz,CCl3D):δ:3.54(d,J＝5.2Hz,2H),1.47-1.43(m,2H),1.28(s,20H),0.90-0.87(m,6H)。
化合物SM2的制备
化合物R的制备
化合物S的制备
化合物SM5的制备
化合物SM6的制备
实施例03-2：化合物04-1(即以下方案中的化合物1)的制备。
化合物1-1
LCMS:Rt:0.750min；MS m/z(ESI):206.2[M+H]+。
化合物1-2
LCMS:Rt:0.870min；MS m/z(ESI):448.3[M+H]+。
化合物1-3
LCMS:Rt:1.360min；MS m/z(ESI):616.5[M+H]+。
化合物1
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.79-0.83(m,6H),1.14-1.26(m,38H),1.47-1.61(m,6H),1.86-1.96(m,4H),2.51-2.58(m,4H),3.17(s,1H),3.32-3.44(m,5H),3.51-3.66(m,3H)。LCMS:Rt:0.94min；MS m/z(ESI):526.5[M+H]+。
实施例03-3：化合物04-2(即以下方案中的化合物2)的制备。
化合物2-1
LCMS:Rt:1.340min；MS m/z(ESI):630.5[M+H]+。
化合物2
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.86-0.90(m,6H),1.25-1.33(m,35H),1.50-1.69(m,7H),1.87-1.99(m,1H),2.00-2.08(m,2H),2.33(t,J＝7.6Hz,2H),2.56-2.81(m,4H),3.17-3.27(m,1H),3.38-3.48(m,3H),3.50-3.65(m,3H),5.08-5.14(m,1H)。LCMS:Rt:1.180min；MS m/z(ESI):540.4[M+H]+。
实施例03-4：化合物04-7(即以下方案中的化合物7)的制备。
化合物7-1
LCMS:Rt:0.780min；MS m/z(ESI):427.4[M+H]+。
化合物7
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.86-0.90(m,9H),1.26-1.35(m,45H),1.41-1.67(m,7H),2.28-2.32(m,3H),2.36-2.70(m,11H),2.79-2.83(m,2H),3.35-3.46(m,4H),3.77-3.85(m,1H),3.96-3.97(m,2H)。LCMS:Rt:1.220min；MS m/z(ESI):669.6[M+H]+。
实施例03-5：化合物04-8(即以下方案中的化合物8)的制备。
化合物8-1
LCMS:Rt:0.730min；MS m/z(ESI):371.3[M+H]+。
步骤2：化合物8的制备
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.86-0.90(m,9H),1.25-1.27(m,47H),1.40-1.49(m,4H),1.56-1.73(m,8H),2.30(t,J＝7.6Hz,3H),2.40-2.82(m,10H),3.32-3.38(m,1H),3.43-3.46(m,3H),3.70-3.80(m,1H),3.92-3.97(m,2H)。LCMS:Rt:1.090min；MS m/z(ESI):709.6[M+H]+。
实施例03-6：化合物04-65(即以下方案中的化合物65)的制备。
化合物65
1H NMR(400MHz,CCl3D):δ:0.79-0.83(m,12H),1.23-1.27(m,62H),1.29-1.37(m,2H),1.51-1.61(m,2H),1.76-1.93(m,7H),2.13-2.16(m,4H),2.17-2.25(m,3H),2.41-2.51(m,7H),3.05-3.06(m,1H),3.52-3.54(m.2H),3.92-4.03(m,4H)。LCMS:Rt:0.588min；MS m/z(ESI):863.6[M+H]+。
使用相应的起始材料以与化合物04-65类似的方式制备以下化合物。
/>
施例03-7：化合物04-68(即以下方案中的化合物68)的制备。
化合物68-2
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.86-0.90(m,12H),1.26-1.46(m,53H),1.56-1.62(m,2H),1.83(s,2H),1.96-2.02(m,1H),2.23-2.24(m,4H),3.64(s,2H),4.02-4.11(m,4H)。
化合物68
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.83-0.92(m,12H),1.17-1.37(m,56H),1.38-1.45(m,2H),1.64-1.67(m,2H),1.70-1.86(m,6H),1.92-2.04(m,2H),2.19-2.26(m,4H),2.40-2.49(m,3H),2.57-2.65(m,2H),3.41-3.51(m,2H),3.97-4.12(m,4H)。LCMS:Rt:0.080min；MS m/z(ESI):778.5[M+H]+。
实施例03-8：化合物04-69(即以下方案中的化合物69)的制备。
化合物69-1
LCMS:Rt:1.290min；MS m/z(ESI):750.7[M+H]+。
化合物69
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.83-0.92(m,12H),0.98-1.06(m,3H),1.17-1.47(m,52H),1.54-1.72(m,5H),1.78-2.06(m,8H),2.20-2.27(m,4H),2.37-2.46(m,4H),2.49-2.66(m,5H),3.01-3.12(m,1H),3.52-3.59(m,2H),3.98-4.11(m,4H)。LCMS:Rt:0.093min；MS m/z(ESI):821.6[M+H]+。
使用相应的起始材料以与化合物04-69类似的方式制备以下化合物。
实施例04：脂质纳米颗粒的制备和表征
简言之，将阳离子脂质(化合物01-1、化合物03-15、化合物03-23、化合物03-17、化合物03-99)、DSPC、胆固醇和PEG-脂质以如本文所述的摩尔比溶解在乙醇中，并将mRNA稀释在10-50mM柠檬酸盐缓冲液(pH＝4)中。可替代地，将本文提供的阳离子脂质、DSPC、胆固醇和聚合物结合的脂质以如本文所述的摩尔比溶解在乙醇中，并将mRNA稀释在10-50mM柠檬酸盐缓冲液(pH＝4)中。通过使用总流速在9-30mL/min范围内的微流体装置将乙醇脂质溶液与mRNA水溶液以1:3的体积比混合，以大约10:1至30:1的总脂质与mRNA重量比制备LNP。使用透析移除乙醇且以DPBS替代。最后，将脂质纳米颗粒通过0.2μm无菌过滤器过滤。
通过动态光散射，使用Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern UK)，使用173°反向散射检测模式测定脂质纳米颗粒大小。使用Quant-it Ribogreen RNA定量分析试剂盒(Thermo Fisher Scientific,UK)，根据制造商的说明书，测定脂质纳米颗粒的包封效率。
如文献中所报道，LNP制剂的表观pKa与在体内LNP对于核酸的递送效率相关。使用基于2-(对甲苯氨基)-6-萘磺酸(TNS)的荧光的分析来测定各制剂的表观pKa。如上文所述，制备出在PBS中包含阳离子脂质/DSPC/胆固醇/DMG-PEG的LNP制剂。将TNS制备为在蒸馏水中的300uM储备溶液。将LNP制剂在3mL的含有50mM柠檬酸钠、50mM磷酸钠、50mM硼酸钠和30mM氯化钠的缓冲溶液(其中pH在3至9的范围内)中稀释至0.1mg/ml总脂质。添加TNS溶液的等分试样以得到0.1mg/ml的最终浓度，并且在涡旋混合后，在室温下在MolecularDevices Spectramax iD3光谱仪中使用325nm的激发波长和435nm的发射波长来测量荧光强度。将S形曲线最佳拟合分析应用于荧光数据，并将pKa值测量为产生半数最大荧光强度的pH值。
实施例B1：mRNA合成和纯化。
DNA线性化。将含有编码RV G蛋白(例如，SEQ ID NO:1-3)以及信号肽(例如，SEQID NO:4-6)、5’-UTR(例如，SEQ ID NO:24-33)、3’-UTR(例如，SEQ ID NO:34-39)和polyA信号的标靶序列的IVT质粒pJ241(内部构建的，含有卡那霉素(kanamycin)抗性基因、T7启动子序列、poly(A)标记和在poly(A)序列下游的独特IIS型限制位点)使用IIS型限制酶消化进行线性化(构建体的全长显示在表5中)。将每10μg质粒与10U的Esp3I/BsmBI混合，在37℃下孵育4小时以确保完全线性化。通过添加1/10体积的3M乙酸钠(pH 5.5)和2.5倍体积的乙醇终止反应，充分混合并在-20℃冷却1小时。将线性化的DNA通过在4℃下以13800g离心15分钟沉淀，用70％乙醇洗涤两次，重悬于无核酸酶H2O中。
mRNA的体外转录。下表中示出典型20μL反应混合物的内容物：
将反应混合物在37℃下孵育6小时，然后添加1μl DNA酶I(无RNA酶，1U/μL)以除去DNA模板，在37℃下孵育30分钟。将合成的RNA通过添加0.5体积的7.5M LiCl、50mM EDTA并在-20℃下孵育45分钟，然后在4℃下以13800g离心15分钟以沉淀mRNA来进行纯化。然后除去上清液，并将沉淀物用500μL的冰冷70％乙醇冲洗两次，将mRNA重悬于无核酸酶H2O中，将浓度调节至1mg/mL，并在-20℃下储存。
mRNA加帽。将每10μg未加帽的mRNA在65℃下加热10分钟，在冰上放置5分钟，然后与10U牛痘病毒加帽酶、50U mRNA帽2’-O-甲基转移酶、0.2mM SAM、0.5mM GTP和1U RNA酶抑制剂混合，并在37℃下孵育60分钟以生成帽1修饰结构。如前所述将经修饰的mRNA通过LiCl沉淀，并将RNA重悬于无核酸酶H2O中，并在-20℃下储存。
HPLC纯化。使用C4柱(5μm)(10mm×250mm柱)，通过高效液相色谱(HPLC)纯化RNA。缓冲液A含有0.1M乙酸三乙铵(TEAA)(pH＝7.0)，并且缓冲液B含有0.1M TEAA(pH＝7.0)和25％乙腈。
如所预期，mRNA分子通过上述体外转录和成熟过程成功地产生，并使用HPLC从反应体系中纯化。
实施例B2：体外转染和抗原表达分析。
将实施例B1中产生的编码RV G蛋白的不同mRNA分子(表5所示的构建体1、构建体2、构建体3、构建体4、构建体5、构建体6)转染到表达细胞系诸如HEK293T培养细胞中，以评估mRNA分子的体外表达效率。
将HEK293T(ATCC)细胞以1×106个细胞/孔在6孔透明TC处理的板(Corning，#3516)中接种于含有10％FBS(Gibco#12576029)的3mL新鲜DMEMTM培养基(Thermo#10567014)中，并在37℃下在5％CO2中培养12小时。根据手册说明，使用2000(Thermo fisher，#11668019)将3μg/孔的靶mRNA转染至HEK 293T细胞中，同时转染阳性对照mRNA(gfp)(GenBank：MK387175.1)。转染后18小时收获细胞，然后在4℃下以200g离心5分钟。使用两种不同的第一抗体以所指示稀释度对细胞进行染色(1，抗RABV G蛋白小鼠mAb，#DMABT-Z59957，Creative Diagnostics；2，抗RABV G蛋白小鼠mAb，#Ab02097-3.0，Absolute antibody)，并在4℃下孵育0.5小时。然后用含1％FBS的PBS(180μL x 2)洗涤细胞，然后与第二抗体(100μL，1:1000，抗小鼠IgG(H+L)第二抗体，PE，#PA1-84395，Invitrogen)一起在4℃下孵育0.5小时。使用上述缓冲液(180μL x 2)洗涤后，将细胞重悬于200μL含1％FBS的PBS中。使用BD FortessaTM流式细胞仪(BD Biosciences)(FACS)采集样品，并使用Flowjo软件v10.6.2(BD Biosciences)进行分析。
如图1A和图1B所示，除构建体4外，所有mRNA构建体均诱导HEK293T细胞表面上的标靶表达。构建体3诱导候选物中的最高表达。在图1中，质粒是阳性对照mRNA(gfp)，Lipo是2000(Thermo fisher，#11668019)，空白是DMEMTM培养基(Thermo#10567014)。
如图1B所示，与其亲本构建体：构建体1和构建体2相比，包含较短poly-A尾(110nt)的这些mRNA构建体5和构建体6分别诱导了更高表达。
实施例B3.含mRNA的LNP的制备
根据以上实施例04中提供的程序制备含mRNA的LNP，其中脂质根据以上实施例01至03中提供的程序制备，并且mRNA根据以上实施例B1中提供的程序制备。
实施例B4.用含mRNA的LNP疫苗接种的小鼠中抗体和细胞因子的产生
动物免疫
在第0天、第14天使用2μg或10μg用不同脂质包封的mRNA疫苗对多组6-8周龄雌性BALB/c小鼠(每组10只小鼠)进行肌内(i.m.)免疫。在第0天、第14天注射0.1人用剂量的市售灭活疫苗(HDCVTMKangH(Kangh,Chengdu))作为对照。在初始免疫后14天(疫苗接种前)、28天和45天收集血清样品，并在第45天从每组5只小鼠制备脾细胞，用于使用酶联免疫斑点测定(Elispot测定)分析T细胞反应。
G蛋白特异性IgG滴度的ELISA
将平底、高结合、96孔板(#3590，Corning)用PBS中1μg/ml的G ecto蛋白(由SinoBiological定制)包被至100μL/孔的体积。将板在4℃下储存过夜。用200μL/孔含0.1％Tween 20的PBS(PBS-T)洗涤板5次，然后在37℃下与100μL封闭缓冲液(含5％脱脂乳的PBS-T)一起孵育1小时。将2倍系列稀释的灭活血清样品添加至板中(100μl/孔)，并且向最后一列添加阴性对照血清。将板在37℃下孵育1小时，并用PBS-T洗涤5次。然后以1:10000的稀释度将第二抗体(过氧化物酶结合的山羊抗小鼠IgG；#715-035-151，Jackson)添加至每个孔中，达到最终体积100μL，然后在37℃下孵育1小时。然后用PBS-T洗涤板5次。添加50μl显色溶液(TMB，#PR1200，Solarbio)，并在5分钟后用50μl终止溶液(2M H2SO4)淬灭。在SynergyH1混合多模式微板读取仪(BioTek)上在450/620nm下读取板。终点截断值是0.1。选择检测结果为阳性的最大稀释因子。滴度结果是阳性最大稀释因子的OD值/0.1*相应稀释因子。
对于抗原特异性IgG滴度，来自免疫小鼠的血清在第一次免疫后14天显示稳健滴度，如图2所示。在加强免疫后，滴度与第14天的滴度相比急剧增加，如图3和图4所示。
中和滴度测定
血清中的抗狂犬病病毒中和滴度(VNT)通过WHO19推荐的快速荧光焦点抑制试验(RFFIT)进行分析。简言之，在8孔板中以100μL体积以3倍系列稀释对热灭活血清进行一式四份测试，并以100μL向每个孔中添加50FFD50/0.1mL的CVS。添加培养基而非血清作为阴性对照，并如上所述稀释标准阳性血清(WHO)并添加至指定孔中。将混合物在37℃下孵育1.5小时。随后，以1×105个细胞/孔接种100μL胰蛋白酶化BHK-21细胞，然后在37℃和5％CO2下孵育20-24小时。然后丢弃上清液，并用80％丙酮在室温下固定细胞30分钟。丢弃丙酮，并将细胞用FITC结合的抗狂犬病N蛋白在37℃下染色1小时。使用200μL/孔PBS洗涤板两次。然后将一滴80％甘油添加至每个孔中。在倒置荧光显微镜下计数每孔20个显微镜视野中的阳性显微镜视野数目(即，含有一个或多个被感染细胞)，并计算阳性视野百分比(即，感染性)。使用以下Reed-Meunch式计算测试血清的50％终点滴度：
当测试血清中抗体的滴度以IU/mL表示时，所述滴度可通过与已知IU/mL值的参考血清(标准品)的滴度进行比较来获得。通常，将参考血清稀释至2IU/mL，并与测试血清并行测试。测试血清中抗体的滴度(IU/mL)可通过下式计算：
如图5所示，与灭活疫苗相比，这些含mRNA的LNP在初次免疫后第45天可诱导显著较高水平的针对狂犬病病毒的中和抗体。
如图6A所示，4组小鼠用构建体5加Lip1-1进行疫苗接种，分别向所述小鼠注射5μg、2μg、0.5μg和0.1μg剂量的mRNA。与灭活疫苗免疫的小鼠相比，用不同剂量的构建体5加Lip1-1免疫的这些小鼠在所述时间点表现出较高水平的针对狂犬病病毒的中和抗体。
如图6B所示，4组小鼠用构建体6加Lip1-1进行疫苗接种，分别向所述小鼠注射5μg、2μg、0.5μg和0.1μg剂量的mRNA。与灭活疫苗免疫的小鼠相比，用5μg、2μg和0.5μg剂量的构建体6加Lip1-1免疫的这些小鼠在所述时间点表现出较高水平的针对狂犬病病毒的中和抗体。
T细胞反应
酶联免疫斑点(ELISPOT)测定如所描述进行，进行了微小修改20。简言之，将预包被板(对于IFN-γ，MabTech#3321-4HST-2；对于IL-4，MabTech#3311-4APW-2；对于IL-6，MabTech#3361-4APW-2；对于IL-2，MabTech#3441-4APW-2)使用含有10％FBS的RPMI 1640(#22400-089Gibco)封闭，并在37℃下孵育30分钟。然后将来自免疫小鼠的脾细胞以300,000个细胞/孔铺板，用G蛋白的肽库(每种肽2μg/mL，Genscript)、作为阳性对照的伴刀豆球蛋白A(#C2010,Sigma)或作为阴性对照的RPMI 1640培养基进行刺激。在37℃、5％CO2下孵育36小时后，用200μL/孔PBS洗涤板，并向各孔中添加生物素化抗小鼠IFN-γ、IL-2、IL-4或IL-6抗体，然后在室温下孵育2小时。添加100μL AEC底物溶液(MabTech#3311-4APW-2)后，使用自动化ELISPOT读取仪AID ELISPOT(AID)读取风干板。计算并显示每1,000,000个细胞的斑点形成细胞(SFC)数量。
如图7A-图7F所示，所述构建体可诱导稳健的Th1偏向性细胞反应。
实施例B5.小鼠中含mRNA的LNP的攻毒研究
在第0天，分别用含mRNA的LNP和灭活疫苗对多组6-8周龄雌性BALB/c小鼠(每组10只小鼠)进行免疫。14天后，再次用含mRNA的LNP对这些组的小鼠进行免疫。初次免疫后第21天，所有小鼠通过大脑内注射感染100×LD50狂犬病病毒CVS强毒株。感染后，连续观察所有小鼠21天，记录小鼠的死亡事件和神经学体征，神经学体征明显的这些小鼠也被视为死亡事件。
如图8所示，与用灭活疫苗(Vero细胞，Chengda Sucheng(Chengda Bio,Liaoning))免疫的小鼠相比，用构建体5和构建体6免疫的这些组小鼠表现出更高的存活率。
实施例B6.在小鼠中用含mRNA的LNP疫苗接种后抗体反应的持续时间
在第0天、第14天使用2μg或0.5μg用不同脂质包封的mRNA疫苗对多组6-8周龄雌性BALB/c小鼠(每组10只小鼠)进行肌内(i.m.)免疫。在第0天、第14天注射0.1人用剂量的市售灭活疫苗(HDCVTMKangH(Kangh,Chengdu))作为对照。在初次免疫后13天(疫苗接种前)、21天、35天、91天和175天收集血清样品。通过ELISA分析所有血清样品的G蛋白特异性IgG滴度和中和滴度测定。
与灭活疫苗相比，在相同时间点，含mRNA的LNP可在小鼠中诱导较高水平的抗体。如图9A和图9B所示，与用灭活疫苗免疫的小鼠相比，用含mRNA的LNP免疫的小鼠中抗体的持续时间更长。
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Claims (50)

1.一种非天然存在的核酸，所述非天然存在的核酸包含编码狂犬病病毒(RV)的糖蛋白(G)或其片段的编码核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的非天然存在的核酸，其中所述G蛋白由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：与SEQ ID NO:1-3中任一个中所列的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的非天然存在的核酸，其中所述编码核苷酸序列由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：与SEQ ID NO:7-10中任一个中所列的核苷酸序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
4.如权利要求1所述的非天然存在的核酸，其中所述编码核苷酸序列已进行了密码子优化以在受试者细胞中表达。
5.如权利要求4所述的非天然存在的核酸，其中所述受试者是非人哺乳动物；优选地，所述非人哺乳动物是犬科动物，或人。
6.如权利要求1至5中任一项所述的非天然存在的核酸，其中所述G蛋白或片段与天然信号肽融合；优选地，所述天然信号肽包含SEQ ID NO:4-6中任一个中所列的氨基酸序列。
7.如权利要求1至5中任一项所述的非天然存在的核酸，其中所述G蛋白或片段与异源多肽融合。
8.如权利要求7所述的非天然存在的核酸，其中所述异源多肽选自人免疫球蛋白的Fc区、信号肽和促进所述融合蛋白多聚化的肽。
9.如权利要求8所述的非天然存在的核酸，其中所述信号肽是来自IgE的信号肽；优选地，来自IgE的所述信号肽包含SEQ ID NO:14中所列的氨基酸序列。
10.如权利要求1至9中任一项所述的非天然存在的核酸，所述非天然存在的核酸还包含5’非翻译区(5’-UTR)，其中所述5’-UTR包含SEQ ID NO:24-33中任一个中所列的序列。
11.如权利要求1至10中任一项所述的非天然存在的核酸，所述非天然存在的核酸还包含3’非翻译区(3’-UTR)，其中所述3’-UTR包含SEQ ID NO:34-39中任一个中所列的序列。
12.如权利要求11所述的非天然存在的核酸，其中所述3’-UTR还包含poly-A尾或聚腺苷酸化信号。
13.如权利要求12所述的非天然存在的核酸，其中所述核酸由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：与SEQ ID NO:16-19中任一个中所列的核苷酸序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列；优选地，所述核酸的所述poly-A尾被截短至110nt。
14.如权利要求1至13中任一项所述的非天然存在的核酸，所述非天然存在的核酸包含选自假尿苷、1-甲基-假尿苷和5-甲基胞嘧啶的一种或多种功能性核苷酸类似物。
15.如权利要求1至14中任一项所述的非天然存在的核酸，其中所述核酸是DNA或mRNA。
16.一种载体，所述载体包含如权利要求1至15中任一项所述的非天然存在的核酸；优选地，所述载体是IVT质粒。
17.一种细胞，所述细胞包含如权利要求1至15中任一项所述的非天然存在的核酸。
18.一种细胞，所述细胞包含如权利要求16所述的载体。
19.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1至15中任一项所述的非天然存在的核酸和至少第一脂质。
20.如权利要求19所述的组合物，其中所述第一脂质是根据式01-I或式01-II的化合物；或表01-1中所列的化合物；或根据式02-I的化合物；或表02-1中所列的化合物；或根据式03-I的化合物；或表03-1中所列的化合物；或根据式04-I的化合物；或表04-1中所列的化合物。
21.如权利要求19或20所述的组合物，所述组合物还包含第二脂质。
22.如权利要求21所述的组合物，其中所述第二脂质是根据式05-I的化合物。
23.如权利要求19至22中任一项所述的组合物，所述组合物被配制为将所述核酸包封在脂质壳中的脂质纳米颗粒。
24.如权利要求19至23中任一项所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。
25.如权利要求19至23中任一项所述的组合物，其中所述组合物是疫苗。
26.一种用于控制、预防或治疗受试者中由RV或由感染RV引起的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1至15中任一项所述的非天然存在的核酸或如权利要求19至25中任一项所述的组合物。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述受试者是人或非人哺乳动物；优选地，所述非人哺乳动物是犬科动物。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述受试者是人类成人、人类儿童或人类幼儿。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述受试者是老年人。
30.如权利要求26至29中任一项所述的方法，其中所述受试者患有所述疾病或病症。
31.如权利要求26至29中任一项所述的方法，其中所述受试者处于RV感染的风险中或对RV感染易感。
32.如权利要求26至29中任一项所述的方法，其中所述受试者已被诊断为RV感染阳性。
33.如权利要求26至32中任一项所述的方法，其中所述受试者是无症状的。
34.如权利要求26至33中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用包封所述核酸的脂质纳米颗粒，并且其中所述脂质纳米颗粒被所述受试者中的细胞内吞。
35.如权利要求26至34中任一项所述的方法，其中所述核酸由所述受试者中的细胞表达。
36.如权利要求26至35中任一项所述的方法，其中在所述受试者中引发针对所述RV的免疫反应。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述免疫反应包括在淋巴细胞中产生细胞因子。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述淋巴细胞是CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。
39.如权利要求37或38所述的方法，其中所述细胞因子是IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6中的一种或多种。
40.如权利要求37至39中任一项所述的方法，其中表达细胞因子的淋巴细胞的比例增加。
41.如权利要求37至40中任一项所述的方法，其中淋巴细胞中细胞因子的产生增加。
42.如权利要求36至41中任一项所述的方法，其中所述免疫反应包括产生与由所述核酸编码的病毒G蛋白特异性结合的抗体。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述抗体是针对RV或被RV感染的细胞的中和抗体。
44.如权利要求42或43所述的方法，其中在所述受试者中所述抗体的血清滴度增加。
45.如权利要求42至44中任一项所述的方法，其中所述抗体结合至病毒颗粒或被感染的细胞，并且标记被感染细胞的病毒颗粒，以被所述受试者的免疫系统破坏。
46.如权利要求42至45中任一项所述的方法，其中诱导或增强由所述抗体结合的病毒颗粒的内吞作用。
47.如权利要求42至46中任一项所述的方法，其中诱导或增强所述受试者中针对被感染细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
48.如权利要求42至47中任一项所述的方法，其中诱导或增强所述受试者中针对被感染细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。
49.如权利要求42至48中任一项所述的方法，其中诱导或增强所述受试者中针对被感染细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)。
50.如权利要求26至49中任一项所述的方法，其中由RV引起的所述疾病或病症是狂犬病。
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