CN101909635B

CN101909635B - 针对多种登革病毒亚型的新颖疫苗

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Publication number: CN101909635B
Application number: CN200980101862.0A
Authority: CN
Inventors: M·P·拉马纳桑; N·Y·萨德萨尔
Original assignee: VGX Pharmaceuticals LLC
Current assignee: VGX Pharmaceuticals Inc; VGX Pharmaceuticals LLC
Priority date: 2008-01-11
Filing date: 2009-01-12
Publication date: 2014-09-17
Anticipated expiration: 2029-01-12
Also published as: KR101686942B1; CA2708668A1; KR20100103677A; EP2234624A4; WO2009099716A4; JP5788676B2; AU2009210624A1; CA2708668C; ZA201004688B; MX2010007461A; WO2009099716A1; CN101909635A; EP2234624A1; US20100291144A1; ES2685435T3; EP2234624B1; WO2009099716A9; JP2011509659A; US8835620B2

Abstract

本发明的一个方面涉及能够表达引发哺乳动物针对多于一种登革病毒亚型的免疫反应的多肽的核酸构建体和使用它们的方法。另外，存在能够在哺乳动物中产生针对多种登革病毒亚型的免疫反应的DNA质粒疫苗和使用它们的方法，所述DNA质粒疫苗包含DNA质粒和药学上可接受的赋形剂。所述DNA质粒能够在所述哺乳动物的细胞中以有效引发所述哺乳动物的免疫反应的量表达共有登革抗原。

Description

针对多种登革病毒亚型的新颖疫苗

相关申请的交叉引用

本申请要求享有2008年1月11日提交的美国临时申请第61/020,490号的权益，该临时申请的内容通过引用并入本文。

发明领域

本发明涉及改进的登革疫苗、用于诱导针对登革病毒的免疫反应和用于预防性地和/或治疗性地针对登革病毒免疫个体的改进的方法。

背景

登革病毒(DENV)是一种新出现的引起登革热(DF)和严重的威胁生命的疾病登革出血热/登革休克综合征(DHF/DSS)的蚊媒病原。DENV是一种小的、包膜的正链RNA病毒，它属于黄病毒科(Flaviviridae)家族的黄病毒属。登革病毒的四种不同的亚型或血清型(DV-1到DV-4)通过蚊种埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(Aedesalbopictus)的叮咬传播给人类。据估计每年出现5千万至1亿的DF病例和250,000至500000的DHF病例。登革成为了巨大的国际公共卫生问题，因为世界人口的五分之二生活在登革的流行区域并且每年出现估计5千万至1亿的登革感染病例。此外，在不存在有效干涉的情况下，在世界的亚热带和热带区域，25亿人处在感染的危险之下。

超过100个热带国家具有流行性登革病毒感染，并且已证明DHF在大于60个这些国家中存在。在大多数国家缺乏对DF/DHF的监视并且过去主要集中于DHF；因此只能估计每年出现的DF病例的数目。然而在1998年，主要的流行病发生遍及亚洲和美国，其中向世界卫生组织(WHO)报告了＞120万例DF/DHF病例。DHF的全球报告在过去20年内已平均增加五倍。在21世纪初，根据流行病活性，估计每年出现5千万至1亿的DF病例和几十万DHF病例。病死率(CFR)在国家之间有差异，但是在一些国家可以高达10-15％而在另一些国家＜1％。

存在四种登革病毒亚型：登革1型(DV-1)、登革2型(DV-2)、登革3型(DV-3)和登革4型(DV-4)。这些亚型中的每一个在黄病毒家族内形成抗原上不同的亚类。它们是编码十种蛋白的包膜的RNA病毒：三种结构蛋白和七种非结构蛋白。所述结构蛋白是衣壳(C)、包膜(E)和预膜前体(preM)。DV的生命周期开始于受体介导的病毒进入细胞的胞吞作用，接着病毒的包膜蛋白与晚期内含体膜融合，这导致病毒的基因组释放到细胞质中复制。

DV感染可能无症状或者以发热、寒战、额痛、肌痛、关节痛和疹为特征。随后感染不同的血清型可导致包括血浆渗漏或出血(登革出血热)和休克(登革休克综合征)的更为严重的疾病表现。虽然多年来已进行广泛研究来了解DENV感染的病原性，但在特效的抗DV化合物的研制上没有取得什么进展。目前在美国没有批准的针对登革感染的特定抗病毒剂或疫苗。

包膜(E)糖基化蛋白是成熟的登革病毒粒子表面上存在的主要结构蛋白，是一种I型整合膜蛋白。已证明成熟登革病毒的E蛋白以反向平行方式(头到尾方向)形成同型二聚体。每个单体被折叠成三种不同的结构域，即结构域I(DI，中心的N端结构域)、结构域II(DII，二聚化结构域)和结构域III(DIII，免疫球蛋白(Ig)样的C端结构域)。E蛋白的DIII结构域由C端的100个氨基酸(残基303-395)组成。这个结构域已表明是受体识别和结合结构域。DIII蛋白中存在的Ig样折叠通常与具有附着功能的结构有关。这个结构域垂直地延伸到病毒的表面，具有一个从病毒粒子表面伸出的比E蛋白的任何其他部分更远的尖端。此外，研究已证明重组DIII蛋白和产生的抗黄病毒的E蛋白的DIII的抗体均能抑制黄病毒进入靶细胞。此外，具有E蛋白的DIII的突变的黄病毒显示出减弱的毒力或逃避免疫中和的能力。

研制安全且有效的针对登革病毒感染的疫苗仍是一个主要的公共卫生目标。假定免疫性与登革病毒的主要关联被认为是中和抗体的存在，那么用于比较和优化疫苗候选物的前提是精确地测量由疫苗诱发的中和抗体反应的能力。来自所有四种血清型的包含减弱的活病毒的疫苗的组合已显示导致几种并发症(Guy B，Almond JW，Comp ImmunolMicrobiol Infect Dis.2008年3月；31(2-3)：239-52)。此外，存在很少的关于基于腺病毒的登革抗原的递送的报告。尽管如此，腺病毒系统的这个众所周知的问题是大多数的人类群体已知具有抗腺病毒之一的抗体，并且此类预先存在的抗体能够引起这些基于腺病毒的疫苗失效。

因此，仍有必要研制提供针对多种且优选所有四种血清型的登革病毒的广泛免疫性或通用免疫性(universal immunity)的疫苗，以及优选地是经济的且在所有血清型之间有效的疫苗。此外，存有需要向哺乳动物施用疫苗诸如DNA疫苗或DNA质粒疫苗以在预防上或治疗上提供针对登革病毒的免疫的有效方法。

发明概述

本发明的一个方面提供能够表达引发哺乳动物针对多于一种登革病毒亚型的免疫反应的多肽的核酸构建体。所述核酸构建体由编码核苷酸序列和与所述编码核苷酸序列可操作地连接的启动子组成。所述编码核苷酸序列表达所述多肽，其中所述多肽包括来自至少两种不同的登革病毒亚型的包膜蛋白的结构域III(DIII结构域或DIII)。所述启动子调节哺乳动物中所述多肽的表达。

本发明的另一个方面提供了能够在哺乳动物中产生针对多种登革病毒亚型的免疫反应的DNA质粒疫苗。所述DNA质粒疫苗由能够在所述哺乳动物中表达共有登革抗原的DNA质粒和药学上可接受的赋形剂组成。所述DNA质粒由与编码所述共有登革DIII抗原的编码序列可操作地连接的启动子组成。所述共有登革抗原由登革病毒亚型1、登革病毒亚型2、登革病毒亚型3或登革病毒亚型4的共有DIII结构域组成。

本发明的另一方面提供了引发哺乳动物针对多种病毒亚型的免疫反应的方法，所述方法包括向所述哺乳动物的组织递送DNA质粒疫苗，并用能量脉冲以有效允许所述DNA质粒进入所述细胞的恒定电流将所述组织的细胞电穿孔，所述DNA质粒疫苗包含能够在所述哺乳动物的细胞中表达衍生自所述病毒亚型的多种共有抗原以引发所述哺乳动物的免疫反应的DNA质粒，所述多种共有抗原包含来自所述至少两种不同的病毒亚型的抗原结构域。

附图简述

通过参考附图，本领域的技术人员可以更好地理解本发明的许多目的和优点，其中：

图1展示了示出登革病毒基因组的结构以及该登革病毒包膜的三维构象模型的简图。

图2展示了示出来自所有四种登革亚型的DIII结构域和通用DIII带的凝胶照片。

图3展示了示出人类密码子优化的通用登革DIII(DV-U)的结构和DV-U-DIII的共有氨基酸序列的简图。

图4a展示了四种质粒的质粒图谱，所述质粒各自具有一种亚型的DIII结构域。

图4b展示了包含DV-U-DIII的质粒的质粒图谱。

图5展示了示出在表达来自所有四种亚型和DV-U片段的克隆到pVAX中的DIII的细胞中的DIII mRNA转录物的凝胶照片。

图6展示了在RD细胞中表达DV DIII疫苗构建体的间接免疫荧光分析(IFA)的照片，所述DV DIII疫苗构建体具有FLAGGED表位。

图7展示了示出DIII产物的体外翻译的凝胶照片。

图8展示了检测DIII产生的大肠杆菌(E.coli)溶菌产物和镍柱纯化样品的SDS-PAGE凝胶。

图9展示了DV接种方案的时间线。

图10展示了光谱读数的柱状图，该图示出来自接种pDV-U-DIII的小鼠的抗DIII血清与捕获到镍涂覆的ELISA板上的DV-1到DV-4的DIII抗原之间的特异性反应。

图11展示了示出通过蛋白质印迹分析使用来自接种pDV-U-DIII的小鼠的抗DIII血清对DIII蛋白的免疫检测的凝胶照片。

图12展示了示出使用来自接种pDV-U-DIII的小鼠的抗DIII血清对单独和组合的DIII结构域的特异性染色的照片。

图13展示了示出通过来自接种pDV-U-DIII的小鼠的血清对感染DV-2的Vero细胞染色的照片。

图14展示了示出针对DV-2的中和抗体滴度的柱状图。

图15展示了示出用pDV-U DIII血清对感染登革病毒的细胞染色的照片。

图16展示了示出DV-U DIII血清针对所有四种登革亚型的中和作用的图。

图17展示了示出B细胞酶联免疫斑点测定的结果的图：通过pDV-UDIII诱导抗DIII抗体分泌细胞。

优选实施方案的详细描述

给出下述简略或简短的定义以帮助理解本发明的优选实施方案。这里所给出的简略的定义绝不是详尽的，它们与本领域理解的定义或字典含义也绝不矛盾。在这里给出简略的定义是为了补充或更清晰地界定本领域中已知的定义。

定义

如本文使用，核苷酸和氨基酸的序列同源性可使用FASTA、BLAST和Gapped BLAST(Altschul等人，Nuc.Acids Res.，1997，25，3389，其通过引用将其全部内容并入本文)以及PAUP^*4.0b10软件(D.L.Swofford，Sinauer Associates，Massachusetts)确定。简言之，BLAST算法代表基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)，它适合于确定序列相似性(Altschul等人，J.Mol.Biol.，1990，215，403-410，其通过引用将其全部内容并入本文)。用于执行BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)公共可利用的。由BLAST算法提供的相似性的一个量度是最小和概率(P(N))法，它提供了两条核苷酸序列之间的匹配偶然发生的概率的指示。例如，如果在检测核酸与另一种核酸的比较中最小和概率小于大约1、优选地小于大约0.1、更优选地小于大约0.01且最优选地小于大约0.001，那么认为该核酸与所述另一种核酸是相似的。可使用PAUP^*4.0b10软件(D.L.Swofford，Sinauer Associates，Massachusetts)计算“相似性的百分比”。计算出共有序列与系统树(phylogenic tree)中的所有序列相比的平均相似性。

如本文所用，术语“核酸构建体”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。编码序列或“编码核酸序列”可包括与调控元件可操作地连接的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用了所述核酸分子的个体的细胞中指导表达的启动子和聚腺苷酸化信号。

如本文使用，术语“可表达的形式”是指包含必要调控元件的核酸构建体，所述调控元件与编码蛋白质的编码序列可操作地连接以使得当所述编码序列存在于个体的细胞中时，其将被表达。

本文使用术语“恒定电流”来定义由组织或界定所述组织的细胞在递送到相同组织的电脉冲的持续期间所接受或经历的电流。所述电脉冲是从本文所述的电穿孔装置中递送的。这种电流在电脉冲的使用期内在所述组织中保持恒定安培数，因为本文提供的电穿孔装置具有反馈元件，优选地具有瞬时反馈。所述反馈元件能够测量整个脉冲持续期间组织(或细胞)的阻抗，并引起电穿孔装置改变其电能输出(例如增加电压)，所以相同组织中的电流在整个电脉冲(微妙数量级)以及从脉冲到脉冲中保持恒定。在一些实施方案中，反馈元件包括控制器。

术语“反馈”或“电流反馈”可被互换使用并且表示所提供的电穿孔装置的主动反应，所述反应包括测量在电极之间的组织中的电流并且因此改变由EP装置递送的能量输出以保持电流在恒定水平。这个恒定水平由使用者在脉冲序列或电处理开始之前预先设定。优选地，反馈是由电穿孔装置的电穿孔部件例如控制器完成，因为其中的电路能够连续地监测在电极之间的组织中的电流，并将该监测的电流(或组织内的电流)与预设电流比较，并且能够连续地进行能量输出调整以保持监测的电流在预设水平。在一些实施方案中，所述反馈环路是瞬时的，因为它是模拟闭合环路反馈。

如本文可互换使用的术语“电穿孔”、“电渗透”或“电动力学增强”(“EP”)是指使用跨膜电场脉冲来诱导生物膜中的微观途径(孔)；这些微观途径的存在允许生物分子例如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子和/或水从细胞膜的一侧通过到另一侧。

本文使用术语“分散电流”来定义从本文所述的电穿孔装置的各个针电极阵列中递送的电流模式，其中所述模式使得在被电穿孔的组织的任何区域上的电穿孔相关的热应激的发生最小化，或者优选地将其消除。

如本文使用，术语“反馈机制”是指通过软件或硬件(或固件)执行的过程，所述过程接收期望组织的阻抗(在递送能量脉冲之前、过程中和/或之后)并将其与预设值(present value)(优选电流)进行比较，并且调整递送的能量脉冲以达到预设值。当讨论反馈机制时，术语“阻抗”被本文使用并且能够根据欧姆定律被转换为电流值，由此能够与预设电流比较。在一个优选的实施方案中，“反馈机制”通过模拟闭合环路执行。

本文使用术语“免疫反应”来表示宿主的免疫系统例如哺乳动物的免疫系统的激活，该免疫系统的激活是对通过所提供的DNA质粒疫苗引入登革抗原例如通用登革抗原的反应。免疫反应可以是细胞反应或体液反应的形式或二者兼有。

本文使用术语“共有”或“共有序列”来表示基于特定登革亚型的多个毒株的比对分析而构建的合成的核酸序列或对应的多肽序列，其产生亚型1、亚型2、亚型3、亚型4和以下所述的通用登革的共有登革DIII序列。所述共有通用登革可被用来诱导针对多种登革病毒亚型或血清型的宽泛的免疫性。

本文使用术语“佐剂”来表示加到本文所述的DNA质粒疫苗中以增强由所述DNA质粒和下文所述的编码核酸序列所编码的登革抗原的抗原性的任何分子。

术语“亚型”或“血清型”可在本文中互换使用并涉及一种病毒例如登革病毒使用，并且表示该病毒抗原的遗传变体以使得一个亚型区别于一个不同亚型地被免疫系统识别。例如，登革病毒亚型1在免疫学上可区别于登革病毒亚型2。

本发明的一个方面提供能够表达引发哺乳动物针对多于一种登革病毒亚型的免疫反应的多肽的核酸构建体。所述核酸构建体由编码核苷酸序列和与所述编码核苷酸序列可操作地连接的启动子组成。编码核苷酸序列表达多肽，其中所述多肽包括来自至少两种不同的登革病毒亚型的DIII结构域。所述启动子调控哺乳动物中所述多肽的表达。

在一些实施方案中，核酸构建体还可以包括与编码序列的N端末端可操作地连接并与启动子可操作地连接的IgE前导序列。优选地，所述IgE前导序列具有SEQ ID NO：11的序列。所述核酸构建体还可以包含与所述编码序列的C端末端相连的聚腺苷酸化序列。优选地，所述核酸构建体是密码子优化的。

在一些实施方案中，编码核苷酸序列编码包括来自登革病毒亚型1、登革病毒亚型2、登革病毒亚型3和登革病毒亚型4的DIII结构域的多肽。在优选的实施方案中，该编码核苷酸序列选自由以下组成的组：SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5。

在一些实施方案中，该编码核苷酸序列是表达盒的一部分并且可以包括以下核苷酸序列：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16。表达盒包括(从5’末端到3’末端)：KpnI位点、IgE前导序列、编码序列(DIII)、两个终止密码子和PstI位点。掌握可用技术的普通技术人员能够通过如下方式改变表达盒：用可选的剪接位点代替任一个剪接位点(KpnI或PstI)、用可选的信号传导前导序列或靶向前导序列代替IgE前导序列和/或用更多或更少的终止密码子替代终止密码子。

本发明的另一个方面提供了能够在哺乳动物中产生针对多种登革病毒亚型的免疫反应的DNA质粒疫苗。所述DNA质粒疫苗由能够在所述哺乳动物中表达共有登革抗原的DNA质粒和药学上可接受的赋形剂组成。所述DNA质粒由与编码所述共有登革抗原的编码序列可操作地连接的启动子组成。所述共有登革抗原由登革病毒亚型1、登革病毒亚型2、登革病毒亚型3或登革病毒亚型4的共有DIII结构域组成。优选地，所述DNA质粒由编码共有DIII结构域的共有登革抗原组成，所述共有DIII结构域选自由以下组成的组：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。具有序列SEQ ID NO：10的共有DIII结构域DV-U-DIII包含连接四种DIII亚型(DV-1-DIII、DV-2-DIII、DV-3-DIII和DV-4-DIII)的每一种的连接序列，所述连接序列具有序列RGRKRRS，它是已知的切割位点并且允许将DV-U-DIII切割成特定亚型的分离的DIII序列。然而，所述连接序列可以是具有相似特征的本领域中可用的任何其他的连接序列；并且用这种连接体替换成当前利用的RGRKRRS属于本领域的普通技术。

在一些实施方案中，该DNA质粒还包括与所述编码序列的N端末端相连并与启动子可操作地连接的IgE前导序列。优选地，所述IgE前导序列具有SEQ ID NO：11的序列。DNA质粒还可以包括与所述编码序列的C端末端相连的聚腺苷酸化序列。优选地，DNA质粒是密码子优化的。

在一些实施方案中，所述药学上可接受的赋形剂是佐剂。优选地，佐剂选自由IL-12和IL-15组成的组：在一些实施方案中，所述药学上可接受的赋形剂是转染促进剂。优选地，转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子或脂质，以及更优选地是聚L谷氨酸。优选地，聚L谷氨酸为小于6mg/ml的浓度。优选地，DNA质粒疫苗具有1mg/ml或更大的总DNA质粒浓度。

在一些实施方案中，所述DNA质粒包括多种单一DNA质粒，其中所述多种单一DNA质粒的每一种都编码包含来自登革病毒亚型1、登革病毒亚型2、登革病毒亚型3或登革病毒亚型4的DIII结构域的多肽。

所述DNA质粒疫苗可包括含有以下编码核苷酸序列的DNA质粒：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：5，以及优选SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，DNA质粒包含以下编码核苷酸序列中的至少两种：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4。在一些实施方案中，DNA质粒包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；在一些实施方案中，DNA质粒包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3；在一些实施方案中，DNA质粒包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4；在一些实施方案中，DNA质粒包含SEQ ID NO：2和SEQID NO：3；在一些实施方案中，DNA质粒包含SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：4；在一些实施方案中，DNA质粒包含SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；在一些实施方案中，DNA质粒包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3；在一些实施方案中，DNA质粒包含SEQ ID NO：1、SEQID NO：2和SEQ ID NO：4；在一些实施方案中，DNA质粒包含SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：3；在一些实施方案中，DNA质粒包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；或者在一些实施方案中，DNA质粒包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。优选地，DNA质粒包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

在一些实施方案中，DNA质粒疫苗包含表达登革病毒DIII结构域的至少两种不同的DNA质粒，所述质粒选自由以下组成的组：包含编码共有登革病毒亚型1的DIII结构域的序列的DNA质粒、包含编码共有登革病毒亚型2的DIII结构域的序列的DNA质粒、包含编码共有登革病毒亚型3的DIII结构域的序列的DNA质粒和包含编码共有登革病毒亚型4的DIII结构域的序列的DNA质粒。在一些实施方案中，DNA质粒疫苗可包括四种共有登革病毒亚型的DIII结构域(亚型1-4)。

在一些实施方案中，共有登革病毒亚型1的DIII结构域具有包括SEQ ID NO：1的核酸序列。在一些实施方案中，共有登革病毒亚型2的DIII结构域具有包括SEQ ID NO：2的核酸序列。在一些实施方案中，共有登革病毒亚型3的DIII结构域具有包括SEQ ID NO：3的核酸序列。在一些实施方案中，共有登革病毒亚型4的DIII结构域具有包括SEQ IDNO：4的核酸序列。

在一些实施方案中，其中DNA质粒疫苗产生免疫反应的哺乳动物是灵长类。优选地，哺乳动物是灵长类。免疫反应可以是体液反应或细胞反应，并且优选地二者兼有。

本发明的另一方面提供了引发哺乳动物针对多种登革病毒亚型的免疫反应的方法，所述方法包括向所述哺乳动物的组织递送DNA质粒疫苗并且用能量脉冲以有效允许所述DNA质粒进入所述细胞的恒定电流将所述组织的细胞电穿孔。

在一些实施方案中，引发免疫反应的方法包括将DNA质粒疫苗注射到皮内组织、皮下组织或肌肉组织中的递送步骤。

在一些实施方案中，引发免疫反应的方法还可以包括预先设定期望被递送到组织的电流；并且用能量脉冲以等于预设电流的恒定电流将所述组织的细胞电穿孔。

在一些实施方案中，引发免疫反应的方法还包括测量被电穿孔的细胞中的阻抗；相对于测量的阻抗调整能量脉冲的能量水平以保持电穿孔细胞中的恒定电流。所述测量和调整步骤优选地发生在所述能量脉冲的使用期内。

在一些实施方案中，电穿孔步骤包括根据以分散模式递送能量脉冲的脉冲序列模式，将能量脉冲递送至多个电极。

在本发明的一些实施方案中，DNA质粒疫苗能够还包括佐剂。在一些实施方案中，佐剂选自由以下组成的组：α-干扰素、γ-干扰素、血小板衍生的生长因子(PDGF)、TNF-α、TNF-β、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达的趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86，包括信号序列被删除并任选地包括来自IgE的信号肽的IL-15。可能是有用的佐剂的其他基因包括编码以下的基因：MCP-1、MIP-1-α、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变体形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素反应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及它们的功能片段。在一些优选的实施方案中，佐剂选自IL-12、IL-15、CTACK、TECK或MEC。

在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂是转染促进剂，它可包括以下转染促进剂：表面活性剂，例如免疫刺激复合物(ISCOMS)；弗氏不完全佐剂；LPS类似物，包括单磷酰脂质A；胞壁酰肽；醌类似物；小泡，例如角鲨烯和角鲨烯(squalene and squalene)；透明质酸；脂质；脂质体；钙离子；病毒蛋白；聚阴离子；聚阳离子；或纳米颗粒或者其他已知的转染促进剂。优选地，转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子、包括聚L谷氨酸(LGS)或脂质。优选地，转染促进剂是聚L谷氨酸，并且更优选地，聚L谷氨酸以小于6mg/ml的浓度存在于DNA质粒疫苗中。在一些实施方案中，DNA质粒疫苗中聚L谷氨酸的浓度是小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。

在一些实施方案中，可以将DNA质粒疫苗递送给哺乳动物以引发免疫反应；优选地，哺乳动物是灵长类动物，包括人类和非人类的灵长类动物、牛、猪、鸡、狗或雪貂。更优选地，哺乳动物是人类灵长类动物。

本发明的一个方面涉及引发哺乳动物针对多种病毒亚型的免疫反应的方法。所述方法包括向所述哺乳动物的组织递送DNA质粒疫苗，并且用能量脉冲以有效允许所述DNA质粒进入所述细胞的恒定电流将所述组织的细胞电穿孔。DNA质粒疫苗包含能够在所述哺乳动物的细胞中表达衍生自所述病毒的亚型的多种共有抗原以引发所述哺乳动物的免疫反应的DNA质粒，所述多种共有抗原包括来自至少两种不同病毒亚型的抗原结构域。所述病毒选自已知具有不同血清型的许多病毒之一，并且优选地所述病毒将具有在不同血清型之间高度保守的抗原结构域。优选地，所述病毒选自西尼罗病毒、人免疫缺陷病毒、流感病毒或登革病毒。

本发明的一个方面涉及引发哺乳动物针对多种登革病毒亚型的免疫反应的方法。所述方法包括向所述哺乳动物的组织递送DNA质粒疫苗，所述DNA质粒疫苗包含能够在所述哺乳动物的细胞中表达共有登革抗原以引发所述哺乳动物的免疫反应的DNA质粒，所述共有登革抗原包含编码包膜蛋白的结构域III的共有序列，所述包膜蛋白的结构域III来自至少两种登革亚型，以及优选地来自所有四种登革亚型。登革亚型包括亚型1、亚型2、亚型3和亚型4。引发免疫反应的方法包括用能量脉冲以有效允许DNA质粒进入细胞的恒定电流将所述组织的细胞电穿孔。

在一些实施方案中，本发明的方法包括将DNA质粒疫苗注射到皮内组织、皮下组织或肌肉组织的递送步骤。优选地，这些方法包括使用体内电穿孔装置来预先设定期望被递送到组织的电流；并且用能量脉冲以等于预设电流的恒定电流将所述组织的细胞电穿孔。在一些实施方案中，电穿孔步骤还包括：测量电穿孔的细胞中的阻抗；相对于测量的阻抗调整能量脉冲的能量水平以保持电穿孔细胞中的恒定电流；其中所述测量和调整步骤发生在能量脉冲的使用期内。

本发明还包括编码能够在哺乳动物中引发免疫反应的多肽的DNA片段，所述免疫反应基本上类似于至少一种登革病毒亚型的非片段的免疫反应。当所述DNA片段应用于本文提供的特定编码核酸序列时，它是选自于本发明的各种编码核苷酸序列(包括SEQ ID NO：1、2、3、4和5)的至少一种的片段，并且可以是以下所述DNA片段中的任一种。在一些实施方案中，DNA片段可包括30个或更多、45个或更多、60个或更多、75个或更多、90个或更多、120个或更多、150个或更多、180个或更多、210个或更多、240个或更多、270个或更多、300个或更多、320个或更多、340个或更多或者360个或更多的氨基酸。在一些实施方案中，DNA片段可包括免疫球蛋白E(IgE)前导序列的编码序列。在一些实施方案中，DNA片段可以包括少于60、少于75、少于90、少于120、少于150、少于180、少于210、少于240、少于270、少于300、少于320、少于340或少于360个核苷酸。优选地，DNA片段是SEQ ID NO：1、2、3、4或5的片段，以及更优选地是SEQ ID NO：1、2、3或4的片段。

本发明包括由编码核苷酸序列所编码的多肽并且可包括具有SEQID NO：6、7、8、9或10的氨基酸序列的多肽。本发明还包括能够在哺乳动物中引发免疫反应的多肽片段，所述免疫反应基本上类似于至少一种登革亚型的非片段的免疫反应。当所述多肽片段应用于本文提供的特定多肽序列时，它们选自于本发明的各种多肽序列(包括SEQ ID NO：5、7、6、8、9、和10)的至少一种，并且可以是以下所述多肽片段中的任一种。在一些实施方案中，多肽片段可包括15个或更多、30个或更多、45个或更多、60个或更多、75个或更多、90个或更多、100个或更多、110个或更多或者120个或更多的氨基酸。在一些实施方案中，多肽片段可包括少于30、少于45、少于60、少于75、少于90、少于100、少于110或少于120个氨基酸。优选地，多肽片段是SEQ ID NO：5、6、7、8、9或10的片段，以及更优选地是SEQ ID NO：5、6、7、8或9的片段。

在哺乳动物中引发与至少一种登革亚型的非片段的免疫反应基本上类似的免疫反应的功能片段的确定，可由本领域普通技术人员容易地确定。如由公共可利用的数据库例如国家生物技术信息中心(NCBI)所提供的，可分析所述片段以包含至少一个、优选地更多个抗原表位。此外，可使用小鼠和抗体滴度以及酶联免疫斑点分析常规地评估免疫反应研究，例如在下文实施例中所示。

疫苗

在一些实施方案中，本发明通过提供蛋白质和编码具有如下表位的蛋白质的遗传构建体而提供了改进的疫苗：所述表位使得蛋白质特别有效地作为诱导免疫反应所针对的免疫原。因此，可提供疫苗以诱导治疗性或预防性免疫反应。

根据本发明的一些实施方案，将根据本发明的疫苗递送给个体来调节个体免疫系统的活性并由此增强免疫反应。当编码所述蛋白质的核酸分子被所述个体的细胞摄取时，所述核苷酸序列在细胞中被表达并且所述蛋白质由此被递送给个体。本发明的各方面提供了将蛋白质的编码序列递送到核酸分子例如质粒上的方法。

根据本发明的某些方面，提供了预防性和/或治疗性免疫个体的组合物和方法。

当被细胞摄取时，DNA质粒能够作为分离的遗传物质留在细胞中。可选择地，RNA可被施用至细胞。还包括提供作为线性微型染色体的遗传构建体，包括着丝粒、端粒和复制起点。遗传构建体包括核酸分子的基因表达所必需的调控元件。所述元件包括：启动子、起始密码子、终止密码子和聚腺苷酸化信号。此外，编码靶蛋白或免疫调节蛋白的序列的基因表达通常需要增强子。这些元件必须与编码期望蛋白的序列可操作地连接，并且调节元件必须可操作地处于施用它们的个体中。

一般认为起始密码子和终止密码子是编码期望蛋白的核苷酸序列的一部分。然而，这些元件在施用核酸构建体的哺乳动物中必须是有功能的。起始密码子和终止密码子与编码序列必须处在框内。

所使用的启动子和聚腺苷酸化信号必须是在个体细胞中有功能的。

实施本发明尤其是在人遗传疫苗的生产中使用的启动子的实例包括但不限于：来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)例如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复(LTR)启动子、莫洛尼(Moloney)病毒、禽类白细胞增生病毒(ALV)、巨细胞病毒(CMV)例如CMV立即早期启动子、EB病毒(EBV)、劳斯氏肉瘤病毒(RSV)的启动子，以及来自人类基因例如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和人金属硫蛋白(metalothionein)的启动子；在其他实施方案中，启动子可以是天然的或合成的组织特异性启动子例如肌肉或皮肤特异性启动子。此类启动子的实例描述于美国专利申请公布号US20040175727中，其以全文并入本文。

实施本发明尤其是在人遗传疫苗的生产中使用的聚腺苷酸化信号的实例包括但不限于：SV40聚腺苷酸化信号、LTR聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)聚腺苷酸化信号和人β-珠蛋白聚腺苷酸化信号。具体而言，可使用pCEP4质粒(Invitrogen，San Diego，CA)中的SV40聚腺苷酸化信号，称为SV40聚腺苷酸化信号。

除了DNA表达所需的调控元件之外，其他元件也可以被包括在DNA分子中。此类其他元件包括增强子。增强子可选自于包括但不限于以下的组：人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和病毒增强子，例如来自CMV、RSV和EBV的增强子。

遗传构建体可与哺乳动物复制起点一起被提供以便使构建体保持在染色体外，并且在细胞中产生构建体的多个拷贝。来自Invitrogen(SanDiego，CA)的质粒pVAX1、pCEP4和pREP4包含EB病毒的复制起点和产生未整合的高拷贝附加型复制的核抗原EBNA-1编码区。

为了使蛋白质的产生最大化，可选择很好地适合施用构建体的细胞中基因表达的调控序列。此外，可选择在所述宿主细胞中被最有效率地转录的编码所述蛋白质的密码子。本领域普通技术人员可生产在细胞中有功能的DNA构建体。

在一些实施方案中，可提供其中本文所述蛋白质的编码序列与IgE信号肽相连的核酸构建体。在一些实施方案中，本文所述的蛋白质与IgE信号肽相连。

在使用蛋白质的一些实施方案中，例如，本领域普通技术人员可使用公知技术生产并使用公知技术分离本发明的蛋白质。在使用蛋白质的一些实施方案中，例如，本领域普通技术人员可使用公知技术将编码本发明的蛋白质的DNA分子插入到在公知表达系统中使用的可商购获得的表达载体中。例如，可商购获得的质粒pSE420(Invitrogen，San Diego，Calif.)可被用于在大肠杆菌(E.coli)中生产蛋白。例如，可商购获得的质粒pYES2(Invitrogen，San Diego，Calif.)可被用于在酵母的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株中的生产。例如，可商购获得的MAXBAC^TM完整杆状病毒表达系统(Invitrogen，San Diego，Calif.)可用于在昆虫细胞中的生产。例如，可商购获得的质粒pcDNA或pcDNA3(Invitrogen，San Diego，Calif.)可用于在哺乳动物细胞，例如中华仓鼠卵巢(CHO)细胞中的生产。本领域普通技术人员可使用这些商购表达载体和系统或其他载体和系统通过常规技术和可容易获得的起始材料生产蛋白质(参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning a LaboratoryManual(分子克隆实验指南)，第二版.Cold Spring Harbor Press(1989))。因此，可以在原核系统和真核系统中制备期望蛋白，产生蛋白质的一系列加工形式。

本领域普通技术人员可使用其他可商购获得的表达载体和系统，或者使用公知方法和容易获得的起始材料来生产载体。包含必要的调控序列例如启动子和聚腺苷酸化信号以及优选地包含增强子的表达系统可容易地获得并且在本领域中对于各种宿主是已知的。参见例如，Sambrook等人，Molecular Cloning a Laboratory Manual(分子克隆实验指南)，第二版.Cold Spring Harbor Press(1989)。基因构建体包括与启动子可操作地连接的蛋白质编码序列，所述启动子在转染构建体的细胞系或靶组织的细胞中是有功能的。组成型启动子的实例包括来自巨细胞病毒(CMV)或SV40的启动子。诱导型启动子的实例包括小鼠乳腺白血病病毒或金属硫蛋白的启动子。本领域普通技术人员可从容易获得的起始材料中容易地生产用于用编码本发明的蛋白质的DNA转染细胞的遗传构建体。将包括编码蛋白质的DNA的表达载体用来转化相容的宿主，然后将所述宿主在其中发生外源DNA表达的条件下培养并保持。

通过溶解细胞或者从适当的和本领域技术人员已知的培养基中将产生的蛋白质从培养物中回收。本领域普通技术人员可使用公知技术来分离使用此类表达系统生产的蛋白质。使用与以上所述的特定蛋白特异性结合的抗体从自然来源中纯化蛋白质的方法可同样地应用于通过重组DNA方法产生的纯化蛋白质。

除了通过重组技术生产蛋白质之外，还可以采用自动化肽合成仪来生产分离的、基本上纯的蛋白。此类技术对于本领域普通技术人员是公知的，并且如果具有替代的衍生物没有在DNA编码的蛋白质的生产中提供的话，此类技术是有用的。

可使用几种公知技术中的任一种递送核酸分子，所述技术包括：有和没有体内电穿孔的DNA注射(也称为DNA接种)，脂质体介导，纳米颗粒促进，重组载体例如重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组牛痘苗。优选地，本文所述的核酸分子例如DNA质粒是通过DNA注射连同体内电穿孔递送。

施用途径包括但不限于：肌内、鼻内、腹膜内、皮内、皮下、静脉内、动脉内、眼内和口服以及局部地、经皮、通过吸入或栓剂或者至粘膜组织例如通过灌洗至阴道、直肠、尿道、颊或舌下的组织。优选的施用途径包括肌内、腹膜内、皮内和皮下注射。遗传构建体可以通过如下手段施用，包括但不限于：常规注射器、无针注射装置、“微弹轰击基因枪(microprojectile bombardment gone gun)”或其他物理方法例如电穿孔(“EP”)、“流体动力学方法”或超声。

用于促进本发明的DNA疫苗的递送的优选的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括在Draghia-Akli等人的美国专利号7,245,963、Smith等人递交的美国专利公开2005/0052630中描述的实例，两篇文献的内容通过引用将它们的全部内容并入本文。还优选下述文献中提供的用于促进DNA疫苗的递送的电穿孔装置和电穿孔方法：2007年10月17号提交的共同待审和共有拥有的美国专利申请系列号11/874072，它依据美国法典第35条119款要求享有2006年10月17日提交的美国临时申请序列号60/852,149和2007年10月提交的60/978,982的权益，所有这些文献均将其全部内容并入本文。

Draghia-Akli等人的美国专利号7,245,963描述了标准电极系统和它们用于促进将生物分子导入身体或植物内选定组织的细胞中的用途。标准电极系统包括多个针状电极；皮下针；提供从程序化恒定电流脉冲控制器到所述多个针状电极的传导连接的电连接器；以及电源。操作者可以抓住装在支撑结构上的多个针状电极并将它们牢固地插入到身体或植物内的选定组织中。然后将生物分子通过皮下针递送到选定组织中。程序化恒定电流脉冲控制器被激活，并且恒定电流的电脉冲被应用到多个针状电极。应用的恒定电流电脉冲促进生物分子导入到多个电极之间的细胞中。美国专利号7,245,963的全部内容通过引用并入本文。

Smith等人递交的美国专利公开2005/0052630描述了可被用来有效促进生物分子导入到身体或植物内选定组织的细胞中的电穿孔装置。所述电穿孔装置包括由软件或固件指定操作的电动装置(“EKD装置”)。EKD装置基于使用者的控制和脉冲参数的输入在阵列中的电极之间产生一系列可程序化的恒定电流脉冲模式，并且允许电流波形数据的存储和获取。电穿孔装置还包括具有针状电极阵列的可替代的电极盘、用于注射针的中心注射通道以及可移去的引导盘。美国专利公开2005/0052630的全部内容通过引用并入本文。

美国专利号7,245,963和美国专利公开2005/0052630中描述的电极阵列和方法适合用于深深穿入例如肌肉的组织以及其他组织或器官。因为电极阵列的配置，注射针(递送选择的生物分子)也被完全插入到靶器官中，并且注射被垂直施用至由电极预先划定的区域中的靶组织。在美国专利号7,245,963和美国专利公开2005/005263中描述的电极优选地是20mm长以及21厚度(gauge)。

以下是本发明的方法的一个实例，并且在以上讨论的专利参考文献中更详细地被讨论：可以配置电穿孔装置来将产生的恒定电流的能量脉冲递送至哺乳动物的期望组织，所述恒定电流类似于使用者的预设电流输入。电穿孔装置包括电穿孔部件和电极组件或手柄组件。电穿孔部件可包括并掺入电穿孔装置的各种元件中的一个或多个，包括：控制器、电流波形发生器、阻抗测验器、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通信端口、记忆部件、电源和电源开关。电穿孔部件能够作为电穿孔装置的一个元件起作用，并且其他元件是与电穿孔部件保持联系的分开的元件(或部件)。在一些实施方案中，电穿孔部件能够作为多于一个电穿孔装置的元件起作用，它还能够与电穿孔装置的其他元件保持联系，所述其他元件与电穿孔部件是分开的。本发明不受作为机电装置或机械装置的零件存在的电穿孔装置的元件限制，因为所述元件能够作为一个装置或者作为彼此保持联系的分开的元件起作用。电穿孔部件能够递送在期望组织中产生恒定电流的能量脉冲，并且包括反馈机制。电极组件包括在空间排布中具有多个电极的电极阵列，其中所述电极组件接收来自电穿孔部件的能量脉冲并且将此能量脉冲通过电极递送到期望组织。多个电极中的至少一个在递送能量脉冲的过程中是中性的，并且测量期望组织中的阻抗，并且将该阻抗传递到电穿孔部件。反馈机制能够接收测量的阻抗并且能调整由电穿孔部件递送的能量脉冲以保持恒定电流。

在一些实施方案中，所述多个电极能够以分散模式递送能量脉冲。在一些实施方案中，所述多个电极能够通过在程序序列下控制电极以分散模式递送能量脉冲，并且所述程序序列是由使用者输入到电穿孔部件中。在一些实施方案中，程序序列包括按顺序递送的多个脉冲，其中多个脉冲中的每个脉冲是通过至少两个活性电极和测量阻抗的一个中性电极递送，并且其中多个脉冲中的随后脉冲是通过至少两个活性电极中不同的一个和测量阻抗的一个中性电极递送。

在一些实施方案中，反馈机制是通过硬件或软件执行的。优选地，反馈机制是通过模拟闭合环路执行的。优选地，这种反馈每50μs、20μs、10μs或1μs发生，但优选地是实时反馈或是瞬时反馈(即如通过用于确定反应时间的可用技术所确定的基本上瞬时的反馈)。在一些实施方案中，中性电极测量期望组织中的阻抗并且将该阻抗传递至反馈机制，该反馈机制响应该阻抗，并调整能量脉冲以将恒定电流保持在与预设电流类似的值。在一些实施方案中，反馈机制在递送能量脉冲的过程中连续地并瞬时地保持恒定电流。

药学上可接受的赋形剂可包括例如运载体、佐剂、载体或稀释剂这类公共已知并且可容易获得的功能分子。优选地，药学上可接受的赋形剂是佐剂或转染促进剂。在一些实施方案中，将核酸分子或DNA质粒递送至细胞，并且施用多核苷酸功能增强剂或遗传疫苗促进剂(或转染促进剂)。多核苷酸功能增强剂描述于美国系列号5,593,972、5,962,428和1994年1月26日提交的国际申请系列号PCT/US94/00899中，这些文献各自通过引用并入本文。遗传疫苗促进剂描述于1994年4月1日提交的美国系列号021,579中，其通过引用并入本文。转染促进剂能够与核酸分子一起作为与核酸分子的混合物施用，或者在核酸分子施用的同时、之前或之后分开施用。转染促进剂的实例包括表面活性剂，例如免疫刺激复合物(ISCOMS)；弗氏不完全佐剂；LPS类似物，包括单磷酰脂质A；胞壁酰肽；醌类似物以及小泡例如角鲨烯和角鲨烯；并且也可以使用透明质酸与遗传构建体联合施用。在一些实施方案中，DNA质粒疫苗还可以包括转染促进剂，例如脂质；脂质体，包括卵磷脂脂质体或本领域其他已知脂质体，为DNA脂质体混合物(参见例如W09324640)；钙离子；病毒蛋白；聚阴离子；聚阳离子或纳米颗粒；或者其他已知的转染促进剂。优选地，转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包括聚L谷氨酸(LGS)或脂质。

在一些优选的实施方案中，将DNA质粒与佐剂一起递送，所述佐剂是进一步增强针对此类靶蛋白的免疫反应的蛋白质的基因。此类基因的实例是那些编码其他细胞因子和淋巴因子的基因，所述细胞因子和淋巴因子例如α-干扰素、γ-干扰素、血小板衍生的生长因子(PDGF)、TNF-α、TNF-β、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、MHC、CD80、CD86和IL-15，包括信号序列被删除并任选地包括来自IgE的信号肽的IL-15。可能有用的其他基因包括编码以下的基因：MCP-1、MIP-1□、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变体形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素反应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及它们的功能片段。

根据本发明的DNA质粒疫苗包含的DNA量为从约1纳克到100毫克；约1微克到约10毫克；或者优选地约0.1微克到约10毫克；或者更优选地约100微克到约1毫克。在一些优选的实施方案中，根据本发明的DNA质粒疫苗包含约5纳克到约1000微克的DNA。在一些优选的实施方案中，DNA质粒疫苗含有约10纳克到约800微克的DNA。在一些优选的实施方案中，DNA质粒疫苗含有约0.1微克到约500微克的DNA。在一些优选的实施方案中，DNA质粒疫苗含有约1微克到约350微克的DNA。在一些优选的实施方案中，DNA质粒疫苗含有约25微克到约250微克的DNA。在一些优选的实施方案中，DNA质粒疫苗含有约100微克到约1毫克的DNA。

根据待使用的施用方式配制根据本发明的DNA质粒疫苗。在DNA质粒疫苗是可注射的组合物的情况中，它们是灭菌的和/或无热原的和/或无颗粒的。优选地使用等渗制剂。一般来说，等渗性的添加剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。在一些情况中，优选等渗溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施方案中，将血管收缩剂加到制剂中。在一些实施方案中，使得制剂在室温或环境温度下稳定延续的一段时间的稳定剂例如LGS或其他聚阳离子或聚阴离子被加到制剂中。

在一些实施方案中，引发哺乳动物针对共有登革抗原的免疫反应的方法包括诱导粘膜免疫反应的方法。此类方法包括向所述哺乳动物施用一种或多种CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白和它们的功能片段或它们的可表达的编码序列以及包括以上所述的共有登革抗原的DNA质粒。一种或多种CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白和它们的功能片段可以在本文提供的DNA质粒登革疫苗的施用之前、同时或之后施用。在一些实施方案中，向哺乳动物施用分离的核酸分子，所述核酸分子编码一种或多种选自由以下组成的组的蛋白质：CTACK、TECK、MEC和它们的功能片段。

实施例

在以下实施例中进一步举例说明了本发明。应当理解这些实施例指出本发明的优选实施方案时，仅通过举例说明方式被给出。由以上讨论和这些实施例，本领域技术人员能够确定本发明的必要特征，并且在不背离本发明的精神和范围的情况下，能够对本发明进行各种变动和改良以使其适合于各种运用和条件。因此，由上述描述，本发明的各种改良以及本文示出并描述的那些改良对本领域技术人员将是明显的。此类改良也旨在落入所附权利要求书的范围之内。

优选地，供本文所述的肌肉或皮肤EP装置使用的DNA制剂具有小体积的高DNA浓度，优选包括微克到数十毫克量的、并且优选毫克量的DNA浓度，所述小体积对于递送到皮肤是最佳的，优选小注射体积，理想的是25-200微升(μL)。在一些实施方案中，所述DNA制剂具有高DNA浓度，例如1mg/mL或更大(mg DNA/制剂体积)。更优选地，DNA制剂具有的DNA浓度提供了在200μL的配方中的克量的DNA，并且更优选在100μL的配方中克量的DNA。

可使用已知装置与技术的组合配制或制造供本发明的EP装置使用的DNA质粒，但优选地使用在以下文献中描述的优化的质粒制造技术来制造它们：美国申请第12/126611号，它作为2009年1月1日公开的美国公开第20090004716号而公开。在一些实例中，在这些研究中使用的DNA质粒能够以大于或等于10mg/mL的浓度配制。除了在美国公开第20090004716号中描述的和在2007年7月3日提交的美国专利第7,238,522号中描述的装置和方案之外，制造技术还包括或结合了本领域普通技术人员通常知道的各种装置和方案。供本文描述的皮肤EP装置和递送技术使用的高浓度质粒允许质粒以相当低的体积施用到ID/SC空间中并且帮助增强表达和免疫作用。公开文本美国公开第20090004716号和美国专利第7,238,522号均将其整体在此并入。

实施例1：登革DIII表达构建体

从GeneBank收集来自不同地理人口的大约15个亚型序列以避免取样偏倚。所有使用的序列均是非重组的。利用应用程序Clustal X(1.81版本)进行登革包膜(登革E)DIII序列的多重比对，在Clustal X中成对比对参数被设定到动态缓慢-准确程序设计(slow-accurateprogramming)，使用10作为空位开口罚分(gap opening penalty)且0.1作为空位延伸罚分(gap extension penalty)。多重比对参数包括等于0.2的空位延伸罚分。在进行多重比对和一些较少的手动调整之后获得了登革E共有核苷酸序列。使用推导的氨基酸序列来指导比对空位的引入以使得这些空位在密码子之间插入。通过使用GeneOptimizer(GENEART，Germany)进行密码子优化和RNA优化。将密码子优化的合成序列进一步克隆到pVAX哺乳动物表达质粒的KpnI/PstI位点中。

图1图示了登革多肽的结构和登革E的构象特征。登革E由三种不同的结构域：I、II和III组成。从NCBI数据库选择登革E DIII结构域的氨基酸序列并对其进行比对以产生共有序列：DV-1 DIII(SEQ ID NO：1)、DV-2 DIII(SEQ ID NO：2)、DV-3 DIII(SEQ ID NO：3)和DV-4DIII(SEQ ID NO：4)。集合来自不同毒株的氨基酸序列用于使用Lasergene 7(DNA Star Inc，Madison，WI)比对。将位于Kozak序列之后的Ig-E前导序列融合到编码序列的N端。基于氨基酸序列，使用GeneartInc的软件工具产生了人类优化的合成基因序列并将其克隆到pVAX载体中。编码亚型-1、亚型-2、亚型-3和亚型-4的登革包膜DIII结构域的表达载体分别称为pDV-1 DIII、pDV-2 DIII、pDV-3 DIII和pDV-4 DIII。质粒图谱在图4a中提供。

构建了组合所有四种DIII结构域(通用的或通用DIII)的构建体并将其称为DV-U-DIII(SEQ ID NO：5)，所述四种DIII结构域是由蛋白水解切割序列分开。图3示出可读框的结构以及氨基酸序列的简图，以所述氨基酸序列为基础合成了人类优化的基因。将DV-U-DIII克隆到pVAX载体中以产生通用表达构建体：pDV-U-DIII，其质粒图谱可见于图4b中。

实施例2

登革DIII结构域在哺乳动物系统中的表达

白纹伊蚊C6/36细胞、Vero、HEK293、HeLa、RD和BHK细胞是从美国标准生物品保藏中心(Manassas，VA)获得。在28C于5％CO₂中，将C6/36细胞保持在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)、青霉素G(100U/ml)、链霉素(100ug/ml)、L-谷氨酰胺和非必需氨基酸的伊格尔最低基础培养基(EMEM；Gibco BRL)中。在37℃于5％CO₂中，将Vero细胞保持在含有115mM HEPES缓冲液，补充有10％热灭活胎牛血清、青霉素G(100U/ml)、链霉素(100ug/ml)、L-谷氨酰胺和非必需氨基酸的的达尔伯克改良的伊格尔培养基(DMEM)-F12(GibcoBRL)中。在37℃于5％CO₂中，将HEK293、HeLa和RD细胞保持在补充有10％热灭活胎牛血清、青霉素G(100U/ml)、链霉素(100ug/ml)的DMEM培养基中。

所用的病毒包括DENV 1病毒、DENV 2、原型DENV 3(H 87毒株)和原型DENV 4(H241)。登革病毒的所有实验使用的临床病毒分离物和原种在细胞培养物中传代少于四次。通过用在1ml的EMEM-2％FBS中稀释的200ul病毒接种75-cm²组织培养瓶中的单层C6/36细胞获得病毒原种。在一小时之后，加入14ml补充有2％FBS的EMEM，并且在28C在5％的CO₂下将细胞培养10天。将上清液从细胞移出并以2000X g离心5分钟以沉淀细胞碎片。将上清液等分并储存在80℃。使DENV1在Vero细胞中生长并传代，而DENV 4(H241)在以上所述的C6/36细胞中生长并在Vero细胞中传代一次。

因为基于pVAX的登革DIII疫苗构建体不包括另外的合成表位，所以利用RT-PCR方法来检测编码DIII结构域的mRNA转录物的存在。用DIII表达构建体(独立地，四种血清型中的每一种和通用血清型)转染人横纹肌肉瘤细胞系RD细胞，并且在转染后两天，从转染的细胞中制备总RNA。使用每种登革病毒血清型的特异性引物，进行RT-PCR来扩增相应的DIII结构域。图5是显示来自转染细胞的扩增的DIII片段的凝胶照片，所述扩增的DIII片段是由表示长度为360bp片段的条带表示。模拟转染的细胞(用空pVAX载体转染)没有显示这些扩增的产物。这项研究证实来自转染细胞的用于DIII表达的mRNA转录物的存在。因此这些DNA构建体表明蛋白质产物的表达。

除了这些基于pVAX的DNA构建体之外，构建了另外一组DNA构建体来表达相似的蛋白质产物。出于免疫检测的目的，这些构建体包括登革病毒DIII结构域与合成FLAG(Sigma Co.)表位的融合体(称为FLAGGED构建体)。用FLAGGED构建体转染RD细胞，并且在转染后三十六小时，用免疫荧光测定法，使用抗FLAG单克隆抗体(SigmaCo.)分析细胞。

来自pDV-U-DIII的单独的所有四种DIII结构域和组合的DIII结构域或通用DIII(或通用登革抗原)的表达模式是相同的，如从蛋白质的细胞质定位模式所证明(参见图6)。几份报告已经很好地证明了全长登革E的表达产生典型的细胞质型。因此，单独的DIII的表达模式与全长登革E的表达模式一致。放射标记的登革E DIII蛋白由这些FLAGGED构建体产生，并且在SDS-PAGE凝胶中分析。这些蛋白质的迁移率与16kDa左右质量的蛋白质对应，如在图7的凝胶照片中所示。组合的DIII结构域的分子质量显示出总体上约为50kDa。

实施例3

使用细菌表达和纯化系统从所有四种亚型合成和产生DENV E DIII蛋白：

通过用包括编码的DIII结构域的pQE载体转化，在大肠杆菌中表达了代表所有四种登革血清型的DIII结构域的包膜区(295-415)。登革E-DIII的预测大小是约16kDa。细菌溶胞产物的SDS-PAGE(SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳)示出在(异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷)IPTG诱导的大肠杆菌培养物中过量表达的预期大小的蛋白质。IPTG通常用作诱导β-乳糖苷酶的活性的异乳糖的分子模拟物。此外，在镍柱(具有结合聚组氨酸标记的重组蛋白的能力的镍螯合柱)洗脱的级分中出现的蛋白质条带的显现与具有IPTG处理的溶胞产物的柱中出现的主要条带的迁移率相对应。来自pQE载体转化的样品的未处理(Un)和IPTG处理(In)的两种样品的溶胞产物(图8，前两个泳道)没有显示对应于DIII结构域的蛋白质条带。这个结果证实纯化的蛋白质是在IPTG诱导时从pQE载体表达构建体中表达的登革DIII结构域(图8)。

实施例4

用pDV-U-DIII疫苗候选物经EP(使用CELLECTRA)免疫小鼠和DV-U-DIII血清针对DIII结构域的特异性：

根据图9中图示的方案，用质粒DNA构建体(如以上实施例1中所述)免疫小鼠。

将四周鼠龄的Balb/c小鼠的各组(n＝4)用15ug pDV-U DIII和剩余的单个DIII表达载体肌内免疫。pVAX用作对照载体。在免疫之前，使用通过眼静脉采血的现有方案收集免疫前血液样品。在所有实验中使用方波脉冲(Draghia-Akli和Smith，2003)并用恒定电流CELLECTRA电穿孔仪(VGX Pharmaceuticals，Blue Bell，PA)递送。在小鼠实验中使用三电极阵列(3-EA)。3-EA是由三个等腰三角形结构的26规格的实心不锈钢电极组成，其中两个长边长度为0.5mm且短边长度为0.3mm，这三个电极用不导电的塑料合在一起。小鼠实验的特定EP条件是使用恒定电流，0.1安培，三个脉冲，52毫秒/脉冲，脉冲间隔4秒。质粒注射与EP之间的滞后时间为约20秒。

质粒施用/EP的事件顺序如下进行：将可处理的电极组件安放在手柄的插孔中，按压手柄上的启动按钮，进入动物实验组编号，使用胰岛素注射器注射50ul的DNA构建体(15ug总DNA)质粒，将针立即放到注射部位周围的区域中，按压手柄上的启动按钮，并且在4秒的倒数计秒之后，递送脉冲。在电穿孔5秒后，将阵列从肌肉轻轻地移出。在所有处理过程中，所有的电极被完全插入到肌肉中。所有DNA使用无内毒素的Qiagen柱制备。将动物圈养在宾夕法尼亚大学的温度受控的、光循环的设施中，并且动物护理按照美国国家卫生研究所和宾夕法尼亚大学的指引。

通过ELISA测定了在第三次加强免疫之后从单个小鼠获得的血清样品的DENV抗体滴度。所有的小鼠产生抗DIII抗体。由免疫的小鼠产生的抗DENV E DIII的抗体滴度是通过ELISA测定，使用纯化的DIII片段作为捕获抗原而确定。将抗原捕获在镍涂覆的ELISA板中，然后针对来自接种pDV-U-DIII的小鼠的血清对抗原测试。如在图10中所示，用pDV-U-DIII免疫的小鼠的血清展示出高水平的ELISA反应性，而pVAX免疫的小鼠的血清的反应性可忽略不计(数据未显示)。就抗DIII结构域的抗体的产生来说，在pDV-U-DIII接种前和接种后的小鼠之间也存在巨大差异。由单个DIII结构域表达构建体产生的抗体滴度的水平显著低于由pDV-U-DIII疫苗候选物引发的抗体滴度。基于这个ELISA数据，我们决定用从用pDV-U-DIII疫苗候选物免疫的小鼠中收集的抗DIII血清进行后面所有的分析。

检查了从用pDV-U-DIII构建体免疫的小鼠中收集的血清与所有四种血清型的DIII结构域反应的能力。将IPTG诱导的细菌溶胞产物以及所有四种血清型的纯化的DIII结构域在SDS-PAGE凝胶中分析，并通过蛋白质印迹分析进行免疫探测，使用pDV-U-DIII血清作为潜在的抗登革DIII血清。使用缀合HRP的抗小鼠抗体来检测抗原-抗体复合物，并使用化学发光系统来检测免疫反应。D-U血清清楚地识别来自IPTG诱导的溶胞产物以及所有四种血清型的镍洗脱的样品这两者的DIII蛋白。与DIII抗原特定结合而不与粗制溶胞产物的其他蛋白样品结合得出血清与DIII抗原之间的特异性反应的直接证据(参见分辨的条带，包括多聚体条带，在图11中)。血清识别整体上约16kDa的分子，该质量等同于由纯化的DIII片段显示的质量。

还检查DV-U-DIII血清来验证它是否能够与用所有四种DIII结构域单独转染的细胞中表达的DIII抗原结合。出于这个目的，用这些编码DIII的pVAX表达构建体瞬时转染HeLa细胞，并且在转染后三十六小时，固定细胞用于免疫荧光分析。

首先，使用FuGENE 6转染试剂(Roche)用登革疫苗构建体和pVAX(1mg/孔)转染细胞。在用抗小鼠登革抗体或来自接种pDV-U DIII的小鼠的血清孵育转染的细胞90分钟后，用四甲基罗丹明异硫氰酸酯缀合的第二抗体(Sigma-Aldrich)孵育玻片45分钟。将40，6-二氨基-2-苯基吲哚盐酸盐(Sigma-Aldrich)加入到第二抗体的溶液中来将细胞核复染色以显示出在给定区域中可用的细胞总数的细胞核。使用荧光显微镜(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)的三相Pro程序(Phase 3 Proprogram)分析图像。

抗DV-U-DIII血清对于未转染的HeLa细胞和pVAX转染的HeLa细胞(从ATCC，Va接受)两者没有产生任何显著的染色。然而，DV-U-DIII血清对于单独的DIII抗原产生了高特异性的染色(图12)。最重要的是，表达DIII的细胞主要展现细胞质定位方式。这一观察与用FLAG表位标记的DIII表达载体进行的免疫荧光研究一致，该研究使用靶向融合FLAG表位的DIII蛋白质的抗FLAG抗体，如图6所示。

实施例5：

来自pDV-U-DIII接种的小鼠的抗DIII血清与来自活病毒粒子的天然构象的E的完整DIII结构域的结合：

检测DV-U DIII血清抗登革2感染的细胞以观察该抗DIII血清是否可与登革2病毒反应。自然地，认为DIII结构域被定位在病毒外表面上的登革E三维构型的峰区中。

在BHK-21(幼仓鼠肾细胞系；ATCC，Manassas，Va)细胞中扩增登革2病毒以达到高滴度。此外，将这种高滴度病毒原种用来感染Vero细胞(ATTC，Manassas，Va)。在感染四天后，按以上实施例4中概述的方案，登革2感染的细胞用抗DV-U DIII血清、接着用FITC缀合的抗小鼠抗体染色。抗DV-U DIII血清对于未感染的细胞不能产生任何不同的染色类型。这种血清仅与被登革2亚型病毒感染的细胞反应。从接种pVAX的小鼠中收集的血清也不与感染登革2的Vero细胞和未感染的Vero细胞反应。因此，只有接种DV-U-DIII的小鼠产生能够识别登革E的DIII结构域的抗DIII抗体(图13)。

检测DV-U DII血清抗感染了所有四种登革亚型的细胞以观察该抗DIII血清是否可与所有这四种类型的感染细胞反应。

使室型玻片(chamber-slide)中生长过夜的Vero细胞用所有四种亚型的高滴度病毒原种感染。在感染四天后，按照更早概述的方案，登革感染的细胞用抗DV-U DIII血清、接着用FITC缀合的抗小鼠抗体染色。抗DV-U DIII血清对于未感染的细胞不能产生任何不同的染色类型。这种血清仅与被登革亚型感染的细胞反应。有趣的是，从接种pVAX的小鼠中收集的血清也不与感染登革的Vero细胞以及未感染的Vero细胞中任何一个反应。因此，只有接种DV-U-DIII的小鼠产生能够识别来自登革病毒粒子的E的DIII结构域的抗DIII抗体(图15)。上面的图片表明受感染的细胞，而底部图片显示具有DAPI染色的相同区域以表明在该区域中可用的细胞的核含量。这一观察不仅表明在接种DV-U DIII的小鼠中存在的抗DIII抗体与DIII抗原之间的特异性相互作用，而且表明这种抗体能够与来自登革病毒本身的天然构象的E的完整DIII结构域反应。

实施例6：

抗DIII血清针对各种登革病毒亚型的中和能力：

使用噬斑中和测定法确定针对pDV-U DIII产生的血清或免疫前血清(对照)对DENV1、DENV2、DENV3和DENV4的感染性的中和能力。使用来自以下的改良方案进行噬斑减少中和试验：Russel等人(APlaque Reduction Test for Dengue Virus Neutralizing Antibodies(登革病毒中和抗体的噬斑减少试验).1967.第285-290页)，Kochel，T.J.等人(Effect of dengue-1 antibodies on American dengue-2 viral infection anddengue haemorrhagic fever(登革1抗体对美国登革2病毒感染和登革出血热的作用).The Lancet，2002.360(9329)：第310-312页)和Wu，S.-J.L.等人(Detection of Dengue Viral RNA Using a Nucleic AcidSequence-Based Amplification Assay(使用基于核酸序列的扩增测定检测登革病毒RNA).2001.第2794-2798页)。

将病毒的原种与来自接种pDV-U-DIII的小鼠的抗DIII血清的不同稀释物混合，并且将得到的混合物在Eppendorf管中混合到200微升的D10培养基(补充有10％胎牛血清的DMEM培养基；Invitrogen)中。将这些混合物在37℃下在培养箱中保持一小时，然后将其加到细胞(细胞在组织培养物室型玻片上被过夜接种)中以使Vero细胞能够感染。在用病毒的混合物孵育一小时后，用PBS彻底地洗涤细胞，并将细胞留在培养箱中另外与细胞培养基一起孵育四天。这项测定的对照包括：(1)未感染的Vero细胞，(2)用病毒原种感染的且未用任何血清处理的细胞，以及(3)用病毒原种感染的且用来自接种pVAX的小鼠的血清处理的细胞。

来自接种pDV-U-DIII的小鼠的抗DIII血清染色感染登革2的细胞而没有任何模糊(图13)。此外，该血清对于未感染的细胞不能产生任何显著染色。对于没有用任何血清处理的病毒原种，观察到最高数目的染色的感染细胞。发现病毒感染的细胞数目在用抗DIII血清处理的病毒原种感染的细胞中比在接受未处理的病毒原种的细胞中少。因此，用抗DIII血清处理病毒原种降低了登革2病毒的滴度，如在图14中所示的柱状图中所观察到的。

通过使用来自登革1、登革3和登革4亚型的原种代替以上使用的登革2病毒原种得到类似的中和结果。来自接种p-DV-U DIII的小鼠的抗DIII血清使用所有四种登革亚型感染的细胞染色而没有任何模糊。此外，观察到该血清对于未感染的细胞没有产生任何显著的染色。对于没有用任何血清处理的病毒原种观察到最高数目的染色的感染细胞。发现病毒感染的细胞数目对于用抗DIII血清处理的病毒原种处理的细胞中比接受未处理的病毒原种的细胞显著降低。因此，用抗DIII血清处理病毒原种降低了感染性登革病毒粒子的滴度。因此，来自接种pDV-U DIII的小鼠的血清含有抗DIII抗体，该抗体显示出针对所有四种登革亚型的中和能力。

此外，测试pDV-U DIII血清的中和作用以确定其对由登革感染所引起的细胞病变作用的影响。图16示出使用具有各种登革亚型的DV-UDIII血清产生的中和数据(来自美国南方研究所(Southern ResearchInstitute)，Frederick，MD的数据)。这个图表明DV-U DIII血清具有中和所有四种登革病毒亚型至高达1∶1100的稀释系数的能力。从接种pVAX的小鼠收集的血清不能中和任何一种登革病毒亚型。

实施例7

针对登革E DIII抗原的B细胞激活

制备了接种DIII-DNA的小鼠的小鼠脾脏来测量B细胞能够产生针对DIII蛋白的抗体的频率。

将登革蛋白悬浮液解冻，将该管涡旋以悬浮细小的蛋白微粒。将重悬蛋白的小的等份试样溶解在缓冲液TU(62mM Tris-HCl/8M尿素，pH8.0)中以产生10ug/ml溶液。登革蛋白在这种缓冲液中是可溶的。将100ul稀释蛋白的等份试样(1ug)施加到Pierce HisGrab铜涂覆的高结合容量板(Pierce HisGrab Copper Coated High Binding Capacity Plate)的孔中，并且按照常规方案进一步分析这些抗原涂覆的镍板(Yan，J.，等人.，Enhanced Cellular Immune Responses Elicited by an Engineered HIV-1Subtype B Consensus-based Envelope DNA Vaccine(由基于工程HIV-1亚型B共有区的包膜DNA疫苗引发的增强的细胞免疫反应).Mol Ther.15(2)：第411-421页)。在包含小鼠和猴模型的未来研究中将应用相同的方案。对于IFN-γ的酶联免疫斑点测定，具有跨所有四种血清型的DIII区的10个重叠氨基酸的15mer肽将被用作抗原刺激物。从被激发的小鼠以及猴受试者的脾脏中收集的细胞将使用这些测定法。

酶联免疫斑点测定的结果与以上所述的DIII抗体ELISA数据一致。在用pDV-U DIII接种的小鼠中观察到比单独接受单个DIII结构域的组更高的频率的DIII特异性小鼠抗体分泌细胞(图17)。综观来说，此酶联免疫斑点的结果表明，如ELISA研究所确定，与DIII特异性抗体的滴度相对应的高亲和力抗原特异性B细胞的激活。

实施例7：

在猕猴(Rhesus Macaque)中登革中和抗体的产生：

可以用pDV-U-DIII登革表达构建体接种猕猴。在三次追加免疫之后，可以评定抗体滴度，并且可以用所有四种登革病毒血清型攻击该猴。

使猕猴在实验开始之前适应2个月。该研究可如下进行：第0周-进行第一次免疫(质粒剂量施用)和基线采血；第2周进行采血；第3周进行第二次免疫(质粒剂量施用)；第5周进行采血；第6周进行第三次免疫(质粒剂量施用)和采血；8周进行采血。

将这些受试者用浓度约1mg/ml(并且优选约10mg/ml)的pDV-UDIII制剂和剩余的单个DIII表达载体肌内免疫。pVAX可用作对照载体。在所有实验中将使用方波脉冲(Draghia-Akli和Smith，2003)并用恒定电流CELLECTRA电穿孔仪(VGX Pharmaceuticals，Blue Bell，PA)递送。选择EP条件如下：0.5安培，三个脉冲，52毫秒，脉冲间隔1秒。

序列表

<110>VGX制药公司

马图拉·拉玛纳桑

让加·萨尔德赛

<120>针对多种登革病毒亚型的新颖疫苗

<130>133121.01002

<150>61/020,490

<151>2008-01-11

<160>16

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>363

<212>DNA

<213>登革病毒1型

<400>1

aagggcacca gctacgtgat gtgcaccggc agcttcaagc tggaaaaaga ggtggccgag 60

actcagcacg gcactgtgct cgtccaggtc aagtacgagg gcaccgacgc cccctgcaag 120

atccccttca gcacccaaga cgagaagggc gtgacacaga acggccggct gatcaccgcc 180

aaccccatcg tgaccgacaa agaaaagccc gtgaacatcg agaccgagcc ccccttcggc 240

gagagctaca tcgtggtggg agccggcgag aaggccctca agctgagttg gttcaaaaag 300

ggcagcagca tcggcaagat gttcgaggcc accgccaggg gcgctcgcag gatggctatt 360

ctc 363

<210>2

<211>363

<212>DNA

<213>登革病毒2型

<400>2

aagggcatgt cctacagcat gtgtactggc aagttcaagg tcgtcaaaga gatcgccgaa 60

acacaacacg ggaccatcgt gatccgggtg cagtatgagg gcgacggcag cccttgtaag 120

atccctttcg agatcatgga cctggaaaag cggcacgtgc tgggccgcct gatcacagtg 180

aatcctatcg tgacagagaa ggacagccct gtgaatattg aggcagagcc accatttggc 240

gactcctaca tcatcatcgg cgtggagccc ggccagctga agctgaattg gtttaagaag 300

gggtcctcca ttgggcagat gtttgagact actatgagag gcgccaagag aatggctatt 360

ctc 363

<210>3

<211>363

<212>DNA

<213>登革病毒3型

<400>3

aagggcatga gttacgcaat gtgtctgaac accttcgtgc tgaagaaaga agtgagcgag 60

acacagcatg gcacaatcct gattaaggtg gagtacaagg gcgaggatgc cccttgcaag 120

attccattct ccaccgagga cggccagggc aaggctcaca acggcagact gattacagcc 180

aaccctgtgg tgaccaagaa agaggaacca gtcaatatcg aagccgaacc accattcggc 240

gagtccaaca ttgtgatcgg cattggcgat aaagccctga aaatcaactg gtataagaag 300

ggctcaagca tagggaaaat gtttgaggca actgcccgcg gagcaagaag aatggctatc 360

ttg 363

<210>4

<211>363

<212>DNA

<213>登革病毒4型

<400>4

aagggcatgt cttacactat gtgctctgga aagttcagca tcgacaaaga gatggctgaa 60

acccagcatg gaaccaccgt ggtgaaggtg aaatatgaag gcgctggggc tccctgtaag 120

gtgcccatcg agatcaggga cgtgaacaaa gaaaaagtgg tgggccggat catcagcagc 180

acccctttcg ccgagaacac caacagcgtg accaacatcg agctggaacc ccctttcggc 240

gattcttata tcgtgattgg cgtgggcgac tccgccctga ccctgcactg gttccggaag 300

ggctcctcta taggaaagat gtttgaaagc acctaccggg gagccaaacg catggccatc 360

ctg 363

<210>5

<211>1515

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>通用登革抗原DNA

<400>5

aagggcacca gctacgtgat gtgcaccggc agcttcaagc tggaaaaaga ggtggccgag 60

actcagcacg gcactgtgct cgtccaggtc aagtacgagg gcaccgacgc cccctgcaag 120

atccccttca gcacccaaga cgagaagggc gtgacacaga acggccggct gatcaccgcc 180

aaccccatcg tgaccgacaa agaaaagccc gtgaacatcg agaccgagcc ccccttcggc 240

gagagctaca tcgtggtggg agccggcgag aaggccctca agctgagttg gttcaaaaag 300

ggcagcagca tcggcaagat gttcgaggcc accgccaggg gcgctcgcag gatggctatt 360

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agaggcgcca agagaatggc tattctcaga ggccggaaga gaaggtccaa gggcatgagt 780

tacgcaatgt gtctgaacac cttcgtgctg aagaaagaag tgagcgagac acagcatggc 840

acaatcctga ttaaggtgga gtacaagggc gaggatgccc cttgcaagat tccattctcc 900

accgaggacg gccagggcaa ggctcacaac ggcagactga ttacagccaa ccctgtggtg 960

accaagaaag aggaaccagt caatatcgaa gccgaaccac cattcggcga gtccaacatt 1020

gtgatcggca ttggcgataa agccctgaaa atcaactggt ataagaaggg ctcaagcata 1080

gggaaaatgt ttgaggcaac tgcccgcgga gcaagaagaa tggctatctt gcgtgggaga 1140

aagcgccggt caaagggcat gtcttacact atgtgctctg gaaagttcag catcgacaaa 1200

gagatggctg aaacccagca tggaaccacc gtggtgaagg tgaaatatga aggcgctggg 1260

gctccctgta aggtgcccat cgagatcagg gacgtgaaca aagaaaaagt ggtgggccgg 1320

atcatcagca gcaccccttt cgccgagaac accaacagcg tgaccaacat cgagctggaa 1380

ccccctttcg gcgattctta tatcgtgatt ggcgtgggcg actccgccct gaccctgcac 1440

tggttccgga agggctcctc tataggaaag atgtttgaaa gcacctaccg gggagccaaa 1500

cgcatggcca tcctg 1515

<210>6

<211>121

<212>PRT

<213>登革病毒1型

<400>6

Lys Gly Thr Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly Ser Phe Lys Leu Glu Lys

1 5 10 15

Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val Leu Val Gln Val Lys Tyr

20 25 30

Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Gln Asp Glu

35 40 45

Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val

50 55 60

Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu Thr Glu Pro Pro Phe Gly

65 70 75 80

Glu Ser Tyr Ile Val Val Gly Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Leu Ser

85 90 95

Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala

100 105 110

Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala Ile Leu

115 120

<210>7

<211>121

<212>PRT

<213>登革病毒2型

<400>7

Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys Val Val Lys

1 5 10 15

Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile Arg Val Gln Tyr

20 25 30

Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu Ile Met Asp Leu

35 40 45

Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile Thr Val Asn Pro Ile Val

50 55 60

Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly

65 70 75 80

Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn

85 90 95

Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Gln Met Phe Glu Thr Thr Met

100 105 110

Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu

115 120

<210>8

<211>121

<212>PRT

<213>登革病毒3型

<400>8

Lys Gly Met Ser Tyr Ala Met Cys Leu Asn Thr Phe Val Leu Lys Lys

1 5 10 15

Glu Val Ser Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Leu Ile Lys Val Glu Tyr

20 25 30

Lys Gly Glu Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Glu Asp Gly

35 40 45

Gln Gly Lys Ala His Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Val

50 55 60

Thr Lys Lys Glu Glu Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly

65 70 75 80

Glu Ser Asn Ile Val Ile Gly Ile Gly Asp Lys Ala Leu Lys Ile Asn

85 90 95

Trp Tyr Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys MetPhe Glu Ala Thr Ala

100 105 110

Arg Gly Ala Arg Arg Met AlaIle Leu

115 120

<210>9

<211>121

<212>PRT

<213>登革病毒4型

<400>9

Lys Gly Met Ser Tyr Thr Met Cys Ser Gly Lys Phe Ser Ile Asp Lys

1 5 10 15

Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr Val Val Lys Val Lys Tyr

20 25 30

Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro Ile Glu Ile Arg Asp Val

35 40 45

Asn Lys Glu Lys Val Val Gly Arg Ile Ile Ser Ser Thr Pro Phe Ala

50 55 60

Glu Asn Thr Asn Ser Val Thr Asn Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly

65 70 75 80

Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Asp Ser Ala Leu Thr Leu His

85 90 95

Trp Phe Arg Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ser Thr Tyr

100 105 110

Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu

115 120

<210>10

<211>505

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>通用登革抗原

<400>10

Lys Gly Thr Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly Ser Phe Lys Leu Glu Lys

1 5 10 15

Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val Leu Val Gln Val Lys Tyr

20 25 30

Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Gln Asp Glu

35 40 45

Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val

50 55 60

Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu Thr Glu Pro Pro Phe Gly

65 70 75 80

Glu Ser Tyr Ile Val Val Gly Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Leu Ser

85 90 95

Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala

100 105 110

Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala Ile Leu Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser

115 120 125

Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys Val Val Lys

130 135 140

Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile Arg Val Gln Tyr

145 150 155 160

Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu Ile Met Asp Leu

165 170 175

Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile Thr Val Asn Pro Ile Val

180 185 190

Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly

195 200 205

Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn

210 215 220

Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Gln Met Phe Glu Thr Thr Met

225 230 235 240

Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser

245 250 255

Lys Gly Met Ser Tyr Ala Met Cys Leu Asn Thr Phe Val Leu Lys Lys

260 265 270

Glu Val Ser Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Leu Ile Lys Val Glu Tyr

275 280 285

Lys Gly Glu Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Glu Asp Gly

290 295 300

Gln Gly Lys Ala His Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Val

305 310 315 320

Thr Lys Lys Glu Glu Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly

325 330 335

Glu Ser Asn Ile Val Ile Gly Ile Gly Asp Lys Ala Leu Lys Ile Asn

340 345 350

Trp Tyr Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala

355 360 365

Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala Ile Leu Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser

370 375 380

Lys Gly Met Ser Tyr Thr Met Cys Ser Gly Lys Phe Ser Ile Asp Lys

385 390 395 400

Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr Val Val Lys Val Lys Tyr

405 410 415

Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro Ile Glu Ile Arg Asp Val

420 425 430

Asn Lys Glu Lys Val Val Gly Arg Ile Ile Ser Ser Thr Pro Phe Ala

435 440 445

Glu Asn Thr Asn Ser Val Thr Asn Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly

450 455 460

Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Asp Ser Ala Leu Thr Leu His

465 470 475 480

Trp Phe Arg Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ser Thr Tyr

485 490 495

Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu

500 505

<210>11

<211>60

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>11

gccaccatgg actggacctg gatcctgttt ctggtcgctg ctgccactcg ggtgcacagc 60

<210>12

<211>441

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>登革病毒1表达盒

<400>12

ggtaccgcca ccatggactg gacctggatc ctgtttctgg tcgctgctgc cactcgggtg 60

cacagcaagg gcaccagcta cgtgatgtgc accggcagct tcaagctgga aaaagaggtg 120

gccgagactc agcacggcac tgtgctcgtc caggtcaagt acgagggcac cgacgccccc 180

tgcaagatcc ccttcagcac ccaagacgag aagggcgtga cacagaacgg ccggctgatc 240

accgccaacc ccatcgtgac cgacaaagaa aagcccgtga acatcgagac cgagcccccc 300

ttcggcgaga gctacatcgt ggtgggagcc ggcgagaagg ccctcaagct gagttggttc 360

aaaaagggca gcagcatcgg caagatgttc gaggccaccg ccaggggcgc tcgcaggatg 420

gctattctct gatgactgca g 441

<210>13

<211>441

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>登革病毒2表达盒

<400>13

ggtaccgcca ccatggactg gacctggatc ctgtttctgg tcgctgctgc cactcgggtg 60

cacagcaagg gcatgtccta cagcatgtgt actggcaagt tcaaggtcgt caaagagatc 120

gccgaaacac aacacgggac catcgtgatc cgggtgcagt atgagggcga cggcagccct 180

tgtaagatcc ctttcgagat catggacctg gaaaagcggc acgtgctggg ccgcctgatc 240

acagtgaatc ctatcgtgac agagaaggac agccctgtga atattgaggc agagccacca 300

tttggcgact cctacatcat catcggcgtg gagcccggcc agctgaagct gaattggttt 360

aagaaggggt cctccattgg gcagatgttt gagactacta tgagaggcgc caagagaatg 420

gctattctct gatgactgca g 441

<210>14

<211>441

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>登革病毒3表达盒

<400>14

ggtaccgcca ccatggactg gacctggatc ctgtttctgg tcgctgctgc cactcgggtg 60

cacagcaagg gcatgagtta cgcaatgtgt ctgaacacct tcgtgctgaa gaaagaagtg 120

agcgagacac agcatggcac aatcctgatt aaggtggagt acaagggcga ggatgcccct 180

tgcaagattc cattctccac cgaggacggc cagggcaagg ctcacaacgg cagactgatt 240

acagccaacc ctgtggtgac caagaaagag gaaccagtca atatcgaagc cgaaccacca 300

ttcggcgagt ccaacattgt gatcggcatt ggcgataaag ccctgaaaat caactggtat 360

aagaagggct caagcatagg gaaaatgttt gaggcaactg cccgcggagc aagaagaatg 420

gctatcttgt gatgactgca g 441

<210>15

<211>441

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>登革病毒4表达盒

<400>15

ggtaccgcca ccatggactg gacctggatc ctgtttctgg tcgctgctgc cactcgggtg 60

cacagcaagg gcatgtctta cactatgtgc tctggaaagt tcagcatcga caaagagatg 120

gctgaaaccc agcatggaac caccgtggtg aaggtgaaat atgaaggcgc tggggctccc 180

tgtaaggtgc ccatcgagat cagggacgtg aacaaagaaa aagtggtggg ccggatcatc 240

agcagcaccc ctttcgccga gaacaccaac agcgtgacca acatcgagct ggaaccccct 300

ttcggcgatt cttatatcgt gattggcgtg ggcgactccg ccctgaccct gcactggttc 360

cggaagggct cctctatagg aaagatgttt gaaagcacct accggggagc caaacgcatg 420

gccatcctgt gatgactgca g 441

<210>16

<211>1593

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>通用登革表达盒

<400>16

ggtaccgcca ccatggactg gacctggatc ctgtttctgg tcgctgctgc cactcgggtg 60

cacagcaagg gcaccagcta cgtgatgtgc accggcagct tcaagctgga aaaagaggtg 120

gccgagactc agcacggcac tgtgctcgtc caggtcaagt acgagggcac cgacgccccc 180

tgcaagatcc ccttcagcac ccaagacgag aagggcgtga cacagaacgg ccggctgatc 240

accgccaacc ccatcgtgac cgacaaagaa aagcccgtga acatcgagac cgagcccccc 300

ttcggcgaga gctacatcgt ggtgggagcc ggcgagaagg ccctcaagct gagttggttc 360

aaaaagggca gcagcatcgg caagatgttc gaggccaccg ccaggggcgc tcgcaggatg 420

gctattctcc ggggcaggaa gcggcggagc aagggcatgt cctacagcat gtgtactggc 480

aagttcaagg tcgtcaaaga gatcgccgaa acacaacacg ggaccatcgt gatccgggtg 540

cagtatgagg gcgacggcag cccttgtaag atccctttcg agatcatgga cctggaaaag 600

cggcacgtgc tgggccgcct gatcacagtg aatcctatcg tgacagagaa ggacagccct 660

gtgaatattg aggcagagcc accatttggc gactcctaca tcatcatcgg cgtggagccc 720

ggccagctga agctgaattg gtttaagaag gggtcctcca ttgggcagat gtttgagact 780

actatgagag gcgccaagag aatggctatt ctcagaggcc ggaagagaag gtccaagggc 840

atgagttacg caatgtgtct gaacaccttc gtgctgaaga aagaagtgag cgagacacag 900

catggcacaa tcctgattaa ggtggagtac aagggcgagg atgccccttg caagattcca 960

ttctccaccg aggacggcca gggcaaggct cacaacggca gactgattac agccaaccct 1020

gtggtgacca agaaagagga accagtcaat atcgaagccg aaccaccatt cggcgagtcc 1080

aacattgtga tcggcattgg cgataaagcc ctgaaaatca actggtataa gaagggctca 1140

agcataggga aaatgtttga ggcaactgcc cgcggagcaa gaagaatggc tatcttgcgt 1200

gggagaaagc gccggtcaaa gggcatgtct tacactatgt gctctggaaa gttcagcatc 1260

gacaaagaga tggctgaaac ccagcatgga accaccgtgg tgaaggtgaa atatgaaggc 1320

gctggggctc cctgtaaggt gcccatcgag atcagggacg tgaacaaaga aaaagtggtg 1380

ggccggatca tcagcagcac ccctttcgcc gagaacacca acagcgtgac caacatcgag 1440

ctggaacccc ctttcggcga ttcttatatc gtgattggcg tgggcgactc cgccctgacc 1500

ctgcactggt tccggaaggg ctcctctata ggaaagatgt ttgaaagcac ctaccgggga 1560

gccaaacgca tggccatcct gtgatgactg cag 1593

Claims

1.一种能够表达引发哺乳动物针对多于一种登革病毒亚型的免疫反应的多肽的核酸构建体，所述核酸构建体包含：

表达所述多肽的编码核苷酸序列，其中所述多肽包括来自4种登革病毒亚型的DIII结构域，且所述编码核苷酸序列编码SEQ ID NO：6、7、8和9或SEQ ID NO：10的氨基酸序列，和

在所述哺乳动物中调控所述多肽的表达并且与所述编码核苷酸序列可操作地连接的启动子。

2.如权利要求1所述的核酸构建体，还包含与所述编码序列的N端末端可操作地连接并且与所述启动子可操作地连接的IgE前导序列。

3.如权利要求1-2中任一项所述的核酸构建体，还包含与所述编码序列的C端末端相连的聚腺苷酸化序列。

4.如权利要求3所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体是密码子优化的。

5.如权利要求4所述的核酸构建体，其中所述编码核苷酸序列编码包括来自登革病毒-亚型1、登革病毒-亚型2、登革病毒-亚型3和登革病毒-亚型4的DIII结构域的多肽。

6.如权利要求1所述的核酸构建体，其中所述编码核苷酸序列由SEQ ID NO：1、2、3和4或SEQ ID NO：5组成。

7.如权利要求1所述的核酸构建体，其中所述DIII结构域使用连接序列连接在一起。

8.一种能够在哺乳动物中产生针对多种登革病毒亚型的免疫反应的DNA质粒疫苗，该疫苗包含：

编码共有登革抗原的核苷酸序列，所述共有登革抗原包括来自登革病毒-亚型1、登革病毒-亚型2、登革病毒-亚型3和登革病毒-亚型4的共有DIII结构域，所述共有DIII结构域为SEQ ID NO：6、7、8和9或SEQ ID NO：10，和

药学上可接受的赋形剂；

所述DNA质粒包含与编码所述共有登革抗原的编码序列可操作地连接的启动子。

9.如权利要求8所述的DNA质粒疫苗，其中所述DNA质粒还包含与所述编码序列的N端末端相连并且与所述启动子可操作地连接的IgE前导序列。

10.如权利要求8-9中任一项所述的DNA质粒疫苗，其中所述DNA质粒还包含与所述编码序列的C端末端相连的聚腺苷酸化序列。

11.如权利要求10所述的DNA质粒疫苗，其中所述DNA质粒是密码子优化的。

12.如权利要求11所述的DNA质粒疫苗，其中所述药学上可接受的赋形剂是佐剂。

13.如权利要求12所述的DNA质粒疫苗，其中所述佐剂选自由IL-12和IL-15组成的组。

14.如权利要求11所述的DNA质粒疫苗，其中所述药学上可接受的赋形剂是转染促进剂。

15.如权利要求14所述的DNA质粒疫苗，其中所述转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子或脂质。

16.如权利要求14所述的DNA质粒疫苗，其中所述转染促进剂是浓度小于6mg/m1的聚L谷氨酸。

17.如权利要求11所述的DNA质粒疫苗，其中所述DNA质粒疫苗具有≥1mg/m1的总DNA质粒的浓度。

18.如权利要求17所述的DNA质粒疫苗，其中所述DNA质粒包括多种单一DNA质粒，其中所述多种单一DNA质粒的每一种编码包含来自登革病毒-亚型1、登革病毒-亚型2、登革病毒-亚型3和登革病毒-亚型4的DIII结构域的多肽。

19.如权利要求18所述的DNA质粒疫苗，其中所述编码核苷酸序列由SEQ ID NO：1、2、3和4或SEQ ID NO：5组成。

20.如权利要求8所述的DNA质粒疫苗，其中所述哺乳动物是非人的灵长类。

21.如权利要求8所述的DNA质粒疫苗，其中所述免疫反应是体液反应。

22.如权利要求8所述的DNA质粒疫苗，其中所述免疫反应是细胞反应。

23.如权利要求8所述的DNA质粒疫苗，其中所述免疫反应是联合的体液反应和细胞反应。

24.如权利要求8所述的DNA质粒疫苗，其中所述DIII结构域使用连接序列连接在一起。

25.权利要求8-24任一项所述的DNA质粒疫苗在制备用于引发哺乳动物针对多种病毒亚型的免疫反应的方法中的试剂盒中的用途，其中所述DNA质粒疫苗包含能够在所述哺乳动物的细胞中表达衍生自所述病毒的亚型的多种共有抗原以在所述哺乳动物中引发免疫反应的DNA质粒，所述多种共有抗原包括来自所述病毒的4种亚型的抗原结构域，且其中所述方法包括：

向所述哺乳动物的组织递送DNA质粒疫苗，并且

用能量脉冲以有效允许所述DNA质粒进入所述细胞的恒定电流将所述组织的细胞电穿孔。

26.如权利要求25所述的用途，其中所述病毒包括登革病毒。

27.如权利要求25-26中任一项所述的用途，其中所述递送步骤包括：

将所述DNA质粒疫苗注射到皮内组织、皮下组织或肌肉组织中。

28.如权利要求27所述的用途，还包括：

预先设定期望被递送到所述组织的电流；并且

用能量脉冲以等于所述预设电流的恒定电流将所述组织的细胞电穿孔。

29.如权利要求28所述的用途，其中所述电穿孔步骤还包括：

测量所述电穿孔细胞中的阻抗；

相对于所述测量的阻抗调整所述能量脉冲的能量水平以在所述被电穿孔的细胞中保持恒定电流；

其中所述测量和调整步骤发生在所述能量脉冲的使用期内。

30.如权利要求29所述的用途，其中所述电穿孔步骤包括：

根据以分散模式递送所述能量脉冲的脉冲序列模式将所述能量脉冲递送至多个电极。

31.如权利要求25所述的用途，其中所述DIII结构域使用连接序列连接在一起。