CN117003886A - 一种利用表达o157:h7抗原的转基因生菜研制的口服疫苗 - Google Patents

一种利用表达o157:h7抗原的转基因生菜研制的口服疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了一种利用表达O157:H7抗原的转基因生菜研制的口服疫苗，具体公开了一种重组蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列为a)或b)：a):SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:7所示；b):a)所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列。本发明提供了将抗原EspB和γ‑intimin亚型羧基端280个氨基酸片段(IntC280)与FLAG标签整合重组得到重组蛋白，该重组蛋白可在生菜稳定表达，以制备EHEC O157:H7口服疫苗。

Description

一种利用表达O157:H7抗原的转基因生菜研制的口服疫苗
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种利用表达O157:H7抗原的转基因生菜研制的口服疫苗。
背景技术
出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC)能产生毒力较强的志贺毒素(Shiga toxins，Stxs)，导致人患上腹泻、出血性结肠炎，引发溶血性尿毒综合症等症状。EHEC是一种食源性致病菌，其宿主是以牛为主的反刍动物。该细菌优先定植于动物的直肠-肛门交界处，并随着粪便排放到环境中，通过污染食物和水而进入人类食物链，从而感染人类。EHEC中对人类影响最大的血清型是O157:H7。至今为止，对EHEC O157:H7的感染并没有针对性的治疗手段，主要采用保守性治疗方案，此外，由于使用抗生素会使病菌释放Stx而加重病情，所以不被提倡。为EHEC O157:H7的宿主-牛接种疫苗是降低O157:H7流行病发生的一个有效的方案。研究人员发现，如果给牛接种疫苗，它们所排放的粪便含有EHEC O157:H7的概率将减少50％，而人类感染该类菌的概率更减少85％。目前，可以商品化的疫苗共有EconicheTM和EpitopixTM两种牛用疫苗。然而，使用这些疫苗需要对牛进行每年3次的皮下注射，这意味着使用该疫苗，除了支付疫苗本身的费用外，还需花较多的费用以聘用专业人员进行注射。如此复杂的给药方式和高昂的应用成本使这些疫苗无法在市场销售。由此可见，方便和低成本的给药方式将有利于动物疫苗的市场化，而植物口服疫苗则是一个很好的选择。
植物口服疫苗是含有抗原蛋白且可以直接口服的植物组织。与传统疫苗相比，利用转基因植物制造口服疫苗具有低成本，给药方便，容易大规模生产、储存和分销等优点。与利用动物细胞生产的方法相比，用植物细胞生产抗原可以排除药物被动物病原体污染的可能性。此外，众多研究表明，植物组织还具有很多其他优良的特性，使它们非常适合用作疫苗生产的载体。例如，植物细胞壁具有生物胶囊的作用，能避免抗原蛋白提前变性或降解；植物化合物具有助剂性和粘附性，能提高口服疫苗的效力等。
EHEC O157:H7中的分泌效应蛋白Esp、细菌粘附素intimin及粘附素转位受体Tir等多个毒力因子都能够诱导动物或人的免疫反应，以预防细菌定植。更有报道指出，如果给处于妊娠期的动物接种EspB或者intimin，能诱导出大量可通过乳汁传递给初生儿的特异性抗原。因此，接种EspB和/或intimin抗原不但能直接保护受接种的动物和人类，而且能诱导乳汁中免疫蛋白的产生，进而保护新生儿。另外，含有免疫蛋白的乳汁还能加工为儿童的配方奶粉。
与注射免疫相比，口服免疫通常需要更大的剂量来激活有效的免疫反应。因此，目前对植物疫苗的研究主要集中于如何在植物宿主中实现抗原的高产和稳产。已有研究成果的大多数都是利用烟草表达抗原蛋白。然而，烟草不是一种粮食作物，如果用它作为口服药物的生产载体，必须去除尼古丁等有害的代谢产物，这样一来便增加了口服疫苗的生产成本。最近也有研究人员利用油菜籽作为生产载体表达EHEC O157:H7抗原。实验证明给小鼠饲喂油菜籽粉可以有效免疫小鼠。可是，油菜是一种非常容易杂交的大田作物，若将药用的转基因植株种植于大田则容易造成基因漂移，污染非转基因油菜作物。该风险的存在可能会影响监管部门对口服疫苗的批准。
相比之下，利用生菜作为表达寄主具有众多优势。(1)具有较高营养价值且可直接食用，(2)容易在温室中大规模种植且生物量大，(3)不是异型杂交作物(杂交率<0.5％)，(4)可制成能在室温下稳定储存的冻干品。据了解，第一个利用生菜生产EHEC O157:H7抗原(EspA，III型分泌系统的分泌因子)的研究是利用瞬时表达完成的。小鼠取食这些瞬时表达的生菜组织后，可以诱导特异性抗体和多克隆抗血清的产生，体外试验表明，这些物质能防止EHEC O157:H7诱导Hela细胞肌动蛋白聚合变化，进而阻止病原菌侵入。但是该研究具有一定的应用局限性，例如生菜中含有活的农杆菌(其本身就是一种植物病原物)，载体中具有抗卡那霉素的筛选基因等，这些因素都会引起安全问题，妨碍监管部门对该药物的批准。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种重组蛋白质。
本发明第二方面的目的，在于提供编码本发明第一方面的重组蛋白质的核酸分子。
本发明第三方面的目的，在于提供与本发明第二方面的核酸分子相关的生物材料。
本发明第四方面的目的，在于提供一种重组表达载体。
本发明第五方面的目的，在于提供本发明第一方面的重组蛋白质、本发明第二方面的核酸分子、本发明第三方面的生物材料和/或本发明第四方面的重组表达载体在制备预防或治疗EHEC O157:H7的疫苗中的应用。
本发明第六方面的目的，在于提供一种疫苗。
本发明第七方面的目的，在于提供一种产品。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明第一个方面，在于提供一种重组蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列为a)或b)：
a):SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:7所示；
b):a)所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列。
优选地，所述蛋白质的氨基酸序列还可为与a)或b)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上或者90％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列。
本发明第二个方面，在于提供编码本发明第一方面的重组蛋白质的核酸分子。
优选地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示。
本发明第三个方面，在于提供与本发明第二方面的核酸分子相关的生物材料，所述生物材料包括(1)和/或(2)：
(1)表达盒，含有本发明第二方面的核酸分子；
(2)重组细胞，含有本发明第二方面的核酸分子或(1)中表达盒。
本发明第四个方面，在于提供一种重组表达载体，含有本发明第二方面的核酸分子或本发明第三方面的表达盒。
优选地，所述重组表达载体还包括绿色荧光蛋白标记基因和抗卡那霉素的新霉素磷酸转移酶筛选基因；和/或，所述重组表达载体还包括RS2、attP和lox。
优选地，所述绿色荧光蛋白标记基因(gfp)和抗卡那霉素的新霉素磷酸转移酶筛选基因(npt)的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:33～SEQ ID NO:34所示。
优选地，所述gfp的控制元件为甘蔗杆状病毒(ScBV)启动子和章鱼碱合成酶基因(ocs)终止子。
优选地，所述npt的控制元件为胭脂碱合成酶基因(nos)启动子和花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus，CaMV)35S终止子
优选地，所述核酸分子表达的控制原件为生菜泛素启动子和生菜泛素终止子。
优选地，所述生菜泛素启动子和生菜泛素终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO:13～SEQ ID NO:14所示。
优选地，编码所述gfp和npt基因片段的两旁的两个同向的lox。
优选地，在所述核酸分子旁边含有一个attP。
优选地，所述重组表达载体的T-DNA从左边界到右边界之间的片段加入了一对Acetinetobacter质粒中能被重组酶CinH识别的同向的RS2重组位点。
优选地，所述重组表达载体的attP和RS2之间具有一个与gfp和npt基因片段两旁的lox反向的lox。
本发明第五个方面，在于提供本发明第一方面的重组蛋白质、本发明第二方面的核酸分子、本发明第三方面的生物材料和/或本发明第四方面的重组表达载体在制备预防或治疗EHEC O157:H7的疫苗中的应用。
本发明第六个方面，在于提供一种疫苗，本发明第一方面的重组蛋白质、本发明第二方面的核酸分子、本发明第三方面的生物材料和/或本发明第四方面的重组表达载体。
优选地，所述疫苗是采用农杆菌介导法将本发明第一方面的重组蛋白质、本发明第二方面的核酸分子、本发明第三方面的生物材料和/或本发明第四方面的重组表达载体整合到植物外植体中得到。
优选地，所述植物为生菜。
优选地，所述生菜包括美国大速生菜和/或飞翔100。
本发明第六个方面，在于提供一种产品，包含本发明第一方面的重组蛋白质、本发明第二方面的核酸分子、本发明第三方面的生物材料、本发明第四方面的重组表达载体和/或本发明第五方面的疫苗。
优选地，所述产品的功能为(b1)～(b3)中的任一种：
(b1)预防或治疗EHEC O157:H7感染相关疾病；
(b2)引起粘膜免疫反应；
(b3)制备EHEC O157:H7抗体。
优选地，所述产品包括试剂和/或试剂盒。
优选地，所述产品为药物，进一步为疫苗。
本发明的有益效果是：
本发明提供了将抗原EspB和γ-intimin亚型羧基端280个氨基酸片段(IntC280)与FLAG标签(还可以包括豌豆二磷酸羧化酶/加氧酶叶绿体转运肽)整合重组得到重组蛋白，该重组蛋白可在生菜稳定表达，以制备EHEC O157:H7口服疫苗。
本发明利用生菜稳定表达抗原EspB和γ-intimin亚型羧基端280个氨基酸片段(IntC280)以研制EHEC O157:H7口服疫苗。为提高植物疫苗的环境生物安全性，在植物疫苗的设计上加入了可以删除抗性基因等非必须DNA片段的技术；为增加疫苗的可塑造性，在植物疫苗的设计上加入可以叠加或替换基因的重组技术，为研究成果能真正走上商品化铺垫。
具体的，本发明在抗性筛选基因和报告基因两边加入同向lox(locus of x-crossover)，这些重组位点可以被大肠杆菌噬菌体P1 Cre(control of recombination)重组酶识别并进行删除；T-DNA左、右边界之间加入能被解离酶CinH识别的一对Acetinetobacter质粒中的同向RS2重组位点。前人的研究表明，花粉特异表达CinH这个功能可以用于在花粉中表达ChiH解离酶可以删除T-DNA左右边界之间所有转基因序列，从而大大减少转基因逃逸事件。本发明所用载体还加入了可以被分枝杆菌噬菌体Bxb1整合酶识别的attP(attachment phage)片段，所以，本发明所获得的生菜植株可以通过用新的抗原基因替换旧基因，或定点整合其他抗原基因方法，把疫苗升级为效果更强或作用更广的疫苗。
过去研究表明，用肌肉注射的方法注入混有油性助剂的抗原EspB或IntC280，能使动物产生血清免疫反应。其产生的特异性IgG能渗出并到达肠道粘膜，进而减少接种动物中的EHEC O157:H7。以上信息说明了含有EspB或IntC280抗原的肌肉注射疫苗制剂的有效性。然而，在接种疫苗的动物中并没有检测到特异性IgA产生。本申请提供利用生菜表达EspB或IntC280研制的口服植物疫苗，可以有效预防或减少病原菌在动物中的定植，并降低病原物通过动物排泄物进入人类食物链的可能性。
附图说明
图1为pSY27、pSY28质粒的图谱。
图2为转化载体设计以及转基因植物检测；其中(a)～(f)分别为pSY25、pSY26、pSY27、pSY28、pSY29、pSY30的T-DNA，在载体T-DNA的左边界(LB)和右边界(RB)之间含有一个抗原基因(Tp-espB-FLAG、espB-FLAG、Tp-IntC280-FLAG或IntC280-FLAG)、筛选标记基因npt、报告基因gfp和重组位点lox、attP、RS2(插图图例含有标记)，除了用倒置字母表示的npt，其他基因的转录方向为左到右，洋红色的线表示用以斜体标出的引物对扩增出的PCR片段产物，蓝色线标识出用核酸内切酶酶切的DNA片段(片段大小的单位为kb)；(g)为用(a)～(f)中标示的引物对T0代植物进行PCR检测的情况；(h)为T1植株的southern blot结果；在(g)和(h)中，泳道M:DNA标记，单位为kb，泳道FWT和AWT分别为野生型飞翔100和美国大速生菜。
图3为农杆菌介导的生菜(飞翔100和美国大速生菜品种)转化流程。
图4为T1和T2植株中抗原基因的转录本表达情况，用参照基因Ubiquitin(UBQ)和18Sribosomal RNA 1(18S1)对抗原基因的表达水平进行标准化，生菜RNA样本提取于45天的植株的第一片完全展开的叶片，由于A29.7、F26.4、F26.5的T1代植株的可用株数只有2、1、2棵，所以除了这些株系，图中显示的其他株系的数据为3株转基因植物的平均值±标准误，FWT和AWT分别为飞翔100和美国大速生菜的野生型。
图5为不同转基因株系T2代植株中的重组蛋白检测结果；其中，(a)为anti-FLAG抗体检测总蛋白中的EspB-FLAG；(b)为anti-FLAG抗体检测总蛋白中的IntC280-FLAG；阳性对照为从E.coli BL21(DE3)表达产物中纯化的15ng EspB-FLAG或IntC280-FLAG，FWT和AWT分别为飞翔100和美国大速生菜的野生型。
图6为每个株系中EspB-FLAG或IntC280-FLAG的表达情况，图中显示的数据为3个植株样本的平均值±标准误，不同的字母表示组间有显著差异(p<0.05)(用IBM SPSSStatistics 20的Kruskal-Wallis H test进行显著性分析)。
图7为转基因生菜中的重组位点所能提供的基因叠加、基因替换和转基因删除策略；其中，(a)为生菜基因组中的pSY28 T-DNA的结构，经过Southern blot、PCR和测序验证，该结构完整且插入的拷贝数为单拷贝；Cre重组酶识别lox位点后可介导DNA重组并删除标记基因，产生如(b)所示的结构；整合酶Bxb1则能介导attP和attB位点之间的重组，将如另一抗原编码基因(图中显示为A基因)的新DNA，叠加到整合位点中(c)，产生(d)中所示的结构；或者，在整合载体(e)中再添加一个lox位点，Bxb1催化的反应将产生(f)中所示的结构，接着再利用Cre-lox对结构(d)和(f)进行另一轮重组，以删除可选择的标记，从而产生(g)和(h)中所示的无筛选标记结构；(g)和(h)中的最终产物分别是叠加在原始抗原基因旁边的新抗原基因A和替换了原始抗原基因的新抗原基因B；为降低转基因DNA漂移概率，(g)和(h)中RS2位点内部的DNA可以通过在花粉中特异表达的CinH重组酶删除，以产生(i)中所示的结构。
图8为重组位点序列，序列的范围用灰色横杠表示，pSY28载体的骨架序列用黑色字母显示，RS2、lox、attP序列分别用红色、黑色加粗和褐色的字母表示，pSY28表示pSY28质粒上的序列，而A28.1.10指在A28.1株系的T1代植株中克隆的序列。
图9为Tp-IntC280-FLAG基因的DNA序列，序列的范围用灰色横杠表示，Tp-IntC280-FLAG基因的DNA序列用橙色字母表示，绿色字母表示相对于载体上的相应序列，在植物中突变的碱基，pSY30表示在pSY30质粒中的序列而F30.1.3指在F30.1株系的T1代植株中克隆的序列。
图10为Tp-IntC280-FLAG基因的蛋白序列，绿色字母表示相对于载体上的相应序列，在植物中突变的者氨基酸。
图11为用牛的特异性抗体检测T3代植株的抗原重组蛋白，A27.3和A28.1的样品为用45天的T3代生菜第一片完全展开叶片组织提取的可溶性总蛋白，经过SDS-PAGE胶分离后，转到硝酸纤维素膜上，再用以EspB-His或IntC280-His免疫所得的anti-IntC280或anti-EspB牛血清作为一抗检测，二抗为羊抗牛的IgG-HRP，显色的反应底物为DAB，EspB-His和IntC280-His重组蛋白为纯化后的E.coli的抗原表达产物(阳性对照)，AWT为野生型美国大速生菜(阴性对照)。
图12为饲喂转基因生菜的小鼠的免疫反应；其中，(a)为小鼠实验的流程；(b)为小鼠的免疫反应，用Student’s T test进行显著性分析；(c)为用EHEC O157:H7 clade 8攻毒后小鼠粪便中的含菌量，在图(a)所示的第22天对用生菜免疫后的小鼠灌喂6×107CFU的抗链霉素的EHEC O157:H7，并于第23、25、27、29、30天(攻毒后的第1、3、5、7、8天)对每只小鼠的粪便进行收集并检测抗链霉素的EHEC O157:H7的含量，用Kruskal-Wallis H Test进行显著性分析；(d)为小鼠重量，用one-way ANOVA进行显著性分析发现，三组间没有显著性差异；图中，(b)～(d)图中数据所示为5只小鼠样品的平均值±标准差，*代表p＜0.05，**代表p＜0.01和***代表p＜0.001。
具体实施方式
现结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不限制本发明的范围。
本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。
实施例1载体的构建
为了选择更有效的抗原基因espB或IntC280表达方式，本申请设计两套启动子和终止子用于控制这两个基因的表达：P35S/Tnos(花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaicvirus，CaMV)35S启动子/农杆菌的胭脂碱合成酶基因(the nopaline synthase，nos)终止子)和Pubi/Tubi(生菜泛素启动子/终止子)。其中，本发明克隆所得的生菜泛素启动子序列与现有研究者(Hirai T,Shohael AM,Kim YW,Yano M,Ezura H(2011)Ubiquitinpromoter–terminator cassette promotes genetically stable expression of thetaste-modifying protein miraculin in transgenic lettuce.Plant Cell Reports 30(12):2255-2265)泛素启动子存在1个碱基的差异(第1311个碱基)，而生菜泛素终止子方面，与该研究者所用的终止子序列一致。为了方便蛋白的检测，在每个抗原基因3’端加入了编码FLAG标签的DNA。为提高蛋白在叶绿体的积累，在4个载体的基因序列的5’端加入豌豆二磷酸羧化酶/加氧酶叶绿体转运肽(chloroplast transit peptide of pea ribulosebisphosphate carboxylase oxygenase(Rubisco)，pea rbcs transit peptide)(Tp)的编码序列。
具体的，由生工生物工程股份有限公司(上海，中国)和金斯瑞生物科技有限公司(南京，中国)根据生菜密码子偏好性对EspB或IntC280与FLAG融合蛋白序列进行密码子优化以及核苷酸序列合成，优化后的EspB与FLAG融合蛋白序列(记为EspB-FLAG)的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，优化后的IntC280与FLAG融合蛋白序列(记为IntC280-FLAG)的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。为更有效地表达抗原基因，本申请设计了6个载体：pSY25～30。对于其中pSY25、pSY26、pSY29、pSY30的抗原基因编码的蛋白序列前加入了Tp编码序列，相关基因命名为Tp-espB-FLAG(氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)和Tp-IntC280-FLAG(氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示)。转运肽的序列由生工生物工程股份有限公司(上海，中国)根据生菜密码子的偏好性进行优化和合成。密码子优化主要包括以下3点：根据Codon usage database:http://www.kazusa.or.jp/codon/的生菜密码子使用频率调整基因序列密码子偏好性，提高翻译效率；调整GC含量增加mRNA的半衰期；去除或调整茎-环结构，重复序列和负顺式作用位点等，以便基因表达顺利进行。
pSY25和pSY26两个载体中的Tp-espB-FLAG和Tp-IntC280-FLAG的启动子、终止子分别为35S启动子和nos终止子(图2)。pSY27～pSY30表达载体中的抗原基因表达的控制元件为生菜泛素启动子(SEQ ID NO:13)和终止子(SEQ ID NO:14)，该启动子和终止子是根据研究人员Hirai等(Hirai T,Shohael AM,Kim YW,Yano M,Ezura H(2011)Ubiquitinpromoter–terminator cassette promotes genetically stable expression of thetaste-modifying protein miraculin in transgenic lettuce.Plant Cell Reports 30(12):2255-2265)报道的信息，分别用1a/1b和2a/2b引物(SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:12)对美国大速生菜基因组进行PCR扩增，产物连接于pMD-19T(Takara，中国)中，经测序验证(生工生物工程股份有限公司(上海，中国))。pSY25～30的转化载体均含有绿色荧光蛋白报告基因(green fluorescent protein(gfp)(enhanced version)和抗卡那霉素的新霉素磷酸转移酶筛选基因(neomycin phosphotransferase II，npt)(图2)，其核苷酸序列分别如SEQID NO:33～SEQ ID NO:34所示。gfp的控制元件为甘蔗杆状病毒(Sugarcane Bacilliformvirus，ScBV)启动子和章鱼碱合成酶基因(the octopine synthase，ocs)终止子。npt的控制元件为nos启动子和35S终止子。
为实现农杆菌介导的转化，将每一个编码抗原的DNA插入本实验室的叠加载体中，这些载体命名为pSY25～pSY30，其中，pSY27和pSY28的质粒图谱如图1所示。图2中(a)～(f)展示的是每个载体T-DNA从左边界到右边界的部分。每个载体都具有包含筛选标记npt和报告基因gfp的片段，这个片段两端为两个同向的lox位点。因此，未来将可通过导入Cre重组酶，把这两个同向的lox位点之间所含有的npt和gfp序列删除，从而剩下抗原基因两侧的两个反向的lox位点。因为Cre对反向的lox之间的片段所进行的重组只会形成倒置作用，所以抗原基因可以以任意方向继续留在基因组中。在抗原基因旁边的attP能被Bxb1整合酶识别，因此，以后可通过Bxb1介导的attP x attB位点特异性整合，加入一段含有attB的新的DNA。此外，T-DNA左边界和右边界之间的片段加入了一对能被重组酶CinH识别的同向的Acetinetobacter质粒中的RS2位点。这些RS2位点可以用于选择性地删除T-DNA左右边界之间的序列。当现实需要时，可在花粉中表达CinH重组酶以删除T-DNA左右边界之间的所有转基因，避免转基因逃逸事件的发生。
各个载体的具体构建步骤如下：
(1)构建含SpeI和KpnI酶切位点的PCaMV 35S–Tnos和Pubi-Tubi片段。用HindIII和Sac1切开pZH98(来自韩志国，Ow实验室)，将酶切产物与1.6kb的PCaMV 35S片段和0.8kb的Tnos片段(上述两个片段是以pZH98为模板经PCR扩增所得)进行In-fusion连接，获得载体pZ98rPCaMV 35S-Tnos；或将酶切产物与1.6kb的Pubi片段和0.6kb的Tubi片段(上述两个片段以含有生菜泛素启动子和终止子的pMD-19T为模板经PCR扩增所得)进行In-fusion连接，获得载体pZ98rPubi-Tubi。最后，分别以pZ98rPCaMV 35S-Tnos和pZ98rPubi-Tubi为模板，经PCR扩增得到含SpeI和KpnI酶切位点的2.4kb的PCaMV 35S-Tnos和2.3kb的Pubi-Tubi片段。
(2)改造本实验室叠加载体pZH109(来自韩志国，Ow实验室)。pZH109含有水稻actin1启动子控制的潮霉素磷酸转移酶hpt(hygromycin phosphotransferase)筛选标记基因和ScBV启动子控制的gfp基因，以及与pSY25-30一样的attP、lox、RS2位点。为了将水稻actin1启动子控制的hpt筛选标记基因替换为适合生菜中使用的nos启动子和npt筛选标记基因，具体做法为：以pBI121和pZH84(来自韩志国，Ow实验室)为模板经PCR扩增获得0.3kb的Pnos与0.8kb的npt片段，并以这些片段为模板进行重叠延伸PCR获得1.1kb的Pnos-npt片段，将该片段与用PacI和Bsu36I切开pZH109的酶切产物进行In-fusion连接，获得载体pZH109 Pnos-npt。将pZH109 Pnos-npt用SbfI切开，其酶切产物分别与PCaMV 35S–Tnos和Pubi–Tubi片段用In-fusion连接，获得pZH109 Pnos-npt-PCaMV 35S–Tnos和pZH109 Pnos-npt-Pubi-Tubi载体。用SpeI和KpnI切开载体pZH109 Pnos-npt-PCaMV 35S-Tnos，将酶切产物分别与抗原基因的人工合成片段Tp-espB-FLAG和Tp-IntC280-FLAG进行In-fusion连接，获得载体pSY25和pSY26。用SpeI和KpnI切开载体pZH109 Pnos-npt-Pubi–Tubi，将酶切产物分别与抗原基因的人工合成片段espB-FLAG、IntC280-FLAG、Tp-espB-FLAG和Tp-IntC280-FLAG进行In-fusion连接，分别获得pSY27、pSY28、pSY29和pSY30载体。
载体构建相关的PCR扩增均用KOD FX高保真酶(TOYOBO，日本)进行，而In-fusion连接则用HD Cloning Kit(Clontech，USA)完成。
实施例2
1.质粒转化农杆菌
取1μL的质粒(pSY25、pSY26、pSY27、pSY28、pSY29或pSY30)于50μL EHA105感受态细胞中混匀后加入电极杯，利用Gene Pulser XcellTM电穿孔系统(Bio-Rad，美国)进行电激。将电激后的混合液加入200μL LB液体培养基中，28℃(200rpm)培养2.5h。取50μL菌液，涂于含50mg/L Rif(Rifampicin，利福平)和50mg/L Kan(Kanamycin，卡那霉素)的LB固体培养基平板上，28℃倒置培养3天。挑取单克隆，用5mL含50mg/L Rif和50mg/L Kan的LB液体培养基培养过夜，-80℃保存菌液，备用。
2.生菜转化
生菜转化步骤参照朱春燕(朱春燕(2008).白藜芦醇合酶基因转化生菜的研究.南方医科大学)报道的进行。具体步骤如下：用70％乙醇浸泡种子(美国大速生菜(Lactucasativa cv.American Grand Rapids)(散叶型)和飞翔100(L.sativa cv.Flying100)(结球型)，分别购于中国北京硕源种子有限公司和中国北京绿金蓝种苗有限责任公司)60s，接着用无菌水洗3次，然后用含0.1％ Tween 20的2％次氯酸钠浸泡10min，再用含0.1％ Tween20的2％次氯酸钠浸泡10min，最后用无菌水洗5～6次。吹干种子后，播种于含1/2MS的培养基上。种子发芽后，在超净工作台中，切下子叶以作外植体。将外植体放入含有0.2mg/L 6-BA(6-benzylaminopurine，6-苄基腺嘌呤)、0.l mg/L NAA(α-naphthaleneacetic acid，萘乙酸)的MS培养基上预培养1天。随后，用含农杆菌MS悬浮液(OD600＝0.05)浸泡外植体15min。吹干外植体后，放入含有0.2mg/L 6-BA、0.lmg/L NAA的MS培养基上，黑暗共培养3天(美国大速生菜)或4天(飞翔100)。用含有0.5mg/L 6-BA、0.04mg/L NAA、500mg/L Carb(Carbinicillin，羧基苄青霉素)的MS液体冲洗共培养后的外植体。将吹干后的外植体，切口垂直向下接种于含有0.2mg/L 6-BA、0.l mg/LNAA、500mg/L Carb、100mg/L Kan的MS筛选培养基中培养。出苗后，把小苗割下移入含0.05mg/L NAA、300mg/L Carb的1/2MS培养基中诱导生根。所有生菜培养步骤均在温度为25℃±2℃、光周期为日:夜＝16h:8h的温室中进行。主要步骤如图3所示。
3.转基因植物的GFP绿色荧光信号检测
用Leica DMI600B显微镜(Leica,德国)检测生菜叶片和根部的表达情况。用于GFP的激发滤光片的波长范围为440至520nm，阻挡滤光片为510LP。
4.DNA提取和PCR检测
用CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)法提取生菜叶片中的DNA(Stewart和Via 1993)后使用2×Taq PCR StarMix(Dye)(GenStar,中国)进行PCR反应，所用引物如表1所示。
表1 PCR所用引物序列
5.Southern blot分析
用HindIII或BglII酶切基因组DNA(15μg以上)，所得产物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离。将分离好的基因组DNA利用真空转膜系统(Bio-Rad model 785vacuum blotter，美国)转到Hybond-N+尼龙膜上(GE Healthcare，美国)。用紫外灯(UVP CL-1000UltravioletCrosslinker，美国)将膜上的基因组DNA交联后，使用DIG High Prime DNA Labelling andDetection Starter Kit II(Roche，瑞士)将npt探针与其杂交并检测。DIG-dUTP(alkali-labile)标记的npt探针用PCR DIG Probe Synthesis Kit(Roche，瑞士)合成，合成所用引物如SEQ ID NO:23～24所示。
6.实时荧光定量PCR(RT-qPCR)
从45天的生菜的第1片完全展开叶片上取样，用HiPure Plant RNAMini Kit(广州美基生物科技有限公司，中国)提取总RNA后，取0.7μg RNA用PrimeScriptTM RT ReagentKit with gDNAEraser(Perfect Real Time)(Takara，日本)合成cDNA。用qPCRMaster Mix(Promega，美国)配置反应体系，所用的引物序列如表2所示。将体系置于480(Roche，瑞士)中进行qPCR反应，程序如下：95℃孵育30s,然后进行40个循环的扩增反应：95℃变性5s，60℃延伸30s。所有的RT-qPCR反应进行2个技术性重复。采用2–△CT方法对qPCR数据进行分析。参照基因为生菜的Ubiquitin(UBQ)(AccessionNo.DW144476)和18S ribosomal RNA 1(18S1)(Accession No.DW138800)。
表2 RT-qPCR所用引物序列
7.EspB-FLAG和IntC280-FLAG的E.coli原核表达与纯化
EspB-FLAG和IntC280-FLAG中的EspB和IntC280的序列与现有技术报道的相同，FLAG的编码序列则从pCambia 1305中克隆所得。克隆上述两个基因序列后，酶切连接于pET-28b(+)的NcoI和BlpI之间。测序正确后转入E.coli BL21(DE3)感受态中。用含50mg/LKan的LB液体培养基37℃(200rpm)过夜培养含载体的E.coli BL21(DE3)直到OD600达到0.5～0.6。加入0.5mM终浓度的IPTG(Isopropylβ-D-Thiogalactoside,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导蛋白表达。对于表达EspB-FLAG的菌体，用6M盐酸胍裂解后进行超声破碎。随后在4℃下，边搅拌边缓慢加入复性液(含50mM三羟甲基氨基甲烷、0.5mM乙二胺四乙酸、50mM氯化钠、5％甘油、1％谷胱甘肽、1％ L-精氨酸、0.5mmol/L PMSF(Phenyl Methane SulfonylFluoride，苯甲基磺酰氟)，pH7.0)稀释20倍以复性EspB-FLAG。接着，用Ultra-15Centrifugal Filter Concentrator with Ultracel-10(Millipore，美国)浓缩后，以PBS(pH 7.4)替换复性液，直到蛋白浓度达到100mg/L。对于表达IntC280-FLAG的菌体，加入IPTG后，在16℃、200rpm的条件下培养24h以诱导表达。菌体用TBS溶液(含0.1M Tris-HCL、150mM氯化钠，pH7.4)重悬浮后进行超声破碎裂解。用Anti-DYKDDDDK G1 Affinity Resin(金斯瑞，中国)对复性后的EspB-FLAG和IntC280-FLAG纯化。
8.蛋白提取、Western blot分析与定量
以2.5μL提取液(含200mM Tris-Cl(pH 8.0)、100mM氯化钠、400mM蔗糖、10mM乙二胺四乙酸、14mM 2-巯基乙醇、1mM PMSF、0.05％ Tween-20)/每毫克的生菜叶片粉末(Arakawa et al.1997)的用量提取生菜可溶性总蛋白(Total soluble protein，TSP)。具体操作：将提取液加入生菜粉末后混匀，冰上放置15min，4℃下16000×g离心10min收集上清液，所得上清液为含生菜TSP的溶液(储存于-80℃备用)。生菜TSP和纯化后的EspB-FLAG或IntC280-FLAG分别用Coomassie protein assay reagent(Thermo Scientific，美国)和PierceTMBCAProtein Assay Kit(Thermo Scientific，美国)定量，OD值检测仪为EpochMicroplate Spectrophotometer(BioTek Instruments，美国)。蛋白样品用12％聚丙烯酰胺胶分离后，经Bio-Rad Mini-protein Tetra(Bio-Rad，美国)转到0.2μm聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(GE healthcare，德国)上。接着以稀释5000倍的Monoclonal Anti-FLAG(R)M2(mouse)(Sigma，美国)作为一抗，稀释10000倍的羊抗兔IgG-HRP(Abmart，中国)作为二抗孵育EspB-FLAG或IntC280-FLAG。用AmershamTMECLTMprime(GE Healthcare，英国)检测蛋白的免疫反应并用ChemiDocTM MP Imaging system(Bio-Rad，美国)成像。每张PVDF膜上，用3、6、12、24、48ng的E.coli EspB-FLAG和1.5、3、6、12、24ng的E.coli IntC280-FLAG作标准曲线。在Image J中将样品量与标准曲线比对，计算出生菜TSP中EspB-FLAG或IntC280-FLAG的含量。计算生菜叶片中的EspB-FLAG或IntC280-FLAG含量的方法参照现有技术(Verma D,Samson N,Koya V,Daniell H(2008)Aprotocol for expression of foreign genes inchloroplast.Nature Protocol 3:739-758、Boyhan D,Daniell H(2011)Low-costproduction of proinsulin in tobacco and lettuce chloroplasts for injectableor oral delivery of functional insulin and C-peptide.Plant BiotechnologyJournal 9(5):585-598)。
通过转化5463个外植体(其中，1900个为飞翔100品种，3563个为美国大速生菜品种)并对抗性苗进行分子检测，最后发现具有GFP荧光信号且含有完整的抗原基因、npt以及重组位点片段(图2中(g))的植株共52棵，它们分别来自于33个抗性外植体。在这些生菜中，只有来自于22个外植体的34个植株能结籽(表3)。由于来自同一个外植体的再生植株可能具有相同的遗传信息，所以对于每个外植体所产生的转基因植株，只选取1棵结种较多的进行抗原基因的表达分析。即共有22个株系用于实验，其中包括由飞翔100或美国大速生菜转化所得的9个espB株系和13个IntC280株系(图4)。图4结果显示，在由pSY27、pSY28、pSY29、pSY30载体转化所得的T1植株中均可检测出抗原基因的转录本，而这些植株的抗原基因的控制元件均为Pubi/Tubi。在由pSY25、pSY26载体转化所得的生菜中，几乎无法检测出抗原基因的转录本，而这些植株中的抗原基因则由P35S/Tnos控制。这个结果与现有技术所报道的相符。虽然CaMV 35S启动子被广泛应用于多种植物，但可能由于启动子沉默等因素，在本发明pSY25和pSY26转化出的株系的T1代中，都几乎检测不到抗原基因的表达，所以CaMV35S启动子不是生菜的强启动子。本研究在能够检测出抗原基因表达的株系中，选取8个T1代gfp分离方式呈现单拷贝的株系用于后续实验(表4)。其中包含5个espB株系(A27.3、A27.8、A29.6、A29.7、A29.8；“A”指cv.American Grand Rapids，美国大速生菜)和3个IntC280株系(A28.1、A28.2、F30.1；“F”指cv.Flying 100，飞翔100)。因为A29.7没有获得纯合子，所以只对剩余的7个株系的纯合T2植株进行抗原的转录本和蛋白表达情况分析。qPCR的结果表明，除了A29.6和A29.8两个株系，剩下5个株系的T2植株的抗原表达量均高于T1父母本(图4)。
表3 T0转基因生菜信息
表4 gfp在T0转基因植株后代中的分离情况
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注:编号用加粗标记的株系，其可能只有一个分离位点，且抗原转录本表达水平比较高。
EspB-FLAG和IntC280-FLAG的预测大小为35.3kDa和32.5kDa。利用Western blot检测7个株系中带有FLAG标签的抗原蛋白，结果显示，利用E.coli BL21(DE3)表达的抗原大小约为40kDa和37kDa(图5)，比预测大小大5kDa左右，该结果与现有技术报道的相似。而E.coli和生菜表达的重组蛋白大小相近。即使在抗原基因前面加入编码叶绿体转运肽序列的转基因植株中，其表达的抗原大小也与没有加入转运肽序列的一致，这表明在植物体内转运肽能被正确切割(图5)。然而，Western blot的灰度值显示，A27株系的抗原蛋白含量高于A29株系，A28株系和F30株系的表达量相近，因此，本发明的结果表示，在抗原前加入信号肽未能提高目的蛋白在植物中的积累(图5)。
在7个用于抗原表达检测的株系中，A29.8株系的转录本和蛋白表达量都很低，而A29.6株系的株型小而且结实率低，所以这两个株系没有用于后续的实验。本发明对余下的5个株系(A27.3、A27.8、A28.1、A28.2、F30.1)检测了抗原在不同时期不同叶位的表达量。实验结果表明，未完全展开的叶片所含的抗原蛋白浓度最高，对于完全展开的叶片，越嫩的叶片的抗原浓度越高(图6)。对于2个espB株系，叶片中抗原浓度最高是30天的A27.3植株的未完全展开叶片(32.0±9.1μg/g叶片鲜重)和60天的A27.8植株的未完全展开叶片(20.6±5.2μg/g叶片鲜重)(图6)。对于3个IntC280株系，叶片中抗原浓度最高的分别是30天的A28.1植株(50.6±21.8μg/g叶片鲜重)和F30.1植株(43.4±14.7μg/g叶片鲜重)的未完全展开叶片，以及60天的A28.2植株的未完全展开叶片(46.0±8.0μg/g叶片鲜重)。
利用Southern blot分析上述5个株系(A27.3、A27.8、A28.1、A28.2、F30.1)T1植株的转基因拷贝数。经HindⅢ和BglⅡ酶切植物基因组后，分别预期得到的左边界片段大小应大于1.7kb和大于2.5kb(图2中(c)、(d)、(f))。通过npt探针检测，结果如图2中(h)所示，5个株系中只有A28.1(T1植株为A28.1.10)在两种酶切情况下都杂交出符合预期大小的单一条带。其他植株A27.3.2、A27.8.3、A28.2.1、F30.1.3在一种或者两种酶切情况下杂出2条或以上的条带。所以在5个用于检测的株系中只有A28.1株系是单拷贝的。
尽管没有必要利用单拷贝的转基因株系生产抗原，但是在本发明中，如果能获得单拷贝的株系，就可以顺利地对该些株系进行后续的基因工程操作：删除如标记基因等非必须转基因；定点叠加或替换性状基因；在花粉中实现T-DNA的全删除(图2和图7)。本发明对单拷贝植株A28.1.10进行了重组位点(lox，attP，RS2)的克隆与测序，结果表明这些位点都没有发生突变，所以未来将可引入重组酶识别该些位点并对转基因进行删除或叠加(图8)。其中，lox位点可用于Cre重组酶介导的删除，以删除gfp-npt片段，提高疫苗生菜作为转基因作物和药物的安全性。attP位点则能为Bxb整合酶提供识别位点以整合新的基因或用新的基因替换原来的抗原基因，方便日后的疫苗升级。RS2能被CinH重组酶识别，以用于在花粉中删除整个T-DNA片段，防止基因漂移。由于这些重组技术在烟草、水稻、棉花、大豆等植物上都有所实现，因此，在获得A28.1.10的基础株系后，未来通过技术的进一步开发，也必能在生菜中实现这些基因工程操作。
本发明对5个用于southern blot分析的植株的抗原基因进行测序。结果表明，A27(A27.3和A27.8株系的A27.3.2和A27.8.3植株)和A28(A28.1和A28.2株系的A28.1.10和A28.2.1植株)株系的抗原基因序列都与预期相同。但在F30.1.3克隆的抗原基因序列中，与IntC280原编码序列对比，有两个碱基发生了突变(SEQ ID NO:6中第538为碱基由A突变为G，第923为碱基由C突变为T)(图9)，这两个碱基的变化导致了IntC280中两个氨基酸(Ile180和Ser297)也发生了变化(图10)。
实施例3体内实验
在进行小鼠实验前，先用含EspB或IntC280抗体的牛血清，通过Western blot检测A27.3、A28.1、F30.1株系总蛋白中的抗原蛋白，以确定植物所表达的抗原的有效性。选择这些株系用于预实验的原因是，对于表达同一种抗原的株系，在30和45天的植物的未完全展开叶片和第一片完全展开叶片中，这些株系的抗原表达量都较高(图6)。预实验的结果表明，A27.3、A28.1株系表达的抗原蛋白都能被检出(图11)，却未能检出F30.1的抗原蛋白，这可能是F30.1所表达的IntC280-FLAG具有两个氨基酸突变所造成的。因此，最后选择了A27.3和A28.1为espB和IntC280的代表性株系用于后续的小鼠实验中。
1.小鼠免疫实验
将6周大BALB/c雌性小鼠以分为3组，每组5只。禁食5小时后，以灌胃的方式分别给3组小鼠饲喂espB生菜(A27.3株系T3代植株)、IntC280生菜(A28.1株系T3代植株)、野生型美国大速生菜。具体方法为，将0.3g(使用前对生菜粉末定量，每克生菜粉末含有2.8μgIntC280或1.1μg EspB)生菜粉末加入600μL的无菌PBS中制成匀浆液后，灌喂小鼠，共持续6天(图12中(a))。此实验获得了实验动物管理和使用委员会CICUAE INTACICVyA批准(number of reference 20/2022)。
2.血清和粪便中的抗体测定
在第0、9、15、20天对实验小鼠进行颌下采血和粪便收集。提取血液样本的血清后，储存于-20℃备用。对于粪便样本，具体处理方法为，在500mg粪便材料中加入1mL含有蛋白酶抑制剂混合物(ProteinSafeTM，TransGen Biotech，中国)和1w/v％叠氮化钠的无菌PBS，匀浆后，20,000g离心10min，取上清液以收集粪便中的抗体，并储存于-20℃备用。血清和粪便样品均用ELISA的方法(Martorelli L,Garbaccio S,Vilte DA,Albanese AA,MejíasMP,Palermo MS,Mercado EC,Ibarra CA,Cataldi AA(2017)Immune response in calvesvaccinated with type three secretion system antigens and Shiga toxin 2Bsubunit of Escherichia coli O157:H7.PLoS One 12(1):e0169422.)分别检测其中的IgG和IgA抗体。检测过程如下：在Nunc-Immuno MaxiSorp 96孔酶标版(Nunc,Roskilde，丹麦)中加入100μL含0.1μg/mL EspB或IntC280的碳酸盐缓冲液(pH9.6)，4℃过夜包被。随后，用含有0.05％ Tween 20PBS(pH 7.4)(PBST)洗涤3次，在室温下再用含有3％脱脂奶粉的PBS溶液封闭1h。封闭后，用PBST洗涤，接着在每个孔中加入100μL样品，室温下孵育2h。对于每个96孔板，取2个孔加入PBST作为阴性对照，取1个孔加入已知样品作为阳性对照。每个样品做2个重复。孵育样品后，用PBST洗涤,然后在血清样品所在的孔中加入100μL用PBST稀释20,000倍的辣根过氧化物酶HRP标记的兔抗大鼠IGG(A9044.Sigma，美国)。在粪便样品所在的孔中，加入用PBST稀释1000倍的辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗兔IgA(sc-3791SantaCruz Biotechnology，美国)。随后，用PBST洗涤酶标板3次。最后加入邻苯二胺盐酸盐(OPD)显色，在分光光度计下读取450nm处的OD值。
将生菜匀浆物通过经口灌胃的方式免疫小鼠，在免疫后第9、15、20天收集血液和粪便样本，利用ELISA检测血液中的特异性IgG抗体和粪便中的特异性IgA抗体。结果显示，系统性全身体液免疫反应(IgG)只有在用espB生菜免疫的小鼠的第20天的血清样品中能检测到显著上升(p<0.05)；用espB和IntC280生菜免疫的小鼠粪便中的IgA水平均有显著提高，而在第20天时达到峰值(分别用1:500和1:750的滴定度检测EspB和IntC280)(图12中(b))。这些结果与预期的相符合：口服疫苗接种主要引起肠道粘膜的免疫反应。
3.免疫小鼠的攻毒试验
在攻毒前的5天，每天给小鼠提供含有5g/L str(streptomycin sulfate，硫酸链霉素)的饮用水，以减少体内正常菌群，帮助抗str的EHEC O157:H7定植，使其成为肠道中优势菌群，利于该病原菌对小鼠感染。小鼠禁食12h后，在第22天用灌胃针给小鼠接种6×107CFU抗str的超毒力EHEC O157:H7 clade 8Rafaela II。接种后，恢复对小鼠提供食物。在如图12中(a)所示的第23、25、27、29、30天(攻毒后的1、3、5、7、8天)收集小鼠粪便，检测其中的菌量。制备粪便(0.1g)匀浆的系列稀释液后，在含头孢克肟、碲化物和链霉素山梨醇的麦康凯培养上接种，8天后，计算出每克粪便中含有活力且具有str抗性的EHEC O157:H7(CFU/g粪便)的量。此外，每天对小鼠进行称重。
EHEC O157:H7的菌量监测结果显示，用espB生菜免疫的小鼠的粪便含菌量，从第27天(攻毒后的第5天)开始低于对照组(只有对照组的5.8％)，而在第29、30天，处理组与对照组间的数据差异显著。对于用IntC280生菜免疫的处理组，虽然与对照组之间没有统计学上的显著差异，但是从平均值的角度来比较，从第29天开始，处理组粪便中的含菌量已明显低于对照组，而在第30天，其平均含菌量只有对照的29.0％(图12中(c))。体重监测结果显示，三组小鼠的体重没有明显差异(图12中(d))。
综上所述，小鼠取食espB或IntC280生菜后，能显著增加特异性的IgA。此外，通过粪便含菌量测定，口服espB生菜能显著降低粪便中EHEC O157:H7的量，减少病原菌在体内的定植；口服IntC280生菜，也可抑制O157:H7排出，虽然在统计学上不显著。因此，本发明的口服疫苗可以有效地诱导粘膜免疫反应，并减少O157:H7从动物体内排出至环境中。
目前，一些研究表明植物口服疫苗具有抗EHEC O157:H7的作用，但是由于实验条件不同，所以难以直接比较疫苗效果。本发明中，在用转基因生菜口服免疫后的小鼠中，特异性IgA滴度显著升高，而病原菌的定植量都有所降低。不过，如果要把转基因植物口服疫苗推出市场，不仅仅需要产品具有免疫效力，而作为转基因植物，它必须经过严格的管制程序。所以，在本发明的载体中，嵌入了可以进一步实现基因改造的元件以满足政府对转基因植物、药物的管控要求。如图7所示，对于用来选择转化体的选择标记—卡那霉素抗性基因，可以通过位点特异性重组技术去除。此外，本发明的转化载体上还携带了其他重组位点，这些位点能用于未来的植物改造，例如在同一整合位点上添加更多的抗原基因(该技术已经在烟草、水稻、大豆和棉花中得以实现)；或者用新的基因替换旧的基因(该技术已在烟草中实现)。上述技术是疫苗开发的一种实用技术，例如可以在本疫苗的基础上通过加入新的抗原基因或者替换旧的基因以开发预防covid19等的疫苗。由于载体中还含有能被CinH识别的RS2位点，因此本发明的疫苗还可以如已在烟草中证明的那样，在花粉中去除所有的转基因，减少转基因漂移。烟草实验表明，在30000花粉粒中，仅有不到1％的花粉具有标记基因。最后，由于本疫苗的生产载体是生菜，且抗原表达量最高的植物组织为嫩叶，所以，在疫苗生产上，人们可以按药品生产质量管理规范(Good Manufacturing Practice)所需，在封闭的温室中种植转基因生菜，也可以在开花前收割到抗原含量较高的植物材料。这些措施的可行性都可以减少疫苗生产过程中出现的转基因漂移，提高转基因疫苗的生物安全性。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种重组蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列为a)或b):
a):SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:7所示；
b):a)所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述重组蛋白质的核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列优选如SEQID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示。
3.与权利要求2所述核酸分子相关的生物材料，所述生物材料包括(1)和/或(2)：
(1)表达盒，含有权利要求2所述的核酸分子；
(2)重组细胞，含有权利要求2所述的核酸分子或(1)中表达盒。
4.一种重组表达载体，含有权利要求2所述的核酸分子或权利要求3中所述的表达盒。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体还包括编码卡那霉素和绿色荧光蛋白标记基因片段；和/或，所述重组表达载体还包括RS2、attP和lox。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述核酸分子表达的控制原件为生菜泛素启动子和生菜泛素终止子；优选地，所述生菜泛素启动子和生菜泛素终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO:13～SEQ ID NO:14所示。
7.权利要求1所述的重组蛋白质、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的生物材料和/或权利要求4～6中任一项所述的重组表达载体在制备预防或治疗EHEC O157:H7的疫苗中的应用。
8.一种疫苗，包含权利要求1所述的重组蛋白质、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的生物材料和/或权利要求4～6中任一项所述的重组表达载体。
9.根据权利要求8所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗是采用农杆菌介导法将权利要求1所述的重组蛋白质、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的生物材料和/或权利要求4～6中任一项所述的重组表达载体整合到植物外植体中得到；优选地，所述植物为生菜。
10.一种产品，包含权利要求1所述的重组蛋白质、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的生物材料、权利要求4～6中任一项所述的重组表达载体和/或权利要求8或9所述的疫苗；优选地，所述产品的功能为(b1)～(b3)中的任一种：
(b1)预防或治疗EHEC O157:H7感染相关疾病；
(b2)引起粘膜免疫反应；
(b3)制备EHEC O157:H7抗体。
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