CN1031328A - 制备鼻内施用疫苗的方法 - Google Patents

Abstract

抗病毒感染的免疫方法，该方法是鼻内施用免疫 有效量病毒外壳亚单位疫苗，该疫苗是由糖蛋白与脂 类复合组成的。

Description

副流感病毒是副粘液病毒组的成员之一，该组还包括流行性腮腺炎病毒和新城病病毒。人类的3型副流感病毒（PI3：血吸附1型）可能是造成（特别是儿童中）严重呼吸道疾病的副流感病毒类中的最常见者。副流感病毒1型和2型具有相似的流行病形式，并且经常造成1-4岁儿童的哮吼。已经报道了副感冒病毒1-4型之间的免疫原性关系以及副流感病毒与流行性腮腺炎病毒之间的免疫原性关系，尽管对有关的蛋白组成的情况所知有限。

以往已经报道过用福尔马林灭活的病毒对儿童进行免疫以抵抗副流感病毒性侵染的各种尝试，但是这类制剂均没有提供有效的保护。随后的有关免疫抵抗副粘液病毒的研究结果倾向于指明用化学处理灭活病毒可能破坏一些负责诱导保护性免疫应答的重要抗原位点。

另外还提出的有用修饰的活病毒免疫以抵抗呼吸道病原体。已经尝试过的有通过鼻内施用稀释的病毒以及用更常规的途径如皮下、腹腔内、肌肉和静脉内等。在这些情况中，通过鼻腔内施用稀释病毒所引起的免疫应答不能被认为是意想不到的，因为疫苗中的修饰的活病毒遵循野生型病毒的天然感染途径，通过临床症状不明显的感染来造成免疫性。然而，用修饰的活病毒进行免疫会留下一些危险，因为既便是无毒性的但仍然活着的病毒在施给受者后仍然可能回复到其毒性 状态。

以前已经报道的过，副粘液病毒的外壳糖蛋白HN和F是负责感染过程的开始和进展的。有关研究表明，这些糖蛋白的抗体在防止感染方面是有效的。

我们以前报道过发现了由人类3型副流感病毒包被糖蛋白与脂肪复合所得的新型病毒性亚单位疫苗能够诱发抗体反应，该反应比由原先所用的福尔马林灭活病毒性疫苗制剂所获得的反应更为优越（Ray    et    al.，J.Infect.Dis.，152：1219-1230〔1985〕）。对使用这种新型亚单位疫苗的研究表明，一次皮下免疫就可以完全不受感染（同上）。还发现分离出的病毒性糖蛋白亚单位疫苗（由糖蛋白-脂肪复合囊组成）比在此之前所提出的亚单位疫苗易制备。而原有的亚单位疫苗分离时所用的方法使其不含脂肪。例如，参见美国专利第4344935号和4356169号以及Morein    et    al.，J.Gen.Virol.64：1557-1569（1983）。糖蛋白-脂肪复合物表现出这种产生免疫性的异常能力是令人惊奇的，因为一般均认为脂肪是非抗原性的，因而，当其存在于疫苗组合物中时，将被认为会减低免疫有效力。

我们的病毒性糖蛋白亚单位疫苗，其制备方法和应用方法是共悬未决的美国专利申请号    ，于19    年申请的。

在我们的亚单位疫苗的制备方法中，为获得所需抗体反应的基本抗原性位点并不经化学修饰，其结果是抗原性不受损害。再者，我们的疫苗制剂不含任何病毒性基因组，因此，免去了感染的危险。由此，我们的亚单位疫苗具有独特的超过化学灭活病毒疫苗和修饰的活病毒疫苗的优点。然而，迄今为止，还没有把鼻腔内施用病毒性外壳 亚单位疫苗作为有效的抗侵染方法。因为亚单位疫苗不含病毒基因组，因而使用这种疫苗时不会产生临床症状明显的和临床症状不明显的感染。由此可知，前述鼻腔内施用修饰的活病毒疫苗并不意味着如同我们的由来自病毒的双层脂膜和两个外壳糖蛋白所组成的亚单位疫苗可以通过鼻腔内应用诱发免疫性。

本发明提供了鼻腔内施用病毒性糖蛋白亚单位疫苗的方法，其可以使疫苗的受者提高保护性免疫应答。在鼻腔内免疫后，对病毒性糖蛋白亚单位疫苗的全身性和局部性抗体反应均得到提高。这一结果与用同样抗原剂量进行皮下免疫的结果正好相反，皮下免疫能引起全身性抗体反应的明显升高，但只能引起支气管道的中度的局部反应，因而，只产生有限的抗感染作用。

在本申请的附图中：

图1表示用蜜二糖（0.1M）洗脱结合在固定化Jacalin柱上的仓鼠血清蛋白的洗脱情况。

图2表示从分析兔抗仓鼠IgA抗血清所得到的免疫电泳图谱。

图3表示在不同试验动物组中，³⁵S-蛋氨酸标记的3型副流感病毒侵染的LLC-MK₂细胞溶胞物与支气管洗出物的免疫沉淀结果。

图4以图形给出在对照组中的试验动物组中用3型副流感病毒攻击后，IgA类特异性抗体对在支气管洗出物中出现的病毒外壳蛋白的相对量。

任何具有抗原性糖蛋白组分的含脂类病毒均属适用于本发明方法的材料。糖蛋白-脂类复合物的脂类组分是从产生病毒的宿主细胞中得到的。当在宿主细胞中组合外壳时，脂类就随着病毒特异性蛋白结合到病毒外壳中。疫苗的制备方式造成糖蛋白和脂类形成松散的复合 物或囊。並非如所预料到的那样，即脂类会成为所获糖蛋白亚单位疫苗所不需要的组分，而实际上，伴随的蛋白作为佐剂使制剂的免疫性能得到提高。一般而言，形成抗原性脂类-糖蛋白囊的能力是糖蛋白和脂类的化学本性，因此，并不限于任何特殊类型的糖蛋白和脂类。

在较为熟悉的病毒性糖蛋白中，一般被认为是抗原的有2种，即受体-结合糖蛋白和融合糖蛋白。这是由其在宿主细胞的感染过程中的作用而定义的，而且在不同的病毒中会有不同的特定名称。至少一种，且经常是两种均存在于以下熟知的疾病诱发物中，有副粘液病毒、流感病毒、呼吸合胞体的病毒、狂犬病病毒、疱疹病毒以及人体免疫缺陷病毒，而后者则包括获得性免疫综合症（AIDS）的病原。

特别熟知的是所有副粘液病毒组的成员均具有的受体-结合类型的和融合型的糖蛋白。该组包括副流感病毒，麻疹病毒，流行性腮腺炎病毒，呼吸合胞体病毒，新城病病毒以及仙台病毒。在副流感病毒中，这些糖蛋白分别指HN（72000道尔顿）和Fo（54000道尔顿和20000道尔顿），而且被认为是负责附着或血细胞凝集和神经氨酸苷酶活性（HN）以及病毒的侵染（F）过程。这两种糖蛋白均已知是高度抗原性的，因此，特别适合用在本发明的免疫方法中。很明显，由副粘液病毒组的某些成员，特别是副流感病毒、麻疹病毒和流行性腮腺炎病毒所引起的疾病在人类中特别是儿童中传播得很广，因而也许会对患者造成不寻常的有害综合症和（或）副作用。

F糖蛋白至少在副流感病毒中的F糖蛋白是已知可以分出亚单位的。为了本说明的目的，F糖蛋白指其本身或者其亚单位，而这两者均可以是清洁剂溶解的。

虽然在参照自PI3病毒的外壳来的亚单位疫苗描述和给出了本发明方法的例证，但该方法具有更为广泛的用途。据信，按本发明的方法以鼻腔内的方式施用在此所述的病毒性糖蛋白亚单位疫苗，可以有效地抵抗包括副流感病毒、呼吸合胞体病毒、疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒和狂犬病毒在内的副粘液病毒组的侵染，但并不仅限于此。

在实践本发明中所用的亚单位疫苗可以按照本专业领域的技术人员所熟知的技术很容易地制备出来。将所需的病毒通过适合的宿主细胞培养，经纯化去除细胞破碎物，用可透析的清洁剂如胆酸盐或辛基-D-糖苷处理以溶解所需的外壳糖蛋白。重要的是使用可容易透析的清洁剂，以保证在进一步加工成为疫苗时仅有清洁剂被去除。溶解之后，清洁剂溶解的病毒部分通过离心或其它适宜的方式与不溶性核蛋白壳分开。然后将上清液透析，产生由内源性脂肪和病毒性糖蛋白组成的复合物，该复合物组成所获疫苗的致免疫剂。这种病毒性糖蛋白亚单位疫苗的制备方法详见于Ray    et    al.，J.Infect    Dis.，152，PP1219-1930（1985），该文的全部内容通过在此引述而合并于本专利申请的参考文献中。病毒性糖蛋白还可以用遗传工程（例如，使用重组DNA技术）或其它适于本发明目的之技术来生产。

用亲和层析可以使糖蛋白进一步纯化。制备抗人类3型副流感病毒的HN和F糖蛋白的单克隆抗体的过程和使用这些抗体分离和纯化糖蛋白的方法参见Ray    et    al.，Virology，148，PP323-336（1986）和Ray    et    al.，J.Gen    Virol.，68，PP409-18（1987）。这两篇文章所揭示的内容通过在此引述而合并于本申请。本发明专业领域的技术人员非常熟悉用永存细 胞系与对免疫原制剂敏感的淋巴细胞相融合制备杂交瘤细胞系的技术。这样的技术可参见如Douillard，J-Y，和Hoffman，J.，Basic    Facts    Abowt    Hybridomas，Compendium    of    Immunology，Vol.Ⅱ，L.Schwartz（ed.）（1981）;Kohler，G.and    Milstein，C.，Nature    256，495-497（1975）;European    Journal    of    Immunology，Vol.6    PP511-519（1986）;Koprowski    et    al.，U.S.Patent4172124，Koprowski    et    al.，U.S.Patent    4196265，这些文献均通过在此引述而合并于本申请。

就进行亲和层析的独特方法而言，其常用技术的总结可见于Goding，J.W.，Monoclonal    Antibodies：Principles    and    Practice，Academic    Press，（1982）。

按如上所述制备的纯化HN和F糖蛋白，不论其单独或合并使用，均是有用的疫苗。然而，优选的是按所需比例将这两种成分合并于适宜的赋形剂或载体中。以HN∶F为约4∶1-1∶1的比率可获得有效的抗感染作用。

如上所述，与糖蛋白一起存在于疫苗中的脂类显示出可对刺激受体的免疫应答提供意想不到的有益作用。尽管对这种免疫应答的机制还解释不清，但也许是脂类作为辅剂的功能增强了糖蛋白的抗原效应。当用前述方法提取糖蛋白时一起提取出来的存在于病毒外壳中的内源性脂类足以引起适当保护水平的抗体产生。然而，如果用经纯化和分离的糖蛋白制备疫苗，则以加上外源性脂肪为好，这样才能获得与包括天然脂类的未经纯化制剂相同的效果。以这种方法制备亚单位疫苗，则原有的蛋白质-脂肪外壳有效地重建。还发现，加入脂类自 动形成囊泡，其包括HN和F两种外壳糖蛋白和脂类双分子层，因此，模仿了通过溶解病毒外壳然后又透析所获得的产品。这样的方法简便易行，即将脂类溶解在含糖蛋白的可透析的清洁剂溶液中，按前边溶解程序中所述进行溶液透析。采用这样的方式，不仅可能由纯化的蛋白质与外源性脂类结合形成囊泡，而且还可能的是由于将脂类加入到经溶解的蛋白质-脂肪制剂中提高了天然脂类与蛋白质的比率，因而增大了内源性脂类的效应。从本质上讲，任何脂类均可用于重建囊泡产物。在被认为是可用于本发明疫苗的脂类中，有磷脂类，其代表例有卵磷脂、脑磷脂和鞘磷脂。优选的是卵磷脂，特别是蛋黄卵磷脂，其为一种磷脂化的胆碱。

上述亚单位疫苗可以与药理上可接受的载体一起制成鼻腔内用剂，载体包括水、缓冲盐水、乙醇、多元醇（如甘油、丙二醇、液状聚乙二醇等），它们的适当混合物，或植物油。如果需要，可用各种抗菌剂和抗真菌剂来防止微生物的污染，这类药剂有Parabens，氯丁醇、石炭酸、山梨酸、硫汞撒等。制剂中通常以含有等渗剂为好，如葡萄糖或氯化钠。这种制剂可以作为气雾剂或喷雾或以液滴的形式施用于鼻腔内。

本申请中所用“药理上可接受的载体”包括适用于鼻腔内施用病毒性糖蛋白亚单位疫苗的任何和全部的溶剂。分散介质，抗菌剂和抗真菌剂等渗剂和延迟吸收剂等。用这些介质和物质去配合药理活性物质是已知的。除了不能与活性组合共同使用的介质或制剂之外，其余的均可用在药物组合物中。如果需要或期望时，辅助活性组分也可结合到组合物中。

为了便于使用和使用量均匀，将疫苗制成单位剂量的形式就更为 有利。单位剂量形式指的是适宜被免疫对象物理性分散的疫苗单位。每剂量均应含有按产生所需药效计算出的一定数量的活性物质以及所选择的药用载体。本专业领域的技术人员熟知如何确定对某类受者为适宜的疫苗剂量。一般而言，当使用含病毒的HN和F抗原的组合物时，则约10-200μg的剂量可以满足产生所需免疫应答的要求。

含糖蛋白-脂类的病毒对在许多脊椎动物宿主中造成侵染负有责任，上述亚单位疫苗制剂适于给怀疑患有这些侵染的脊椎动物鼻腔内施用。然而，本发明优选的要防止副流感病毒侵染的疫苗对于包括人类在内的哺乳动物宿主是非常有价值的。

以下的各实施例将进一步详细描述本发明。但这些实施例者在说明本发明而不是限制本发明。

实施例1-从3型（PI3）人类副流感病毒制备疫苗

按Ray et al.，J.Infect.Dis，同上，PP1220-21所述的方法培养LLC-MK₂细胞（猕猴肾）制备疫苗，并按其所述确定蛋白质量。在清洁剂溶解组分中有总病毒蛋白的约三分之一可以被回收。这一物质表现出显著的HA效价（1∶320）。

实施例2-免疫受试动物

A.剂量对免疫保护的影响

三组受试动物（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组）用不同剂量的如实施例1制备的疫苗按每周一次连续四周鼻腔内免疫。将所需的100μg疫苗通过两个鼻孔按等份缓慢滴入。施药完成之前，将动物的舌头约束住以使被吞咽的疫苗为最少。另一平行组（Ⅳ）包括未免疫的对照动物。最后一次免疫21天后用100μg含10⁵P.f.u。活病毒在鼻 腔内对动物攻击。侵染70小时后，处死被侵染的仓鼠，收集血液用于制备血清。

通过缓慢滴注和用18号针头及注射器从气管吸入1ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）收集，每只仓鼠的支气管排出物。支气管排出物经离心澄清后，按等份冷冻储存。取出动物的气管和肺，悬浮于含1%BSA血清白蛋白的2ml    Dulbecco氏培养基中，并冷冻保存备用。

按Ray    et    al.，J.Infect.Dis.，同上，PP1220所述的方法对仓鼠肺匀浆物进行噬菌斑检测。在经鼻腔免疫后又受侵染攻击的肺中没回收到病毒。

相反，未免疫的试验但动物如前报道CId.1226-27页（Ⅳ组）可从组织回收到10⁴Pfu/gm的病毒，上面所述免疫试验的结果见表1A。

B.给药方式对免疫保护的影响：

为进一步用相对低的疫苗量测定预防性免疫应答和比较鼻内和皮下用药，用另外四组仓鼠作试验。用例1制备的疫苗分别皮下和鼻内用药，每周一次，每次用量5μg，用药四次使Ⅴ和Ⅵ组动物免疫。将Ⅶ组只鼻内用药三次，每次用疫苗5μg使其免疫。Ⅷ组作为对照。结果皮下免疫注射的动物仅仅部分免遭感染。Ⅴ组动物肺中的病毒效价比未免疫的对照组低100倍。另一方面，用同样量疫苗鼻内免疫的动物则完全免受感染。Ⅶ组受试动物也仅显示部分保护。本试验结果见表1B。

^＊每组由四个仓鼠组成。

回收病毒用四个仓鼠几何平均效价值表达。

例3：测定局部免疫应答

杀死感染的仓鼠后收集支气管灌洗液，将其用于在Vero单层细胞上进行的PI3病毒噬菌斑中和试验。该试验是根据Ray等人在J.Infect.Dis.，Supra，1121-1122页上叙述的步骤进行的。试验结果是以抑制生成50%斑的血清最高稀释度的倒数来表示，见表2。结果表明每次用5μg例1制备的疫苗鼻内免疫三次或，每次用5μg该疫苗皮下免疫注射10次的动物，其中和效价有两倍变差，而且是部分免受感染。相反，用5μg，10μg或20μg鼻内免疫注射四次的动物，其支气管灌洗液显示大于20的互补中和效价，而且完抗感染。

根据Ray等人在J.Infect.Dis.，Supra.1221页所述步骤，用HI试验进行受试动物血清和支气管灌洗液抗-HN抗体试验。结果见表2。皮下免疫注射动物的血清，其互补效价为16，而支气管灌洗液没有HI活性。然而，用高量的糖蛋白鼻内免疫的动物（用10μg或20μg，四次），其支气管灌洗液和血清均测出HI活性。

用免疫沉淀分析支气管灌洗液，测定局部抗体对病毒多肽的比活性。在该分析中，用PI3病毒感染LLC-MK₂细胞，再用³⁵S-蛋氨酸在感染后30小时标记感染细胞3小时。用溶菌缓冲液溶解细胞，在13，000g下离心5分钟，将澄清溶菌液用作病毒多肽材料。将支气管灌洗液（100μl）与溶菌液混合，加入预先涂盖山羊抗仓鼠全血清的蛋白A-琼脂糖CL-4B珠，得到免疫沉淀。广泛地洗琼脂糖珠，用SDS-PAGE分析，再用Ray等人在J.Infect.Dis，Supra，1222页上所述的荧光法分 析 。

对从每组仓鼠得到的典型样品进行的免疫沉淀分析见图3。PI3病毒³⁵S-蛋氨酸标记多肽的图象出现在1道，Ⅰ和Ⅵ组仓鼠支气管灌洗液免疫沉淀的图象分别在2到7道，这些图象均在10%SDS PAGE上自显影的。8道是疱疹性口炎病毒的多肽，是作为分子量标志。

用不同剂量的糖蛋白鼻内免疫仓鼠的支气管灌洗液可有效地沉淀HN和F多肽（4、5、6和7道），HN（68K）沉淀强度似乎比F₁（54K）高。由此结果很难定量测出该抗体对这些糖蛋白的应答，因为不能鉴定出高分子量带（＞68K），所以只能代表未切的融和蛋白（FO）和HN及F的同质或异质的多聚体。也发现皮下免疫动物的支气管灌洗液也能沉淀HN和F₁，但与鼻内免疫动物相比，沉淀强度低得多。用高剂量糖蛋白鼻内免疫动物的支气管灌洗液免疫沉淀中，发现核壳蛋白M多肽（5、6和7道），估计是由于它们存在于用作疫苗免疫制剂中。

^＊用8HAU病毒测定效价，以四个动物的平均值表达。 例4：比较局部与系统应答

为进一步分析免疫应答，需要用酶联免疫试验（ELISA）测定血清和支气管灌洗液中HN和F的抗体。其试验结果见表3。分别测定血清和支气管灌洗液对HN和F的特异抗体应答。将亲和层析纯化的HN和F分别用于涂盖ELISA盘。用含1%BSA的硼酸盐-盐水在加入被测样品前固定抗原涂盖的盘。用2倍稀释的系列血清或支气管灌洗液在抗原涂盖的穴中温育。将家兔抗仓鼠全血清用作测定总体Ig对病毒糖蛋白应答的第二抗体。用家兔抗血清测定IgA类特异抗体对仓鼠IgA的应答。

用Jacalin（Pierce化学公司，Rockford，IL）作试剂进行凝集素亲合层析从混合血清中制备抗仓鼠IgA家兔抗血清所需的仓鼠IgA。Jaealin是一种α-D-半乳糖结合凝集素，它是从Jack（一种类似面包树的树）果中的种子萃取的，可与人IgA特异结合。固定在琼脂糖珠上的Jacalin包装在一个特制的小塑料柱中（Biorad实验室，Richmond，CA）该柱体积为4ml。用柱体积5倍的pH7.4的PBS洗该柱。将混合的仓鼠血清（6ml）对PBS透析，再通过Jacalin柱缓慢地循环四次。用10倍体积的PBS洗柱，再用含0.1M蜜二糖（Sigma化学公司.，St.bouis，MO），的PSB洗脱结合蛋白，监测收集吸收率为280mm部分，在火棉胶袋中浓缩（Schleicher和Schuell产品，Keene，NH）。

用蜜二糖洗脱结合在Jacalin柱上的仓鼠血清蛋白，显示一个狭峰（见图1）。家兔抗血清随蛋白纯度而上升显示在免疫扩散试验中有一强的沉淀素带。由于有从Jacalin柱洗脱的杂质血清蛋白存 在，可观察到一个附加弱沉淀素带。用免疫电泳（IEP）进一步分析说明家兔抗血清与仓鼠IgG（H和L链特异的）交叉反应。通过琼脂糖凝胶4B-仓鼠IgG柱反复吸附家兔抗血清，再用IEP监测收集（见图2）及抗纯化仓鼠IgG的ELISA使该交叉反应性消除了。如图2所示，抗纯化IgA（1道）的家兔抗血清和吸附在仓鼠IgG（3道）的抗血清都分别与电泳后仓鼠IgG（a和c穴中）及仓鼠全血清（b穴）反应。抗仓鼠IgG的山羊抗血清用作对照（2道）。与仓鼠IgA和IgG出现沉淀弧的位置已用箭头标出。与IgA出现的沉淀弧的残余部分可能是由于在Jacalin柱上得到的IgA中存在仓鼠血清蛋白的杂质。

这样得到的IgA用于诱导高免疫家兔抗血清。用纯化IgA，每周一次、每次100μg皮内免疫家兔三次。头一次免疫需用弗氏完全佐剂Difco实验室，Detoit，MI）乳化蛋白。第二次免疫则用弗氏不完全佐剂，而第一次用无佐剂的纯IgA，每次用同样量蛋白，均皮下给药。再将另一些家兔用100μg纯IgA静脉免疫注射，最后一次注射的第4天心脏穿刺杀死家兔，制备和贮存其血清。将血清过Sepharose-4B与仓鼠IgG（H&L链特异的）偶联的亲合层析柱（Southern    Biotechnology    Associates，Birmingham，AL）循环四次，吸附出与仓鼠IgG交叉反应部分。用免疫扩散，免疫电泳和ELISA试验分析抗血清，测定其对仓鼠IgA的比活性。

将其与第二抗体-与碱性磷酸盐连接的山羊抗家兔Ig温育后，加入到ELISA盘的穴内。最后，用对-硝基苯基磷酸盐作底物，发生一成色反应，温育后加等体积2N的NaOH中止反应。用分光 光度计（Titertek    Multiskan    RMC，Flow    Laboratories，MCLean，Va）在405纳米处测量其颜色强度。用涂盖Jacalin或山羊抗仓鼠血清（Cappel    Philadelphia，PA）及家兔抗仓鼠IgA（作为第二抗体）的滴定盘测定支气管灌洗液中总体IgA效价。所有ELISA试剂均要预先标定以确定所用合适的稀释度。

根据表3所示ELISA试验结果，用例1的疫苗皮下免疫的动物血清的抗体效价均提高，而在支气管洗液中则为低水平。另一方面，鼻内免疫仓鼠的支气管洗液中观察到较高的抗体应答，其效价随糖蛋白（C、D、E和F组）用量的增加而增加。鼻内免疫动物的血清和支气管洗液中都观察到有糖蛋白特异抗体出现和IgA类对HN和F的特异应答。有趣的是由于用20μg免疫4次的动物与皮下免疫动物血清抗体的Ig和IgA水平相似，所以用较高疫苗量鼻内免疫也产生系统抗体应答。支气管洗液中抗体的ELISA效价比较低，这可能是由于其收集过程稀释了支气管液体。

进而支气管洗液中抗原特异IgA和总体IgA比例。为测定总体IgA效价，需用两种不同试剂-涂盖在ELISA盘的Jacalin和山羊抗仓鼠全血清分别试验支气管洗液。用这两种试验得到相似的效价。分别测定支气管洗液中糖蛋白特异IgA对亲合纯化HN和F的效价，结果见图4。图中光密度对每个不同支气管洗液稀释液作图，得到光密度与不同浓度特异抗原及总体IgA效价成直线关系。特异抗原和总体IgA在同一浓度两个重复下，其光密度乘10代表支气管中特异抗原IgA的百分数。未免疫的（A组），用5μg皮下免疫4次的（B组），用5μg鼻内免疫3次的（C组），用5μg鼻内免疫4次的（D组），用10μg鼻内免疫4次的（E组） 或用20μg鼻内免疫4次的动物，其抗HN和抗F抗体水平用图线表示，上面的线代表每组间的变差。

从图4可看出鼻内免疫的动物显示出对HN（＞15%）和F（＞7%）有明显高的局部IgA应答，而抗HNIgA应答大于抗-F。也用捣碎病毒涂盖在ELISA盘来测试支气管洗液，发现产生相似的IgA应答。从相似试验中看出其它类抗原特异免疫珠蛋白以较低的效价出现。

上述例子的试验结果表明前述糖蛋白亚单位疫苗鼻内给药后在呼吸道中可有效地诱导保护免疫应答。这至少是由于诱导局部抗体产生，特别是IgA类抗体。上面资料进而说明为有效保护机体免受感染，鼻内免疫与皮下免疫相比需要低剂量病毒外壳糖蛋和脂类复合物。

上述本发明实施例不是为了限定实施本发明，不离开其范围及构思的修饰是允许的

Claims (27)

1、抗病毒感染的免疫方法，包括鼻内施用免疫有效量病毒外壳亚单位疫苗，疫苗是由糖蛋白与脂类复合组成。

2、根据权利要求1所述方法，其中为有效免疫施用与脂类复合的受体结合糖蛋白或融合糖蛋白或两者结合。

3、根据权利要求1所述的方法，其中为有效免疫施用与脂类复合的F糖蛋白和HN糖蛋白。

4、根据权利要求1所述方法，其中为有效免疫施用重建到脂类囊中的F糖蛋白和HN糖蛋白。

5、抗选自下组之一病毒感染的免疫方法，该组病毒包括付粘液病毒，流感病毒，呼吸合胞体病毒，狂犬病病毒，疱疹病毒和人类免疫缺陷病毒，该方法包括鼻内施用免疫有效量的该病毒外壳亚单位疫苗，该疫苗是由糖蛋白与脂类复合组成的。

6、根据权利要求5所述方法，其中为有效免疫施用与脂类复合的受体结合糖蛋白或融合糖蛋白或两者结合。

7、根据权利要求5的方法，其中为有效免疫施用与脂类复合的F糖蛋白和HN糖蛋白。

8、根据权利要求5的方法，其中为有效免疫施用重建到脂类囊中的F糖蛋白和HN糖蛋白。

9、抗付流感病毒感染的免疫方法，该方法包括鼻内施用免疫有效量的来自该病毒的病毒外壳亚单位疫苗，该疫苗包括与脂类复合的糖蛋

10、根据权利要求9所述方法，其中为有效免疫施用与脂类复合的受体糖蛋白或融合蛋白或其两者结合。

11、根据权利要求9所述方法，其中为有效免疫施用与脂类复合的F糖蛋白和HN糖蛋白。

12、根据权利要求9所述方法，其中为有效免疫施用重建到脂类囊中的F糖蛋白和HN糖蛋白。

13、抗人付流感3型病毒的免疫方法，该方法包括鼻内施用免疫有效量的来自该病毒的病毒外壳亚单位疫苗，该疫苗包括与脂类复合的糖蛋白。

14、根据权利要求13所述方法，其中为有效免疫施用与脂类复合的受体结合蛋白或融合蛋白或两者的结合。

15、根据权利要求13所述方法，其中为有效免疫施用与脂类复合的F糖蛋白和HN糖蛋白。

16、根据权利要求13所述方法，其中为有效免疫施用重建到脂类囊中的F糖蛋白和HN糖蛋白。

17、根据权利要求1的方法，其中所述病毒外壳亚单位疫苗是用遗传工程方法制造的。

18、应用由脂类与糖蛋白复合组成的病毒外壳亚单位疫苗，制造鼻内施用、抗病毒感染药物的方法。

19、根据权利要求18的应用方法，其中用权利要求2到17中任一项所定义的疫苗。

20、在抗病毒感染免疫方法中适用于鼻内施用的组合物，包括由与脂类复合物的糖蛋白组成的有效免疫量的病毒外壳亚单位疫苗和适用鼻内用药的药物学可接受的载体。

21、权利要求20中所述组合物，其中用的疫苗如权利要求2到17中任一项所定义。

22、权利要求20所述组合物，以气雾剂或喷雾剂或液滴形式。

23、权利要求20所述组合物，单位用药量为该疫苗的10-20mg。

24、制备抗病毒感染免疫疫苗的方法，包括（1）将由与脂类复合糖蛋白组成的免疫有药量的病毒外壳亚单位疫苗与（2）药物学上可接受的适于鼻内给药的载体结合。

25、根据权利要求24所述方法，其中制备权利要求2-17中任一项所定义的疫苗。

26、根据权利要求24所述方法，其中疫苗是用作为喷雾剂、气雾剂或液滴配方。

27、根据权利要求24所述方法，其中的疫苗是用作10-200mg用药量的配方。

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