JP2001500487A

JP2001500487A - 植物ウイルスコートタンパク質と融合したポリペプチド

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Publication number: JP2001500487A
Application number: JP10511934A
Authority: JP
Inventors: コプロウスキ、ヒラリー; フーパー、ダグラス・クレイグ; ユスィボブ、ビダディ; モデルスカ、アンナ
Original assignee: トーマス・ジェファーソン・ユニバーシティー
Priority date: 1996-08-28
Filing date: 1997-08-28
Publication date: 2001-01-16
Also published as: US6042832A; ATE325882T1; EP1006782A4; EP1006782B1; WO1998008375A1; US6448070B1; CA2264571A1; EP1006782A1; DE69735854D1

Abstract

(57)【要約】抗原性ポリペプチドに融合した植物ウイルスキャプシドタンパク質を含む融合キャプシドタンパク質を、ヒトのような動物の免疫系に当該ポリペプチドを提示するための分子として用いる。この植物ウイルスキャプシドタンパク質は、アルファルファも座一句ウイルス（AlMV）又はアイラーウイルスである。

Description

【発明の詳細な説明】植物ウイルスコートタンパク質と融合したポリペプチド〔発明の分野〕本発明の分野は、組換え植物ウイルスの分野であり、特に、哺乳類（例えばヒト）または他の動物病原体に由来する抗原性配列をもった免疫感作剤としてのその使用、および興味の対象であるポリペプチドの産生を増大させるためのシステムとしてのその使用である。〔発明の背景〕従来、予防接種の成功は、弱毒化された生ウイルス製剤または病原性死菌製剤の使用に依存している。これらのワクチンは、感染性疾患を抑制し、或いは天然痘の場合のように完全に征服する上で非常に効果的である。しかし、それらの使用は安全性の懸念を生じることが多い。病原体から誘導されたペプチドもしくはタンパク質に基づくサブユニットワクチンは、従来のワクチンよりも危険性が少ないが、一般的には免疫原性に乏しく且つ高価である。更に、現在のワクチンは、幾つかの例外はあるが、経腸的に投与しなければならない。しかし、殆どの病原体が身体の粘膜を通して侵入することは周知であるから、粘膜免疫反応の方がより適切であろう。安全性の問題、並びにより効果的な免疫感作のために粘膜組織をターゲットにすることの要望の両者によって、予防接種の新たなアプローチの必要性が提起された。粘膜応答を誘導するためには、経口投与が適切であり、安価で且つ安全である。しかし、経口経路で効果的に免疫感作するためには、胃腸（ＧＩ）管内での低ｐＨまたはプロテアーゼによる分解、免疫誘導部位への露出が短時間であること、および透過性が制限されることのような幾つかの障害を克服しなければならない。最近の研究は、植物および植物ウイルスが、ワクチンの製造およびデリバリーのための有効なツールとして機能し得ることを示している。更に、リポソームおよびマイクロカプセルと同様に、植物細胞および植物ウイルスは、これらに付随する抗原についての天然の保護を与え、且つＧＩ管からの抗原の取り込みを向上させるデリバリー担体として働くと思われる。〔発明の概要〕一つの一般的な側面において、本発明は、キメラキャプシドタンパク質をコードする遺伝子物質と組み合わされた組換えタバコモザイクウイルス（TMV）遺伝子物質［キメラキャプシドタンパク質をコードする遺伝子物質と組み合わされた TMV遺伝子物質；ここで、該キメラキャプシドタンパク質は、外来ポリペプチドに融合されたアルファルファモザイクウイルス（AlMV）キャプシドタンパク質（ CP）またはアイラーウイルスCPである］をデリバリー担体に用いて、融合キャプシドタンパク質（外来ポリペプチドに融合した植物ウイルスキャプシドタンパク質）を、哺乳類（例えばヒト）または他の動物にデリバリーする方法である。前記外来ポリペプチドは、TMV、AlMVまたはアイラーウイルスの何れにも、天然には存在しないものである。この融合タンパク質は、外来ポリペプチドに対する免疫を誘導する目的のために、哺乳類または他の動物に投与される。第二の一般的側面において、本発明は、このようなキメラウイルスの製造方法、および植物において融合被覆タンパク質を発現させるための該キメラウイルスの使用である。〔図面の簡単な説明〕図１Ａ： TMVのゲノムの模式図である。ウイルス複製に必要な126kDaおよび1 83kDaのタンパク質、30kDaのウイルス移動タンパク質、およびCP（ウイルス外皮タンパク質）をコードするゲノム領域が摸式的に示されている。「TMV CP SP」の下の矢印は、TＭVのサブゲノムプロモータを示している。「pep」の下の３つの連結された楕円形は、AlMV CPに融合されたポリペプチドを表している。Rz-はリボザイムを示す。B3ORz-は、TMVの派生物である。AvB3Orz-は、B3oRz-の派生物であり、外皮タンパク質の翻訳に関して欠陥を有している。図１Ｂ：クローニングストラテジーを模式的に表した図である。TMVベースのベクター中へのキメラAlMV CPのクローニング。HIV-1および狂犬病ウイルス由来のポリペプチドの配列が、組換えウイルスを作製するための「pep」として使用される。この「pep」ポリペプチドは次のアミノ酸配列を有している。 BrzCPMNV3について：（配列番号１） BrzCPNLV3について：（配列番号２） BrzCPDnv10cについて：（配列番号３） BrzCPDrg24について：（配列番号４） BrzCPDNLprについて：（配列番号１５） BrzCPDNLVpuについて：（配列番号１６）図２：組換えウイルスの転写物に感染したたばこプロトプラストにおける、異なったペプチドに融合したキメラAlMV CPの蓄積。タンパク質を13％SDS-ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動により分離し、ナイロン膜上にエレクトロブロットした。このタンパク質をAlMV CPに対するモノクローナル抗体と反応させた後、ウエスタチン(Westatin)免疫染色キット（シグマ社）を用いて検出した。レーン１は、wt AlMV CPを表している。レーン２およびレーン３は、夫々pSPCPD 10cおよびpSPCPDrf24のインビトロでの転写生成物である。レーン４はpBRzCPNLV pu、レーン５はpBRzCPNLVpr、レーン６はpBRzCPDrg24、レーン７はpBRzCPDNV10c 、レーン８はpBRzCPMNV3、レーン９はpBRzCPNLV、レーン１０は、B30Rzである。図３：異なる構築物を呈するTMVの組換え転写物に感染した、たばこ植物に由来する組換えAlMV粒子の電子顕微鏡写真である。この粒子は2％の酢酸ウラニルで陰性に染色された。バーは100nmを示す。ＡはB30Rz、ＢはpBRzCPNLV3である。一重の矢印はTMV粒子を示す。二重の矢印は組換えAlLMV粒子を示す。図４：全身感染したたばこの葉におけるキメラAlMV CPの蓄積。たばこの葉に組換えウイルスの転写物を接種した。タンパク質を、13％のSDS-ポリアクリルアミドケル中での電気泳動により分離した。このタンパク質をAlMV CPに対するモノクローナル抗体と反応させた後、ウエスタチン免疫染色キットを用いて検出した。レーン１は、wt AlMV CPを表している。レーン２はpBRzCPNLVpu、レーン３はB30Rz、レーン４はpBRzCPDrg24、レーン５はpBRzCPDNV10c、レーン６はpBRz CPNLVpr、レーン７はpBRzCPMNV3、レーン８はpBRzCPNLV3である。図５：狂犬病ウイルスおよびHIV-1のエピトープを含むキメラ粒子の免疫沈降。組換えウイルスの転写物に同時感染した植物組織から精製され、狂犬病ウイルスＧタンパク質（rg24）の線形エピトープに対するモノクローナル抗体を用いて免疫沈降された粒子。免疫沈降したタンパク質を、13％SDS-ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動により分離した。このタンパク質を、HIV-1 V3ループ抗体または狂犬病ウイルスのＮタンパク質に対するモノクローナル抗体と反応させ、続いてウエスタチン免疫染色キットを用いて検出した。レーン１は、Ｎタンパク質に対する抗体と反応する免疫沈降したタンパク質を表している。レーン２は野生型狂犬病ウイルスである。レーン３はV3ループに対する抗体と反応したHIV-1 gp 120であり、レーン４はV3ループに対する抗体と反応する免疫沈降したタンパク質である。図６Ａおよび６Ｂ： TMVおよびAlMVの混合物で免疫感作された対照マウスとp BRzCPDrg24で免疫感作されたマウスとを比較した、ELISAおよび中和試験で得られた結果。８週齢の雌スイス-ウエブスター異系交配マウスを、エピトープを発現するように加工した各組換えウイルス10μｇの投与により免疫感作した。0.1mLの３回の免疫感作剤を、１：１(v:v)のフロイントの完全アジュバントと共に、２週間間隔で腹腔内に投与した。野生型TMVとAlMVとの当量混合物を、対照としてのフロイントの完全アジュバントと共に用いた。夫々の免疫感作後10〜14日に、血清サンプルを個々のマウスから採取し、固相酵素免疫吸着試験を用いて、狂犬病ウイルスについて特異的抗体力価を評価した。試験結果をO.D. 単位で表した。狂犬病ウイルスCVS-11の特異的中和を、pBRzCPDrg24で免疫感作したマウスから得た血清およびBHKインジケータ細胞を用いた改良型迅速蛍光フォーカス形成試験で評価した。５匹のマウスのうちの１匹は、中和抗体を有していた。図７： pBRzCPDrg24（Rg24--A/TMV）またはAIMとTMVとの混合物（対照）を用いてi.p.で免疫感作した後の、特異的な狂犬病ウイルス抗体を産生するマウスのパーセンテージ。その結果はELISAによって得られたものである。実験は図６の脚注に記載してある。図８： CPMNV3で免疫感作したマウスの血清抗体反応およびこれら抗体の中和活性。血清抗体反応は、HIV-1のV3ループに似た合成ペプチドでコーティングしたプレート上でのELISAによって測定した。図８Ａは、CFAなしで免疫原を投与したときの血清抗体反応を示しているのに対して、図８ＢはCFAを加えたときの反応を示している。また、免疫前および対照ウイルスで免疫感作したマウスに関するELISAデータも示されている。図８Ｃは、CPMNV3で免役したマウスの血清により単離されたHIV-1/MNの中和を示している。図７Ｃにおけるデータ点は、免疫前および最後（７回目）抗原接種後の血清を用いて得た平均である。図９： CPDrg24で免疫感作したマウスの血清抗体応答。1:14の希釈血清およびAlMVでコーティングしたプレート（ベクタープレート）を用いたELISAによって、血清抗体反応を測定した。図９Ａは、ベクターおよびDrg24に特異的な血清ＩｇＡ反応を示しているのに対して、図９ＢはベクターおよびDrg24に特異的な血清ＩｇＧ反応を示している。また、免疫前および対照ウイルスで免疫感作したマウスについてのELISAデータも示されている。〔発明の詳細な説明〕使用する用語の解説この特許出願の目的において、「植物」とは、コケ類(Hepaticae)、蘚類(Musc i)、古生マツバラン類（Psilopsida）、クラブモス（Lycopsida）、トクサ類(Sp henopsida)、シダ類および種子植物、および以下で述べる或る種の真菌類、藍藻類を含む藻類を含むものである。シダ類および種子植物共にプテロプシダを形成する。種子植物には、裸子植物（Gymnospermae）および被子植物（Angiospermae ）が含まれる。食物として使用される植物の大部分は種子植物である。この出願の目的において、次の真菌類、即ち、きのこを含む担子菌類は植物とみなされる。この出願の目的において、次のものは植物とはみなさない。即ち、バクテリア、単細胞真核生物、および次の真菌類：藻菌類(Phycoycetes)、子嚢菌(Ascomyce tes)（酵母類）および不完全菌類(Deuteromycetes)である。「植物組織」の用語は、植物の如何なる組織をも包含するものである。これらには、完全植物体(whole plant)、植物細胞、植物の種子、および植物のプロトプラスとが含まれる。「動物」の語は、ヒト並びに他の動物を意味する。「鳥」は、鳥類の分類の温血脊椎動物である。「魚」は、鰓および鰭を有する水生の冷血脊椎動物である。「キメラタンパク質」は、正常には二つの別々のタンパク質をコードする２以上の遺伝子が、天然にまたは人間の介在の結果として、これら二つの端パク質の全部または一部が組み合わされたタンパク質をコードするように組み合わされたときに形成される。この出願において、「コードする」の語句は、ポリペプチド配列をコードする核酸配列、およびこのような核酸配列に対して相補的な塩基配列の両者を意味するように使用する。「融合キャプシドタンパク質」は、キメラの一方の遺伝子が、植物ウイルスのキャプシドタンパク質をコードするキメラタンパク質である。「二部分融合キャプシドタンパク質」は、二つのタンパク質のための遺伝子が組換えられる融合である。「三部分融合キャプシドタンパク質」は、三つのタンパク質のための遺伝子が組換えられる融合である。「病原体タンパク質」は、病原体の遺伝子物質によりコードされるタンパク質である。「天然に存在する植物タンパク質」は、その天然の生息地における少なくとも一つのライフサイクルにおいて、植物に正常に存在するタンパク質である。「植物細胞を感染させる」とは、植物細胞を、それが天然には有していない１以上の遺伝子で感染させること（この感染は、ウイルスに封入されていてもいなくてもよい核酸分子によるものである）を言う。「保護免疫」とは、哺乳類、鳥類または魚類のような動物が、病原体の抗原に曝された結果として、そうでない場合には病原体との接触によって生じる疾病または死に対して抵抗する能力を意味する。保護免疫は、粘膜性免疫、液性免疫または細胞性免疫の１以上のメカニズムによって達成される。粘膜性免疫は、主として、呼吸管、胃腸管および尿生殖路の粘膜表面上での分泌性ＩｇＡ（sIGA）抗体の結果である。sIGA抗体は、身体の粘膜で覆われた組織にＢリンパ球によるsI GA産生をもたらすような、抗原プロセッシング細胞（Ｂリンパ球およびＴリンパ球）により媒介された一連の事象の後に発生する。粘膜性免疫は、蛍光ワクチンによって刺激することができる。保護免疫の主な結果は、病原体の破壊またはその自己複製能力の阻害である。「液性免疫」は、血清中のＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体の結果である。「細胞性免疫」は、細胞障害性Ｔリンパ球を介して、またはマクロファージおよびＴリンパ球を含む遅延型の過敏性、並びに抗体を必要としないＴ細胞を含むメカニズムを介して達成される。感染植物細胞から誘導された「派生細胞」は、感染植物が、感染によって害植物細胞に導入された外来遺伝子の１以上のコピーが該派生細胞中に存在するように、細胞分裂または一連の細胞分裂を受ける結果として発生する細胞である。「アイラーウイルス類」には次のサブグループが含まれる：たばこ条斑病ウイルス、スモモ矮性ウイルス、ライラック環状斑点ウイルス、柑橘類葉しわウイルス、柑橘類まだらウイルス、ニレ斑点ウイルス、ほうれん草潜在性ウイルス、アスパラガスウイルス２、パリータリア(Parietaria)斑点ウイルス、アジサイモザイクウイルス、リンゴモザイクウイルス、スモモ壊死性輪紋ウイルス、ツラレ(t ulare)リンゴモザイクウイルス、ブルーベリー萎凋ウイルス、チェリー皺ウイルス、デーニッシュスモモ線状斑点ウイルス(danish plum line pattern virus)、ホップＡウイルス、ホップＣウイルス、アメリカスモモ線状斑ウイルス、およびホップカナムグラ・ジャポニクス・ウイルス(Humulus japonicus virus)。「組換えウイルス」は、ウイルスの遺伝子物質が他の遺伝子物質と結合されたウイルスである。「ポリペプチド」は、少なくとも４つのアミノ酸がペプチド結合で連結されている分子である。「ウイルス核酸」は、ウイルスのゲノム（もしくはその大部分）であってもよく、または塩基配列が当該ゲノムに対して相補的な核酸であってもよい。ウイルスＲＮＡに対して相補的なＤＮＡ分子もまた、ウイルス核酸とみなされる。塩基配列がウイルス性ＤＮＡに対して相補的であるＲＮＡ分子もまた、ウイルス核酸とみなされる。「AlMV」は、アルファルファモザイクウイルスである。「TMV」は、たばこモザイクウイルスである。本発明の「ワクチン」は、融合キャプシドタンパク質であり、一部が該タンパク質である何れかの粒子、または一部が該タンパク質である植物材料のような何れかの製剤であり得る。「複数」とは１以上を言う。発明の特徴一般的な側面において、本発明は、動物（特に哺乳類、鳥類または魚類）に対してポリペプチドを投与する方法であり、その方法は、（１）植物細胞中でプロセッシングされて、ウイルスキャプシドタンパク質と、植物ウイルスキャプシドタンパク質でないポリペプチドとを含む融合キャプシドタンパク質を産生する組換え植物ウイルス核酸を、植物細胞に感染させて感染細胞を作製する工程と、（２）この感染細胞または該感染細胞から誘導された派生細胞を、前記感染細胞または派生細胞が、前記融合キャプシドタンパク質を製造するような条件下で培養する工程と、（３）前記融合キャプシドタンパク質またはその一部を動物に投与する工程とを具備する。工程（１）において、ウイルス核酸は、ウイルス形態ものであっても、ウイルス形態のものでなくてもよい。ウイルス形態でないときは、純粋な核酸または他の分子もしくは分子構造体に結合した核酸であり得る。工程（１）において、前記組換え植物ウイルス核酸がTMV核酸を含むものであるときは、該TMV核酸は、好ましくは、TMVの123kDa、183kDa、および30kDaタンパク質をコードする核酸を含むであろう。工程（１）および（２）において、前記感染細胞または派生細胞は、植物または植物組織の一部であってもよく、または他の植物細胞を含まなくてもよい。工程（１）において、前記ウイルス核酸は、工程（２）においてウイルス粒子を産生するための充分な遺伝子情報を有している。工程（３）における投与経路は、非経腸的または経腸的であることができる。非経腸的に投与される場合、動物に投与すべきタンパク質は、これを産生する植物細胞中に存在する他の物質を実質的に含まないのが好ましい。工程（３）において、前記タンパク質またはその一部は、前記感染細胞または派生細胞の一部であってもよく、このような感染細胞または派生細胞の抽出物の一部であってもよく、或いは、タンパク質精製の結果としての、感染細胞または派生細胞に通常存在する他の物質を含まないものであってもよい。本発明の特別な実施例において、前記工程（３）の結果は、植物ウイルスタンパク質ではない融合キャプシドタンパク質の一部に対する免疫反応である。該免疫反応は、好ましくは、保護免疫または全身耐性を生じる。融合キャプシドタンパク質を精製する工程は、植物をそれらのタンパク質成分に分画し、また個々のタンパク質を感染細胞または派生細胞の他の成分から分離するために通常使用されるものである。このような工程は、ドライアイスまたは液体窒素を用いた植物材料のフラッシュ冷凍のような工程による、病原体タンパク質の本来のコンホメーションの保護を含む、抽出物は、細胞の機械的もしくは化学的破壊を含むプロセスによって形成される。幾つかの場合には、この抽出物を製造するために、追加のタンパク質精製工程が使用されるであろう。本発明の一つの重要な実施例において、工程（３）における融合キャプシドタンパク質は、植物もしくは植物産物の一部であり、哺乳類に給餌される(即ち経ロルートでの投与)。このような場合、植物は生であること、即ち、調理（増殖、保存および輸送に伴う温度を超えた加熱）がされていないことが好ましい。以下で説明する実施例では、植物は調理されない。動物は、典型的には植物、植物の断片、植物のピューレまたは植物ジュースを飲食すればよい。その結果、工程（２）は食用植物または食用植物の一部で行うことが好ましいことが多い。動物は、どのような食物を摂食可能であるかに関して相違がある。最も興味深い植物としては、ジャガイモ、トマト、エンドウ豆、インゲン豆、アルファルファ、柑橘類（例えば、オレンジ、レモン、グレープフルーツ）、ブドウ、人参、イチゴ、ブルーベリーおよび他のベリー類、バナナ、米、小麦、トウモロコシ、大麦、燕麦、ライ麦、ナツメヤシ、キャベツ、ブラッセルモヤシ(Brussel sprou ts)、カリフラワー、カブ、カボチャ、パパイヤ、グアバ、リンゴ、チェリー、アプリコット、ナシ、およびグレープが挙げられる。本発明の他の重要な実施例において、興味深い融合キャプシドタンパク質は精製された形態で植物から抽出され、実質的に純粋なタンパク質として等良され、或いはワクチン投与を容易にし若しくは改善するために、必要なアジュバントもしくは他の化合物と共に投与される。狂犬病ウイルス糖タンパク質（Rgp）の場合のように、工程（１）で述べたポリペプチドは、病原体中の糖タンパク質中のペプチドであってもよい。興味のある病原体病原体は、ウイルス、バクテリア、真菌または寄生体のような何れかの生物体、並びにプリオンのようなに自己複製可能で且つ動物において疾病を誘起できるタンパク質である。本発明によって作製されたワクチンが効果的である病原体としては、ストレプトコッカス属およびスタフィロコッカス属のバクテリア、並びにマイコプラズマ、リケッチアおよびスピロヘータが挙げられるが、これらに限定されるものではない。以下のウイルス群は、全て、本発明のワクチンが適用される代表的なメンバーを含んでいる：即ち、パルボウイルス科、パポバウイルス科、アデノイウルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、イリドウイルス科、ピコルナウイルス科、カリシウイルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科、コロナウイルス科、オルトおよびパラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、ブニアウイルス科、レオウイルス科、ビルナウイルス科、およびレトロウイルスである。本発明のワクチンが特に有用であると期待される病原体は、狂犬病ウイルス、呼吸器シンシチアウイルス、コレラ菌、腸チフス菌、ヘルペスシンプレックスウイルスＩ型およびII型、結核菌、病原性肺炎球菌、ヒト免疫不全ウイルス−１( ＨＩＶ−１)、およびヒト免疫不全ウイルス−２（ＨＩＶ−２）である。病原体のスペクトルには獣医学的に重要なものを含んでおり、パルボウイルス科、パポバウイルス科、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、イリドウイルス科、ピコルナウイルス科、カリシウイルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科、コロナウイルス科、オルトおよびパラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、ブニアウイルス科、レオウイルス科、ビルナウイルス科、およびレトロウイルスが含まれる。グラム陰性菌およびグラム陽性菌の両者およびスピロヘータもまた、本発明の植物ワクチンによって臨床的に影響され得る病原菌と思われる。植物を感染させるための方法遺伝子は、次のものを含む種々の感染手段の何れかによって導入すればよいが、これらに限定されるものではない。１）植物表面を、場合によっては表皮を剥離して、ウイルスまたはウイルス核酸でコートする。２）例えば、小麦についてはV.Vasil et al.，Bio/Technology 9,7443(1991) に、また一般的にはBio/Technoloty 7,503(1989)に記載された、微粒子ボンバード法。３）例えば、レタスについて、M.C．Chupeau et al.，Bio/Technology 7,503( 1989)に記載された、電気穿孔法。４）プロトプラスととのリポソーム融合(A．Deshayes et al.，EMBO J.4,p.27 31-2737(1985))。５）ポリエチレングリコールに媒介された形質転換(I.Potrykus et al.,Mol.G en Genetics,197,183-188)。６）マイクロインジェクション(R．Griesbach，Biotechnology 3，p.348-350; C.K.Shewmaker Mol.Gen.Genetics,202,p.179-185(1986))。組換えタンパク質の保護を高めるために、異なった植物組織（即ち、果実および葉）および異なった細胞内位置（即ち、葉緑体、液胞、原形質膜）に、タンパク質発現をターゲッティングするのが望ましい。また、パイエル板のＭ細胞による取り込みのために、巨大構造の一部として抗原を提示するのも望ましい。主要抗原の提示を、免疫反応を刺激または向上し且つアジュバントとして作用する生物学的に活性な分子と組み合わせるのが望ましいかもしれない。修飾されたプラントは遺伝子的に交配することができるので、アジュバントタンパク質および主要抗原を発現する植物を別々に製造して組み合わせることにより、抗原およびアジュバントを一つの植物中に供給できる。植物ウイルス準アイソメトリック／桿状ウイルスは、J.A.Levy etal.（Virology,3rd editi on,Prentice Hall,Englewood Cliffs,New Jersey(1994)）に従って、二つのサブグループ、即ち、AlMVとアイラーウイルスとに分割される。本発明における抗原提示キャプシドタンパク質は、準／桿状ウイルスのキャプシドタンパク質である。その合成は、問題のキメラキャプシドタンパク質（その成分には、準／桿状キャプシドタンパク質および抗原タンパク質もしくはポリペプチドが含まれる）を製造するために構築されたゲノムによって駆動される。抗原性タンパク質の製造のために、キメラキャプシドタンパク質を植物に導入するウイルスは、それ自身が準アイソメトリック／桿状のウイルスであってもよく、或いは、準アイソメトリック／桿状である正のセンスＲＮＡゲノムをもったエンベロープに包まれていないウイルスであってもよい。以下、AlMVまたはTMVが如何にしてデリバリー担体の主要部分を形成できるかについての例を記載する。タバコモザイクウイルスおよびアルファルファモザイクウイルス本発明を例証するためにここで用いた二つのウイルスは、タバコモザイクウイルス（TMV）およびアルファルファモザイクウイルス（AlMV）である。TMVは、タバモウイルスグループの代表メンバーである。TMVは、独自のコートタンパク質（17.5ｋＤａ）で被包された一本鎖のプラスセンス・ゲノムＲＮＡ（6.5ｋｂ）から成り、これは、杆状体粒子（300ｎｍ）を形成する。タバコモザイクウイルスの広い宿主範囲により、種々の植物種を生産システムおよびデリバリーシステムとして利用することが可能である。タンパク質の発現はウイルス複製にのみ依存しており、植物の核の転写機構を妨害しないので、感染細胞において高レベルのタンパク質が蓄積される。このベクターに挿入された外来遺伝子は、高レベルのタンパク質を生産できることが示されている(Yusibovら、Proc．Natl．Acad． Sci．U.S．92，8980(1995))。ここで例証された組み換え発現ベクターの第二の構成要素は、AlMV CPである。AlMVは、ブロモウイルス（Bromoviridae）科の代表メンバーである。このウイルスのゲノムは、CP（２４ｋＤａ）により被包される３種のプラスセンスＲＮＡ（ＲＮＡ１−３）から成り、これは、３０−６０ｎｍの杆状体粒子を形成する。AlMVの第４のＲＮＡ（サブゲノムＲＮＡ４）は、CP のメッセンジャーであり、ゲノムＲＮＡ３から合成される。ＲＮＡ４は、２０，３０ｎｍの球状粒子へと別々にキャプシドで被包される。ウイルスに重要であると考えられるCPの機能は、感染の開始、ウイルスＲＮＡの安定性、マイナスＲＮＡからプラスＲＮＡへのスイッチング、宿主の全体に亘って感染材料を移動させること、および被包などである。AlMV CPのＮ末端は、ウイルスＲＮＡの３’末端にあるＡＵＧＣ反復配列を必要として、AlMVの全ＲＮＡの３’非コード領域に特異的に結合し、感染を開始させる。CPのカルボキシ末端は、ウイルスＲＮＡのキャプシド被包のために必要である。以前、我々は、そのＮ末端に３７アミノ酸を有するAlMV CPが生物学的活性を保持しており、in vitroで粒子を形成することを示した(Yusibovら、J.Gen.Virol 77,567(1996))。AlMV CPがin vitroでこれら粒子を形成し、大ペプチド有する能力のために、AlMV CPは、TMV発現システムを補充するための付加的構成要素として使用される。挿入配列を有するTMVのin vitro転写産物は、タバコ植物の機械的接種のために使用される。接種から10−1 4日以内に、感染した植物組織を、組織のタンパク質量を測定するため、ウイルス粒子の精製のため、および粘膜の免疫原性を試験する給餌実験のために使用することができる。後者に関しては、動物に給餌し得る低アルカロイドのタバコ植物を、組み換えウイルスを増殖させるために使用する。融合タンパク質（抗原性ポリペプチドに融合したAlMVキャプシドタンパク質）をコードする組み換えウイルスＲＮＡによる感染の後、感染ＲＮＡは化学的に処理され、該感染により二つのタイプのウイルス粒子が生じる。１）組み換えTMV−野生型のTMV CPで被包された組み換えウイルスＲＮＡ；２）組み換えAlMV−融合タンパク質（抗原性ポリペプチドに融合したAl MVキャプシドタンパク質）をコードするサブゲノムＲＮＡおよび融合タンパク質から成る非感染性AlMV粒子。組み換えAlMV CPから成る該粒子は、抗原のデリバリーシステムおよび呈示システムの役割を果たす。これら粒子は、AlMVまたはアイラーウイルスの融合キャプシドタンパク質を有していない組み換えTMV粒子以上の利点をもっている。AlM Vまたはアイラーウイルスのキャプシドタンパク質の使用は、外来の抗原性または非抗原性配列を呈示する１００アミノ酸までのアセンブリーを可能にする。TM V CPは、２５アミノ酸までを呈示することができる。大ペプチドは、TMVのアセンブリーを妨害する。加えて、それぞれの分子が種々の抗原ポリペプチドに融合するAlMV CP分子は、複数の抗原を有する多価粒子へとアセンブリーされるので、これは複数の病原体に対する同時の免疫感作を可能にする。〔実施例〕例１＜ベクターの構築および植物形質転換の方法＞キメラAlMV CPを担持する組換えTMVを含むプラスミドの構築タバコ・モザイク・ウイルスがキメラ遺伝子発現用ベクターとして使用された。TMVゲノムおよび多重クローニング部位を含むプラスミドB30RzおよびAvB30Rz （Proc.Natl.Sci.U.S.88,7204(1991)）が、フロリダ大学のウイリアム・ドーソン（William Dawson）博士より寄贈された。すべての融合キャプシドタンパク質がAlMV CPを使用して作成された。該AlMV CPにおいて、最初のAUGコドン（AlMV CPのインビトロ翻訳用開始コドン）はTCGと交換されてクローニング用のXhol（CTCGAG）部位を作成しており、RNA分子は翻訳されなかった[インビトロまたはインビボで安定かつ検出可能なポリペプチドの合成をサポートする連続的なオープンリーディングフレームを持たないRNA分子、psPΔAUG(Yusibov and Loesch-fries,Virology 208,405(1994))]。例えば、ヒト免疫欠損ウイルス（HIV ）および狂犬病ウイルス由来のペプチド類またはタンパク質類は、AlMVのキャプシドタンパク質との融合物として作成され、B3ORz中にクローンされた。完全長AlMV CPおよびHIV−1MN菌株のV3ループからなる融合タンパク質の構築 HIV-1エンベロップタンパク質（env,160）の配列を含むプラスミドDNAが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のテンプレートとして使用された。（このようなプラスミドは、PCRクローニングを使用して、V3ループを含むgp120配列を含むHI V−1MN菌株のcDNAをPCRIIベクター中（invirogen,Inc）または他の適切なベクター中にクローンすることによって作ることができる。ここで使用されたプラスミドは、ペンシルベニア大学デビット・ワイナー(David Weiner)によって提供された。HIV−1エンベロップタンパク質の配列を含むプラスミドDNAについてのPCRを、第一鎖プライマーとしてを使用し、第二鎖プライマーとして、を使用して行なった。このPCR産物をXho1で消化し、Xho1で直鎖化されたpSPCPΔ AUG中に連結した。この連結産物pSPCPMNV3は、HIV V3ループをコードしているＤＮＡおよび完全長AlMV CPを含んでいた。翻訳開始コドン（AUG）が、該コドンのみから完全長の融合タンパク質が読み取れるように、Ｖ３ループの第一コドン（ CysのコードであるUGC）の上流に作成された。該クローンはまた、AlMVの5'-側( 野生型AlMN CP翻訳開始コドンの上流の37 ヌクレオチド)および3'-側（構築物のAlMV起源を含むAlMV CP停止コドンに続く1 92ヌクレオチド）の非コード領域を含んでいた。HIV−1 V3ループに対するDNA、 AlMN CPおよびAlMN CPの5'-側および3'-側の非コード領域を含むpSPCPMNV3のセグメントは、EcoRIおよびSmalによって切除されて、Xho1で開裂されていたB30Rz 中に、平滑末端連結によって連結された。その結果得られたプラスミドは、pBRz CPMNV3であった。この戦略（HIV1 MN菌株のV3ループのクローニングとして述べたもの）を使用して、HIV-1 ＮL4.3菌株のV3ループ、vprおよびvpuをクローンした。これらの遺伝子の特異的配列を得るためにPCR反応に使用されるプライマーが、表１に掲載されている。そのPCR産物を、Xholで直線化されたPSPΔAUG中にクローン化してAlMP CPと融合し、キメラタンパク質を創造した。その結果得られたプラスミドは、pSPCPNLV3、pSPCPNLVpr、およびpSPCPNLVpuと命名された。V 3ループ、vpr、またはvpuを担持する完全長融合タンパク質をB30Rz中に導入し、プラスミドpBRzCPNLV3、pBRzCPNLVpr、およびpBRzCPNLVpuを作製した。これらのプラスミドは、完全長TMV分子およびTMP CPのサブゲノム・プロモータ下でサブクローンされた作成融合タンパク質を含む。 DNV10cは、狂犬病ヌクレオカプシドタンパク質の直線状エピトープ（NV10c）と合成ペプチド31Dのキメラである。Drg24は、狂犬病糖タンパク質の直線状エピトープ（rg24）と合成ペプチド31Dとのキメラである。NV10cおよびrg24は、Ｂ細胞決定因子である。合成ペプチド31Dは、Ｔ細胞決定因子である。狂犬病ウイルスのＮ（NV10C）およびＧ（g24）タンパク質の直線状エピトープは、合成ペプチド31Dとのキメラとして作成され、該キメラはAlMV CPと融合された。各キメラ（DNV10cおよびDrg24）は、お互いがテンプレートとして働くオーバーラップ・プライマー（表１）を使用して、PCRによって合成された。該プライマーは、第一鎖および第二鎖のプライマーが、PCR反応中にアニールする事になる18の相同ヌクレオチドを持つように作成される。このように、各プライマーが、他のプライマーのテンプレートとして働き、新しい鎖の合成をサポートする。これらのプライマーは。既知のアミノ酸配列を合成するために作製された。これらの反応から得られたPCR産物は、Xho1で消化され、pSPCPΔAUG中にクローン化されてAlMV CPと融合された。この結果得られたプラスミドは、pSPCPDNV10cおよびpSPCPDrg24と命名された。完全長融合キャプシドタンパク質および5'-,3'- 側非コード領域の配列をEcoRI÷Smalによって切断し、Xho1で直線化されたB30Rz 中にクローン化し、続いて平滑末端連結を行って、pBRzCPDNV10cおよびpBRzCPDr g24を作成した。上記記載のすべてのクローン（pSPCPMNV3、pSPCPNLV3、pSPCPNL Vpr、pSPCPNLVpu、pSPCPDNV10c、およびpSPCPDrg24）は、最終ベクター中にクローンされる前に、インビトロの翻訳および配列分析に供された。キメラＡＣＰ／ＴＭＶの構築 AlMV CPで被包されたキメラTMVを作成するために、我々は、翻訳不可能なコートタンパク質を持つTMVベクター（Av／TMV）を使用した。Av／TMVは、フロリダ大学のウイリアム・ドーソンの実験室で作成された。該プラスミドは、上記記載のクローニングに使用されたB30Rzから誘導した。該プラスミドの概略は、図1A に示される。該キメラウイルスを加工するために、野生型または組換えAlMV CP( Drg24を持つCP)はTMV CPサブゲノム・プロモータの制御を受けるようにクローン化された。該AlMV CPを、pSP65A4(Yusibov and Loesch-Fries,Proc Natl.Acd.Sci.US92,8980(1995))からEcoRI＋SmaIによって切り出し、Xho1によって消化されたAv／TMV中に平滑末端によって連結して、pAV／ ACPを作成した。pAv／ACPDrg24は、上記記載のプライマーおよびXho1クローニング部位を使用して、pBRzCPDrg24と同じく作成された。インビトロ転写および翻訳組換え遺伝子のインビトロ転写物または組換え TMVは、プロメガ(Promega)T7またはSP6 RNAポリメラーゼおよびCsCl精製されたプラスミドDNAを使用して合成された。該反応は、メーカーの案内書に従って遂行された。転写物は、RNAキャップ構造類似物（m7G（5）ppp（5）G，Biolabs）を使用して被包された。転写物は、インビトロ翻訳によって分析され、各RNAのメッセンジャー活性が確定された。インビトロ翻訳反応は、無小麦胚芽細胞翻訳系（Promega）および³⁵SMet（DuP ont）を使用して行なわれた。該反応は、メーカーによる記載の通り実施され、その結果得られた産物は、13％SDSポリアクリルアミドゲル中で電気泳動によって分離され、その後オートラジオグラフィにかけられた。プロトプラストの調整、接種および免疫分析プロトプラストは、無菌のタバコ・プラント（Nicotiana tabacum var.Xanthi -nc）から文献（Yusibov and Loesch-Fries，1996）に記載されているようにして分離され、ポリエチレン・グリコール手法（Yusibov and Loesche-Fries,Proc .Natl.Acad.Sci.U.S.1995）を使用して、1x10⁵プロトプラスト当たり組換えTMV 転写物３μｇで接種された。接種後、プロトプラストは、氷上で（15分）インキュベートされ、ペレット化され、10％マンニトールで二回洗浄された。最終spee nの後、該プロトプラストは、1xAlOK培地（0.2mM,KH₂PO₄,１mM KNO₂１mM MgSO₄, １μＭ KI,0.1μＭ CuSQ,10mM CaCl₂・2H₂O,pH6.5）中に再懸濁され、25−27℃ 、低光量条件下でインキュベートされた。該プロトプラストは、インキュベーション後24時間で採集され、AlMV CP（Loesch−Fries & T Hall,J.Gen,Virol.,47, 323(1980)）に対するモノクローナル抗体を使用した免疫蛍光検査によって分析され、組換えタンパク質の蓄積を測定した(免疫蛍光顕微鏡検査またはウエスタン分析)。粒子の免疫沈殿組換えウイルスの転写物で共感染させた植物組織から抽出された粒子を、狂犬病Ｇタンパク質（rg24）の直線状エピトープに対するモノクローナル抗体を使用して免疫沈殿させた。抗体（Dietzschold et al.,Virology64,3804(1990)）は、組換えウイルスと１：500（ｗ：ｗ）の割合で混合され、４℃で二時間攪拌しながらインキュベートされた。２時間以内に、５０μｌのフォルマリン固定された staph.A細胞の懸濁液がインキュベーション混合物中に添加され、もう１時間同じ条件でインキュベーションが継続された。インキュベーション終了後、該細胞をペレット化し、ウイルス粒子が貯蔵されていた原緩衝液（りん酸ナトリウム緩衝液、pH7.2）で３回洗浄された。最終ペレットは、50μｌのタンパク質充填緩衝液中に再懸濁され、ウエスタン分析に使用された。ウエスタン分析被ウイルス感染組織、精製されたウイルスサンプルからのタンパク質調整物、または免疫沈殿物からのタンパク質調整物が、SDS-PAGE電気泳動上で分離され、トウビン（Towbins）トランスファー緩衝液（0.025M Tris、0.192Mグリシン、20 ％メタノール、pH8.3）を使用して、一晩33mAで、ナイロン膜上に電気ブロットされた。ミルク（Kierkegarden）でブロックした後、これらのタンパク質は適切な抗体（Westatin stain kit manuacturer(sigma)）と反応させた。植物感染およびウイルス単離タバコの葉の一次感染が、上記記載の組換えTMV菌株のインビトロ転写産物で開始された。組換えウイルスの転写産物を、30mMりん酸ナトリウムpH7.2中で１：１（最終濃度15mM）に希釈し、消費されるタバコの葉（３−４週齢に生育）に適用された。カルボランダム（carborumdum）（320grid;Fisher,Pittsburgh,PA ）の存在下、優しくこする事によって接種を行ない、接種物を延ばして拡げ、葉の表面をこすった。接種物は、擦った後に適用された。接種されたN．bentamian a植物は、温室中で単離され、通常の水遣りおよび施肥によって保持された。組換えタンパク質を担持しているウイルス粒子を、局所的に体系的に感染したタバコの葉から単離するために、タバコの葉は、接種から12日目に収穫された。葉の組織は、液体窒素中で凍結され、予め冷却された乳鉢で粉砕された。粉砕された組織は、緩衝液（1ml/組織1g、0.25Ｍ燐酸ナトリウム、pH7.2）を含む殺菌された管中に移され、ボルテックスによって再懸濁され、続いて10、00 0rpｍ、15分間遠心分離された。サンプルの操作の全ては、０-４℃で実施された。遠心分離後、上澄み液を新しい管に移し、ウイルス粒子を、4％のポリエチレン・グリコール（MW15,000‐20,000）および50mMNaClを含む緩衝液中に、２時間、選択的に沈殿させた。ポリエチレン・グリコールは、ウイルス粒子を沈殿させる構成成分である。該ウイルス粒子は、次に10,000rpｍ、20分でペレット化された。該ペレットは、25mＭ燐酸ナトリウム緩衝液、pH7.2で再懸濁され、同様の条件下でもう一度遠心分離されて、有望なプラント粉砕物および不溶解プラント構成物を分離した。本ステップからの上澄み液（ウイルスを含む）が、以降の実験に使用された。例２融合キャプシドタンパク質の合成融合キャプシドのin vitroにおける翻訳最終ベクター（３０ＢＲＺ）にクローニングする前に、融合キャプシドタンパク質の完全なオープンリーディングフレームの存在について、配列分析および／またはin vitroにおける翻訳により、組み換え遺伝子を検査した。配列分析は、ＰＣＲの原断片を含有するＣｓＣｌ精製プラスミドＤＮＡ（pSPCPMNV3、pSPCPNL V3、pDPCPNLVpr、pSPCPNLVpu、pSPCPD10c、およびpSPCPDrg24）およびＳＰ６プライマーを用いて行った。ＣｓＣｌにより、組み換えプラスミド（pSPCPMNV3、p SPCPNLV3、pDPCPNLVpr、pSPCPNLVpu、pSPCPD10c、およびpSPCPDrg24）が精製された。操作遺伝子を含有するＤＮＡをＳｍａＩで処理し、in vitroにおける転写に使用した。ＳＰ６ポリメラーゼを用いて組み換え遺伝子のキャップ付き転写産物を合成し、上記のコムギ胚の無細胞系翻訳システムで翻訳した。検査した全ての転写産物は、メッセンジャー活性を有し、期待したサイズのポリペプチドへの³⁵ ＳＭｅｔの取り込みを指令した。感染させたタバコ・プロトプラストにおける融合キャプシドタンパク質の翻訳 TMVベクターからの融合キャプシドタンパク質の発現を評価するため、組み換えウイルスの完全長のキャップ付き転写産物を作成し、タバコ・プロトプラストの感染に使用した。１×１０⁵あたり３μｇの転写産物を接種した２４時間後、プロトプラストを回収し、免疫学的検定およびウェスタン解析のために使用した。我々がAlMV CPに対する検出用抗体(Loesch−Fries and T.Hall,J.Gen.Virol., 47,323(1980))を使用した固定化プロトプラストの免疫蛍光アッセイは、個々の感染細胞において相当量のタンパク質が蓄積することを示した(データ示さず)。発現したタンパク質のサイズおよび該タンパク質の特異的抗体との反応を評価するため、該タンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、ナイロンメンブレンに移し、各ペプチド（結果は示さず）またはAlMV CPに対するモノクローナル抗体と反応させた（図２）。融合キャプシドタンパク質の全てが、期待したサイズの範囲内（28−35ｋＤａ）で移動し、AlMV CPまたは特異的ペプチドに対するモノクローナル抗体と反応した。融合タンパク質のサイズの違いは、AlMV C Pペプチドと融合した各々のサイズの違いに依るものである。感染させた植物における融合キャプシドタンパク質の発現局所的および全体的に感染させた植物組織における組み換えタンパク質の発現を評価するため、タバコの発達中の葉に組み換えTMVの転写産物を接種した。接種から１２日後、そのウイルスを、局所的および全体的に感染させた葉から別々に精製した。局所的な感染においては、最初に接種した葉で感染が起こった。全体的な感染において、ウイルスの拡散は、新たに成長中の非接種の葉まで植物の至るところで起こった。感染した組織を30−50ｍｇ精製する前に、組み換えAlMV 粒子がTMV粒子とともにアセンブリーされるかどうかを測定するために使用した。該組織をホモジナイズし、その液を炭素被覆されたグリッド上に載せた。電子顕微鏡写真は、（組み換えAlMVを示す）球状粒子が、全ての構築物（pBRzCPMNV3 、pBRzCPNLV3、pBRzCPNLVpr、pBRzCPNLVpu、pBRzCPDNV10c、およびpBRzCPDrg24 ）の転写産物の感染によりアセンブリーされることを示す。図３は、２％酢酸尿素を用いた粒子（野生型B30Rzおよび組み換え型BRzCPDrg24）の陰性染色の結果を示す。精製されたウイルスサンプルのウェスタンブロット解析により、局所的および全体的に感染した葉からの両サンプルとも、融合キャプシドタンパク質の存在が実証された（図４）。このことは、組み換えウイルスが生存可能で、植物全体を移動する間、融合キャプシドタンパク質を保持していることを示している。 pAv/ACP およびpAv/ACPDrg24によるタバコ植物の感染 pAv/ACPまたはpAv/ACPDrg24のin vitroにおける転写産物が、タバコ植物の接種のために使用された。８日以内に、組織サンプルを回収して、非接種の葉におけるウイルスの全体的な拡散を評価した。ウェスタン解析（データ示さず）により、全体的な非接種のタバコ葉において、ｗｔ(ACP)または組み換え（ACPDrg24 ）タンパク質が検出され、このことは、AlMV CPがCP欠陥性TMVの全体的な拡散を助けることを示している。ベクターそれ自体（pAv/TMV）の転写産物を接種した植物は、接種の２０日後でさえ、タバコ植物に何ら全体的な兆候を示さなかった。種々の病原体由来のエピトープを呈示する組み換えAlMV粒子のアセンブリー pBRzCPMNV3、pBRzCPNLV3、pBRzCPDNV10c、およびpBRzCPDrg24により感染した植物から、感染した葉組織のサンプルを採取し、ひとまとめにして、タバコ植物の感染のために使用した。ウイルス粒子を接種から１２日後に精製し、種々の構築物からの組み換えAlMV CPの共集合について評価した。ウイルス粒子を、狂犬病Ｇタンパク質（rg24）の直鎖状エピトープに対するモノクローナル抗体およびホルマリン固定化Staph A細胞を用いて免疫沈降させた。免疫沈降による生成物を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（上記）により分離し、ウェスタンブロット解析に使用した。分離したタンパク質を、AlMV CP用のモノクローナル抗体、狂犬病ＮおよびＧタンパク質の直鎖状エピトープに対する抗体、およびHI V1 MN株のＶ３ループに対する抗体（National Institute of Allergy and Infec tious Diseases、AIDS Research and Reference Reagent Program、HIV-1 V3に対する#1728抗体）に反応させた。全ての抗体は、ゲル分離後、免疫沈降生成物と反応し（図５）、このことは、共感染により、AlMV CP分子が種々の病原体からの抗原エピトープを呈示する多価抗体粒子へと集合することを示している。図５で観察される高分子量のバンドは、コントロールウイルスのもの（AlMV CP）と類似のタンパク質ダイマーを表している。例３狂犬病糖タンパク質のDrg24ペプチド・エピトープを発現する AlMV／TMV構築物によるマウスの免疫処置８週齢のメスのスイス−ウェブスター、異系交配マウスを、一回投与に付き１０μｇの狂犬病糖タンパク質のｒｇ２４エピトープを発現するように操作された組み換えTMVウイルスで免疫処置した。0.1ｍＬの３回免疫処置は、１：１の体積比でFreund完全アジュバント（ＣＦＡ）を含む場合および含まない場合、それぞれ２週間の間隔で腹膜内に投与した。野生型AlMVプラスTMVの等量混合物を、コントロールとしてＣＦＡを含む場合および含まない場合で用いた。各免疫処置の１０ないし１４日後、血清サンプルを個々のマウスから採取して、狂犬病ウイルス特異的抗体の力価を評価した。血清の抗原特異的抗体解析を、固相酵素免疫検定法(ELIZA)で行った。ELIZAプレート（Nunc Polysorp,Denmark）を、ウェルあたり100μＬの不活性化したＥＲＡ株・狂犬病ウイルス（リン酸・緩衝化した食塩水中で５μｇ／ｍＬ）を用いて、室温で一晩（ＲＴ；約２５℃）表面を覆った。被覆したプレートをPBS−Tween（0.05％）で３回洗い、次いでＰＢＳ中の５％乾燥ミルクを用いて、ＲＴで少なくとも１時間ブロックした。血清の一連の希釈液を、プレートに（３０μＬ／ウェル）２ないし４時間ＲＴで添加した。次いで、プレートをＰＢＳ−Tweenで３回洗って、ペルオキシダーゼ結合の二次抗体（分子全体またはガンマ鎖特異的であるヤギの抗−マウスＩｇＧ）を、ＰＢＳ中１：2000の最終希釈で、１時間ＲＴで添加した(100μＬ／ウェル)。次いで、プレートをＰＢＳ−Tweenで５回洗い、ＴＭＢ基質を、尿素含有のリン酸−クエン酸緩衝液中で、３０分間ＲＴで暗所において添加した(100μＬ／ウェル)。反応を２ＭのＨ₂ＳＯ₄で停止させ（５０μＬ／ウェル）、結合した特異的抗体から生じる色の変化を、エリザプレート・リーダー（Bio−Tek,Winooski VT）で45OｎＭにおいて測定した。Ｏ．Ｄ．単位で表示した結果を示す(図６Ａ)。Drg24を有する粒子で免疫処置されたマウスの８０％が狂犬病特異的抗体をもっていた(図７) 。狂犬病ウイルスの特異的中和を、改良型高速蛍光フォーカス形成アッセイを用いて評価した(図６Ｂ)。血清は５６℃で３０分間の処理により不活性化し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＭＥＭ培地中で最初の１／５に希釈した。１／５血清希釈液を、各ウェルが５０μＬの滴定血清を含有するように、９６穴プレート（Nunc）中でさらに連続して１／２（１体積プラス１体積の希釈液）に希釈した。狂犬病ＣＶＳ−１１ウイルスの３０ μＬの調製品を各ウェルに添加した。狂犬病ウイルス溶液は、５０μＬの培地および３０μＬのＢＨＫ指示薬細胞（1.5×１０⁶／ｍＬ）で希釈した３０μＬが、２０時間後、単層培養中の細胞の８０から９０％の感染を引き起こすのに充分なウイルスを含有するように、調製した。血清希釈液および狂犬病ウイルスを含有する９６穴プレートは、３０μＬのＢＨＫ指示薬細胞（1.5×１０⁶／ｍＬ）と充分に混合される前に、１時間３７℃でインキュベートした。これら混合物の各々の１０μＬを、Terasakiプレート（Nunc）のウェルに移した。Terasakiプレートを２０時間３７℃で９５％空気および５％ＣＯ₂の加湿大気中でインキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳで３回洗い、細胞を氷冷アセトン（９０％）の２０分間の添加により固定した。次いで、プレートを空気乾燥して、フルオレセイン結合・狂犬病ウイルス特異的抗体（Centocor）の１／４０希釈液５μＬを、各ウェルに４０分間３７℃で添加した。次いで、プレートを水で３回洗い、感染したＢＨＫ細胞のパーセンテージを、蛍光顕微鏡（Leitz）を用いて評価した。図６Ｂは、血清中の中和抗体の存在を示す。例４ TMV核酸を含まないAlMV構築物上記の構築物に類似のTMVのＲＮＡを含まないAlMV構築物を、TMV組み換え構築物と類似の方法で構築した。AlMVの核酸をTMVのＲＮＡと置換した。AlMVゲノムの構造が公表され、AlMVゲノムによりコードされる必須の機能をマッピングした (Bolら、Virology 46,73(1971);Bolら、Virology 58,101(1974))。例５キメラ狂犬病ペプチドＤｒｇ２４を有する組み換えAlMV CPを含んだAlMV／TMV構築物によるマウスの免疫処置、および免疫処置されたマウスのＣＶＳ−２４株・狂犬病ウイルスによる攻撃誘発８週齢の雌スイス−ウェブスター異系交配マウスを、一回投与に付き５０ｍｇの狂犬病ウイルスのキメラエピトープ(DRg24)を有する組み換えAlMV CP(CPDrg24 )を発現するように操作された組み換えTMVウイルスで免疫処置した。0.1ｍＬの３回免疫処置は、２週間の間隔で腹膜内に投与された。この実験ではアジュバントは使用しなかった。野生型ＡＭＶプラスTMVの等量混合物を、コントロールとして使用した。各免疫処置の１４日後、血清サンプルを個々のマウスから採取して、狂犬病ウイルス特異的抗体の力価を評価した。血清の抗原特異的抗体解析を、例３に記載の固相酵素免疫検定法（ELIZA）で行った。狂犬病ウイルスの特異的中和を、改良型高速蛍光フォーカス形成アッセイを用いて評価した。このアッセイは、CVS-11株・狂犬病ウイルスを用いて例３に記載したようにして行った（表２）。３回目の免疫処置から１４日後、マウスのグループ（１グループ内１０マウス）に、CVS-24株・狂犬病ウイルスを、ＩＭＬＤ５０（「筋肉内の50％致死量」）の約１０倍に相当する致死量で接種した。全てのコントロールマウス（免疫処置なしのマウスおよびベクターのみで免疫処置したマウス）は、６ないし７日目までに死亡したが、CPDrg24で免疫処置されたマウスの40％は保護された。CPDrg24により免疫処置されたマウスの６０％は、１５ないし１６日目までに死亡した。しかし、免疫処置された全マウスは、コントロールマウスまたは免疫処置なしのマウスより長く生存し、このことは、免疫処置された全マウスに関するあるレベルの保護免疫性を示す。攻撃誘発実験の結果を表２に示す。例６ HIV-１MN株のV3ループを有する組み換えAlMV CPを含むAlMV ／TMV構築物によるマウスの免疫処置８週齢の雌スイス−ウェブスター異系交配マウスを、一回投与に付き１０ｍｇのHIV-１ MN株のＶ３ループを有する組み換えAlMV CP（CPMN Ｖ３）を発現するように操作された組み換えTMVウイルスで免疫処置した。0.1ｍＬの７回免疫処置は、２週間の間隔で腹膜内に投与された。0.1ｍＬの３回免疫処置は、１：ｌの体積比でFreund完全アジュバント（ＣＦＡ）を含む場合および含まない場合、それぞれ２週間の間隔で腹膜内に投与した。野生型AlMVプラスTMV の等量混合物（図８における３０Ｂ／AlMV）を、コントロールとしてＣＦＡを含む場合および含まない場合で用いた。各免疫処置から１４日後、血清サンプルを個々のマウスから採取して、狂犬病ウイルス特異的抗体の力価を評価した。血清の抗原特異的抗体解析を、例３に記載の固相酵素免疫検定法(ELIZA)で行った。C PMNV3で免疫処置したマウスからの血清を、HIV-1のＶ３ループに由来する合成ペプチドに特異的な抗体の存在について評価した。HIVに特異的な血清抗体が、３回目の接種の後、低レベルで検出された。CPMNV3による最後の免疫処置から１４日後、HIV−1 MN単離株のＶ３ループに特異的な血清抗体が、図８Ａ、図８Ｂ、および図８Ｃで示されるように、ELISAおよび中和アッセイの両方で検出された。免疫前血清は、１：128および１：256の希釈において低い中和活性（約２５％）を有していたが、CPMNV3を接種された実験マウスからの血清は、それぞれ同じ希釈において、平均約８０％および７６％の中和活性が実証された(図８Ｃ)。 HTLV-I/MT2細胞株（NIH AIDS Research and References Reagent Programから入手）を、ＨＩＶ−１中和アッセイにおいて標的細胞として使用した。これらの細胞を、１０％ＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシンおよびピルビン酸塩を補充したRPMI 1640培地中で維持した。無細胞系HIV-1/MN単離株を、記載どおりにHTLV-I/MT2細胞中で増殖させた。無細胞系ウイルス（100TCID50）を、熱不活性化した免疫前血清または免疫性血清の種々の希釈液とともに、１時間３７℃においてプレインキュベーションした。インキュベーションの後、血清処理したウイルスを、HTLV-I/MT2細胞に感染させるのに使用した。シンシチウム形成を、位相差顕微鏡により、HTLV-I/MT2細胞の接種から５日後に観察した。例７キメラ狂犬病ペプチドDrg24を有する組み換えAIMVCPを含むAMV/TMV構築物によるマウスの経口免疫処置８週齢のメスのスイス−ウェブスター、異系交配マウスを、一回投与に付き25 0ｍｇの狂犬病ウイルスのキメラエピトープ(Drg24)を有するAlMV CP(CPDrg24)を発現するように操作された組み換えTMVウイルスを用いて、胃挿管法により免疫処置した。0.1ｍＬの５回免疫処置は、２週間の間隔で経口投与された。この実験において、アジュバントは使用されなかった。野生型ＡＭＶプラスTMVの等量混合物（図９Ａおよび図９ＢにおけるA/TMV）をコントコールとして用いた。各免疫処置から１４日後、血清サンプルを個々のマウスから採取して、狂犬病ウイルス特異的抗体の力価を評価した。血清の抗原特異的抗体解析を、例３に記載の固相酵素免疫検定法(ELIZA)で行った。狂犬病ウイルス特異的ＩｇＧおよびＩｇＡは、免疫処置されたマウスの血清において増大したレベルで検出された( 図９Ａおよび図９Ｂ)。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 15/09 ＺＮＡ 5/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:92） (72)発明者フーパー、ダグラス・クレイグアメリカ合衆国、ニュージャージー州 08055、メドフォード、オレゴン・トレール２ (72)発明者ユスィボブ、ビダディアメリカ合衆国、ペンシルバニア州 19083、ハバータウン、イースト・ダービー・ロード 2323、アパートメント 512 (72)発明者モデルスカ、アンナアメリカ合衆国、ペンシルバニア州 19096、ワインウッド、フェアヒル・ロード 334

Claims

【特許請求の範囲】１．動物にポリペプチドを投与する方法であって：（１）植物細胞中でプロセッシングされて、ウイルスキャプシドタンパク質（AlMVキャプシドタンパク質またはアイラーウイルスキャプシドタンパク質）および植物ウイルスキャプシドタンパク質でないポリペプチドを含む融合キャプシドタンパク質を産生する組換え植物ウイルス核酸を、植物細胞に感染させて感染細胞を作製する工程と、（２）この感染細胞または該感染細胞から誘導された派生細胞を、前記感染細胞または派生細胞が前記融合キャプシドタンパク質を製造するような条件下で培養する工程と、（３）前記融合キャプシドタンパク質またはその一宇を動物に投与する工程とを具備する方法。２．請求項１に記載の方法であって、前記組換え植物ウイルス核酸がTMV核酸を含む方法。３．請求項１に記載の方法であって、該方法の結果物が保護免疫である方法。４．請求項１に記載の方法であって、前記融合キャプシドタンパク質が植物または植物材料の一部である方法。５．請求項１に記載の方法であって、前記工程（３）において、前記融合キャプシドタンパク質は前記植物から純粋な形で抽出され、また植物の他の化合物を実質的に含まないタンパク質として投与される方法。６．請求項１に記載の方法であって、前記タンパク質はラブドウイルスタンパク質である方法。７．請求項１に記載の方法であって、前記ポリペプチドはヒト免疫不全ウイルスタンパク質である方法。８．請求項１に記載の方法であって、前記動物は哺乳類である方法。９．動物にポリペプチドを投与する方法であって：（１）植物細胞中でプロセッシングされて、夫々が、植物ウイルスキャプシドタンパク質でない異なったポリペプチドを含み、更にAlMVキャプシドタンパク質もしくはアイラーウイルスキャプシドタンパク質を含む複数の融合キャプシドタンパク質を産生する複数の組換え植物ウイルス核酸を、植物細胞に感染させて感染細胞を作製する工程と、（２）この感染細胞または該感染細胞から誘導された派生細胞を、前記感染細胞または派生細胞が前記融合キャプシドタンパク質を製造するような条件下で培養する工程と、（３）前記融合キャプシドタンパク質またはその一宇を動物に投与する工程とを具備する方法。１０．ポリペプチドを製造する方法であって：（１）植物細胞によりプロセッシングされて、AｌMVまたはアイラーウイルスキャプシドタンパク質およびポリペプチド（これは植物ウイルスキャプシドタンパク質ではない）を含む融合キャプシドタンパク質を産生する組み替え植物ウイルス核酸を、植物細胞に感染させることにより感染細胞を作製する工程と、（２）前記感染細胞または前記感染細胞から誘導された派生細胞を、前記感染細胞または派生細胞が前記融合キャプシドタンパク質を製造する条件下で培養する工程とを具備する方法。１１．三成分融合キャプシドタンパク質を有する組換えウイルスであって、A ｌMVまたはアイラーウイルスでないウイルスのキャプシドタンパク質と、AlMV又はアイラーウイルスのキャプシドタンパク質と、植物ウイルスポリペプチドでないポリペプチドとを含む融合キャプシドタンパク質。１２．請求項１に記載の方法であって、前記方法の結果が、前記融合キャプシドタンパク質の一部であるが、植物ウイルスタンパク質ではないポリペプチドに対する免疫反応である方法。１３．請求項１２に記載の方法であって、前記免疫反応が、前記ポリペプチドに対する抗体のｓなんせいである方法。