JP2015514097A - 組換えパパイヤモザイクウイルスコートタンパク質およびインフルエンザワクチンにおけるその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
他に規定しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は本発明が属する分野の当業者であれば一般に理解する意味を有する。
本発明による組換えPapMVコートタンパク質(CP)は、CP N末端表面コイル領域内の位置でPapMV CPに融合した抗原に由来する1つ以上の抗原ペプチドを含んでいる。
本発明による組換えPapMV CPの製造に使用するPapMVコートタンパク質は、PapMV CP全体もしくはその一部であってよい、または野生型PapMV CPの遺伝子修飾版であって、CPがVLPに自己集合する能力を維持していることを前提に、例えば、1つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、置換などを含む遺伝子修飾版であってよい。野生型PapMVコート(もしくはカプシド)タンパク質のアミノ酸配列は当該分野において公知であり(例えば、Sit,et al.,1989,J.Gen.Virol,70:2325−2331およびGenBank登録番号NP_044334.1を参照)、本明細書において配列番号1とした(図1Aを参照)。PapMV CPのヌクレオチド配列は当該分野において公知であり(例えば、Sit,et al.,ibid.およびGenBank登録番号NC_001748(ヌクレオチド5889〜6536)を参照)、本明細書において配列番号2とした(図1Bを参照)。
本発明による組換えPapMV CPは、予測CP N末端表面コイル内でCPに融合した1つ以上の抗原ペプチドを含んでいる。好ましくは、抗原ペプチドは、インフルエンザ抗原に由来する。抗原ペプチドは、組換えCPが発現する能力、またはVLPに自己集合する能力を妨害しないように選択され、どちらも例えば本明細書に記載の標準技術によって試験できる。
(式中、
X1は、EもしくはDである、
X2は、PもしくはLである、
X3は、TもしくはIである、
X4は、RもしくはKである、および
X5は、N、SもしくはKである)
本発明の所定の実施形態によると、組換えPapMV CPは、CPのN末端の13アミノ酸内の予想ランダムコイル内で融合した1つ以上の抗原ペプチドを含んでいる(図16を参照、図中CPのNおよびC末端にあるランダムコイル領域がボールド体で表示されている)。
本発明は、1つ以上の抗原ペプチドを含む組換えPapMV CPを提供する。抗原ペプチドをCPに遺伝的に融合させる方法は当該分野において公知であり、以下および実施例の項に記載した方法が含まれる。抗原ペプチドをタンパク質へ化学的に架橋させる方法は当該分野において周知であり、適切であれば使用できる。
本発明による組換えPapMV CPは、野生型もしくは親タンパク質の配列が提供された当業者であれば標準遺伝子工学技術によって容易に製造できる。タンパク質を遺伝子組み換えする方法は、野生型PapMV CP(配列番号1および2を参照)のアミノ酸およびヌクレオチド配列と同様に、当該分野において周知である(例えば、Ausubel et al.(1994 & updates)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New Yorkを参照)。
本発明との関連において有用なPapMV CPは、VLPに集合することができる。本発明の所定の実施形態において組換えCPは、CPを発現する宿主細胞内でVLPに集合することができる。VLPは、例えばDenis et al.2007,Virology,363:59−68、Denis et al.,2008,Vaccine,26、3395−3403およびTremblay et al.,2006,FEBS,273:14−25に記載の標準技術によって、宿主細胞から単離することができる。一般に、宿主細胞から入手した単離体は、CPのVLP、ディスクおよび余り組織化されていない形態(例えば、単量体および二量体)の混合物を含有している。
組換えCPは、それらがVLPに自己集合する能力について、標準技術、例えば電子顕微鏡によって精製組換えタンパク質を視認する工程によって分析できる(例えば、本明細書に記載した実施例の項を参照)。VLPの形成は、超遠心法によっても決定することができ、所望であれば円二色性(CD)分光測光法を使用して組換えタンパク質の二次構造をWTウイルスと比較することができる。VLPのサイズは、動的光散乱法(DLS)によって評価できる。
組換えPapMV CPを含むVLPが組換えCPによって構成される抗原ペプチドに対する免疫応答を誘導する有効性は、当該分野において公知の様々な標準のin vitroおよびin vivo技術によって評価できる。
本発明の所定の実施形態は、組換えPapMV CPを含むVLPを1つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および/または賦形剤とともに含む医薬組成物に関する。所望であれば、本組成物中には他の有効成分、アジュバントおよび/または免疫増強剤を含めることができる。所定の実施形態において本医薬組成物は、ワクチン内に含めることができる、またはワクチンとして調製できる。
組換えPapMV CPを含むVLPの多数の投与および使用が、本発明によって企図されている。本発明の所定の実施形態は、インフルエンザウイルスに対して防御免疫応答を誘導するためのVLPの使用に関する。インフルエンザ感染に対してVLPを使用して被験者を免疫する方法も所定の実施形態において提供される。本発明の一部の実施形態は、インフルエンザに罹患するリスクを低下させるために被験者に予防投与するためのVLPを含むワクチンに関する。
本発明の一部の実施形態は、組換えCPを含むVLPを含む医薬品パックもしくはキットに関する。1つ以上の組換えCPをコードする核酸を含むキットも提供される。キットの個々の成分は、別個の容器に包装される、およびそのような容器と関連付けられ、注意書は医薬品もしくは生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府官庁によって規定された様式であってよく、その注意書は、製造、使用または販売の規制官庁による承認を反映している。キットは、場合によりVLPの使用もしくは投与レジメンの方法、または組換CPをコードする核酸からのVLPの製造について概説している取扱説明書もしくは指示書を含有していてよい。
PapMVコートタンパク質(CP)がCPの様々な領域でHA11エピトープと融合した場合に発現する能力は、Rioux et al.(2012,PLoS ONE,7(2):e31925)において調査され結果が報告された。PapMV CP[配列番号4]のアミノ酸80の後またはアミノ酸130の後でのHA11ペプチドの融合は不安定なタンパク質をもたらし、HA11ペプチドのアミノ酸29、118もしくは158の後での融合は組換え融合タンパク質の産生をもたらしたが、これは低収率であった。しかしPapMV CPのアミノ酸8、183の後またはC末端でのHA11ペプチドの融合は、高収率で組換えCPの産生を生じさせた。これらの組換えタンパク質は、さらにまたVLPに自己集合することができ、アミノ酸8の後にHA11融合を含むVLPはマウスにおいてHAペプチドへの免疫応答を誘発した。
これらの組換えタンパク質は、1mMのIPTGを用いて誘導できるpET3Dベクターを使用して大腸菌BL219DE3内で発現させた。この組換えタンパク質は、以前Denis et al.,2008,Vaccine,26、3395−3403に記載されたように精製した。タンパク質の発現は、25℃で16時間にわたり実施した。細菌ペレットは、Frenchプレスを用いて溶解させ、遠心(20分間にわたり10,000g)によって浄化し、Ni2+カラム(IMAC社)上に装填した。結合組換えタンパク質は、500mM〜1Mのイミダゾールを用いてIMACカラムから溶出させた。洗剤(TX−100(1〜2%)+Zwittergent(1%))を使用してLPSを除去した。溶出後、イミダゾールは10mMのTris HCl(pH8)中での透析によって除去した。PapMV VLPは透析後に100,000gで90分間の超遠心によって回収した。VLPを含有するペレットは、1mg/mLで10mMのTris HCl(pH8.0)中に再懸濁させた。
構築物の評価結果は表7および図6〜8に示した。構築物#1〜6の配列は図3に示した[配列番号23〜28]。
ディスクを形成した構築物#7を除いて、全構築物がVLPを形成した。これは、コートタンパク質の構造を変化させ、それが多量体化してVLPを形成する能力を妨害する可能性がある、M2eペプチド挿入の位置に起因する可能性が高い。
組換えCP融合タンパク質は、チフス菌(Salmonella typhi)由来のB細胞エピトープ:OmpCポーリン由来のloop6ペプチド(GTSNGSNPSTSYGFAN[配列番号29])を用いて調製した。loop6エピトープは、細菌の表面上で露出したチフス菌(S.typhi)(腸チフスの作用因子)の膜結合タンパク質であるOmpCポーリンに由来し、ポーリンを用いた免疫によって誘導される防御機序に含まれることが証明されている(Paniagua−Solis et al.,1996,FEMS Microbiol Lett.,14:31−6)。これらの領域はチフス菌ポーリン内にのみ存在するので、他のグラム陰性菌由来のポーリンとの交差反応性は見いだされていない。
結果は、図9に示した。図9Bは、組換えPapMV CP融合タンパク質のSDS−PAGE分析を示し、レーン1は、誘導前の細菌の細菌溶解物を含有する。レーン2は、タンパク質PapMV Loop6−8の発現後の細菌の細菌溶解物を含有する。レーン3は、精製PapMV Loop6−8を含有する、レーン4は、誘導前の細菌の細菌溶解物を含有する。レーン5は、タンパク質PapMV Loop6−183の発現後の細菌の細菌溶解物を含有する。レーン6は、精製PapMV Loop6−183を含有する。レーン7は、誘導前の細菌の細菌溶解物を含有する。レーン8は、タンパク質PapMV Loop6−Cの発現後の細菌の細菌溶解物を含有する。レーン9は、精製PapMV Loop6−Cを含有する。全ての場合において、組換えタンパク質は大腸菌内で良好に発現し、Ni2+カラム上の親和性クロマトグラフィーによって容易に精製された。
下記の実験は、実施例2に記載したCP融合タンパク質を含むPapMV VLPがマウスにおいて体液性応答を誘導する能力を評価するために実施した。
結果は図10に示したが、loop−6融合を有するPapMVプラットフォームが高度に免疫原性であることを確証している。PapMV特異的全IgGの産生は、動物をPapMV CPsm、PapMV CP Loop6−8、PapMV CP Loop6−183およびPapMV CP Loop6−Cのいずれかを含むVLPで免疫した場合には誘発されたが(図10A)、プラットフォームに向けられたIgG2a力価は、PapMV CP Loop6−183構築物については極めて低かった(図10B)。loop−6ペプチドに向けた検出可能な全IgG応答を誘導したのはPapMV Loop−6−C VLPだけであった(図10C)。loop−6ペプチドに向けての検出可能なIgG2a応答を引き起こしたVLPはなかった(図10D)。全部のVLPが高度に免疫原性であったので、loop6ペプチドのCPへの融合は、融合ペプチドに立てられた抗体が(ELISAにおいて使用されるような)遊離ペプチドとは反応しないようにペプチドの構造に影響を及ぼせる可能性が高い。しかしC末端での融合は、PapMV Loop6−C VLPで免疫したマウスの一部に由来するIgGがELISAにおける遊離ペプチドに結合できるほどにはペプチドの構造に影響を及ぼさないと思われた。PapMV Loop6−C VLPで免疫したマウス全部が免疫応答を増加させることができた訳ではないので、そのような実験において頻回に観察される作用であるマウスの免疫レパートリーは、個体毎に異なる可能性が高い。
下記の実験では、インフルエンザウイルスの高度に保存されたNPタンパク質に由来するCTLエピトープに融合した組換えPapMV CPの調製を説明する。このペプチド(NP147−155とも呼ばれるTYQRTRALV[配列番号36])は、マウスモデルにおけるインフルエンザによる感染に対する防御CTL応答を誘導するために使用できるBalb/cのH−2d CTLエピトープである(Fu et al.,1997,J.Virol,71:2715−2721、Tao et al.,2009,Antiviral Research,81:253−160)。このためこのペプチドは、Balb/cマウスモデルにおいてPapMV VLPがIFN−γ細胞応答を誘導する能力を評価するために選択した。
結果は、図11に示した。タンパク質のアミノ酸8位、183位の後およびC末端で挿入したCTLエピトープを用いる3種の異なる組換えPapMV CP融合を生成した(図11A)。CTLエピトープの両側では、図11Aに示したようにマウス抗原提示細胞(APCs)内でのCTLエピトープの適正なプロセッシングを保証するために、5個のフランキングアミノ酸(NLNDA[配列番号43]およびRTGMD[配列番号44])を加えた。
PapMV−NP構築物を用いる免疫スケジュール
5匹の6〜8週齢のBALB/cマウス(Charles River社、マサチューセッツ州ウィルミントン)に腹腔内注射(i.p.)により100μgの組換えPapMV CPsm、PapMV NP−8、PapMV−NP−183およびPapMV NP−Cを用いて2週間の間隔で3回免疫した。マウスは、同一融合を有するVLPもしくはディスクのいずれかで免疫した。最終ブーストの2週間後、以下に記載するようにマウスを犠死させ、脾臓を切除し、脾細胞を単離した。
脾細胞単離の前日、エタノール(70%)処理MultiScreen−IP不透明96ウエルプレート(高タンパク質結合イモビリン−P膜、Millipore社、マサチューセッツ州ベッドフォード)を一晩かけて4℃で、マウスインターフェロン−γELISPOTキット内で製造業者によって提案されるようにDPBS(Abcam社、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ)中に希釈させた100μL/ウエルの捕捉IFN−γ抗体を用いてコーティングした(Abcam社、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ)。一晩のインキュベーション後、プレートを200μLのPBS/ウエルを用いて3回洗浄し、PBS中の100μL/ウエルの2%乾燥脱脂乳を用いて37℃、5%のCO2で2時間ブロックした。
精製脾細胞によって分泌されたIFN−γのレベルは融合ペプチドに特異的なCD8+細胞毒性リンパ球の前駆体のレベルと比例するであろうから、IFN−γ分泌の評価により、各組換えVLPがBALB/cマウスにおいて細胞免疫応答を誘導する能力を比較することができる。結果を図12Aに示した。この結果は、NP147−155ペプチドに融合した全PapMV VLPはPapMV CP VLP単独より高いレベルでIFN−γの分泌を誘導することができたが、PapMV CP VLP単独より有意に高いIFN−γの分泌を誘発したのはPapMV NP−12 VLPだけであることを示している。驚くべきことに、PapMV NP−C VLPによって誘導されたIFN−γ分泌の量は、PapMV NP−C VLPを用いた3回の免疫後にワクチンプラットフォームに向けられた抗体の産生によって証明されたように、PapMV NP−Cが免疫系に良好に提示された場合でさえPapMV CP VLP単独によって誘導された分泌量と有意に相違しなかった。
動的光散乱法
動的光散乱法(DLS)のため、VLPのサイズをZetaSizer Nano ZS(Malvern社、英国ウスターシア)を用いて10℃の温度でPBS 1×中に希釈した0.1mg/mLの濃度で記録した。温度変動によって誘導されたVLPサイズの変動は、同一実験条件下で1℃の温度増分で測定した。
最終量50μL中10mMのTris中の0.1%のグルタルアルデヒド、50mMのNaCl(pH7.5)を使用した。架橋に使用したタンパク質の最適濃度は150ng/mLであった。グルタルアルデヒドの添加後、混合液を暗所にて室温で30分間インキュベートした。この反応を15μLのローディングダイを用いて停止させ、95℃で10分間加熱し、タンパク質をSDS−PAGEによって分離した。免疫のために使用した架橋タンパク質は、ローディングダイを加えずに免疫時まで4℃で保存した。
10μgのタンパク質は50μLの量で37℃で120分間、0.2μgのトリプシンを含む100mMのTris−HCl(pH8.5)(Roche社、1418475)中でインキュベートした。この反応は、10μLのローディングダイを添加して停止させた。サンプルは、SDS−PAGEによる分析の前に95℃で10分間加熱した。
DLSを使用してPapMV NP−12、PapMV NP−187、PapMV NP−CおよびPapMV CP VLPの安定性を評価した(図18A)。PapMV NP−187 VLPおよびPapMV NP−C VLPはどちらも、マウスの体温(36.9℃)より低い温度(各々、およそ20℃および25℃)で凝集し始めた。これとは対照的に、PapMV NP−12 VLPは、PapMV CP VLPに類似するおよそ37℃で凝集し始めた(図18A)。PapMV NP−12 VLPのより大きな安定性は、実施例5に示したようにそれらがCTL反応を刺激する能力と良好に相関する。
この実験では、CP内の単独位置またはCP内の相違する位置に挿入された2もしくは3CTLペプチドを有する組換えPapMVコートタンパク質の調製および分析について記載する。この実験では、実施例4に記載したNP147−155ペプチドを使用した。
PapMV 3NP−C − C末端で挿入されたNP CTLペプチドの3つのコピーを備える。
PapMV NP−8/183 − アミノ酸8の後で挿入された1つのNP CTLペプチドおよびアミノ酸183の後で挿入された1つを備える。
PapMV NP−8/C − アミノ酸8の後で挿入された1つのNP CTLペプチドおよびC末端で挿入された1つを備える。
PapMV NP−183/C − アミノ酸183の後で挿入された1つのNP CTLペプチドおよびC末端で挿入された1つを備える。
PapMV 3NP−8 − アミノ酸8で挿入されたNP CTLペプチドの3つのコピーを備える。
PapMV NP−8/183/C(PapMVトリプルNP) − アミノ酸8の後で挿入された1つのNP CTLペプチドおよびC末端で挿入された1つを備える。
挿入部位のアミノ酸配列は図13Aに示した。図13Bは、これらの組み換えPapMV CP融合の発現についてのSDS−PAGE分析を示している:レーン1:誘導前の細菌の細菌溶解物。レーン2:多重融合タンパク質PapMV−NP8/183の発現後の細菌の細菌溶解物。レーン3:誘導前の細菌の細菌溶解物。レーン4:多重融合タンパク質PapMV−NP8/Cの発現後の細菌の細菌溶解物。レーン5:誘導前の細菌の細菌溶解物。レーン6:タンパク質PapMV−NP183/Cの発現後の細菌の細菌溶解物。レーン7:誘導前の細菌の細菌溶解物。レーン8:多重融合タンパク質PapMV−トリプルNPの発現後の細菌の細菌溶解物。レーン9:誘導前の細菌の細菌溶解物。レーン10:多重融合タンパク質PapMV−3NP/8の発現後の細菌の細菌溶解物。レーン11:誘導前の細菌の細菌溶解物。レーン12:多重融合タンパク質PapMV−3NP/Cの発現後の細菌の細菌溶解物。
ペプチド合成
PapMV−CPの全アミノ酸配列をGenScript社(米国ニュージャージー州ピスカタウェイ)によって短鎖ペプチドで合成し、これらをHPLC精製を行わずに粗ペプチドとして使用した。これらのペプチドは、長さが12アミノ酸となり、4アミノ酸ずつフランキングペプチドと重複するようにそれぞれ設計した(表5)。ペプチド8および13中のシステインは、本実験において他の化合物によるスルファイド結合の干渉が発生する可能性を回避するためにセリンに変更した。システインを含有するペプチドについても試験し、結果は、これらがGenScript社(米国ニュージャージー州ピスカタウェイ)による干渉ペプチドを生成しないことを示していたので、HPLC精製を行わずに粗物質として使用した。ペプチドは長さが12アミノ酸であり、各端で4アミノ酸ずつ重複しており、後続ペプチドおよび先行ペプチドを備える(表5)。ペプチド8および13中のシステインは、本実験において他の化合物によるスルファイド結合の干渉が発生する可能性を回避するためにセリンに代えた。システインを含有するペプチドについても試験し、干渉を全く生成しないことが証明された。
5匹の6〜8週齢のBALB/cマウスに100μgのPapMV VLPを皮下注射した199。ブースターショット(追加抗原投与)は第1回注射の2週間後に実施し、血液サンプルはブーストの2週間後に入手した。ペプチドは、製造業者のプロトコールにしたがってNexterion−EスライドMPX 16(Schott社、米国ニューヨーク州エルムスフォード)上に2回ずつ適用した。次にスライドを室温で1時間にわたり、PBS+Tween(登録商標)20(0.05%)+BSA(1%)を用いてブロックした。5匹の免疫マウスからのプール血清をアレイ上にブロッキングバッファー中の1:100の希釈率で2回ずつ1時間室温で配置した。ペプチド抗体は、1時間1:800の希釈率でAlexa−fluor 647抗マウスIgGヤギ抗体(Invitrogen社、米国カリフォルニア州カールスバッド)を用いて検出した。スライドは、室温で3分間PBS−Tを用いて各工程間に3回洗浄した。ガラススライドは、ScanArray 4000XL(GSI Lumonics社)を用いて読取り、GenePix 6.1.0.4(Molecular devices社)を用いて分析した。
図14は、免疫ドット分析の結果を示している。予想どおり、NおよびC末端に対応するペプチドは、ポリクローナル抗体によって検出した。さらに、PapMVポリクローナル抗体はペプチド15、16、18、22および24に対応する5つの他の領域も(高親和性で)検出することができた。同一実験を単一マウスからの別個の血清を使用して実施すると本質的に同一の結果が得られたが、ペプチド18、22および24について記録された信号の強度には変動が見られた。しかし、全マウスで一貫して、ペプチド15および16は強度の信号を生じさせた。
DEPCおよびEDCを用いた化学修飾
PapMVナノ粒子は、溶液中で所定のアミノ酸と選択的に相互作用する化学的で化学修飾した。カルボキシル基には1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)を用いて、ならびにセリン、トレオニン、ヒスチジンおよびチロシンにはジエチルピロカーボネート(DEPC)を用いた。どちらの反応も用量100μL中の1mg/mLのPapMV VLPを用いて実施した。手短には、EDC反応は、50mMの塩酸グリシンアミドバッファー(pH6.0)中で2.0mMの濃度を得るためにEDCを加える工程および室温で1時間にわたりこの反応液をインキュベートする工程によって実施した。DEPC反応は、50mMの酢酸アンモニウム+1%アセトニトリル溶液中の0.4mMのDEPCの濃度で37℃にて1分間実施した。VLPは、DEPCには50mMの酢酸アンモニウムおよびEDCには10mMのTris−HCl(pH8.0)を用いて0.5mLのAmicon Ultra(10kDa)MWCO(Millipore社、米国マサチューセッツ州ビルリカ)中で14,000×gでの2回の遠心によって15分間洗浄した。VLPの完全性は、電子顕微鏡および動的光散乱法によって検証した。消化および質量分析法実験は、Eastern Quebec Genomics Center(カナダ国ケベック州)のProteomicsプラットフォームによって実施した。
VLPを水中で0.03mg/mLの濃度へ希釈し、10μLのサンプルと10μLの3%のアセテートウラニルとを暗所で7分間混合し、その後にこの溶液8μLをカーボン−ホルムバールグリッド上に5分間置いて染色した。グリッドは、JEOL−1010透過型電子顕微鏡(日本国東京)を用いて観察した。VLPのサイズは、ZetaSizer Nano ZS(Malvern社、英国ウスターシア)を用いて4℃で、PBS 1×中に希釈した0.1mg/mLの濃度で記録した。
トリプシン消化は、製造業者の仕様書およびShevchenko et al.のプロトコール(1996,Anal Chem 68:850−858)にしたがって、Havlis et al.によって提案された修正(2003,Anal Chem 75:1300−1306)を加えて、MassPrep液体取扱いロボット(Waters社、米国ミルフォード)上で実施した。手短に言えば、タンパク質は10mMのDTTで還元し、55mMのヨードアセトアミドを用いてアルキル化した。トリプシン消化は、105mMの改質ブタトリプシン(シーケンシング等級、Promega社、ウィスコンシン州マディソン)を使用して58℃で1時間実施した。消化生成物は、1%ギ酸、2%アセトニトリル、その後に1%のギ酸、50%のアセトニトリルを使用して抽出した。回収した抽出物をプールし、真空遠心乾燥させ、次に7μLの0.1%のギ酸中に再懸濁した。2μLを質量分析法によって分析した。
ペプチドサンプルはオンライン逆相(RP)ナノスケールのキャピラリー液体クロマトグラフィー(nanoLC)によって分離し、エレクトロスプレー質量分析法(ES MS/MS)によって分析した。これらの実験は、ナノエレクトロスプレーイオン源(ThermoFisher社、米国カリフォルニア州サンホセ)を装備したLTQ線形イオントラップ質量分析計(ThermoFisher社、米国カリフォルニア州サンホセ)に接続したThermo Surveyor MSポンプを用いて実施した。ペプチド分離は、Jupiter(Phenomenex社)5u、300A C18、10cm×0.075mm(内径)をパッキングしたセルフパック式PicoFritカラム(New Objective社、マサチューセッツ州ウォバーン)上で実施した。ペプチドは2〜50%の溶媒B(アセトニトリル、0.1%のギ酸)からの線形勾配を用いて30分間、200nL/分(フロー・スプリッティングによって得た)で溶出した。質量スペクトルは、Xcaliburソフトウエアバージョン2.0を使用してデータ依存性収集モードを用いて収集した。各フルスキャン質量スペクトル(400〜2,000m/z)は、7個の最強度イオンの衝突誘起解離法にしたがった。動的除外(30秒間の排除時間)機能を有効にし、相対衝突破壊エネルギーは35%に設定した。
全MS/MSサンプルは、Mascot(Matrix Science社、英国ロンドン265、バージョン3.1.2)を使用して分析した。Mascotを設定して、消化酵素トリプシンを想定したPapMV−CPアミノ酸配列を検索した。Mascotは、フラグメントイオン質量公差0.50Daおよび親イオン公差2.0Daを用いて検索した。システインのヨードアセトアミド誘導体を固定修飾として規定し、メチオニンの酸化は可変修飾と規定した。2つのミスセンス切断が許容された。
スカフォールド(3.2.0、Proteome Software社、オレゴン州ポートランド)を使用してMS/MSに基づくペプチドおよびタンパク質同定の妥当性を確認した。ペプチド同定は、Peptide Prophetアルゴリズム(Keller et al.,2002,Anal Chem 74:5383−5392)によって規定した95.0%より高い確率で同定できた場合は容認された(Keller et al.,2002,Anal Chem 74:5383−5392)。修飾は、EDCについて56DaおよびDEPCについて72Daのペプチド質量におけるシフトで同定した。
実施例8に記載した免疫学的結果を確証するために、PapMV VLPは、表面が露出した残基で化学修飾し、質量分析法によって分析した。修飾VLPはさらに、一般的態様を保証するために電子顕微鏡およびDLSによって分析し、長さは未処理VLPの長さに類似であった(図15)。VLPは、次にトリプシンを用いて消化し、エレクトロスプレー質量分析法によって分析した。PapMVコートタンパク質のおよそ70%のアミノ酸配列は、トリプシン消化後の修飾について分析することができた。EDCおよびDEPCによる修飾は、ペプチドの分子量に56Daおよび72Daを各々加えた。EDC修飾は、MS/MSスペクトル上に示したように、D17位、E128位およびE215位で(図19)ならびにDEPC修飾はS135位およびT219位で見られた(図20)。N末端およびC末端はどちらも化学修飾されたためPapMV VLPの表面に位置することが確証された。興味深いことに、中央領域E128およびS135は、免疫ブロット法およびMS/MSによって確証されたようにVLPの表面で露出していると思われた。
mcKLHアジュバントタンパク質へのペプチド結合、免疫およびELISA
ペプチドは、mcKLH結合キットを使用してmcKLHへ結合させた(Pierce社、米国イリノイ州ロックフォード)。免疫は、ペプチド1、13、15、16、17、18、22、24および26に対して10μgのQuil−Aサポニン(Brenntag Biosector社、デンマーク国)アジュバントとともに100μgの結合mcKLHを使用して、ブーストショット前に2週間の間隔で実施した。抗原として天然PapMV VLPを0.1μg/mLで使用して他の箇所(Savard et al.,2011,PLoS ONE 6:e21522)に記載されたように天然タンパク質ELISAによって分析するために第28日にペプチド1つ当たりマウス2匹の血清を採取した。力価は、最適密度が免疫前血清より3倍高い場合に陽性と見なした。
抗体および化学修飾が標的とする残基(実施例8および9)がPapMV VLPの表面上にあることをさらに確証するために、ペプチド1、15、16、18、22、24および26に対する抗体をmcKLHアジュバントタンパク質への融合によって生成した。ペプチド13および17への融合も陰性コントロールとして生成した。表面上にあると予想される全ペプチドは、ペプチド15を除いて、高い全IgG力価によって確証された(表6)。2つのコントロールであるペプチド13および17は、予測どおり陰性であった。
Claims (31)
- 配列番号1のアミノ酸6、7、8、9、10、11もしくは12に対応するアミノ酸の後のパパイヤモザイクウイルス(PapMV)コートタンパク質に融合したインフルエンザM2eペプチドに由来するペプチド抗原を含む融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は自己集合してウイルス様粒子(VLP)を形成することができ、前記ペプチド抗原は、長さが20アミノ酸以下であり、一般配列V−X1−T−X2−X3−X4−X5[配列番号96](式中、X1はEもしくはDである、X2はPもしくはLである、X3はTもしくはIである、X4はRもしくはKである、およびX5はN、SもしくはKである)を含む融合タンパク質。
- 前記ペプチド抗原は、配列番号1のアミノ酸6、7もしくは10に対応するアミノ酸の後で融合している請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記ペプチド抗原は、配列番号1のアミノ酸6に対応するアミノ酸の後で融合している請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記PapMVコートタンパク質は配列番号4に記載したアミノ酸を含み、前記ペプチド抗原は配列番号4の1、2、3、4、5、6、7もしくは8の後で前記PapMVコートタンパク質に融合している請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記ペプチド抗原は、配列番号4のアミノ酸2、3もしくは6の後で前記PapMVコートタンパク質に融合している請求項4に記載の融合タンパク質。
- 前記ペプチド抗原は、長さが約7〜約12アミノ酸、または長さが約7〜約10アミノ酸である請求項1〜5のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記ペプチド抗原は、長さが約7〜約9アミノ酸である請求項1〜5のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記ペプチド抗原は、配列番号14〜22および96〜104のいずれか1つに記載の配列を含む請求項1〜8のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記ペプチド抗原は、配列EVETPIRNE[配列番号21]またはVETPIRN[配列番号22]を含む請求項1〜8のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記ペプチド抗原は、配列EVETPIRNE[配列番号21]またはVETPIRN[配列番号22]から本質的になる請求項1〜8のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質は、配列番号23におけるアミノ酸1〜224、配列番号24におけるアミノ酸1〜222、配列番号25におけるアミノ酸1〜221、配列番号26におけるアミノ酸1〜219、配列番号27におけるアミノ酸1〜224、または配列番号28におけるアミノ酸1〜222に記載したアミノ酸配列を含む請求項4に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質は、配列番号23におけるアミノ酸1〜224に記載したアミノ酸配列を含む請求項4に記載の融合タンパク質。
- 前記VLPは、少なくとも37℃の温度で安定である請求項1〜12のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜13のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むウイルス様粒子(VLP)。
- 請求項14に記載のVLPおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- ワクチンとして調製した請求項15に記載の医薬組成物。
- 被験者におけるインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、前記被験者に有効量の請求項14に記載のVLPを投与する工程を含む方法。
- 被験者のインフルエンザを発症するリスクを低減させる方法であって、前記被験者に有効量の請求項14に記載のVLPを投与する工程を含む方法。
- インフルエンザウイルスによる感染に対して被験者を免疫する方法であって、前記被験者に有効量の請求項14に記載のVLPを投与する工程を含む方法。
- 前記VLPは、前記被験者における体液性免疫応答を誘導する請求項17〜19のいずれか一項に記載の方法。
- それを必要とする被験者におけるインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するために使用する請求項1〜13のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むウイルス様粒子(VLP)。
- それを必要とする被験者におけるインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するための請求項1〜13のいずれか一項に記載の記融合タンパク質を含むウイルス様粒子(VLP)の使用。
- 被験者におけるインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するための医薬品の製造における請求項1〜12のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むウイルス様粒子(VLP)の使用。
- インフルエンザを発症する被験者のリスクを低減させるために使用する請求項1〜13のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むウイルス様粒子(VLP)。
- インフルエンザを発症する被験者のリスクを低減させるための請求項1〜13のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むウイルス様粒子(VLP)の使用。
- インフルエンザを発症する被験者のリスクを低減させるための医薬品の製造における請求項1〜13のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むウイルス様粒子(VLP)の使用。
- インフルエンザウイルスによる感染に対して被験者を免疫するために使用する、請求項1〜13のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むウイルス様粒子(VLP)。
- インフルエンザウイルスによる感染に対して被験者を免疫するための請求項1〜13のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むウイルス様粒子(VLP)の使用。
- インフルエンザウイルスによる感染に対して被験者を免疫するための医薬品の製造における請求項1〜13のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むウイルス様粒子(VLP)の使用。
- 請求項21、24もしくは27のいずれか一項に記載のVLP、または請求項22、23、25、26、28もしくは29のいずれか一項に記載の使用であって、前記VLPが被験者において体液性免疫応答を誘導する、VLP又は使用。
- 請求項14に記載のVLPおよび取扱説明書を含む医薬キット。
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