RU2815252C1 - Способ получения очищенного гетерологического иммуноглобулина против лихорадки Эбола - Google Patents
Способ получения очищенного гетерологического иммуноглобулина против лихорадки Эбола Download PDFInfo
- Publication number
- RU2815252C1 RU2815252C1 RU2023113282A RU2023113282A RU2815252C1 RU 2815252 C1 RU2815252 C1 RU 2815252C1 RU 2023113282 A RU2023113282 A RU 2023113282A RU 2023113282 A RU2023113282 A RU 2023113282A RU 2815252 C1 RU2815252 C1 RU 2815252C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- immunoglobulin
- purification
- ebola
- sorbent
- serum
- Prior art date
Links
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 title claims abstract description 73
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 title claims abstract description 73
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 title claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 21
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 claims abstract description 19
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims abstract description 15
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 claims abstract description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 12
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 9
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 claims abstract description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims abstract description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims abstract description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims abstract 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 abstract description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 abstract 2
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 20
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 10
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 7
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 3
- 208000030820 Ebola disease Diseases 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 208000001718 Immediate Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 102000005686 Serum Globulins Human genes 0.000 description 2
- 108010045362 Serum Globulins Proteins 0.000 description 2
- 206010045240 Type I hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 208000010216 atopic IgE responsiveness Diseases 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 2
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 2
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 102000002572 Alpha-Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010068307 Alpha-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 102000006734 Beta-Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010087504 Beta-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 206010061192 Haemorrhagic fever Diseases 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- BBMHARZCALWXSL-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogenphosphate monohydrate Chemical compound O.[Na+].OP(O)([O-])=O BBMHARZCALWXSL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения высокоочищенного гетерологичного иммуноглобулина жидкого против лихорадки Эбола. Способ получения высокоочищенного гетерологичного иммуноглобулина жидкого против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей, включающий приготовление антигена из вирулентного штамма вируса Эбола, получение иммунной крови, получение иммунной сыворотки с использованием 30% раствора хлористого кальция, выделение иммуноглобулина, очистку и концентрирование методом хроматографии, фасовку и упаковку, отличающийся тем, что выделение иммуноглобулина из лошадиной иммунной сыворотки проводят методом осаждения путем добавления сульфата аммония, очистку иммуноглобулина проводят в два этапа, для первого этапа очистки применяют аффинную хроматографию на сорбенте Protein G при скорости подачи образца 60 см⋅ч-1 с последующей элюцией на скорости потока 100 см⋅ч-1 100 мМ раствором глицина, рН 2,7, для второго этапа применяют гель-фильтрационную хроматографию на сорбенте Superdex 200 с разделением белков в изократическом режиме элюирования фосфатно-солевым буфером, рН 7,2, при скорости потока 50 см⋅ч-1. Использование изобретения обеспечивает получение иммуноглобулина против лихорадки Эбола лошадиного очищенного с высоким содержанием мономерной фракции иммуноглобулина (не менее 97%) и количеством посторонних фракций димеров, полимеров и агрегатов (не более 3%), что снижает анафилактогенность иммуноглобулина (индекс анафилактогенности ≤1,0) и приводит качество препарата в соответствие с требованиями Европейской Фармакопеи к гетерологичным препаратам. 6 ил., 4 табл., 7 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к разработке технологий производства защитных иммунобиологических препаратов, в частности, к разработке способа получения специфического средства экстренной профилактики против лихорадки Эбола.
Геморрагическая лихорадка, вызываемая вирусом Эбола, является особо опасным вирусным инфекционным заболеванием, характеризующимся летальным исходом в 50-90% случаев. Данная нозологическая форма впервые была выявлена в 1976 г., а пристальное внимание к заболеванию значительно усилилось после крупнейшей эпидемии лихорадки Эбола за всю историю наблюдений в странах Западной Африки во втором десятилетии 21 века. Общее количество заболевших (подтвержденные случаи) с декабря 2013 г. по июнь 2016 г. составило 28652, из них погибло 11325. В ходе данной эпидемии зарегистрированы случаи завоза заболевания из Западной Африки на все обитаемые континенты. Всего было зарегистрировано 36 завозных случаев заболевания в не эндемичных регионах [Baize, S.EmergenceofZaireEbolaVirusDiseaseinGuinea-PreliminaryReport/S. Baize, D. Pannetier, L. Oestereich, [et al.]//NewEng. J. Med. - 2014. -NEJM.org. - P. 1-8].
Важнейшим компонентом рассматриваемого Всемирной организацией здравоохранения спектра медицинских средств экстренной профилактики и лечения лихорадки Эбола на сегодняшний день являются препараты на основе вирусспецифических антител, в том числе и гетерологичные иммуноглобулины с высоким титром вируснейтрализующих антител (далее - ВНА) [http://apps.who.int/gho/data/node.ebola-sitrep].
Показана возможность использования лошадей в качестве продуцентов гипериммунной сыворотки против вируса Эбола [Краснянский В.П., Михайлов В.В., Борисевич И.В., Градобоев В.Н., Евсеев А.А., Пшеничнов В.А. Получение гипериммунной лошадиной сыворотки против вируса Эбола //Вопр. вирусол. - 1995. - №3. - С. 138-140]. После первичного введения лошадям вируса в диапазоне доз от 2,5⋅107 до 6,0⋅109 БОЕ титры специфических ВНА в сыворотке крови животных определяли в диапазоне от 1:4 до 1:64. Повторные введения вируса Эбола в тех же дозах позволяют значительно повысить уровень иммунного ответа у продуцентов, что позволяет получать от них гипериммунные сыворотки с титром ВНА до 1:4096.
На основе гипериммунной сыворотки из крови лошадей разработан иммуноглобулин против лихорадки Эбола, жидкий [Борисевич И.В., Краснянский В.П., Михайлов В.В. и др. Разработка и изучение свойств иммуноглобулина против лихорадки Эбола // Вопр. вирусол. - 1995. - №6. С. 270-273], разрешенный для медицинского применения. Препарат зарегистрирован в Государственном Реестре лекарственных средств и разрешен для медицинского применения и промышленного выпуска в РФ (регистрационное удостоверение №96/309/123/8) [Государственный Реестр лекарственных средств. М.: Медицина, 1996].
Способ получения иммуноглобулина против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей, включает наработку биомассы штамма Заир вируса Эбола на основе плодиков инфицированных, развивающихся куриных эмбрионов, проведение иммунизации лошадей, взятие гипериммунной крови у лошадей-продуцентов, получение сыворотки, выделение иммуноглобулинов методом осаждения этиловым спиртом на холоду, концентрирование, стерилизующую фильтрацию, фасовку и упаковку готового препарата. Указанный способ обеспечивает получение нетоксичного стерильного средства экстренной профилактики против лихорадки Эбола со специфической активностью, выражающейся титром вируснейтрализующих антител (ВНА) не ниже 1:4096, содержанием гамма-глобулиновой фракции не ниже 90%, содержанием примесей посторонних белков не более 10%. Препарат иммуноглобулина содержит остаточное количество этилового спирта (не более 4%.). [Борисевич И.В., Краснянский В.П., Михайлов В.В. и др. Разработка и изучение свойств иммуноглобулина против лихорадки Эбола. Вопр. вирусол. 1995; 6: 270-273].
Недостатком разработанного препарата является его высокая анафилактогенность (индекс анафилаксии по Вейглу 2,5±0,5), обусловленная наличием в получаемом конечном продукте большого количества посторонних белков сыворотки крови (до 10% альбуминов, α- и β-глобулинов). Эти компоненты, а также остаточное количество (до 4%) этилового спирта повышают реактогенность препарата [Иммуноглобулин против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей, жидкий: ФСП 42-0102-0242-00, ФС 42-0030-00. Введ. 2000-07-26. М.: Департамент Государственного контроля качества, эффективности, безопасности лекарственных средств и медицинской техники МЗ РФ, 2000].
Так же разработан способ получения иммуноглобулина против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей, обеспечивающий получение конечного продукта с более высоким содержанием мономерной фракции иммуноглобулина (не менее 95%) и меньшим количеством посторонних фракций димеров, полимеров и агрегатов (не более 5%), а также отсутствием остаточного этилового спирта [Пат. 2018 г. Способ получения иммуноглобулина против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей, жидкого //А.Ю. Попова, Ю.В. Демина, В.Ю. Смоленский, Е.В. Гордеев, Е.В. Рождественский, В.П. Краснянский, Д.А. Кутаев, В.Б. Пантюхов, Н.К. Черникова, С.А. Мельников, С.В. Борисевич, И.В. Борисевич, С.А. Нимирская, Я.В. Полянский, С.В. Назаров, Г.Д. Тиманькова, А.Ю. Зверев, В.В. Осин, А.Ф. Андрус, С.И. Сыромятникова, И.В. Шатохина, Т.Е. Сизикова, И.Г. Румянцева, заявитель и патентообладатель ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России]. Данный способ рассматривается нами в качестве прототипа к заявленному изобретению.
Общими с прототипом признаками являются наличие стадий приготовления антигена из вирулентного штамма Заир вируса Эбола для иммунизации лошадей, взятие крови, содержащей специфические антитела к вирусу Эбола, получение иммунной сыворотки с использованием 30% раствора хлористого кальция, стерилизующая фильтрация, фасовка и упаковка.
Заявленный способ отличается от прототипа тем, что выделение иммуноглобулина из лошадиной иммунной сыворотки проводят методом осаждения путем добавления сульфата аммония, а не осаждением этиловым спиртом нахолоду, для очистки используют сочетание аффинной и гель-фильтрационной хроматографии, а не ионообменной и гель-фильтрационной хроматографии. Доля мономеров иммуноглобулина в конечном препарате при заявляемом способе составляет 97,5±0,5%, при прототипом способе - 95,0±0,5% (различия достоверны с вероятностью р<0,01). В способе-сравнении предполагается оценка с помощью ВЭЖХ только конечного препарата, в заявленном способе ВЭЖХ проводят как после аффинной, так и после гель-фильтрационной хроматографии.
Целью настоящего изобретения является разработка способа получения иммуноглобулина против лихорадки Эбола, обеспечивающего получение конечного продукта со степенью очистки не менее 97%, что позволяет минимизировать анафилактогенность и реактогенность готового препарата.
Технический результат изобретения
Заявленный способ обеспечивает получение иммуноглобулина против лихорадки Эбола лошадиного очищенного с высоким содержанием мономерной фракции иммуноглобулина (не менее 97%) и количеством посторонних фракций димеров, полимеров и агрегатов (не более 3%), что снижает анафилактогенность иммуноглобулина (индекс анафилактогенности ≤1,0) и приводит качество препарата в соответствие с требованиями Европейской Фармакопеи к гетерологичным препаратам [Европейская Фармакопея 7.0.Том 1, 2010: 1273 с.].
Указанный технический результат достигается за счет того, что выделение иммуноглобулина из лошадиной иммунной сыворотки проводят методом осаждения путем добавления сульфата аммония, очистку иммуноглобулина проводят в два этапа, для первого этапа очистки применяют аффинную хроматографию на сорбенте Protein G и скорости подачи образца 60 см ч-1 с последующей элюцией на скорости потока 100 см ч-1 100 мМ раствором глицина, рН 2,7, для второго этапа применяют гель-фильтрационную хроматографию на сорбенте Superdex 200 c разделением белков в изократическом режиме элюирования фосфатно-солевым буфером, рН 7,2, при скорости потока 50 см ч-1.
Сущность изобретения заключается в том, что способ получения гетерологичного иммуноглобулина против лихорадки Эбола предполагает выделение иммуноглобулина из лошадиной иммунной сыворотки методом осаждения путем добавления сульфата аммония, двухэтапную очистку иммуноглобулина с применением аффинной и гель-фильтрационной хроматографии, а также концентрирование раствора иммуноглобулина в тангенциальном потоке с использованием кассеты с пределом эксклюзии мембраны 50 кДа.
Стадия аффинной хроматографии с использованием сорбента Protein G позволяет выделить из осажденной сульфатом аммония смеси глобулинов сыворотки крови лошади фракцию иммуноглобулина G, удалить сульфат аммония, остатки альбумина, а также фракции эуглобулинов.
На следующем этапе очистки с помощью гель-фильтрационной хроматографии от целевого продукта отделяют высокомолекулярные фракции димеров и полимеров антител и низкомолекулярные фрагментарные фракции, которые снижают качество иммуноглобулинов, а также происходит переход на конечный буферный раствор.
Предлагаемый способ является новым, поскольку из общедоступных сведений в Российской Федерации неизвестен аналогичный способ получения гетерологичного иммуноглобулина против геморрагической лихорадки Эбола.
Предлагаемое техническое решение имеет изобретательский уровень, поскольку из уровня техники явным образом не следует, что использование совокупности используемых методических приемов обеспечивает получение высокоочищенного иммуноглобулина с долей мономерной фракции 97,5±0,5%.
Предлагаемое техническое решение промышленно применимо, поскольку для его реализации может быть использовано типовое оборудование, а также широко распространенные в вирусологических и молекулярно-генетических исследованиях реактивы и материалы.
Изобретение иллюстрируют следующие табличные и графические материалы.
В таблице 1 представлены результаты количественной оценки процесса получения специфического гетерологичного иммуноглобулина против лихорадки Эбола двухстадийным методом аффинной хроматографии и гель-фильтрации.
В таблице 2 представлена сравнительная характеристика показателей качества иммуноглобулинов против лихорадки Эбола, полученных разными методами.
В таблице 3 представлена оценка гиперчувствительности немедленного типа при введении хроматографически очищенного иммуноглобулина против лихорадки Эбола и иммуноглобулина, полученного спиртовым осаждением.
В таблице 4 представлены результаты сравнения протективных свойств препаратов хроматографически очищенного иммуноглобулина и препарата, полученного методом спиртового осаждения.
На фиг. 1 представленахроматограмма ВЭЖХ исходной гипериммунной лошадиной сыворотки против вируса Эбола.
На фиг. 2 представленахроматограмма аффинной очистки препарата иммуноглобулина на колонке ХК 26/40 с сорбентом Protein G Sepharose6 FF
На фиг. 3 Хроматограмма ВЭЖХ иммуноглобулина G к вирусу Эбола после стадии аффинной препаративной очистки
На фиг 4 Хроматограмма ВЭЖХ IgG после стадии препаративной гель-фильтрации на сорбенте Superdex 200 prepgrade
На фиг. 5 Хроматограмма ВЭЖХ IgG после стадии гель-фильтрации На фиг.6 Хроматограмма иммуноглобулина G, из сыворотки крови лошадей фирмы Rockland(США)
Пример выполнения 1. Выделение иммуноглобулина G методом осаждения сульфатом аммония
Лошадиную сыворотку содержащую антитела к вирусу Эбола разбавляли буфером 20 мМТрис, рН 8,0, в соотношении 1:1. К полученному раствору по каплям добавляли насыщенный (4,32 М) раствор сульфата аммония (в соотношении 1:2) в течение 60 минут, в результате чего достигали 50% насыщения раствора. При этом гамма глобулиновые фракции сыворотки крови лошади выпадают в осадок, а в растворе остаются альбумины. Для получения осадка проводили центрифугирование полупродукта при 3000 об мин-1 в течение 30 минут. Полученный осадок растворяли в соотношении 1:100 буфером, содержащим 16 мМ Na2HPO4 и 4 мМ NaH2PO4 (буфер А), рН раствора доводили до значения 7,0 1 М раствором гидроксида натрия. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически по методу Бредфорда на спектрофотометре GeneQuant1300 (GEHealthcare, Швеция). Далее раствор (для отделения от липидов и липопротеинов) фильтровали через стекловолоконный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.
Полученный препарат соответствовал следующим показателям:
Концентрация общего белка - 21,4 мг мл-1;
Содержание иммуноглобулина G - 88,2%;
Выход по мономерной фракции иммуноглобулина G - 89,3%;
Титр ВНА - 1:2048.
Пример выполнения 2. Очистка методом аффинной хроматографии
Очистка методом аффинной хроматографии на сорбенте Protein G включает следующие стадии:
- уравновешивание колонки буфером А;
- нанесение образца на колонку;
- промывание колонки буфером А для удаления не связавшихся с сорбентом белков;
- элюция с колонки фракции целевого белка.
Для хроматографической очистки препарат наносили на колонку со скоростью потока 60 см⋅ч-1. Белковые компоненты, не связавшиеся с сорбентом, выходят с потоком, объем которого составляет 1,1 от объема нанесенного препарата. Связавшийся с сорбентом специфический иммуноглобулин элюировали с колонки 100 мМ раствором глицина, рН 2,7 (буфер Б) со скоростью потока 100 см⋅ч-1.
Полученный препарат соответствовал следующим показателям:
Концентрация общего белка - 50 мг-мл-1;
Содержание иммуноглобулина G - 92,1%;
Выход по мономерной фракции иммуноглобулина G - 92,0%;
Титр ВНА - 1:4096.
Пример выполнения 3. Очистка методом гель-фильтрационной хроматографии
Заключительную очистку проводили с помощью препаративной гель-фильтрации на колонке ХК 26/70, наполненной сорбентом Superdex 200 prepgrade (GEHealthcare, Швеция). Разделение белков проводили в изократическом режиме элюирования фосфатно-солевым буфером, рН 7,2, при скорости потока 50 см⋅ч-1. Фракции мажорных пиков объединяли и концентрировали в тангенциальном потоке на мембранах с пределом эксклюзии 50 кДА (Millipore, Франция) до конечной концентрации 5%. Данный способ позволяет разделить белковые молекулы в зависимости от их молекулярных масс, благодаря большей скорости прохождения через сорбент тяжелых молекул по сравнению с более легкими фрагментами.
Полученный препарат соответствовал следующим показателям:
Концентрация общего белка - 50 мг⋅мл-1;
Содержание иммуноглобулина G - 98,6%;
Выход по мономерной фракции иммуноглобулина G - 97,5%;
Титр ВНА - 1:8192.
Пример выполнения 4. Проведение эксклюзионной ВЭЖХ для оценки молекулярных параметров иммуноглобулина против лихорадки Эбола
Использовали хроматографическую колонку Agilent BioSEC-3, размер 300⋅7,8 мм, диаметр частиц 3 мкм (Agilent, США), которая позволяет разделить белки в диапазоне молекулярных масс от 10 до 600 кДа. Исследование проводили на хроматографической системе Agilent 1260 Infinity с диодно-матричным детектором. Испытуемые образцы доводили до концентрации 5 мг⋅мл-1 раствором, содержащим 20 мМ натрия дигидрофосфата моногидрата и 0,2% глицина (данный раствор используют так же в качестве плацебо).
Объем пробы - 20 мкл. Содержание белка - около 100 мкг. Скорость потока - 0,5 мг⋅мл-1. Длина волны детектирования - 280 нм. Последовательность ввода проб: П-С1-С2-О1-О2-О3-С1-С2, где П - плацебо, C1 и С2 - растворы стандартных образцов лошадиного и человеческого иммуноглобулинов соответственно, О1, O2, О3 - испытуемые образцы иммуноглобулинов (серии №2, 3, 4). Инжекции испытуемых образцов повторяли трижды для каждой серии.
Пример выполнения 5. Концентрирование и стерилизующая фильтрация
Для доведения содержания иммуноглобулина в препарате до нормативного - 30 мг/мл (3% раствор) после второго этапа хроматографической очистки полупродукт иммуноглобулина концентрировали на установке с тангенциальным потоком Sartoflow Smart с использованием кассеты Sartocon Slice (Sartorius®, Германия) (мембрана PESU с размером пор 50 кДа).
Раствор с помощью перистальтического насоса подавали в рециркуляторный бак и далее на мембрану кассеты. Пермиат, содержащий раствор солей, по отводящим трубкам поступал в сборник и утилизировался, а концентрат (частицы размером больше 50 кДа), содержащий целевой белок, возвращался в рециркуляторный бак. Разница давления на входе и выходе при фильтровании автоматически поддерживалась на уровне одного бара. Из одного литра иммуноглобулина получали около 100 мл концентрированного препарата (концентрирование в 10 раз).
Стерилизующую фильтрацию раствора иммуноглобулина проводили под давлением, не превышающем 0,2 Мпа, при помощи перистальтического насоса, со скоростью потока 0,025 л/мин, через комбинированный стекловолоконый-полиэфирсульфоновый фильтр Sartolab P20Plus (Sartorius®, Германия) с размером пор 0,2 мкм.
Разработанный образец иммуноглобулина против лихорадки Эбола представляет собой препарат с содержанием мономерной фракции иммуноглобулина 97,5±0,5%, доля димеров иммуноглобулина не более 2,3%, полимеров и агрегатов не более 0,2%.
Стерильный препарат разливали в стеклянные флаконы по 5 мл.
Пример выполнения 6. Сравнительное определение гиперчувствительности немедленного типа для полученного препарата иммуноглобулина
При проведении экспериментов использовали беспородных морских свинок разнополых массой от 250 до 350 г. из питомника ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России.
Морским свинкам в область подмышечной впадины внутрикожно вводили 0,1 мл исследуемого иммуноглобулина. Через 30 мин регистрировали отек или покраснение в месте введения и измеряли его диаметр. Проведено сопоставление величин диаметра отека или покраснения в месте введения препарата и содержанием мономеров иммуноглобулина. Данные, полученные при анализе хроматографически очищенного препарата иммуноглобулина, и препарата, полученного спиртовым осаждением по Кону, представлены в таблице 3.
Как следует из представленных данных, между сравниваемыми показателями установлена коррелятивная зависимость. Полученные результаты указывают на необходимость использования параметров, полученных с помощью ВЭЖХ, при разработке гетерологичных иммуноглобулинов против особо опасных инфекционных заболеваний вирусной этиологии.
Пример выполнения 7. Определение протективных свойств полученного препарата иммуноглобулина в отношении геморрагической лихорадки Эбола при использовании по схеме экстренной профилактики.
Проведено сравнительное изучение протективных свойств препарата хроматографически очищенного иммуноглобулина и препарата иммуноглобулина, полученного спиртовым осаждением по Кону.
Испытания защитной эффективности препаратов при введении по экстренно-профилактической схеме проводили на морских свинках. При проведении испытаний использовали серию №3 хроматографически очищенного иммуноглобулина и серию №8 иммуноглобулина, полученного методом спиртового осаждения. В экспериментах использовали морских свинок массой от 250 до 350 г из питомника ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России. Животных делили на две опытные группы: - введение инфицированным свинкам испытуемых препаратов иммуноглобулина (группы 1 и 2) и четыре контрольные группы: - инфицированные животные без последующего введения иммуноглобулина (группа 3): неинфицированные животные с введением хроматографически очищенного иммуноглобулина (группа 4): - неинфицированные животные с введением иммуноглобулина, полученного методом спиртового осаждения по Кону (группа 5): - чистые животные (группа 6). Животных групп 1-3 внутримышечно инфицировали адаптированным к морским свинкам штаммом вируса Эбола в дозе 50 БОЕ(≈20ЛД50МСВБ). [Патент РФ №2749345 на изобретение «Адаптированный для морских свинок штамм ЭЗМС 2020 вируса Эбола-Заир, предназначенный для проведения доклинических испытаний МСЗ в отношении геморрагической лихорадки Эбола, авторы Сизикова Т.Е., Сыромятникова СИ., Шатохина И.В., Боярская Н.В., Шагарова Н.В., Левкович Н.Г., Румянцева И.Г., Андрус А.Ф., Чифанов Д.Е., Чухраля О.В., Ковальчук А.В., Пантюхов В.Б., Борисевич С.В.].Через час после инфицирования животным в место инъекции вируссодержащего материала вводили 1,0 мл препарата иммуноглобулина. Животным групп 4 и 5 вводили 1,0 мл препарата иммуноглобулина. Наблюдение за животными проводили в течение 21 суток. Специфичность гибели подтверждали выявлением РНК вируса Эбола в печени погибших животных с помощью ОТ-ПЦР-РВ.
Как следует из полученных данных, для обоих изучаемых видов гетерологичного иммуноглобулина установлена высокая защитная эффективность, что позволяет сделать вывод о том, что примененный процесс очистки не оказывает влияния на его протективные свойства.
Claims (1)
- Способ получения высокоочищенного гетерологичного иммуноглобулина жидкого против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей, включающий приготовление антигена из вирулентного штамма вируса Эбола, получение иммунной крови, получение иммунной сыворотки с использованием 30% раствора хлористого кальция, выделение иммуноглобулина, очистку и концентрирование методом хроматографии, фасовку и упаковку, отличающийся тем, что выделение иммуноглобулина из лошадиной иммунной сыворотки проводят методом осаждения путем добавления сульфата аммония, очистку иммуноглобулина проводят в два этапа, для первого этапа очистки применяют аффинную хроматографию на сорбенте Protein G при скорости подачи образца 60 см⋅ч-1 с последующей элюцией на скорости потока 100 см⋅ч-1 100 мМ раствором глицина, рН 2,7, для второго этапа применяют гель-фильтрационную хроматографию на сорбенте Superdex 200 с разделением белков в изократическом режиме элюирования фосфатно-солевым буфером, рН 7,2, при скорости потока 50 см⋅ч-1.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2815252C1 true RU2815252C1 (ru) | 2024-03-12 |
Family
ID=
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2302424C1 (ru) * | 2005-10-31 | 2007-07-10 | Михаил Борисович Раев | Способ выделения и очистки альфа-фетопротеина |
| RU2346047C2 (ru) * | 2001-12-14 | 2009-02-10 | Астерион Лимитед | Химерный полипептид - антагонист рецептора гормона роста, нуклеиновая кислота, экспрессирующий вектор, применение химерного полипептида (варианты), фармацевтическая композиция, клетка, способ получения химерного полипептида и способ лечения |
| US20120214976A1 (en) * | 2005-06-21 | 2012-08-23 | Cytos Biotechnology Ag | Scalable Process for Protein Purification |
| RU2673546C1 (ru) * | 2017-08-10 | 2018-11-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт" Министерства обороны Российской Федерации | Способ получения иммуноглобулина против лихорадки эбола из сыворотки крови лошадей, жидкого |
| CN112898413A (zh) * | 2021-04-07 | 2021-06-04 | 杭州奕安济世生物药业有限公司 | 采用亲和层析纯化减少抗体聚集的方法 |
| RU2770425C2 (ru) * | 2020-06-15 | 2022-04-18 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт" Министерства обороны Российской Федерации | Способ получения иммуноглобулина противооспенного из сыворотки крови лошадей |
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2346047C2 (ru) * | 2001-12-14 | 2009-02-10 | Астерион Лимитед | Химерный полипептид - антагонист рецептора гормона роста, нуклеиновая кислота, экспрессирующий вектор, применение химерного полипептида (варианты), фармацевтическая композиция, клетка, способ получения химерного полипептида и способ лечения |
| US20120214976A1 (en) * | 2005-06-21 | 2012-08-23 | Cytos Biotechnology Ag | Scalable Process for Protein Purification |
| RU2302424C1 (ru) * | 2005-10-31 | 2007-07-10 | Михаил Борисович Раев | Способ выделения и очистки альфа-фетопротеина |
| RU2673546C1 (ru) * | 2017-08-10 | 2018-11-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт" Министерства обороны Российской Федерации | Способ получения иммуноглобулина против лихорадки эбола из сыворотки крови лошадей, жидкого |
| RU2770425C2 (ru) * | 2020-06-15 | 2022-04-18 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт" Министерства обороны Российской Федерации | Способ получения иммуноглобулина противооспенного из сыворотки крови лошадей |
| CN112898413A (zh) * | 2021-04-07 | 2021-06-04 | 杭州奕安济世生物药业有限公司 | 采用亲和层析纯化减少抗体聚集的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1031328A (zh) | 制备鼻内施用疫苗的方法 | |
| JP2013535483A (ja) | Ｐ２４タンパク質の産生を阻害するか又は排出を促進する医薬組成物及び方法 | |
| EP0102731A2 (en) | Methods for preparation of hepatitis B surface antigen free gamma globulins and products | |
| US9945868B2 (en) | Method for determining degree of modified potency of bipathic medicament | |
| RU2815252C1 (ru) | Способ получения очищенного гетерологического иммуноглобулина против лихорадки Эбола | |
| Ehrnst et al. | Fluctuations and distribution of measles virus antigens in chronically infected cells | |
| Tokumaru | The protective effect of different immunoglobulins against herpetic encephalitis and skin infection in guinea pigs | |
| Schmidt et al. | The complement-fixing antigen of rubella virus. | |
| RU2673546C1 (ru) | Способ получения иммуноглобулина против лихорадки эбола из сыворотки крови лошадей, жидкого | |
| RU2130318C1 (ru) | Препарат, содержащий иммуноглобулин против лихорадки эбола, из сыворотки крови лошадей, жидкий (иммуноглобулин эбола) | |
| JPS62192326A (ja) | エイズの予防および治療用免疫グロブリン含有製剤の製造方法 | |
| CN107304230A (zh) | 一种抗犬细小病毒精制抗体及其制备方法 | |
| JPS61502680A (ja) | 生化学的薬剤及びその製造方法 | |
| CN112375142A (zh) | 静注新型冠状病毒人免疫球蛋白的制备方法 | |
| RU2770425C2 (ru) | Способ получения иммуноглобулина противооспенного из сыворотки крови лошадей | |
| Geller et al. | Studies on herpes simplex virus: V. The fate of viable herpes simplex virus administered intravenously to man | |
| CN101113177A (zh) | 从血浆或血浆组分中分离纯化抗乙肝免疫球蛋白的方法 | |
| Hofmann et al. | Protection of mice against tick-borne encephalitis by different classes of immunoglobulins | |
| RU2257916C1 (ru) | Препарат, содержащий иммуноглобулин против лихорадки марбург из сыворотки крови лошадей жидкий (иммуноглобулин лошадиный марбург) | |
| EP0308717B1 (en) | Method of treating viral encephalitis | |
| EA044535B1 (ru) | Способ получения иммуноглобулина g против covid-19 | |
| CN1305526C (zh) | 乙型脑炎病毒裂解疫苗及其制备方法 | |
| RU2158136C1 (ru) | Способ получения igm-содержащего концентрата иммуноглобулина | |
| RU2101030C1 (ru) | Способ получения антибруцеллезной сыворотки | |
| RU2381037C1 (ru) | Сывороточный иммунобиологический препарат для экстренной профилактики и лечения сибирской язвы |