JP2010508860A - パパイヤモザイクウイルスに基づくインフルエンザ用ワクチン - Google Patents
パパイヤモザイクウイルスに基づくインフルエンザ用ワクチン Download PDFInfo
- Publication number
- JP2010508860A JP2010508860A JP2009536573A JP2009536573A JP2010508860A JP 2010508860 A JP2010508860 A JP 2010508860A JP 2009536573 A JP2009536573 A JP 2009536573A JP 2009536573 A JP2009536573 A JP 2009536573A JP 2010508860 A JP2010508860 A JP 2010508860A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- vlp
- papmv
- protein
- coat protein
- influenza virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55516—Proteins; Peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6075—Viral proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/64—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the architecture of the carrier-antigen complex, e.g. repetition of carrier-antigen units
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/00022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/00023—Virus like particles [VLP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/00041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2770/00043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
インフルエンザウイルスVLPも当技術分野において記述されている(特許文献2〜4参照)。B型肝炎ウイルス(HBV)(非特許文献24)又はヒト乳頭腫ウイルス(HPV)(非特許文献25)へのM2eペプチドの化学的架橋及びHBVコートタンパク質とM2eペプチドのインフレーム融合(非特許文献4及び24、及び特許文献5)はすべて、インフルエンザウイルスでの抗原投与に対してマウスを防御することに成功した。インフルエンザウイルスヘマグルチニン又は核タンパク質エピトープに融合した酵母レトロトランスポゾンTy p1タンパク質から作製されたキメラVLPも記述されている(特許文献6)。
本発明のもう一つの態様に従って、1つ以上のインフルエンザウイルス抗原に融合したパパイヤモザイクウイルスコートタンパク質を含むポリペプチドが提供される。
本発明のもう一つの態様に従って、動物においてインフルエンザウイルス免疫応答を誘導するための抗原提示系の使用方法が提供され、前記抗原提示系は、パパイヤモザイクウイルス(PapMV)又はPapMVコートタンパク質を含むVLPと併用される1つ以上のインフルエンザウイルス抗原を含む。
本発明のもう一つの態様に従って、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する方法が提供され、前記方法は、1つ以上の抗原提示系を含有する組成物の有効量を動物に投与することを含み、前記抗原提示系の各々は、パパイヤモザイクウイルス(PapMV)又はPapMVコートタンパク質を含むVLPと併用される1つ以上のインフルエンザウイルス抗原を含む。
異なる定義が為されない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書で使用される、「免疫応答」という用語は、抗原又は抗原性物質に応答した動物の免疫系の反応性の変化を指し、抗体産生、細胞媒介性免疫の誘導、補体活性化、免疫学的寛容の発現、又はそれらの組合せを含み得る。
物体に適用されるとき、本明細書で使用される「天然に生じる」は、物体が自然界において見出され得るという事実を指す。例えば、生物(ウイルスを含む)、又は自然界のソースから単離されることができ、実験室においてヒトによって意図的に改変されていない、生物内に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、天然に生じるものである。
本明細書で使用される「免疫原」及び「抗原」という用語は、単独で又はアジュバントとの併用により、被験者において免疫応答を誘導することができる全細胞及び組織までを含む、1つの分子、複数の分子、分子の一部又は複数の部分、又は分子の組合せを指す。免疫原/抗原は、1個のエピトープを含み得るか又は複数のエピトープを含み得る。それ故この用語は、ペプチド、炭水化物、タンパク質、核酸、及びウイルス、細菌及び寄生生物を含む、全体的又は部分的な、様々な微生物を包含する。ハプテンも、本明細書で使用される「免疫原」及び「抗原」の用語に包含されるとみなされる。
本明細書で使用される「動物」という用語は、哺乳動物、鳥類及び魚類を含むがこれらに限定されない、ヒト及び非ヒト動物の両方を指し、例えばウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ又は他の有蹄動物、イヌ、ネコ、ニワトリ、アヒル、非ヒト霊長動物、モルモット、ウサギ、フェレット、ラット、ハムスター及びマウスのような、家畜、動物園の動物、実験動物及び野生動物を包含する。
本発明の抗原提示系(APS)は、パパイヤモザイクウイルス(PapMV)又はPapMVコートタンパク質に由来するVLPと併用される1つ以上の抗原を含む。「に由来する」とは、VLPが、野生型コートタンパク質の配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するコートタンパク質を含み、場合により、以下でより詳細に述べるように、コートタンパク質に結合した1つ以上の抗原を含み得ることを意味する。PapMVコートタンパク質は、野生型コートタンパク質の配列又はVLPを形成するように多量体化し、自己組織化することができるその修飾型を含み得る。本発明の一つの実施形態では、以下で詳述するように、APSはインフルエンザウイルスからの1つ以上の抗原を含む。
本発明のAPSは、PapMV及びPapMV VLPのいずれかを含む。PapMV VLPは、VLPを形成するように多量体化し、自己組織化した組換えPapMVコートタンパク質から形成される。組織化したとき、各々のVLPはコートタンパク質サブユニットの長いらせん配列を含む。野生型ウイルスは1200超のコートタンパク質サブユニットを含み、約500nmの長さである。野生型ウイルスより短い又は長いPapMV VLPも、しかしながら、有効であり得る。本発明の一つの実施形態では、VLPは少なくとも40個のコートタンパク質サブユニットを含む。もう一つの実施形態では、VLPは約40〜約1600個のコートタンパク質サブユニットを含む。選択的実施形態では、VLPは少なくとも40nmの長さである。もう一つの実施形態では、VLPは約40nm〜約600nmの長さである。
本発明の一つの実施形態に従って、APSは1つ以上のインフルエンザ抗原を含む。抗原は、インフルエンザウイルスに由来する免疫原、エピトープ、ミモトープ又は抗原決定基であり得、また例えばインフルエンザウイルスに由来するペプチド、タンパク質、核酸又はそれらの組合せであり得るか、又は不活化又は弱毒化型のウイルスであり得る。
上記のように、APSに組み込まれる1つ以上の抗原は、PapMV VLPのPapMVのコートタンパク質に結合し得るか、又はそれらは非結合形態でAPS中に存在し得る(すなわち単にPapMV VLPのPapMVと組み合わされている)。結合は、例えばコートタンパク質との遺伝子的融合によってであるか、又は共有結合、非共有結合又は親和力手段を通しての結合であり得る。PapMV又はVLPと抗原の組合せは、しかし、宿主の免疫系による抗原の認識又はPapMV又はVLPが免疫応答を増強する能力に干渉すべきではない。
本発明は、PapMV又は組換えPapMVコートタンパク質に由来するPapMV VLPを含むAPSを提供する。本発明はさらに、コートタンパク質と遺伝子融合された1つ以上の抗原、又は親和性部分を含む組換えPapMV VLPを提供する。これらの組換えコートタンパク質は、多量体化され、VLPに組織化することができる。抗原への結合のために抗原又は親和性ペプチドをコートタンパク質に遺伝子的に融合する方法は当技術分野において既知であり、その一部は以下で及び実施例で述べられている。様々な分子をタンパク質に化学的に架橋する方法は、当技術分野において周知であり、使用することができる。
PapMVは当技術分野において既知であり、例えばAmerican Type Culture Collection(ATCC)よりATCC No.PV−204(商標)として入手できる。このウイルスは、標準プロトコールに従って(例えばErickson,J.W.& Bancroft,J.B.,1978,Virology 90:36−46参照)パパイヤ(Carica papaya)及びキンギョソウ(Antirrhinum majus)のような宿主植物で維持され、前記宿主植物から精製され得る。
本発明のVLPを作製するために使用される組換えコートタンパク質は、野生型タンパク質の配列が提供されれば、当業者により標準遺伝子工学手法によって容易に作製され得る。タンパク質を遺伝子操作する方法は、野生型PapMVコートタンパク質の配列(配列番号1及び2)と同様に、当技術分野において周知である(例えばAusubel et al.(1994&updates)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York参照)。
組換えコートタンパク質は、標準手法により、例えば電子顕微鏡によって精製組換えタンパク質を視覚化することにより(例えば実施例I参照)、多量体化してVLPへと自己組織化するそれらの能力に関して分析することができる。VLP形成も、超遠心法によって測定することができ、組換えタンパク質の二次構造を野生型(WT)ウイルスと比較するために円偏光二色性(CD)分光測光法が使用され得る(例えば実施例I参照)。
ワクチンとしての本発明のAPSの効果を評価するために、抗原投与を実施することができる。そのような試験は、標準手法による試験動物(マウスなど)群への本発明のAPSの接種を含む。非接種動物及び/又は市販のワクチンを摂取した動物又は他の陽性対照を含む対照群を並行して設定する。ワクチン接種後適切な期間を置いた後、動物をインフルエンザウイルスにより抗原投与する。接種前と接種後並びに抗原投与後に動物から採集した血液試料を、次に、ウイルスに対する抗体応答に関して分析する。抗体応答に関する適切な試験は、ウエスタンブロット分析及び酵素免疫検定法(ELISA)を含むが、これらに限定されない。動物はまた、例えば体温、体重等を含む、インフルエンザウイルスによる感染に関連する他の状態の発現に関しても観測され得る。インフルエンザの一部の株に関しては、生存率も適切なマーカーである。
PapMV又はVLPのストックの産生
組換えPapMV又はVLPのストックは標準手法によって作製できる。例えば、十分なPapMV又は組換えウイルスを採取できるように、PapMV又は組換えウイルスをパパイヤ又はキンギョソウのような適切な宿主において増殖させることができる。
本発明は、1つ以上の非毒性の医薬的に許容される担体、希釈剤及び/又は賦形剤と共に本発明の1つ以上のAPSを含有するインフルエンザワクチンとしての使用に適する組成物を提供する。所望する場合は、他の有効成分、アジュバント及び/又は免疫増強剤が組成物に含まれていてもよい。
他の医薬組成物及び医薬組成物を製造する方法は当技術分野において既知であり、例えば「Remington:The Science and Practice of Pharmacy」(以前の「Remingtons Pharmaceutical Sciences」);Gennaro,A.,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA(2000)に記載されている。
本発明は、本明細書で述べるAPSの多くの適用及び使用方法を提供する。非限定的な例は、インフルエンザに対する及び/又はインフルエンザ抗原に対する免疫応答を増強するためのワクチンとしてのAPSの使用方法、及びインフルエンザウイルスに対する抗体をスクリーニングするためのAPSの使用方法を含む。本発明は、それ故また、動物においてインフルエンザ抗原に対する免疫応答を増強する及び/又は誘導するための方法を提供する。同様に、ワクチン及び/又は医薬組成物を含む、薬剤の製造のための本発明のPapMV、VLP及びAPSの使用方法は本発明の範囲内である。
本発明は、インフルエンザワクチンとして使用するための1つ以上のAPSを含むキットをさらに提供する。キットの個々の成分は別々の容器内に包装され、及びそのような容器と共に、医薬品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府当局によって規定される形態の表示が存在し得るが、かかる表示は製造、使用又は販売の当局による認可を反映する。キットは、場合によりワクチンについての使用方法又は投与レジメンを概説する指示書又は説明書を含み得る。
PapMVコートタンパク質のRNA結合及び自己組織化への突然変異の影響
2位にアラニンの挿入を保持し、N末端の5個のアミノ酸がWT配列から欠失したPapMVコートタンパク質(CPΔN5;配列番号3に示す)を、Tremblay,M− H.,et al.,2006,FEBS J.,273:14−25に概説されている一連の突然変異体を創製するために使用した。PapMV CPの128位に対応するアミノ酸は、大部分のポテクスウイルス(potexvirus、ジャガイモXウイルス)ではAであるが、PapMVにおいてはEであることを明らかにした、PapMV CPのアミノ酸90〜169の間の19のポテクスウイルスCPのアミノ酸配列のアラインメント、及び荷電残基R104、K133、K137及びR161がゲノムRNAとの相互作用に関与する可能性が高く、ウイルスゲノムの組織化とパッケージングにおいて重要な役割を果たすという報告(Abouhaidar,& Lai,1989,J.Gen.Virol.70,1871−5)に基づき、以下の突然変異を作製した:E128A;K97A;R104K105R108/A;R118D120K121/A;K133K137/A;D142D145/A;E148A;R161A又はE166E168/A。
VLP又はウイルスを10mM トリス−HCl、pH8で希釈し、カーボン被覆したフォームバー(formvar)グリッドに3分間吸着させた。グリッドをBSA(10mg/mL)8mLで30秒間ブロックし、PBSで洗浄した。グリッドを、PBSで1:10希釈したウサギ抗6×Hタグ抗体(Amersham,Pittsburgh,PA,USA)と共に室温で30分間インキュベートした。次にグリッドをPBSで3回洗浄し、PBSで1:20希釈した6nm金粒子結合ロバ抗ウサギ抗体(Jackson Immuno Research,West Baltimore Pike,West Grove,PA,USA)と共に室温で30分間インキュベートした。その後グリッドを脱イオン水で洗浄し、上述したように染色した。
CDスペクトルを20℃でOlis RSM 1000(Olis,Conway DriveSuites A&B,Bogart,GA,USA)高速スキャナーモノクロメータに記録した。遠紫外CD(260〜190nm)のために、0.1cm光路長の恒温装置付き石英セルを使用した。平均残基楕円率(deg×cmz×dmol単位での[6]mRW)を、方程式:[6]MRW=[6]*MRW/(10×c×1)、[式中、[6]は度(degree)単位での楕円率であり、MRWはタンパク質中の残基の平均分子量であり(この試験では108を使用した)、cはg/ml単位のタンパク質濃度であり、及び1はcmでの光路長である]を用いて算定した(Johnson,W.C.(1996)Circular Dichroism Instrumentation in Circular Dichroism and the Conformational Analysis of Biomolecules(Fasman,G.D.,ed)pp.635−652,Kluwer Academic/Plenum Publishers)。
RNAプローブを、RiboMAX(商標)Large Scale RNA Production System−T7キット(Promega P1300,Madison,WI,USA)及びT7プロモーターの前のPapMVの5’末端側80ヌクレオチドのクローンを使用して、インビトロでの転写によって作製した。インビトロ転写の前にクローンをEcoRIで線状化した。RNA転写産物を、DNA/RNA精製のためのG50 Quick Spin Column(Roche 1273 965)で精製した。同じ方法を使用して、インビトロ組織化アッセイのためにPapMVの5’末端側1800ヌクレオチドの転写産物を作製した。RNAプローブを、エビアルカリホスファターゼ(Fermentas,Hanover,MD,USA,EFO511)を用いて脱リン酸化し、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(NEB,Ipswich,MA,USA,M0201S)を用いてガンマ32P−ATPで標識した。次にG−50 Quick Spin Columnを前記のように使用してプローブを精製した。標識RNAを組換えタンパク質と共に室温で60分間インキュベートした。RNA 165fomlを各々の反応のために使用し、7.5UのRNアーゼ阻害剤(Amersham Biosciences 27−0816O1)を含むインビトロ組織化緩衝液中の様々な量の精製組換えタンパク質を使用した。反応物の最終容量は10μLであった;負荷染料2μLを試料に添加した後、5%未変性ポリアクリルアミドゲルに負荷した。電気泳動を、0.5Xトリス−ホウ酸−EDTA緩衝液中、10mAで90分間実施した。ゲルを乾燥し、Kodak BioMax MSフィルム(Amersham Biosciences V8326886)で16時間のオートラジオグラフィーに供して、現像した。
PapMVを、モザイク症状を示したパパイヤの葉から分画遠心によって精製した。感染した葉(100g)を、市販の混合機において10mM EDTAを含む50mMトリス−HCl(pH8.0)100mL中で摩砕した。摩砕した葉をチーズクロスでろ過し、1%のトリトンX−100をろ液に添加して、ろ液を静かに10分間攪拌した。クロロホルムを、ろ液の容量の4分の1に等しい容量まで滴下して加えた。溶液を4℃でさらに30分間攪拌し、10,000gで20分間遠心分離して沈殿物を除去した。上清を120分間高速(100,000g)遠心分離に供した。ウイルスペレットを懸濁し、スクロースクッション(3%スクロース)を通して100,000gで3時間半、さらなる高速遠心分離に供した。最終ウイルスペレットを50mMトリス(pH8.0)10mLに懸濁した。色が持続する場合は、クロロホルムによるさらなる清澄化を実施した。精製ウイルスを超遠心法によって収集した。酢酸分解法によるディスクの単離を以前に述べられているように(Erickson,et al.,1976,Virology.72,514−7)実施した。
タンパク質10μgを、トリプシン0.2μg(Roche,Indianapolis,IN,USA,1418475)と100mMトリスHCl緩衝液、pH8.5中で120分間、50μlの容量にて37℃でインキュベートした。5%SDS、5mM DTT及び40%グリセロールを含む追加の負荷染料10μLの添加によって反応を停止させた。試料を5分間煮沸した後、SDS−PAGEゲルに負荷した。タンパク質をクマシーブルー染色によって視覚化した。
PapMVは、CPオープンリーディングフレーム(ORF)の1位と6位に2個のM残基を保持する。これらの開始コドンの両方がウイルスの複製の間に使用されるかどうかは明らかでない。しかし、精製ウイルスのCPの大きな割合がN末端のいくつかのアミノ酸を欠くことが示された(Zhang,et al.,1993,J.Mol.Biol.234,885−7)。大腸菌において1つのオープンリーディングフレームだけの生産を確実にするため、M6が開始コドンとして働くようにN末端の5アミノ酸を除去した。NcoI部位への開始コドンの導入は、すべての構築物で認められる余分のAを導入した。精製工程を容易にするために6×Hタグをタンパク質のC末端に負荷した。組換えタンパク質CPΔN5は大腸菌BL21(pLysS)において発現され、精製ウイルスから抽出されたWT CPの分子量よりもわずかに大きな分子量(MW)を示した。2つのタンパク質の間で認められる相違は、おそらくC末端の6×Hタグ融合によって引き起こされる。Ni2+カラムを用いて組換えタンパク質をアフィニティー精製し、1Mイミダゾールを用いて溶出した。精製組換えタンパク質の収率は40〜50mg/Lと推定された。WT PapMV CPに対して惹起した抗体を用いたウエスタンブロット分析により、精製タンパク質が実際にPapMV CPであることが確認された。
(実施例II)
PapMV gp100及びPapMV Flu VLPの生産及び工学的操作
PapMV CP遺伝子のクローニング
CPΔN5 PapMVコートタンパク質(CP)遺伝子を使用し(実施例I参照)、Tremblay,M−H.,et al.,2006,FEBS J.,273:14−25に述べられているように作製した。簡単に述べると、CP遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して単離ウイルスRNAからRT−PCRによって増幅した。
5’−AGTCCCATGGATCCAACGTCCAATCTTCTG−3’[配列番号19]
リバースCPΔN5プライマー:
5’−ATGCGGATCCTTACTAATGGTGATGGTGATGGTGTTCGGGGGGTGGAAG−3’[配列番号20]
PCR産物をNcoI及びBamHIで消化し、ベクターpET−3dに挿入して、N末端の5アミノ酸がWT配列から欠失したCPΔN5 PapMV VLPクローンを作製した。PapMV VLPはまた、組換えタンパク質の2位にアラニンの挿入を保持する。CPΔN5 PapMV VLPクローンのアミノ酸配列を図1Cに示す[配列番号3]。
広く定義されている腫瘍抗原gp100から(IMDQVPFSV;配列番号21)及びインフルエンザM1タンパク質から(GILGFVFTL;配列番号22)の9量体HLA−A*0201エピトープを選択した。HLA−A*0201エピトープは、プロテアソームによる天然プロセシングを促進するためにそれぞれの天然配列から5残基だけN末端側及びC末端側に隣接した(図5A参照)。
センスgp100オリゴヌクレオチド:
5’−CTAGTTCTTCTGCGTTCACCATCATGGACCAGGTTCCGTTCTCTGTTTCTGTTTCTCAGCTGA−3’[配列番号23]、及び
アンチセンスgp100オリゴヌクレオチド:
5’−CTAGTCAGCTGAGAAACAGAAACAGAGAACGGAACCTGGTCCATGATGGTGAACGCAGAAGAA−3’[配列番号24]。
センスFLUオリゴヌクレオチド:
5’−CTAGTTCTCCGCTGACCAAAGGTATCCTGGGTTTCGTTTTCACCCTGACCGTTCCGTCTGAAA−3’[配列番号25]、及び
アンチセンスFLUオリゴヌクレオチド:
5’−CTAGTTTCAGACGGAACGGTCAGGGTGAAAACGAAACCCAGGATACCTTTGGTCAGCGGAGAA−3’[配列番号26]。
生じたPapMV gp100及びPapMV FLU構築物は、それらのC末端にそれぞれのペプチドの融合物を有するPapMV CP遺伝子、次いで精製工程を容易にするための6×Hタグから構成された。PapMVクローンの配列をDNA塩基配列決定によって確認した。
大腸菌発現株BL21(DE3)RIL(Stratagene,La Jolla,CA)を、上述した構築物の1つを含むプラスミドpET−3dで形質転換し、アンピシリン(50μg/mL)を含む2×YT培地で維持した。細菌細胞を600nmで0.6の光学密度まで37℃で増殖させ、1mMイソプロピル−β−d−チオガラクトピラノシド(IPTG)でタンパク質発現を誘導した。誘導を25℃で16時間続けた。6000 rpmで15分間の遠心分離によって細菌を採集した。ペレットを氷冷溶解緩衝液(50mM NaH2PO4、pH8.0、300mM NaCl、10mMイミダゾール、20μMフッ化フェニルメタンスルホニル、1mg/mLリゾチーム)に再懸濁し、フレンチプレスに1回通すことによって細菌を溶解した。溶解産物を13,000rpmで30分間2回遠心分離して、細胞デブリを除去した。上清を、4℃で4時間、穏やかに攪拌しながらNi−NTA(Qiagen,Valencia,CA)1mLと共にインキュベートした。溶解産物をカラムに負荷し、ビーズを、漸増濃度のイミダゾール(10 mM、20mM及び50mM)を含む3×15mL洗浄緩衝液(50mM NaH2PO4、pH8.0、300mM NaCl)で洗浄した。次にビーズを作業緩衝液(10mMトリス/HCl、pH8又は10mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.2)15mLで洗浄した。LPS夾雑物を除去するために2回の洗浄工程を実施し、1回は10mMトリス−HCl、50mMイミダゾール、0.5%トリトンX100、pH8で、もう1回は10mMトリス−HCl、50mMイミダゾール、1%両性洗浄剤(Zwittergent)、pH8で洗浄した。タンパク質を、1Mイミダゾールを含む作業緩衝液中で溶出した。溶出したタンパク質を、Beckman 50.2 TIローターで120分間の高速超遠心(100,000g)に供した。VLPペレットをエンドトキシン不含PBS(Sigma社)に再懸濁した。最後に、0.45uMフィルターを用いてタンパク質溶液をろ過した。タンパク質濃度をBCAタンパク質キット(Pierce社)によって評価した。精製タンパク質中のLPSのレベルを製造者(Cambrex社)の指示に従いリムルス試験で評価したところ、0.005エンドトキシン単位(EU)/μgタンパク質以下であった。この手順により、細菌培養物1リットル当たり20mg以上の精製VLPが生成された。
タンパク質をPBSで希釈し、カーボン被覆したフォームバーグリッドに3分間吸着させた。グリッドを脱イオン水で2回洗浄し、室温で10分間、0.1%酢酸ウラニルで染色した。次にグリッドをJeol JEM220FS透過型電子顕微鏡で観察した。100VLPの平均長をAdobe Photoshopソフトウェアを用いて評価した。
大腸菌で生産された種々のPapMV VLPの電子顕微鏡分析(図5B)により、長さが80〜200nmの範囲で、直径がPapMV VLPについては15nm、操作したPapMV gp100及びFlu VLPについては16nmの典型的な長い棒形構造が明らかになった。PapMV CPは、大腸菌において、大きさ及び形状に関してPapMV VLPと類似のVLPへと自発的に組織化することができた。
(実施例III)
PapMV VLP上で発現されるgp100及びインフルエンザM1エピトープのインビトロプロセシングと交差提示
ペプチド
gp100及びFluペプチドは、GLBiochem Shangai社によって合成され、DMSO(Sigma社)に再懸濁された。
Tリンパ球、樹状細胞(DC)及びCD40で刺激したBリンパ球(CD40−B)を、7.5%ヒト血清(熱不活化、正常ドナーから調製)、2mM L−グルタミン、100U/mlペニシリン/ストレプトマイシン及び10μg/mlゲンタマイシン(最後の3つはInvitrogen社及びWisent社より)を添加した完全培地(イスコフ改変ダルベッコ培地;Invitrogen;Carlsbad,CA;及びWisent; St−Bruno,Quebec,Canada)において当技術分野に記載されているように(Lapointe et al.,2003,Can.Res.63:653−662)培養した。
種々の標的細胞を、gp100又はインフルエンザM1特異的T細胞による定義されたエピトープのMHCクラスI提示に関して分析した。gp100特異的CD8+T細胞クローンは、National Cancer Institute;NIH,Bethesda,MDの好意により提供され、209−217位の天然HLA−A*0201制限エピトープ(ITD QVP FSV;配列番号27)及び210位にMを有する修飾型(IMD QVP FSV;配列番号21)の両方に特異的であり、ペプチド/MHC複合体の安定性を高めた。gp100特異的T細胞を、Dudley et al,1999,J.Immunother,22:288−298によって記述された急速増殖プロトコールを用いて増殖させた。
CD40活性化B細胞又はDCに様々な型のPapMV CP(上記実施例IIで述べたような)を20時間パルスした。細胞を採集し、PBSで2回洗浄した。パルスしたAPC(2〜5×105)を、48穴プレートの個々の穴において、完全培地500μl中2×106細胞で自己PBMCと共培養した。培地が黄色になったときは、培地200μlを除去し、新鮮な完全培地400μlを添加した。7日目から10日目まで、新鮮PapMVをパルスしたAPC(5×105;20時間パルスし、PBSで2回洗浄した)を個々の培養物に添加した。次にIL−2を100IU/mlで3日ごとに添加した。
DCは、当技術分野では最適APCと定義され、今回の実験で及び当技術分野において、CD40刺激後に増殖したBリンパ球は効率的なAPCであることが明らかにされた。これらのAPCにPapMV VLP、PapMV gp100及びPapMV Fluをパルスし、gp100及びインフルエンザM1タンパク質からのMHCクラスIエピトープに特異的な定義されたT細胞と共培養した。図7Aに示すように、PapMV gp100をパルスしたAPCだけがgp100特異的T細胞クローンによって認識された。反対に、PapMV FluをパルスしたAPCだけがインフルエンザM1特異的T細胞によって認識された(図7B)。各々のT細胞培養物の特異性は、各エピトープに対応する合成ペプチドをCD40活性化B細胞にパルスすることによって確認された。また、特異的T細胞へのPapMV Fluの添加は、それらを刺激してIFN−γを分泌させることができず、APCがペプチド認識のために必須であることを示した。
(実施例IV)
H1N1 M2eインフルエンザ抗原を含むPapMV VLPの生産及び工学的操作
PapMVコートタンパク質のクローニング及び工学的操作
PapMV CP遺伝子を、以下のプライマーを使用して単離したウイルスRNAからRT−PCRによって増幅した:
5’−AGTCCCATGGCATCCACACCCAACATAGCCTTC−3’[配列番号28]、及び
5’−GATCGGATCCTTACTAATGGTGATGGTGATGGTGACGCGTGGTACTAGTTTCGGGGGGTGGAAGGAATTGGATGGTTGG−3’[配列番号29]。
5’−GATCGGATCCTTACTAATGGTGATGGTGATGGTGACGCGTGGTACTAGTTTCGGGGGGTGGAAGGAATTGGATGGTTGG−3’[配列番号45]。
M2eフォワード:
5’−CTAGTTCCCTGCTGACCGAAGTGGAAACCCCGATTCGCAACGAATGGGGCTGCCGCTGCAACGATTCCTCCGATA−3’[配列番号30]、及び
M2eリバース:
5’−CGCGTATCGGAGGAATCGTTGCAGCGGCAGCCCCATTCGTTGCGAATCGGGGTTTCCACTTCGGTCAGCAGGGAA−3’[配列番号31]。
PapMVCP構築物の発現と精製を、わずかな修正を加えて先に述べられているように(Tremblay et al.2006,FEBS J.273:14)実施した。簡単に述べると、フレンチプレスを通して細菌を溶解し、その後Ni2+カラムに負荷して、10mMトリス−HCl、50mMイミダゾール、0.5%トリトンX100、pH8で洗浄し、次に10mMトリス−HCl、50mMイミダゾール、1%両性洗浄剤、pH8で洗浄してエンドトキシン汚染を除去した。VLPを単離するため、溶出したタンパク質をBeckman 50.2 TIローターで120分間の高速遠心(100,000g)に供した。ペレット中で認められたVLPをエンドトキシン不含PBS(Sigma社)に再懸濁した。超遠心の上清からPapMV−M2eディスクを得た。ディスクの緩衝液交換は、エンドトキシン不含PBS(Sigma社)に対する透析によって実施された。ELISAのために使用したM2ペプチドは、GLBiochem Shangai社によって合成され、エンドトキシン不含PBS(Sigma社)に再懸濁された。使用前に0.45μMフィルターを用いてタンパク質溶液をろ過した。BCAタンパク質キット(Pierce社)を使用してタンパク質の量を評価した。精製タンパク質中のLPSのレベルを、製造者(Cambrex社)の指示に従ってリムルス試験で評価したところ、0.005エンドトキシン単位(EU)/μgタンパク質以下であった。
SDS−PAGE及び電気ブロッティングを、先に述べられているように(Tremblay,et al.,2006、同上)実施した。タンパク質をPBSで希釈し、カーボン被覆したフォームバーグリッドに3分間吸着させた。グリッドを脱イオン水で2回洗浄し、室温で10分間、0.1%酢酸ウラニルで染色した。次にグリッドをJeol JEM220FS透過型電子顕微鏡で観察した。Adobe Photoshopソフトウェアを使用し、100VLPを測定することによって平均VLP長を評価した。
インフルエンザウイルス株H1N1(A/New Caledonia/20/99)のM2(イオンチャネル)に由来する普遍的M2eを本実施例において使用した。このペプチドはまた、ヒトに感染するインフルエンザウイルス株の85%以上で認められる。ペプチドをPapMV CPのC末端、次いで6×Hタグに融合させた(図12A)。大腸菌でのPapMV−M2eの発現は、PapMV−VLPに類似する約100nm長のPapMV−M2e VLP(図12B)及びCPサブユニットの20サブユニットで構成されるディスクの生産を生じさせた。VLP及びディスクは、組換えタンパク質のC末端に位置する6×Hタグ及び Ni2+カラム(Qiagen)を用いて容易に精製することができた。それらの形態の各々の精製は、VLPをペレットから単離し、ディスクを上清から単離する、超遠心(100,000gで90分間)を通して容易に実施できる。
(実施例V)
M2eインフルエンザ抗原を含むPapMV VLPによるマウスの免疫
PapMV VLP及びPapMV−M2e VLPを実施例IVで述べたように作製した。
5匹の4〜8週齢のBalb/cマウス(Charles Rivers Laboratories社)に、PapMV VLP、PapMV−M2e VLP又はPapMV−M2e VLP+IgG 100μgを皮下注射した。3番目の群で使用したIgGは、PapMV−M2e VLPでワクチン接種したマウスから単離したポリクローナル血清0.5μlを指す。初回免疫に続いて、2週間後に1回の追加接種を実施した。種々の時点で血液試料を採取し、分析まで−20℃で保存した。
Costar High Binding 96穴プレート(Corning,NY,USA)を、0.1M NaHCO3緩衝液、pH9.6中で1μg/ml濃度に希釈したM2ペプチド(SSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD;配列番号6)100μl/穴で、4℃にて一晩被覆した。プレートをPBS/0.1%トゥイーン−20/2%BSA(150μl/穴)により37℃で1時間ブロックした。PBS/0.1%トゥイーン−20で3回洗浄した後、血清を1:50から始まる2倍段階希釈に添加し、37℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを3回洗浄し、PBS/0.1%トゥイーン−20/2%BSA中1/10,000希釈のペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG、IgG2a、IgG2b(すべてJackson Immunoresearch社より)、IgG3(Rockland社)100μlと共に37℃で1時間インキュベートした。3回の洗浄後、IgGの存在を、製造者の指示に従ってTMB−S 100μlで検出した;0.18mM H2SO4 100μlを添加することによって反応を停止させ、450nmでODを読み取った。結果は、OD値がPBSマウスからの血清の1:50希釈で得られたバックグラウンド値の3倍であるときに測定された、抗体終点力価として表されている。
インフルエンザウイルス(A/WSN/33、H1N1サブタイプ)を、先に述べられているように(Abed et al.,2004,Antivir.Ther.9:577−581)増殖させ、精製し、力価測定した。肺ウイルス力価及び中和力価を、先に述べられているように(Abed et al.,2004、同上)メイディン‐ダービー(Mardin−Darby)イヌ腎臓(MDCK)細胞に関して定量した。マウスを、PBSで希釈したウイルス100μlに鼻内感染させた(致死的感染、3000PFU/マウスの生ウイルス又は3LD50)。症状の発現を感染後2、5、6、7、8、9、10、12及び20日目に観測した。
PapMV−M2e VLP又はディスクが免疫応答を誘導する能力を検討するため、20匹のBalb/Cマウスに組換えVLP又はディスク100μgを皮下注射した。各々の用量中に存在するM2eペプチドの量は8μgと推定される。初回免疫の15日後に追加接種を実施した。マウス血清を、注射後23日目に抗M2e抗体に関して検定した(図13)。免疫応答の分析は、PapMV−M2eディスクが弱い免疫原性であるか又は全く免疫原性でないことを明らかにする。しかし、PapMV−M2e VLPは、処置した20匹のマウスのうち11匹において高い力価に達する体液性応答を誘発することができた(>l/1600;図13に示す対数スケール(2×50)で8)。残りのマウス(9/20)も、力価はより低かったが、PapMV−M2eに応答する抗体を示した。総IgG応答の間には大きな変動が認められた(図13)。
マウスを、28日目に3×103pfu(3LD50)のインフルエンザH1N1株A/WSN/33で抗原投与した。この株は、マウスにおいて増殖し、高いビルレンスを示すように適合された(Francis and Moore,1940,J.Exp.Med.72,717−728)。症状の発現を毎日追跡した。動物が25%以上の体重減少を示したら犠死させた。結果から、PapMV−M2e VLPがマウスの45%(20匹のうち9匹)に感染に対する防御を与え得ることが明確に示された(図14)。PapMV−M2e VLPでワクチン接種したマウスのプールから単離した血清によるPapMV−M2e VLPのオプソニン化(上述したような)は、抗原投与に対する防御を有意に改善し、マウスの80%が防御された。これらの結果は、オプソニン化VLPで認められた抗体価の改善(図14)が、感染に対する防御の改善として表れたことを示唆する。
(実施例VI)
PapMVCP−E2及びPapMVCP27−215−E2の生産及び工学的操作
本実施例は、PapMVコートタンパク質の多量体化がPapMV VLPの免疫原性にとって必須であることを明らかにする。
PapMV CPΔN5−SM遺伝子を実施例IVで述べたようにクローニングした。PapMVCP−E2構築物を作製するため、以下のオリゴヌクレオチドを使用した:
5’−GATCACTAGTGTGGTGGTGGGTACCACCGATCGTAGCGGTGCGCCGACCTACAGCTGGGGTGCGAACGATACGCGTCATG−3’[配列番号32]、及び
5’−CATGACGCGTATCGTTCGCACCCCAGCTGTAGGTCGGCGCACCGCTACGATCGGTGGTACCCACCACCACACTAGTGATC−3’[配列番号33]。
フォワードプライマー:
5’−AGTCCCATGGCCGATCCAACGTCCAATCTTCTG−3’[配列番号34]、及び
リバースプライマー:
5’−ACGTCCATGGTATATCTCCTTCTTAAAG−3’[配列番号35]。
PapMVCP構築物の発現と精製を実施例IVで述べたように実施した。E2ペプチドは、GLBiochem Shangai社によって合成され、エンドトキシン不含PBS(Sigma)に再懸濁された。使用前に0.45μMフィルターを用いてタンパク質溶液をろ過した。BCAタンパク質キット(Pierce社)を使用してタンパク質の量を評価した。精製タンパク質中のLPSのレベルを、製造者(Cambrex社)の指示に従ってリムルス試験で評価したところ、0.005エンドトキシン単位(EU)/μgタンパク質以下であった。
SDS−PAGE及び電気ブロッティングを先の実施例で述べたように実施した。タンパク質をPBSで希釈し、カーボン被覆したフォームバーグリッドに3分間吸着させた。グリッドを脱イオン水で2回洗浄し、室温で10分間、0.1%酢酸ウラニルで染色した。次にグリッドをJeol JEM220FS透過型電子顕微鏡で観察した。Adobe Photoshopソフトウェアを使用し、100VLPを測定することによって平均VLP長を評価した。
5匹の4〜8週齢のC3H/HeJマウス(Charles Rivers Laboratories社)に、PapMVCP−E2、PapMVCP27−215−E2 25μg又は当量のE2ペプチド(2μg)又はエンドトキシン不含PBS(Sigma社)を皮下注射した。初回免疫に続いて、2週間後に1回の追加接種を実施した。種々の時点で血液試料を採取し、分析まで−20℃で保存した。すべての実験プロトコールはラヴァル大学動物保護委員会によって承認された。
Costar High Binding 96穴プレート(Corning,NY,USA)を、0.1M NaHCO3緩衝液、pH9.6中で1μg/ml濃度に希釈したP3、P3E2、PapMVCP、PapMVCP27−215又はPapMVCP−E2 100〜200μl/穴で、4℃にて一晩被覆した。プレートをPBS/0.1%トゥイーン−20/2%BSA(150μl/穴)により37℃で1時間ブロックした。PBS/0.1%トゥイーン−20で3回洗浄した後、血清を1:50から始まる2倍段階希釈に添加し、37℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを3回洗浄し、PBS/0.1%トゥイーン−20/2%BSA中1/10,000希釈のペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG、IgG1、IgG2a、IgG2b(すべてJackson Immunoresearch社より)、IgG3(Rockland社)100μlと共に37℃で1時間インキュベートした。3回の洗浄後、IgGの存在を、製造者の指示に従ってTMB−S 100μlで検出した;0.18mM H2SO4 100μlを添加して反応を停止させ、450nmでODを読み取った。結果は、OD値がPBSマウスからの血清の1:50希釈で得られたバックグラウンド値の3倍であるときに測定された、抗体終点力価として表されている。
CD−1(22週齢)を0、15、30及び45日目にPapMVCP−E2(25μg)で免疫した後、65日目に犠死させた。秘蔵を切除し、DMEM(2×105細胞/穴)に懸濁した。赤血球を高張性塩化アンモニウム溶液で除去した。脾細胞を洗浄し、96穴平底マイクロプレート(Costar社)においてDMEM培地(10%FBS[HyClone]、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、2mM L−グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム及び50μM β−メルカプトエタノールを添加したDMEM)200μl中に2.5×105細胞/mlの濃度で再懸濁した。試料を25μg/mlのPapMVCP又はPapMVCP−E2 VLPと共に4日間インキュベートした。コンカバリンA(Concavalin A)(ConA−10μg/ml)とPBSを陽性及び陰性対照として使用した。細胞培養上清を収集し、液体マウス10サイトカインキット(Qiagen社)を用いてサイトカインを測定した。
10〜12週齢のCD−1マウス(Charles River Laboratories社)において空気嚢を惹起した。空気嚢は、0日目と3日目に無菌空気3mlを皮下注射することによって背部に惹起した。7日目に、1mlの組換えPapMVCP(1〜10μg/ml)、LPS(10μg/ml)又はPBSを空気嚢に注入した。処置の6時間後、CO2を用いた窒息によってマウスを屠殺した。空気嚢をPBS−5mM EDTA 1mlで1回洗浄し、PBS−5mM EDTA 2mlで2回洗浄して、滲出液を室温にて500×gで5分間遠心分離した。アセティックブルー(acetic blue)染色後に血球計で細胞を計数した。
骨髄前駆細胞をBALB/cマウスの大腿骨から得て、樹状細胞分化骨髄培地(5%X63−GM−CSF上清培地培養物を添加した、1%ペニシリン−ストレプトマイシンを含む95%RPMI;X63−GM247 CSF細胞系は、B.Ludewig,Research Department,Kantonal Hospital St.Gallen,Switzerland)内で、6日間培養した。培地を2日目と4日目に部分的に交換した。6日目に、培地を、LX63馴化培地を含まない培地と交換した。7日目に、FITC抗CD11c及びPE−Cy5.5抗CD11b表面マーカー(BD Biosciences社)を使用したフローサイトメトリによってAPCの冨化を確認した。試料は25%のCD11c+Cd11b+細胞、80%を上回るCD11b+細胞を含んだ。この試料を「APC」と称する。
APCへのPapMVCP−E2及びPapMVCP27−215−E2のインターナリゼーションを評価するため、APCに由来する100万骨髄細胞をPapMVCP−E2及びPapMVCP27−215−E2のいずれか25μgと共に37℃で2時間インキュベートした。簡単に述べると、細胞を4℃で15分間、PBS10%FBS及び抗CD16/CD32(1μg/100万細胞)でブロックした。PBSで2回洗浄した後、細胞を室温で10分間、PBS/2%パラホルムアルデヒドで固定した。透過処理緩衝液(PBS、10%FBS、0.2%トリトンX−100)で2回洗浄した後、細胞を、透過処理緩衝液で1/200希釈したウサギポリクローナル抗体と共に4℃で45分間インキュベートした。透過処理緩衝液での2回の洗浄後、細胞を、透過処理緩衝液で1/5000希釈した二次抗体(ウサギ抗IgGアレクサ488(Molecular Probes社))と共に4℃で45分間インキュベートした。PBSでの洗浄後、細胞を直ちにEPICS−XLサイトフルオロメーターで分析した。データ解析はWINMDI2.8を用いて実施した。検出のために使用したウサギポリクローナルAbは発明者の施設で生産した:ウサギ免疫前血清を陰性対照として使用した。
APCを、先に述べたのと同じ分別プロトコールに従って、底部に無菌スライドガラスを含む12穴プレート(Corning,NY,USA)で増殖させた(200,000細胞/穴)。抗原インターナリゼーション試験のために、抗原5μg/200,000細胞を使用した。固定、透過処理、及び一次抗体と二次抗体のインキュベーション工程はフローサイトメトリに関して述べた通りであった。スライドガラスを、×60油浸対物レンズを備えたFluoview Fv300共焦点顕微鏡で直ちに分析した。非特異的チャネル緩衝を回避するため連続的に及びx−z切断によって蛍光画像を取得した。画像をその後Image Jソフトウェアでデジタル処理した。
ノンパラメトリッククラスタル‐ワリス(Krustal−Wallis)及びダン(Dunn)の多重比較検定法を統計解析のために使用した。P<0.05の値を統計的に有意とみなした。統計解析をPRISM 3.03プログラムで実施した。
精製組換えタンパク質は、PapMVCP及びPapMVCP−E2に関して23kDa(PapMVCP27−215−E2)と26kDaの予想された分子量を示し、エンドトキシンレベルは常に0.005EU/μgタンパク質を下回った。電子顕微鏡検査(EM)により、PapMVCPのC末端におけるE2ペプチドの付加が、組換えPapMVCP VLPに類似したVLPへと自己組織化するタンパク質の能力に影響を及ぼさないことが確認された。予想されたように、PapMVCP27−215−E2はVLPを形成することができず、先に示されているように単量体形態のままであった(Leclerc et al.,1998,J Biol Chem,273:29015−21)。VLPの長さは多様であり、201±80nmのサイズ範囲内であった。201nm長のタンパク質は、E2ペプチドを反復的及び結晶性に提示するCPの560のコピーである。
(実施例VII)
PapMVのアジュバント作用
PapMVの精製
PapMVを実施例Iで述べたように精製した。
LPS不含のOVAグレードVIをSigma−Aldrich Chemical Co,St Louis,MO.より購入した。ニワトリ卵白リゾチーム(HEL)はResearch Organics Inc.Cleveland,OHより購入した。大腸菌O111:B4からのLPSはSigma−Aldrich,St Louis,MOより購入した。
6−8週齢のBALB/cマウスから採血し、マウスをExperimental Medicine Department,Faculty of Medicine,National Autonomous University of Mexico(UNAM)の動物施設の下で保持して、医薬品安全性試験実施基準に従って飼育した。アジュバントの作用を調べるため、マウスの群を0日目にOVA又はHEL 2mg単独で、又はPapMV、CFA 1:1(v/v)30mgと共に、又は大腸菌O111:B4からのLPS 5mg(Sigma−Aldrich社)と共にi.p.免疫した。対照マウスには食塩水だけを注射した。血液試料を、図19に示されているように、様々な時点で眼窩後洞から収集した。個々の血清試料を分析まで−20℃で保存した。3匹のマウスを各々の実験で使用した。
高結合96穴ポリスチレンプレート(Corning(登録商標),New York,NY)を0.1M炭酸−重炭酸緩衝液(pH9.5)中1mg/mLのPapMV、100mg/mLのHEL又は150mg/mL OVAで被覆した。プレートを37℃で1時間、次に4℃で一晩インキュベートした。翌朝、使用前にプレートを、0.05%トゥイーン−20を含むPBS(pH7.2)(PBS−T)(Sigma−Aldrich社)で3回洗浄した。非特異的結合を、PBSに希釈した5%脱脂粉乳(PBS−M)により37℃で1時間ブロックした。洗浄後、マウス血清をPBS−Mで1:40希釈し、2倍段階希釈をウェルに添加した。プレートを37℃で1時間インキュベートし、次にPBS−Tで4回洗浄した。ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスIgM(最適希釈1:1000)、IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b抗体(Zymed,San Francisco,CA)又はIgG3(最適希釈l:3000)(Rockland,Gilbertsville,PA)を添加し、プレートを37℃で1時間インキュベートし、PBS−Tで3回洗浄した。30%過酸化水素を含む0.1Mクエン酸緩衝液(pH5.6)中のオルトフェニレンジアミン(0.5mg/mL;Sigma−Aldrich社)を酵素基質として使用した。反応を2.5N H2SO4で停止させ、自動ELISAプレートリーダー(Dynex Technologies MRII,Chantilly,VA,USA)をBIOLINX 2.22ソフトウェアと共に使用して490nmで吸光度を測定した。陽性力価は、陰性対照の平均値を3SD上回るものと定義された。
アジュバントを免疫原性の低いワクチンと同時投与したとき、自然免疫応答の抗体応答への転換が認められる。アジュバントは、抗原に対する抗体応答又は細胞性免疫応答を増強させる又は上昇させることができる物質である。PapMVが他の抗原に対する長時間持続性抗体応答を促進するアジュバントとしての機能を果たすことができるかどうかを調べるため、BALB/cマウスをOVA又はHEL単独で、又は以下のアジュバント:PapMV、CFA又はLPSと共に免疫した。OVA又はHELに特異的なIgG抗体価を、示されている時点でELISAによって測定した(図19A及び図19B)。PapMVについてのアジュバント作用が、免疫動物におけるのOVA及びHELに対する総IgG応答で認められた。PapMVによって誘導されるアジュバント作用は、免疫後30日目にHELに関して認められ、この時点で抗体価は、HEL単独によって誘導される抗体価と比較して8倍上昇していた。この抗体価の差は120日目まで維持されたが、400日目までには低下していた(図19A)。LPSは免疫後最初の30日間のみアジュバント作用を誘導したが、CFAは、免疫後8日目から400日目の実験終了時まで最も強いアジュバント作用を示した(図19A)。OVAでの免疫に関しては、総IgG抗体価へのアジュバント作用が最初の免疫後120日目まで認められ、その後抗体価は経時的に低下し、400日目にはOVA単独と比較して4倍高かった(図19B)。いずれのIgGサブクラスが、OVA及びアジュバントと共免疫したOVA(PapMVは総IgG応答へのアジュバント作用を示さなかった)によって誘導されるかを同定するため、さらなる分析を20日目に実施した。PapMV、LPS及びCFAはOVA特異的IgG2a及びIgG2b抗体価を誘導したが、OVA単独ではIgG1特異的抗体化だけを誘導した(図19C〜図19E)。OVAを使用したアジュバントのいずれかと共免疫したとき、IgG1に対するアジュバント作用は認められなかった。
(実施例VIII)
親和性ペプチドを含むPapMV VLPの作製及び工学的操作
以下の実施例は、選択した親和性ペプチドが工学的に操作されたコートタンパク質から形成されるVLPの表面で発現され、標的分子に結合するために使用できるように、親和性ペプチドを選択する方法及びPapMVコートタンパク質の工学的操作を示す。この概念は、インフルエンザウイルスエピトープ/抗原に結合し、それによってAPSを形成するために使用できる、その表面にペプチド又は抗体フラグメントを発現するVLPの生産に容易に適用される。
Ph.D.−7ファージディスプレイペプチドライブラリーキット(Phage Display Peptide Library Kit)(New England Biolabs社)と共に提供される、大腸菌株ER2738をファージの増幅のために使用した。大腸菌株DH5α(Invitrogen社)をプラスミド増殖のために使用し、大腸菌BL21−CodonPlus(登録商標)(DE3)−RIL(Stratagene社)を組換えタンパク質の生産のために使用した。
ネコブカビ休止胞子(Horti−Protection社)に対する特異的ペプチドを、Ph.D.−7ファージディスプレイペプチドライブラリーキット((New England Biolabs社)を使用して、製造者のプロトコールに従って「パニング」として知られるインビトロ選択工程によって選択した。簡単に述べると、2×1011ファージを106休止胞子に添加し、室温で1時間静かに混合した。胞子と結合ファージを13,000rpmで1分間の遠心分離によってペレット化した。胞子ペレットを各々の回につき洗浄緩衝液(50mMトリス、pH7.5、150mM NaCl)1mlで10回洗浄した。ファージを、室温で10分間インキュベートすることにより、200mMグリシン−HCl(pH2.2)で溶出した。次に、溶出したファージを増幅し、結合配列に関してプールを濃縮するためにさらなる結合/増幅(パニング)サイクルを通して採取した。洗浄緩衝液は、1回目のパニングについては0.1%のトゥイーン20を含み、その後の回については0.5%に上昇させた。上清を中和し、ファージの死滅を回避するため、1Mトリス−HCl(pH9.1)150μlを添加した。選択したファージを、パニングの各々の回の間に大腸菌株ER2738において増幅した。最も高い親和性を有するペプチドを有するペプチドを選択するためにサイクルを3回反復した。
4つの親和性ペプチドと1つの陰性対照ペプチドを選択し、対応するDNA配列をCPΔN5 PapMVコートタンパク質のC末端(実施例II参照)及び単量体形態のCPΔN5でクローニングした(Lecours et al.,2006,Protein Expression and Purification 47:273−280)。それぞれ5’及び3’末端のNcoI及びBamH1についての制限部位を、大腸菌における発現のために選択DNA配列をベクターpET−3Dに導入するために使用した。ペプチドがPapMV CPとインフレームであることを確認するためにクローンを配列決定した。
ペプチドの選択のために使用した方法を適合させることにより、結合をフローサイトメトリによって分析した。基本的には、106(異なる指示がない限り)胞子を、最初に、PapMV CPを試験する場合は0.5%TBST中のCPΔN5 50μg、又は抗体を使用する場合はブロッキング緩衝液(0.1M NaHCO3、5mg/ml BSA)で1時間ブロックした。Alexa標識タンパク質10μg又はラット抗ネコブカビ1μlを胞子に添加し、わずかに攪拌しながら室温で1時間結合させた。抗体については、0.5%TBST 1mlでの5回の洗浄後、ブロッキング緩衝液中のPEヤギ抗ラットIgG(H+L)5μl(Cedarlanes)と共に室温で1時間インキュベートした。すべての標識胞子を最後に0.5%TBST 1mlで5回洗浄し、胞子ペレットを分析のために0.5%TBST 500μlに再懸濁した。フローサイトメーターを使用して10,000のゲートされた胞子からの読取り値を収集した。
ネコブカビ休止胞子に対する3つのペプチド及び胞子に結合しない陰性対照ペプチドを選択するためにファージディスプレイを使用した。ペプチドの配列は以下のとおりである:
ペプチドA:DPAPRPR(配列番号36)
ペプチドB:LLNSHAV(配列番号37)
ペプチドC:NHAHSTP(配列番号38):
陰性対照ペプチド:KALGDNG(配列番号39)。
標識CPm−A及びCPm対照(どちらもPapMV CPの単量体形態に基づく)を使用したフローサイトメトリ分析は、単量体形態がネコブカビの休止胞子に効率良く結合できないことを示した。予想されたように、CP構築物によって組織化されたVLPの表面のペプチドの多量体化は、ペプチドの結合活性を改善するために重要である(図20)。それ故、予測されたように、単量体形態は標的への結合を示さなかった。
CP−A NLPの表面の親和性ペプチドAの運動の自由度を改善するため、及びPapMV CPのC末端によって引き起こされる立体障害を低減するために、一続きの3 Gly残基をCPのC末端と親和性ペプチドAの間に付加した(CP−GlyA)。加えて、CP−AAを作製するためにCP−AのC末端のAペプチドを重複させた。両方のタンパク質を、上述したように生産し、精製して、フローサイトメトリ結合アッセイにおいて使用した。シグナルをCP−Aのシグナルと比較した。CP−GlyA及びCP−AAの両方が、休止胞子に対する結合活性の改善を示した(図21A〜図21B)。ペプチドAの重複は、最も高い結合活性を有するVLPを生成した(図21B)。
(実施例IX)
M2eH1N1インフルエンザ抗原に融合したPapMVコートタンパク質の生産及び工学的操作
PapMVCP及びPapMVCP−M2eの発現及び精製
PapMVCP−M2e構築物を実施例IVで述べたように作製した。タンパク質の発現及び精製は、VLPの単離を除き、実施例IVで述べたように実施した。VLPは2つの方法のいずれか一方により単離した。
タンパク質をPBSで希釈し、カーボン被覆したフォームバーグリッドに3分間吸着させた。グリッドを脱イオン水で2回洗浄し、室温で10分間、0.1%酢酸ウラニルで染色して、その後JEOL JEM220FS透過型電子顕微鏡で観察した。平均VLP長を、先の実施例で述べたように測定した。
本実施例では、インフルエンザウイルス株H1N1 A/WSN/33からのM2eペプチド配列を、図12Aに示すようにPapMVCPのC末端に融合した。PapMVCP及びPapMVCP−M2eの精製は、VLPをペレット化し、より小さな分子量形態(主としてディスク、二量体及び単量体)を保持して、上清中に残存させるための超遠心工程を含んだ。PapMVCP及びPapMVCP−M2eのSDS−PAGEプロファイルは高純度の組換えタンパク質を示すが、同時に上清中の分解されたタンパク質形態も明らかにする(図22A)。既に記述されているように(Tremblay et al,2006、同上;Lecours et al.,2006、同上)、SDS−PAGEによって評価したときのPapMVCPタンパク質の大きさ(25から33kDaの間)は、コンピュータシミュレーションによって予想される大きさ(PapMVCPについて23.1kDa及びPapMVCP−M2eについては26.4kDa)よりも大きい。抗PapMVCPポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロット法(図22B)により、製剤中の分解されたPapMVCPタンパク質の存在が確認された。これは、低分子量タンパク質(LMWP)の主要部分が分解されていないディスクから構成される(FPLCによって測定したとき約60%)場合でも、不均質なタンパク質混合物の有意の部分が全長M2eエピトープを示さないことを強く示唆している。
(実施例X)
インフルエンザ感染細胞による、M2eインフルエンザ抗原を含むPapMV VLPに対するIgGの特異的結合
マウスの免疫
10匹の6〜8週齢のBALB/cマウス(Charles River,Wilmington,MA)に、i)PapMVCP 100μg;ii)PapMVCP 100μg及びM2eペプチド10μg(図2のみ);iii)PapMVCP−M2e 100μg(VLP又はディスク)、又はiv)エンドトキシン不含PBS(Sigma,St−Louis,MO)を皮下注射した。初回免疫に続いて、2週間後に同じ量の1回の追加接種を実施した。追加接種後8日目に血液試料を採取し、分析まで−20℃で保存した。
M2eペプチド(SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD[配列番号6])は、GLBiochem Shanghai社(Shanghai,China)によって合成され、エンドトキシン不含PBS(Sigma,St−Louis,MO)に再懸濁された。Costar High Binding 96穴プレート(eBioscience,San Diego,CA)を、0.1M NaHCO3緩衝液、pH9.6中で1μg/ml濃度に希釈したM2eペプチド100μl/穴で、4℃にて一晩被覆した。プレートをPBS/0.1%トゥイーン−20/2%BSA(150μl/穴)により37℃で1時間ブロックした。PBS/0.1%トゥイーン−20で3回洗浄した後、血清を1:50から始まる2倍段階希釈に添加し、37℃で90分間インキュベートした。次にプレートを4回洗浄し、PBS/0.1%トゥイーン−20/2%BSA中1/10,000(IgAを除くすべてのアイソタイプについて)又は1/2,000(IgAについて)の希釈のペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG、IgG1、IgG2a、IgG2b(すべてJackson Immunoresearch,Baltimore,PAより)、IgG3(Rockland,Gilbertsville,PA)、IgGA(Serotec,Raleigh,NC)100μlと共に37℃で1時間インキュベートした。4回の洗浄後、IgGの存在を、製造者の指示に従ってTMB−S 100μlで検出した。0.18mM H2SO4 100μlを添加することによって反応を停止させた。450nmでODを読み取った。結果は、OD値がPBS注射マウスからの血清の1:50希釈で得られたバックグラウンド値の3倍であるときに測定された、抗体終点力価として表されている。
MDCK細胞[Labtek IIチャンバー型カバーガラス(Nunc International社)中1.5×106細胞/穴;96穴平底プレート中4×104細胞/穴]を、集密細胞単層を得るために37℃、5%CO2で24時間インキュベートした。培地を除去し、細胞を、MEM HEPESアルブミン(0.5%)GVFに希釈したA/WSN/33インフルエンザウイルス(H1N1)に1の感染多重度(1MOI)で感染させた。インキュベーションの20時間後、培地を除去し、PBS、PapMVCP又はPapMVCP−M2eを注射したマウスからの血清のプールの1:40希釈(PBS中)を各々のウェルに添加した。
使用したインフルエンザA株はA/WSN/33インフルエンザ株(H1N1)であり、この株は、新生児マウスにおける及びその後成体マウスの脳への連続継代によって得られた、マウス肺適応臨床単離物、A/WS/33に由来した(Stuart−Harris,1939,Lancet 1:497−499)。この株のLD50は、以前に約103プラーク形成単位(pfu)と評価された(Abed et al.,2006,Antivir Ther 11:971−976)。本実施例では、低用量のインフルエンザ感染は1LD50に相当し、中間用量の感染は4LD50に相当する。
マウスを、1×103(1LD50)のインフルエンザウイルス株A/WSN/33を含む35μlで鼻内感染させた。マウスを臨床徴候(体重減少、直腸温度、異常行動及び毛の乱れ)に関して毎日観測した。16日間にわたって死亡を記録した。
スチューデント検定、チューキー検定及びダン検定は、マウスの群の間の差(抗体価、温度、体重、肺におけるウイルス力価)を比較した。生存曲線における差をカプラン−マイヤー生存分析によって解析した。p<0.05(*)、p<0.01(**)、p<0.0001(***)の値を統計的に有意とみなした。PRISM 3.03で統計解析を実施した。
PapMVCPへのM2eの遺伝子融合がこのペプチドに対する免疫応答の誘導を促進するかどうかを評価するため、BALB/cマウスを2週間の間隔で2回、100μgのPapMVCP−M2e、PapMVCP VLP(融合エピトープを含まない)又はPapMVCP VLP+融合していない合成M2eペプチドで免疫した。結果は23Aに示されており、PapMV−M2e VLPだけがM2eに対する体液性応答を誘発することができ、IgG2aへのクラススイッチを誘導できることを示し、VLPへのM2eペプチドの遺伝子融合がこのペプチドを免疫原性にすることを示す。PapMVCP−M2e VLPでのワクチン接種によって誘導される抗体が、インフルエンザ感染細胞によって提示されるM2タンパク質を認識できるかどうかを調べるため、ELISAと共焦点顕微鏡検査を実施した。ELISA(図23B)と共焦点顕微鏡検査の両方から得られた結果により、これらの抗M2e抗体が生理的M2eを認識することを確認した。さらに、血清対照症例(PBS及びPapMVCP VLPのいずれかを注射したマウスから)は、感染細胞又は非感染細胞のいずれにも効率的に結合しなかった(図23B)。
(実施例XI)
M2eインフルエンザ抗原を含むPapMV VLP又はディスクによるマウスの免疫:投与レジメン、アジュバント添加及びオプソニン化の作用
マウスの免疫
10匹の6〜8週齢のBALB/cマウス(Charles River社)に、各マウスにつき100μlの最終注射容量中、エンドトキシン不含PBS(Sigma社)100μg、PapMVCP 100μg、又は種々の形態のPapMVCP−M2e(単独、オプソニン化又はアジュバント添加)100μgを皮下注射した。初回免疫の後に、初回接種後2週間の間隔をおいて同じ量の2回の追加接種を実施した。
実施例Xで述べたようにELISAを実施した。
ウイルス抗原投与実験
抗原投与のために4×103pfu(4LD50)を使用したことを除き、実施例Xで述べたようにマウスをインフルエンザウイルス株A/WSN/33で鼻内感染させた。マウスを臨床徴候(体重減少、直腸温度、異常行動及び毛の乱れ)に関して毎日観察した。16日間にわたって死亡を記録した。同時点での肺抗M2レベル及びウイルス肺力価の定量のために、条件ごとに5匹のマウスの群を接種後7日目に犠死させた。気管支肺胞洗浄(BAL)を3×1mlの滅菌PBSで実施した。肺を無菌的に切除し、滅菌PBS 1ml中−80℃で保存した。その後、肺を均質化し、2500rpm/4℃で10分間遠心分離して、上清を、先に述べられている(Abed et al.,2005,Antimicrob Agents Chemother 49:556−559)標準プラークアッセイを用いてMDBK細胞で滴定した。
統計解析を実施例Xで述べたように実施した。
結果
PapMVCP−M2e構築物によって開始されるIgG2a抗M2e応答を上昇させるため、3つの異なる方策を実施した:(1)追加抗原注射の回数を2回に増やすこと、(2)製剤にアジュバント(ミョウバン又はPapMVCP VLP)を添加すること、及び(3)抗PapMVCP又は抗PapMVCP−M2e抗体でのオプソニン化すること。
(実施例XII)
フェレットにおけるM2eインフルエンザ抗原を含むPapMV VLPの免疫原性の評価
PapMV VLP
実施例IXで述べたPapMVCP−M2e構築物をすべての実験に使用した。
16週齢又はそれ以上の雄性フェレットをすべての実験のために使用した。動物は狂犬病に対してワクチン接種されており、イヌジステンパー及びインフルエンザA型サブタイプH1N1及びH2N3に対するELISA検出可能抗体を有していなかった。初回免疫の当日に、血清試料を収集し、プレブリード(prebleed)として使用した。2つの連続的な実験を実施した。最初の実験のために、4匹の動物にPapMV−M2e VLP 25μgを皮下注射した。同じ濃度で2回目及び3回目の注射を3週間の間隔で実施した。ワクチン接種動物並びに2匹の非ワクチン接種対照フェレットを、インフルエンザウイルス株H1N1 New Caledonia/99のヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ糖タンパク質を担持する、ワクチン再集合体PR8の105組織培養感染用量の鼻内接種により、最後の追加免疫の3週間後に抗原投与した。感染後、7日間毎日体温を測定し、2、4及び6又は7日目に体重を測定した。血清試料を3日目と7日目に収集し、感染細胞及びM2eペプチドのいずれかを抗原として使用するELISAによって抗体価を定量した。
抗原投与の時点で、1番目の群の4匹のワクチン接種動物のうち3匹が、M2eペプチド並びにウイルス感染細胞を認識する抗体を発現した(図30A及び図30B)。これらの抗体は、感染後7日以内にさらに増加した。対照動物は、感染の3日後にウイルス感染細胞に対して同様の力価に達し、その後ワクチン接種動物の動態に従った。しかし、対照動物はM2eペプチドと交差反応する抗体を発現することができなかった。感染後1日目に抗体を有さない動物において体温がわずかにより高かったことを別にして、ワクチン接種動物と対照動物の間で臨床徴候の識別できる差は認められなかった(図30C及びD)。
(実施例XIII)
インフルエンザA型H9N2株からのM2eエピトープを含むACSの開発
H9N2 PapMV−M2eウイルス様粒子(VLP)のクローニング及び作製
タンパク質のC末端で融合したH9N2インフルエンザ株からのM2eエピトープを含むPapMVコートタンパク質を、M2eコード配列を創製するために以下のオリゴヌクレオチドを使用したことを除き、実施例IXで述べたように作製した:
オリゴH9N2フォワード:
5’−CTAGTTCCCTGCTGACCGAAGTGGAAACCCCGACCCGCAACGGTTGGGGCTGCCGCTGCTCTGATTCCTCCGATA−3’[配列番号50]
オリゴH9N2リバース:
5’−CGCGTATCGGAGGAATCAGAGCAGCGGCAGCCCCAACCGTTGCGGGTCGGGGTTTCCACTTCGGTCAGCAGGGAA−3’[配列番号51]。
5’−CTAGTGGTGGCGGTCTGCTGCTGA−3’[配列番号52]
オリゴH9N2 spe1−GLYリバース:
5’−CTAGTCAGCAGCAGACCGCCACCA−3’[配列番号53]。
生じた構築物を実施例IXで述べたように大腸菌において発現させ、H9N2 PapMV−M2e及びH9N2 PapMV−3GLM2eタンパク質を実施例IXで述べたように超遠心によって精製した。
発現されたタンパク質の分析を実施例IXで述べたように実施した。
結果
PapMVコートタンパク質、H9N2 PapMV−M2e及びH9N2 PapMV−3GLM2eのC末端配列を32Aに示す。PapMV、H9N2 PapMV−M2e及びH9N2 PapMV−3GLM2eのSDS−PAGEプロファイルは、組換えタンパク質の高い純度を示す(図32B)。予想されたように、FPLCプロファイルは、両方のタンパク質についてVLPに対応する固有のピークを示し、H9N2 PapMV−3GLM2eに関してペレット中に高い比率のVLP(90% VLP、分子量≧650kDa)を指示し、H9N2 PapMV−M2e VLP(80% VLP)についても同様の結果を示した(図32C)。既に明らかにされているように、大腸菌において発現されるPapMVCPは、電子顕微鏡検査によって数多くの棒状体が見られるので(図32D、左のパネル)、VLPへと効率的に自己組織化することができる。重要な点として、PapMVCPのC末端でのH9N2 M2eエピトープの融合は、超遠心後にペレット中で多くの棒状体が認められたので(図32D、中央のパネル(H9N2 PapMV− 3GLM2e)及び右のパネル(H9N2 PapMV−M2e))、このタンパク質がVLPへと自己組織化する能力を損なわなかった。
(実施例XIV)
インフルエンザA型H9N2株からのM2eエピトープを含むACSの免疫原性
Balb/CマウスにおけるH9N2 PapMV−M2e VLPの免疫原性
10匹のマウスの群に、100μgの精製H9N2 PapMV−M2e VLP、等量のミョウバンをアジュバントとして添加したH9N2 PapMV−M2e VLP、又はさらなる100μgのPapMV VLPをアジュバントとして添加したH9N2 PapMV−M2e VLPを3回皮下注射した。また、別の群のマウスに、全タンパク質、すなわち超遠心を行わずに大腸菌から単離した、少なくとも20%のディスクを含む全精製タンパク質を注射した。すべての場合において、マウスに注射した最終容量は500μlであった。
H9N2 M2eペプチドに対する高レベルの抗体を産生し、3回目の注射後140日目に保持されていた2匹のマウスの血清を分析した。抗体応答はこの期間全体にわたって維持されることが認められ、H9N2 PapMV−M2e VLPがマウスにおいて効率的に記憶応答を誘導できることを指示した(図34A)。さらに、これらのマウスはまた、持続性で豊富な量のIgG1(図34B)及びIgG2a(図34C)アイソタイプを産生することが示された。この結果は、H9N2 PapMV−M2e VLPが種々のアイソタイプに対するB細胞のクラススイッチを効率的に誘導できることを示し、マウスにおける平衡Th1/Th2応答を示唆する。
H9N2 PapMV−M2e VLPに対して強く反応したマウスから得られた抗血清を、他のM2eペプチドの配列が認識されるかどうかを判定するためELISAによって分析した。H9N2ペプチドを含む5つの異なるM2eペプチドを試験した(表3参照)。
(実施例XV)
インフルエンザA型H3N8株からのM2eエピトープを含むACSの開発
H3N8 PapMV−M2eウイルス様粒子(VLP)のクローニング及び作製
タンパク質のC末端で融合したH3N8インフルエンザ株からのM2eペプチドを含むPapMVコートタンパク質を、M2eコード配列を創製するために以下のオリゴヌクレオチドを使用したことを除き、実施例IXで述べたように作製した:
オリゴM2−H3N8フォワード:
5’−CTAGTTCCCTGCTGACCGAAGTGGAAACCCCGACCCGCAACGGTTGGGAATGCAAATGCTCTGATTCCTCCGATA−3’[配列番号54]
オリゴM2−H3N8リバース:
5’−CGCGTATCGGAGGAATCAGAGCATTTGCATTCCCAACCGTTGCGGGTCGGGGTTTCCACTTCGGTCAGCAGGGAA−3’[配列番号55]
最終構築物のヌクレオチド配列を図1Iに示し[配列番号56]、エンコードされるアミノ酸配列を図1J[配列番号57]に示す。
SDS−PAGE、FPLC及び電子顕微鏡検査
発現されたタンパク質の分析を実施例IXで述べたように実施した。
PapMVコートタンパク質及びH3N8 PapMV−M2eのC末端配列を図36Aに示す。PapMV及びH3N8 PapMV−M2eのSDS−PAGEプロファイルは、組換えタンパク質の高い純度を示す(図36B)。予想されたように、PBSに再懸濁した超遠心タンパク質のFPLCプロファイルは、両方のタンパク質についてVLPに対応する固有のピークを示した(図36C)。H3N8 PapMV−M2e VLPピークは、92%のVLPからなると推定された。PapMVCPのC末端でのH3N8 M2eエピトープの融合は、超遠心後にペレット中で多くの棒状体が認められたので(図36D、右のパネル)、このタンパク質がVLPへと自己組織化する能力を損なわなかった。
(実施例XVI)
インフルエンザA型H5N1株からのM2eエピトープを含むACSの開発
H5N1 PapMV−M2eウイルス様粒子(VLP)のクローニング及び作製
タンパク質のC末端で融合したH5N1インフルエンザ株からのM2eペプチドを含むPapMVコートタンパク質を、M2eコード配列を創製するために以下のオリゴヌクレオチドを使用したことを除き、実施例IXで述べたように作製した:
オリゴM2−H5N1フォワード:
5’−CTAGTTCCCTGCTGACCGAAGTGGAAACCCCGACCCGCAACGAATGGGAATGCCGCTGCTCTGATTCCTCCGATA−3’[配列番号60]
オリゴM2−H5N1リバース:
5’−CGCGTATCGGAGGAATCAGAGCAGCGGCATTCCCATTCGTTGCGGGTCGGGGTTTCCACTTCGGTCAGCAGGGAA−3’[配列番号61]
最終構築物のヌクレオチド配列を図1Kに示し[配列番号58]、エンコードされるアミノ酸配列を図1L[配列番号59]に示す。
SDS−PAGE及び電子顕微鏡検査
発現されたタンパク質の分析を実施例IXで述べたように実施した。
PapMVコートタンパク質及びH5N1 PapMV−M2eのC末端配列を図37Aに示す。PapMV及びH5N1 PapMV−M2eのSDS−PAGEプロファイルは、組換えタンパク質の高い純度を示す(図37B)。PapMVCPのC末端でのH5N1 M2eエピトープの融合は、超遠心後にペレット中で多くの棒状体が認められたので(図37C、右のパネル)、このタンパク質がVLPへと自己組織化する能力を損なわなかった。
(実施例XVII)
インフルエンザNPタンパク質の作製
インフルエンザウイルス株A/WSN/33からのNPタンパク質のコード配列(図41A;配列番号63参照)を、以下のプライマーを使用してPCR増幅した:
フォワード:5’−GACTCC ATG GCG ACC AAA GGC ACC AAA CGA−3’[配列番号65]
リバース:5’−GATC CTC GAG TTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG ATT GTC GTA CTC CTC−3’[配列番号66]。
(実施例XIII)
PapMVによる市販インフルエンザワクチンへのアジュバント添加は免疫原性を改善する
PapMV
野生型PapMVを実施例Iで述べたように植物から単離した。
5匹のマウスの2つの群を、最終容量350μl中の市販のFluviral(登録商標)ワクチン9μg(GlaxoSmithKline社)(第1群)又は野生型PapMVウイルス100μgをアジュバントとして添加したFluviral(登録商標)ワクチン9μgで皮下的に1回免疫した。免疫後5、10及び14日目に血液試料を収集した。
ELISA分析を、Fluviral(登録商標)ワクチン及び組換えNPタンパク質(大腸菌において生産され、実施例XVIIで述べたように精製された)のいずれかで被覆したプレートを使用したことを除き、先の実施例で概説したプロトコールを用いて実施した。NPタンパク質に対するIgG2aの量の測定のため(図40Bに示すように)、NPタンパク質でのプレートの被覆を4℃で一晩ではなく37℃で2時間実施した。
血清中の総IgGを測定するために実施したELISAは、免疫後5日目にFluviral(登録商標)ワクチンに対するIgGが検出できなかったことを示す(図38A)。しかし、10日目までに、PapMVによるアジュバント添加は、Fluviral(登録商標)ワクチン単独で得られたIgG力価に比べて、2〜4倍に相当する1〜2対数だけIgG力価を改善し(図38B)、この上昇は14日目に維持されていたか又はわずかに改善されていた(図38C)。
Claims (77)
- パパイヤモザイクウイルス(PapMV)又はPapMVコートタンパク質を含むVLPと併用される1つ以上のインフルエンザウイルス抗原を含む抗原提示系。
- 前記VLPが、前記VLPを形成するように自己組織化することができる修飾PapMVコートタンパク質を含む、請求項1に記載の抗原提示系。
- 前記1つ以上のインフルエンザウイルス抗原が前記PapMV又は前記VLPのコートタンパク質に結合している、請求項1又は2に記載の抗原提示系。
- 前記1つ以上のインフルエンザウイルス抗原が前記PapMV又はVLPに結合していない、請求項1又は2に記載の抗原提示系。
- 前記系がVLPを含み、かつ前記1つ以上のインフルエンザウイルス抗原がVLPの前記コートタンパク質に遺伝子的に融合している、請求項3に記載の抗原提示系。
- 前記1つ以上のインフルエンザウイルス抗原が、前記PapMV又は前記VLPの前記コートタンパク質に共有結合している、請求項3に記載の抗原提示系。
- 前記インフルエンザウイルス抗原の少なくとも1つがM2タンパク質に由来する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗原提示系。
- 前記インフルエンザウイルス抗原の少なくとも1つがM2eペプチド又はそのフラグメントである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗原提示系。
- 前記抗原提示系がVLPを含み、前記VLPが、配列番号1又は3に示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するPapMVコートタンパク質を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗原提示系。
- 前記抗原提示系がVLPを含み、前記VLPが、配列番号4、47及び48のいずれか1つに示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するPapMVコートタンパク質を含む、請求項1〜3及び5のいずれか一項に記載の抗原提示系。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の抗原提示系を1つ以上含有する、インフルエンザワクチン組成物。
- 1つ以上のインフルエンザウイルス抗原に融合したパパイヤモザイクウイルスコートタンパク質を含むポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号4、47及び48のいずれか1つに示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む、請求項12に記載のポリペプチド。
- 請求項12又は13に記載のポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド。
- 動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するための抗原提示系の使用方法であって、前記抗原提示系が、パパイヤモザイクウイルス(PapMV)又はPapMVコートタンパク質を含むVLPと併用される1つ以上のインフルエンザウイルス抗原を含む使用方法。
- 前記VLPが、前記VLPを形成するように自己組織化することができる修飾PapMVコートタンパク質を含む、請求項15に記載の使用方法。
- 前記1つ以上のインフルエンザウイルス抗原が前記PapMV又は前記VLPのコートタンパク質に結合している、請求項15又は16に記載の使用方法。
- 前記1つ以上のインフルエンザウイルス抗原が前記PapMV又はVLPに結合していない、請求項15又は16に記載の使用方法。
- 前記系がVLPを含み、かつ前記1つ以上のインフルエンザウイルス抗原がVLPの前記コートタンパク質に遺伝子的に融合している、請求項17に記載の使用方法。
- 前記1つ以上のインフルエンザウイルス抗原が、前記PapMV又は前記VLPの前記コートタンパク質に共有結合している、請求項17に記載の使用方法。
- 前記インフルエンザウイルス抗原の少なくとも1つがM2タンパク質に由来する、請求項15〜20のいずれか一項に記載の使用方法。
- 前記インフルエンザウイルス抗原の少なくとも1つがM2eペプチド又はそのフラグメントである、請求項15〜20のいずれか一項に記載の使用方法。
- 前記抗原提示系がVLPを含み、前記VLPが、配列番号1又は3に示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するPapMVコートタンパク質を含む、請求項15〜22のいずれか一項に記載の使用方法。
- 前記抗原提示系がVLPを含み、前記VLPが、配列番号4、47及び48のいずれか1つに示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するPapMVコートタンパク質を含む、請求項15〜17及び19のいずれか一項に記載の使用方法。
- 前記免疫応答が体液性応答を含む、請求項15〜24のいずれか一項に記載の使用方法。
- 前記動物がヒトである、請求項15〜25のいずれか一項に記載の使用方法。
- 前記動物が非ヒト動物である、請求項15〜25のいずれか一項に記載の使用方法。
- 動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するための、抗原提示系、及びアジュバント又はオプソニンを含む組成物の使用方法であって、前記抗原提示系が、パパイヤモザイクウイルス(PapMV)又はPapMVコートタンパク質を含むVLPと併用される1つ以上のインフルエンザウイルス抗原を含む使用方法。
- 前記組成物がアジュバントを含む、請求項28に記載の使用方法。
- 前記アジュバントがPapMV又はPapMV VLPを含む、請求項29に記載の使用方法。
- 前記VLPが、前記VLPを形成するように自己組織化することができる修飾PapMVコートタンパク質を含む、請求項28〜30のいずれか一項に記載の使用方法。
- 前記1つ以上のインフルエンザウイルス抗原が前記PapMV又は前記VLPのコートタンパク質に結合している、請求項28〜31に記載の使用方法。
- 前記1つ以上のインフルエンザウイルス抗原が前記PapMV又はVLPに結合していない、請求項28〜31に記載の使用方法。
- 前記系がVLPを含み、かつ前記1つ以上のインフルエンザウイルス抗原がVLPの前記コートタンパク質に遺伝子的に融合している、請求項32に記載の使用方法。
- 前記1つ以上のインフルエンザウイルス抗原が、前記PapMV又は前記VLPの前記コートタンパク質に共有結合している、請求項32に記載の使用方法。
- 前記インフルエンザウイルス抗原の少なくとも1つがM2タンパク質に由来する、請求項28〜35のいずれか一項に記載の使用方法。
- 前記インフルエンザウイルス抗原の少なくとも1つがM2eペプチド又はそのフラグメントである、請求項28〜35のいずれか一項に記載の使用方法。
- 前記抗原提示系がVLPを含み、前記VLPが、配列番号1又は3に示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するPapMVコートタンパク質を含む、請求項28〜37のいずれか一項に記載の使用方法。
- 前記抗原提示系がVLPを含み、前記VLPが、配列番号4、47及び48のいずれか1つに示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するPapMVコートタンパク質を含む、請求項28〜32及び34のいずれか一項に記載の使用方法。
- 前記免疫応答が体液性応答を含む、請求項28〜39のいずれか一項に記載の使用方法。
- 前記動物がヒトである、請求項28〜40のいずれか一項に記載の使用方法。
- 前記動物が非ヒト動物である、請求項28〜40のいずれか一項に記載の使用方法。
- 薬剤の製造における、請求項1〜10のいずれか一項に記載の抗原提示系の使用方法。
- 前記薬剤が、動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するためのものである、請求項43に記載の使用方法。
- 前記免疫応答が体液性応答を含む、請求項44に記載の使用方法。
- 前記動物がヒトである、請求項44又は45に記載の使用方法。
- 前記動物が非ヒト動物である、請求項44又は45に記載の使用方法。
- 前記薬剤がアジュバント又はオプソニンをさらに含む、請求項43〜47のいずれか一項に記載の使用方法。
- 前記アジュバントがPapMV又はPapMV VLPを含む、請求項48に記載の使用方法。
- インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、前記方法は、1つ以上の抗原提示系を含有する有効量の組成物を動物に投与する工程を含み、前記抗原提示系の各々が、パパイヤモザイクウイルス(PapMV)又はPapMVコートタンパク質を含むVLPと併用される1つ以上のインフルエンザウイルス抗原を含む方法。
- 前記VLPが、前記VLPを形成するように自己組織化することができる修飾PapMVコートタンパク質を含む、請求項50に記載の方法。
- 前記1つ以上のインフルエンザウイルス抗原が前記PapMV又は前記VLPのコートタンパク質に結合している、請求項50又は51に記載の方法。
- 前記1つ以上のインフルエンザウイルス抗原が前記PapMV又はVLPに結合していない、請求項50又は51に記載の方法。
- 前記系がVLPを含み、かつ前記1つ以上のインフルエンザウイルス抗原がVLPの前記コートタンパク質に遺伝子的に融合している、請求項52に記載の方法。
- 前記1つ以上のインフルエンザウイルス抗原が、前記PapMV又は前記VLPの前記コートタンパク質に共有結合している、請求項52に記載の方法。
- 前記インフルエンザウイルス抗原の少なくとも1つがM2タンパク質に由来する、請求項50〜55のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インフルエンザウイルス抗原の少なくとも1つがM2eペプチド又はそのフラグメントである、請求項50〜55のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原提示系がVLPを含み、前記VLPが、配列番号1又は3に示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するPapMVコートタンパク質を含む、請求項50〜57のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原提示系がVLPを含み、前記VLPが、配列番号4、47及び48のいずれか1つに示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するPapMVコートタンパク質を含む、請求項50〜52及び54のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫応答が体液性応答を含む、請求項50〜59のいずれか一項に記載の方法。
- 前記動物がヒトである、請求項50〜60のいずれか一項に記載の方法。
- 前記動物が非ヒト動物である、請求項50〜60のいずれか一項に記載の方法。
- インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、前記方法は、アジュバント又はオプソニン及び1つ以上の抗原提示系を含有する有効量の組成物を動物に投与する工程を含み、前記抗原提示系の各々が、パパイヤモザイクウイルス(PapMV)又はPapMVコートタンパク質を含むVLPと併用される1つ以上のインフルエンザウイルス抗原を含む抗原提示系からなる方法。
- 前記組成物がアジュバントを含む、請求項58に記載の方法。
- 前記アジュバントがPapMV又はPapMV VLPを含む、請求項64に記載の方法。
- 前記VLPが、前記VLPを形成するように自己組織化することができる修飾PapMVコートタンパク質を含む、請求項63〜65のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上のインフルエンザウイルス抗原が前記PapMV又は前記VLPのコートタンパク質に結合している、請求項63〜66に記載の方法。
- 前記1つ以上のインフルエンザウイルス抗原が前記PapMV又はVLPに結合していない、請求項63〜66に記載の方法。
- 前記系がVLPを含み、かつ前記1つ以上のインフルエンザウイルス抗原がVLPの前記コートタンパク質に遺伝子的に融合している、請求項67に記載の方法。
- 前記1つ以上のインフルエンザウイルス抗原が、前記PapMV又はVLPの前記コートタンパク質に共有結合している、請求項67に記載の方法。
- 前記インフルエンザウイルス抗原の少なくとも1つがM2タンパク質に由来する、請求項63〜70のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インフルエンザウイルス抗原の少なくとも1つがM2eペプチド又はそのフラグメントである、請求項63〜70のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原提示系がVLPを含み、前記VLPが、配列番号1又は3に示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するPapMVコートタンパク質を含む、請求項63〜72のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原提示系がVLPを含み、前記VLPが、配列番号4、47及び48のいずれか1つに示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するPapMVコートタンパク質を含む、請求項63〜67及び69のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫応答が体液性応答を含む、請求項63〜74のいずれか一項に記載の方法。
- 前記動物がヒトである、請求項63〜75のいずれか一項に記載の方法。
- 前記動物が非ヒト動物である、請求項63〜75のいずれか一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US86599706P | 2006-11-15 | 2006-11-15 | |
PCT/CA2007/002069 WO2008058396A1 (en) | 2006-11-15 | 2007-11-15 | Papaya mosaic virus-based vaccines for influenza |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013168552A Division JP2013234198A (ja) | 2006-11-15 | 2013-08-14 | パパイヤモザイクウイルスに基づくインフルエンザ抗原提示系及びそれを含むインフルエンザワクチン |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010508860A true JP2010508860A (ja) | 2010-03-25 |
Family
ID=39401290
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009536573A Pending JP2010508860A (ja) | 2006-11-15 | 2007-11-15 | パパイヤモザイクウイルスに基づくインフルエンザ用ワクチン |
JP2013168552A Pending JP2013234198A (ja) | 2006-11-15 | 2013-08-14 | パパイヤモザイクウイルスに基づくインフルエンザ抗原提示系及びそれを含むインフルエンザワクチン |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013168552A Pending JP2013234198A (ja) | 2006-11-15 | 2013-08-14 | パパイヤモザイクウイルスに基づくインフルエンザ抗原提示系及びそれを含むインフルエンザワクチン |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20100111996A1 (ja) |
EP (1) | EP2069503B1 (ja) |
JP (2) | JP2010508860A (ja) |
CA (1) | CA2669485C (ja) |
DK (1) | DK2069503T3 (ja) |
ES (1) | ES2562774T3 (ja) |
WO (1) | WO2008058396A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014519817A (ja) * | 2011-05-13 | 2014-08-21 | フォリア バイオテック インコーポレイテッド | ウイルス様粒子およびその調製プロセス |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8101189B2 (en) | 2002-07-05 | 2012-01-24 | Folia Biotech Inc. | Vaccines and immunopotentiating compositions and methods for making and using them |
US9119804B2 (en) | 2006-03-10 | 2015-09-01 | Institut Pasteur De Lille | Live attenuated bordetella strains as a single dose vaccine against whooping cough |
WO2012048430A1 (en) * | 2010-10-14 | 2012-04-19 | Folia Biotech Inc. | Affinity-conjugated nucleoprotein-papaya mosaic virus-like particles and uses thereof |
EP2082042A4 (en) * | 2007-01-26 | 2010-08-18 | Folia Biotech Inc | VACCINE VACCINE FROM PAPAYA MOSAIC AGAINST SALMONELLA TYPHI AND OTHER ENTEROBACTERIAL PATHOGENS |
WO2010012069A1 (en) * | 2008-07-30 | 2010-02-04 | Folio Biotech Inc. | Multivalent vaccines based on papaya mosaic virus and uses thereof |
EP2442826B1 (en) * | 2009-06-15 | 2015-07-08 | National University of Singapore | Influenza vaccine, composition, and methods of use |
ES2781481T3 (es) | 2011-11-02 | 2020-09-02 | Nat Univ Singapore | Efecto de una cepa de Bordetella atenuada contra enfermedades alérgicas |
ES2657875T3 (es) * | 2012-03-22 | 2018-03-07 | Fraunhofer Usa Inc. | Partículas tipo virus que comprenden una proteína de la matriz de un virus encapsulado de plantas y usos de las mismas |
JP2015514097A (ja) * | 2012-04-02 | 2015-05-18 | フォリア バイオテック インコーポレイテッド | 組換えパパイヤモザイクウイルスコートタンパク質およびインフルエンザワクチンにおけるその使用 |
EP2722338A1 (en) | 2012-10-17 | 2014-04-23 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Novel recombinant Bordetella strains |
US20150274784A1 (en) * | 2012-11-07 | 2015-10-01 | Vacplanta Limted | Production of an Immunogen Using a Plant Virus |
US10117923B2 (en) | 2012-11-07 | 2018-11-06 | Vacplanta Limited | Production of an immunogen using a plant virus |
US9655959B2 (en) | 2014-10-01 | 2017-05-23 | National University Of Singapore | Adenylate cyclase deficient bordetella strains |
EP3141600A1 (en) * | 2015-09-11 | 2017-03-15 | Institut National de la Recherche Agronomique | Nepovirus coat protein fusion polypeptides and their use |
US10682377B2 (en) | 2016-03-29 | 2020-06-16 | Institut Pasteur De Lille | Mutant Bordetella strains and methods of use |
AU2018353409A1 (en) | 2017-10-18 | 2020-04-16 | Institut National De La Santé Et De La Recherche Médicale (Inserm) | Bordetella strains expressing serotype 3 Fimbriae |
EP3730620A4 (en) * | 2017-12-21 | 2022-01-05 | Green Biomed, Inc. | CROSS-IMMUNIZATION ANTIGENIC VACCINE AND PROCESS FOR PREPARATION |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002508748A (ja) * | 1997-05-01 | 2002-03-19 | カイロン コーポレイション | アジュバントとしてのウイルス様粒子の使用 |
WO2005055957A2 (en) * | 2003-12-10 | 2005-06-23 | Apovia, Inc. | Influenza immunogen and vaccine |
JP2006504644A (ja) * | 2002-07-05 | 2006-02-09 | デニス レクレルク | アジュバントウィルス粒子 |
JP2010508857A (ja) * | 2006-11-15 | 2010-03-25 | フォリア バイオテック インコーポレイテッド | パパイヤモザイクウイルスに基づく免疫原性の親和性で複合体化された抗原系及びその使用 |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5977438A (en) * | 1988-02-26 | 1999-11-02 | Biosource Technologies, Inc. | Production of peptides in plants as viral coat protein fusions |
JPH06500232A (ja) * | 1990-08-15 | 1994-01-13 | サリオン・バイオロジクス・コーポレイシヨン | 自己集合性複製欠陥型ハイブリッドウイルス粒子 |
US5443969A (en) * | 1992-10-29 | 1995-08-22 | Rutgers University | RNA packaging system |
GB9227068D0 (en) * | 1992-12-29 | 1993-02-24 | British Bio Technology | Novel proteinaceous particles |
GB9414118D0 (en) * | 1994-07-13 | 1994-08-31 | Axis Genetics Ltd | Modified plant viruses as vectors of heterologous peptides |
US6042832A (en) * | 1996-08-28 | 2000-03-28 | Thomas Jefferson University | Polypeptides fused with alfalfa mosaic virus or ilarvirus capsid proteins |
ES2255181T3 (es) * | 1997-08-05 | 2006-06-16 | Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw. | Antigeno inmunoprotector contra la gripe y su uso en vacunacion. |
CA2352738A1 (en) * | 1998-12-04 | 2000-06-08 | Biogen, Inc. | Hbv core antigen particles with multiple immunogenic components attached via peptide ligands |
IL153290A0 (en) * | 2000-06-23 | 2003-07-06 | American Cyanamid Co | Assembly of wild-type and chimeric influenza virus-like particles (vlps) |
US20030202982A1 (en) * | 2001-08-15 | 2003-10-30 | Birkett Ashley J. | Influenza immunogen and vaccine |
US8101189B2 (en) * | 2002-07-05 | 2012-01-24 | Folia Biotech Inc. | Vaccines and immunopotentiating compositions and methods for making and using them |
BRPI0407877A (pt) * | 2003-03-07 | 2006-03-01 | Merck & Co Inc | conjugado de peptìdeo-proteìna, vacina para a prevenção ou melhora da infecção pelo vìrus influenza, e, método para induzir um resposta imune em um paciente |
US8592197B2 (en) * | 2003-07-11 | 2013-11-26 | Novavax, Inc. | Functional influenza virus-like particles (VLPs) |
KR20080028941A (ko) * | 2005-07-19 | 2008-04-02 | 다우 글로벌 테크놀로지스 인크. | 재조합 인플루엔자 백신 |
EP2082042A4 (en) * | 2007-01-26 | 2010-08-18 | Folia Biotech Inc | VACCINE VACCINE FROM PAPAYA MOSAIC AGAINST SALMONELLA TYPHI AND OTHER ENTEROBACTERIAL PATHOGENS |
WO2010012069A1 (en) * | 2008-07-30 | 2010-02-04 | Folio Biotech Inc. | Multivalent vaccines based on papaya mosaic virus and uses thereof |
-
2007
- 2007-11-15 WO PCT/CA2007/002069 patent/WO2008058396A1/en active Application Filing
- 2007-11-15 JP JP2009536573A patent/JP2010508860A/ja active Pending
- 2007-11-15 EP EP07845539.1A patent/EP2069503B1/en not_active Not-in-force
- 2007-11-15 CA CA2669485A patent/CA2669485C/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-11-15 DK DK07845539.1T patent/DK2069503T3/da active
- 2007-11-15 US US12/515,265 patent/US20100111996A1/en not_active Abandoned
- 2007-11-15 ES ES07845539T patent/ES2562774T3/es active Active
-
2013
- 2013-08-14 JP JP2013168552A patent/JP2013234198A/ja active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002508748A (ja) * | 1997-05-01 | 2002-03-19 | カイロン コーポレイション | アジュバントとしてのウイルス様粒子の使用 |
JP2006504644A (ja) * | 2002-07-05 | 2006-02-09 | デニス レクレルク | アジュバントウィルス粒子 |
WO2005055957A2 (en) * | 2003-12-10 | 2005-06-23 | Apovia, Inc. | Influenza immunogen and vaccine |
JP2010508857A (ja) * | 2006-11-15 | 2010-03-25 | フォリア バイオテック インコーポレイテッド | パパイヤモザイクウイルスに基づく免疫原性の親和性で複合体化された抗原系及びその使用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6012059387; Vaccine Vol.24, 20060612, p.6597-6601 * |
JPN6012059390; FEBS J. Vol.273, 20051213, p.14-25 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014519817A (ja) * | 2011-05-13 | 2014-08-21 | フォリア バイオテック インコーポレイテッド | ウイルス様粒子およびその調製プロセス |
US9833504B2 (en) | 2011-05-13 | 2017-12-05 | Folia Biotech Inc. | Virus-like particles and process for preparing same |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2669485A1 (en) | 2008-05-22 |
WO2008058396A1 (en) | 2008-05-22 |
EP2069503A4 (en) | 2010-08-04 |
ES2562774T3 (es) | 2016-03-08 |
EP2069503A1 (en) | 2009-06-17 |
US20100111996A1 (en) | 2010-05-06 |
CA2669485C (en) | 2017-01-03 |
EP2069503B1 (en) | 2016-01-06 |
DK2069503T3 (da) | 2016-02-15 |
JP2013234198A (ja) | 2013-11-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP2069503B1 (en) | Papaya mosaic virus-based vaccines for influenza | |
JP7250878B2 (ja) | 新規多価ナノ粒子に基づくワクチン | |
ES2534332T3 (es) | Composiciones que incluyen hemaglutinina, métodos de preparación y métodos de uso de las mismas | |
V Petukhova et al. | Immunogenicity and protective efficacy of candidate universal influenza A nanovaccines produced in plants by Tobacco mosaic virus-based vectors | |
Ben-Yedidia et al. | Towards an epitope-based human vaccine for influenza | |
AU2012343981A1 (en) | Influenza virus vaccines and uses thereof | |
US20100316665A1 (en) | Papaya mosaic virus-based vaccines against salmonella typhi and other enterobacterial pathogens | |
US20110206727A1 (en) | Multivalent Vaccines Based on Papaya Mosaic Virus and Uses Thereof | |
US20090162400A1 (en) | Compositions of influenza viral proteins and methods of use thereof | |
Diamos et al. | Codelivery of improved immune complex and virus-like particle vaccines containing Zika virus envelope domain III synergistically enhances immunogenicity | |
JP2010538619A (ja) | Malvaモザイクウイルスおよびウイルス様粒子およびこれらの使用 | |
US10117923B2 (en) | Production of an immunogen using a plant virus | |
Heinimäki et al. | Antigenicity and immunogenicity of HA2 and M2e influenza virus antigens conjugated to norovirus-like, VP1 capsid-based particles by the SpyTag/SpyCatcher technology | |
US20130280298A1 (en) | Immunogenic Affinity-Conjugated Antigen Systems Based on Papaya Mosaic Virus and Uses Thereof | |
KR101557191B1 (ko) | 넓은 범위의 방어능력을 갖는 인플루엔자 단독 또는 보강 백신 | |
KR101302245B1 (ko) | 넓은 범위의 교차 방어능력을 갖는 신규한 보강 인플루엔자 백신 | |
US20150056231A1 (en) | Recombinant papaya mosaic virus coat proteins and uses thereof in influenza vaccines | |
Attaran et al. | Immunogenicity and protective efficacy of recombinant M2e. Hsp70c (Hsp70 359–610) fusion protein against influenza virus infection in mice | |
Lin | Development of vaccine approaches for pandemic influenza infections | |
LIM RUI FEN | DEVELOPMENT OF BORDETELLA PERTUSSIS AS A UNIVERSAL INFLUENZA VACCINE DELIVERY SYSTEM AND APPLICATION AS A LIVE PERTUSSIS VACCINE | |
US20150274784A1 (en) | Production of an Immunogen Using a Plant Virus |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20101110 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20120127 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20121113 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130208 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20130416 |