JPS62270534A - ウイルス糖蛋白サブユニツトワクチン - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 ［産業−１−の利用分野］ この発明は、ウィルス感染予防用ワクチン組成物に関す
るものである。さらに詳細には、この発明は、有効成分
としてウィルスザブユニットを含む、ウィルス感染感受
性ポスト、特にひとを含めた哺乳類種への接種用ワクチ
ン組成物に関するものである。またこの発明は、これら
ワクチン組成物の製造方法に関するものである。

［背景技術］ 広範囲に及ぶ種“々のウィルスが、動物およびひとにお
いで重度の異なるウィルス感染症を起す原因であるとさ
れている。ウィルス感染による、例えばインフルエンザ
のような重度の可能性があるかまたは広範囲に広がる流
行病の数が極めて大きなため、これらの病原体による疾
患の予防または治療法が常に探求されてきた。これらの
ほとんど判明していない病原体で起る疾患の治療法の発
見が困難なことから、科学者がウィルス疾患の予防問題
に専心することになった。この線に沿って、ウィルス感
染症の症状を予防または軽減できるワクチンの開発が、
長い間色疫学者の目標とされてきた。２種の原理上の型
に属するワクチンが、現在最も広範に使用されている。

一方の型は、一定数のホスト細胞の通過によるか、また
は一般性は低いがある種の形の遺伝子弱毒化により、ウ
ィルスが無毒化されるか殺されてはいない弱毒生存ウィ
ルス型ワクチンである。この型のワクチンはある程度の
成功をおざめたか、主要な欠点は弱毒ウィルスがホスト
体内で生活している間に毒力を回復し得ることである。

他方の型のワクチンは、ポルマリンまたはその他の化学
もしくは物理的処理により不活性化されたウィルス粒子
からなるものである。死滅ウィルスの使用の背後にある
原理は、理論的に、必要な保護免疫応答を生じ得るウィ
ルス抗原が無傷で残っているにも拘らず、ポスト内でウ
ィルスを複製する能力がポルマリン処理により破壊され
ているということにある。このホルマリン不活性化型ワ
クチンは、おそらく現在市場で最も一般的なものである
１、シかし、このワクチン製造技術の広範性に反して、
得られる製品は、ホルマリン処理がしばしば抗原を化学
的に変化させてポストにおける免疫反応の誘発能力を低
下させるため、極めて有効とはいえなかった。

２種の一般的な型のワクチンに見られる欠点を回避する
ために、ウィルスコートの抗原成分の単離に大きな努力
が払われた。理論的には、ウィルスの他の部分が存在し
なくても単離された抗原はホストの免疫系を刺激する筈
である。同時に、生存ウィルスがないため感染の可能性
もない。勿論、ウィルス抗原は化学的変化を受けず抗原
性を完全に保つように分離されなυればならない。この
見地から、最も有用な成分としてウィルスエンベロープ
の一部をなす糖蛋白が挙げられる。糖蛋白はほとんど全
てのウィルスの構造的および／または機能的成分である
ごとがわかっており、しばしば高度の抗原性を有する。

数々のウィルスエンベロープ由来糖蛋白製剤がワクヂン
組成物の有効成分として提案されてきた。例えば米国特
許第４４７０９６７号は、ウィルス糖蛋白をレクチンと
複合させて作ったワクヂン製剤を記載１．ており、レク
チンはアジュバントとして作用する。数々の文献、例え
ば米国特許第１１３４４９３５号または第４３５６１６
９号、またはモレイン等、ジャーナル・オブ・ゼネラル
・ピｏｏジー（、Ｊ　、　Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、）６４
巻＋５５７−１５５９頁（１９８３年）の記載では、ウ
ィルス細組１：−ロ」ＮおよびＦを清浄剤（ブタ−ジエ
ンｌ−）で溶か１７、ウィルスエンベロープからこれら
を抽出し、清浄剤と脂質を除くために相分離を行なうこ
とによる、パラインフルエンザ糖蛋白組成物の製造法を
使用している。後者の方法は、実質的に清浄剤を含まな
いのみならず脂質も含まない糖蛋白ザブユニットの製造
をクレームしている。後者の型の高純度糖蛋白は、現在
市販ワクチンとして使用するに好適な型の有効成分とし
て推奨されている。しかし、現在のところこのような高
純度糖蛋白製品を含むワクヂン組成物は全く市販されて
いない。これは糖蛋白ザブユニットの製造が困難なこと
が大きく影響している。清浄剤と脂質の除去は通常しょ
糖勾配」二での分離により行なわれるが、これは商業生
産規模で実施可能とするのが困難な工程である。

［発明の記載］ 驚くべきことに、ウイルスザブユニットワクヂンの新規
製造法により、個人に接種したとき抗体応答を誘発でき
、一般に用いられるホルマリン不活化ウイルスワクヂン
製品よりはるかにすぐれた抗原製品が得られることが判
明した。さらに、数々の従来のワクチンのように精製・
脂質不含有蛋白ミセルからなるのでなく、普通に存在す
る脂質を溶解糖蛋白から除く必要のない糖蛋白・脂質複
合体ベシクル（小胞）からこの製品ができているため、
この発明の単離ザブユニットの製造は極めて簡単だとの
利点を（ｆする。糖蛋白・脂質複合体がこのような高度
の免疫付与能力を有するという事実は、従来の知識が脂
質は非抗原的であり、そのためワクヂン組成物中に存在
すると効果を減少させ、ないしはワクヂン組成物全体と
しての免疫誘発能をそこなうと教えていたことから考え
ると、意外なことである。このザブユニットであるワク
チン有効成分は、公知のザブユニット組成物の多くと同
様に、清浄剤抽出により製造される。しかし、明確な特
徴は、この抽出法に用いる清浄剤が透析可能な清浄剤で
あるという点に存する。透析可能な清浄剤を用いること
により、大規模においても、この発明の糖蛋白・脂質複
合体を透析による比較的簡単な精製法で得ることが可能
となった。

すなわち、この製剤は文献に示される糖蛋白ワクチン組
成物より製造か容易であるとの利点に加えて、現在市販
されている製品よりはるかに有効だとの利点を有する。

この発明は、有効成分として、脂質と複合した少なくと
も１種の免疫原性ウィルスエンベロープ糖蛋白の免疫原
的有効型を含有する、ウィルス性疾患の予防用ワクヂン
組成物を提供する。この発明はまた、透析可能な清浄剤
、少なくとも１種の溶解糖蛋白、および溶解脂質を含む
溶液を、清浄剤を除去するに充分に時間透析し、糖蛋白
・脂質複合体を生成させることからなる、ウィルス性疾
患の予防用ワクチン組成物の製法を提供する。さらにこ
の発明は、パラインフルエンザ糖蛋白に対するモノクロ
ーナル抗体類、およびこれらモノクローナル抗体類を免
疫吸着剤として用いる糖蛋白の分離法を提供する。

［図面の説明］ 第１図は、オクチルグルコシドによりＰＩ３ウィルスエ
ンベロープ成分の可溶化を示す。３Ｉ］−ロイシン標識
ＰＩ３ウィルス（レーン１）をオクチルグルコシドで処
理し、清浄剤不溶（レーン２）および可溶（レーン３）
フラクションをＳ　Ｉ）　Ｓ　−Ｐ　ＡＧＥで分析した
。３１！−グルコザミン標識ＰＩ３ウィルス（レーン４
）、その清浄剤不溶（レーン５）および可溶（レーン６
）フラクションの糖蛋白プ［Ｊフィールを同様に分析し
た。レーン５におけるポリベブヂドへの″１トー標識と
りこみは、アミノ酸前駆体への代謝的変換を示す。

第２図は、ウィルスエンベローブ蛋白（パネルＡ）の３
用量まノこはホルマリン不活化ウィルス蛋白（パネルＢ
）の対応用量の１回皮下投与免疫化後週間隔で採取した
ハムスター血清の血球凝集抑制力価を示す。力価は、エ
ンベ〔１−ブ蛋白２０μ９（○−○）、４０μ！７（△
−△）、８０μ９（ローロ）およびポルマリン不活化ウ
ィルス蛋白６０μ９（○−○）、１２０１１ｇ（△　△
）、２４０１Ｂ（ローロ）で免疫した動物９匹の平均値
で示す。免疫前および非免疫ハムスター３匹の血清力価
はく１６であった。

第３図は、ウィルスエンベロープ蛋白（パネルＡ）の３
用量またはホルマリン不活化ウィルス蛋白（パネルＢ）
の対応用…の１回皮下投与免疫化後週間隔で採取したハ
ムスター血清の中和抗体力価を示す。力価は、エンベロ
ープ蛋白２０１１ｇ（○−○）、４０μ９（△−△）、
８０μｇ（ローロ）およびホルマリン不活化ウィルス蛋
白６０μｇ（○−○）、１２０μｇ（△−△）、２４０
μｇ（ローロ）で免疫した動物９匹の平均値で示す。免
疫前および非免疫ハムスター３匹の血清力価はく１０で
あった。

第４図は、　’１−ｒ−グルコサミン標識精製ウィルス
と代表的ハムスター血清および気管支洗液の免疫沈降を
示す。３Ｉ−■−グルコサミン標識ウィルス（レーンｌ
）の糖蛋白プロフィールとエンベロープ蛋白８０μ９（
レーン２および３）または不活性ウィルス蛋白２４０１
ｌｌｌ（レーン４および５）で免疫したハムスターの血
清による免疫沈降物を５ＤＳ−ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅで分析し
た、エンベロープ蛋白８０１１９（レーン６）または不
活化ウィルス蛋白２４０７１ｇ（レーン７）で免疫した
ハムスターの感染試行後の気管支洗液による免疫沈降物
を同様に分析した。

第５図は、ハムスター中でのＰＩ３ウィルスの複製を示
す。３匹の実験動物からの気管支洗液（総−１１＝ ｐｆｕ）および肺または気管（ｐｆｕ、Ｑｍ）からのウ
ィルス収率を示す。

この発明のワクヂン製品は、有効成分として、少なくと
も１種のウィルスエンベロープ糖蛋白ザブユニット・脂
質［９合体を含む。この明細書中で、「免疫原性」およ
び［抗原性」の語は交換的に使用されており、ポスト生
物で保護免疫応答を刺激する能力を有することを意味す
る。

実質的にすべての脂質含有ウィルスが、少なくとも１種
、場合により２挿置」二の糖蛋白をウィルスエンベロー
プ表面−１−に有し、前述のように、これら糖蛋白は、
ある程度抗原性であることが、そうでないことよりはる
かに多い。すなわち、抗原性糖蛋白成分を含む任意の脂
質含有ウィルスは、この発明のワクチンの適当な材料と
なる。糖蛋白・脂質複合体の脂質成分は、ウィルスが生
産されるポスト細胞からのウィルスエンベロープに実際
に寄与する。脂質はウィルスにより特定の蛋白と共にホ
ストでのエンベロープ形成中にエンベロープにとりこま
れる１、ついで、脂質は清浄剤に対する溶解性に基づい
て糖蛋白と同時に抽出される。

透析に４１；す、糖蛋白と脂質は自然に複合体または（
すなわち）ベシクルを形成する。予期されていたように
生成する糖蛋白ザブユニットワクチンの望ましからざる
成分としてではなく、同伴脂質はアジュバントとじて作
用することにより全体としての製品の免疫原性を増強す
ることができる。免疫原性脂質・糖蛋白ベシクルの形成
能力は、一般に糖蛋白と脂質の関数であり、糖蛋白また
は脂質の特定の型に限定されるものではない。

一般に抗原性と考えられている公知のウィルス糖蛋白中
には、一般にレセプター結合糖蛋白および融合糖蛋白と
して知られる２つの型がある。これらはポスト細胞感染
プロセス中の機能により定義され、ウィルスが異なると
別の固有名で知られることもある。少なくとも１種、多
くの場合両者が、ヘルペスウィルス、インフルエンザウ
ィルス、パラミクソウィルス類、狂犬病（ｒａｂｉｅｓ
）ウィルス、およびＨＴＬＶ（ｈｕｍａｎＴ−ｃｅｌｌ
　　Ｉｉｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃｖｉｒｕｓ、エイズの病
因）のような重要な疾患因子中に存在する。

特によく特性か知られているのは、パラミクソウィルス
群の全構成口が有するレセプター結合型およびＦ融合型
糖蛋白である。これらの中には、パラインフルエンザウ
ィルス、麻疹（ｍｅａｓｌｅｓ）ウィルス、流行性耳下
腺炎（ｍｕ＋ｎｐｓ）ウィルス、Ｒ，５（ｒｅｓｐｉｒ
ａｔｏｒｙ　　５ｙｎｃｙＬｉａｌ）ウィルス、エコー
カッスル病ウィルスおよびセンダイウィルスが含まれる
。パラインフルエンザウィルスでは、これら糖蛋白はＦ
およびＩＩＮとして知られ、感染（Ｆ’）の開始および
ウィルスによる血球凝集とノイラミナーゼ活性化（１−
ＩＮ）の原因と考えられている。これら糖蛋白はそれぞ
れ抗原性が高いことが知られており、したがってこの発
明のワクヂン組成物の製造に特に有用である３、明らか
に、この群の構成員による疾患のあるもの、特にパライ
ンフルエンザ、麻疹およびおたふくかぜは、ひと、特に
子供に広がっており、特に（ｊ“害な症状および／また
は副作用をΦ者にもたらすことがある。例えば、パライ
ンフルエンザ３型ウイルスは米国で６オ以下のほとんど
全での子供に感染する。

Ｆ糖蛋白は少なくともパラインフルエンザにおいてザブ
ユニットに分離し得ることが知られている。この明細書
において、Ｆ糖蛋白という場合には、全体としてのＦ糖
蛋白またはその個々のサブユニット（これらは全て清浄
剤可溶性である）の何れをも指し得るものとする。

この発明の組成物は、その製造が比較的簡単である。関
心の対象であるウィルスをまず適当なポスト細胞培養物
中で培養する。細胞は、ウィルスの生育を支持すること
が知られている任意のホスト細胞であってよく、これら
とそのウィルス培養条件は当業者に周知である。一般に
ひとのウィルスに用いられるセルライン中には、ベロ細
胞（アフリカみどりざるの腎）、ベビーハムスター腎（
ＢＨＫ）およびＬ　Ｌ　ＣＭＫ　２（あかげざる腎）が
含まれるが、他の種々の型も種々のウィルスに用いるこ
とができ、これらは全て当業者によく知られている。ウ
ィルスを短時間、通常培養細胞に細胞変性変化が現われ
始めるまで増殖させる。この点でウィルスを培養液から
採取し得る。別法として、ウィルスを胚発生鶏卵または
あひるの卵生で生育させる。ついでウィルスを培養液か
らベレット化し、さらに精製して公知の分離法により細
胞砕片を除く。このような技術は微生物学界で公知であ
る。

精製ビオリンを、ついで透析可能な清浄剤により可溶化
する。清浄剤の特性は、糖蛋白と脂質が可溶化され、清
浄剤が容易に透析されるものでなければならない。「容
易に透析される−１とは、清浄剤の除去が敗退ではなく
数日程度でなし得ることを意味する。この部類に属する
清浄剤は、非イオン性、カヂオン性またはアニオン性で
あってよく、当業者には容易に知られる。可能な選択範
囲内に、コレートまたはオクチル−Ｄ−グルコシドがあ
る。

理論的には透析可能な、例えばトリトンＸ−１００のよ
うな一般に用いられる数々の清浄剤があるが、透析によ
り清浄剤を除くに要する時間が長いため実際上使用でき
ない。ここで、可溶性製剤から脂質を除くのか望ましい
という公知の糖蛋白製剤に関する事情と異なって、この
発明の製剤では脂質か最終製品に残ることが必要である
。それ故、清浄剤が透析可能であり、そのため清浄剤の
みが製造中に除かれることか重要視される。溶解後、不
溶のヌクレオカプシドを遠心または他の適当な手段によ
り溶液から除去し得る。透析後、溶解製品は清浄剤を含
まず、目的とする抗原成分ＨＮおよびＦ糖蛋白を含む。

他の蛋白は、主抗原成分の抗原活性に影響せず、これら
は最終製品中に痕跡量存在しても悪影響がない。糖蛋白
のそれ以」二の精製は、ＨＮおよびＦに対するモノクロ
ーナル抗体を用いるアフイニテイクロマトグラフイーに
より行なうことができる。その詳細は後述する。最終透
析物中にはまた、著ｍの内生ビールス脂質（これは最終
ワクヂン組成物の重要成分である）が存在し得ろ。糖蛋
白と脂質から清浄剤を除くと、共同して目的とする免疫
効果を生ずるベンクルが生成する。これら糖蛋白・脂質
複合体は、最終ワクヂン組成物の免疫原成分である活性
ザブユニットを形成する。

ウィルスエンベロープ中に天然に存在するため、Ｉ（Ｎ
およびＦ蛋白（」種々の割合で存在することが判明した
。例えばひとＰ［−３では、Ｉ−Ｉ　Ｎ糖蛋白はウィル
スエンベロープ中にＦ糖蛋白の約４倍存在する。Ｆ糖蛋
白はウィルス中に少量天然に存在ずろが、さらされた個
人の免疫発生に極めて重要であることが判明した、完全
な免疫の発生には著最のＦ蛋白にさらされることが必要
である。」二足方法で製造したワクヂン製剤は、単離さ
れたエンベロープ蛋白の適当量が投与される限り、完全
な免疫を与えるに充分な量のＦ糖蛋白を供給する。

その詳細は後述する。しかし、必要ではないが、場合に
よっては精製Ｆ糖蛋白を加えてザブユニット成分を強化
し、ワタヂン用（ｎの低下を可能にすることが望ましい
ごとがある。Ｆ強化ワクヂンでは、Ｉ（Ｎ　：　ｌ；’
の割合を約１：１にするに充分な精製Ｆ糖蛋白を加える
ことができる。

別の用途に用いろＦまたは）−Ｉ　Ｎ糖蛋白を分＃／精
製可能とすることに関連して、各々の抗原に対するモノ
クローナル抗体を容易に製造できる。不死セルラインと
免疫原製品に対して感作したリンパ球を融合したハイツ
リドーマセルラインの製造は当業考に周知の方法で行な
い得る（例えは、ドウイラールおよびホフマン、「ペイ
シック・ファクツ・アバウド・ハイブリドーマズ（Ｂａ
ｓｉｃ　　Ｆａｃｔｓ　Ａｂｏｕｔ　ｙｂｒｉｄｏｍａ
ｓ）−１，コンベンゾイウム・オブ０イムノロジー（Ｃ
ｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　　ｏｆ　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
）２巻（シ、バルツ、１９８１年）、コラ−およびミル
スタイン、ネイチャーｒＮａｔｕｒｅＪ２５６巻４９５
−４９７頁、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ争イムノ
ロノー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ’　
Ｉ　ｍｍｕｎ。

１ｏｇｙ）　６巻５１１−５１９頁、カブロフスキ等、
米国特許第４．１７２１２４号、同米国特許第４１９６
２６５号、ウオンド、米国特許第４２７１１４５号参照
。これらを引用して説明の一部とする）。

動物の選択は、そのリンパ球と融合し得る適当な不死ラ
インが入手できるかどうかによる。ハイブリドーマ技術
でマウスとラットが動物として選ばれてきたが、ここで
も使用するに好ましい。ひどしまた、適当ならば感作リ
ンパ球源として用い−１，Ｌ ることかでき、不死ひと（またはひと以外の）セルライ
ンを動物血清か免疫原製品に陽性になるまで用いる。こ
の発明のたぬには、動物に精製ピリオンまたは破壊ウィ
ルスエンベロープからのウィルス蛋白の何れかをｔＬ射
できる。通常注射物質はフロイント完全アジコバシト中
に乳化させる１、抗体の検出は適当に標識しノこ抗血清
で試験することにより実施できろ３６　リンパ球は、感
作動物から脛臓またはリンパ節を無菌的に摘出し融合さ
せて得られろ。別法として、リンパ球をインビトロで刺
激または免疫するごとができろ。

融合に摘出な多数のセルラインが開発されており、ハイ
ブリダイゼーションのプロ）・コルに用いる特定のライ
ンの選択は、生育速度、特性の均一性、生育培地成分の
代謝欠如、良好な融合頻度等の数々の基準中の（［意の
ものによって定まる。

種内ハイブリッ１ζ特に株間のものが、種間のものより
良好である４、数種のセルラインが入手でき、その中に
ミニ［Ｊ−マ免疫グ［１プリンの分泌能を欠如ずろもの
として選択された突然変異が含まれる。

＝２０＝ これらの中には下記マウスミエローマラインが含まれる
。ＭＰＣ，＝Ｘ／Ｉ　５−６１’Ｇ、Ｐ３−ＮＳＩ−ｌ
−Ａｇ４−１、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８、またはその変異
、例えばＸ６３−八ｇ８．６５３、ＳＦ３−０−Ａｇｉ
４（すべてＢＡＬＢ／Ｃ由来）、Ｙ３−’Ａｇｌ　、２
．３（ラット）、およびＵ２６６（ひと）。

細胞融合は、ウィルス、例えばエプスタイン・バールま
たはセンダイウィルス、またはボリエヂＩノングリコー
ルで誘発し得る。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は
哺乳類体細胞の融合に最も有効な試剤である。ＰＥＧ自
体は細胞毒性であり得るので、融合を行なう前に種々の
濃度で生存性試験を行なう必要がある。ＰＥＧの分子量
範囲は、１０００−６０００であり得る。約５０％Ｗ／
Ｗに食塩水または血清欠乏培地で希釈したとき最良の結
果が得られる。ＰＥＧに３７°Ｃで約３０秒さらすのが
、ねずみ細胞を用いる場合に好ましい。極端な温度は回
避すべきであり、融合系の各成分を融合前に３７℃で予
備インキュベーションすると最適の結果が得ら治７ろ。

リンパ球と悪性細胞の比は牌臓細胞同志の融合の回避を
最適にするように定める。ミエローマ／リンパＩｌはｌ
：Ｉ〜ｌ１ｌＯの場合良好な結果を与える。

都合よく融合した細胞は任意の公知技術によりミエロー
マラインから分離することができる。最も一般的で好ま
しい方法は、ヒボキサンヂングアニンホスホリボソルト
ランスフエラーゼ（Ｉ（ＣＩ）ＲＴ）欠如悪性細胞を選
ぶことであり、これはチミジンとヒボキサンチンからプ
リンを合成する能力に欠けるのでアミノプテリン含有培
地で生育しない。ハイブリッドの生育のみをさせるのに
用いる培地は、一般にヒボキサンチンｌＸｌ０−’、ア
ミノプテリンｌＸ１Ｏ’Ｍ、およびデミジン３×１０−
５Ｍからなり、１■Δ′Ｆ培地として知られる。

融合混合物は、融合直後または２４時間後Ｌ［ＡＴ含有
培地で生育し得る。フィー１ζスケジユールは通常２週
間ＩＩ　Ａ　ｉ’培地で維持し、ついで通常培地または
ヒボキサンチン・デミジン含有培地を供給する。

ついで、生育コロニーを、抗原製品認識抗体の存否につ
いて試験する。ハイブリドーマ抗体の検出は、抗原が固
体担体に結合し、これを抗体を含むと思われるハイブリ
ドーマ上清と反応させることからなるアッセイにより行
なう。抗体の存在は、種々のインディケータを用いる「
サンドイッチ」技術により検出することができる。一般
的な方法の多くは、ハイブリッドの生育中に分泌される
抗体濃度範囲で使用し得るに充分な感度をもつ。

ハイブリッドのクローニングは、選択した培地で細胞生
育を２１２３日間行なった後実施できる。クローニング
は、液相中で細胞の限界希釈をするかまたは半固体アガ
ロース中で生育する単細胞を直接選択して実施し得る。

限界希釈では、細胞けんだく液を連続希釈して、ウェル
当り１個のみの細胞が含まれる統計的確度を得る。アガ
ロース法では、ハイブリッドを半固体上層に接種し、下
層にフィーダー細胞を含ませる。上層のコロニーをとり
」二げ、ウェルに移ずことかできる。

抗体分泌ハイブリッドは、種々の組織培養フラー２３＝ スコで生育さＵることができ、種々の濃度の抗体含有上
清か得られる。膜製を得るため、ハイブリッドを炎症腹
水を有する動物中に移すことができる。

抗体含有腹水は、腹腔内注入後８−１２日後に採取し得
る。腹水は高濃度の抗体を含むが、炎症腹水からの免疫
グロブリンとモノクローナルの両者を含む。

上記技術は、ひとＰＩ−３ＨＮまたはＦ糖蛋白に特異的
な抗体を分泌するハイブリドーマを得るに特に有用であ
る。生成したモノクローナル抗体は、免疫蛍光血球凝集
抑制（Ｈｌ）、ノイラミニダーゼ抑制（Ｎｌ）、伝染性
中和（ＮＴ）、および免疫沈降試験で抗体特異性を確認
するこ七ができ、これらは何れも当業界で周知の技術で
ある。ＨＩ、ＮｌおよびＮＴ試験における顕著な反応性
により、ＨＮ糖蛋白に体する抗体が同定される。ウィル
ス感染性の中和および低希釈でのウィルス誘発細胞融合
の使用は、顕著なＨＩまたはＮＩ力価を伴わない場合Ｆ
糖蛋白に対する抗体を示す。上記試験における反応性パ
ターンは抗体によって若干異な−２４〜 ることかあるが、Ｉ−Ｉ　ＮまたはＦ糖蛋白に特異的な
数々のモノクローナル抗体が得られ、」１記方法により
同定された。

抗体のアイソタイプは、アルカリホスファターゼ（ザザ
ン・バイオテクノロジー・アソシェイッ・インコーホレ
イチット、バーミンガム）と組合わせたやぎ抗マウスア
イソタイプ特異抗体を用いるＥＬＩＳＡ法により測定さ
れる。同定された抗体は全て特異的糖蛋白に充分な水準
の反応性を有するが、特に有効な抗体は１３−５°９°
６°２（ＡＴＣＣ／ＨＢ８９３４）および９−４°３（
ＡＴＣＣ／ＨＢ　８９３５）で示されるハイブリドーマ
が産生ずるものであり、それらの抗体はＨＮおよびＦ糖
蛋白にそれぞれ特異的である。

生物学的に純粋な上記ハイブリドーマ培養物の寄託は、
１９８５年１１月５日に、米国メリーランド州ロックビ
ル、パークローンドライブ＋２３０１のアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクションに対して行なった。上
記寄託番号は生存試験完了後に付与され、必要な費用が
払われた。上記培養物は、最近の試料分与請求後最低５
年間常に得られ、寄託から最低３０年間は必らず得られ
る。培養物が生存しないか、誤まって廃棄された場合、
分類学的記載に合う生（ｊ培養物が補充される。

上記モノク「Ｊ−ナル抗体は、Ｉ−Ｉ　ＮおよびＦ糖蛋
白のアフイニテイ精裂に使用できろ。アフイニテイクロ
マトグラフイーは、特定の分子を第２の分子に生物特異
的に結合させるフラクション化法であり、この発明のモ
ノクローナル抗体による高純度抗原の製造に極めて好適
に使用できる。一般に、この方法ではモノクローナル抗
体がアフイニテイマ）・リックスとして固定され、に１
的とする抗原を含む溶液が固定化抗体と接触されろ。抗
原に対する抗体の高度特異性により、抗原の選択的抽出
が可能であり、溶液中の残留不純物はカラムを通過する
。ついで、結合した抗原をカラムから分離溶出する。固
定化および溶出技術は当業界で周知であり、この目的の
ためにこれらの任意の数が適当なものとして検討される
。一般に用いられる技術の要約は、ゴーディング、モノ
クローナル・アンテイボデイズ、プリンシプル・アンド
・ブラクテイス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ：Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓａｎｄ　　Ｐｒａｃ
ｔｉｃｅ）６章（アカデミツクプレス、１９８３年）に
みられる。

当業者には、」１記のように精製したＦ糖蛋白の使用が
この糖蛋白の強化材料として可溶化糖蛋白・脂質サブユ
ニットワクチンに添加することに限定されないことが明
らかである。実際に、アフイニテイ法で精製したＩ−Ｉ
　ＮとＦ糖蛋白はまた、ワクチン製剤の適当な成分でも
ある。これらの物質は別個に分離精製されたため、必要
な割合で、適当な希釈媒質または担体中で合わせること
ができる。

約４：Ｉ〜約１：ｌ（またはそれ以」二）のＩ−Ｉ　Ｎ
対Ｆの比率が、顕著な保護効果を得るために用いること
ができる。Ｆ糖蛋白はまた、免疫誘発能に大きな効果を
もつため、単独で用いることも可能である。

この発明のモノクローナル抗体はまた、糖蛋白精製以外
の目的でも用いることができる。例えば、抗体は、バラ
インフルエンザに感染した疑のある患者におυるバライ
ンフルエンザウィルスの存否の診断試験用試薬としても
有用である。しかし、さらに重要と思われるのは、抗体
を受身免疫プログラムの一部に用いろこと、ずなわし、
抗体をウィルス抗原に対Ｗる身体の自然の免疫応答の代
りに用いることである。それ故、ワクチン形のモノクロ
ーナル抗体は、患者の抗体応答の発動を待つことなく、
直接保護用に用いることができろ。

前述のように、ワクチン中に糖蛋白と共に脂質が存在す
ることが、ホストの体の免疫応答刺激に予期できない利
益をもたらすと、思われる。これが起る原因は未知であ
るが、ごれら天然脂質の存在がアジ、バントの作用をし
、糖蛋白の抗原作用を増強する可能性がある。、　＋ｉ
７ｊ述の方法により糖蛋白と同時に抽出されたウィルス
エンベロープ中の内性脂質は適当な保護レベルの抗体産
生をもたらすに充分である。ｊ−か１７、精製単離糖蛋
白からワクチンを製造する場合、天然脂質を含む未精製
製剤で得られるのと同し効果を得るために外来脂質を加
えるのが望ま１２い。これは、基本的に元の蛋白＝２８
− ・脂質膜構造を再構成する作用をもつ。脂質を加えると
、自然に蛋白とベシクルを形成し、ウィルスエンベロー
プを単に可溶化し透析して得た製品に似たものになる。

糖蛋白に脂質を加えることによりベシクルを形成するの
は比較的簡単である。

必要なことの実質的全ては、糖蛋白を含む透析可能清浄
剤溶液に脂質を溶かし、可溶化法で前述したように溶液
を透析することである。こうして、精製蛋白と外性脂質
を合わせてベンクルを製造し得るのみでなく、可溶化蛋
白・脂質製剤に脂質を加えて内性脂質の効果を天然脂質
：蛋白比の上昇により強化することも可能である。ベン
クル構造の再構成に、はとんど任意の原料からの脂質を
用いることができろ。この発明のワクチンに有用と考え
られる脂質には、レシチン、セファリンおよびスフィン
ゴリピドに見られるようなホスホリピドがある。特に好
ましいのはレシチン、中でも卵しソチン、ポスファヂジ
ルコリンである。

この発明の組成物は、代表的には、非経１］的、例えば
皮下、腹腔内、筋肉内または静脈内投与される。抗原複
合体は、＋１１−に水、緩衝食塩水、エタノール、ポリ
オール（例えばグリセリン、プ〔１ピレングリコール、
液体ポリエチレングリコール等〕、それらの適当な混合
物、および植物油のような医薬として許容される担体と
組合イっせて投与することができる。適当な場合に（」
、汚染微生物の作用を、パラベン類、り（Ｊロブタノー
ル、フェノール、ソルビン酸、ヂメ［ｌザール等のよう
な種々の抗菌剤および抗かび剤により防止することがで
きる。

しばしば、等張網、例えばグルコースまたは塩化ナトリ
ウムを加えるのが有利である。

この明細書において、「医薬的に許容される担体−１の
語には、任意の、すべての溶媒、分散媒、被覆、抗菌剤
および抗かび〜１、等張化剤および吸収遅延剤等が含ま
れる。このような媒質および剤を薬学的有効物質に用い
るのは当業界で公知である。常用媒質または剤か有効成
分に相容性がない場合を除いて、治療組成物にこれを用
いることが考慮される。補助有効成分もまた組成物に含
ま什ることができる。

投与を容易にし用量を均一にするために、非経口組成物
を単位用型形態に製剤するのが特に有利である。ここで
用いる用量単位形態の語は、処置すべきを椎動物の対象
に用いる単位用量として適する物理的に独立した単位を
指す。各単位は、目的とする治療効果を生ずるように計
算した有効成分の予じめ定めた量を必要な医薬用担体と
共に含有する。この発明の新規用量単位形態の仕様は、
有効成分の独特の特性と達成されるべき特定の治療効果
により指示され、それらに直接依存して変るが、患者に
対して適当な用量を定めることは医師の技術の範囲内で
可能である。一般に、ウィルスのＨＮおよびＦ抗原を含
む組成物を投与する場合、約４０−２００μりの用量が
目的とする免疫応答の生成に充分である。勿論、用量範
囲は混合物中に存在するＦ抗原の割合によって変る。組
成物がほぼ等量のＨＮとＦを含む場合、用量は範囲の下
限であるのが好ましいが、大量のＦが存在する組成物の
製造が実際的でない場合、高用量の投与が必要となる。

＝３１＝ 糖蛋白・脂質含ぞｊウィルスは、広範囲のを椎動物ホス
トにおいて疾病を起す原因であり、この発明のワクヂン
組成物はこれらの疾病に感受性があるすべてのを椎動物
ホストの処置に適応し得る。

しかし、パラインフルエンザの感染予防に用いろこの発
明の好ましいワクチンは、ひとを含む哺乳類ホストの処
置に最も有用である。

以下、この発明の理解をさらに容易にするために実施例
を示すが、ごれは限定を意図するものではない。

［実施例］ 実施例１ 以下に示す実施例は、ひとパラインフルエンザ３ウイル
スを用いてこの発明のワクヂン組成物を製造するための
」−程を示す。

ひとパラインフルエンザ３ウイルス（４７８８５株）は
、デビジョン・オブ・リザーヂ・アント・リソーズ、Ｎ
ｒｌｌから人手した。ウィルスは、ベロ細胞中で精製１
刀ごプラークであった。Ｌ　Ｌ　Ｃ−Ｍ　Ｋ　２　（ベ
ンガルざるの腎臓）、ベロ（アフリカみ〜３２− どりざるの腎臓）およびＢＨＫ（幼ハムスターの腎臓）
セルラインはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ノヨンから入手した。

２００マイクロリツトル容量中の」１清の連続１０倍希
釈物を、直径４０ｍｍウェルのプラスデック製組織培養
皿（コースタ−・プラスチックス）中でベロ細胞の単層
に接種した。３７℃、５％ＣＯｐインキュベータ中で、
振とうしながら１時間インキコベーンヨン後、皿を培地
で洗浄しその後、１％仔牛血清（ＮＣ３）および０．９
％寒天を含有するダルベツコ培地３１１１１で被せて細
胞を３７℃で４日間インキュベートした。最後に１％Ｎ
Ｃ８および０９％寒天を含有するダルベツコ培地３ｍｌ
を別に被せ、０．００５％ニュートラルレッドを加えて
、プラークを計算する前に皿をさらに１２時間インキコ
ヘートした。

Ｌ　Ｌ　ＣＭ　Ｋ　２細胞の全面単層に１プラ一ク形成
単位／細胞濃度で感染させた。１時間、３７°Ｃで吸収
後、細胞を１％ＮＣ３および０９％寒天を含有するダル
ベツコ培地でインキコヘートした。

アミノ酸前駆体を用いて放射性標識するために、ウィル
スを、２％Ｎ　ＣＳおよび３［１−ロイシン（アメジャ
ム、比活性Ｇ４．６Ｃｉ／ミリモル）または３５Ｓ−メ
チオニン（アメジャム、比活性１３４５Ｃｉ／ミリモル
）の１ｏｕｃｉ／ｍｌ溶液を含有するロイシンまたはメ
チオニン欠乏イーグル培地中で育成した。糖の標識は、
３Ｈ−塩化グルコサミン（アメジャム、比活性３９ｕＣ
ｉ／ミリモル）のｌ０ｕＣ１／ｍ１溶液を含有する血清
非含有イーグル培地中で行った。ウィルスは、中程度の
細胞変性効果を発生させた際、４８時間の後感染で、培
地流体から採集した。培地液体を、最初低速遠心（５０
００×ｇ、４℃で３０分）により細胞骸から除去１２、
ウィルスを高速遠心（１４３０００ｘｇ、４℃で４５分
）によってペレット化した。ペレットをリン酸緩衝生理
食塩水（ｒ）Ｂｓ　）中で再懸濁し、ウィルスを３０−
６０％不連続ンコークロース緩衝剤を通した遠心（３０
（］、０００ｘｇ、４°Ｃで１時間）によって精製した
。ウィルスのバンドを境界域から採集し、ＰＢＳで希釈
した後、高速遠心（３００゜０００Ｘｇ、４℃で３０分
）によってペレット化した。

精製したウィルス粒子は、２％オクチルグルコシド（シ
グマ・ケミカル・コーポレーション、セン）・ルイス、
ミズーリー）を含有する０　１モルトリス−ＣＩ−１１
，０１モルＮａＣ１、ｐｌ−１７，６中で懸濁し、室温
で３０分間静置させた。不溶のヌクレオカプシド部を遠
心（３００，０００ｘｇ、４℃で３０分）によって除去
した。界面活性剤可溶性エンベロープ構成物を含有する
」−清を、０．０１モルトリス−１−Ｉ　ＣＩ、０．０
１モルＮａＣ１、ｐＨ７６，４°Ｃで４８時間、三日交
換して透析した。

透析物の蛋白含量および血球凝集力価を測定した。

標品の蛋白含量は、市販用に生産された染料（ノクイオ
ラッド・ラボラトリーズ、す・ンチモンド、カリフォル
ニア）を使用し、ブラッドフォード［アナリテイカル・
バイオケミストリー（Ａ　ｎａ）　、　Ｂ　ｉｏｃｈｅ
ｍ、　）、７２巻、２４８−５４頁、１９７６年１の方
法に従ってＩ’ｌｌ定した。ｉ−Ｉ　ＮおよびＦ糖蛋白
類に加えて、ウィルス性エンベロープの蛋白成分を種々
の分子量の他のポリペプチドが構成することが発見され
た。これらはり、ｒ−’、ＮＰ、Ｍ、アクヂンとして表
され、２２にポリペプチドであった。

３■−Ｉ−ロイシン標識ウィルス粒子のオクチルグルコ
シドを用いた処置後の可溶性および不溶性フラクション
を第１図に示した５ＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。

界面活性剤（清浄剤）がウィルス性１４Ｎ、Ｆを、およ
びおそらく同程度にＭおよびアクチンを溶解しうろこと
が明らかである。他方、ヌクレオカプシドを会合した蛋
白、ＮＰ、ＰおよびＬは界面活性剤不溶性部に残った。

界面活性剤を用いた３１−１−グルコサミン標識ウィル
ス粒子の処置は、ｌ（ＮおよびＦ糖蛋白類の可溶化を確
定した。全ウィルス蛋白の約３分の１が、界面活性剤可
溶部で回収され、その物質は、顕著なＩ−Ｉ　Ａ力価（
１：３２０）を示した。対照的に、ポルマリンによる不
活性化全ウィルス製品は極めて低いＩ（Ａ力価（Ｉ・８
）を有した。

実施例２ この実施例は、は乳動物宿主での免疫応答を含めたこの
ワクチンの有効性を示す。

４週令、各々体重約６５ｇｍの酸ハムスターをカルレス
・リバー・ブリーチング・ラボラトリーズから人手した
。免疫の前に、その動物を、眼　詞から採血して実験前
に存在する抗体の存在を測定した。

２つの型のワクチン組成物を製造した。第１のものは、
実施例１に記載のように活性成分として可溶性エンベロ
ープ蛋白を含有し、第２のものは、精製ウィルス懸濁物
を０，２５％ホルムアルデヒド中、３７℃で一夜インキ
コベートすることによって製造したホルマリン不活性化
ウィルスを含有した。不活性化ウィルス懸濁物を０．０
１モル　ｌ・リス−Ｔ−ｒ　Ｃ］、０．０１モルＮａＣ
］、Ｔ）Ｈ７，６で一夜透析してホルムアルデヒドを除
去した。ａ度を変えた組成物を製造し、以下のようにハ
ムスターに投与した。

動物の群を界面活性剤可溶性ウィルス性エンヘロープ蛋
白またはホルマリン不活性化全ウィルス蛋白を用いて同
時に免疫した。免疫した動物から得た血清標品を眼　洞
から毎週採血することによって採集した。血清を５６℃
で３０分間不活性してから、ウィルス性糖蛋白に対する
抗体応答の試験をした。ウィルス性エンｌ＼ロープ製品
で免疫した動物は、ＨＩ試験でＩＮ糖蛋白に対する上昇
した抗体応答を示した（第２図）。ポルマリン不活性化
全ウィルス蛋白によって免疫した別の群の動物は、低い
Ｈ１１刀を示した。抗体応答は、ワクヂン投与によって
変化したが、両方の群の動物は、免疫後第２週までにピ
ーク応答を有Ｉ５、Ｉ−Ｉ　Ｎ糖蛋白に対する抗体の水
準を第５週日まで持続した。

免疫したハムスターの血清中和抗体応答も抗原の投与に
左右され、最高用量のエンベロープ蛋白（８０ｕｇ）は
遷延応答を誘発した（第３図）。４０ｕｇのエンベロー
プ蛋白または２４０ｕｇのホルマリン不活性化ウィルス
性蛋白で免疫した動物は、免疫後第４週までに抗体応答
において徐々に上昇を示したが、一方低用織は高力価を
誘発しなかった。

週間隔で採集１刀こ免疫ハムスター血清も、試験して３
Ｈ−グルコザミン標識ウィルスを用いた免疫沈降によっ
て、ウィルス糖蛋白に対する抗体応答を評価した（第４
図）ＨＮ糖蛋白に対する抗体応答が、二種の抗原製品の
最低用量でさえ免疫後第２週から観察された。最高用量
のウィルス性エンベロープ蛋白またはホルマリン不活性
化ウィルス蛋白を用いて免疫したハムスター由来の血清
も、免疫後第３週までにＦ糖蛋白に対する検知しうる抗
体応答を示したが、一方低用量の抗原を用いて免疫した
動物は、この糖蛋白に対してなんら抗体応答を示さなか
った。

ハムスター血清も、細胞融合の阻害に関する試験の際に
顕著な差異を示した。ウィルス感染ＢＨＫ細胞は、エン
ベロープ糖蛋白製品を用いて免疫しノこハムスター由来
の血清（１：２．０）でインキュベーションを行った後
、表示しうる細胞変性効果を示さなかった。対照的に、
大型シンシヂウム（合胞体）が、ホルマリン不活性化ウ
ィルスを用いて免疫した他の群の動物から得た血清で処
置した培地中で観察された。

実施例３ この実施例は、投与後の活性ウィルスによる攻撃を用い
たエンベロープ糖蛋白ワクチンの保護効果を示す。

ハムスターを、ケタミン塩酸塩（８７ｍｇ／ｍｌＸブリ
ストル・ラボラトリーズ、ニューヨーク）およびキシラ
ジン（１３ｍｇ／ｍｌＸバーバー−ロックバート、ザラ
ニー、カンザス）の混合物の筋肉内投与（０、２５ｍｌ
／　Ｉ　００ｇｍ）によって麻酔し、１％ＢＳＡを含有
する１００ｕｌダルベツコ培地中でウィルス粒子を鼻腔
内に感染させた。接種の間、動物の舌を引き出して飲み
込むことを防ぎ、ウィルスを鼻孔を通して等分量でゆっ
くりと投与した。

ハムスターを、致死量のケタミン塩酸塩イラジンを使用
して殺した。動物がまだ生きている間に、脇の下から死
ぬまでに採血した。胸腔を開き、気管の上部を通して、
１％ＢＳ八を含有するダルベツコ培地１．ｍｌをシリン
ダーおよび１６・Ｉ／２ゲージ針を用いて滴下および吸
引することで気管支洗浄物を最初に採取した。肺および
気管支を分離し、上記培地に懸濁し、アッセイするまで
一７０℃で凍結保存した。組織懸濁物を解凍し、小片に
切った後、ドーンス組織タラインダー（ワツｌ□ン・ザ
イエンテフィクス、ニューシャーシー）でホモジナイズ
した。ホモジナイズした組織懸濁物を１゜５００　Ｘｇ
で１５分間遠心して粒子状物質を除去した。

ハムスターでの感染を成立するために必要とされた最小
感染用量は、肺からのウィルス採取により測定したとこ
ろＩ　Ｏ″ｐ、　ｆ、　ｕ、と決定した。１０５ｐ、　
ｆ、　ｕ、の用量で感染させたハムスターでのウィルス
の複製は第５図に示す。感染２時間後、感染ウィルスは
気管支洗浄物、気管支または肺ポモジネイト内で発見さ
れなっかた。感染後、その日のみ気管で低収率が観察さ
れ、同様の力価のウィルスが気管支洗浄物で感染の第３
日日まで見られた。ウィルスは、感染の日まで感染動物
の肺で採取され、力価は２日目には３　Ｘ　Ｉ　Ｏ’／
ｇｍまで増加した。力価は３日目および４日目で徐々に
減少しその後ウィルスが探知されなくなった。

感染攻撃後第３］コ目に免疫動物および対照からえたウ
ィルスの確認は第１表に示ｄ−ｏ同様のウィルス力価を
、最低用量のホルマリン不活性化ウィルス蛋白（６０ｕ
ｇ）を用いて免疫したハムスターおよび非免疫対照動物
から得た。１．かじながら、２０ｕｇまたは４０ｕにの
エンベロープ蛋白を用いて免疫した動物はそれらの肺で
減少したウィルス力価を示した。同様のウィルス力価が
１２０または２４０ｕｇのホルマリン不活性化ウィルス
蛋白を用いた動物から確認された。８０ｕｇのエンベロ
ープ蛋白用量を用いて免疫した動物は感染攻撃の後それ
らの肺でいかなる探知しうるウィルスも示さなかった。

この群の動物から得られる肺ポモジネイトを大型組織培
養皿（１００ｍｍ）でさらに高い量の接種物（０，６ｍ
１）を用い、プラークアッセイによって試験し、低レベ
ルの感染ウィルスを探知した。９動物の内２動物以りが
高い重の接種により極めて低レベル（３，３ｘｌＯ’お
よび４．４Ｘ１０’ｐｒ、　ｕ、　／ｇｍ）でウィルス
の存在を示し、感染性が残りの動物では検知されなかっ
た。これらの結果はエンベロープ糖蛋白を用いた免疫が
、ハムスターでの感染攻撃に対する用量に応じた保護免
疫応答を誘導したことを示している。他方、ホルマリン
不活性化ウィルスによる免疫が感染ウィルスの力価を減
少ずろが、最高用量で試験しても完全な保護を与えない
。

第１表　感染ウィルスで免疫したノ＼ムスターに対する
攻撃 免疫抗原　　　　　　　感染攻撃の７２時間後肺からの
ウィルス検出量（ｐ、　ｒ、　ｕ、　／ｇｍ）非免疫対
照ハムスター　　　　　１．ｌＸｌ０’６０ｕｇ不活化
全ウィルス蛋白　　　４．２ＸＩ０３１２０ｕｇ不活化
全ウィルス蛋白　　　３．０ｘｌＯ’２４ｆｌｕｇ不活
化全ウィルス蛋白　　　２，９ＸｌＯ’２０１ｇエンベ
ロープ蛋白　　　　　　２．５ＸＩＯ’ＡＯｕｇエンヘ
ローブ蛋白　　　　　　２．３ＸＩＯ’８０ｕｇエンベ
ロープ蛋白　　　　　＜　　ｌＸｌ０’１０’ｐｆｕを
鼻腔内に接種した ｌ） 番屋は、各用量のエンベロープ蛋白または不活化全ウィ
ルス蛋白で免疫した９動物からｉ４た相乗平均力価を表
す。

最高用量の抗原で免疫し、両方のウィルス糖蛋白に対し
て血清抗体応答を示す動物の群を、感染攻撃後気管支洗
浄物内での抗ウイルス抗体の存在について評Ｇ１１ｉ　
Ｌ−た９、両方の免疫群から得た気管支洗浄物はＥＬＩ
ＳＡ法でｌ／１００の希釈まで反応性を持つことか分か
った。感染攻撃後の免疫していない対照ハフ２スターか
ら得た気管支清浄物はいかなる反応性ら、Ｊミさなか−
、た。気管支洗浄物中でウィルス性エンベ［ノーブ糖蛋
白に特異的なＩｇＧ抗体の存在はざらに非固定ウィルス
感染Ｌ　Ｌ　ＣＭ　Ｋ　、細胞およびやぎ抗ハムスター
１ｇＧＦＩＴＣコンンコゲ−１・を用いた間接免疫蛍光
法によって確認した。両方のＩｔＴの免疫動物から得た
気管支洗浄物は免疫ｉ１２光法において、非免疫対照と
は異なり陽性であることがわっかた。

気管支洗浄物はまた、３１−１−グルコザミン標識ウィ
ルスを用いた免疫沈降実験によって測定した。

両免疫群動物はウィルストＩＮおよびＦ糖蛋白に対して
特異的な抗体の存在を示し）こが非免疫攻撃動物は、こ
れら２つの糖蛋白に対する明確な抗体を示さなかった。

実施例４ この実施例は、ひとバラインフルエンザ３ウイルスのト
ＩＮおよびＦ細組Ｇｌｉこ対するモノクローナル抗体の
製造に関する前駆体を現す。

冷凍および解凍を繰り返す（１０回）ことにより粉砕し
たウィルスを用いてＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスを免
疫化した。各々１０Ｂ９のウィルス蛋白質を用いた全部
で５回の筋肉内免疫処置を３目間隔で行なった。最初の
免疫処置はフロイント完全アジロ。

バントを含むものであった。最後の注射の３日後にポリ
エチレングリコール４０００を用いてリンパ節細胞を非
分泌性ミエローマセルライン（Ｘ６３？Ａｇ８．６５３
）と融合させた３、初めにＥＬＩＳＡ、（エンザイムー
リンク）・イムノソルベントアッセイ）により培養液の
スクリーニングを行ない、ミクロタイタープレート中制
限希釈によりクローニングを行なった。ヒボキサンチン
、アミノプテリンおよびデミジンを含むＲＰＭｌｌ、６
４０培地において融合細胞を培養した。初めに、抗原と
して粉砕されたピリオンを用いたＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ八によ
り、生長しているコしｌニーから得た培養液をスクリー
ンした。ウィルス抗原に対して反応を示す培養をミクロ
タイタープレート中において制眼希釈によりクローンし
た。さらにクローンされた細胞から得た培養液に、免疫
蛍光法、赤血球凝集阻害、ノイラミニダーゼ阻害、感染
力の無力化および免疫沈降試験を行なうことによりそれ
らの抗体特異性を確認した。アルカリ性ホスファターゼ
に結合させたやぎ抗マウスアイソタイプ特異的抗体を用
いた（サザーン・バイオテクノロジー・アソーシエーツ
、インコーホレイチット、バーミンガム、アラバマ）Ｅ
ＬＩＳΔによりアイソタイプを測定した。腹水から抗体
を大規模製造するため、ハイブリドーマ細胞を７１クス
に腹膜腔内接種した。全部で２３のモノク〔Ｊ−ナル抗
体を得たが、そのうし２０についてはＩ−Ｉ　Ｎ　（糖
蛋白）および１つについてはＦ（糖蛋白）に対するもの
であることが測定された。

赤血球凝集阻害（ＩＮ＋　）、ノイラミニダーゼ阻害（
Ｎｌ）、固定および非固定化ウィルス感染細胞を用いた
免疫蛍光法および放射能標識されたウィルス感染リゼイ
トを用いた免疫沈降を測定することによりモノクローナ
ル抗体特異性を測定シタ。これらのアッセイの各々に対
するプロトコルの概略を次に示す。

（１）赤血球凝集阻害（１−１１）：メタ過ヨウ素酸ナ
トリウムを用いて血清をつくり、阻害剤を含む存在しう
るシアル酸を破壊した。試験血清またはモノクローナル
抗体の血清２倍希釈液を９６ウエルのミクロタイタープ
レート中Ｐ　Ｂ　Ｓ　（Ｃａ”および Ｍ　ｇ＋２は無い）で調製した。次いで、８赤面球凝集
単位のウィルスけん濁液（５０μＱ）を各ウェルに加え
、３７℃で１時間インキュベートした。次いでＰ　Ｂ　
Ｓ　（Ｃａ４′’およびＭｇ＋２は含まず）中ひつじ赤
血球の０．３％けん濁液１００μρを各ウェルに加え、
陰性および陽性対照について各々澄明なボタンまたは赤
血球凝集が観察されるまでプレートを４℃で約２時間イ
ンキュベートした。Ｉ−１１力価を完全に赤血球凝集を
ト１１害した血清の最高希釈液の逆数として表イっオ。

（ｉｉ）ノイラミニダーゼ阻害（Ｎｌ）＋０．２モルの
酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５、５）中ハイブリトーマ
腹水液の血清２倍希釈液（５０μのを等容量のウィルス
けん濁液（４００μｇ／ｖｒρ）と混合し、３７℃で１
時間インキュベートした。次いで同緩衝液に溶かしたＯ
、１ｍｇのうしフェツイン（ＩＶ型）（１５ｏ／Ｈの（
シグマ・ケミカル・カンパニー、セントルイス、ミズー
リ）を加え、反応混合物を３７℃で一夜インキコベート
した。放出されたノイラミン酸をワレン（Ｗａｒｒｅｎ
）法により測定した。腹水液を含まない反応混合物を対
照として用いた。

ノイラミニダーゼ力価を、５０％阻害をもたらした最高
希釈液の逆数として表わす。

（ｉｉｉ）感染力の無力化（中和）、試験血清またはハ
イブリドーマ」１清の血清２倍希釈液を、Ｉ％ＢＳＡ含
有ダルベツコ（Ｉ）　ｕｌｂｅｃｃｏ）培地中で等容量
のウィルスけん濁液（１００ｐ、ｌｕ、　、プラーク形
成単位）と混合し、３７℃で１時間インキュベートした
。インキュヘーション後、０．２叶の混合物を組織培養
血中でヘロ（Ｖｅｒｏ）細胞単細胞層に加え、プラーク
検定について記載された処置を行なった。中和力価を、
５０％のプラーク形成阻害を示した最高希釈血清として
表わした。

（１ｖ）免疫沈降：気管支洗浄液（４００μの、試験血
清またはモノクローナル抗体（２０μのを溶解緩衝液中
希釈して１ｍｇとし、ＬＬＣ−ＭＫ、細胞のアセトン粉
末を用いて充分に吸収させた。溶解緩衝液の組成は、０
，０５モルトリス−ｏｃｔｌ、ｐＨ７，４，０，１５モ
ルＮａＣ（２，０，００１モルＥ１）ＴＡ、１％デオキ
シコール酸ナトリウム、１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）
Ｚ−１００および０１％Ｓ　Ｉ）Ｓであった。細胞くず
を遠心分離により除去した。

上清部分を３５８−メチオニン−標識ウィルス−感染Ｌ
ＬＣ−ＭＫ２細胞リゼイトまたは精製″Ｉ］−グルコザ
ミンー標識ウィルスと混合し、４℃で一夜回転ミキザー
中でインキクベートした。予め測定された量のプロティ
ンＡアガロース（ピアス・ケミカル・カンパニー、ＵＳ
Ａ）を抗原抗体混合物に加え、同様の状態で２時間イン
キュベートシた。

免疫吸着ビーズを遠心分離により集め、冷溶解緩衝液に
より４回洗浄した。最後に免疫沈降を５ＤＳ−ＰＡＧＥ
（ドデンル硫酸す］・リウムーポリアクリルアミドゲル
電気泳動）、次いでオートラジオグラフィーまたはフル
オログラフィーにより分析した。

（ｖ）ウィルス誘発性細胞融合の阻害；マルチウェル組
織培養面においてＤ　ＩＩ　Ｋ細胞の全面性単細胞層を
生育し、１１ｆ１述のようにウィルスにより感染させた
。感染６時間後、細胞を培養培地で洗浄し、前免疫血清
または試験血清の２倍希釈液を含有する新鮮な培地（５
６℃で３０分間加熱活性化を行なった）と置き換え、イ
ンキコベーションをさらに３０時間続けた。感染細胞単
細胞層をＰＢＳで洗浄し、メタノールで固定化した。細
胞単細胞層をギームザ（Ｇｉｅｍｓａ）で染色し、ニコ
ン（Ｎ　１ｋｏｎ）位相差顕微鏡で観察した。

（ｖｌ）エンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ
（Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ）：ダイナチク（ｒ）ｙｎａｔｅ
ｃｈ）ポリビニルプレーＩ・を１μ９蛋白質／ウエルま
たはボレー　ｌ−−緩衝食塩水＋　００Ｊｌｆ２（ｐＨ
８，３）中精製された凍結解凍粉砕ピリオンで、−夜４
℃でインキコベーンヨンすることにより被覆した。生理
食塩水で３回洗浄後プレートを上記緩衝液中１％うし血
清アルブミン（シグマ・ケミカル・カンパニー、セント
ルイス、ミズーリ）により室温で１時間かけて充填し、
（ＬＬＣ−ＭＫｔ細胞）のアセトン乾燥粉末により充分
に吸着させた）をブロックし、抗原被覆ウェルに加え、
３７℃で１時間インキュベートした。プレートを３回洗
浄し、やぎ抗ハムスター１ｇＧ（カッペル・ラボラトリ
ーズ、フィラデルフィア、ペンシルベニア）の適当な希
釈ｅ（チェッカーボード滴定により測定）を各ウェルに
加え、さらに１時間３７℃でインキコベートした。再び
プレートを洗浄し、アルカリ性ホスファターゼにコンジ
ュゲートしたうさぎ抗ヤギＴｇ（シグマ・ケミカル・カ
ンパニー、セントルイス、ミズーリ）の適当な希釈液１
００μρを各ウェルに加え、３７℃でさらに１時間イン
キュベートした。最後に、プレートを洗浄し、０．５モ
ルのＭ　ｇ　Ｃ（ｌ　ｔを含む１０％ジェタノールアミ
ン緩衝液（ｐ＋−１９、６）中ｐ−ニトロフェニルホス
フエート（シグマ・ケミカル・カンパニー、セントルイ
ス、ミズーリ）１００μｇを各ウェルに加えた。３０分
間インキコヘーション後、分光光度計（タイターチク・
マルヂスキャン・エムシー、フロー・ラボラトリーズ）
を用いて着色反応を４０５ｎｍで読み取った。

（ｖＩＩ）免疫蛍光法（ＩＰ）＋ｉ、ｉ、Ｃ−ＭＫ、細
胞の全面性単細胞層をカバースリップ上で生育し、前述
のようにウィルスで感染させた１、感染後２４時間目に
細胞をＰＢＳで洗浄した。試験サンプルを感染細胞に適
用し、室温で１５分間インキュベー１・した。ＰＴ３Ｓ
で洗浄後、フルオレセインイソチオシアネートにコンジ
ユゲートしたヤギ抗ハムスターｉｇＧ（カッペル・ラボ
ラトリーズ、フィラデルフィア、ペンノルベニア）を加
え、さらに１５分間インキュベートシた。Ｐ　Ｂ　Ｓで
大規模に洗浄後、カバースリップをＩ’　＋３３および
グリセロールからなる溶液を用い、顕微鏡スライド」二
にのせ、ニコン製蛍光顕微鏡により観察した。

−に記のように、２３の抗体のうち２０が、ＨＩ、Ｎｌ
およびＮＴ試験にお＋′Ｊる顕著な反応性に基づくとＩ
−Ｉ　Ｎ糖蛋白質に対するものであった。これらの抗体
の反応性の概略を第２表に示す。クローンＬ−４，３か
らの抗体はほとんどＨＩまたはＮｌ力価を示さなかった
が、低希釈度でウィルス感染力を中和し得るものであり
、ウィルス誘発性細胞融合を阻害したことにより、それ
がＦ糖蛋白質に対して特異的であることがわかった。さ
らにこれらの特異性を、ウィルスエンベロープのＨＮお
よびＦ成分として既に認められた単離ポリペプチドを用
い、これらの特異性を反応性により確認した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、オクチルグルコシドによるＰＩ３ウイルスエ
ンヘロープ成分の可溶化を示ず。３Ｈ−ロイシン標識Ｐ
Ｉ３ウィルス（レーンｌ）をオクチルグルコシドで処理
し、清浄剤不溶（レーン２）および可溶（レーン３）フ
ラクションを５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。３ｔｒ−グ
ルコサミン標識ＰＩ３ウィルス（レーン４）、その清浄
剤不溶（レーン５）および可溶（レーン６）フラクショ
ンの糖蛋白プロフィールを同様に分析した。レーン５に
おけるポリペプチドへの３ｌ−１＝標識とりこみは、ア
ミノ酸前駆体への代謝的変換を示す。 第２Ａ、２Ｂ図は、ウィルスエンベロープ蛋白（第２Ａ
図）の３用量またはホルマリン不活性ウィルス蛋白（第
２Ｂ図）の対応用量の１回皮下投与免疫化後週間隔で採
取したハムスター血清の血球凝集抑制力価を示す。力価
は、エンベロープ蛋白２０μｇ（○−○）、４０μｇ（
△−△）、８０μｇ（ローロ）およびホルマリン不活化
ウィルス蛋白６０μ９（〇−〇）、１２０μＱ（△−△
）、２４０μｇ（ローロ）で免疫した動物９匹の平均値
で示す。免疫前および非免疫ハムスター３匹の血清力価
はく１６であった。 第３Ａ、３Ｂ図は、ウィルスエンベロープ蛋白（第３Ａ
図）の３用楕またはポルマリン不活化ウィルス蛋白（第
３Ｂ図）の対応用量の１回皮下投与免疫化後週間隔で採
取したハムスター血清の中和抗体力価を示す。力価は、
エンベロープ蛋白２０μ９（○−○）、４０μｇ（△−
△）、８０７Ｂ（ローロ）およびホルマリン不活化ウィ
ルス蛋白６０μ９（〇−〇）、１２０μ９（△−△）、
２４０μｇ（ローロ）で免疫した動物９匹の平均値で示
す。免疫前および非免疫ハムスター３匹の血清力価はく
１０であった。 第４図は、’Ｉ−Ｔ−グルコサミン標識精製ウィルスと
代表的ハムスター血清および気管支洗液の免疫沈降を示
す。３Ｈ−グルコザミン標識ウィルス（レーンｌ）の糖
蛋白プロフィルとエンベロープ蛋白８０μｇ（レーン２
および３）または不活性ウィルス蛋白２４０μｇ（レー
ン４および５）で免疫したハムスターの血清による免疫
沈降物でＳ　Ｉ）　Ｓ　−Ｉ）ＡＧＥで分析した。エン
ベロープ蛋白８０μ９（レーン６）または不活化ウィル
ス蛋白２４０μ９（レーン７）で免疫したハムスターの
感染試行後の気管支洗液による免疫沈降物を同様に分析
した。 第５図は、ハムスター中でのＩ）　Ｉ　３ウイルスの複
製を示す。３匹の実験動物からの気管支洗液（総ｐｆｕ
）および肺または気管（ｐｆ　ｕ／　９ｍ）からのウィ
ルス収率を示す。 特許出願人　リザーヂ・コーポレイション代　理　人　
弁理士　前出　葆　はか１名図面の浄書（内容に変更な
し） 第１図 第２Ａ区１ 免疫後の週数 第２Ｂ図 免疫後の週数 第３Ａ図 第３Ｂ図 第４図 第５図 感染後日数

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）有効成分として、脂質と複合した少なくとも１種
   の免疫原性ウィルスエンベロープ糖蛋白の免疫原的有効
   量を含有し、所望により医薬として許容される担体を配
   合してなる、ウィルス性疾患の予防用ワクチン組成物。
2. （２）ウィルスが、ヘルペスウィルス、インフルエンザ
   ウイルス、狂犬病ウィルス、パラミクソウィルス類、Ｈ
   ＴＬＶ類からなる群から選ばれたものである、特許請求
   の範囲第１項記載の組成物。
3. （３）糖蛋白が、レセプター結合蛋白または融合糖蛋白
   である、特許請求の範囲第１または２項記載の組成物。
4. （４）ウィルスがパラミクソウィルスである、特許請求
   の範囲第１−３項の何れか１項記載の組成物。
5. （５）Ｆ糖蛋白を含む、特許請求の範囲第１−４項の何
   れか１項記載の組成物。
6. （６）Ｆ糖蛋白およびＨＮ糖蛋白の両者を含む、特許請
   求の範囲第１−５項の何れか１項記載の組成物。
7. （７）ウィルスがパラインフルエンザウィルスである、
   特許請求の範囲第１−６項の何れか１項記載の組成物。
8. （８）ウィルスがパラインフルエンザウィルス３である
   、特許請求の範囲第１−７項の何れか１項記載の組成物
   。
9. （９）ウィルスがヒトパラインフルエンザウィルス３で
   ある、特許請求の範囲第１−３項の何れか１項記載の組
   成物。
10. （１０）糖蛋白と脂質の両者がウィルスエンベロープに
    由来するものである、特許請求の範囲第１−９項の何れ
    か１項記載の組成物。
11. （１１）脂質がウィルスエンベロープ以外の資源に由来
    するものである、特許請求の範囲第１−１０項の何れか
    １項記載の組成物。
12. （１２）脂質がレシチンである、特許請求の範囲第１−
    １１項の何れか１項記載の組成物。
13. （１３）透析可能な清浄剤、少なくとも１種の溶解糖蛋
    白、および溶解脂質を含む溶液を、清浄剤を除去するに
    充分な時間透析し、糖蛋白・脂質複合体を生成させるこ
    とを特徴とする、ウィルス性疾患の予防用ワクチン組成
    物の製造方法。
14. （１４）糖蛋白および脂質が、ウィルスエンベロープを
    透析可能な清浄剤で抽出することにより溶解されたもの
    である、特許請求の範囲第１３項記載の方法。
15. （１５）パラインフルエンザＦ糖蛋白に特異性を有する
    モノクローナル抗体の採取可能な量を分泌する連続ハイ
    ブリドーマセルライン。
16. （１６）ＡＴＣＣ・ＨＢ８９３５の同定特性を有する、
    特許請求の範囲第１５項記載のセルライン。
17. （１７）ひとパラインフルエンザ３ＨＮ糖蛋白に特異性
    を有するモノクローナル抗体の採取可能な量を分泌する
    セルラインであって、ＡＴＣＣ・ＨＢ８９３４の同定特
    性を有するものである、連続ハイブリドーマセルライン
    。
18. （１８）特許請求の範囲第１５−１７項の何れかに記載
    のセルラインが生産するモノクローナル抗体。
19. （１９）有効成分として、特許請求の範囲第１５−１７
    項の何れかに記載のモノクローナル抗体の免疫産成有効
    量を含有する、パラインフルエンザ感染予防用ワクチン
    組成物。
20. （２０）糖蛋白含有溶液を、特許請求の範囲第１５−１
    ７項の何れかに記載の固定化抗体と接触させることを特
    徴とする、パラインフルエンザ糖蛋白の精製方法。