CN103889460B - 改进的hcv疫苗及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本文公开改进的抗-HCV免疫原和编码它们的核酸分子。所公开的免疫原包括具有共有序列HCV基因型1a，包括例如NS4B、NS5A和NS5B的那些免疫原。本文公开药物组合物、包含其的重组疫苗和活减毒疫苗，还公开在个体中诱导针对HCV的免疫应答的方法。

Description

改进的HCV疫苗及其使用方法

发明领域

本发明涉及改进的HCV抗原和由其制成的疫苗、以及用于针对HCV诱导免疫应答并预防性和/或治疗性免疫个体的改进的方法。

发明背景

申请人公开了2011年4月29日提交的共同待决的美国专利申请号13/127,008，其公开内容各自以引用的方式并入本文。

丙型肝炎(HCV)是一种小型包膜的正链RNA病毒，它代表全世界范围内的一个主要的健康问题，当前有多于1.7亿个体被感染此病毒[Thomson,B.J.和R.G.Finch,HepatitisCvirusinfection.ClinMicrobiolInfect,2005.11(2):第86-94页]。最成功的所有人类病毒之一HCV潜在地感染肝细胞并且能够存留在所有感染个体的高达70％的肝中[Bowen,D.G.和C.M.Walker,AdaptiveimmuneresponsesinacuteandchronichepatitisCvirusinfection.Nature,2005.436(7053):第946-52页]。据估计，高达30％的慢性感染个体将在其寿命中发展进行性肝疾病，包括肝硬化和肝细胞肝癌(HCC)，使得HCV感染成为世界上肝移植的主要原因。另外，HCV和HBV感染与所有HCC病例的70％有牵连，所述HCV和HBV感染是全世界癌症死亡的第三主要原因[Levrero,M.,Viralhepatitisandlivercancer:thecaseofhepatitisC.Oncogene,2006.25(27):第3834-47页]。

由于病毒的持久性质，HCV感染治疗起来会非常困难且昂贵。大多数感染个体并不接受治疗。然而，接受治疗的个体平均支付17,700至22,000美元用于标准治疗方案[Salomon,J.A.等,Cost-effectivenessoftreatmentforchronichepatitisCinfectioninanevolvingpatientpopulation.Jama,2003.290(2):第228-37页]。在欧洲和北美最盛行的基因型1感染具有最差的预后，仅仅42％的个体响应于标准治疗[Manns,M.P.等,Peginterferonalfa-2bplusribavirincomparedwithinterferonalfa-2bplusribavirinforinitialtreatmentofchronichepatitisC:arandomisedtrial.Lancet,2001.358(9286):第958-65页]。

因此，慢性HCV的高感染盛行率、有效治疗的缺乏以及经济负担表明急需开发新型免疫治疗策略来对抗此疾病。当前没有针对HCV的预防性或治疗性疫苗。

理解对此病毒的适应性免疫对于设计策略如DNA疫苗来对抗病毒感染是至关重要的。虽然病毒特异性抗体在HCV感染之后7-8周检测到[Pawlotsky,J.M.,DiagnostictestsforhepatitisC.JHepatol,1999.31Suppl1:第71-9页]，但它们不能防范再感染[Farci,P.等,LackofprotectiveimmunityagainstreinfectionwithhepatitisCvirus.Science,1992.258(5079):第135-40页；Lai,M.E.等,HepatitisCvirusinmultipleepisodesofacutehepatitisinpolytransfusedthalassaemicchildren.Lancet,1994.343(8894):第388-90页]，并且在感染消退后它们会完全不存在[Cooper,S.等,AnalysisofasuccessfulimmuneresponseagainsthepatitisCvirus.Immunity,1999.10(4):第439-49页；Post,J.J.等,ClearanceofhepatitisCviremiaassociatedwithcellularimmunityintheabsenceofseroconversioninthehepatitisCincidenceandtransmissioninprisonsstudycohort.JInfectDis,2004.189(10):第1846-55页]。

因此，针对HCV开发疫苗的一个主要挑战是，不像其中已经产生成功的抗体基疫苗的其它肝炎病毒如甲型肝炎和乙型肝炎，防范HCV感染似乎并不是抗体介导的。虽然免疫保护的确切相关性仍然需要阐述，但对急性感染患者和黑猩猩的大量研究已提供了有力的证据证明定向针对病毒的更遗传保守的非结构区域的强辅助T1(Th1)应答与HCV感染的清除率有关。参见Missale,G.等,DifferentclinicalbehaviorsofacutehepatitisCvirusinfectionareassociatedwithdifferentvigoroftheanti-viralcell-mediatedimmuneresponse.JClinInvest,1996.98(3):第706-14页；和Diepolder,H.M.等,PossiblemechanisminvolvingT-lymphocyteresponsetonon-structuralprotein3inviralclearanceinacutehepatitisCvirusinfection.Lancet,1995.346(8981):第1006-7页。而且，重要的是已显示HCV特异性T细胞定位于肝而非周围血液对于病毒量的减小和急性感染的清除都至关重要。参见Thimme,R.等,DeterminantsofviralclearanceandpersistenceduringacutehepatitisCvirusinfection.JExpMed,2001.194(10):第1395-406页；和Shoukry,N.H.等,MemoryCD8+TcellsarerequiredforprotectionfrompersistenthepatitisCvirusinfection.JExpMed,2003.197(12):第1645-55页

此外，似乎产生早期多特异性肝内CD4+辅助和CD8+细胞毒性T细胞应答的感染个体倾向于显示出HCV感染消除[Lechner,F.等,AnalysisofsuccessfulimmuneresponsesinpersonsinfectedwithhepatitisCvirus.JExpMed,2000.191(9):第1499-512页；Gerlach,J.T.等,RecurrenceofhepatitisCvirusafterlossofvirus-specificCD4(+)T-cellresponseinacutehepatitisC.Gastroenterology,1999.117(4):第933-41页；Thimme,R.等,DeterminantsofviralclearanceandpersistenceduringacutehepatitisCvirusinfection.JExpMed,2001.194(10):第1395-406页；Grakoui,A.等,HCVpersistenceandimmuneevasionintheabsenceofmemoryTcellhelp.Science,2003.302(5645):第659-62页]。

DNA疫苗相对于更加传统的疫苗接种法具有许多概念上的优点，如活减毒病毒和重组蛋白基疫苗。DNA疫苗安全、稳定、容易生产并且在临床试验的人中具有良好耐受性，这表明质粒整合的迹象微乎其微[Martin,T.等,PlasmidDNAmalariavaccine:thepotentialforgenomicintegrationafterintramuscularinjection.HumGeneTher,1999.10(5):第759-68页；Nichols,W.W.等,PotentialDNAvaccineintegrationintohostcellgenome.AnnNYAcadSci,1995.772:第30-9页]。另外，DNA疫苗非常适于反复施用，因为疫苗的效果实际上不受到对于载体预先存在的抗体滴度的影响[Chattergoon,M.、J.Boyer以及D.B.Weiner,Geneticimmunization:anewerainvaccinesandimmunetherapeutics.FASEBJ,1997.11(10):第753-63页]。然而，在移至较大动物时，临床采用DNA疫苗的一个主要障碍是平台免疫原性的降低[Liu,M.A.和J.B.Ulmer,HumanclinicaltrialsofplasmidDNAvaccines.AdvGenet,2005.55:第25-40页]。DNA疫苗免疫原工程化中的近期技术进展如密码子优化、RNA优化和添加免疫球蛋白前导序列已经提高了DNA疫苗的表达和免疫原性[Andre,S.等,IncreasedimmuneresponseelicitedbyDNAvaccinationwithasyntheticgp120sequencewithoptimizedcodonusage.JVirol,1998.72(2):第1497-503页；Deml,L.等,MultipleeffectsofcodonusageoptimizationonexpressionandimmunogenicityofDNAcandidatevaccinesencodingthehumanimmunodeficiencyvirustype1Gagprotein.JVirol,2001.75(22):第10991-1001页；Laddy,D.J.等,Immunogenicityofnovelconsensus-basedDNAvaccinesagainstavianinfluenza.Vaccine,2007.25(16):第2984-9页；Frelin,L.等,CodonoptimizationandmRNAamplificationeffectivelyenhancestheimmunogenicityofthehepatitisCvirusnonstructural3/4Agene.GeneTher,2004.11(6):第522-33页]，以及质粒递送系统方面的近期开发的技术如电穿孔[Hirao,L.A.等,Intradermal/subcutaneousimmunizationbyelectroporationimprovesplasmidvaccinedeliveryandpotencyinpigsandrhesusmacaques.Vaccine,2008.26(3):第440-8页；Luckay,A.等,EffectofplasmidDNAvaccinedesignandinvivoelectroporationontheresultingvaccine-specificimmuneresponsesinrhesusmacaques.JVirol,2007.81(10):第5257-69页；Ahlen,G.等,InvivoelectroporationenhancestheimmunogenicityofhepatitisCvirusnonstructural3/4ADNAbyincreasedlocalDNAuptake,proteinexpression,inflammation,andinfiltrationofCD3+Tcells.JImmunol,2007.179(7):第4741-53页]。另外，研究表明相比于单独的天然抗原，共有免疫原的使用能够增加细胞免疫应答的宽度[Yan.,J.等,EnhancedcellularimmuneresponseselicitedbyanengineeredHIV-1subtypeBconsensus-basedenvelopeDNAvaccine.MolTher,2007.15(2):第411-21页；Rolland,M.等,Reconstructionandfunctionofancestralcenter-of-treehumanimmunodeficiencyvirustype1proteins.JVirol,2007.81(16):第8507-14]。

编码HCVNS3和NS4的DNA疫苗公开在Lang,K.A.等Vaccine，第26卷，第49期，第6225-6231页(2008年11月)中。

因此，仍存在对于针对HCV的有效疫苗的需要。而且，仍存在对于治疗感染有HCV的个体的有效方法的需要。

发明概述

本发明的方面包括核酸分子，所述核酸分子包含编码选自包括以下各项的组的一个或多个蛋白质的编码序列：a)SEQIDNO:2；与SEQIDNO:298％同源的蛋白质；或SEQIDNO:2的免疫原性片段；b)SEQIDNO:4；与SEQIDNO:498％同源的蛋白质；或SEQIDNO:4的免疫原性片段；c)SEQIDNO:6；与SEQIDNO:698％同源的蛋白质；或SEQIDNO:6的免疫原性片段。在一些实施方案中，核酸分子可以缺少编码SEQIDNO:9的IgE前导序列的编码序列。优选地，核酸分子可以是选自包括以下各项的组的一个或多个序列：a)SEQIDNO:1；或与SEQIDNO:198％同源的编码序列；b)SEQIDNO:3；或与SEQIDNO:398％同源的编码序列；或c)SEQIDNO:5；或与SEQIDNO:598％同源的编码序列。在一些实施方案中，这些核酸分子缺少具有SEQIDNO:7或SEQIDNO:8的序列的IgE前导序列的编码序列。

另外，公开了包括治疗诊断患有HCV的受试者的方法的方面，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的核酸分子。

在另一方面，描述了选自由以下各项组成的组的蛋白质：a)SEQIDNO:2；与SEQIDNO:298％同源的蛋白质；或SEQIDNO:2的免疫原性片段；b)SEQIDNO:4；与SEQIDNO:498％同源的蛋白质；或SEQIDNO:4的免疫原性片段；或c)SEQIDNO:6；与SEQIDNO:698％同源的蛋白质；或SEQIDNO:6的免疫原性片段。在一些实施方案中，本文所述的蛋白质可以缺少具有序列SEQIDNO:9的IgE前导序列。

本文进一步描述了治疗诊断患有HCV的受试者的方法，包括施用本文所述的蛋白质。

另外，本文描述了药物组合物，包含本文提供的核酸分子和药学上可接受的赋形剂。此外，描述了药物组合物，包含本文提供的蛋白质和药学上可接受的赋形剂。

附图简述

图1：pConNS4B、pConNS5A和pConNS5B的剂量应答。用5μg、12.5μg或25μg的pConNS4B、pConNS5A和pConNS5B来免疫动物(n＝5)。动物接收总共两次肌内免疫，随后进行电穿孔，每次免疫相隔两周提供。最后一次免疫之后一周将动物处死，之后单独分离并分析脾细胞。通过使用IFN-γELISpot测定确定每只单独动物的应答，通过所述测定确定每种构建体的最优剂量。

图2：分离的脾细胞的IFN-γ+T细胞应答的流式细胞分析。自每只动物(n＝5)分离脾细胞并单独分析NS4B-、NS5A-或NS5B-特异性T细胞应答。脾细胞用R10(阴性对照)或NS4B、NS5A或NS5B肽池离体刺激5小时。孵育之后，细胞内染色细胞的IFN-γ，并使用流式细胞术来分析细胞。免疫特异性应答被报告为肽刺激的组中的IFN-γ+T细胞百分数减去R10刺激的组中的IFN-γ+T细胞百分数。所述图示出每组中的代表性动物。所示出的值是来自未处理组和免疫组的五只单独动物的平均应答。通过学生t检验测定显著性(*p<0.05，**p<0.005且***p<0.0005)。

图3：分离的脾细胞的免疫特异性IFN-γ+T细胞应答百分数的图形表示。值被报告为来自未处理组和免疫组的每只动物(n＝5)的A)平均CD4+IFN-γ+T细胞应答百分数和B)平均CD8+IFN-γ+T细胞应答百分数。通过学生t检验测定显著性(*p<0.05，**p<0.005且***p<0.0005)。

图4：分离的肝淋巴细胞的免疫特异性IFN-γ+T细胞应答百分数的图形表示。值被报告为来自未处理组和免疫组的每只动物(n＝5)的以下平均数(±SE)：A)CD4+IFN-γ+T细胞应答百分数和B)CD8+IFN-γ+T细胞应答百分数。通过学生t检验测定显著性(*p<0.05，**p<0.005且***p<0.0005)。

图5：自脾、静止肝和转染肝分离的淋巴细胞的IFN-γ+T细胞应答百分比的流式细胞分析。自每只动物(n＝5)分离淋巴细胞并单独分析NS4B-、NS5A-或NS5B-特异性T细胞应答。细胞内染色分离的淋巴细胞的IFN-γ，并使用流式细胞术来分析分离的淋巴细胞。所述图示出每组中的代表性动物。所示出的值是来自未处理组和免疫组的五只单独动物的平均应答(±SE)。通过学生t检验测定显著性(*p<0.05，**p<0.005且***p<0.0005)。

图6：自脾、静止肝和转染肝分离的淋巴细胞的IFN-γ+T细胞应答百分比的图形表示。值被报告为来自未处理组和免疫组的每只动物(n＝5)的以下平均百分数(±SE)：A)对于pConNS4B的CD4+IFN-γ+T细胞应答；B)对于pConNS5A的CD4+IFN-γ+T细胞应答；C)对于pConNS5B的CD4+IFN-γ+T细胞应答；D)对于pConNS4B的CD8+IFN-γ+T细胞应答；E)对于pConNS5A的CD8+IFN-γ+T细胞应答；F)对于pConNS5B的CD8+IFN-γ+T细胞应答。通过学生t检验测定显著性(*p<0.05，**p<0.005且***p<0.0005)。

图7：标准化为DAPI的NS4B、NS5A或NS5B表达的MFI比的图。对于每个组，对于每只动物(n＝5)捕获三个图像。对于每个图像计算NS4B、NS5A或NS5B的MFI值(红色)并将其标准化为DAPI的MFI值(蓝色)。所示出的值是来自未处理组和免疫组的五只单独动物的平均应答(±SE)。通过学生t检验测定显著性(*p<0.05，**p<0.005且***p<0.0005)。

图8示出以下质粒图谱：图8A表达构建体pConNS4B_pVAX1，包括共有抗原NS4B；图8B表达构建体pConNS5A_pVAX1，包括共有抗原NS5A；以及图8C表达构建体pConNS5B_pVAX1，包括共有抗原NS5B。

优选实施方案详述

如本文所使用的，措词"严格杂交条件"或"严格条件"是指这样的条件:在该条件下核酸分子将杂交另一核酸分子，但不杂交其它序列。严格条件是序列依赖性的并且在不同情况下将是不同的。较长序列在较高温度下特异性杂交。通常，对于在限定离子强度和pH下的特定序列，严格条件被选择为低于热熔点(Tm)约5℃。Tm是这样的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)：在该温度下平衡时，与靶序列互补的探针中的50％与靶序列杂交。由于靶序列通常过量存在，因此在Tm下平衡时50％的探针被占据。通常，严格条件是这样的条件：其中在pH7.0至8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子，通常约0.01至1.0M钠离子(或其它盐)，并且对于较短探针、引物或寡核苷酸(例如10至50个核苷酸)温度为至少约30℃，且对于较长探针、引物或寡核苷酸温度为至少约60℃。严格条件还可通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。

核苷酸和氨基酸的序列同源性可使用FASTA、BLAST和GappedBLAST(Altschul等,Nuc.AcidsRes.,1997,25,3389，其以引用的方式整体并入本文)以及PAUP*4.0b10软件(D.L.Swofford,SinauerAssociates,Massachusetts)来测定。“相似性百分比”使用PAUP*4.0b10软件(D.L.Swofford,SinauerAssociates,Massachusetts)来计算。共有序列的平均相似性是相较于系统发生树中的所有序列来计算。

简言之，BLAST算法(表示基本局部比对搜索工具(BasicLocalAlignmentSearchTool))适用于确定序列相似性(Altschul等,J.Mol.Biol.,1990,215,403-410，其以引用的方式整体并入本文)。进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)公开获得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。该算法包括首先通过鉴定在查询序列中长度W的短字串，该字串与数据库序列中相同长度的字串比对时匹配或者满足某些正数值阈值分值T，从而来鉴定高分序列配对(HSP)。T被称为邻近字串分值阈值(Altschul等，同上)。这些初始邻近字串命中作为用于起始搜索以发现含有它们的HSP的种子。只要累积序列比对分值可以增加，那么字串命中则在两个方向上沿每个序列延伸。字串命中在每个方向上的延伸当遇到下述情况时终止：1)累积序列比对分值从其获得的最大值下降了数量X；2)累积分值为零或零以下，这是由于一个或多个负分值残基比对的累积所致；或者3)到达任一序列的末端。Blast算法参数W、T和X决定所述比对的灵敏度和速度。Blast程序使用如下默认值：字长(W)为11，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1992,89,10915-10919，其以引用的方式整体并入本文)比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝4，以及两条链都比较。BLAST算法(Karlin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993,90,5873-5787，其以引用的方式整体并入本文)和GappedBLAST进行两个序列之间相似性的统计学分析。BLAST算法提供的一种相似性量度是最小和概率(P(N))，它提供两个核苷酸序列可能偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果一个核酸与另一核酸比较中的最小和概率小于约1、优选小于约0.1、更优选小于0.01、并且最优选小于约0.001，则认为该测试核酸与另一核酸相似。

如本文所使用的，术语“基因构建体"是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。编码序列包括可操作地连接至调控元件(包括能够在核酸分子所施用的个体的细胞内指导表达的启动子和聚腺苷酸化信号)的起始和终止信号。

如本文所使用的，术语"可表达的形式"是指含有可操作地连接至编码蛋白质的编码序列的必需调控元件的基因构建体，以使得当存在于个体的细胞中时，编码序列将被表达。

公开了改进的疫苗，所述疫苗源自用以设计不同DNA疫苗的多步骤方法，所述DNA疫苗可以增强细胞免疫应答，包括具体的定向针对病毒内的多保守区域的细胞毒性和IFN-γ和HCV特异性T细胞应答。产生修饰的共有序列，包括例如包括共有抗原NS4B、NS5A和NS5B的DNA疫苗。还公开了基因修饰，包括密码子优化、RNA优化以及高效免疫球蛋白前导序列添加。

改进的HCV疫苗是基于蛋白质和编码具有使它们作为可用以诱导出抗-HCV的免疫原特别有效的表位的蛋白质的基因构建体。

在一些实施方案中描述了核酸分子，所述核酸分子包含编码选自包括以下各项的组的一个或多个蛋白质的编码序列：a)SEQIDNO:2；与SEQIDNO:298％同源的蛋白质；或SEQIDNO:2的免疫原性片段；b)SEQIDNO:4；或与SEQIDNO:498％同源的蛋白质；或SEQIDNO:4的免疫原性片段；c)SEQIDNO:6；与SEQIDNO:698％同源的蛋白质；或SEQIDNO:6的免疫原性片段。在一些实施方案中，核酸分子可以缺少编码SEQIDNO:9的IgE前导序列的编码序列。优选地，核酸分子可以是选自包括以下各项的组的一个或多个序列：a)SEQIDNO:1；或与SEQIDNO:198％同源的编码序列；b)SEQIDNO:3；或与SEQIDNO:398％同源的编码序列；或c)SEQIDNO:5；或与SEQIDNO:598％同源的编码序列。在一些实施方案中，这些核酸分子缺少具有SEQIDNO:7或SEQIDNO:8的序列的IgE前导序列的编码序列。

因此，疫苗可诱导治疗或预防性免疫应答。在一些实施方案中，递送免疫原的方式是DNA疫苗、重组疫苗、蛋白质亚单位疫苗、包含免疫原的组合物、减毒疫苗或灭活疫苗。在一些实施方案中，疫苗包含选自由以下各项组成的组的组合：一种或多种DNA疫苗、一种或多种重组疫苗、一种或多种蛋白质亚单位疫苗、一种或多种包含免疫原的组合物、一种或多种减毒疫苗以及一种或多种灭活疫苗。

根据一些实施方案，疫苗被递送至个体以调节个体的免疫系统的活性并且由此增强针对HCV的免疫应答。当编码蛋白质的核酸分子被个体细胞所摄取时，核苷酸序列在细胞中表达并且蛋白质由此被递送至个体。提供：在核酸分子如质粒(作为重组疫苗的一部分和作为减毒疫苗的一部分，作为分离的蛋白质或载体的蛋白质部分)上递送蛋白质的编码序列的方法。

在另一方面，描述了选自由以下各项组成的组的蛋白质：a)SEQIDNO:2；与SEQIDNO:298％同源的蛋白质；或SEQIDNO:2的免疫原性片段；b)SEQIDNO:4；或与SEQIDNO:498％同源的蛋白质；或SEQIDNO:4的免疫原性片段；或c)SEQIDNO:6；与SEQIDNO:698％同源的蛋白质；或SEQIDNO:6的免疫原性片段。在一些实施方案中，本文所述的蛋白质可以缺少具有序列SEQIDNO:9的IgE前导序列。

另外，公开了包括治疗诊断患有HCV的受试者的方法的方面，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的核酸分子。

本文进一步描述了治疗诊断患有HCV的受试者的方法，包括施用本文所述的蛋白质。

另外，本文描述了药物组合物，包含本文提供的核酸分子和药学上可接受的赋形剂。此外，描述了药物组合物，包含本文提供的蛋白质和药学上可接受的赋形剂。

提供针对HCV预防性和/或治疗性免疫个体的组合物和方法。用于递送包含编码免疫原的核苷酸序列的核酸分子组合物可操作地连接至调控元件。组合物可包含：编码免疫原的质粒、包含编码免疫原的核苷酸序列的重组疫苗、编码本发明的蛋白质和/或包含本发明的蛋白质的活减毒病原体、包含本发明的蛋白质的灭活病原体、或包含本发明的蛋白质的组合物如脂质体或亚单位疫苗。本发明还涉及包含组合物的可注射的药物组合物。

SEQIDNO:1包含编码HCV蛋白NS4B的HCV基因型1a共有免疫原的核苷酸序列。SEQIDNO:1进一步包含连接至编码HCV蛋白NS4B的HCV基因型1a共有免疫原的核苷酸序列的IgE前导序列，连同IgE前导序列的另外的5’上游序列。SEQIDNO:2包含HCV蛋白NS4B的HCV基因型1a共有免疫原的氨基酸序列。SEQIDNO:2进一步包含连接至共有免疫原序列的IgE前导序列。IgE前导序列位于共有序列NS4B的N-末端，并且是SEQIDNO:9，并且可由SEQIDNO:8编码。

本文所述的共用抗原和由其制成的疫苗可以包括或已经去除IgE前导序列。

在一些实施方案中，疫苗优选包含SEQIDNO:2或编码其的核酸分子。在一些实施方案中，疫苗优选包含SEQIDNO:1。疫苗优选包含IgE前导序列SEQIDNO:9或编码其的核酸序列。

SEQIDNO:1的同源序列可包含90个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，SEQIDNO:1的片段可包含180个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含270个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含360个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含450个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含540个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含630个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含720个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含810个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，并且在一些实施方案中可包含870个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，SEQIDNO:1的片段可包含IgE前导序列的编码序列。在一些实施方案中，SEQIDNO:1的同源序列不包含IgE前导序列的编码序列。优选地，同源序列与SEQIDNO:1具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性，并且更优选具有98％或99％的同源性。在一些实施方案中，描述了SEQIDNO:1的免疫原性片段，以及优选地与SEQIDNO:1具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性且更优选98％或99％同源性的片段。

SEQIDNO:2的同源序列可包含30个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，SEQIDNO:2的片段可包含60个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含90个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含120个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含150个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含180个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含210个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含240个或更多个氨基酸；并且在一些实施方案中，可包含270个或更多个氨基酸。优选地，同源序列与SEQIDNO:2具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性，并且更优选具有98％或99％的同源性。在一些实施方案中，描述了SEQIDNO:2的免疫原性片段，以及优选地与SEQIDNO:2具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性且更优选98％或99％同源性的片段。

SEQIDNO:3包含编码HCV蛋白NS5A的HCV基因型1a共有免疫原的核苷酸序列。SEQIDNO:4包含HCV蛋白NS5A的HCV基因型1a共有免疫原的氨基酸序列。SEQIDNO:3进一步包含连接至编码HCV蛋白NS5A的HCV基因型1a共有免疫原的核苷酸序列的IgE前导序列，连同IgE前导序列的另外的5’上游序列。SEQIDNO:4包含HCV蛋白NS5A的HCV基因型1a共有免疫原的氨基酸序列。SEQIDNO:4进一步包含连接至共有免疫原序列NS5A的IgE前导序列。IgE前导序列位于共有序列NS5A的N-末端，并且是SEQIDNO:9，并且可由SEQIDNO:7编码。

SEQIDNO:3的同源序列可包含90个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，SEQIDNO:3的片段可包含180个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含270个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含360个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含450个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含540个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含630个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含720个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含810个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含900个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含990个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含1080个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含1170个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含1260个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含1350个或更多个核苷酸；并且在一些实施方案中，可包含1430个或更多个核苷酸。优选地，同源序列与SEQIDNO:3具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性，并且更优选具有98％或99％的同源性。在一些实施方案中，描述了SEQIDNO:3的免疫原性片段，以及优选地与SEQIDNO:3具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性且更优选98％或99％同源性的片段。

SEQIDNO:4的同源序列可包含30个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，SEQIDNO:4的片段可包含60个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含90个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含120个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含150个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含180个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含210个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含240个或更多个氨基酸；可包含270个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含300个或更多个氨基酸；可包含330个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含360个或更多个氨基酸；可包含390个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含420个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含450个或更多个氨基酸；并且在一些实施方案中，可包含470个或更多个氨基酸。优选地，同源序列与SEQIDNO:4具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性，并且更优选具有98％或99％的同源性。在一些实施方案中，描述了SEQIDNO:4的免疫原性片段，以及优选地与SEQIDNO:4具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性且更优选98％或99％同源性的片段。

SEQIDNO:5包含编码HCV蛋白NS5B的HCV基因型1a共有免疫原的核苷酸序列。SEQIDNO:6包含HCV蛋白NS5B的HCV基因型1a共有免疫原的氨基酸序列。SEQIDNO:5进一步包含连接至编码HCV蛋白NS5B的HCV基因型1a共有免疫原的核苷酸序列的IgE前导序列，连同IgE前导序列的另外的5’上游序列。SEQIDNO:6包含HCV蛋白NS5B的HCV基因型1a共有免疫原的氨基酸序列。SEQIDNO:6进一步包含连接至共有免疫原序列NS5B的IgE前导序列。IgE前导序列位于共有序列NS5B的N-末端，并且是SEQIDNO:9，并且可由SEQIDNO:8编码。

SEQIDNO:5的同源序列可包含90个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，SEQIDNO:5的片段可包含180个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含270个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含360个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含450个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含540个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含630个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含720个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含810个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含900个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含990个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含1080个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含1170个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含1260个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含1350个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含1440个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含1530个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含1620个或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含1710个或更多个核苷酸；并且在一些实施方案中，可包含1800个或更多个核苷酸。优选地，同源序列与SEQIDNO:5具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性，并且更优选具有98％或99％的同源性。在一些实施方案中，描述了SEQIDNO:5的免疫原性片段，以及优选地与SEQIDNO:5具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性且更优选98％或99％同源性的片段。

SEQIDNO:6的同源序列可包含30个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，SEQIDNO:6的片段可包含60个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含90个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含120个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含150个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含180个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含210个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含240个或更多个氨基酸；可包含270个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含300个或更多个氨基酸；可包含330个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含360个或更多个氨基酸；可包含390个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含420个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含450个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含480个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含510个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含540个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含570个或更多个氨基酸；并且在一些实施方案中，可包含600个或更多个氨基酸。优选地，同源序列与SEQIDNO:6具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性，并且更优选具有98％或99％的同源性。在一些实施方案中，描述了SEQIDNO:6的免疫原性片段，以及优选地与SEQIDNO:6具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性且更优选98％或99％同源性的片段。

根据一些实施方案，在个体中诱导针对免疫原的免疫应答的方法包括向所述个体施用HCV蛋白NS4B、NS5A或NS5B、其功能片段、或其可表达的编码序列或前述组合的HCV基因型1a共有免疫原的氨基酸序列。一些实施方案包括分离的核酸分子，其编码HCV蛋白NS4B、NS5A或NS5B或其片段的HCV基因型1a共有免疫原的氨基酸序列。一些实施方案包括重组疫苗，其编码HCV蛋白NS4B、NS5A或NS5B或其片段的HCV基因型1a共有免疫原的氨基酸序列。一些实施方案包括亚单位疫苗，其包含HCV蛋白NS4B、NS5A或NS5B或其片段的HCV基因型1a共有免疫原的氨基酸序列。一些实施方案包括活减毒疫苗和/或灭活疫苗，其包含HCV蛋白NS4B、NS5A或NS5B的HCV基因型1a共有免疫原的氨基酸序列。

改进的疫苗包含蛋白质和编码具有使它们作为可用于诱导抗-HCV免疫应答(具体诱导肝内HCV特异性T细胞免疫)的免疫原特别有效的表位的蛋白质的基因构建体。因此，可提供疫苗以诱导治疗或预防性免疫应答。在一些实施方案中，递送免疫原的方式是DNA疫苗、重组疫苗、蛋白质亚单位疫苗、包含免疫原的组合物、减毒疫苗或灭活疫苗。在一些实施方案中，疫苗包含选自由以下各项组成的组的组合：一种或多种DNA疫苗、一种或多种重组疫苗、一种或多种蛋白质亚单位疫苗、一种或多种包含免疫原的组合物、一种或多种减毒疫苗以及一种或多种灭活疫苗。

根据本发明的一些实施方案，疫苗被递送至个体以调节所述个体的免疫系统活性并且由此增强免疫应答。当编码蛋白质的核酸分子被个体的细胞摄取时，核苷酸序列在细胞中表达并且蛋白质由此被递送至个体。本发明的方面提供在核酸分子如质粒(作为重组疫苗的一部分和作为减毒疫苗的一部分，作为分离的蛋白质或载体的蛋白质部分)上递送蛋白质的编码序列的方法。

根据本发明的一些方面，提供预防性和/或治疗性免疫个体的组合物和方法。

DNA疫苗描述于美国专利号5,593,972、5,739,118、5,817,637、5,830,876、5,962,428、5,981,505、5,580,859、5,703,055、5,676,594以及本文中引用的优先权申请中，其均以引用的方式并入本文。除了这些申请中所述的递送方案之外，递送DNA的替代性方法还描述于美国专利号4,945,050和5,036,006中，其都以引用的方式并入本文。

本发明涉及改进的减毒活疫苗、改进的灭活疫苗、和改进的使用重组载体以递送编码抗原的外源基因的疫苗、以及亚单位疫苗和糖蛋白疫苗。减毒活疫苗、使用重组载体以递送外源抗原的那些疫苗、亚单位疫苗以及糖蛋白疫苗的实例描述于美国专利号：4,510,245；4,797,368；4,722,848；4,790,987；4,920,209；5,017,487；5,077,044；5,110,587；5,112,749；5,174,993；5,223,424；5,225,336；5,240,703；5,242,829；5,294,441；5,294,548；5,310,668；5,387,744；5,389,368；5,424,065；5,451,499；5,453,364；5,462,734；5,470,734；5,474,935；5,482,713；5,591,439；5,643,579；5,650,309；5,698,202；5,955,088；6,034,298；6,042,836；6,156,319以及6,589,529中，其均以引用的方式并入本文。

当被细胞摄取时，基因构建体可保持存在于细胞中作为功能性染色体外分子和/或整合到细胞的染色体DNA中。DNA可引入细胞中，在细胞中其保持为呈一个或多个质粒形式的单独的遗传材料。或者，可整合到染色体中的线性DNA可引入到细胞中。当将DNA引入细胞中时，可以添加促进DNA整合到染色体中的试剂。适用于促进整合的DNA序列还可包括在DNA分子中。或者，可对细胞施用RNA。还涵盖提供呈线性微型染色体形式的基因构建体，包括着丝粒、端粒以及复制起点。基因构建体可在减毒活微生物或在细胞中存活的重组微生物载体中保持为遗传材料的一部分。基因构建体可以是重组病毒疫苗的基因组的一部分，其中遗传材料整合到细胞的染色体中或保持在染色体外。基因构建体包括核酸分子的基因表达所必需的调控元件。元件包括：启动子、起始密码子、终止密码子以及聚腺苷酸化信号。另外，通常需要增强子用于编码靶蛋白或免疫调节蛋白的序列的基因表达。这些元件需要可操作地连接至编码所需蛋白质的序列，并且调控元件需要在其所施用的个体中是可操作的。

起始密码子和终止密码子通常被认为是编码所需蛋白质的核苷酸序列的一部分。然而，这些元件需要在基因构建体所施用的个体中有功能。起始密码子和终止密码子必须与编码序列同框。

所使用的启动子和聚腺苷酸化信号必须在个体的细胞内有功能。

适用于实施本发明，尤其在制造人用基因疫苗中实施本发明的启动子的实例包括但不限于：来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人类免疫缺陷病毒(MV)如BIV长末端重复(LTR)启动子、莫洛尼氏病毒、ALV、巨细胞病毒(CMV)如CMV即刻早期启动子、EB病毒(EBV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)以及来自人基因如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和人金属硫蛋白的启动子。

适用于实施本发明，尤其在制造人用基因疫苗中实施本发明的的聚腺苷酸化信号的实例包括但不限于：SV40聚腺苷酸化信号和LTR聚腺苷酸化信号。具体地说，使用在pCEP4质粒(Invitrogen,SanDiegoCA)中的SV40聚腺苷酸化信号，其称为SV40聚腺苷酸化信号。

除了DNA表达所需要的调控元件之外，其它元件也可包含在DNA分子中。这类另外的元件包括增强子。增强子可选自下组，所述组包括但不限于：人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和病毒增强子，如来自CMV、RSV和EBV的那些增强子。

可提供具有哺乳动物复制起点的基因构建体以便将构建体维持在染色体外并且在细胞中产生构建体的多个拷贝。来自Invitrogen(SanDiego,CA)的质粒pVAX1、pCEP4和pREP4含有EB病毒复制起点和核抗原EBNA-1编码区，该编码区产生高拷贝的附加型复制而没有整合。

在涉及免疫应用的一些优选实施方案中，递送核酸分子，所述核酸分子包含编码本发明的蛋白质的核苷酸序列，并且另外包含进一步增强针对这类靶蛋白的免疫应答的蛋白质的基因。这类基因的实例是：编码其它细胞因子和淋巴因子的那些基因，如α-干扰素、γ-干扰素、血小板源生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、上皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、MHC、CD80、CD86和IL-15(包括信号序列缺失并且任选地包含来自IgE的信号肽的IL-15)。可能有用的其它基因包括编码下列的那些基因：MCP-1、MIP-1α、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性NIK、SAPK、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANKLIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段

可添加另外的元件，如果出于任何原因希望消除接受基因构建体的细胞，则所述元件充当用于细胞破坏的靶。可表达形式的疱疹病毒胸苷激酶(tk)基因可包含在基因构建体中。药物更昔洛韦可施用至个体并且所述药物将引起任何产生tk的细胞的选择性杀死，由此提供选择性破坏具有基因构建体的细胞的方式。

为了最大化蛋白质制备，可选择调控序列，所述调控序列非常适用于构建体所施用的细胞中的基因表达。而且，可选择在细胞中最高效地转录的密码子。本领域技术人员可制备在细胞中具有功能的DNA构建体。

在一些实施方案中，可提供基因构建体，其中本文所述的蛋白质的编码序列连接至IgE信号肽。在一些实施方案中，本文所述的蛋白质连接至IgE信号肽。

在使用蛋白质的一些实施方案中，例如使用熟知的技术，本领域技术人员可使用熟知的技术来制备和分离本发明的蛋白质。在使用蛋白质的一些实施方案中，例如，本领域技术人员可使用熟知的技术来将编码本发明的蛋白质的DNA分子插入在熟知表达系统中使用的市售表达载体中。例如，市售质粒pSE420(Invitrogen,SanDiego,Calif.)可用于在大肠杆菌中制造蛋白质。市售质粒pYES2(Invitrogen,SanDiego,Calif.)可例如用于在酵母的酿酒酵母菌株中的制备。市售MAXBAC^TM完整杆状病毒表达系统(Invitrogen,SanDiego,Calif.)可例如用于在昆虫细胞中的制备。市售质粒pcDNAI或pcDNA3(Invitrogen,SanDiego,Calif.)可例如用于在哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞中的制备。本领域技术人员可使用这些商业表达载体和系统或其它载体和系统来通过常规技术和可容易获得的起始材料制备蛋白质。(例如参见Sambrook等,MolecularCloningaLaboratoryManual,第二版ColdSpringHarborPress(1989)，其以引用的方式并入本文)。因此，所需蛋白质可在原核和真核系统中制备，从而产生一系列加工形式的蛋白质。

本领域技术人员可使用其它市售表达载体和系统或使用熟知方法和可容易获得的起始材料来制备载体。含有需要的控制序列(如启动子和聚腺苷酸化信号、并且优选增强子)的表达系统对于多种宿主来说是容易获得的和本领域已知的。例如参见Sambrook等,MolecularCloningaLaboratoryManual,第二版ColdSpringHarborPress(1989)。基因构建体包括可操作地连接至启动子的蛋白质编码序列，所述启动子在构建体所转染的细胞系中具有功能。组成型启动子的实例包括来自巨细胞病毒或SV40的启动子。可诱导启动子的实例包括小鼠乳腺白血病病毒或金属硫蛋白启动子。本领域技术人员可由可容易获得的起始材料容易地制备适用于使用编码本发明的蛋白质的DNA转染细胞的基因构建体。使用包含编码蛋白质的DNA的表达载体来转化相容性宿主，然后培养所述宿主并保持在其中发生外源DNA表达的条件下。

制备的蛋白质通过使细胞裂解来从培养物中回收或者从对于本领域技术人员来说适当和已知的培养基中回收。本领域技术人员可使用熟知技术分离使用这类表达系统制备的蛋白质。使用如上所述特异性结合特定的蛋白质的抗体从天然来源纯化蛋白质的方法可同样应用于通过重组DNA方法制备的蛋白质的纯化。

除了通过重组技术来制备蛋白质，还可以使用自动肽合成器来制备分离的基本上纯的蛋白质。这类技术是本领域技术人员熟知的，并且适用于具有DNA-编码的蛋白质制备中未提供的取代的衍生物。

核酸分子可使用若干种熟知的技术中的任一种来递送，所述技术包括DNA注射(也称为DNA疫苗接种)、重组载体，如重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组牛痘。

施用途径包括但不限于肌内、鼻内、腹膜内、皮内、皮下、静脉内、动脉内、眼内和口服以及局部、透皮、通过吸入或栓剂施用、或对粘膜组织施用，如通过灌洗阴道、直肠、尿道、口腔和舌下组织施用。优选的施用途径包括肌内、腹膜内、皮内和皮下注射。基因构建体可通过这样的方式来施用，所述方式包括但不限于电穿孔方法和装置、传统注射器、无针注射装置或"微弹轰击基因枪法"。

优选用于促进DNA疫苗的递送的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括下列专利中描述者：美国专利号7,245,963(Draghia-Akli等)、美国专利公布2005/0052630(由Smith等递交)，其全部内容以引用的方式并入本文。还优选的是，于共同待决和共同拥有的美国专利申请序列号11/874072中提供的用于促进DNA疫苗的递送的电穿孔装置和电穿孔方法，所述美国专利申请提交于2007年10月17日，并且在35USC119(e)下要求下列申请的优先权：2006年10月17日提交的美国临时申请序列号60/852,149和2007年10月10日提交的美国临时申请序列号60/978,982，其均以引用的方式整体并入本文。

以下是使用电穿孔技术的实施方案的实例，并且在上述专利参考文献中更详细地讨论：电穿孔装置可被配置为递送产生类似于用户输入的预设电流的恒定电流的能量脉冲至哺乳动物的期望组织。电穿孔装置包括电穿孔部件和电极组件或手柄组件。电穿孔部件可包括且并有电穿孔装置的多种元件中的一种或多种，包括：控制器、电流波形产生器、阻抗试验器、波形记录仪、输入元件、状态报告元件、通信端口、记忆部件、电源和电源开关。电穿孔部件可充当电穿孔装置的一个元件，并且其它元件是与所述电穿孔部件通信的单独元件(或部件)。在一些实施方案中，电穿孔部件可充当电穿孔装置的多于一个元件，其可与电穿孔装置的独立于所述电穿孔部件的其它元件通信。使用电穿孔技术递送改进的HCV疫苗不受到现存作为一个机电或机械装置的部分的电穿孔装置的元件的限制，因为所述元件可充当与彼此通信的一个装置或单独元件。电穿孔部件能够递送在期望组织中产生恒定电流的能量脉冲，并且包括反馈机制。电极组件包括在空间布置中具有多个电极的电极阵列，其中电极组件从电穿孔部件接收能量脉冲，并且通过电极将所述能量脉冲递送至期望组织。多个电极中的至少一个在能量脉冲的过程中是中性的，并且测量期望组织中的电阻和将电阻通知电穿孔部件。反馈机制可接收所测量到的电阻，并且可调整由电穿孔部件递送的能量脉冲以保持恒定电流。

在一些实施方案中，多个电极可以分散型式来递送能量脉冲。在一些实施方案中，多个电极可以分散型式通过控制电极在编程序列下递送能量脉冲，并且编程序列由用户输入至电穿孔部件。在一些实施方案中，编程序列包含依序递送的多个脉冲，其中多个脉冲中的各脉冲通过至少两个有效电极(其中有一个中性电极测量电阻)来递送，并且其中多个脉冲的后续脉冲通过至少两个有效电极(其中有一个中性电极测量电阻)中的不同的那个来递送。

在一些实施方案中，反馈机制通过硬件或软件来执行。优选地，反馈机制通过模拟闭环电路来执行。优选地，该反馈每隔50μs、20μs、10μs或1μs发生，但优选是实时反馈或瞬时的(即，如通过用于测定应答时间的可用技术所测定，其基本上是瞬时的)。在一些实施方案中，中性电极测量期望组织中的电阻并将电阻通知反馈机制，并且反馈机制回应于电阻并调整能量脉冲以使恒定电流维持在类似于预设电流的数值下。在一些实施方案中，反馈机制在能量脉冲递送的过程中连续和瞬时地维持恒定电流。

在一些实施方案中，核酸分子是结合多核苷酸功能增强子或基因疫苗促进剂的施用而递送至细胞。多核苷酸功能增强子描述于美国序列号5,593,972、5,962,428和1994年1月26日提交的国际申请序列号PCT/US94/00899，其均以引用的方式并入本文。基因疫苗促进剂描述于1994年4月1日提交的美国序列号021,579中，其以引用的方式并入本文。结合核酸分子施用的辅剂可作为与核酸分子的混合物来施用，或者在核酸分子施用的同时、之前或之后单独施用。另外，可用作转染剂和/或复制剂和/或炎症剂并且可与GVF共同施用的其它药剂包括：生长因子、细胞因子和淋巴因子，如a-干扰素、γ-干扰素、GM-CSF、血小板源生长因子(PDGF)、TNF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和IL-15以及成纤维细胞生长因子、表面活性剂如免疫刺激性复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰基脂质A(WL))、胞壁肽、醌类似物和囊泡如三十碳六烯和角鲨烯，并且透明质酸也可与基因构建体结合而使用施用。在一些实施方案中，免疫调节蛋白可用作GVF。在一些实施方案中，联合提供核酸分子与PLG以增强递送/摄取。

根据本发明的药物组合物包含约1纳克至约2000微克DNA。在一些优选实施方案中，根据本发明的药物组合物包含约5纳克至约1000微克DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约10纳克至约800微克DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约0.1至约500微克DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约1至约350微克DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约25至约250微克DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约100至约200微克DNA。

根据本发明的药物组合物根据所使用的施用方式来进行配制。在药物组合物是可注射的药物组合物的情况下，它们是无菌、无热原质和无颗粒的。优选使用等渗制剂。通常，用于等渗性的添加剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情况下，等渗溶液如磷酸盐缓冲盐水是优选的。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施方案中，将血管收缩剂添加至制剂中。

根据本发明的一些实施方案，提供诱导免疫应答的方法。疫苗可以是基于蛋白质的、活减毒疫苗、细胞疫苗、重组疫苗或核酸或DNA疫苗。在一些实施方案中，在个体中诱导针对免疫原的免疫应答的方法(包括诱导粘膜免疫应答的方法)包括向个体施用下列中的一种或多种：CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白及其功能片段、或其可表达的编码序列，与编码本发明的蛋白质的分离的核酸分子、和/或编码本发明的蛋白质的重组疫苗、和/或包含本发明的蛋白质的亚单位疫苗、和/或活减毒疫苗和/或灭活疫苗的组合。CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白及其功能片段中的一种或多种可在下列物质施用之前、同时或之后施用：编码免疫原的分离的核酸分子、和/或编码免疫原的重组疫苗、和/或包含免疫原的亚单位疫苗、和/或活减毒疫苗和/或灭活疫苗。在一些实施方案中，向个体施用编码选自由以下各项组成的组的一种或多种蛋白质的分离的核酸分子：CTACK、TECK、MEC及其功能片段。

在下列实施例中进一步说明了本发明。应理解，此实施例尽管指出了本发明的实施方案，但是其仅以说明的方式给出。根据上述讨论和此实施例，本领域技术人员可确定本发明的实质性特性，并且在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，除了本文中示出和描述的修改之外，根据先前的描述，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的。这类修改也意在属于所附权利要求书的范围内。

本公开通篇中引用的美国专利、美国申请和引用文献各自均以引用的方式整体并入本文。

实施例

实施例1

pConNS4B、pConNS5A和pConNS5B的设计和表达

由获得自LosAlamosNationalLaboratoryHCV序列数据库的170种不同的序列产生HCV蛋白NS4B、NS5A和NS5B的HCV基因型1a共有序列。然后对共有构建体进行若干修饰以便增强它们的表达和检测，所述修饰包括在每个构建体的C-末端处和N-末端的HA-标签处添加前导序列IgE。另外，通过密码子和RNA优化使用GeneOptimizer^TM(GENEART,Germany)对每个构建体进行进一步修饰，并且将其亚克隆至临床表达载体pVAX中受CMV启动子的控制。最终构建体称为pConNS4B、pConNS5A和pConNS5B(质粒图谱示出于图8A-图8C)。

通过用每个单独的构建体瞬时转染人RD肌细胞来确定每个构建体的蛋白质表达。使用Lipofectamine^TM(Invitrogen)根据制造商的指导用pConNS4B、pConNS5A和pConNS5B来瞬时转染RD肌细胞。转染之后48小时，将细胞固定并透化。先后使用抗-HA多克隆兔抗体(Invitrogen)和Cy3偶联的山羊抗-兔二级抗体(Invitrogen)来检测每个蛋白质的表达。

使用共聚焦显微镜并且在250倍放大率下观测细胞(图像未示出)。显示所有三种构建体都表达，pConNS4B示出最高数目的转染细胞而pConNS5B示出最低数目的转染细胞。用空白载体pVax进行转染作为对照。

实施例2

用pConNS4B、pConNS5A和pConNS5B免疫C57BL/6小鼠诱导强的细胞免疫应答

一旦确定了构建体的表达，就免疫C57BL/6小鼠以测定构建体的免疫原性。从杰克逊实验室购买6至8周龄的雌性C57BL/6小鼠，并且根据国立卫生研究院和宾夕法尼亚大学实验动物管理和使用委员会(IACUC)的指导维持它们。对于每个单独的构建体将动物分成三个不同的给料组，每组五只动物。用5μg、12.5μg或25μg的pConNS4B、pConNS5A或pConNS5B肌内免疫动物，随后进行电穿孔。

使用CELLECTRA^TM适应性恒定电流电穿孔装置和电极阵列(InovioPharmaceuticals,Inc.,BlueBell,PA)进行电穿孔。

动物总共接受两次免疫，相隔两周，并且在第二次免疫之后一周被处死。使用IFN-γELISpot测定来确定构建体的免疫原性。

如先前在Yan,J.等,EnhancedcellularimmuneresponseselicitedbyanengineeredHIV-1subtypeBconsensus-basedenvelopeDNAvaccine.MolTher,2007.15(2):第411-21页中所述进行小鼠IFN-γELISpot测定。用与8个氨基酸重叠并且涵盖每个构建体长度的15mer肽池刺激脾细胞。通过Genscript(Piscataway,NJ)合成肽，重悬浮于DMSO中并以2μg/ml/肽的浓度汇集。以每孔200,000个细胞的浓度铺板脾细胞。调整结果并以每1x10^6个脾细胞的斑点形成单位(SFU)的平均数来作图。结果在图1中可见。

如免疫荧光所测定的，构建体的免疫原性与构建体的表达水平密切相关。虽然所有的构建体都具有强的免疫原性，但对pConNS4B的应答是最大的，而对pConNS5B的应答是最小的。最优剂量：pConNS4B为12.5μg(1687±237SFU/10^6个脾细胞)；pConNS5A为5μg(1091±111SFU/10^6个脾细胞)；并且pConNS5B为12.5μg(736±136SFU/10^6个脾细胞)。

一旦确定了每种构建体的给料，就对由每种构建体所诱导的细胞免疫应答进行更详细的分析。如先前所述对动物进行免疫和分组。处死之后，将脾分离并使用Stomacher装置来单独压碎。脾细胞用40μM细胞滤过器滤过，并用ACK裂解缓冲液(Biosource)处理5分钟以清除RBC。将脾细胞重悬浮于完全培养基(RPMI1640，具有2mM/LL-谷氨酸，补充有10％热灭活FBS、1X抗生素/抗真菌剂、以及55μM/Lβ-巯基乙醇)中。使用血细胞计数器测定细胞数目。

为了测定对于每种构建体的CD8+和CD4+T细胞应答的相对贡献率，细胞内染色脾细胞的IFN-γ，并使用流式细胞术来观测，图2。细胞内细胞因子染色的结果与先前使用IFN-γELISpot测定所见到的那些结果密切相关。对于pConNS4B的应答是最大的，而pConNS5B具有最小的免疫原性。对于pConNS4B和pConNS5A的IFN-γ应答大部分是由CD8+T细胞产生的，但也识别到对每种构建体特异的CD4+T细胞。有趣的是，对于pConNS5B的IFN-γ应答大部分是CD4+T细胞介导的，而仅识别到很少的IFN-γ+CD8+T细胞。对于pConNS4B、pConNS5A和pConNS5B的IFN-γ+CD4+T细胞的平均百分比分别为0.50％±0.11％、0.27％±0.06％和0.32％±0.11％，图3A。对于pConNS4B和pConNS5A的IFN-γ+CD8+T细胞的平均百分比分别为3.29％±1.33％和0.68％±0.22％，图3B。

实施例3

肌内免疫之后在肝内检测到免疫诱导的NS4B-、NS5A-和NS5B-特异性T细胞

如先前在上文实施例1所述免疫小鼠。在最后一次免疫之后一周，将动物处死。处死之后，将肝分离并使用Stomacher机器来单独粉碎。将所得混合物滤过并使用10mlACK裂解缓冲液(Bioscience)处理5分钟以便清除RBC。沉淀混合物并通过使用35％珀可梯度将肝细胞自淋巴细胞分离。将沉淀的淋巴细胞重悬浮于完全培养基中。在或不在肝灌注下进行实验，没有观察到不同。

自每个肝分离T细胞，并用对应于每个单独构建体的重叠肽刺激。免疫诱导的HCV-特异性T细胞通过经由细胞内细胞因子染色和流式细胞术检测到的IFN-γ表达得到识别。单独分析每只动物。有趣的是，在所有免疫小鼠的肝中识别到HCV-特异性T细胞。在用pConNS4B和pConNS5A免疫的小鼠的肝中检测到CD4+和CD8+T细胞应答，而在用pConNS5B免疫的小鼠中仅检测到CD4+T细胞应答。在肝内检测到的优势T细胞应答与在脾内识别到的那些相同。用pConNS4B和pConNS5A免疫的小鼠在肝内具有强的CD8+T细胞应答，而用pConNS5B免疫的小鼠显示出主要的CD4+T细胞应答和很少的CD8+T细胞应答。对于pConNS4B、pConNS5A和pConNS5B的CD4+T细胞应答分别为0.29％±0.07％、0.41％±0.09％和0.41％±0.06％，图4A。对于pConNS4B、pConNS5A和pConNS5B的CD8+T细胞应答分别为3.73％±0.73％、2.28％±0.68％和0.06％±0.02％，图4B。

实施例4

3.4肝细胞肝特异性表达HCV抗原引起增加的IFN-γ产生和转染肝细胞清除

接着我们意图确定NS4B、NS5A或NS5B蛋白的肝特异性表达是否会活化在肝内检测到的HCV-特异性T细胞。为了诱导NS4B、NS5A和NS5B的肝特异性表达，通过如先前在Ahlen,G.等,InvivoclearanceofhepatitisCvirusnonstructural3/4A-expressinghepatocytesbyDNAvaccine-primedcytotoxicTlymphocytes.JInfectDis,2005.192(12):第2112-6页中所述施用pConNS4B、pConNS5A或pConNS5B的尾静脉注射液来转染免疫小鼠的肝细胞。使肝被转染48小时，之后收集肝并且如上文实施例3所述分离肝淋巴细胞。如之前所提及，免疫诱导的HCV-特异性T细胞通过经由细胞内细胞因子染色和流式细胞术检测到的IFN-γ分泌得到识别。

细胞内细胞因子染色

将脾细胞以1x10^6个细胞/100μl的浓度重悬浮于完全培养基中并铺在圆底96孔板中。脾细胞用100μl以下各项刺激：1)2μg/mlpConNS4B、pConNS5A或pConNS5B重叠肽；2)1μg/ml葡萄球菌肠毒素B(阳性对照；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)或3)0.1％二甲亚砜(阴性对照)，这些都稀释在完全培养基中，补充有GolgiStop和GolgiPlug(BDBioscience)。在37C下刺激脾细胞共计5小时，之后细胞用PBS洗涤三次并染色以测定生存力。在4C下对脾细胞的表面标记物抗-CD4、CD8细胞外染色30分钟。之后将脾细胞透化并使用BDCytofix/Cytoperm溶液试剂盒(BDBioscience)洗涤，并且接着在4C下用抗-IFN-γ和CD3细胞内染色45分钟。染色之后，将脾细胞用1％多聚甲醛固定并储存在4C下直至进行分析。对于每只动物，特定函数报告为肽刺激的组的百分数函数减去0.1％二甲亚砜刺激的组(阴性对照)的百分数函数。

流式细胞术试剂

使用以下直接偶联的抗体：抗小鼠CD3-别藻蓝素花青染料7(APC-Cy7)[克隆145-C11]、抗小鼠CD4-异硫氰酸荧光素(FITC)[克隆H129.19]、抗小鼠CD8-多甲藻素叶绿素蛋白5.5(PerCP5.5)[克隆53-6.7]、抗小鼠IFN-γ-藻红蛋白花青染料7(PE-Cy7)[克隆XMG1.2](全部来自BDBiosciences,SanJose,CA)。根据制造商的方案使用水性活/死可固定的死细胞染色试剂盒(MolecularProbes,Eugene,OR)以识别活细胞。

在LSRII流式细胞仪(BDBiosciences,FranklinLakes,NJ)上收集样品。使用BDCompBeads(BDBiosciences)和单一荧光染料用于补偿。使用用于Mac的8.7.1版本的FlowJo软件(TreeStar,Ashland,OR)分析数据。

尾静脉注射之后，相比于在脾和所得肝中所检测到的HCV-特异性T细胞的百分比，在所有三个免疫组中见到CD4+和CD8+HCV-特异性T细胞的百分比大幅增加，图5。对于用pConNS4B、pConNS5A和pConNS5B免疫的小鼠，CD4+HCV-特异性T细胞的百分比分别为2.27％±0.70％、2.55％±0.70％和1.22％±0.22％，图6A。对于用pConNS4B、pConNS5A和pConNS5B免疫的小鼠，CD8+HCV-特异性T细胞的百分比分别为9.46％±1.53％、6.98％±0.48％和0.477％±0.16％，图6B。如在尾静脉注射之前和之后在肝中的HCV-特异性IFN-γ+T细胞的百分比所测定的，对于CD4+T细胞应答见到最大的成倍增加。pConNS4B、pConNS5A和pConNS5B免疫的小鼠中的肝内CD4+T细胞应答的成倍增加大约分别为8倍、6倍和3倍。虽然在尾静脉注射之前和之后在肝中CD8+T细胞应答仍然是优势应答，但与CD4+T细胞应答相比所见到的CD8+T细胞应答的成倍增加稍微较小。pConNS4B、pConNS5A和pConNS5B免疫的小鼠中的肝内CD8+T细胞应答的成倍增加大约分别为3倍、3倍和8倍。

在评定由每种构建体产生的肝内HCV-特异性IFN-γ应答之后，进行研究以确定免疫是否也产生肝内细胞毒性HCV-特异性T细胞。自每组的每只动物获得一叶肝，并对其染色以用于测定NS4B、NS5A或NS5B的肝细胞表达。通过在与转染的免疫未处理对照组相比时，每只免疫动物在转染之后清除NS4B、NS5A或NS5B表达肝细胞的能力，评定由用每种构建体进行免疫所产生的肝内T细胞应答的细胞毒性。观察每组的此染色的代表性共聚焦图像(图像未示出)。

共聚焦显微术

切割肝并将检体固定在2％多聚甲醛中，随后在30％蔗糖中超低温保护过夜。将检体浸没在Tissue-TekOCT(BayerCorporation,Pittsburgh,PA)中并在干冰氮气上在2-甲基丁烷中快速冷冻。对封固在SuperfrostPlus玻璃载片(FisherScientific,Pittsburgh,PA)上的组织切片(6μm)进行染色，并将其保持在80℃下直至使用。在免疫荧光染色之前，将载片带至室温下并在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤三次，每次10分钟，并且用含有10％的其中产生第二试剂的物种的正常血清和0.1％的Triton的PBS阻断。将第一试剂施用于切片并将切片在室温下孵育1小时或在4℃下孵育过夜。切片在PBS中洗涤三次，每次10分钟，必要时在室温下施用第二试剂30分钟。将切片再次在PBS中洗涤三次，每次10分钟。用ProlongGold封固介质(Invitrogen,Carlsbad,CA)封固盖玻片，并将载片保持在4℃下在黑暗中，直至研究和拍照。所有的染色在潮湿环境中进行。所使用的抗体获得自Invitrogen，或者一个制造抗体的竞争对手公司。使用ZeissAxiovert100倒置共聚焦显微镜获得所有图像，并且使用ImageJ软件(NIH,Rockville,MD)对荧光强度进行分析和量化。

每组转染肝细胞的清除率通过由如核DAPI染色的MFI所测量的每个视野内存在的肝细胞的数目标准化的NS4B、NS5A或NS5B表达的平均荧光强度(MFI)来量化，图9。与未处理的对照组相比，对于所有三种构建体在动物免疫组中见到转染肝细胞的数目大量降低。与未处理的对照组相比，用pConNS4B、pConNS5A或pConNS5B免疫的动物的转染肝细胞表达下降大约9倍、3倍和2倍。在每个免疫组中所观察到的清除量与在转染的肝内检测到的HCV-特异性CD8+T细胞应答密切相关。在用pConNS4B免疫的动物中观察到最大的清除量，而在pConNS5B免疫的动物中观察到最小的清除率。

所提供的结果显示，通过全身免疫诱导的HCV-特异性T细胞在不存在同源抗原的肝特异性表达的情况下复原回到肝中，导致大的肝内HCV-特异性T细胞池形成。这些T细胞仍然在肝内充分发挥功能，这表明它们复原至静止肝中可另外充当免疫监视的持续过程的一部分，并且可证明是肝借以防范感染的重要机制。为了支持这一点，响应于HCV抗原的肝特异性表达，此肝定位的HCV特异性T细胞群体能够快速诱导IFN-γ表达并清除转染的肝细胞。由于先前已报告未观察到T细胞浸润直到肝转染72小时之后(Ahlen等，见上文)，所以HCV转染的肝细胞的快速清除似乎很可能取决于在转染之前在肝内存在的肝定位的HCV特异性T细胞群体。另外，如在用pConNS5B免疫的动物中所见，即使相对较小百分比的疫苗特异性应答(如IFN-γ产生所测量的)也足以诱导肝内转染肝细胞的大的2倍减少，这表明如在外围所检测的较小百分比的疫苗特异性应答具有在肝内发挥巨大作用的能力。

肝诱导的T细胞耐受可通过全身免疫来破坏，并且有效的肝特异性免疫可通过利用肝在静止条件下复原和隔绝抗原特异性T细胞的能力来实现。肝的这种独特特性可利用来在已经感染有病毒的患者中增强HCV-特异性应答，并且在未处理个体的肝内产生具有在感染第一信号之后快速应答并迁移的能力的HCV-特异性T细胞池。总之，所述发现结果表明，抗原特异性T细胞至肝的复原连同它们的效应子功能在肝内的保留可以在免疫监视的过程中起到重要且以前未被认识到的作用，这可以在未来T细胞基HCV疫苗中加以利用。

Claims (12)

1.一种核酸分子，其由以下组成：编码选自由以下各项组成的组的一个或多个蛋白质的编码序列：

a)SEQIDNO:2；

b)SEQIDNO:4；

或

c)SEQIDNO:6。

2.如权利要求1所述的核酸分子，其中所述核酸分子缺少由SEQIDNO:9序列组成的IgE前导序列的编码序列。

3.如权利要求1所述的核酸分子，其由以下组成：选自由以下各项组成的组的一个或多个序列：

a)SEQIDNO:1；

b)SEQIDNO:3；

或

c)SEQIDNO:5。

4.如权利要求3所述的核酸分子，其中所述核酸分子缺少IgE前导序列的编码序列，其中所述缺少编码序列是SEQIDNO:7或SEQIDNO:8。

5.一种质粒，包含如权利要求1至4中任一项所述的核酸分子。

6.一种表达载体，包含如权利要求1至4中任一项所述的核酸分子，其中编码所述一个或多个蛋白质的序列可操作地连接至调控元件。

7.权利要求1至4中任一项所述的核酸分子、权利要求5所述的质粒或权利要求6所述的表达载体在制备用于治疗诊断患有HCV的受试者的药物中的用途。

8.一种蛋白质，其选自由以下各项组成的组：

a)SEQIDNO:2；

b)SEQIDNO:4；

或

c)SEQIDNO:6。

9.如权利要求8所述的蛋白质，其中所述蛋白质缺少由序列SEQIDNO:9组成的IgE前导序列。

10.权利要求8至9中任一项所述的蛋白质在制备用于治疗诊断患有HCV的受试者的药物中的用途。

11.一种药物组合物，其包含如权利要求1至4中任一项所述的核酸分子、权利要求5所述的质粒或权利要求6所述的表达载体和药学上可接受的赋形剂。

12.一种药物组合物，其包含如权利要求8至9中任一项所述的蛋白质和药学上可接受的赋形剂。