NO340722B1 - Transgene planter som uttrykker et rekombinant tetravalent kimært denguevirusantigen for å fremstille effektive vaksiner avledet derfra, samt transgent plastid, plantecelle og frø, rekombinant DNA molekyl, vektor, fremgangsmåter for fremstilling og anvendelse derav - Google Patents

Transgene planter som uttrykker et rekombinant tetravalent kimært denguevirusantigen for å fremstille effektive vaksiner avledet derfra, samt transgent plastid, plantecelle og frø, rekombinant DNA molekyl, vektor, fremgangsmåter for fremstilling og anvendelse derav Download PDF

Info

Publication number
NO340722B1
NO340722B1 NO20140819A NO20140819A NO340722B1 NO 340722 B1 NO340722 B1 NO 340722B1 NO 20140819 A NO20140819 A NO 20140819A NO 20140819 A NO20140819 A NO 20140819A NO 340722 B1 NO340722 B1 NO 340722B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
ediii
amino acid
acid sequence
seq
transgenic
Prior art date
Application number
NO20140819A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20140819A1 (no
Inventor
Jihong Liu Clarke
Original Assignee
Norwegian Institute For Agricultural & Environmental Res
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Norwegian Institute For Agricultural & Environmental Res filed Critical Norwegian Institute For Agricultural & Environmental Res
Priority to NO20140819A priority Critical patent/NO340722B1/no
Priority to US15/321,362 priority patent/US20170136115A1/en
Priority to PCT/NO2015/050120 priority patent/WO2015199551A1/en
Priority to EP15811403.3A priority patent/EP3161141A4/en
Publication of NO20140819A1 publication Critical patent/NO20140819A1/no
Publication of NO340722B1 publication Critical patent/NO340722B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8214—Plastid transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C12N15/8258—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon for the production of oral vaccines (antigens) or immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/63—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/517—Plant cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Transgene planter som uttrykker et rekombinant tetravalent kimært denguevirusantigen for å fremstille effektive vaksiner avledet derfra, samt transgent
plastid, plantecelle og frø, rekombinant DNA molekyl, vektor, fremgangsmåter for fremstilling og anvendelse derav
Oppfinnelsens område
Den foreliggende oppfinnelsen vedrører generelt området molekylær plantebiologi og bioteknologi ettersom den vedrører fremstilling av planteavledede vaksiner. Nærmere bestemt vedrører den foreliggende oppfinnelsen rekombinante DNA-molekyler som koder for et kimært tetravalent denguevirusantigen og vektorer, transgene plastider, transgene planteceller, transgene planter og transgene deler av slike planter omfattende de rekombinante DNA-molekylene, samt som er nyttige for å fremstille genetisk transformerte planter og planteceller. Oppfinnelsen inkluderer planteoptimerte gener som koder for kimært tetravalent denguevirusantigen.
Bakgrunn for oppfinnelsen
Denguefeber er den virale sykdommen overført via mygg som sprer seg raskest i verden
og truer mer enn 40 % av jordens befolkning. Febersykdommen er endemisk i mer enn 100 land i Afrika, Amerika, det østlige Middelhavet, Sørøst-Afrika og det vestlige Stillehavet. Dengue går på tvers av internasjonale grenser og oppstår raskt som følge av globalisering, raskt uplanlagt og uregulert byutvikling, feil lagring av vann, utilfredsstillende sanitærforhold, klimaendring og global oppvarming. I 2010 ble den første europeiske lokale utbredelsen av dengue rapportert i Frankrike og Kroatia, og i 2012 resulterte et utbrudd av dengue på de portugisiske Madeira-øyene i over 2000 tilfeller (WHO, 2013).
Infisering med denguevirusene kan forårsake denguefeber (DF), dengue hemoragisk feber
(DHF) og dengue sjokksyndrom (DSS). Denguefeber er en influensalignende sykdom ledsaget av symptomer som hodepine, smerte bak øynede, muskel- og leddsmerter,
kvalme, oppkast, hovne kjertler eller utslett. De alvorlige formene DHF og DSS er potensielt dødelige komplikasjoner som skyldes plasmalekkasje, fluidakkumulering, åndenød, alvorlig blødning eller organsvikt (WHO, 2013). Dengueinfeksjoner er en viktig årsak til sykelighet og dødelighet og fører til sosiale og økonomiske skadevirkninger i mange tropiske utviklingsland. WHO anslår at det oppstår 50-100 millioner av nye
infeksjoner hvert år (WHO, 2013) og ytterligere 500 000 tilfeller av DHF/DSS og over 20 000 denguerelaterte dødsfall hvert år (WHO, 2006).
Tilfeller rapportert til Verdens Helseorganisasjon (WHO) de fire siste tiår viser en oppadgående tendens, som delvis er et resultat av økt spredning av vektormygg og økning i total befolkning, inkludert spesifikk økning i urban befolkning som står i fare for dengueinfeksjon. Dengue er endemisk i Sørøst-Asia-regionen og er en viktig årsak til sykehusinnleggelse og død blant barn i flere land i regionen (WHO, 2010). Dengue berører alle lag i befolkningen, men blomstrer i urban slum og fattige peri-urbane områder. Dengue vekker stor bekymring i India, særlig for grupper med lav inntekt, som ikke har beleilig tilgang på medisinske og diagnostiske fasiliteter, og på grunn av utilstrekkelig myggkontroll.
Dengueviruset tilhører slekten Flavivirus, Flaviviridae-familien (Calisher et al, 1989) og dets genom er et~11 kb langt positivt enkelttrådet RNA. RNA-et transkriberes som polycistroner, og polyproteinet gjennomgår posttranslasjonell spalting ved hjelp av virale og vertsproteaser som genererer tre strukturelle og sju ikke-strukturelle proteiner. Kappeviruspartiklene er av ikosaedrisk form med en diameter på 500 Å, som tilsvarer 50 nm. Viruset overføres typisk ved bitt fra den blodsugende dagaktive myggen Åedes aegypti (WHO, 2009), og inntil nylig trodde man at det oppstår i fire nært beslektede, men antigenisk og genetisk distinkte serotyper, DEN-1, DEN-2, DEN-3 og DEN-4.
Infisering med en hvilken som helst serotype forårsaker vanligvis den milde formen av sykdommen (denguefeber) og tilveiebringer livslang homogen immunitet mot denne serotypen med kun kortvarig kryssbeskyttelse mot de andre. Påfølgende infeksjon med en ulik serotype fører imidlertid til livstruende former av sykdommen: DHF og DSS. Denguepatogenese synes å være et resultat av en kompleks interaksjon av verts- og virale faktorer, der de to mest opplagte bidragsyterne er antistoffavhengig forbedring og inherent virulens til denguevirus.
Den mest effektive måten å redusere sykdoms- og dødelighetsraten på grunn av infeksjonssykdommer er å vaksinere risikoutsatt befolkning. Utvikling av en vaksine gir potensiale for effektiv forebygging og langsiktig kontroll av virusinfeksjon. Til tross for dette, mer enn 60 år etter at viruset ble oppdaget og starten på systematisk forskning på denguevaksiner, har ingen slik vaksine kommet på markedet så langt (WHO, 2013). Utviklingen av vaksinen har blitt hindret og forsinket på grunn av sykdommens komplekse patologi, behov for å kontrollere fire virus samtidig og mangel på en egnet dyremodell. Den økte spredningen av og intensiteten til sykdommen de siste årene har imidlertid skapt ny interesse og investering i forskning på denguevaksiner.
Infisering med en hvilken som helst av dengueserotypene tilveiebringer livslang immunitet mot denne serotypen, men sekundær infeksjon med en annen serotype kan predisponere et individ for potensiell dødelig DHF og DSS. Dette er fordi antidengueantistoffer som er spesifikke for én serotype, kryssreagerer med de gjenværende serotypene, men kryssbeskytter ikke mot dem (Halstead, 1988). Dette har tvunget frem oppfatningen om at en effektiv denguevaksine må være tetravalent og tilveiebringe beskyttelse mot alle fire virusserotypene samtidig (Hombach et al, 2005). Hovedstrategiene anvendt for vaksinefremstilling mot denguefeber består i tradisjonelt og molekylært svekkede levende virus, kimære levende virusvaksiner, vektorbaserte vaksiner, DNA-vaksiner og rekombinante subenhetsvaksiner (Guzman et al, 2009).
De mest avanserte denguevaksinekandidatene er utviklet som enkeltserotypespesifikke vaksineformuleringer (monovalente vaksiner) og blir vurdert som fysiske fire-i-én-blandinger for deres evne til å fremkalle beskyttende immunitet mot de fire serotypene (Swaminathan et al, 2010). Empirisk svekkede vaksinestammer for alle fire dengueserotypene har blitt oppnådd ved gjentatt seriell passasje i primære hundenyreceller (Halstead & Marchette, 2003) av to uavhengige forskningsgrupper. Mahidol-universitetet i Thailand (Bhamarapravati & Yoksan, 2001) lisensierte sine vaksinekandidatstammer til Sanofi Pasteur (Frankrike, Mahidol-vaksinen), mens Walter Reed Army Institute of Research (Eckels et al, 2000b) lisensierte sine kandidatstammer til GlaxoSmithKline (Belgia, WRAIR-vaksine) for storskalaproduksjon og ytterligere evaluering. Gjentatte rapporter om ubalansert immunrespons i forsøk med mennesker ved bruk av de svekkede tetravalente vaksineformuleringene av både Mahidol- (Edelman et al 2003; Kanesa-thasan et al, 2001) og WRAIR-vaksinen (Eckels et al, 2000a; Edelman et al, 2003; Sun et al, 2003) har stanset videre utvikling og markedsføring av disse vaksinekandidatene.
En alternativ strategi er tatt i bruk av Sanofi-Pasteur, der de strukturelle genene til den empirisk svekkede gulfebervirus-stammen 17D (YF17D, (Monath, 1997) ble erstattet med premembran- (prM-) og kappe- (E-)genet til denguevirus for å frembringe fire monovalente kimære gulfeber-denguevaksinestammer (CYD-stammer, (Guirakhoo et al, 2001). Immunisering av apekatter med en tetravalent vaksineformulering resulterte igjen i en ubalansert immunrespons der den høyeste responsen var rettet mot DEN-2 (Guirakhoo et al, 2001). Etter flere dosejusteringer og lovende resultater av en administreringsstudie hos friske voksne frivillige (Morrison et al, 2010) gikk imidlertid den tetravalente CYD-formuleringen inn i fase ll-førsøk. Resultatene rapportert av det pediatrisk fase 2b-forsøket i Thailand viste god beskyttelse mot DEN-1, DEN-3 og DEN-4, men ikke mot DEN-2 (Sabchareon et al, 2012). For øyeblikket gjennomgår den tetravlente vaksinekandidaten CYD15 en fase III kliniske forsøk i dengue-endemiske områder i Lati n-A me ri ka innenfor rammen av evaluering av beskyttelseseffektiviteten og -sikkerheten hos friske barn og ungdommer fra 9 til 16 år (Pasteur, 2011).
Andre tilnærminger inkluderer delesjon av 30 nukleotider i virus-3'UTR (A30 vaksiner, (Durbin et al, 2001), intertypiske kimære denguevaksiner (Bhamarapravati et al, 1996) selvdestruerende virusmutanter med et fu rint proteasespaltingssted i membranglykoproteinet (Brown, 2004), RepliVax-vektorer som gjennomgår kun én infeksjonssyklus i den vaksinerte verten (Frolov et al, 2007), og bruken av den levende svekkede Schwarz-meslingvirusvaksinen som en bærer for dengueantigener (Brandler et al, 2007).
Selv om de aktuelle tetravalente denguevaksinekandidatene, som i fremskredne utviklingsstadier er basert på levende svekkede virusstammer eller genmanipulert kimært Flavivirus, har de kontinuerlige vanskelighetene forbundet med disse vaksinekandidatene nødvendiggjort utforsking av alternative ikke-repliserende subenhetsvaksiner. Majoriteten av forsøkene på å fremstille en rekombinant proteinbasert vaksine fokuserer på kappe- (E-) proteinet til denguevirus.
E-proteinet består av tre domener (Modis et al, 2003): kappedomenet I (EDI) flankert av et dimeriseringsdomene (EDII) inneholdende fusjonspeptidet og et immunoglobulin-lignende domene (EDIII) som inneholder bindingsmotivet til vertscellens overflatereseptor (Chen et al, 1997) og flere serotypespesifikke nøytraliserende epitoper (Chin et al, 2007; Megret et al, 1992). EDIII-en springer frem fra virusoverflaten for å lette binding til vertscellens overflatereseptor (Crill & Roehrig, 2001) og medierer vertsmembranfusjon (Allison et al, 2001). Dette EDIII-domenet, som spenner over aminosyrer 300-400 til E-proteinet, har fremkommet som den mest lovende regionen for vaksineutvikling (Guzman et al, 2010), ettersom det viser seg å ha bare svært lavt intrinsisk potensiale for å fremkalle kryssreaktive antistoffer mot heterologe serotyper (Hombach et al, 2005).
Rekombinante EDIII-antigener er fremstilt ved å bruke bakterie- (f.eks., McDonald et al, 2009;), gjærsopp- (Ivy et al, 2000) og planteekspresjonssystemer (f.eks., Martinez et al, 2010;). For å unngå den ubalanserte immunresponsen fremkalt av tetravalente formuleringer bestående av støkiometrisk blandede monovalente vaksiner, er det utviklet et rekombinant fusjonsprotein som forbinder EDIII-domenet til denguevirusserotypene 1, 2, 3 og 4. Denne konstruksjonen ble rapportert for å fremkalle nøytraliserende antistoffer mot alle fire serotypene (Batra et al, 2007; Etemad et al, 2008).
WHO og andre organisasjoner har understreket behovet for ny teknologi for å skape vaksiner der leveringskostnadene kan reduseres, og derved gjøre vaksinene mer prismessig overkommelig og mer tilgjengelige for befolkninger i utviklings- og svake økonomier.
Det er følgelig et formål for den foreliggende oppfinnelsen å tilveiebringe vaksiner mot denguevirus som er sikre og kostnadseffektive, og som vil være prismessig overkommelige for sluttbrukere i utviklingsland.
Kort beskrivelse av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse omfatter rekombinant DNA-molekyl omfattende en promoter som er funksjonell i en plantecelle for å bevirke produksjon av et mRNA-molekyl, og som er operativt forbundet med en nukleotidsekvens som koder for et polyprotein omfattende det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 1 (EDIII-1) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 2 (EDIII-2) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 3 (EDIII-3) eller en variant derav, og det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 4 (EDIII-4) eller en variant derav.
Foreliggende oppfinnelse omfatter også transgent plastid avledet fra en plantecelle i Asferaceae-familien omfattende et rekombinant DNA-molekyl i følge krav 1-7 omfattende en promoter som er funksjonell i en plantecelle i Asteraceae- fam\\\ er\.
Omfattet av oppfinnelsen er også transgen plantecelle avledet fra /Asteraceae-familien omfattende et rekombinant DNA-molekyl i følge et hvilket som helst av kravene 1-7
omfattende en promoter som er funksjonell i en plantecelle i Asferaceae-familien.
Videre omfatter foreliggende oppfinnelse transgen plante i Asteraceae- fam\\\ er\ eller transgen del av planten omfattende et rekombinant DNA-molekyl i følge et hvilket som helst av kravene 1-7, omfattende en promoter som er funksjonell i en plantecelle fra Asferaceae-familien.
Videre omfatter foreliggende oppfinnelse transgen plantecelle, transgen plante eller transgen del av planten ifølge et hvilket som helst av kravene 12 til 21 for anvendelse til vaksinasjon av et individ mot denguevirus.
Videre omfatter foreliggende oppfinnelse transgent frø avledet fra en plante eller plantecelle i Asteraceae-familien omfattende et rekombinant DNA-molekyl i følge et hvilket som helst av kravene 1-7 omfattende en promoter som er funksjonell i en plantecelle fra /Asteraceae-familien.
Videre omfatter foreliggende oppfinnelse vektor omfattende det rekombinante DNA-molekylet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7.
Videre omfatter foreliggende oppfinnelse vaksine omfattende en transgen plantecelle, en transgen plante eller en transgen del av planten ifølge et hvilket som helst av kravene 12 til 21, eventuelt sammen med én eller flere farmasøytisk akseptable eksipienter.
Omfattet av oppfinnelsen er også fremgangsmåte for å fremstille et transgent plastid omfattende trinnene: å føre inn et rekombinant DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7 eller en vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 27 til 30 i et plastid.
Omfattet av oppfinnelsen er også fremgangsmåte for å fremstille en plantecelle, en transgen plante eller en transgen plantedel omfattende trinnene: å føre inn et rekombinant DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7 eller en vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 27 til 30 i en plantecelle, en plante eller plantedel.
Omfattet av oppfinnelsen er også fremgangsmåte for å fremstille en transgen plante omfattende trinnene: (a) å plante et transgent frø ifølge et hvilket som helst av kravene 24 til 26; og (b) å dyrke en plante fra frøet.
Videre omfatter oppfinnelsen fremgangsmåte for å fremstille et tetravalent kimært denguevirusantigen omfattende trinnene: å fremstille en transgen plante omfattende et rekombinant DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7; og
å inkubere planten under betingelser hvori planten uttrykker antigenet.
Omfattet av foreliggende oppfinnelse er også fremgangsmåte for å fremstille en vaksine omfattende følgende trinn: a) fremstille en transgen plantecelle, en transgen plante eller en transgen del av planten omfattende et rekombinant DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7; a) inkubere den transgene plantecellen, den transgene planten eller den transgene delen av planten under betingelser hvori plantecellen, planten eller den delen av planten uttrykker polyproteinet kodet av det rekombinante DNA-molekylet; c) høste den transgene plantecellen, den transgene planten eller den transgene delen av planten; og d) formulere den transgene plantecellen, den transgene planten eller den transgene delen av planten i en vaksine, eventuelt sammen med én eller flere farmasøytisk akseptable
eksipienter.
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre transgen plantecelle, en transgen plante eller en transgen del av planten ifølge et hvilket som helst av kravene 12 til 21 for anvendelse i fremstillingen av et medisinsk produkt for vaksinasjon av et individ mot denguevirus.
Foreliggende oppfinnelse omfatter Rekombinant DNA-molekylkarakterisert vedat den omfatter en promoter som er funksjonell i en plantecelle fra Asteraceae-familien for å bevirke produksjon av et mRNA-molekyl, og som er operativt forbundet med en nukleotidsekvens som koder for et polyprotein omfattende det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 1 (EDI 11-1) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 2 (EDIII-2) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 3 (EDIII-3) eller en variant derav, og det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 4 (EDIII-4) eller en variant derav.
Omfattet av foreliggende oppfinnelse er også vektorkarakterisert vedat den omfatter det rekombinante DNA-molekylet ifølge et hvilket som helst av kravene 28 til 34.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer rekombinante DNA-molekyler omfattende en nukleotidsekvens som, når den uttrykkes i en plantecelle, koder for et tetravalent dengue-(DEN-)virusantigen. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer særlig et rekombinant DNA-molekyl omfattende en promoter som er funksjonell i en plantecelle for å bevirke fremstilling av et mRNA-molekyl, og som er operativt forbundet med en nukleotidsekvens som koder for et polyprotein omfattende det immunoglobulinlignende domenet til kappe-(E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 1 (EDI 11-1) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 2 (EDIII-2) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 3 (EDIII-3) eller en variant derav, og det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 4 (EDIII-4) eller en variant derav.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer i et ytterligere aspekt vektorer som beskrevet i detalj. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer særlig en vektor, slik som en transformasjonsvektor, omfattende et rekombinant DNA-molekyl omfattende en promoter som er funksjonell i en plantecelle for å bevirke fremstilling av et mRNA-molekyl, og som er operativt forbundet med en nukleotidsekvens som koder for et polyprotein omfattende det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 1 (EDI11-1) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 2 (EDIII-2) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 3 (EDIII-3) eller en variant derav, og det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 4 (EDIII-4) eller en variant derav.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer i et ytterligere aspekt transgene plastider som beskrevet i detalj. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer særlig et plastid, slik som en kloroplast, omfattende et rekombinant DNA-molekyl omfattende en promoter som er funksjonell i en plantecelle for å bevirke fremstilling av et mRNA-molekyl, og som er operativt forbundet med en nukleotidsekvens som koder for et polyprotein omfattende det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 1 (EDIII-1) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 2 (EDIII-2) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 3 (EDIII-3) eller en variant derav, og det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 4 (EDIII-4) eller en variant derav.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer i et ytterligere aspekt transgene planteceller som beskrevet i detalj. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer særlig en transgen plantecelle, slik som en transgen Lactuca saf/Va-celle, omfattende et rekombinant DNA-molekyl omfattende en promoter som er funksjonell i en plantecelle for å bevirke fremstilling av et mRNA-molekyl, og som er operativt forbundet med en nukleotidsekvens som koder for et polyprotein omfattende det immunoglobulinlignende domenet til kappe-(E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 1 (EDIII-1) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 2 (EDIII-2) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 3 (EDIII-3) eller en variant derav, og det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 4 (EDIII-4) eller en variant derav.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer i et ytterligere aspekt transgene planteceller omfattende et plastid som beskrevet i detalj.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer i et ytterligere aspekt transgene planter eller transgene deler av plantene som beskrevet i detalj. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer særlig en transgen plante eller transgen del av planten, slik som en transgen Lactuca saf/Va-plante, omfattende et rekombinant DNA-molekyl omfattende en promoter som er funksjonell i en plantecelle for å bevirke fremstilling av et mRNA-molekyl, og som er operativt forbundet med en nukleotidsekvens som koder for et polyprotein omfattende det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 1 (EDIII-1) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 2 (EDIII-2) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 3 (EDIII-3) eller en variant derav, og det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 4 (EDIII-4) eller en variant derav.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer i et ytterligere aspekt transgene planter eller transgene deler av plantene omfattende en flerhet planteceller som beskrevet i detalj.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer i et ytterligere aspekt transgene frø som beskrevet i detalj. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer et transgent frø, slik som transgent frø avledet fra en Lactuca sativa- plånte, omfattende et rekombinant DNA-molekyl omfattende en promoter som er funksjonell i en plantecelle for å bevirke fremstilling av et mRNA-molekyl og som er operativt forbundet med en nukleotidsekvens som koder for et polyprotein omfattende det immunoglobulinlignende domenet til kappe-(E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 1 (EDIII-1) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 2 (EDIII-2) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 3 (EDIII-3) eller en variant derav, og det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 4 (EDIII-4) eller en variant derav.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer i et ytterligere aspekt fremgangsmåter for å frembringe et transgent plastid som beskrevet i detalj. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer særlig en fremgangsmåte for å fremstille et transgent plastid omfattende trinnet med å føre inn et rekombinant DNA-molekyl eller vektor som redegjort for i detalj i et plastid, slik som en kloroplast.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer i et ytterligere aspekt fremgangsmåter for å fremstille en transgen plantecelle, en transgen plante eller en transgen plantedel som beskrevet i detalj. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer særlig en fremgangsmåte for å fremstille en transgen plantecelle, en transgen plante eller en transgen plantedel omfattende trinnet med å føre inn et rekombinant DNA-molekyl eller en vektor som redegjort for i detalj i en plantecelle, en plante eller plantedel, slik som Lactuca sativa-celler eller Lactuca saf/Va-plante.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer i et ytterligere aspekt fremgangsmåter for å fremstille en transgen plante ved å bruke et transgent frø som beskrevet i detalj. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer særlig en fremgangsmåte for å fremstille en transgen plante omfattende trinnene med (a) å plante et transgent frø som beskrevet i detalj; og (b) å dyrke en plante av frøet.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer i et ytterligere aspekt fremgangsmåter for å fremstille et tetravalent kimært denguevirusantigen. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer særlig en fremgangsmåte for å fremstille et tetravalent kimært denguevirusantigen omfattende trinnene med a) å fremstille en transgen plante som beskrevet i detalj; og b) å inkubere planten under betingelser hvori planten uttrykker antigenet.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer i et ytterligere aspekt transgene planteceller, transgene planter eller transgene deler av plantene som beskrevet i detalj, for bruk i vaksinasjon. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer særlig en transgen plantecelle, transgen plante eller transgen del av planten som beskrevet i detalj, for bruk i vaksinasjon av et individ, slik som et menneske, mot denguevirus.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer i et ytterligere aspekt vaksiner som beskrevet i detalj. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer særlig en vaksine omfattende en transgen plantecelle, en transgen plante eller en transgen del av planten som beskrevet i detalj, eventuelt sammen med én eller flere farmasøytisk akseptable eksipienter.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer i et ytterligere aspekt fremgangsmåter for å fremstille en vaksine. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer særlig en fremgangsmåte for å fremstille en vaksine omfattende trinnene med a) å fremstille en transgen plantecelle, en transgen plante eller en transgen del av planten omfattende et rekombinant DNA-molekyl som beskrevet i detalj, b) å inkubere den transgene plantecellen, den transgene planten eller den transgene delen av planten under betingelser hvori plantecellen, planten eller delen av planten uttrykker polyproteinet kodet av det rekombinante DNA-molekylet, c) å høste den transgene plantecellen, den transgene planten eller den transgene delen av planten og d) å formulere den transgene plantecellen, den transgene planten eller den transgene delen av planten til en vaksine, eventuelt sammen med én eller flere farmasøytisk akseptable eksipienter.
Det beskrives fremgangsmåter for vaksinasjon. Særlig beskrives en fremgangsmåte for å vaksinere et individ, slik som et menneske, mot denguevirus, der fremgangsmåten omfatter trinnet med å administrere en effektiv mengde av en vaksine som beskrevet i detalj til et individ.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer i et ytterligere aspekt bruken av en transgen plantecelle, en transgen plante eller transgen del av planten som beskrevet i detalj i produksjonen av et medisinsk produkt. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer særlig bruken av en transgen plantecelle, en transgen plante eller en transgen del av planten som beskrevet i detalj for produksjon av et medisinsk produkt for vaksinasjon av et individ, slik som et menneske, mot denguevirus.
Det beskrives et isolert nukleinsyremolekyl som koder for polyproteinet som beskrevet i detalj. Spesielt et isolert nukleinsyremolekyl omfattende nukleotidsekvensene angitt i SEQ ID NO: 7, 8, 9 og 10 eller nukleotidsekvenser som er minst ca. 80 %, slik som minst ca. 85 %, minst ca. 90 %, minst ca. 93 %, minst ca. 95 %, minst ca. 96 %, minst ca. 97 %, minst ca. 98 % eller minst ca. 99 % identiske dermed.
Kort beskrivelse av tegningene
Figur 1: Skjematisk presentasjon av ekspresjonsvektorene for generering av transplastomiske salatplanter. a) Den endelige salatspesifikke plastidtranformasjonsvektoren pEXP-PN-goi-L; b) villtype salatplastidgenom (CP); c) salatplastidgenom med integrert transgen ekspreksjonskassett for henholdsvis EDI 11 1 og EDIII 1-4. Southern Blot-proben (trnA) er vist som en pil, og de forventede Smal-fragmentene er vist som piler, og deres størrelse er angitt ved siden av respektive goi. aadA: spektinomycinresistensgen; Amp(R): ampicillinresistensgen; attB1/attB2: Gateway® rekombinasjonssteder; INSL7INSR<*>: salatspesifikke venstre/høyre innsettingssted; trnl/trnA: sekvenser som koder for tRNA-l/tRNA-A; EDIII 1/1-4: kodingssekvens for transgen som inkluderer et Heksa-his-merke; PsbA: tobakk psbA-promoter (Staub & Maliga, 1993); Prrn16: tobakk rrn16 PEP+NEP-promoter (Ye et al, 2001); 3'(C): 3'UTR til Chlamydomonas rbcL-gen; 5'psbA: 5'UTR til tobakk psbA-gen; 3'(T): 3'UTR til tobakk psbA-gen; ORI: bakteriell replikasjonsopprinnelse. p296/p297: primere brukt for PCR og det korresponderende PCR-produktet er vist som en stiplet linje merket med sin molekylvekt for begge transgenen
Figur 2: PCR og Southern blot-analyse av salattransformanter som uttrykker det kimære tetravalente EDIII-antigenet. a) PCR som bruker primer p296/p297-binding inni den transgene ekspresjonskassetten. Det forventede PCR-produktet er 1841 bp for S12-PN-EDIII 1-4 (felt 1) eller 836 bp for S16-PN-EDIII 1 (felt 2). b) Southern blot-analyse av DNA isolert fra regenerererte plantelinjer og vi 11 type (wt) ble utført ved å bruke en 665 bp DIG-merket probe som binder inni trnA-regionen (INSR) til plastidgenomet. Den forventede fragmentstørrelsen etter Smal-kutting er 6533 bp (for S12-PN-EDIII 1-4) eller 5545 bp (for S16-PN-EDIII 1) og 3130 bp for wt planter. Primernes posisjon og den korresponderende forventede størrelsen på PCR-produktet, så vel som restriksjonssteder, probeposisjon og størrelsen på forventede Southern blot-bånd er angitt i figur 1. M: 1 kb DNA-stige, NEB. Figur 3: Fenotype og spiringsassay til transplastomiske salatplanter. a) planter som vokser i drivhus; b) blomstrende planter; c) én uke gamle frøplanter oppnådd fra transplastomiske planter og villtypefrø spiret på spektinomycin- (30 mg/l)holdig medium. Figur 4: Western Blot-analyse. a) TP og TSP isolert fra plantelinje S12-PN-EDIII 1-4; b) TP og TSP isolert fra plantelinje S16-PN-EDIII 1; den lastede mengden av TSP/TP er angitt over det respektive feltet i ug; i a) ble 20 ug TP/TSP lastet for villtypen, mens i b) ble 50 ug TP/TSP lastet i villtypen. Pilene angir 47 kDa EDIII 1-4 og 13 kDa EDIII 1; M: "spectra multicolour" proteinstige over et bredt område (Thermo Scientific), molekylstørrelse angitt i kDa.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Med mindre det er definert spesifikt, har alle anvendte tekniske og vitenskapelige termer samme betydning som vanligvis oppfattes av fagmannen innen feltene biokjemi, genetikk, molekylær biologi og immunologi.
Alle fremgangsmåter og materialer som ligner eller tilsvarer de som er beskrevet, kan anvendes til å praktisere eller teste den foreliggende oppfinnelsen, der egnede fremgangsmåtene og materialene er beskrevet. Alle publikasjoner, patentsøknader, patenter og andre henvisninger nevnt er innlemmet i sin helhet ved henvisning. Ved konflikt vil den foreliggende beskrivelsen, inkludert definisjoner, gjelde. Videre er materialer, fremgangsmåter og eksempler kun illustrative og er ikke ment å være begrensende, med mindre annet er spesifisert.
Utøvelsen av den foreliggende oppfinnelsen vil benytte, med mindre noe annet er angitt, konvensjonelle teknikker innen cellebiologi, cellekultur, molekylær biologi, transgen biologi, mikrobiologi, rekombinant DNA og immunologi, som omfattes av teknikken. Slike teknikker er forklart i sin helhet i litteraturen. Se for eksempel Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley og son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tredje utgave, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. US- pat. No. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds. (1984), Transcription And Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning
(1984); the series, Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson and M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., New York), spesifikt bind 154 og 155 (Wu et al. eds.) og bind 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes l-IV (D. M. Weirand C. C. Blackwell, eds., 1986); and Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).
Rekombinante DNA- molekyler og - vektorer
Som angitt ovenfor, koder den foreliggende oppfinnelsens rekombinante DNA-molekyler omfattende en nukleotidsekvens som, når den uttrykkes i en plantecelle, for et tetravalent dengue- (DEN-)virusantigen.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer særlig et rekombinant DNA-molekyl omfattende en promoter som er funksjonell i en plantecelle for å bevirke fremstilling av et mRNA-molekyl, og som er operativt forbundet med en nukleotidsekvens som koder for et polyprotein omfattende det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 1 (EDIII-1) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 2 (EDIII-2) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 3 (EDIII-3) eller en variant derav, og det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 4 (EDIII-4) eller en variant derav.
Det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 1 (EDIII-1) kan omfatte aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 1. En variant av EDIII-1 kan omfatte en aminosyresekvens som har minst ca. 70 %, slik som minst ca. 75 %, minst ca. 80 %, minst ca. 85 %, minst ca. 90 %, minst ca. 93 %, minst ca. 95 %, minst ca. 96 %, minst ca. 97 %, minst ca. 98 % eller minst ca. 99 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt SEQ ID NO: 1. Ifølge visse utførelsesformer kan en variant av EDIII-1 omfatte en aminosyresekvens som har minst ca. 90 %, slik som minst ca. 93 %, minst ca. 95 %, minst ca. 96 %, minst ca. 97 %, minst ca. 98 % eller minst ca. 99 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt SEQ ID NO: 1. Ifølge visse andre utførelsesformer kan en variant av EDIII-1 omfatte en aminosyresekvens som har minst ca. 95 %, slik som minst ca. 96 %, minst ca. 97 %, minst ca. 98 % eller minst ca. 99 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt SEQ ID NO: 1. Foretrukket er varianten en immunogen variant, noe som betyr at den er i stand til å fremkalle en immunrespons ved administrering til et individ.
Det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 2 (EDIII-2) kan omfatte aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 2. En variant av EDIII-2 kan omfatte en aminosyresekvens som har minst ca. 70 %, slik som minst ca. 75 %, minst ca. 80 %, minst ca. 85 %, minst ca. 90 %, minst ca. 93 %, minst ca. 95 %, minst ca. 96 %, minst ca. 97 %, minst ca. 98 % eller minst ca. 99 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt SEQ ID NO: 2. Ifølge visse utførelsesformer kan en variant av EDIII-2 omfatte en aminosyresekvens som har minst ca. 90 %, slik som minst ca. 93 %, minst ca. 95 %, minst ca. 96 %, minst ca. 97 %, minst ca. 98 % eller minst ca. 99 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt SEQ ID NO: 2. Ifølge visse andre utførelsesformer kan en variant av EDIII-2 omfatte en aminosyresekvens som har minst ca. 95 %, slik som minst ca. 96 %, minst ca. 97 %, minst ca. 98 % eller minst ca. 99 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt SEQ ID NO: 2. Foretrukket er varianten en immunogen variant, noe som betyr at den er i stand til å fremkalle en immunrespons ved administrering til et individ.
Det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 3 (EDIII-3) kan omfatte aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 3. En variant av EDIII-3 kan omfatte en aminosyresekvens som har minst ca. 70 %, slik som minst ca. 75 %, minst ca. 80 %, minst ca. 85 %, minst ca. 90 %, minst ca. 93 %, minst ca. 95 %, minst ca. 96 %, minst ca. 97 %, minst ca. 98 % eller minst ca. 99 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt SEQ ID NO: 3. Ifølge visse utførelsesformer kan en variant av EDIII-3 omfatte en aminosyresekvens som har minst ca. 90 %, slik som minst ca. 93 %, minst ca. 95 %, minst ca. 96 %, minst ca. 97 %, minst ca. 98 % eller minst ca. 99 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt SEQ ID NO: 3. Ifølge visse andre utførelsesformer kan en variant av EDIII-3 omfatte en aminosyresekvens som har minst ca. 95 %, slik som minst ca. 96 %, minst ca. 97 %, minst ca. 98 % eller minst ca. 99 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt SEQ ID NO: 3. Foretrukket er varianten en immunogen variant, noe som betyr at den er i stand til å fremkalle en immunrespons ved administrering til et individ.
Det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 4 (EDIII-4) kan omfatte aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 4. En variant av EDIII-4 kan omfatte en aminosyresekvens som har minst ca. 70 %, slik som minst ca. 75 %, minst ca. 80 %, minst ca. 85 %, minst ca. 90 %, minst ca. 93 %, minst ca. 95 %, minst ca. 96 %, minst ca. 97 %, minst ca. 98 % eller minst ca. 99 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt SEQ ID NO: 4. Ifølge visse utførelsesformer kan en variant av EDIII-4 omfatte en aminosyresekvens som har minst ca. 90 %, slik som minst ca. 93 %, minst ca. 95 %, minst ca. 96 %, minst ca. 97 %, minst ca. 98 % eller minst ca. 99 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt SEQ ID NO: 4. Ifølge visse andre utførelsesformer kan en variant av EDIII-4 omfatte en aminosyresekvens som har minst ca. 95 %, slik som minst ca. 96 %, minst ca. 97 %, minst ca. 98 % eller minst ca. 99 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt SEQ ID NO: 4. Foretrukket er varianten en immunogen variant, noe som betyr at den er i stand til å fremkalle en immunrespons ved administrering til et individ.
De fire EDIII-ene eller varianter derav kan være anordnet i polyproteinet i en hvilken som helst rekkefølge.
Polyproteinet kan omfatte, anordnet i N- terminal- til C-terminalretningen, EDIII-1, EDIII-2, EDIII-3 og EDIII-4. Polyproteinet kan omfatte, anordnet i N- terminal- til C-terminalretningen, EDIII-1, EDIII-3, EDIII-4 og EDIII-2. Polyproteinet kan omfatte, anordnet i N- terminal- til C-terminalretningen, EDIII-1, EDIII-4, EDIII-2 og EDIII-3. Polyproteinet kan omfatte, anordnet i N- terminal- til C-terminalretningen, EDIII-1, EDIII-2, EDIII-4 og EDIII-3. Polyproteinet kan omfatte, anordnet i N- terminal- til C-terminalretningen, EDIII-1, EDIII-3, EDIII-2 og EDIII-4. Polyproteinet kan omfatte, anordnet i N- terminal- til C-terminalretningen, EDIII-1, EDIII-4, EDIII-3 og EDIII-2.
Polyproteinet kan omfatte, anordnet i N- terminal- til C-terminalretningen, EDIII-2, EDIII-1, EDIII-3 og EDIII-4. Polyproteinet kan omfatte, anordnet i N- terminal- til C-terminalretningen, EDIII-2, EDIII-1, EDIII-4 og EDIII-3. Polyproteinet kan omfatte, anordnet i N- terminal- til C-terminalretningen, EDIII-2, EDIII-3, EDIII-1 og EDIII-4. Polyproteinet kan omfatte, anordnet i N- terminal- til C-terminalretningen, EDIII-2, EDIII-3, EDIII-4 og EDIII-1. Polyproteinet kan omfatte, anordnet i N- terminal- til C-terminalretningen, EDIII-2, EDIII-4, EDIII-3 og EDIII-1. Polyproteinet kan omfatte, anordnet i N- terminal- til C-terminalretningen, EDIII-1, EDIII-4, EDIII-2 og EDIII-1.
Polyproteinet kan omfatte, anordnet i N- terminal- til C-terminalretningen, EDIII-3, EDIII-2, EDIII-1 og EDIII-4. Polyproteinet kan omfatte, anordnet i N- terminal- til C-terminalretningen, EDIII-3, EDIII-2, EDIII-4 og EDIII-1. Polyproteinet kan omfatte, anordnet i N- terminal- til C-terminalretningen, EDIII-3, EDIII-1, EDIII-2 og EDIII-4. Polyproteinet kan omfatte, anordnet i N- terminal- til C-terminalretningen, EDIII-3, EDIII-1, EDIII-4 og EDIII-2. Polyproteinet kan omfatte, anordnet i N- terminal- til C-terminalretningen, EDIII-3, EDIII-4, EDIII-1 og EDIII-2. Polyproteinet kan omfatte, anordnet i N- terminal- til C-terminalretningen, EDIII-3, EDIII-4, EDIII-2 og EDIII-1.
Polyproteinet kan omfatte, anordnet i N- terminal- til C-terminalretningen, EDIII-4, EDIII-1, EDIII-2 og EDIII-3. Polyproteinet kan omfatte, anordnet i N- terminal- til C-terminalretningen, EDIII-4, EDIII-1, EDIII-3 og EDIII-2. Polyproteinet kan omfatte, anordnet i N- terminal- til C-terminalretningen, EDIII-4, EDIII-2, EDIII-3 og EDIII-1. Polyproteinet kan omfatte, anordnet i N- terminal- til C-terminalretningen, EDIII-4, EDIII-2, EDIII-1 og EDIII-3. Polyproteinet kan omfatte, anordnet i N- terminal- til C-terminalretningen, EDIII-4, EDIII-3, EDIII-1 og EDIII-2. Polyproteinet kan omfatte, anordnet i N- terminal- til C-terminalretningen, EDIII-4, EDIII-3, EDIII-2 og EDIII-1.
Det skal forstås at hver av de fire EDIII-ene kan erstattes av dets respektive variant. Den foregående anordningen i polyproteinet gjelder slik likedan for varianter og sammensetninger av EDIII-er og varianter.
EDIII-ene (eller varianter derav) kan enten være direkte forbundet med hverandre eller kan forbindes med en linker. Ifølge visse utførelsesformer er derfor EDIII-ene (eller varianter derav) direkte forbundet med hverandre. Ifølge visse andre utførelsesformer er de tilstøtende EDIII-ene forbundet med linkere. Linkerne kan hver uavhengig være en peptidlinker, slik som en polyglysinlinker. Peptidlinkere er generelt sammensatt av én eller flere aminosyrer som kan være naturlig og/eller ikke-naturlig forekommende aminosyrer, slik som glysin.
En peptidlinker anvendt i henhold til den foreliggende oppfinnelsen kan være sammensatt av minst ca. én aminosyre, slik som minst ca. 2 aminosyrer, minst ca. 3 aminosyrer, minst ca. 4 aminosyrer, minst ca. 5 aminosyrer, minst ca. 6 aminosyrer, minst ca. 7 aminosyrer, minst ca. 8 aminosyrer, minst ca. 9 aminosyrer, minst ca. 10 aminosyrer eller minst ca. 15 aminosyrer. En peptidlinker kan følgelig være sammensatt av minst 5 aminosyrer. For eksempel kan en peptidlinker anvendt i henhold til den foreliggende oppfinnelsen være en pentaglysinlinker.
En peptidlinker anvendt i henhold til oppfinnelsen kan være sammensatt av fra ca. 1 til ca. 20 aminosyrer, slik som fra ca. 2 til ca. 15 aminosyrer, fra ca. 2 til ca. 10, fra ca. 2 til ca. 7, fra ca. 2 til ca. 6, fra ca. 2 til ca. 5, fra ca. 3 til ca. 15, fra ca. 3 til ca. 10, fra ca. 3 til ca. 7, fra ca. 3 til ca. 6, fra ca. 3 til ca. 5, fra ca. 4 til ca. 15, fra ca. 4 til ca. 10, fra ca. 4 til ca. 7, from 4 til ca. 6, fra ca. 4 til ca. 5, fra ca. 5 til ca. 15, fra ca. 5 til ca. 10, fra ca. 5 til ca. 7 eller fra ca. 5 til ca. 6, slik som ca. 5 aminosyrer.
Ifølge visse utførelsesformer omfatter det rekombinante DNA-molekylet en nukleotidsekvens som koder for et polyprotein som omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 5 eller en aminosyresekvens som har minst ca. 80 %, slik som minst ca. 85 %, minst ca. 90 %, minst ca. 93 %, minst ca. 95 %, minst ca. 96 %, minst ca. 97 %, minst ca. 98 % eller minst ca. 99 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt SEQ ID NO: 5. Ifølge spesielle utførelsesformer omfatter det rekombinante DNA-molekylet en nukleotidsekvens som koder for et polyprotein som omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 5 eller en aminosyresekvens som har minst ca. 90 %, slik som minst ca. 93 %, minst ca. 95 %, minst ca. 96 %, minst ca. 97 %, minst ca. 98 % eller minst ca. 99 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt SEQ ID NO: 5. Ifølge andre spesielle utførelsesformer omfatter det rekombinante DNA-molekylet en nukleotidsekvens som koder for et polyprotein som omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 5 eller en aminosyresekvens som har minst ca. 95 %, slik som minst ca. 96 %, minst ca. 97 %, minst ca. 98 % eller minst ca. 99 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt SEQ ID NO: 5. Foretrukket er en slik variant i stand til å fremkalle en immunrespons ved administrering til et individ.
Ifølge visse utførelsesformer omfatter det rekombinante DNA-molekylet en nukleotidsekvens angitt i SEQ ID NO: 6 eller en nukleotidsekvens som har minst ca. 70 %, slik som minst ca. 75 %, minst ca. 80 %, minst ca. 85 %, minst ca. 90 %, minst ca. 93 %, minst ca. 95 %, minst ca. 96 %, minst ca. 97 %, minst ca. 98 % eller minst ca. 99 % sekvensidentitet med nukleotidsyresekvensen angitt SEQ ID NO: 6. Ifølge visse utførelsesformer omfatter det rekombinante DNA-molekylet nukleotidsekvensen angitt i SEQ ID NO: 6 eller en nukleotidsekvens som har minst ca. 90 %, slik som minst ca. 93 %, minst ca. 95 %, minst ca. 96 %, minst ca. 97 %, minst ca. 98 % eller minst ca. 99 % sekvensidentitet med nukleotidsekvensen angitt SEQ ID NO: 6. Ifølge andre visse utførelsesformer omfatter det rekombinante DNA-molekylet nukleotidsekvensen angitt i SEQ ID NO: 6 eller en nukleotidsekvens som har minst ca. 95 %, slik som minst ca. 96 %, minst ca. 97 %, minst ca. 98 % eller minst ca. 99 % sekvensidentitet med nukleotidsekvensen angitt SEQ ID NO: 6.
Ifølge visse utførelsesformer omfatter det rekombinante DNA-molekylet nukleotidsekvensene angitt i SEQ ID NO: 7, 8, 9 og 10 eller nukleotidsekvenser som har minst ca. 70 %, slik som minst ca. 75 %, minst ca. 80 %, minst ca. 85 %, minst ca. 90 %, minst ca. 93 %, minst ca. 95 %, minst ca. 96 %, minst ca. 97 %, minst ca. 98 % eller minst ca. 99 % sekvensidentitet med nukleotidsyresekvensene angitt SEQ ID NO: henholdsvis 7, 8, 9 og 10. Ifølge spesielle utførelsesformer omfatter det rekombinante DNA-molekylet nukleotidsekvensene angitt i SEQ ID NO: 7, 8, 9 og 10 eller nukleotidsekvenser som har minst ca. 90 %, slik som minst ca. 93 %, minst ca. 95 %, minst ca. 96 %, minst ca. 97 %, minst ca. 98 % eller minst ca. 99 % sekvensidentitet med nukleotidsekvensene angitt SEQ ID NO: henholdsvis 7, 8, 9 og 10. Ifølge andre spesielle utførelsesformer omfatter det rekombinante DNA-molekylet nukleotidsekvensene angitt i SEQ ID NO: 7, 8, 9 eller 10 eller nukleotidsekvenser som har minst ca. 95 %, slik som minst ca. 96 %, minst ca. 97 %, minst ca. 98 % eller minst ca. 99 % sekvensidentitet med nukleotidsekvensen angitt SEQ ID NO: henholdsvis 7, 8, 9 og 10.
Promotere som er nyttige i henhold til oppfinnelsen, er hvilke som helst kjente promotere som er funksjonelle i en plantecelle for å forårsake fremstilling av et mRNA-molekyl. Mange slike promotere er kjent for fagmannen. Slike promotere inkluderer promotere som normalt assosieres med andre gener, og/eller promotere isolert fra hvilken som helst plantecelle. Bruken av promotere for proteinekspresjon er generelt kjent for fagmannen innen molekylær biologi, se for eksempel Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Den anvendte promoteren kan være induserbar. Betegnelsen "induserbar" brukt i sammenheng med en promoter betyr at promoteren kun dirigerer transkripsjon av en operasjonelt forbundet nukleotidsekvens dersom et stimulus er til stede, slik som en endring i temperaturen eller tilstedeværelsen av et kjemisk stoff ("kjemisk induser"). Som anvendt, refererer "kjemisk induksjon" ifølge den foreliggende oppfinnelsen til fysisk påføring av et eksogent eller endogent stoff (inkl. makromolekyler, f.eks. proteiner eller nukleinsyrer) på en plantecelle eller plante (f.eks. ved å sprøyte en væskeløsning omfattende en kjemisk induser derpå, slik som på bladene til en plante, påføring på røttene eller eksponering av plantecellen eller planten for gass eller damp). Dette har den virkningen at det bevirker at målpromoteren som er til stede i plantecellen eller plantens cellene, øker transkripsjonsraten. Alternativt kan den anvendte promoteren være konstitutiv. Betegnelsen "konstitutiv" brukt i sammenheng med en promoter betyr at promoteren er i stand til å dirigere transkripsjon av en operasjonelt forbundet nukleotidsekvens i fravær av stimulus (slik som varmesjokk, kjemikalier etc).
Ikke-begrensende eksempler på funksjonelle plantepromoter er Lactuca sative psbA-promoteren, tobakk psbA-promoteren, tobakk rrn16 PEP+NEP-promoteren, CaMV 35S-promoteren, 19S-promoteren, tomat E8-promoteren, nospromoteren, Mac-promoteren, pet E-promoteren eller ACT1-promoteren.
Foretrukket er promoteren anvendt i henhold til den foreliggende oppfinnelsen en promoter som er funksjonell i en plantecelle i /Asteraceae-familien, særlig en plantecelle i Lactuca-slekten og nærmere bestemt i en Lactuca saf/Va-celle.
Ifølge visse utførelsesformer er promoteren Lactuca sative psbA-promoteren eller tobakk psbA-promoteren. Ifølge visse utførelsesformer er promoteren Lactuca sative psbA-promoteren. Ifølge andre spesielle utførelsesformer er promoteren tobakk psbA-promoteren.
Det rekombinante DNA-molekylet kan ytterligere omfatte minst ett regulerende element valgt fra gruppen bestående av en 5' utranslatert region (5' UTR), 3' utranslatert region (3' UTR) og transittpeptidregion.
I henhold til visse utførelsesformer omfatter det rekombinante DNA-molekylet en 5' utranslatert region. Mange 5' UTR-er er kjent for fagmannen. Slike 5' UTR-er inkluderer 5' UTR vanligvis assosiert med andre gener, særlig gener funnet i planteceller. Ikke-begrensende eksempler på 5' UTR-er som er egnet i henhold til den foreliggende oppfinnelsen er 5' UTR-ene til Lactuca sative psA-genet og 5' UTR-en til tobakk psbA-genet.
I henhold til visse utførelsesformer omfatter det rekombinante DNA-molekylet en 3' utranslatert region. Den 3' utranslaterte regionen fungerer i plantecellen slik at den bevirker termineringen av transkripsjon og tillegg av polyadenylerte ribonukleotider til 3'-enden av et mRNA-molekyl. Mange 3' UTR-er er kjent for fagmannen. Slike 3' UTR-er inkluderer 3' UTR vanligvis assosiert med gener, særlig gener funnet i planteceller. Ikke-begrensende eksempler på 3' UTR-er som er egnet i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, er 3' UTR-en til Lactuca sative psbA-genet, tobakk psbA-genet og tobakk rbsL-genet.
Det rekombinante DNA-molekylet ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan være del av en vektor. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer følgelig en vektor, slik som en transformasjonsvektor, omfattende et rekombinant DNA-molekyl som beskrevet i detalj. Vektoren kan være en ekspresjonsvektor eller en transformasjonsvektor.
Ifølge visse utførelsesformer er vektoren en transformasjonsvektor, og nærmere bestemt en plastidtransformasjonsvektor for stabil transformasjon av et plastid. For stabil transformasjon av et plastid, slik som en kloroplast, kan vektoren omfatte en første flankerende DNA-sekvens og andre flankerende DNA-sekvens, der hver er homolog med sekvenser i en spacerregion til plastidets genom. Den første og andre flankerende DNA-sekvensen er posisjonert henholdsvis 5' og 3' til sekvensen til det rekombinante DNA-molekylet. Plastidets spacerregion kan for eksempel være en transkripsjonelt aktiv spacerregion, slik som den transkripsjonelt aktive spacerregionen mellom trnl- og trnA-genet i plastidgenomet. De flankerende DNA-sekvensene tillater slik stedsrettet integrasjon av det rekombinante DNA-molekylet i plastidgenomets spacerregion ved homolog rekombinasjon.
Ifølge visse utførelsesformer omfatter vektoren en første flankerende DNA-sekvens og andre flankerende DNA-sekvens som er homologe med henholdsvis trnl-kodingssekvens og trnA-kodingssekvens.
Vektoren kan slik omfatte, som operasjonelt forbundne komponenter anordnet i 5' til 3'-retningen, den første flankerende DNA-sekvensen, promoteren, den 5' utranslaterte regionen, nukleotidsekvensen som koder for polyproteinet, den 3' utranslaterte regionen og den andre flankerende DNA-sekvensen.
Transgene plastider, planteceller og planter
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer transgene plastider, planteceller og planter som uttrykker polyproteinet som beskrevet i detalj.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer transgene plastider. Særlig er et transgent plastid ifølge oppfinnelsen et plastid, slik som en kloroplast, omfattende et rekombinant DNA-molekyl som beskrevet i detalj. Foretrukket uttrykker det transgene plastidet polyproteinet kodet av det rekombinante DNA-molekylet.
Ifølge visse utførelsesformer er det rekombinante DNA-molekylet stabilt integrert i genomet til det transgene plastidet ifølge oppfinnelsen.
Plastidet kan være en kloroplast, kromoplast, gerentoplast, etioplast eller leukoplast (slik som en amyloplast, proteinoplast eller elaioplast). Ifølge visse utførelsesformer er plastidet en kloroplast. Plastidet kan være avledet fra en hvilken som helst kjent plantecelle. Ifølge visse utførelsesformer er plastidet avledet fra en plante eller plantecelle i Asteraceae-familen, særlig avledet fra en plante eller plantecelle i Lacfrvca-slekten, og nærmere bestemt fra en Lactuca sativa -plante eller -celle.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også transgene planteceller. Særlig omfatter en transgen plantecelle, slik som en transgen Lactuca sativa -celle, ifølge den foreliggende oppfinnelsen et rekombinant DNA-molekyl som beskrevet i detalj. Foretrukket uttrykker den transgene plantecellen polyproteinet kodet av det rekombinante DNA-molekylet.
Det rekombinante DNA-molekylet kan være stabilt integrert i et genom til plantecellen. Det rekombinante DNA-molekylet kan særlig være stabilt integrert i genomet til et plantecelleplastid eller kan være stabilt integrert i et kromosom til plantecellens kjerne. Den transgene plantecellen kan også være en plantecelle omfattende et transgent plastid som beskrevet i detalj.
Den transgene plantecellen kan være (eller avledet fra) en hvilken som helst kjent plantecelle. Ifølge visse utførelsesformer er den transgene plantecellen en plantecelle i
Asferaceae-familen, særlig en plantecelle i Lacfuca-slekten, og nærmere bestemt fra en Lactuca sativa -plantecelle.
Den transgene plantecellen kan være en plantecelle i en dyrket plante eller et plantefrø.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også transgene planter eller transgene deler av plantene. Særlig omfatter en transgen plante eller transgen del av planten, slik som en transgen Lactuca saf/Va-plante eller en del derav, ifølge den foreliggende oppfinnelsen et rekombinant DNA-molekyl som beskrevet i detalj. Foretrukket uttrykker den transgene planten polyproteinet kodet av det rekombinantet DNA-molekylet.
En transgen del av den transgene planten ifølge oppfinnelsen kan være en hvilken som helst del av planten, slik som et blad eller en rot. Med "transgen del" av en plante menes at delen, slik som blad(er), og nærmere bestemt celler derav, omfatter et rekombinant DNA-molekyl som beskrevet i detalj. Foretrukket uttrykker den transgene delen polyproteinet kodet av det rekombinantet DNA-molekylet.
Det rekombinante DNA-molekylet kan være stabilt integrert i et genom til en plantecelle. Det rekombinante DNA-molekylet kan særlig være stabilt integrert i genomet til en plantecelle eller kan være stabilt integrert i et kromosom til en plantecelles kjerne.
Den transgene planten eller transgen del av planten kan omfatte en flerhet transgene planteceller som beskrevet i detalj.
Den transgene planten kan være (eller avledet fra) en hvilken som helst kjent plante. Ifølge visse utførelsesformer er den transgene planten en plante i Asteraceae- f amWen, særlig en plante i Lacfrvca-slekten, og nærmere bestemt en Lactuca sativa -plante.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også transgene frø. Særlig omfatter et transgent frø, slik som transgent frø avledet fra en Lactuca sativa -plante, et rekombinant DNA-molekyl som beskrevet i detalj. Et transgent frø ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan omfatte en flerhet transgene planteceller som beskrevet i detalj.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også fremgangsmåter for å fremstille transgene plastider, transgene planteceller og transgene planter eller transgene deler av slike planter. Slike fremgangsmåter omfatter generelt trinnet med å føre inn et rekombinant DNA-molekyl eller vektor som beskrevet i detalj i et plastid, slik som en kloroplast, en plantecelle eller en plante.
Planten eller plantecellen som kan brukes for å praktisere den foreliggende oppfinnelsen, inkluderer et hvilket som helst dikotyledon og monokotyledon. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til, tobakk, tomat, potet, squash, pepino, yamsrot, ert, sukkerroe, salat, paprika, selleri, gulrot, asparges, løk, druestokk, moskusmelon, jordbær, ris, solsikke, hvete, havre, mais, bomull, valnøtt, gran/bartre, poppel og eple, bær slik som jordbær, bringebær, alfalfa og banan. Ettersom mange spiselige planter brukt av mennesker til mat eller som bestanddeler i dyrefor er dikotyledene planter, typisk brukes dikotyledoner. Oppfinnelsen inkluderer hele planter, planteceller, planteorganer, plantevev, plantefrø, protoplaster, kallus, cellekulturer og en hvilket som helst gruppe av planteceller organisert i strukturelle og/eller funksjonelle enheter som er i stand til å uttrykke et polyprotein ifølge den foreliggende oppfinnelsen.
Ifølge visse utførelsesformer er planten eller plantecellen en plante eller plantecelle i /Asteraceae-familien, særlig en plante eller plantecelle i Lacføca-slekten, og nærmere bestemt en Lactuca saf/Va-plante eller -celle.
Teknikker for å føre inn DNA i planteceller eller planter er velkjent for fagmannen. Fire basisfremgangsmåter for å levere fremmet DNA inn i planteceller eller planter er beskrevet. Kjemiske fremgangsmåter (se f.eks. Graham and van der Eb, Virology, 54 (02): 536-539,1973; Zatloukal, Wagner, Cotten, Phillips, Plank, Steinlein, Curiel, Birnstiel, Ann. N. Y. Acad. Sei., 660: 136-153,1992); Fysiske fremgangsmåter inkludert mikroinjeksjon (se f.eks., Capecchi, Cell, 22 (2): 479-488,1980), elektroporering (se f.eks., Wong og Neumann, Biochim. Biophys. Res. Conmmun. 107 (2): 584-587,1982; Fromm, Taylor, Walbot, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82 (17): 5824-5828,1985; U. S. Pat. No. 5,384, 253) og genpistol (se f.eks. Johnston and Tang, Methods Cell. Biol., 43 (A): 353-365,1994; Fynan, Webster, Fuller, Haynes, Santoro, Robinson, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90 (24): 11478-11482,1993); Virale fremgangsmåter (se f.eks. Clapp, Clin. Perinatol., 20 (1): 155-168,1993; Lu, Xiao, Clapp, Li, Broxmeyer, J. Exp. Med. 178 (6): 2089-2096,1993; Eglitis and Anderson, Biotechniques, 6 (7): 608-614,1988; Eglitis, Kantoff, Kohn, Karson, Moen, Lothrop, Blaese, Anderson, Avd. Exp. Med. Biol., 241: 19- 27,1988); og reseptormedierte fremgangsmåter (se f.eks. Curiel, Agarwal, Wagner, Cotten, Proe. Natl.Acad. Sei. USA, 88 (19): 8850-8854, 1991; Curiel, Wagner, Cotten, Birnstiel, Agarwal, Li, Loechel, Hu, Hum. Gen. Ther., 3 (2): 147-154,1992; Wagner et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 89 (13): 6099-6103,1992).
Innføring av DNA i planteceller eller planter ved hjelp av elektroporering er velkjent for fagmannen. Plantecelleveggnedbrytende enzymer, slik som pektinnebrytende enzymer, blir brukt for å gjøre mottakercellen mer mottakelig for transformasjon ved elektroporering enn ubehandlede celler. For å utføre transformasjon ved elektroporering kan det anvendes enten lettsmuldrende vev, slik som en suspensjonskultur av celler, eller embryogent kallus eller umodne embryoer eller andre organiserte vev direkte. Det er generelt nødvendig å bryte delvis ned celleveggene til målplantematerialet til pektinnedbrytende enzymer eller mekanisk skading på kontrollert måte. Slikt behandlet plantemateriale er klart til å motta fremmed DNA ved elektroporering.
Andre fremgangsmåter for å levere fremmed DNA til planteceller eller planter er ved mikroprosjektilbombardement. I denne fremgangsmåten belegges mikropartikler med fremmed DNA og leveres inn i cellene ved en drivende kraft. Slike mikropartikler er typisk dannet av wolfram, gull, platina og lignende metaller. En fordel ved mikroprosjektilbombardement er at verken isolasjonen av protoplaster (Cristou et al., 1988, Plant Physiol., 87: 671-674) eller mottakeligheten for Agrobacterium-infeksjon er nødvendig. En illustrativ utførelsesform av en fremgangsmåte for å levere DNA inn i maisceller ved akselerasjon er et biolistisk partikkelleveringssystem, som kan brukes for å drive partikler belagt med DNA eller celler gjennom en skjerm på filteroverflate dekket med kornceller dyrket i suspensjon. Skjermen dispergerer partiklene slik at de ikke leveres til mottakscellene i store aggregater. For bombardementet er cellene i suspensjonen foretrukket konsentrert på filtre eller fast kulturmedium. Alternativt kan umodne embryoer eller andre målceller anordnes på fast kulturmedium. Cellene som skal bombarderes, er plassert i egnet avstand under makroprosjektilstoppeplaten. I bombardementstransformasjon kan prebombardementskultur-betingelsene og bombardementsparameterne optimeres for å gi det maksimale antallet av stabile transformanter. Både de fysiske og biologiske parametrene for bombardement er viktige i denne teknologien. Fysiske faktorer er de som innebærer manipulering av DNA-/mikroprosjektilpresipitatet eller de som påvirker mikropsosjektilenes flukt og hastighet. Biologiske faktorer inkluderer alle trinn som er involvert i manipulering av celler før og umiddelbart etter bombarderingen, den osmotiske justeringen av målceller for å bidra til å lette traumet assosiert med bombardement, og også arten av det transformerende DNA-et, slik som linearisert DNA eller intakte superkveilede plasmider.
Agrobacterium-mediert overføring er et svært egnet system for å føre inn fremmed DNA i planteceller, ettersom DNA-et kan føres inn i helt plantevev og derved eliminere behovet for å regenerere en intakt plante fra en protoplast. Bruken av Agrobacterium-medierte planteintegrerende vektorer for å føre DNA inn i planteceller er velkjent i teknikken. Se for eksempel fremgangsmåtene beskrevet i Fraley et al.; 1985, Biotechnology, 3: 629; Rogers et al., 1987, Meth. in Enzymol., 153: 253-277. Videre er integreringen av Ti-DNA-et en relativt presis prosess, som fører til få omorganiseringer. Regionene av DNA som skal overføres, er definert ved grensesekvensene, og intervenerende DNA settes vanligvis inn i plantegenomet som beskrevet i Spielmann et al., 1986, Mol. Gen. Genet., 205: 34; Jorgensen et al., 1987, Mol. Gen. Genet., 207: 471.
Moderne Agrobacterium-transformasjonsvektorer er i stand til å replisere i E. coli så vel som Agrobacterium og derved muliggjøre egnet manipulering. Videre har nye teknologiske fremskritt i vektorer for Agrobacterium-mediert genoverføring forbedret anordningen av gener og restriksjonssteder i vektorene for å lette konstruksjon av vektorer som er i stand til å uttrykke ulike proteiner eller polypeptider. Egnede multilinkerregioner flankert av en promoter og et polyadenylasjonssted for direkte ekspresjon av innsatte polypeptidkodende gener er egnet for gjeldende formål. I tillegg kan Agrobacterium som inneholder både "armed" og "disarmed" Ti-gener bruker til transformasjonene.
Transformasjon av planteprotoplaster kan oppnås ved å bruke fremgangsmåter basert på kalsiumfosfatutfelling, polyetylenglykolbehandling, elektroporering og kombinasjoner av disse behandlingene (se f. eks. , Potrykus et al., 1985, Mol. Gen. Genet., 199: 183; Marcotte et al., Nature, 335: 454,1988).
Teknikker for å føre inn DNA i et plastid er også velkjent for fagmannen. For eksempel kan fremmed Delivery System føres inn i et plastid ved å bruke en biolostisk bombardementsfremgangsmåte, slik som en fremgangsmåte som bruker et PDS-1000/He-partikkelleveringssystem og følger den modifiserte protokollen fra Verma et al., 2008.
Når det rekombinante DNA-molekylet er ført inn kan det transgene plastidet, den transgene plantecellen eller den transgene planten dyrkes eller regenereres. Fremgangsmåter for dyrking eller regenerering av mange plantearter er rapportert i litteraturen og er velkjent for fagmannen.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også fremgangsmåter for å fremstille et tetravalent kimært denguevirusantigen. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer særlig en fremgangsmåte for å fremstille et tetravalent kimært denguevirusantigen omfattende trinnene med a) å fremstille en transgen plante som beskrevet i detalj; og b) å inkubere planten under betingelser hvori planten uttrykker antigenet.
Vaksiner
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også en vaksine. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer særlig en vaksine omfattende en transgen plantecelle, en transgen plante eller en transgen del av planten som beskrevet i detalj, eventuelt sammen med én eller flere farmasøytisk akseptable eksipienter. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også transgene planteceller, transgene planter eller transgene deler av plantene som beskrevet i detalj for bruk i vaksinasjon, og mer for bruk i vaksinasjon av et individ. Det er også tilveiebrakt en fremgangsmåte for å vaksinere et individ, slik som et menneske, mot denguevirus, der fremgangsmåten omfatter trinnet med å administrere en effektiv mengde av en vaksine som beskrevet i detalj til et individ. Betraktet av den foreliggende oppfinnelsen er også bruken av en transgen plantecelle, en transgen plante eller en transgen del av planten som beskrevet i detalj i produksjonen av et medisinsk produkt. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer særlig bruken av en transgen plantecelle, en transgen plante eller en transgen del planten som beskrevet i detalj til produksjon av et medisinsk produkt for vaksinasjon av et individ, slik som et menneske, mot denguevirus. Et medisinsk produkt ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan være en farmasøytisk sammensetning, og nærmere bestemt en vaksine.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer slik midler for å beskytte et individ mot en denguevirusinfeksjon, og nærmere bestemt beskytte et individ mot denguefeber (DF), dengue hemoragisk feber (DHF) og/eller dengue sjokksyndrom (DSS).
Det skal forstås at detaljene oppgitt nedenfor for et spesielt aspekt, slik som vaksinen ifølge oppfinnelsen, gjelder mutatis mutandis for de andre aspektene nevnt ovenfor.
En vaksine ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan administreres oralt. Administreringsveien sikrer indusering av en mukosal immunrespons og har også fordeler når det gjelder kostnader og bekvemmelighet. På beleilig vis innebærer oral administrering å konsumere en transgen plante eller plantedel ifølge oppfinnelsen. I vaksinasjonsøyemed kan den transgene planten eller plantedelen ifølge oppfinnelsen konsumeres i ubearbeidet form. Den transgene planten eller plantedelen ifølge oppfinnelsen kan imidlertid formuleres i vaksinen i bearbeidet form.
En vaksine ifølge oppfinnelsen kan være i form av en plantedel, et ekstrakt, en juice, en væske, et pulver eller en tablett. Ifølge særlige utførelsesformer er vaksinen i form av en væske.
En vaksine ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan omfatte én eller flere farmasøytisk akseptable eksipienter. Vaksinen kan formuleres ved å bruke farmasøytisk akseptable bærere som er velkjent i teknikken i doser som er egnet for oral administrering. Slike bærere gjør det mulig å formulere vaksinen som tabletter, piller, drasjerte tabletter, kapsler, væsker, geler, siruper, slurryer, suspensjoner og lignende, for et individs (f.eks. et menneske) inntak. En fysiologisk kompatibel bærer kan være en fysiologisk akseptabel tynner, slik som vann, fosfatbuffret saltlake eller saltløsning.
En vaksine ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan omfatte en adjuvant. Adjuvanter slik som ufullstendig Freunds adjuvant, aluminiumfosfat, aluminiumhydroksid eller alun er materialer som er velkjente i teknikken.
En vaksine for oral bruk kan oppnås ved kombinasjon av den aktive ingrediensen med fast eksipient, eventuelt maling av en resulterende blanding og prosessering av blandingen av granulater etter tilsetting av egnede hjelpestoffer, om ønskelig, for å oppnå tabletter eller kjerner i drasjeer.
Egnede eksipienter er karbohydrat- eller proteinfyllstoffer inkluderer, slik som sukkere, inkludert laktose, sukrose, mannitol eller sorbitol; stivelse fra mais, hvete, ris, potet eller andre planter; cellulose, slik som metylcellulose, hydroksypropylmetylcellulose eller natriumkarboksymetylcellulose; og gummier inkludert arabikum og tragakant; og proteiner slik som gelatin og kollagen. Om ønskelig kan desintegrerings- eller solubiliseringsmidler tilsettes, slik som kryssbundet polyvinylpyrrolidon, agar, alginsyre eller et salt derav, slik som natriumalginat.
Generelt er vaksinen ifølge den foreliggende oppfinnelsen i stand til å fremkalle en immunrespons ved administrering til et individ. Vaksiner for bruk ifølge den foreliggende oppfinnelsen inneholder vanligvis en terapeutisk effektiv mengde av den aktive ingrediensen (dvs. polyproteinet som beskrevet i detalj). Bestemmelse av en effektiv dose er innenfor fagmannens kompetanse. Den terapeutisk effektive dosen kan anslås innledningsvis enten i cellekultur-assayer eller i dyremodeller, vanligvis fugler, mus, kaniner, hunder eller griser. Dyremodellen brukes også for å oppnå et ønsket konsentrasjonsområde. Slik informasjon kan deretter anvendes for å bestemme nyttige doser hos mennesker.
Doseringsmengder kan variere fra 0,1 til 500 000 mikrogram rekombinant polyprotein; transgen plantecelle eller transgen plante per individ per dag, for eksempel 1 ug, 10 ug, 100 ug, 500 ug, 1 mg, 10 mg, 100 mg, 1 g, 10 g, 50 g, 100 g, 200 g, og enda opp til en total dose på ca. 500 g per individ per dag. Ifølge visse utførelsesformer er doseringen i området 1 ng til 5 ng per kilo kroppsvekt. Ifølge en annen spesiell utførelsesformer er doseringen i området 1 ug til 5 g per kilo kroppsvekt. Ifølge andre spesielle utførelsesformer er doseringen i området 0,1 til 5 g per kilo kroppsvekt. Ifølge andre spesielle utførelsesformer er doseringen i området 1 til 5 mg per kilo kroppsvekt.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også fremgangsmåter for å fremstille en vaksine. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer særlig en fremgangsmåte for å fremstille en vaksine omfattende trinnene med a) å fremstille en transgen plantecelle, en transgen plante eller en transgen del av planten omfattende et rekombinant DNA-molekyl som beskrevet i detalj, b) å inkubere den transgene plantecellen, den transgene planten eller den transgene delen av planten under betingelser hvori plantecellen, planten eller delen av planten uttrykker polyproteinet kodet av det rekombinante DNA-molekylet, c) å høste den transgene plantecellen, den transgene planten eller den transgene delen av planten og d) å formulere den transgene plantecellen, den transgene planten eller den transgene delen av planten til en vaksine, eventuelt sammen med én eller flere farmasøytisk akseptable eksipienter.
Det skal også forstås at detaljene oppgitt ovenfor angående vaksinen ifølge oppfinnelsen, gjelder mutatis mutandis for dette aspektet.
Den transgene plantecellen, den transgene planten eller transgen del av planten kan formuleres i sin ubearbeidede form. Alternativt kan den transgene plantecellen, den transgene planten eller transgen del av planten formuleres i en bearbeidet form, slik som i form av et ekstrakt eller en juice.
Definisjoner
Som brukt her refererer "immunrespons" til en respons fra immunsystemet til en organisme eller et stoff, som inkluderer, men er ikke begrenset til, fremmede eller selvproteiner (eng.: seif proteins). Det finnes tre generelle typer "immunrespons", som inkluderer, men ikke er begrenset til, mukosale, humorale og cellulære immunresponser. En "mukosal immunrespons er et resultat av produksjonen av sekretoriske IgA- (slgA-)antistoffer i sekreter som overskyller alle mukosale overflater i luftveiene, mage-tarm-kanalen og urogenitalveiene og i sekreter fra alle sekretoriske kjertler (McGhee, J.R. et al. , 1983, Annals NYAcad. Sei. 409). Disse slgA-antistoffene virker for å hindre kolonisering av patogener på en mukosal overflate (Williams, R.C. et al., Science 177,697 (1972); McNabb, P. C. et al., Ann. Rev. Microbiol. 35,477 (1981)) og fungerer følgelig som en første forsvarslinje for å hindre kolonisering eller invasjon gjennom en mukosal overflate. Produksjonen av sig A kan stimuleres enten ved lokal immunisering av den sekretoriske kjertelen eller vevet eller ved presentasjon av et antigen for enten det tarmassosierte lymfevevet (GALT eller Peyers flekker) er det bronkieassosierte lymfevevet (BALT; Cebra, J. J. et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 41, 210 (1976); Bienenstock, J. M., Adv. Exp. Med. Biol. 107,53 (1978); Weisz-Carrington, P. et al., J. Immunol 123, 1705 (1979); McCaughan, G. et al., Internal Rev. Physiol 28,131 (1983)).
Membranøse mikrofold-celler, også kjent som M-celler, dekker overflaten til GALT og BALT og kan assosieres med andre sekretoriske mukosale overflater. M-celler virker for å ta prøver av antigener fra det luminale rommet tilstøtende til den mukosale overflaten og overfører slik antigener til antigenpresenterende celler (dentrittiske celler og makrofager), som i sin tur presenterer antigenet for en T-lymfocytt (når det gjelder T-avhengige antigener), som prosesserer antigenet for presentasjon til en kommitert B-celle. B-celler stimuleres deretter til å formere seg, migrere og til slutt transformeres til en antistoffsekreterende plasmacelle som produserer IgA mot det presenterte antigenet.
Når antigenet tas opp av M-celler som ligger over GALT og BALT, fører en generalisert mukosal immunitet til at alle sekretoriske vev i kroppen produserer slgA mot antigener (Cebra et al. , supra; Bienenstock et al. , supra; Weinz-Carrington et al. , supra; McCaughan et al. , supra). Oral immunisering er derfor en viktig måte å stimulere en generalisert mukosal immunrespons på, og fører i tillegg til lokal stimulering av en sekretorisk immunrespons i det orale hulrommet og i mage-tarm-kanalen.
En "immunrespons" kan måles ved å benytte teknikker som er kjent for fagmannen. For eksempel kan serum, blod og andre sekreter oppnås fra en organisme i hvilken det mistenkes at en "immunrespons" er til stede og analyseres for tilstedeværelse av ovennevnte immunoglobuliner ved å benytte et enzymforbundet immunoabsorberende assay (ELISA;US-patent No. 5,951, 988; Ausubel et al. , Short Protocols in Molecular Biologv 3rd Ed. John Wiley & Sons, Inc. 1995). Ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan det sies at en vaksine ifølge den foreliggende oppfinnelsen stimulerer en "immunrespons" dersom det kvantitative målet på immunoglobuliner hos et individ behandlet med en vaksine ifølge den foreliggende oppfinnelsen detektert ved ELISA er statistisk forskjellig (for eksempel økt 2-folds eller mer, for eksempel 2,3, 4,5, 10,20, 30,40, 50, 60,70, 80, 90,100 eller 1000-folds eller mer økning eller reduksjon i mengden av produserte antistoffer. En økning betyr også minst 5 % eller mer antistoffproduksjon, for eksempel 5, 6, 10, 20, 30, 40, 50, 60 70,80, 90 eller 100 % eller mer ut fra målingen av immunoglobuliner detektert i et individ som ikke er behandlet med vaksinen, hvori immunoglobulinene er spesifikke for polyproteinet ifølge den foreliggende oppfinnelsen. En statistisk test kjent i teknikken og nyttig for å bestemme forskjellen i målte immunoglobulinnivåer inkluderer, men er ikke begrenset til ANOVA, Studenfs T-test og lignende, hvori P-verdien er minst < 0,1, < 0,05, < 0,01, < 0,005, < 0,001 og enda < 0,0001.
En "immunrespons" kan måles ved å benytte andre teknikker, slik som immunohistokjemi ved å bruke merkede antistoffer som er spesifikke for partier av immunoglobulinene som har økt under "immunresponsen". Vev (f.eks. eggstokkvev) fra et individ til hvilket en vaksine har blitt administrert ifølge oppfinnelsen, kan oppnås og behandles for immunohistokjemi ved å benytte teknikker som er velkjent i teknikken (Ausubel et al.: Short Protocols i Molecular Biologv 3rd Ed. John Wiley & Sons, Inc. 1995). Mikroskopiske data oppnådd ved immunohistokjemi kan kvantifiseres ved skanning av den immunohistokjemisk fargede vevsprøven og ved kvantifisering av fargingsnivået ved å bruke et dataprogram som er kjent for fagmannen, inkludert, men ikke begrenset til NIH Image (National Institutes of Health, Bethesda, MD).
Som brukt her refererer "individ" til en organisme som klassifiseres innen det fylogenetiske riket animalia. Som brukt her refererer "individ" til et pattedyr, og særlig et menneske.
Som brukt her refererer "monokotyledon" til en plantetype hvis embryoer har ett kotyledon eller kimblad. Eksempler på énfrøbladede planter inkluderer, men er ikke begrenset til liljer; gress; mais; korn, inkludert havre, hvete og bygg; orkideer, iris; løk og palmer. Som brukt her refererer "dikotyledon" til en plantetype hvis embryoer har to frøhalvdeler eller kotyledoner. Eksempler på tofrøbladede planter inkluderer, men er ikke begrenset til tobakk, tomat, alfalfa, mint; og valnøtter.
Som brukt her refererer "vektor" til et nukleinsyremolekyl som er i stand til å transportere et annet nukleinsyremolekyl med hvilket det er sammenkoblet. Én type vektor er et "plasmid", som refererer til en sirkelformet dobbelttrådet nukleinsyresløyfe til hvilken ytterligere nukleinsyresegmenter kan være ligert. Visse vektorer er i stand til å dirigere ekspresjonen av gener med hvilke de er operativt sammenkoblet. Slike vektorer refereres til som "ekspresjonsvektorer". Visse andre vektorer er i stand til å lette innsettingen av et rekombinant DNA-molekyl i en plantes genom. Slike vektorer refereres til som "transformasjonsvektorer". Ekspresjonsvektorer for anvendelse i rekombinante nukleinsyreteknikker er ofte i form av plasmider. I den foreliggende beskrivelsen kan "plasmid" og "vektor" brukes om hverandre ettersom plasmidet er den mest brukte formen for vektor. Et stort antall egnede vektorer er kjent for fagmannen og er kommersielt tilgjengelige.
Som brukt her refererer "promoter" til en DNA-sekvens, vanligvis oppstrøms (5') for kodingsregionen til et strukturelt gen, som kontrollerer ekspresjonen av koderegionen ved å tilveiebringe gjenkjennelse og bindingssteder for RNA-polymerase og andre faktorer som kan kreves for initiering av transkripsjon. Seleksjonen av promoteren vil avhenge av den aktuelle nukleinsyresekvensen. En "promoter som er funksjonell i en plantecelle" referer til en "promoter" som er i stand til å støtte initieringen av transkripsjon i planteceller og forårsake produksjon av et mRNA-molekyl.
Som brukt her refererer "operativt sammenkoblet" til en sammenstilling hvori de beskrevne komponentene er i et forhold som tillater dem å fungere på tiltenkt måte. En kontrollsekvens som er "operativt sammenkoblet" med en kodingssekvens, er ligert på en slik måte at ekspresjon av kodingssekvensen oppnås under betingelser som er kompatible med kontrollsekvensene. En promotersekvens er "operativt sammenkoblett" med et gen når den er tilstrekkelig nær transkripsjonsstartstedet til et gen for å regulere transkripsjon av genet.
"Administrering" eller "administrere" er definert som innføring av et stoff, slik som den transgene plantecellen, den transgene planten, den transgene delen av en transgen plante
og vaksiner ifølge den foreliggende oppfinnelsen i kroppen til et individ og inkluderer mukosal, oral, nasal, rektal, vaginal og parenteral vei. Særlige administreringsveier er mukosal vei og nærmere bestemt oral vei.
Som brukt her betyr "farmasøytisk akseptabel" et ikke-toksisk materiale som ikke interfererer med effektiviteten til den/de aktive ingrediensen(e)s biologiske aktivitet.
Som brukt her refererer en "bærer" til et inert og ikke-toksisk materiale som er egnet til å utføre eller fremme levering av vaksinen ifølge den foreliggende oppfinnelsen til et individ.
Som brukt her inkluderer "inkubere" å dyrke en plante enten på marken eller i et kontrollert eller ukontrollert laboratorium eller innendørs omgivelser.
"% identitet" med to nukleotidsekvenser refererer til sekvensidentitet mellom en nukleotidsekvens og en referansenukleotidsekvens. Identitet kan bestemmes ved å sammenligne en posisjon i hver sekvens som kan justeres til sammenligningsformål. Når en posisjon i den sammenlignede sekvensen okkuperes av den samme basen, er molekylene identisk med denne posisjonen. En grad av likhet eller identitet mellom nukleoitidsekvensene er en funksjon av antall identiske eller matchende nukleotider ved posisjoner som deles av nukleotidsekvensene. Ulike sammenstillingsalgoritmer og/eller - programmer kan benyttes for å beregne identiteten mellom to sekvenser, inkludert FASTA eller BLAST, som er tilgjengelige som del av GCG-sekvensanalysepakken (University of Wisconsin, Madison, Wis.) og kan brukes med f.eks. standardinnstillinger.
"% identitet til en aminosyresekvens med en referanseaminosyresekvens, som brukt her, definerer % identitet beregnet ut fra de to aminosyresekvensene som følger: Sekvensene justeres ved å benytte versjon 9 av Genetic Computing Group's GAP (globalt sammenstillingsprogram) ved å bruke standard BLOSUM62-matrise (se nedenfor) med en gapåpningsstraff på -12 (for det første tomrommet i et gap) og gaputvidelsesstraff på -4 (for hvert ytterligere tomrom i gapet). Etter sammenstilling beregnes prosent identitet ved å uttrykke antall matcher som en prosent av antall aminosyrer i referanseaminosyresekvensen.
Følgende BLOSUM62-matrise benyttes:
Der en numerisk grense eller område er oppgitt, er endepunktene inkludert. Alle verdier og underområder innen en numerisk grense eller område er også spesifikt inkludert som om det var eksplisitt utferdiget.
Etter å ha beskrevet denne oppfinnelsen generelt, kan en ytterligere forståelse oppnås ved henvisning til visse spesifikke eksempler, som er tilveiebrakt kun for illustrasjonsformål, og er ikke ment å være begrensende med mindre annet er spesifisert.
Eksempler
Materialer
1. Bakteriestammer
One Shot® OmniMAX™ 2 T1<R>kjemiske kompetent E.coli (Kat. nr. C8540-03, Invitrogen™, Thermo Fisher Scientific Inc., USA)
One Shol® ccdB Survival™ 2 T1<R>kjemisk kompetent E.coli (Kat. nr. A10460. Invitrogen™, Thermo Fisher Scientific Inc., USA)
2. Plantematerialer
Frø fra Lactuca sativa L. cv. Barkley: (WT
Konstruerte transplastomiske plantelinjer:
1) Lactuca sativa-linje som uttrykker EDIII 1-4 konstitutiv: S12-PN-EDII11-4
2) Lactuca sativa-linje som uttrykker EDIII 1 konstitutiv: S16-PN-EDIII 1
3. Instrumenter og forbruksvarer
Tabell IBruksklare reagenser og kit.
Tabell 2 Primere og prober. Primere blir syntetisert på bestilling av Eurofins MWG Operon (Tyskland) og rekonstituert med steril ddH20 til en stock-konsentrasjon på 100 mM, ytterligere fortynnet til en arbeidskonsentrasjon på 10 mM og lagret ved - 20 °C i alikvoter på 500 ul.
Fremgangsmåter
4. Bakterievekstbetingelser
Dyrking over natten av E.coli ble gjort enten på LB-plater med 10 g/l Bacto-Agar eller i 5 ml flytende LB-medium inneholdende egnede antibiotika (tabell 7) for å opprettholde seleksjonstrykket ved 37 °C og risting ved 320 rpm. 33 % glyserol-stock ble dannet av hver væskekultur ved å blande 0,5 ml 100 % glyserol og 1 ml flytende cellekultur. Glyserol-stocken ble sjokkfrosset i flytende N2og lagret ved -80 °C.
5. Plantevekstbetingelser
5.1 Frøsterilisering
Frø fra Lactuca sativa ble dynket med 5 % dimanin C sammen med noen få dråper rengjøringsvæske i 10 minutter. Løsningen ble pipettert, og frøene ble deretter vasket i 70 % etanol i 1 min, vasket tre ganger i destillert vann og lufttørket ved romtemperatur i den rene benken. Frøene ble lagret ved 4 °C.
5.2 In vitro plantevevskultur og regenerering
Frø ble spiret på fast MS-medium inneholdende det egnede antibiotikumet (tabell 8); unge frøplanter ble overført til magenta-bokser inneholdende samme medium.
Vevskultur til de bombarderte bladskivene ble utført på RMOP-medium inneholdende det egnede antibiotikumet (tabell 8); unge skudd utviklet fra kallusvevet ble overført til magenta-bokser inneholdende MS-medium inkl. antibiotika for rotdanneise og ytterligere vekst.
Alle in vitro-kulturer ble inkubert ved 25 °C, i en syklus på 161 lys - 81 mørke i vekstkamre utstyrt med universallamper med hvit fluorescens, lysintensitet; 0,5 -1 W/m2 Osram L85 W/25.
5.3 Drivhusvekstbetingelser
Rotfestede planter ble overført til jord og dyrket i drivhus med ytterligere lys i 161 og lysintensitet på 300 uE s-<1>nrv<2>,ved 25 °C og relativ fuktighet på 60 %.
6. DNA-preparering
6.1 Plasmid DNA-isolasjon
Plasmid DNA ble isolert ved å bruke kittene kjøpt fra Qiagen (Qiagen® Plasmid Maxi Kit, Qiagen® Plasmid Midi Kit og QIAprep® Spin Miniprep Kit) og etter instruksjonene levert med kittene.
Kort sagt ble E.coli som hadde blitt dyrket natten over i flytende LB-medium, høstet ved sentrifugering 8000 g i 3 min, og pelletsene ble resuspendert i Buffer P1. Bakteriecellepelletsene ble lysert ved alkalisk lysis, cellerestene og andre kontminanter ble utfelt, og det rensede lysatet ble påført på silisiummembranen for å tillate DNA-binding. Etter flere vasket ri nn ble DNA-et eluert fra kolonnen med sterilt destillert vann og lagret ved +4 °C.
6.2 Plante-DNA-isolasjon
Totalt plante-DNA isoleres ved å bruke en modifisert CTAB-prosedyre (Murray & Thompson, 1980).
Planteblader ble samlet inn og frosset i flytende nitrogen og malt til fint pulver enten ved å bruke støter og morter eller en Retsch-mølle. 500 pl forvarmet CTAB-buffer (65 °C) ble tilsatt til 200 mg frosset prøvemateriale og inkubert i 1 t ved 65 °C i et resirkulerende vannbad, blandet forsiktig ved å vende om av og til. Prøver fikk kjøles ned i 5 minutter ved RT før tilsetning av 500 pl kloroform. Rørene ble ristet i 30 minutter ved RT og deretter sentrifugert i 10 minutter ved 10000 rpm ved +4 °C. Den øvre vannaktige fasen ble overført til et nytt rørt, og avkjølt isopropanol ble brukt for å utfelle DNA-et. Etter sentrifugering i 10 min ved 10 000 rpm ved +4 °C ble pelleten vasket to ganger med 70 etanol, sentrifugert i 1 min ved 10 000 rpm ved 4 °C og deretter lufttørket i 30 minutter. DNA ble resuspendert i sterilt destillert vann og lagret for senere bruk ved -20 °C.
7. Kloning og E. coli varmesjokktransformasjon
7.1 DNA-kutting med restriksjonsenzymer
Restriksjonskuttinger av plasmid-DNA eller fullstendig plante-DNA med egnede restriksjons-endonukleaser ble utført i de korresponderende buffersystemene tilveiebrakt av produsenten ved 37 °C over natten i et reaksjonsvolum på 30 ul. Restriksjonskuttinger ble varmeaktivert ved inkubering ved 65 °C i 20 minutter før eventuell videre bruk.
7.2 Ligering av vektorhovedkjede med DNA-fragmenter
Rapid DNA Ligation Kit ble brukt for å ligere DNA-fragmenter i samsvar med protokollen tilveiebrakt av produsenten, og formel oppgitt nedenfor ble brukt for å bestemme mengden av innsats basert på et molforhold på 3:1 av innsats i hoved kjede DNA. Følgende reaksjonsblanding ble fremstilt i et reaksjonsrør og inkubert ved 16 °C over natten (tabell 9).
7.3 £.co//-transformasjon
Alle plasmider (1 pl) og ligeringsprodukter (5 pl) transformeres til kjemisk kompetent One Shot® E.coli ved varmesjokk ifølge produsentens protokoll (Invitrogen™).
Cellene ble tint på is, og etter tilsetting av DNA-et ble de inkubert i 30 minutter på is, etterfulgt av varmesjokkbehandling ved 42 °C i 30 sekunder og to minutter inkubering på is. 250 pl SOC-medium ble tilsatt til 50 pl opprinnelig cellekultur og inkubert ved 37 °C i 1 t på risteinnretning. 10 pl og 50 pl av kulturen ble plassert på LB-plater inneholdende egnede antibiotika for seleksjon og vekst ved 37 °C over natten. Resten av transformasjonskulturen ble lagret ved +4 °C og om nødvendig ble cellene pelletert, resuspendert i mindre volum flytende LB-medium og plassert ut igjen.
Enkle kolonier ble plukket og dyrket natten over i flytende LB-medium inneholdende antibiotika, høstet og brukt til glyserol-stock og plasmidisolasjon.
7.4 Gensyntese
Nukleotidsekvensene som koder for transgenene (EDIII 1-4, EDIII 1), ble kodonbrukoptimert for Lactuca saf/Va-plastidet, og gensyntese av disse spesialdesignede sekvensene ble utført av GeneArt (Tyskland).
7.5 Gateway® kloningsprosedyre
Alle Gateway® kloningstrinn ble utført ifølge protokollen tilveiebrakt fra Invitrogen™.
BP-reaksjonen utføres med den Pstl-lineariserte vektoren inkludert det aktuelle genet (eng.: gene of interest, goi) og Donor-vektoren pDONR221™ og BP-enzymblandingen ved 25 °C i 1 t. LR-reaksjonen utføres med de tidligere fremstilte inngangs- og destinasjonsvektorene og LR-enzymblandingen i 1 t ved 25 °C. De resulterende inngangsvektorene og ekspresjonsvektorene transformeres til One Shol® OmniMAX™ E. coli-celler ved varmesjokk. Formelen angitt nedenfor brukes for å beregne de riktige mengdene goi og donorvektor med X for goi og donorvektor og N for størrelsen i bp til henholdsvis goi- og donorvektoren. Standardoppsettet for den utførte BP- og LR-reaksjonen er oppgitt i tabell 10. BP- og LR-reaksjonene ble stoppet ved å tilsette 1 pL proteinase K og inkubering ved 37 °C i 10 minutter.
8. Vektorkonstruksjon
8.1 Destinasjonsvektor pDEST-PN-L
Den salatspesifikke plastidtransformasjonsvektoren pDEST-PN-L (figur 1 (e)) ble oppnådd ved innsetting av den fullstendige aadA-ekspresjonskassetten og Gateway®-kassetten i en hovedkjedevektor inneholdende regionene som er homologe med trnl/trnA-sekvensen fra L. sativum (Ruhlmann et al. 2007).
Re-kutting av hovedkjedevektoren pLettuce-MA (GeneArt, Tyskland) inneholdende den salatspesifikke sekvensen for homolog integrering i plastidgenomet med Kpnl og Sadl ga 3432 bp-innsatsen og 4337 bp-hovedkjeden, som ble separert ved hjelp av gelelektroforese, og de riktige fragmentene ble skåret ut og renset fra gelen. Ligeringsproduktet ble transformert til ccdB Survival™ 2 T1R kjemisk kompetent E. coli, og positive kloner ble valgt på ampicillin- og spektinomycinholdig fast LB-medium.
8.2 Inngangsvektorer og ekspresjonsvektorer
Inngangsvektorene ble fremstilt av den Gateway® BP Clonase®-enzymblandingsmedierte overføringen av det aktuelle attB-stedsflankerte genet i det attP-stedbærende pDONR221™. BP-reaksjonene ble utført ifølge protokollen tilveiebrakt av Invitrogen™. Vektorene som donerte det aktuelle attB-stedsflankerte genet, ble linearisert ved Pstl-kutting for å maksimere rekombinasjonseffektiviteten. BP-reaksjonsproduktene ble transformert til OmniMax™ E.coli ved varmesjokk, cellene ble plassert på fast LB-medium inneholdende kanamycin, og positive kloner ble identifisert ved koloni PCR med primere pM13F/. Det aktuelle genet i inngangsvektorene ble deretter overført til den respektive destinasjonsvektoren inneholdende attR-steder ved å bruke Invitrogen® LR Clonase® enzymblanding. LR-reaksjonene ble utført ifølge protokollen tilveiebrakt av Invitrogen™. LR-reaksjonsproduktene ble transformert til OmniMax™ E.coli ved varmesjokk, cellene ble plassert på fast LB-medium inneholdende ampicillin og spektinomycin, og positive kloner ble identifisert ved koloni PCR med primere p296/p297. Korrektheten til alle utførte kloningstrinn ble verifisert ved sekvensering av plasmid DNA isolert fra PCR-positive kloner.
9. Plastidtransformasjon ved fremgangsmåte for biolostisk bombardement
Transformasjon av kloroplaster og regenerering av transplastomiske planter ble oppnådd med fremgangsmåtene for biolostisk transformasjon ved å bruke et PDS-1000/He partikkelleveringssystem og ved å følge den modifiserte protokollen fra (Verma et al, 2008). Tabell 11 lister opp de utførte transformasjonene og de genererte transplastomiske plantelinjene.
9.1 Fremstilling av plantemateriale
Blad fra 6 ukers gamle planter dyrket under sterile forhold ble høstet, plassert på RMOP-medium med den abaksiale siden opp og inkubert ved 25 °C i mørket over natten.
9.2 Sterilisering av mikrobærer
30 mg gullpartikler ble nøyaktig veid og overført til 1,5 ml Eppendorf-rør. 1 ml 70 % etanol ble tilsatt til røret, virvlet i 15 minutter og sentrifugert i 10 sekunder ved maksimal hastighet. Supernatanten ble fjernet, og gullpaletten ble vasket igjen med 70 % etanol, vaskingen ble gjentatt to eller flere ganger. Etter tredje vasking ble supernatanten kassert og gullpartiklene ble resuspendert i 500 pl 50 % glyserol med en endelig konsentrasjon på 60 mg/ml.
9.3 DNA-belegg til mikrobærer
5 pl DNA (1 pg/pl), 50 pl 2,5 M CaCI2, og 20 ul 0,1 M spermidin ble tilsatt under virvling til 50 pl sterile mikrobærere resuspendert i glyserol. Blandingen ble inkubert på is i 10 minutter og deretter sentrifugert i 1 min ved 8000 rpm. Supernatanten ble forsiktig fjernet, og pelleten ble først vasket med 140 pl 70 % etanol og sentrifugert i 1 minutt ved 10000 rpm; andre pellet ble vasket med 140 pl 100 % etanol i 1 minutt og sentrifugert ved 10000 rpm. Supernatanten ble fjernet, og de DNA-belagte mikrobærerne ble forsiktig resuspendert i 48 pl 100 % etanol og oppbevart på is inntil bruk.
9.4 Bombardement
Alt utstyr og bombardementskammeret ble sterilisert med 70 % etanol. 6 pl nylig fremstilte DNA-belagte gullpartikler ble lastet på makrobærere i makrobærerholder. Den sterile bruddskiven på 1100 psi ble plassert i holdekappen og festet til gassakselerasjonsrøret. Plantevev ble bombardert med DNA-belagte mikrobærere i vakuumkammeret under et trykk på 1100 psi.
9.5 Seleksjon og regenerering av transformerte planter
De bombarderte bladskivene ble plassert på RMOP-medium og inkubert i mørket ved 25 °C i to dager. Bladene ble deretter skåret i små biter (~5 mm2), overført til RMOP-medium inneholdende spektinomycin og oppbevart ved 25 °C under standard lysbetingelser. Tre til fire uker etter transformasjonen begynte de resistente skuddene å regenerere og ble overført til ferskt medium. For å oppnå homoplasmiske planter ble transplastomiske skudd utsatt for 2 ytterligere runder med regenerering på RMOP-medium inneholdende spektinomycin. Integrering av den transgene ekspresjonskassetten i tobakk-plastid-genomet ble verifisert ved hjelp av et 2552 bp PCR-produkt med primer p3/p4 PCR-positive kimplanter ble brukt for videre analyse. Tilstedeværelse av den transgene ekspresjonskassetten i salatplastidgenomet ble verifisert ved 836 bp PCR-produkt for S16-PN-EDIII 1 og 1841 bp PCR-fragment for S12-PN-EDIII 1-4 med primere p296/p297.
10. Molekylær analyse for å verifisere transformantene
10.1 Southern Blot-analyse
Southern Blot-analysene ble utført i samsvar med protokollen tilveiebrakt med DIG-High Prime DNA Labeling og Detection Starter Kit II (Roche). Plante-DNA ble isolert fra transplastomiske og villtype-planter etter tre etterfølgende runder med seleksjon og subkultur på spektinomycin-holdig RMOP-medium og analysert ved å bruke DIG-merkede prober (tabell 12) som bindes inni de transgene ekspresjonskassettene og plastidgenomet. 10 pg plante-DNA ble skåret med Smal (for S12-PN-EDIII 1-4 og S16-PN- EDIII 1), separert ved elektroforese i en 1 % agarose-gel ved 50 V over natten og overført til en positivt ladet nylonmembran ved kapillarvirkning ved å bruke den halvtørre overføringen over natten. Etter immobilisering av DNA-et ved å steke membranen ved 80 °C i 2 t, ble DNA-et prehybridisert i 31 ved 45 °C og hybridisert med den spesifikke merkede proben (tabell 13) ved 45 °C over natten for å visualisere den aktuelle sekvensen. Stringensvasker ble utført med 2X SSC + 1 % SDS ved RT og 0,5X SSC + 1 % SDS ved 65 °C. Etter inkubering i blokkeringsløsning i 30 minutter ved RT og inkubering i antistoffløsning i 30 minutter ved RT, ble membranen vasket to ganger med 1X WB, 1 ml CSPD bruksklar løsning ble påført på membranen og inkubert ved 37 °C i 10 minutter. Signalet ble detektert ved eksponering for røntgenfilm og fremkallingsmiddel og fikseringsløsning ble brukt for å fremkalle røntgenfilmen.
10.2 Western Blot-analyse
200 mg frossen bladprøve ble malt til fint pulver ved å bruke flytende nitrogen og homogenisert i 500 pl planteekstraksjonsbuffer ved virvling i 3 minutter ved RT. PEB II ble brukt for å ekstrahere totalt oppløselig protein (TSP) fra alle plantelinjer. Supernatanten ble samlet opp etter sentrifugering i 10 minutter ved 13000 rpm ved +4°, alikvotert og lagret ved -20 °C.
Alternativt ble 200 mg frossen bladprøve malt til fint pulver ved å bruke flytende nitrogen og homogenisert i 500 pl PEB III ved virvling i 1 minutt ved RT for å ekstrahere totalt protein (TP). 500 pl fenol ble tilsatt til plantecelleekstraktet, virvlet kort og sentrifugert ved 13000 rpm i 10 minutter ved +4 °C. 200 pl av den øvre grønne supernatanten ble overført til et nytt rør, og 1 ml 0,1 M NH40Ac i metanol ble tilsatt, og proteinene ble utfelt i 31 ved -20 °C. Etter sentrifugering ved 13000 rpm ved +4 °C i 10 minutter ble pelleten vasket to ganger med 500 pl 0,1 M NH40Ac i metanol og deretter lufttørket ved RT. Til slutt ble proteinpelleten oppløst i 100 pl 1 % SDS og lagret ved -20 °C. 20 pl prøve ble blandet med 5 pl Laemmli Buffer, denaturert ved 95 °C i 10 minutter, rotert og lastet på 12 % PAA-gelen. Proteiner ble separert ved elektroforese og deretter overført til nitrocellulosemembranen og blokkert med 0,5 % BSA i TBS-T i 1 t. Membranen ble raskt skylt med TBS-T og deretter inkubert med det primære antistoffet 1:1000 fortynnet i TBS-T over natten ved +4 °C. Membranen ble vasket tre ganger med TBS-T ved RT og inkubert i 11 med alkalisk fosfat-konjugert geit antimus-IgG (Promega) som sekundært antistoff fortynnet 1:10000 i TBS-T ved RT. Proteiner ble detektert ved kolorimetrisk reaksjon ved å bruke enten AP color development Kit (Bio-Rad, USA) eller med SigmafastTM BCIP®/NBT (Sigma). Coomassie-farging med Brilliant Blue G ble utført for å verifisere like lastemengder av proteiner. PAA-gelene ble farget i 1 t ved RT med Coomassie-fargingsløsningen og avfarget over natten i 10 % eddiksyre.
10.3 Kvantifisering av TSP og TP.
Kvantifisering av isolert TSP ble utført ved å bruke Bradford-assayet og ved å følge instruksjonene tilveiebrakt i produsentens protokoll. BSA-standardene ble fremstilt ved å fortynne henholdsvis de tilveiebrakte 2 mg/ml Stock i PEB II (tabell 14). Standardene og prøvene ble målt ved å bruke standardprosedyren der 1 ml bruksklar Bradford Reagent tilsettes til 20 pl prøve, inkuberes ved RT i 10 minutter og deretter målt ved 595 nm. T-standard-kurven ble oppnådd som en regresjonsligning og ble brukt til å beregne konsentrasjonen av TSP i de ukjente prøvene. Alle målinger ble utført i tekniske duplikater. Kvantifisering av TP ble utført ved å bruke BCA protein assay Kit (Pierce). BSA standardfortynningsserien ble fremstilt ved å fortynne den tilveiebrakte 2 mg/ml stock i PEB III til de endelige konsentrasjonene oppgitt i tabell 18. Assays ble utført ifølge protokollen tilveiebrakt med kittet og mikroplateprosedyren ble brukt der 25 pl prøve ble blandet med 200 pl 1X arbeidsreagens, inkubert ved 37 °C i 30 minutter og deretter målt ved 652 mm. Standard-kurven ble oppnådd ved regresjon, og konsentrasjonen av de ukjente prøvene ble beregnet. Alle målinger ble utført i tekniske duplikater.
Resultater
11. Ekspresjon av monovalent EDII11 og tetravalent EDII11-4 antiagens i salatplastider 11.1 Vektorkonstruksjon
Salatplastidtransformasjonsvektoren pDEST-PN-L ble konstruert ved innsetting av aadA-ekspresjonskassetten og GatewayO-kassetten mellom salatspesifikke steder for homolog rekombinasjon. Vektorene pEXP-PN-EDIII 1-L og pEXP-PN-EDIII 1-4-L (1(a)) brukt for salatplastidtransformasjon ble oppnådd ved Gateway®-kloning av sekvensene for EDII 1 og EDIII 1-4 i den salatspesifikke pDEST-PN-L-en. Homolog rekombinasjon i den intergenetiske spacerregion mellom trnl og trnA i salatplastidgenomets IR-regionen (figur a (b)) resulterte i at transplastomiske planter bar de korresponderende transgene ekspresjonskassettene (figur 1 (c)).
11.2 Transplastomisk planteregenerering og karakterisering
Transgene skudd utviklet fra kallusvev på RMOP-medium inneholdende spektinomycin, ble testet for transgen integrering ved hjelp av PCR. Tilstedeværelse av den transgene sekvensen i plastidgenomet ble vist ved hjelp av et PCR-produkt på 1841 bp for EDIII 1-4 og 836 bp for EDIII 1 med primere p296/p297
(figur 2 (a)). De transplastomiske plantelinjene (S12-PN-EDIII 1-4 og S16-PN-EDIII 1) ble ytterligerekarakterisert vedSouthern blot-analyse. Den homoplastomiske tilstanden til begge plantelinjer ble verifisert ved tilstedeværelsen av kun 5545 pb-fragmentet (i S16-PN-EDIII 1) eller 6533 bp-fragmentet (i S12-PN-EDIII 1-4) i transformerte planter, sammenlignet med 3130 bp-fragmentet i villtype (figur 2 (b)) etter kutting av totalt plante-DNA med Smal. Ikke-fenotypiske alterasjoner var synlige på transplantomiske planter som vokste i drivhuset (figur 3 (a)), og blomsterstand og frøutviking var normal. Planter ble dyrket til full modenhet (figur 3 (b)), og frøene høstet fra transgene planter ble spiret på spektinomycinholdig medium. Den homogene grønne fenotypen til frøplantene viste fravær av segregering av det antibiotiske resistensgenet i F1-genereringen (figur 3 (c)).
11.3 Analyse av ekspresjonen av EDII11-4 og EDII11 antigener
Totalt protein (TP) og totalt oppløselig protein (TSP) ble isolert fra planter som vokste i drivhuset, kvantifisert ved hjelp av BCA og Bradford-assay, og immunoblotanalysen utført med et anti-dengue-antistoff detekterte både 13 kDa EDIII 1 og 47 kDA EDIII 1-4 i de respektive plantene (figur 4).
Liste over visse henvisnin<g>er anført i beskrivelsen
Allison SL, Schalich J, Stiasny K, Mandl CW, Heinz FX (2001) Mutational evidence for an internal fusion peptide in flavivirus envelope protein E. J Virol 75: 4268-4275
Batra G, Hapugoda M, Chaudhry S, al. e. (2007) Tetravalent dengue specific domain III based chimeric recombinant protein. Vol. WO2007034507.
Bhamarapravati N, Butrapet S, Chang J, al. e. (1996) Infectious dengue 2 virus PDK-53 as quadravalent vaccine.
Bhamarapravati N, Yoksan S. (2001) Attenuated strains of dengue virus and their use in a vaccine composition. Vol. EP1159968.
Brandler S, Lucas-Hourani M, Moris A, Frenkiel M-P, Combredet C, Février M, Bedouelle H, Schwartz O, Després P, Tangy F (2007) Pediatric Measles Vaccine Expressing a Dengue Antigen Induces Durable Serotype-specific Neutralizing Antibodies to Dengue Virus. PLoS Negl Trop Dis 1: e96
Brown D. (2004) Insertion of furin protease cleavage sites in membrane proteins and uses thereof.
Calisher CH, Karabatsos N, Dalrymple JM, Shope RE, Porterfield JS, Westaway EG, Brandt WE (1989) Antigenic relationships between flaviviruses as determined by cross-neutralization tests with polyclonal antisera. J Gen Virol 70 ( Pt 1): 37-43
Chen Y, Maguire T, Hileman RE, Fromm JR, Esko JD, Linhardt RJ, Marks RM (1997) Dengue virus infectivity depends on envelope protein binding to target cell heparan sulfate. Nat Med 3: 866-871
Chin JF, Chu JJ, Ng ML (2007) The envelope glycoprotein domain III of dengue virus serotypes 1 og 2 inhibit virus entry. Microbes Infect 9: 1-6
Crill WD, Roehrig JT (2001) Monoclonal antibodies that bind to domain III of dengue virus E glycoprotein are the most efficient blockers of virus adsorption to Vero cells. J Virol 75: 7769-7773
Durbin AP, Karron RA, Sun W, Vaughn DW, Reynolds MJ, Perreault JR, Thumar B, Men R, Lai CJ, Elkins WR, Chanock RM, Murphy BR, Whitehead SS (2001) Attenuation and immunogenicity in humans of a live dengue virus type-4 vaccine candidate with a 30 nucleotide deletion in its 3'-untranslated region. Am J Trop Med Hyg 65:405-413
Eckels K, Putnak J, Dubois D. (2000a) Multivalent dengue virus vaccine. Vol. WO0057907.
Eckels K, Putnak J, Dubois D, al. e. (2000b) Attenuated dengue-1 (-2, -3 og -4) virus vaccine. Vol. WO0057908 (WO0057909, WO0057904 og WO0057910).
Edelman R, Wasserman SS, Bodison SA, Putnak RJ, Eckels KH, Tang D, Kanesa-Thasan N, Vaughn DW, Innis BL, Sun W (2003) Phase I trial of 16 formulations of a tetravalent live-attenuated dengue vaccine. Am J Trop Med Hyg 69: 48-60
Etemad B, Batra G, Raut R, Dahiya S, Khanam S, Swaminathan S, Khanna N (2008) An Envelope Domain lll-based Chimeric Antigen Produced in Pichia pastoris Elicits Neutralizing Antibodies Against All Four Dengue Virus Serotypes. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 79: 353-363
Frolov I, Frolova E, Mason P. (2007) Pseudoinfectious flavivirus and uses thereof.
Guirakhoo F, Arroyo J, Pugachev KV, Miller C, Zhang ZX, Weltzin R, Georgakopoulos K, Catalan J, Ocran S, Soike K, Ratterree M, Monath TP (2001) Construction, safety, and immunogenicity in nonhuman primates of a chimeric yellow fever-dengue virus tetravalent vaccine. J Virol 75: 7290-7304
Guzman M, Våzquez S, Kouri G. (2009) Dengue: where are we today? Malays J Med Sei., Vol. 16 (3), pp. 4-11.
Guzman MG, Hermida L, Bernardo L, Ramirez R, Guillen G (2010) Domain III of the envelope protein as a dengue vaccine target. Expert Rev Vaccines 9: 137-147
Halstead SB (1988) Pathogenesis of dengue: challenges to molecular biology. Science 239: 476-481
Halstead SB, Marchette NJ (2003) Biologic properties of dengue vimses following serial passage in primary dog kidney cells: studies at the University of Hawaii. Am J Trop Med Hyg 69: 5-11
Hombach J, Barrett AD, Cardosa MJ, Deubel V, Guzman M, Kurane I, Roehrig JT.Sabchareon A, Kieny MP (2005) Review on flavivirus vaccine development. Proceedings of a meeting jointly organised by the World Health Organization and the Thai Ministry of Public Health, 26-27 April 2004, Bangkok, Thailand.
Vaccine 23: 2689-2695
I vy J, Nakano E, Clements D. (2000) Subunit immunogenic composition against dengue infection.
Kanesa-thasan N, Sun W, Kim-Ahn G, Van Albert S, Putnak JR, King A, Raengsakulsrach B, Christ-Schmidt H, Gilson K, Zahradnik JM, Vaughn DW, Innis BL, Saluzzo JF, Hoke CH, Jr. (2001) Safety and immunogenicity of attenuated dengue virus vaccines (Aventis Pasteur) in human volunteers. Vaccine 19: 3179-3188
Martinez CA, Topal E, Giulietti AM, Talou JR, Mason H (2010) Exploring different strategies to express Dengue virus envelope protein in a plant system. Biotechnol Lett 32: 867-875
McDonald W, Powell T, Price A, Becker R. (2009) Composition of dengue viral proteins and methods of use.
Modis Y, Ogata S, Clements D, Harrison SC (2003) A ligand-binding pocket in the dengue virus envelope glycoprotein. Proceedings of the National Academy of Sciences 100: 6986-6991
Monath T (1997) Yellow fever in vaccines. Plotkin S, Orenstein W (eds), 3. utgave, s, 815-880. Philadelphia: WB Saunders Co.
Morrison D, Legg TJ, Billings CW, Forrat R, Yoksan S, Lang J (2010) A novel tetravalent dengue vaccine is well tolerated and immunogenic against all 4 serotypes in flavivirus-naive adults. J Infect Dis 201: 370-377
Pasteur S. (2011) Study of a Novel Tetravalent Dengue Vaccine in Healthy Children and Adolescents Aged 9 to 16 Years in Latin America. NCT01374516. Clinical Trials database of the US NIH.
Ruhlman T, Ahangari R, Devine A, Samsam M, Daniell H (2007) Expression of cholera toxin B-proinsulin fusion protein in lettuce and tobacco chloroplasts - oral administration protects against development of insulitis in non-obese diabetic mice. Plant Biotechnology Journal 5: 495-510
Sabchareon A, Wallace D, Sirivichayakul C, Limkittikul K, Chanthavanich P, Suvannadabba S, Jiwariyavej V, Dulyachai W, Pengsaa K, Wartel TA, Moureau A, Saville M, Bouckenooghe A, Viviani S, Tornieporth NG, Lang J (2012) Protective efficacy of the recombinant, live-attenuated, CYD tetravalent dengue vaccine in Thai schoolchildren: a randomised, controlled phase 2b trial. The Lancet 380: 1559-1567
Staub JM, Maliga P (1993) Accumulation of D1 polypeptide in tobacco plastids is regulated via the untranslated region of the psbA mRNA. EMBO J 12(2): 601-606
Sun W, Edelman R, Kanesa-Thasan N, Eckels KH, Putnak JR, King AD, Houng HS, Tang D, Scherer JM, Hoke CH, Jr., Innis BL (2003) Vaccination of human volunteers with monovalent and tetravalent live-attenuated dengue vaccine candidates. Am J Trop Med Hyg 69: 24-31
Swaminathan S, Batra G, Khanna N (2010) Dengue vaccines: state of the art. Expert Opinion on Therapeutic Patents 20: 819-835
Verma D, Samson NP, Koya V, Daniell H (2008) A protocol for expression of foreign genes in chloroplasts. Nat Protoc 3(4): 739-758
Ye GN, HaidukiewiczllPll. BrovlealB. RodriauezllB. KulCV\I. KehrllFl. EtauBIDM (2001) Plastid-expressed 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase genes provide high level glyphosate tolerance in tobacco. Plant J 25(3): 261-270
Ulike mulige utførelsesformer
1. Rekombinant DNA-molekyl omfattende en promoter som er funksjonell i en plantecelle for å bevirke produksjon av et mRNA-molekyl, og som er operativt forbundet med en nukleotidsekvens som koder for et polyprotein omfattende det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 1 (EDIII-1) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 2 (EDIII-2) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 3 (EDIII-3) eller en variant derav, og det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 4 (EDIII-4) eller en variant derav. 2. Det rekombinante DNA-molekylet ifølge punkt 2, hvori EDIII-1 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 1, EDIII-2 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 2, EDIII omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 3, og EDIII-4 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 4. 3. Det rekombinante DNA-molekylet ifølge punkt 1 eller 2, hvori varianten av EDIII-1 omfatter en aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 1, varianten av EDIII-2 omfatter en aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 2, varianten av EDIII-3 omfatter en aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 3, og varianten av EDIII-4 omfatter en aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i
SEQ ID NO: 4.
4. Det rekombinante DNA-molekylet ifølge et hvilket som helst av punktene 1 til 3, hvori tilstøtende EDIII-er er forbundet med linkere. 5. Det rekombinante DNA-molekylet ifølge punkt 4, hvori linkerne er peptidlinkere, slik som polyglysinlinkere. 6. Det rekombinante DNA-molekylet ifølge punkt 5, hvori linkerne er sammensatt av fra ca. 1 til 20 aminosyrer, slik som ca. 2 til ca. 10 aminosyrer, slik som fra ca. 3 til ca. 7 aminosyrer, slik som ca. 5 aminosyrer. 7. Det rekombinante DNA-molekylet ifølge et hvilket som helst av punktene 1 til 6, hvori polyproteinet omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 5, eller en aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 5. 8. Det rekombinante DNA-molekylet ifølge et hvilket som helst av punktene 1 til 7, hvori promoteren er en promoter som er funksjonell i en Lactuca saf/Va-celle. 9. Det rekombinante DNA-molekylet ifølge et hvilket som helst av punktene 1 til 8, hvori promoteren er valgt fra gruppen bestående av Lactuca sative psbA-promoteren, tobakk psbA-promoteren, tobakk rrn16 PEP+NEP-promoteren, CaMV 35S-promoteren, 19S-promoteren, tomat E8-promoteren, nospromoteren, Mac-promoteren, pet E-promoteren eller ACT1-promoteren. 10. Det rekombinante DNA-molekylet ifølge et hvilket som helst av punktene 1 til 9, hvori promoteren er Lactuca sativa psbA-promoteren eller tobakk psbA-promoteren. 11. Det rekombinante DNA-molekylet ifølge et hvilket som helst av punktene 1 til 10 kan ytterligere omfatte minst ett regulerende element valgt fra gruppen bestående av en 5' utranslatert region (5' UTR), 3' utranslatert region (3' UTR) og transittpeptidregion. 12. Det rekombinante DNA-molekylet ifølge et hvilket som helst av punktene 1 til 11, ytterligere omfattende en 5' utranslatert region valgt fra gruppen bestående av den 5' utranslaterte regionen til Lactuca sative psbA-genet eller den 5' utranslaterte regionen til tobakk psbA-genet. 13. Det rekombinante DNA-molekylet ifølge et hvilket som helst av punktene 1 til 11, ytterligere omfattende en 3' utranslatert region valgt fra gruppen bestående av den 3' utranslaterte regionen til Lactuca sative psbA-genet, tobakk psbA-genet eller tobakk rbcL-genet. 14. Vektor omfattende det rekombinante DNA-molekylet ifølge et hvilket som helst av punktene 1 til 13.
15. Vektoren ifølge punkt 14, hvori vektoren er en ekspresjonsvektor.
16. Vektoren ifølge punkt 14, hvori vektoren er en transformasjonsvektor.
17. Vektoren ifølge punkt 16, hvori vektoren er plastidtransformasjonsvektor for stabil transformasjon av et plastid. 18. Vektoren ifølge et hvilket som helst av punktene 14 til 17, ytterligere omfattende en første flankerende DNA-sekvens og andre flankerende DNA-sekvens, der hver er homolog med sekvenser i en spacerregion til plastidets genom.
19. Vektoren ifølge punkt 18, hvori spacerregionen er en transkripsjonelt aktiv spacerregion.
20. Vektoren ifølge punkt 18, hvori spacerregionen er spacerregionen mellom trnl og trnA kodingssekvenser i plastidgenomet. 21. Vektoren ifølge et hvilket som helst av punktene 18 til 20, hvori den første flankerende DNA-sekvensen er homolog med trnl kodingssekvensen, og den andre flankerende DNA-sekvensen er homolog med trnA kodingssekvensen i plastidgenomet. 22. Vektoren ifølge et hvilket som helst av punktene 14 til 21, hvori vektoren omfatter, som operasjonelt forbundne komponenter anordnet i 5' til 3'-retningen, den første flankerende DNA-sekvensen, promoteren, den 5' utranslaterte regionen, nukleotidsekvensen som koder for polyproteinet, den 3' utranslaterte regionen og den andre flankerende DNA-sekvensen. 23. Transgent plastid omfattende et rekombinant DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av punktene 1 til 13. 24. Plastidet ifølge punkt 23, hvori plastidet er valgt fra gruppen bestående av kloroplast, kromoplast, gerentoplast, etioplast, leukoplast.
25. Plastidet ifølge punkt 24, hvori leukoplasten er en amyloplast, proteinoplast eller elaioplast.
26. Plastidet ifølge et hvilket som helst av punktene 23 til 25, hvori plastidet er avledet fra en plante eller plantecelle i/Asteraceae-familien. 27. Plastidet ifølge et hvilket som helst av punktene 23 til 26, hvori plastidet er avledet fra en plante eller plantecelle i Lacfrvca-slekten. 28. Plastidet ifølge et hvilket som helst av punktene 23 til 27, hvori plastidet er avledet fra en Lactuca saf/Va-plante eller -celle. 29. Transgen plantecelle omfattende et rekombinant DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av punktene 1 til 13. 30. Den transgene plantecellen ifølge punkt 29, hvori det rekombinante DNA-molekylet er stabilt integrert i et plantecellegenom. 31. Den transgene plantecellen ifølge punkt 29, hvori det rekombinante DNA-molekylet er stabilt integrert i genomet til et plantecelleplastid. 32. Den transgene plantecellen ifølge punkt 29, hvori det rekombinante DNA-molekylet er stabilt integrert i et kromosom i en plantecellekjerne. 33. Den transgene plantecellen ifølge et hvilket som helst av punktene 29 til 32, hvori plantecellen er del av en transgen plante. 34. Den transgene plantecellen ifølge et hvilket som helst av punktene 29 til 32, hvori plantecellen er i et plantefrø. 35. Den transgene plantecellen ifølge et hvilket som helst av punktene 29 til 34, hvori plantecellen er en celle i /Asteraceae-familien. 36. Den transgene plantecellen ifølge et hvilket som helst av punktene 29 til 35, hvori plantecellen er en celle i Lacfrvca-slekten. 37. Den transgene plantecellen ifølge et hvilket som helst av punktene 29 til 36, hvori plantecellen er en Lactuca saf/Va-celle.
38. Transgen plantecelle omfattende plastidet ifølge et hvilket som helst av punktene 23 til 28.
39. Transgen plante eller transgen del av planten omfattende et rekombinant DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av punktene 1 til 13. 40. Den transgene planten eller transgen del av planten ifølge punkt 39, hvori det rekombinante DNA-molekylet er stabilt integrert i et plantecellegenom. 41. Den transgene planten eller transgen del av planten ifølge punkt 39, hvori det rekombinante DNA-molekylet er stabilt integrert i genomet til et plantecelleplastid. 42. Den transgene planten eller transgen del av planten ifølge punkt 39, hvori det rekombinante DNA-molekylet er stabilt integrert i et kromosom i en plantecellekjerne. 43. Transgen plante eller transgen del av planten omfattende en flerhet planteceller ifølge et hvilket som helst av punktene 29 til 38. 44. Den transgene planten eller transgen del av planten ifølge et hvilket som helst av punktene 39 til 43, som er homogen for det rekombinante DNA-molekylet. 45. Den transgene planten eller transgen del av planten ifølge et hvilket som helst av punktene 39 til 44, hvori planten er en plante i /Asteraceae-familien. 46. Den transgene planten eller transgen del av planten ifølge et hvilket som helst av punktene 39 til 45, hvori planten er en plante i Lacfrvca-slekten. 47. Den transgene planten eller transgen del av planten ifølge et hvilket som helst av punktene 39 til 46, hvori planten er en Lactuca saf/Va-plante. 48. Den transgene plantecellen, transgen plante eller transgen del av planten ifølge et hvilket som helst av punktene 29 til 47 for bruk i vaksinasjon av et individ mot denguevirus. 49. Transgent frø omfattende et rekombinant DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av punktene 1 til 13. 50. Transgent frø omfattende en flerhet planteceller ifølge et hvilket som helst av punktene 29 til 38. 51. Det transgene frøet ifølge krav 49 eller 50, hvori frøet er avledet fra den transgene planten ifølge et hvilket som helst av punktene 39 til 47.
52. Fremgangsmåte for å fremstille et transgent plastid omfattende trinnene med:
å føre inn et rekombinant DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av punktene 1 til 13 eller en vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 14 til 21 i et plastid. 53. Fremgangsmåten ifølge punkt 52, hvori plastidet er valgt fra gruppen bestående av kloroplast, kromoplast, gerentoplast, etioplast, leukoplast. 54. Fremgangsmåten ifølge punkt 52 eller 53, ytterligere omfattende trinnet med å dyrke det transgene plastidet. 55. Fremgangsmåte for å fremstille en plantecelle, en transgen plante eller en transgen plantedel omfattende trinnene med: å føre inn et rekombinant DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av punktene 1 til 13 eller en vektor ifølge et hvilket som helst av punktene 14 til 21 i en plantecelle, en plante eller plantedel. 56. Fremgangsmåten ifølge punkt 55, ytterligere omfattende trinnet med å dyrke den transgene plantecellen, den transgene planten eller den transgene plantedelen. 57. Fremgangsmåten ifølge punkt 55 eller 56, ytterligere omfattende å regenerere en transgen plante fra den transgene plantecellen. 58. Fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av punktene 55 til 57, ytterligere omfattende å høste frø fra den transgene planten.
59. Fremgangsmåte for å fremstille en transgen plante omfattende trinnene med:
(a) å plante et transgent frø ifølge et hvilket som helst av punktene 49 til 51; og
(b) å dyrke en plante fra frøet.
60. Fremgangsmåte for å fremstille et tetravalent kimært denguevirusantigen omfattende trinnene med: å fremstille en transgen plante omfattende et rekombinant DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av punktene 1 til 13; og
å inkubere planten under betingelser hvori planten uttrykker antigenet.
61. Vaksine omfattende en transgen plantecelle, en transgen plante eller en transgen del av planten ifølge et hvilket som helst av punktene 29 til 47, eventuelt sammen med én eller flere farmasøytisk akseptable eksipienter. 62. Vaksinen ifølge punkt 61, hvori den transgene planten eller den transgene delen av planten er formulert i vaksinen i en ubearbeidet eller prosessert form. 63. Vaksinen ifølge punkt 61 eller 62, hvori vaksinen er i stand til å fremkalle en immunrespons ved administrering til et individ. 64. Vaksinen ifølge et hvilket som helst av punktene 61 til 63, hvori vaksinen kan administreres oralt. 65. Vaksinen ifølge et hvilket som helst av punktene 61 til 64 for bruk i vaksinasjon av et individ mot denguevirus.
66. Vaksinen ifølge punkt 65, hvori individet er et pattedyr.
67. Vaksinen ifølge punkt 65 eller 66, hvori individet er et menneske.
68. Fremgangsmåte for å fremstille en vaksine omfattende trinnene med:
a) å fremstille en transgen plantecelle, en transgen plante eller en transgen del av planten omfattende et rekombinant DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av punktene 1 til 13; a) å inkubere den transgene plantecellen, den transgene planten eller den transgene delen av planten under betingelser hvori plantecellen, planten eller den delen av planten uttrykker polyproteinet kodet av det
rekombinante DNA-molekylet;
c) å høste den transgene plantecellen, den transgene planten eller den transgene delen av planten; og
d) å formulere den transgene plantecellen, den transgene planten eller den transgene delen av planten i en
vaksine, eventuelt sammen med én eller flere farmasøytisk akseptable eksipienter.
69. Fremgangsmåten ifølge punkt 68, hvori den transgene plantecellen, den transgene planten eller den transgene delen av planten formuleres i sin ubehandlede form. 70. Fremgangsmåten ifølge punkt 68, hvori den transgene plantecellen, den transgene planten eller den transgene delen av planten formuleres i en prosessert form. 71. Fremgangsmåten ifølge punkt 70, hvori den prosesserte formen er en ekstrakt av den transgene plantecellen eller den transgene delen av planten. 72. Vaksinen ifølge et hvilket som helst av punktene 68 til 71, hvori vaksinen er i stand til å fremkalle en immunrespons ved administrering til et individ. 73. Fremgangsmåte for vaksinasjon av et individ mot denguevirus, der fremgangsmåten omfatter trinnene med: å administrere en effektiv mengde av vaksinen ifølge et hvilket som helst av punktene 61 til 67 til et individ. 74. Bruk av en transgen plantecelle, en transgen plante eller en transgen del av planten ifølge et hvilket som helst av punktene 29 til 47 i fremstillingen av et medisinsk produkt for vaksinasjon av et individ mot denguevirus. 75. Isolert nukleinsyremolekyl omfattende nukleotidsekvensene angitt i SEQ ID NO: 7, 8, 9 og 10, eller nukleotidsekvenser som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med disse.

Claims (43)

1. Transgent plastid avledet fra en plantecelle i Asferaceae-familien,karakterisert vedat den omfatter et rekombinant DNA-molekyl omfattende en promoter som er funksjonell i en plantecelle i Asferaceae-familien, for å bevirke produksjon av et mRNA-molekyl, og som er operativt forbundet med en nukleotidsekvens som koder for et polyprotein omfattende det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 1 (EDIII-1) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 2 (EDIII-2) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 3 (EDIII-3) eller en variant derav, og det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 4 (EDIII-4) eller en variant derav.
2. Transgene plastide ifølge krav 1,karakterisert vedat EDIII-1 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 1, EDIII-2 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 2, EDIII omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 3, og EDIII-4 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 4.
3. Transgent plastid i følge krav 1 eller 2,karakterisert vedat det rekombinante DNA-molekylet, varianten av EDIII-1 omfatter en aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 1, varianten av EDIII-2 omfatteren aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 2, varianten av EDIII-3 omfatter en aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 3, og varianten av EDIII-4 omfatter en aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 4.
4. Transgent plastid i følge et hvilket som helst av kravene 1 til 3,karakterisert vedat det rekombinante DNA-molekylet koder for polyproteinet som omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 5, eller en aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 5.
5. Transgent plastid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4,karakterisert vedat plastidet er en kloroplast.
6. Transgent plastid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5,karakterisert vedat plastidet er avledet fra en Lactuca saf/Va-plante eller -celle.
7. Transgen plantecelle avledet fra Asferaceae-familienkarakterisert vedat den omfatter et rekombinant DNA-molekyl omfattende en promoter som er funksjonell i en plantecelle i Asteraceae- familien for å bevirke produksjon av et mRNA-molekyl, og som er operativt forbundet med en nukleotidsekvens som koder for et polyprotein omfattende det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 1 (EDIII-1) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 2 (EDIII-2) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue-(DEN-)virusserotype 3 (EDIII-3) eller en variant derav, og det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 4 (EDIII-4) eller en variant derav.
8. Transgen plantecelle i følge krav 7,karakterisert vedat det rekombinante DNA-molekylet, hvori varianten av EDIII-1 omfatter en aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 1, varianten av EDIII-2 omfatteren aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 2, varianten av EDIII-3 omfatter en aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 3, og varianten av EDIII-4 omfatter en aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 4.
9. Transgen plantecelle i følge krav 7 eller 8,karakterisert vedat det rekombinante DNA-molekylet koder for polyproteinet som omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 5, eller en aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 5.
10. Transgen plantecelle ifølge et hvilket som helst av kravene kravene 7 til 9,karakterisert vedat EDIII-1 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 1, EDIII-2 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 2, EDIII omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 3, og EDIII-4 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 4.
11. Transgen plantecelle ifølge et hvilket som helst av kravene 7 til 10,karakterisert vedat det rekombinante DNA-molekylet er stabilt integrert i et plantecellegenom.
12. Transgen plantecelle ifølge et hvilket som helst av kravene 7 til 11,karakterisert vedat det rekombinante DNA-molekylet er stabilt integrert i genomet til et plantecelleplastid.
13. Transgen plantecelle ifølge et hvilket som helst av kravene 7 til 12karakterisert vedat plantecellen er enLactuca saf/Va-celle.
14. Transgen plante i Asteraceae-familien eller transgen del av plantenkarakterisert vedat den omfatter et rekombinant DNA-molekyl omfattende en promoter som er funksjonell i en plantecelle i Asferaceae-familien for å bevirke produksjon av et mRNA-molekyl, og som er operativt forbundet med en nukleotidsekvens som koder for et polyprotein omfattende det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 1 (EDIII-1) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 2 (EDIII-2) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 3 (EDIII-3) eller en variant derav, og det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 4 (EDIII-4) eller en variant derav.
15. Transgen plante eller transgen del av planten ifølge krav 14,karakterisert vedat EDIII-1 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 1, EDIII-2 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 2, EDIII omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 3, og EDIII-4 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 4.
16. Transgen plante i følge krav 14 eller 15,karakterisert vedat det rekombinante DNA-molekylet, hvori varianten av EDIII-1 omfatter en aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 1, varianten av EDIII-2 omfatteren aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 2, varianten av EDIII-3 omfatteren aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 3, og varianten av EDIII-4 omfatter en aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 4.
17. Transgen plante i følge et hvilket som helst av kravene 14 til 16,karakterisert vedat det rekombinante DNA-molekylet koder for polyproteinet som omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 5, eller en aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 5.
18. Transgen plante eller transgen del av planten ifølge et hvilket som helst av kravene 14 til 17,karakterisert vedat det rekombinante DNA-molekylet er stabilt integrert i et plantecellegenom.
19. Transgen plante eller transgen del av planten ifølge et hvilket som helst av kravene 14 til 18,karakterisert vedat det rekombinante DNA-molekylet er stabilt integrert i genomet til et plantecelleplastid.
20. Transgen plante eller transgen del av planten ifølge et hvilket som helst av kravene 14 til 19,karakterisert vedat planten er en Lactuca saf/Va-plante.
21. Transgen plantecelle, transgen plante eller transgen del av planten ifølge et hvilket som helst av kravene 7 til 20 for bruk i vaksinasjon av et individ mot denguevirus.
22. Transgen plantecelle, transgen plante eller transgen del av planten ifølge krav 21, for bruk i vaksinasjon av et individ der individet er et menneske.
23. Transgent frø avledet fra en plante eller plantecelle i Asferaceae-familienkarakterisert vedat det omfatter et rekombinant DNA-molekyl omfattende en promoter som er funksjonell i en plantecelle i Asferaceae-familien til å bevirke produksjon av et mRNA-molekyl, og som er operativt forbundet med en nukleotidsekvens som koder for et polyprotein omfattende det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 1 (EDIII-1) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 2 (EDIII-2) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 3 (EDIII-3) eller en variant derav, og det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 4 (EDIII-4) eller en variant derav.
24. Transgent frø ifølge krav 23,karakterisert vedat EDIII-1 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 1, EDIII-2 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 2, EDIII omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 3, og EDIII-4 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 4.
25. Transgent frø i følge krav 24,karakterisert vedat det rekombinante DNA-molekylet, hvori varianten av EDIII-1 omfatter en aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 1, varianten av EDIII-2 omfatteren aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 2, varianten av EDIII-3 omfatter en aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 3, og varianten av EDIII-4 omfatter en aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 4.
26. Transgent frø i følge et hvilket som helst av kravene 23 til 25,karakterisert vedat det rekombinante DNA-molekylet koder for polyproteinet som omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 5, eller en aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 5.
27. Transgent frø ifølge et hvilket som helst av kravene 23 til 26,karakterisert vedat frøet er avledet fra en Lactuca saf/Va-plante.
28. Rekombinant DNA-molekylkarakterisert vedat den omfatter en promoter som er funksjonell i en plantecelle fra Asteraceae-familien for å bevirke produksjon av et mRNA-molekyl, og som er operativt forbundet med en nukleotidsekvens som koder for et polyprotein omfattende det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 1 (EDIII-1) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue-(DEN-)virusserotype 2 (EDIII-2) eller en variant derav, det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 3 (EDIII-3) eller en variant derav, og det immunoglobulinlignende domenet til kappe- (E-)proteinet til dengue- (DEN-)virusserotype 4 (EDIII-4) eller en variant derav.
29. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 28,karakterisert vedat EDIII-1 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 1, EDIII-2 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 2, EDIII omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 3, og EDIII-4 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 4.
30. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 28 eller 29,karakterisert vedat varianten av EDIII-1 omfatter en aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 1, varianten av EDIII-2 omfatter en aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 2, varianten av EDIII-3 omfatter en aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 3, og varianten av EDIII-4 omfatter en aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 4.
31. Rekombinant DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 28 til 30,karakterisert vedat tilstøtende EDIII-er er forbundet med linkere.
32. Rekombinant DNA-molekylet ifølge et hvilket som helst av kravene 28 til 31,karakterisert vedat polyproteinet omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 5, eller en aminosyresekvens som har minst ca. 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 5.
33. Rekombinant DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 28 til 32,karakterisert vedat det omfatter en promoter som er funksjonell i en plantecelle fra Asferaceae-familien.
34. Rekombinant DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 28 til 33,karakterisert vedat promoteren er Lactuca sativa psbA-promoteren eller tobakk psbA-promoteren.
35. Vektorkarakterisert vedat den omfatter det rekombinante DNA-molekylet ifølge et hvilket som helst av kravene 28 til 34.
36. Vektor ifølge krav 35,karakterisert vedat vektoren er en ekspresjonsvektor.
37. Vektor ifølge krav 35,karakterisert vedat vektoren er en transformasjonsvektor.
38. Vektor ifølge krav 37,karakterisert vedat vektoren er en plastidtransformasjonsvektor for stabil transformasjon av et plastid.
39. Vaksinekarakterisert vedat den omfatter en transgen plantecelle, en transgen plante eller en transgen del av planten ifølge et hvilket som helst av kravene 7 til 22, eventuelt sammen med én eller flere farmasøytisk akseptable eksipienter.
40. Vaksine ifølge krav 39,karakterisert vedat vaksinen kan administreres oralt.
41. Vaksine ifølge krav 39 til 41 for bruk i vaksinasjon av et individ mot denguevirus.
42. Vaksinen ifølge krav 41, hvori individet er et menneske.
43. Transgen plantecelle, en transgen plante eller en transgen del av planten ifølge et hvilket som helst av kravene 7 til 22 for bruk i fremstillingen av et medisinsk produkt for vaksinasjon av et individ mot denguevirus.
NO20140819A 2014-06-27 2014-06-27 Transgene planter som uttrykker et rekombinant tetravalent kimært denguevirusantigen for å fremstille effektive vaksiner avledet derfra, samt transgent plastid, plantecelle og frø, rekombinant DNA molekyl, vektor, fremgangsmåter for fremstilling og anvendelse derav NO340722B1 (no)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NO20140819A NO340722B1 (no) 2014-06-27 2014-06-27 Transgene planter som uttrykker et rekombinant tetravalent kimært denguevirusantigen for å fremstille effektive vaksiner avledet derfra, samt transgent plastid, plantecelle og frø, rekombinant DNA molekyl, vektor, fremgangsmåter for fremstilling og anvendelse derav
US15/321,362 US20170136115A1 (en) 2014-06-27 2015-06-29 Transgenic plants expressing a tetravalent chimeric dengue virus antigen to produce effective vaccines derived therefrom
PCT/NO2015/050120 WO2015199551A1 (en) 2014-06-27 2015-06-29 Transgenic plants expressing a tetravalent chimeric dengue virus antigen to produce effective vaccines derived therefrom
EP15811403.3A EP3161141A4 (en) 2014-06-27 2015-06-29 Transgenic plants expressing a tetravalent chimeric dengue virus antigen to produce effective vaccines derived therefrom

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NO20140819A NO340722B1 (no) 2014-06-27 2014-06-27 Transgene planter som uttrykker et rekombinant tetravalent kimært denguevirusantigen for å fremstille effektive vaksiner avledet derfra, samt transgent plastid, plantecelle og frø, rekombinant DNA molekyl, vektor, fremgangsmåter for fremstilling og anvendelse derav

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20140819A1 NO20140819A1 (no) 2015-12-28
NO340722B1 true NO340722B1 (no) 2017-06-06

Family

ID=54938518

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20140819A NO340722B1 (no) 2014-06-27 2014-06-27 Transgene planter som uttrykker et rekombinant tetravalent kimært denguevirusantigen for å fremstille effektive vaksiner avledet derfra, samt transgent plastid, plantecelle og frø, rekombinant DNA molekyl, vektor, fremgangsmåter for fremstilling og anvendelse derav

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20170136115A1 (no)
EP (1) EP3161141A4 (no)
NO (1) NO340722B1 (no)
WO (1) WO2015199551A1 (no)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111062594A (zh) * 2019-12-06 2020-04-24 北京百分点信息科技有限公司 一种供应商运营能力的评估方法、装置和电子设备

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100218277A1 (en) * 2002-08-08 2010-08-26 Cecilia Lucia Clara Lelivelt Method of plastid transformation in asteraceae, vector for use therein and plants thus obtained
US20120039937A1 (en) * 2006-11-09 2012-02-16 Monika Simmons Induction of an immune response against dengue virus using the prime-boost approach
US20130011433A1 (en) * 2002-05-03 2013-01-10 The Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Dengue tetravalent vaccine containing a common 30 nucleotide deletion in the 3'-utr of dengue types 1, 2, 3, and 4, or antigenic chimeric dengue viruses 1, 2, 3, and 4
US20130095136A1 (en) * 2002-05-31 2013-04-18 Sanofi Pasteur Biologics, Llc Tetravalent Dengue Vaccines
US20130295162A1 (en) * 2010-10-01 2013-11-07 University Of Rochester Flavivirus domain iii vaccine
US20140286983A1 (en) * 2011-10-20 2014-09-25 The Government of the USA as represented by the Secretaryof the Dept. of Health and Human Services Dengue virus e-glycoprotein polypeptides containing mutations that eliminate immunodominant cross-reactive epitopes

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007034507A2 (en) * 2005-09-20 2007-03-29 International Centre For Genetic Engineering And Biotechnology Tetravalent dengue specific domain iii based chimeric recombinant protein
CN101308138B (zh) * 2007-05-15 2012-09-19 广东省疾病预防控制中心 登革病毒IgM抗体酶联免疫诊断试剂盒
WO2008152652A2 (en) * 2007-06-12 2008-12-18 International Centre For Genetic Engineering And Biotechnology A dengue envelope domain iii-based tetravalent protein vaccine
KR101686942B1 (ko) * 2008-01-11 2016-12-28 이노비오 파마수티컬즈, 인크. 뎅기 바이러스 다중 서브타입에 대항하는 신규한 백신
US9821050B2 (en) * 2012-04-02 2017-11-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Chimeric dengue virus E glycoproteins comprising mutant domain I and domain II hinge regions

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130011433A1 (en) * 2002-05-03 2013-01-10 The Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Dengue tetravalent vaccine containing a common 30 nucleotide deletion in the 3'-utr of dengue types 1, 2, 3, and 4, or antigenic chimeric dengue viruses 1, 2, 3, and 4
US20130095136A1 (en) * 2002-05-31 2013-04-18 Sanofi Pasteur Biologics, Llc Tetravalent Dengue Vaccines
US20100218277A1 (en) * 2002-08-08 2010-08-26 Cecilia Lucia Clara Lelivelt Method of plastid transformation in asteraceae, vector for use therein and plants thus obtained
US20120039937A1 (en) * 2006-11-09 2012-02-16 Monika Simmons Induction of an immune response against dengue virus using the prime-boost approach
US20130295162A1 (en) * 2010-10-01 2013-11-07 University Of Rochester Flavivirus domain iii vaccine
US20140286983A1 (en) * 2011-10-20 2014-09-25 The Government of the USA as represented by the Secretaryof the Dept. of Health and Human Services Dengue virus e-glycoprotein polypeptides containing mutations that eliminate immunodominant cross-reactive epitopes

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Kanagaraj A.P et al. Expression of dengue-3 premembrn and envelope polypeptide in lettuce chloroplast. Plant Mol Biol. 2011, Vol. 76, side 323-333., Dated: 01.01.0001 *
Kim T-G et al. M cell-targeting ligand and consensus dengue virus envelope protein domain III fusion protein production in transgenic rice calli. Mol Biotechnol. 2013, Vol. 54, side 880-887., Dated: 01.01.0001 *
Maldaner R.F. et al: Dengue virus tetra-epitope peptide expressed in lettuce chloroplast for potential use in dengue diagnosis. Appl Microbiol biotechnol. 2013, Vol. 97, side 5721-5729., Dated: 01.01.0001 *
Saejung W. et al. Production of dengue 2 envelope domain III in plant using TMV-based vector system. Vaccine. 2007, Vol. 25, side 6646-6654., Dated: 01.01.0001 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2015199551A1 (en) 2015-12-30
EP3161141A1 (en) 2017-05-03
NO20140819A1 (no) 2015-12-28
US20170136115A1 (en) 2017-05-18
EP3161141A4 (en) 2017-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ruhlman et al. Complete plastid genome sequence of Daucus carota: implications for biotechnology and phylogeny of angiosperms
EP2374892B1 (en) Expression of viral proteins in plants
Yusibov et al. Plant viral vectors based on tobamoviruses
Gorantala et al. Generation of protective immune response against anthrax by oral immunization with protective antigen plant-based vaccine
ES2502415T3 (es) Protección de proteínas KRP mutantes negativas dominantes contra la inhibición activa del complejo ciclina-CDK por parte de KRP de tipo salvaje
JP2001500487A (ja) 植物ウイルスコートタンパク質と融合したポリペプチド
KR20060035596A (ko) 외래유전자도입 식물로부터 유래된 면역보호성 조성물을제조하기 위한 벡터와 세포
JP2009526526A (ja) インフルエンザ抗原、ワクチン組成物、および関連する方法
US7879338B2 (en) Vectors and methods for immunization against norovirus using transgenic plants
Rosales-Mendoza et al. Transgenic carrot tap roots expressing an immunogenic F1–V fusion protein from Yersinia pestis are immunogenic in mice
Shahid et al. Early stage development of a Newcastle disease vaccine candidate in corn
CN116218900A (zh) 增加植物中病毒样颗粒的产率
US11566255B2 (en) Expression of PEDV sequences in plants and plant produced vaccine for same
WO2017128791A1 (zh) 基因组合及其用途
JP5008811B2 (ja) ライノウイルス感染を防止するための免疫接着物
WO2016044909A1 (pt) Metodo para transformar uma celula de planta ou tecido de planta usando agrobacterium, planta transgenica, celula transgenica ou tecido transgenico, meio de cultura, e, uso de um metodo para transformar uma celula de planta ou tecido de planta.
Rosales-Mendoza et al. Transplastomic plants yield a multicomponent vaccine against cysticercosis
JP4847016B2 (ja) 植物によって発現される組換えタンパク質による魚の免疫化
NO340722B1 (no) Transgene planter som uttrykker et rekombinant tetravalent kimært denguevirusantigen for å fremstille effektive vaksiner avledet derfra, samt transgent plastid, plantecelle og frø, rekombinant DNA molekyl, vektor, fremgangsmåter for fremstilling og anvendelse derav
US20100003269A1 (en) Methods and uses of cauliflower and collard for recombinant protein production
Mbewana Development of Rift Valley fever virus candidate vaccines and reagents produced in Nicotiana benthamiana
Yiu et al. Immunogenicity of a lettuce-derived vaccine candidate expressing the E2 protein against classical swine fever virus
US20230002780A1 (en) EXPRESSION OF SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS 2 (SARS-CoV-2) SPIKE PROTEIN SEQUENCES IN PLANTS AND PLANT PRODUCED VACCINE FOR SAME
MXPA01009823A (es) Vectores virales de insectos y usos de los mismos.
CN117003886A (zh) 一种利用表达o157:h7抗原的转基因生菜研制的口服疫苗

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees