CN101787079A - 高纯度马抗狂犬病毒抗体F(ab')2片段 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于治疗、预防狂犬病的高纯度马抗狂犬病抗体F(ab’)2片段的制备和纯化的方法，通过该方法得到的抗狂犬病毒抗体F(ab’)2片段纯品中F(ab’)2的纯度大于99％，白蛋白的残留检测不出，抗体效价大于500IU/mL。

Description

高纯度马抗狂犬病毒抗体F(ab')2片段

一.技术领域：

本发明涉及一种用于治疗、预防狂犬病的高纯度马抗狂犬病抗体F(ab’)2片段纯品的制备和纯化方法，属于生物制药领域。

二.背景技术：

狂犬病是由狂犬病毒引起的致死性人畜共患传染病，以侵犯中枢神经系统为特征。狂犬病在世界各地分布广泛，发生普遍，我国是狂犬病的高发区。狂犬病具有致死率非常高的特点，且发病率呈逐年上升趋势，严重的危害了人们的健康。目前防治狂犬病的主要方法是注射狂犬疫苗，虽然对狂犬病能够有效地预防，但狂犬疫苗需要在咬后24小时内注射，并且个别时候狂犬疫苗也无法对个体进行有效的保护。另外，狂犬病的发病后治疗一直是世界性难题，对于严重发病者(III)而言，世界卫生组织建议同时使用疫苗和狂犬病毒免疫球蛋白进行主动和被动免疫治疗。关于狂犬病毒免疫球蛋白，目前可以选用的有人血来源的抗狂犬病毒免疫球蛋白和马抗狂犬病毒免疫球蛋白抗血清。

目前人血来源的抗狂犬病毒免疫球蛋白的来源少，价格高，而且血制品中不仅非特异性杂蛋白多，特异性抗体含量很低，并且最大的问题是血源制品潜在的未能检出的病原污染问题，从长远考虑不适于临床的有效应用。

而马抗免疫球蛋白血清自古以来是用于重要病原体感染的一种有效的应急治疗措施，至今至少有7种抗血清在临床广泛应用，发挥重要的治疗和预防传染病的作用。目前马抗狂犬病毒抗体的抗血清产品虽然已经上市，并且在预防和治疗狂犬病方面有一定的效果，但目前该产品或者是仅仅通过酶切而未去除Fc片段，造成对人的免疫原性过强；或者是去除Fc片段不彻底，产品中有少量Fc片段的残留，所以导致实际应用中容易过敏，大大限制了其临床应用。

鉴于此，本发明通过一系列的处理步骤结合层析的方法对F(ab’)2片段进行了精纯化，有效地解决了由于Fc片段的残留引起过敏的问题，使抗狂犬病毒抗体F(ab’)2片段纯品中F(ab’)2的含量大于99％，白蛋白的含量检测不出，抗体效价大于500U/mL。

动物试验表明本品无过敏性，极大地提高了本品的安全性。另一方面，本项目采用了细胞因子辅助佐剂，大大提高了马匹免疫后产生抗体的效价，降低了本品的制备成本。

三.发明内容：

本发明的目的在于公开一种制备并得到高纯度马抗狂犬病毒免疫球蛋白F(ab’)2片段的方法。

本发明马抗狂犬病毒抗体F(ab’)2片段的制备方法包括以下步骤：

1)使用狂犬病毒疫苗加入不完全福氏佐剂乳化制备免疫原，并配合干扰素α-2a和白细胞介素2，采用多点免疫马匹，免疫三次、间隔10天免疫一次。

2)采集马抗狂犬病毒血浆，用生理盐水稀释1倍并加入20％饱和度硫酸铵混匀、离心弃沉淀，上清再加入10％饱和度硫酸铵混匀离心，收集沉淀。沉淀用20mM PB，pH7.4溶解。

使用中空纤维超滤柱，截留分子量为50kD，进行浓缩，采用20mMPB，pH7.4，0.15M NaCl对浓缩后的蛋白溶液进行换液，得到马抗狂犬病毒IgG。

3)马抗狂犬病毒IgG用稀盐酸调PH至4.5后使用胃蛋白酶进行酶切，然后用2mol/L Tris-HCl，pH8.0调PH值至pH7.4，加热58℃、30min，离心10000rpm，20min去沉淀的Fc段，上清为初步纯化的马抗狂犬病毒抗体F(ab’)2片段。

4)初步纯化的马抗狂犬病毒抗体F(ab’)2使用Q Sepharose FastFlow，用20mM PB，pH7.4平衡，上一步得到的样品稀释后上样，再次平衡后用20mM PB，pH7.4，0～0.5M NaCl梯度洗脱，得到进一步纯化的抗狂犬病毒抗体F(ab’)2。

5)使用Sephacryl S-100High Resolution层析介质，使用20mMPB，pH7.4，0.15M NaCl平衡，上一步得到的样品上样，平衡，收集目的蛋白峰，即得到纯品的抗狂犬病毒抗体F(ab’)2片段。

得到的抗狂犬病毒抗体F(ab’)2片段的含量通过薄层扫描法定量检测，纯度超过了99％。白蛋白含量在琼脂糖电泳中检测不出。其抗体效价达到了500IU/mL。

在急性毒性试验中，小鼠对于本品的最大耐受剂量达到了80mg/kg。在过敏性试验中，在20mg/kg剂量的情况下，单次使用本品，豚鼠未出现过敏性反应。

综上所述，本发明中的抗狂犬病毒抗体F(ab’)2片段安全有效，有望成为一种有效治疗和预防狂犬病的药品。

四.具体实施方案：

(一).抗狂犬病毒抗体F(ab’)2纯品的制备：

1)使用狂犬病毒疫苗加入不完全福氏佐剂乳化制备免疫原，并配合干扰素α-2a和白细胞介素2，给经检验合格的马匹肌肉注射狂犬病毒疫苗，选取背部多点进行注射，分三次注射，每次间隔10日.每程免疫结束的第7日，进行一次采血，隔一日进行第二次采血。采血量按每kg体重采18ml血计算，第二次采血量较第一次减少300ml，由颈静脉采血。

2)采集马抗狂犬病毒血浆4升，室温下用生理盐水稀释1倍并加入20％饱和度硫酸铵混匀，室温放置30min，离心10000rpm，20min弃沉淀，上清再加入10％饱和度硫酸铵混匀，室温放置30min，离心10000rpm，20min，收集沉淀。沉淀使用20mM PB，pH7.4，1000mL溶解。

用截留分子量为50kD的中空纤维超滤器超滤，先将上一步的溶液浓缩至400mL，然后采用1200mL 20mM PB，pH7.4，0.15M NaCl对浓缩后的蛋白溶液进行换液，得到马抗狂犬病毒IgG。

3)马抗狂犬病毒IgG用1M盐酸调PH至4.5后，使用胃蛋白酶进行酶切，加入相当于IgG总量的4％胃蛋白酶，37度，24hr进行酶切，酶切后的反应液用2mol/L Tris-HCl，pH8.0调pH至pH7.4。加热58℃、30min，离心10000rpm，20min去除沉淀的Fc段，上清为初步纯化的马抗狂犬病毒抗体F(ab’)2片段。

4)初步纯化的马抗狂犬病毒抗体F(ab’)2使用Q Sepharose FastFlow，用20mM PB，pH7.4平衡，上一步得到的样品用20mM PB，pH7.4稀释3倍后上样，流速120cm/hr，再次使用20mM PB，pH7.4平衡后用20mM PB，pH7.4，0～0.5M NaCl，20个柱体积的梯度洗脱，分段收集并电泳检测各组分，合并目的蛋白组分，得到进一步纯化的抗狂犬病毒抗体F(ab’)2片段。

5)使用Sephacryl S-100High Resolution层析介质，使用20mMPB，pH7.4，0.15M NaCl平衡，上一步得到的样品直接上样，使用20mM PB，pH7.4，0.15M NaCl平衡，收集目的蛋白峰，即得到纯品的抗狂犬病毒抗体F(ab’)2片段。

(二).抗狂犬病毒抗体F(ab’)2的检测及动物试验：

1)纯度检测；

得到的抗狂犬病毒抗体F(ab’)2片段的纯度按照中国药典第三部，附录Ⅷ F，通过薄层扫描法定量检测。结果：抗体F(ab’)2片段的纯度为99.3％。

白蛋白残留的检测按中国药典第三部，附录Ⅳ B，琼脂糖电泳中检测。结果：没有检测到与白蛋白电泳迁移率相同的条带，说明没有检测到白蛋白的残留。

2)抗体效价的测定：

按照中国药典第三部，附录Ⅺ J，根据抗狂犬病毒抗体能中和狂犬病毒的作用，将供试品和标准品作系列稀释，分别与狂犬病病毒悬液结合，小鼠脑内注射，在规定的时间内观察小鼠存活和死亡情况，以确定样品效价。结果测得本品抗体效价为500IU/mL。

3)动物急性毒性试验：

小鼠单次静脉注射本品达到80mg/kg后，其中毒症状主要表现为活动减少，眼睑下垂。14天观察期内动物未见死亡，但动物体重在给药后前3-4天较对照组下降，以后缓慢增长，其静脉注射的最大耐受量为80mg/kg。

4)动物过敏性试验：

豚鼠单次静脉注射本品，剂量为20mg/kg，连续观察14天，主要看是否有明显的过敏反应，采血并用ELISA的方法检验本品抗体的产生，结果是没有观察到过敏反应，也没有观察到本品抗体的产生。

Claims (2)

1.一种制备用于治疗和预防狂犬病毒的抗狂犬病毒抗体F(ab’)2片段纯品的方法，其特征在于该抗体F(ab’)2片段纯品是由如下制备方法制成的：

1)使用狂犬病毒疫苗加入不完全福氏佐剂乳化制备免疫原，并配合干扰素α-2a和白细胞介素2，采用多点免疫马匹，共免疫三次、间隔10天免疫一次。

2)采集马抗狂犬病毒血浆，用生理盐水稀释1倍并加入20％饱和度硫酸铵混匀、离心弃沉淀，上清再加入10％饱和度硫酸铵混匀离心，收集沉淀。沉淀用20mM PB，pH7.4溶解。

使用中空纤维超滤柱，截留分子量为50kD，进行浓缩，采用20mMPB，pH7.4，0.15M NaCl对浓缩后的蛋白溶液进行换液，得到马抗狂犬病毒IgG；

3)马抗狂犬病毒IgG用稀盐酸调PH值至4.5后使用胃蛋白酶进行酶切，然后用2mol/L Tris-HCl，pH8.0调PH值至pH7.4，加热58℃、30min，离心10000rpm，20min去除沉淀的Fc段，上清为初步纯化的马抗狂犬病毒抗体F(ab’)2片段。

4)初步纯化的马抗狂犬病毒抗体F(ab’)2使用Q Sepharose FastFlow层析介质，用20mM PB，pH7.4平衡，上一步得到的样品稀释上样，再次平衡后用20mM PB，pH7.4，0～0.5M NaCl梯度洗脱，得到进一步纯化的抗狂犬病毒抗体F(ab’)2片段。

5)使用Sephacryl S-100High Resolution层析介质，使用20mMPB，pH7.4，0.15M NaCl平衡，上一步得到的样品上样，平衡，收集目的蛋白峰，即得到纯品的抗狂犬病毒抗体F(ab’)2片段。

2.通过权利要求1中的方法得到的抗狂犬病毒抗体F(ab’)2片段纯品中F(ab’)2片段的纯度大于99％，白蛋白的残留检测不出，抗体效价大于500IU/mL。