CN110437318A

CN110437318A - 免疫马生产抗狂犬病毒抗体用的抗原及其制备方法和应用

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Publication number: CN110437318A
Application number: CN201910529261.5A
Authority: CN
Inventors: 史小月; 范铁炯; 孙九如; 柏伟
Original assignee: Shanghai Sailun Biotechnology Ltd By Share Ltd
Current assignee: Shanghai Sailun Biotechnology Ltd By Share Ltd
Priority date: 2019-06-19
Filing date: 2019-06-19
Publication date: 2019-11-12

Abstract

本发明公开了一种免疫马生产抗狂犬病毒抗体用的抗原，含有编码狂犬病毒糖蛋白G‑protein/pcDNA3.1（简称：G‑protein/pcDNA3.1）的DNA；所述G‑protein/pcDNA3.1是一种重组的DNA质粒，该质粒能在哺乳动物细胞内产生狂犬病毒糖蛋白G‑protein。此外，本发明还公开了该免疫马生产抗狂犬病毒抗体用的抗原的制备方法及在制备抗狂犬病毒糖蛋白抗体中的应用。经实验验证，证明本发明用G‑protein/pcDNA3.1质粒可以代替狂犬疫苗免疫马匹制备抗狂犬血清，获得的产品无抗人血清白蛋白抗体，抗血清的纯度优于狂犬疫苗免疫马匹所得到的抗血清。

Description

免疫马生产抗狂犬病毒抗体用的抗原及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，涉及一种免疫马生产抗狂犬病毒抗体用的抗原；此外还涉及该抗原的制备方法和应用。

背景技术

狂犬病（Rabies）是狂犬病病毒（Rabies virus, RABV）引起的人和所有温血动物的急性致死性中枢神经系统（CNS）的自然疫源性疾病。本病呈全球性分布，自然贮存宿主主要是以犬以及狼、狐、浣熊和蝙蝠等野生动物，人多因被患病动物咬伤而感染，同种和异种动物之间除通过咬伤传播以外，还可以通过吸入、食入或垂直传播等方式传播。人狂犬病的临床特征是恐水、怕风。咽肌痉挛和进行性麻痹等，患者几乎100%死亡。狂犬病是全球性的严重公共卫生问题。WHO资料显示， 80%以上的病例发生于亚洲、非洲和南美，尤以亚洲为最。我国是狂犬病严重流行国家之一，几乎所有的省、市、自治区都曾有发生或流行，东部和南部诸省最严重，加强狂犬病的研究和防治是十分迫切而又任重道远的。

我国狂犬病主要是由犬、猫等动物抓、咬伤引起。根据WHO对于狂犬病防治的指导原则，被疑似患病动物抓、咬伤后，立即或尽早进行暴露处理。伤口处理后应立即或尽早局部浸润注射抗狂犬病免疫球蛋白同时还需注射狂犬疫苗。注射后24小时内，被动免疫抗体即出现于血液中，使机体获得保护。抗狂犬病免疫球蛋白是用人用狂犬疫苗免疫马匹后，采血加工制备而成。例如，中国发明专利申请200910000966.4涉及一种用于治疗、预防狂犬病的高纯度马抗狂犬病抗体F(ab’)2片段的制备和纯化的方法，该方法使用狂犬病毒疫苗免疫马匹后，采血加工制备而成。但是采用狂犬病毒疫苗免疫马匹制得的抗狂犬病免疫球蛋白，由于人用狂犬疫苗在制备过程中添加人血清白蛋白，用之免疫马匹，马匹产生高滴度抗人血清白蛋白抗体，因而使抗血清成品中含有一定量的抗血清白蛋白抗体，注射后容易产生致敏，过敏反应的几率非常高。

因此，本领域亟需研发一种新的抗原来替代狂犬病毒疫苗，以克服上述缺陷。

发明内容

本发明的要解决的技术问题之一在于提供一种免疫马生产抗狂犬病毒抗体用的抗原。

本发明的要解决的技术问题之二在于提供一种所述的免疫马生产抗狂犬病毒抗体用的抗原的制备方法。

本发明的要解决的技术问题之三在于提供所述的免疫马生产抗狂犬病毒抗体用的抗原在制备抗狂犬病毒糖蛋白抗体中的应用，即用DNA免疫马匹获得抗狂犬病毒抗体的方法。

本发明用DNA疫苗替代狂犬病毒疫苗免疫马匹，期望能获得不含抗人体血液成分的抗狂犬病毒抗体。

在本发明的第一方面，提供一种免疫马生产抗狂犬病毒抗体用的抗原，含有编码狂犬病毒糖蛋白G-protein/pcDNA3.1（简称：G-protein/pcDNA3.1）的DNA；所述G-protein/pcDNA3.1是一种重组的DNA质粒，该质粒能在哺乳动物细胞内产生狂犬病毒糖蛋白G-protein。

作为本发明优选的技术方案，所述的编码G-protein/pcDNA3.1的DNA序列根据哺乳动物对密码子的偏好进行优化，优化的狂犬病毒糖蛋白G-protein的核苷酸序列如SEQID No.2所示。

作为本发明优选的技术方案，所述G-protein/pcDNA3.1为一种DNA水溶液注射液，所述免疫马生产抗狂犬病毒抗体用的抗原是用注射方法用于马匹的免疫抗原。

作为本发明优选的技术方案，每个免疫剂量含有G-protein/pcDNA3.1 DNA量为20-200微克；每匹马每次注射一个剂量的，其体积为1毫升；每45天注射一次，注射部位为马的颈部或臀部，注射于皮下或肌肉内；使用周期为3个月。

在本发明的第二方面，提供一种所述的免疫马生产抗狂犬病毒抗体用的抗原的制备方法，包括如下步骤：

步骤1，根据哺乳动物偏好对狂犬病毒糖蛋白序列进行密码子优化；按哺乳动物细胞密码子偏好性优化狂犬病毒糖蛋白（G-protein）（完整基因序列见Tordo N, Poch O, ErmineA, Keith G, Rougeon F.；Walking along the rabies genome: is the large G-Lintergenic region a remnant geneProc Natl Acad Sci U S A. 1986 Jun;83(11):3914-8.），其目的是使G-protein在哺乳动物细胞内的表达最佳化。

步骤2，人工合成G-protein基因，在起始密码子ATG前引入Kozak序列GCCGCCACC，5’-末端引入Hind III，3’-末端引入EcoRI限制性酶切位点，克隆入pBluescript质粒HindIII和EcoRI之间；重组成G-protein/pBluescript质粒；

步骤3， G-protein/pBluescript质粒用Hind III和EcoRI酶切，获得G-protein基因DNA,将此DNA克隆入pcDNA3.1质粒Hind III和EcoRI之间，重组成G-protein/ pcDNA3.1；

步骤4，参照分子克隆实验指南（Molecular Cloning: A Laboratory Manual），用SDS碱裂解法大量制备G-protein/pcDNA3.1质粒DNA；

步骤5，用TE缓冲液将G-protein/pcDNA3.1质粒DNA配制成100微克/毫升浓度备用。

作为本发明优选的技术方案，步骤1中，所述密码子优化后的狂犬病毒糖蛋白序列如SEQ ID No.2所示。

作为本发明优选的技术方案，步骤2中，所述在起始密码子ATG前引入Kozak序列GCCGCCACC，5’-末端引入Hind III，3’-末端引入EcoRI限制性酶切位点，引入后的完整序列如SEQ ID No.3所示。

在本发明的第三方面，提供一种所述的免疫马生产抗狂犬病毒抗体用的抗原在制备抗狂犬病毒糖蛋白抗体中的应用。

作为本发明优选的技术方案，所述制备抗狂犬病毒糖蛋白抗体的方法为用DNA免疫马匹获得抗狂犬病毒抗体的方法，包括如下步骤：

第一步，采用注射方法将所述抗原注射到马匹臀部肌肉，每匹每次注射100微克G-protein/pcDNA3.1质粒DNA，每45天注射一次，共注射三次；

第二步，第三次注射后第十天颈静脉采血，每匹马采100毫升血液；采得的血液37゜C孵育1小时，4゜C放置过夜，离心取血清备用；

第三步，血清混合后用胃蛋白酶消化，硫酸铵沉淀，超滤除盐并浓缩，制备成抗狂犬病毒糖蛋白抗体。

狂犬病病毒基因组3’至5’端依次排列着N、NS、M、G、L 5个结构基因，分别编码核蛋白（NP）。磷蛋白（PP）、基质蛋白（MP）、糖蛋白（GP）和大蛋白（LP）。

糖蛋白（GP）前体由524 个氨基酸组成,分为信号肽、膜外区、跨膜区和膜内区4 个区,转译后在内质网经过糖基化修饰,并被切去N 端信号肽后成为成熟的糖蛋白,全长505个氨基酸,相对分子质量( Mr) 67 ×103 。糖蛋白以同源三聚体形式存在,形成镶嵌于病毒囊膜表面。糖蛋白是狂犬病病毒唯一的表面蛋白,可结合细胞受体,介导病毒侵入,决定病毒的致病性和组织嗜性。糖蛋白识别的受体包括烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR) 、神经细胞黏附因子(NCAM) 或p75 神经营养因子受体(p75NTR) 等。这些蛋白均存在于神经细胞表面,因此狂犬病病毒具有神经嗜性,可以在肌肉2神经及神经元之间传播。缺失G基因的狂犬病病毒不能经突触传播。被感染的细胞中产生的糖蛋白分布到细胞表面,还可能导致离子通道紊乱,从而影响神经电生理并进一步导致神经功能性损伤。神经嗜性、神经侵袭性及神经功能损伤不但是狂犬病病毒感染的显著特征,也是病毒引起病理变化的基础。糖蛋白还是狂犬病病毒的主要保护性抗原,是病毒毒力的分子基础。它识别宿主细胞表面受体，是病毒入侵敏感机体的重要分子基础。既刺激细胞免疫又诱生抗体，抗糖蛋白抗体具有抑制病毒侵袭细胞的作用，能中和狂犬病毒的毒力。

DNA疫苗是指将含有编码某种抗原蛋白的外源基因与质粒重组后直接导入动物细胞内，并通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原的免疫应答，生成细胞和/或体液免疫反应。DNA疫苗经注射途径接种体内后，DNA被体细胞摄取，编码外源基因的DNA被细胞转录翻译表达，然后通过不同的途径刺激机体产生免疫应答。由于DNA疫苗不含有杂蛋白，因此产生的抗体纯度非常高。

用于DNA疫苗的质粒载体必须能在哺乳动物细胞内高效表达，但不能复制，且不含有能与宿主细胞基因组整合的序列。Invitrogen公司生产的 pcDNA3.1含有巨细胞病毒(CMV)的启动子，该启动子是一种组成型强启动子，能进入哺乳动物细胞内，在细胞内能调控与之重组基因高表达。该质粒不含有能与宿主细胞基因组整合的序列，因此使用非常安全。本研究系将含有狂犬病毒糖蛋白基因的 pcDNA3.1质粒注射马匹，期望在马匹中表达狂犬病毒糖蛋白，马匹的免疫系统对狂犬病毒糖蛋白起免疫反应，产生抗狂犬病毒糖蛋白抗体。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明用DNA疫苗替代狂犬病毒疫苗免疫马匹，期望能获得不含抗人体血液成分的抗狂犬病毒抗体。经实验验证，证明本发明用G-protein/pcDNA3.1质粒可以代替狂犬疫苗免疫马匹制备抗狂犬血清，获得的产品无抗人血清白蛋白抗体，抗血清的纯度优于狂犬疫苗免疫马匹所得到的抗血清，本发明克服了采用传统的狂犬病毒疫苗免疫马匹制得的抗狂犬病免疫球蛋白含有一定量的抗血清白蛋白抗体，注射后容易产生致敏，过敏反应的几率非常高的技术缺陷，并达到了本领域预料不到的技术效果。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特列举以下具体实施例详细说明。然而，具体实施例仅仅是用于举例说明，而不是对本发明的限制。

实施例1. 糖蛋白氨基酸序列，根据哺乳动物偏好进行密码子优化

在核酸转录氨基酸的过程中，组成蛋白质氨基酸有20种，编码氨基酸的密码子有61种，一种氨基酸对应的密码子可以有几个。哺乳动物对密码子有偏好，导致哺乳动物细胞内一种氨基酸的有几种密码子翻译效率高，有的密码子翻译效率低。狂犬病毒糖蛋白的核苷酸序列中含有一些哺乳动物细胞翻译效率低的密码子（狂犬病毒糖蛋白的核苷酸序列见SEQID No.1，狂犬病毒糖蛋白氨基酸序列见SEQ ID No.6）。为了提高目的蛋白在细胞内的表达水平，本发明委托上海生物工程公司（生工）将狂犬病毒糖蛋白的核苷酸序列全部改写为在哺乳动物细胞内翻译效率最高的序列。优化后的序列见SEQ ID No.2，并委托生工用人工方法合成此序列，在起始密码子前加入Kozak序列（GCCGCCACC），5’末端和3’ 末端分别引入Hind III（AAGCTT）与BamH I（GGATCC）限制性内切酶序列（引入后的完整序列见SEQ IDNo.3）。克隆至pBluescript KS（-）载体中，获得质粒G-protein/pBluescript。

实施例2. 构建哺乳动物细胞表达载体G-protein/pcDNA3.1

20微升反应体系中含10 微克G-protein/pBluescript（由实施例1制得）、20单位HindIII和20单位BamH I（购自宝生物），37゜C酶切4小时后琼脂糖电泳，在紫外灯下切取分子量为1.6Kb左右的G-protein DNA，用百泰克DNA回收试剂盒回收DNA。

pcDNA3.1质粒线性化反应条件如下：20微升反应体系中含5 微克pcDNA3.1质粒、20单位Hind III和20单位BamH I（购自宝生物），37゜C酶切4小时后琼脂糖电泳，在紫外灯下切取分子量为5.5Kb左右的线性化质粒 DNA，用百泰克DNA回收试剂盒回收DNA。

线性化pcDNA3.1质粒与G-protein DNA的连接反应采用20微升反应体系（含2微升线性化pcDNA3.1 DNA,2微升T4 DNA连接酶，14微升G-protein DNA，2微升10x T4 DNA连接酶缓冲液），混合物置16゜C反应过夜。T4 DNA连接酶购自宝生物。

从-70゜C冰箱中取出大肠杆菌DH5α感受态细胞，在手掌中融化后加入10微升过夜的连接反应混合物立即置冰浴30分钟，然后在42゜C水浴箱中热激90秒，迅速冰浴上冷却2分钟。加入0.8毫升LB培养基，于37゜C、200rpm 培养30分钟。取50微升培养液涂布在含氨苄西林的LB琼脂平板上，37゜C培养过夜。挑取克隆，用PCR方法检测含重组G-protein/pcDNA3.1质粒的克隆。具体方法为用灭菌的牙签挑取单个菌落，将此牙签在25微升PCR反应液中搅拌3-5次，使细菌与PCR反应液混匀后置PCR仪上反应。PCR反应液为：10x扩增缓冲液2.5微升、20mmol/L 4种dNTP混合液 0.5微升、20μmol/L正向引物 1微升、20μmol/L反向引物 1微升、Taq DNA聚合酶 1单位、水加至25微升。反应条件为：第一步94゜C 30秒、第二步55゜C 30秒、第三步72゜C 60秒，重复第一步至第三步29次，最后为94゜C 60秒、55゜C 30秒、 72゜C 120秒。正向引物为SEQ ID No.4,反向引物为SEQ ID No.5。Taq DNA聚合酶购自宝生物，引物由生工合成。

实施例3. 大规模制备G-protein/ pcDNA3.1质粒DNA

参照分子克隆实验指南（Molecular Cloning: A Laboratory Manual），用SDS碱裂解法大量制备G-protein/pcDNA3.1质粒DNA，具体为：挑取含G-protein/ pcDNA3.1 TA质粒DNA的Top 10单菌落，接种到30 ml含100微克/ml氨苄霉素的LB培养基中，37゜C、200rpm条件下培养菌液至OD600约为0.6。在500毫升含100微克/ml氨苄霉素的LB培养基中接种25毫升OD600约为0.6的菌液，将此培养液在37゜C、300rpm条件下培养过夜。菌液5000rpm离心30分钟，弃上清，离心杯倒置使残余的上清液流出。用200毫升冰浴预冷的STE缓冲液（10mMTris， 0.1M NaCl, 1mM EDTA, pH8.0）重悬细菌沉淀。细菌悬液中加入18毫升碱裂解液I（25 mM Tris-Cl，50 mM葡萄糖，10 mM EDTA， pH8.0）混匀，加2毫升新配制的10 mg/ml溶菌酶，混匀。加40毫升新配制的碱裂解液II（0.2 N NAOH，1%（w/v）SDS）轻轻颠倒5次，彻底混匀，室温放置5分钟。加20毫升冰浴预冷的碱裂解液III（5 M醋酸钾60毫升，冰醋酸11.5毫升，水28.5毫升），轻轻震荡混匀后置冰浴10分钟。在4゜C用20000g离心碱裂解液30分钟。将上清移入量筒，加0.6体积的异丙醇，充分混匀，室温下放置10分钟。将混匀液室温12000g离心15分钟，小心弃去上清，将离心管敞开盖、倒置于吸水纸上以除去残留上清。在室温下用70%乙醇刷洗管壁与管底，倒掉乙醇，吸取底部残留的乙醇，离心管开口倒置使残留的乙醇挥发掉。用3毫升TE（10mM Tris， 1mM EDTA, pH8.0）溶解湿润的核酸沉淀。将溶解的核酸转移到15 ml Corex管中，在冰浴中预冷至0゜C，加入3毫升冰浴中预冷的5 M氯化锂，混匀，4゜C离心12000g 10分钟。转移上清到30ml Corex管中，加等体积异丙醇，混匀，室温12000g离心10分钟。倒去上清，倒置管口，使液体流干。在室温下用70%乙醇刷洗管壁与管底，倒掉乙醇，吸取底部残留的乙醇，离心管开口倒置使残留的乙醇挥发掉，用500微升含RNA酶的TE溶解核酸沉淀。将溶液转移到微量离心管，室温放置30分钟后加入等体积酚：氯仿抽提一次，然后再用酚：氯仿抽提一次。用乙醇沉淀回收DNA。回收的DNA沉淀加入1毫升纯水溶解，再加入0.5mlPEG-MgCl2（40% PEG8000（w/v），30mM MgCl2）溶液。室温放置20分钟后14000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用0.5 ml70%乙醇重悬后14000rpm离心5分钟以回收沉淀。沉淀再次用0.5 ml 70%乙醇重悬后14000rpm离心5分钟，弃上清，在离心架上放置20分钟使乙醇挥发。沉淀用TE（pH8.0）500微升溶解。以1:100用TE（pH8.0）稀释后测OD260。按上述方法一次培养2000毫升菌液，最终获得5毫克质粒DNA。用TE缓冲液配成100微克/ml浓度，-20゜C储存备用。

实施例4. G-protein/ pcDNA3.1质粒DNA免疫马匹

选用年龄为4-5岁，经检查无马鼻疽、马传染性贫血等病毒感染，身体健康，体重300-320公斤重的公马3匹。每匹每次臀部肌肉注射100微克G-protein/pcDNA3.1质粒DNA。每45天注射一次，共注射三次。第三次注射后第十天颈静脉采血，每匹马采100毫升血液。采得的血液37゜C孵育1小时，4゜C放置过夜，离心取血清，每匹马获得52毫升血清。

实施例5. 抗狂犬病毒糖蛋白抗体制备

每匹马获得的血清各取2毫升作检测用，其余血清合并后加注射用水300毫升，用2N盐酸调pH至3.2-3.3，置30℃水浴箱，加入胃蛋白酶1800单位，搅拌2小时后，用2N氢氧化钠调pH至6.5左右，温度升至57℃，保温30分钟，然后加硫酸铵至10%饱和度，充分搅拌后，10000rpm离心20分钟；取上清加硫酸铵至50%饱和度，室温搅拌30分钟后10000rpm离心30分钟，弃上清；沉淀用50%饱和硫酸铵洗涤后10000rpm离心30分钟，弃上清；沉淀溶解于150毫升生理盐水，用截留值50kD的超过滤膜包对生理盐水超过滤至硫酸铵浓度低于0.1%，浓缩到15毫升。浓缩液加间甲酚至0.5%（w/v），除菌过滤后样品即为抗狂犬病毒糖蛋白抗体。

实施例6.马抗人血清白蛋白血清制备

人血清白蛋白购自上海生物制品研究所，用DEAE-Sepharose 6 FF离子交换层析纯化后作为免疫用抗原。免疫动物选用年龄为4岁，经检查无马鼻疽、马传染性贫血等病毒感染，身体健康，体重320公斤重的公马1匹。第一次用3毫克白蛋白与0.5毫升福氏完全佐剂充分混匀，颈部皮下注射2点，此后每隔10天注射抗原一次，每次白蛋白用量为5毫克，福氏不完全佐剂1毫升，混合均匀后颈部皮下注射，共4次免疫，最后一次免疫后10天采血，分离血清。

实施例7. ELISA检测G-protein/pcDNA3.1质粒马血清抗狂犬病毒糖蛋白抗体

狂犬病毒包被的ELISA板选用购自宁波天润人狂犬病病毒 IgG抗体测定试剂盒（酶联免疫法），阳性对照血清用狂犬病毒疫苗原液（购自辽宁成大生物股份有限公司）免疫、已知抗体效价的马抗狂犬病毒血清，待检样品为G-protein/pcDNA3.1质粒DNA免疫四次后马匹采得的血清，阴性对照1为正常马血清；阴性对照2为PBS。HRP标记的兔抗马IgG购自北京百奥莱博科技有限公司。

从试剂盒中取出已包被狂犬病毒抗原的酶标板。阳性对照血清用PBS稀释1000倍、待检马血清样品用PBS稀释100倍、抗狂犬病毒糖蛋白抗体1000倍阴性对照血清用PBS稀释20倍后各取0.1ml加入到上述已包被狂犬病毒抗原的酶标板反应孔中，置37℃孵育1小时。洗涤3次，每次3分钟。HRP标记的兔抗马IgG用PBS以1:10000稀释后每孔加0.1毫升，置37℃孵育1小时后弃去，洗涤3次，每次3分钟。最后一次洗涤后吸干残留液体，于各反应孔中加入临时配制的TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）底物溶液0.1ml，37℃反应20分钟后于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml，终止反应。在ELISA检测仪上，读取OD450。表1的ELISA结果中显示用狂犬疫苗免疫的马匹呈现阳性反应，G-protein/pcDNA3.1质粒免疫的3匹马均呈现抗狂犬病毒抗体阳性反应。经胃蛋白酶消化，硫酸铵沉淀纯化得到的抗狂犬病毒糖蛋白抗体也呈现出高滴度的阳性反应，而正常马血清OD450的读数与PBS孔的读数均接近于0，表明G-protein/pcDNA3.1质粒免疫马匹可产生抗狂犬糖蛋白的抗体，经胃蛋白酶消化，硫酸铵沉淀。

表1.ELISA法检测抗狂犬病毒抗体

实施例8. ELISA法检测G-protein/pcDNA3.1质粒免疫马血清和抗狂犬病毒糖蛋白抗体对人血清白蛋白免疫反应

人血清白蛋白购自上海生物制品研究所，马抗人血清白蛋白血清作为阳性对照（由实施例6制备得到），阴性对照为正常马血清。待检样品为G-protein/pcDNA3.1质粒DNA免疫四次后马匹的血清。

人血清白蛋白用0.05M pH9.6碳酸盐包被缓冲液稀释至蛋白质含量为1μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟 (简称洗涤，下同)。每孔加0.2ml封闭液（20 mM PBS，pH7.2，含5%脱脂奶粉），室温放置1小时1后弃去，洗涤一次。马抗人血清白蛋白血清用PBS稀释1000倍、狂犬疫苗免疫马血清100倍稀释、待检马血清样品、抗狂犬病毒糖蛋白抗体与阴性对照血清用PBS稀释20倍后取0.1ml加入到上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。洗涤3次，每次3分钟。HRP标记的兔抗马IgG用PBS以1:10000稀释后每孔加0.1毫升，置37℃孵育1小时后弃去，洗涤3次，每次3分钟。最后一次洗涤后吸干残留液体，于各反应孔中加入临时配制的TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）底物溶液0.1ml，37℃反应20分钟后于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml，终止反应。在ELISA检测仪上，读取OD450。从表2中可见马抗人血清白蛋白血清1000倍稀释后OD450仍接近2.0，表明该具有高滴度的抗人血清白蛋白的抗体，用狂犬疫苗免疫的马匹的血清虽然稀释100倍，OD450读数为0.88，表明该血清也有高滴度的抗人血清白蛋白抗体，而用G-protein/pcDNA3.1质粒DNA免疫的马匹血清，ELISA的OD450读数接近于0，抗狂犬病毒糖蛋白抗体表明无人血清抗白蛋白抗体。

表2.ELISA法检测抗人血清白蛋白抗体

实施例9. 小鼠中和法检测G-protein/pcDNA3.1质粒免疫马抗狂犬血清作用

阳性对照为抗狂犬血清国家标准品，阴性对照为正常马血清，待测样品为G-protein/pcDNA3.1质粒免疫马抗狂犬病毒糖蛋白抗体与狂犬疫苗免疫的马抗狂犬血清，狂犬病毒株为CTN，所用的小牛血清稀释液为含2%小牛血清的PBS。狂犬病毒用小牛血清稀释液稀释到100LD/ml, 阳性对照用小牛血清稀释液稀释成1：10000；阴性对照用小牛血清稀释液稀释成1:10；G-protein/pcDNA3.1质粒免疫马抗狂犬血清与狂犬疫苗免疫的马抗狂犬血清均稀释成1:1000。分别取稀释的抗狂犬国家标准品或各种血清稀释液0.5毫升，各加入100LD50/ml狂犬病毒悬液0.5毫升置37℃水浴箱孵育1小时。选取昆明小鼠，体重为10-12克，每个样品注射6只，每只小鼠脑内接种0.03ml，接种后小鼠饲养14天，每天观察一次，记录发病与死亡情况，接种4天内死亡小鼠作为非特异死亡，不计入狂犬病毒致死统计。

表3. 注射狂犬病毒后各测试组小鼠的成活数：

小鼠中和试验的结果见表3，根据表3显示，正常马血清与与狂犬病毒孵育后小鼠脑内注射，所有小鼠在9天内死亡；抗狂犬血清国家标准品、狂犬疫苗免疫马血清分别与狂犬病毒孵育后小鼠脑内注射后，动物均成活；用G-protein/pcDNA3.1质粒免疫马匹获得的抗狂犬病毒糖蛋白抗体狂犬病毒孵育后小鼠脑内注射后，小鼠也成活。此实验表明抗狂犬病毒糖蛋白抗体可以有效的中和狂犬病毒。

上述结果表明用G-protein/pcDNA3.1质粒可以代替狂犬疫苗免疫马匹制备抗狂犬血清，获得的产品无抗人血清白蛋白抗体，抗血清的纯度优于狂犬疫苗免疫马匹所得到的抗血清。

序列表

<110>上海赛伦生物技术股份有限公司

<120>免疫马生产抗狂犬病毒抗体用的抗原及其制备方法和应用

<130> WH-NP-19-100217

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1575

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 1

atggtgcctc aggccctgct gttcgtgcct ctgctggtgt tccctctgtg cttcggcaag 60

ttccctatct acaccatccc tgacaagctg ggcccttgga gccctatcga catccaccac 120

ctgagctgcc ctaacaacct ggtggtggag gacgagggct gcaccaacct gagcggcttc 180

agctacatgg agctgaaggt gggctacatc agcgccatca agatgaacgg cttcacctgc 240

accggcgtgg tgaccgaggc cgagacctac accaacttcg tgggctacgt gaccaccacc 300

ttcaagagga agcacttcag gcctacccct gacgcctgca gggccgccta caactggaag 360

atggccggcg accctaggta cgaggagagc ctgcacaacc cttaccctga ctaccactgg 420

ctgaggaccg tgaagaccac caaggagagc ctggtgatca tcagccctag cgtggccgac 480

ctggaccctt acgacaggag cctgcacagc agggtgttcc ctggcggcaa ctgcagcggc 540

gtggccgtga gcagcaccta ctgcagcacc aaccacgact acaccatctg gatgcctgag 600

aaccctaggc tgggcatgag ctgcgacatc ttcaccaaca gcaggggcaa gagggccagc 660

aagggcagcg agacctgcgg cttcgtggac gagaggggcc tgtacaagag cctgaagggc 720

gcctgcaagc tgaagctgtg cggcgtgctg ggcctgaggc tgatggacgg cacctgggtg 780

gccatgcaga ccagcaacga gaccaagtgg tgccctcctg gccagctggt gaacctgcac 840

gacttcagga gcgacgagat cgagcacctg gtggtggagg agctggtgaa gaagagggag 900

gagtgcctgg acgccctgga gagcatcatg accaccaaga gcgtgagctt caggaggctg 960

agccacctga ggaagctggt gcctggcttc ggcaaggcct acaccatctt caacaagacc 1020

ctgatggagg ccgacgccca ctacaagagc gtgaggacct ggaacgagat catccctagc 1080

aagggctgcc tgagggtggg cggcaggtgc caccctcacg tgaacggcgt gttcttcaac 1140

ggcatcatcc tgggccctga cggcaacgtg ctgatccctg agatgcagag cagcctgctg 1200

cagcagcaca tggagctgct ggtgagcagc gtgatccctc tgatgcaccc tctggccgac 1260

cctagcaccg tgttcaagaa cggcgacgag gccgaggact tcgtggaggt gcacctgcct 1320

gacgtgcacg agaggatcag cggcgtggac ctgggcctgc ctaactgggg caagtacgtg 1380

ctgctgagcg ccggcgccct gaccgccctg atgctgatca tcttcctgat gacctgctgg 1440

aggagggtga acaggagcga gcctacccag cacaacctga ggggcaccgg cagggaggtg 1500

agcgtgaccc ctcagagcgg caagatcatc agcagctggg agagctacaa gagcggcggc 1560

gagaccggcc tgtga 1575

<210> 2

<211> 1575

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 2

atggtgcctc aggccctgct attcgtccct ctactggtgt tccctctatg cttcggcaag 60

ttccctatct acaccatccc tgacaagctg ggcccttgga gccctatcga catccaccac 120

ctaagctgcc ctaacaacct ggtcgtggag gacgagggct gcaccaacct aagcggcttc 180

agctacatgg agctgaaggt cggctacatc agcgccatca agatgaacgg cttcacctgc 240

accggcgtgg tgaccgaggc cgagacctac accaacttcg tgggctacgt caccaccacc 300

ttcaagagga agcacttcag gcctacccct gacgcctgca gggccgccta caactggaag 360

atggccggcg accctaggta cgaggagagc ctacacaacc cttaccctga ctaccactgg 420

ctgaggaccg tgaagaccac caaggagagc ctagtgatca tcagccctag cgtggccgac 480

ctggaccctt acgacaggag cctacacagc agggtcttcc ctggcggcaa ctgcagcggc 540

gtggccgtga gcagcaccta ctgcagcacc aaccacgact acaccatctg gatgcctgag 600

aaccctaggc tgggcatgag ctgcgacatc ttcaccaaca gcaggggcaa gagggccagc 660

aagggcagcg agacctgcgg cttcgtcgac gagaggggcc tatacaagag cctgaagggc 720

gcctgcaagc taaagctgtg cggcgtgcta ggcctgaggc taatggacgg cacctgggtc 780

gccatgcaga ccagcaacga gaccaagtgg tgccctcctg gccagctggt gaacctacac 840

gacttcagga gcgacgagat cgagcacctg gtggtcgagg agctagtgaa gaagagggag 900

gagtgcctgg acgccctaga gagcatcatg accaccaaga gcgtgagctt caggaggcta 960

agccacctga ggaagctagt ccctggcttc ggcaaggcct acaccatctt caacaagacc 1020

ctgatggagg ccgacgccca ctacaagagc gtgaggacct ggaacgagat catccctagc 1080

aagggctgcc taagggtcgg cggcaggtgc caccctcacg tgaacggcgt gttcttcaac 1140

ggcatcatcc tgggccctga cggcaacgtg ctaatccctg agatgcagag cagcctgcta 1200

cagcagcaca tggagctgct ggtgagcagc gtgatccctc tgatgcaccc tctagccgac 1260

cctagcaccg tgttcaagaa cggcgacgag gccgaggact tcgtggaggt gcacctgcct 1320

gacgtgcacg agaggatcag cggcgtggac ctaggcctgc ctaactgggg caagtacgtg 1380

ctactgagcg ccggcgccct aaccgccctg atgctaatca tcttcctgat gacctgctgg 1440

aggagggtca acaggagcga gcctacccag cacaacctaa ggggcaccgg cagggaggtg 1500

agcgtgaccc ctcagagcgg caagatcatc agcagctggg agagctacaa gagcggcggc 1560

gagaccggcc tatga 1575

<210> 3

<211> 1597

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 3

aagcttgccg ccaccaatgg tgcctcaggc cctgctattc gtccctctac tggtgttccc 60

tctatgcttc ggcaagttcc ctatctacac catccctgac aagctgggcc cttggagccc 120

tatcgacatc caccacctaa gctgccctaa caacctggtc gtggaggacg agggctgcac 180

caacctaagc ggcttcagct acatggagct gaaggtcggc tacatcagcg ccatcaagat 240

gaacggcttc acctgcaccg gcgtggtgac cgaggccgag acctacacca acttcgtggg 300

ctacgtcacc accaccttca agaggaagca cttcaggcct acccctgacg cctgcagggc 360

cgcctacaac tggaagatgg ccggcgaccc taggtacgag gagagcctac acaaccctta 420

ccctgactac cactggctga ggaccgtgaa gaccaccaag gagagcctag tgatcatcag 480

ccctagcgtg gccgacctgg acccttacga caggagccta cacagcaggg tcttccctgg 540

cggcaactgc agcggcgtgg ccgtgagcag cacctactgc agcaccaacc acgactacac 600

catctggatg cctgagaacc ctaggctggg catgagctgc gacatcttca ccaacagcag 660

gggcaagagg gccagcaagg gcagcgagac ctgcggcttc gtcgacgaga ggggcctata 720

caagagcctg aagggcgcct gcaagctaaa gctgtgcggc gtgctaggcc tgaggctaat 780

ggacggcacc tgggtcgcca tgcagaccag caacgagacc aagtggtgcc ctcctggcca 840

gctggtgaac ctacacgact tcaggagcga cgagatcgag cacctggtgg tcgaggagct 900

agtgaagaag agggaggagt gcctggacgc cctagagagc atcatgacca ccaagagcgt 960

gagcttcagg aggctaagcc acctgaggaa gctagtccct ggcttcggca aggcctacac 1020

catcttcaac aagaccctga tggaggccga cgcccactac aagagcgtga ggacctggaa 1080

cgagatcatc cctagcaagg gctgcctaag ggtcggcggc aggtgccacc ctcacgtgaa 1140

cggcgtgttc ttcaacggca tcatcctggg ccctgacggc aacgtgctaa tccctgagat 1200

gcagagcagc ctgctacagc agcacatgga gctgctggtg agcagcgtga tccctctgat 1260

gcaccctcta gccgacccta gcaccgtgtt caagaacggc gacgaggccg aggacttcgt 1320

ggaggtgcac ctgcctgacg tgcacgagag gatcagcggc gtggacctag gcctgcctaa 1380

ctggggcaag tacgtgctac tgagcgccgg cgccctaacc gccctgatgc taatcatctt 1440

cctgatgacc tgctggagga gggtcaacag gagcgagcct acccagcaca acctaagggg 1500

caccggcagg gaggtgagcg tgacccctca gagcggcaag atcatcagca gctgggagag 1560

ctacaagagc ggcggcgaga ccggcctatg aggatcc 1597

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 4

taatacgact cactataggg 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 5

ctcccagctg ctgatgatc 19

<210> 6

<211> 524

<212> PRT

<213> 人工序列(未知)

<400> 6

MVPQALLFVP LLVFPLCFGK FPIYTIPDKL GPWSPIDIHH LSCPNNLVVE DEGCTNLSGF 60

SYMELKVGYI SAIKMNGFTC TGVVTEAETY TNFVGYVTTT FKRKHFRPTP DACRAAYNWK 120

MAGDPRYEES LHNPYPDYHW LRTVKTTKES LVIISPSVAD LDPYDRSLHS RVFPGGNCSG 180

VAVSSTYCST NHDYTIWMPE NPRLGMSCDI FTNSRGKRAS KGSETCGFVD ERGLYKSLKG 240

ACKLKLCGVL GLRLMDGTWV AMQTSNETKW CPPGQLVNLH DFRSDEIEHL VVEELVKKRE 300

ECLDALESIM TTKSVSFRRL SHLRKLVPGF GKAYTIFNKT LMEADAHYKS VRTWNEIIPS 360

KGCLRVGGRC HPHVNGVFFN GIILGPDGNV LIPEMQSSLL QQHMELLVSS VIPLMHPLAD 420

PSTVFKNGDE AEDFVEVHLP DVHERISGVD LGLPNWGKYV LLSAGALTAL MLIIFLMTCW 480

RRVNRSEPTQ HNLRGTGREV SVTPQSGKII SSWESYKSGG ETGL 524

Claims

1.一种免疫马生产抗狂犬病毒抗体用的抗原，其特征在于，含有编码狂犬病毒糖蛋白G-protein/pcDNA3.1的DNA；所述G-protein/pcDNA3.1是一种重组的DNA质粒，该质粒能在哺乳动物细胞内产生狂犬病毒糖蛋白G-protein。

2.根据权利要求1所述的抗原，其特征在于，所述的编码G-protein/pcDNA3.1的DNA序列根据哺乳动物对密码子的偏好进行优化，优化的狂犬病毒糖蛋白G-protein的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求1所述的抗原，其特征在于，所述G-protein/pcDNA3.1为一种DNA水溶液注射液，所述免疫马生产抗狂犬病毒抗体用的抗原是用注射方法用于马匹的免疫抗原。

4. 根据权利要求3所述的抗原，其特征在于，每个免疫剂量含有G-protein/pcDNA3.1DNA量为20-200微克；每匹马每次注射一个剂量的，其体积为1毫升；每45天注射一次，注射部位为马的颈部或臀部，注射于皮下或肌肉内；使用周期为3个月。

5.一种如权利要求1-4任一项所述的免疫马生产抗狂犬病毒抗体用的抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，根据哺乳动物偏好对狂犬病毒糖蛋白序列进行密码子优化；

步骤2，人工合成G-protein基因，在起始密码子ATG前引入Kozak序列GCCGCCACC，5’-末端引入Hind III，3’-末端引入EcoRI限制性酶切位点，克隆入pBluescript质粒Hind III和EcoRI之间；重组成G-protein/pBluescript质粒；

步骤4，参照分子克隆实验指南，用SDS碱裂解法大量制备G-protein/pcDNA3.1质粒DNA；

6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述密码子优化后的狂犬病毒糖蛋白序列如SEQ ID No.2所示。

7. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述在起始密码子ATG前引入Kozak序列GCCGCCACC，5’-末端引入Hind III，3’-末端引入EcoRI限制性酶切位点，引入后的完整序列如SEQ ID No.3所示。

8.如权利要求1-4任一项所述的免疫马生产抗狂犬病毒抗体用的抗原在制备抗狂犬病毒糖蛋白抗体中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，所述制备抗狂犬病毒糖蛋白抗体的方法为用DNA免疫马匹获得抗狂犬病毒抗体的方法，包括如下步骤：