BRPI0617407B1 - Vírus influenza canino inativado, composição compreendendo o referido vírus inativado e uso da referida composição - Google Patents

Abstract

VÍRUS INFLUENZA CANINO, PROTEÍNAS HA, NM, NP, Ml, NSI, PA, PBI E PB2, ACIDOS NUCLEICOS QUE AS CODIFICAM, COMPOSIÇÕES CONTENDO AS REFERIDAS PROTEÍNAS, OS REFERIDOS VÍRUS OU OS REFERIDOS ÁCIDOS NUCLEICOS, BEM COMO USOS A presente invenção refere-se a um vírus influenza canino isolado do subtipo H3N8 que compreende uma HA que tem SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de aminoácido que é mais do que 99% idêntica a SEQ ID NO: 4, com a condição de que os aminoácidos nas posições 94 e 233 são idênticos a SEQ ID NO: 4; uma composição que compreende um vírus atenuado ou inativado; proteínas HA, NM, NP, Ml, NSI, PA, PB1 e PB2 isola- das ou purificadas e fragmentos das mesmas e composições que compreendem as mesmas ou ácidos nucléicos, opcionalmente como parte de um vetor, que codificam as mesmas; e um método de induzir uma resposta imune ao vírus influenza canino em um animal que compreende administrar ao animal uma composição mencionada acima.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS

[001] Esse pedido de patente reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório U.S. N° 60/727.808, depositado em 18 de outubro de 2005, e do Pedido de Patente de Utilidade U.S. N° 11/539.123, depositado em 5 de outubro de 2006, cujos conteúdos estão incorporados nesse por referência em suas totalidades.

CAMPO TÉCNICO DE INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se aos campos da virologia, bio logia molecular e imunologia. Em particular, a presente invenção refere-se ao vírus influenza canino, assim como a composições relacionadas e métodos de uso na indução de uma resposta imune em animais.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] O vírus influenza é um vírus de RNA que pertence a família Orthomyxoviridae. O RNA viral consiste em oito segmentos independentes, que facilmente se recombinam entre vírus influenza para produzir novos subtipos.

[004] A nucleoproteína (NP), que é o componente primário do nucleocapsídeo, é codificada no quinto segmento. A NP e a proteína de matriz são usadas para classificar o vírus influenza em grupo A, B ou C. Como NP é uma proteína interna, ela não está sujeita a pressão de seleção pelo sistema imune de um hospedeiro. Ela se siga ao RNA, é parte do complexo da transcriptase e está envolvida no transporte nuclear-citoplasmático de RNA viral (vRNA).

[005] A neuraminidase (NM), que rompe a ligação a-ceto que une um ácido siálico terminal ao próximo resíduo de açúcar, assim permitindo a liberação da progênie viral das células infectadas, é codificada pelo sexto segmento. Nove subtipos (N1-N9) dessa enzima foram identificados. Todos os subtipos têm duas regiões estruturais - uma base e uma cabeça. Todas as proteínas N8 têm 470 aminoácidos, dos quais os primeiros oito são altamente conservados. A região seguinte é rica em aminoácidos hidrofóbicos e é considerada o domínio trans- membrana. Os próximos 51 aminoácidos constituem a região de base e a região da cabeça começa em Cys91. A última região contém o sítio catalítico da enzima. Resíduos de cisteína na região da cabeça e na base tendem a ser altamente conservados. Existem 6-8 supostos sítios de N-glicosilação.

[006] Hemaglutinina (HA), que é uma glicoproteína de membrana responsável pela adsorção do vírus na célula hospedeira, é o antígeno principal para o qual os anticorpos neutralizantes são direcionados. Sua variação antigênica é a principal causa de epidemias de influenza. Ela é codificada pelo quarto segmento. Dezesseis subtipos diferentes (H1-H16) foram identificados. HA tem um peptídeo de sinal de 16 aminoácidos e dois polipeptídeos (HA1 e HA2) ligados por pontes de dis- sulfeto. HA1 tem a extremidade amino terminal, enquanto que HA2 tem a extremidade carboxi terminal. Uma região hidrofóbica em HA2 ancora HA à membrana viral. Resíduos de cisteína tendem a ser altamente conservados. Há seis supostos sítios de glicosilação, que possibilitam ao vírus mascarar seus sítios antigênicos (Skehel et al., PNAS USA 81: 1779 (1984)).

[007] Outras proteínas incluem a matriz (M ou M1 e M2), não es trutural (NS ou NS1 e NS2), PA, PB1 e PB2. A proteína M1 é o componente principal do vírion que se liga à membrana plasmática das células infectadas por meio de duas regiões hidrofóbicas na terminação N da proteína, enquanto que M2 é um canal de íon e, portanto, uma proteína de membrana integral. A proteína NS1 é encontrada no núcleo e afeta o transporte, splicing e tradução de RNA celular. A proteí na NS2 é encontrada no núcleo e no citoplasma e tem função desconhecida. A proteína PA é uma transcriptase e pode ter atividade de protease, enquanto que a proteína PB1 funciona no alongamento da transcrição e a proteína PB2 funciona na ligação do cap de transcrição.

[008] Mundialmente, a influenza é a doença respiratória mais sig nificativa economicamente em seres humanos, porcos, cavalos e aves de criação Wright et al., Orthomyxoviruses. In: Fields Virology. Knipe et al., eds. Lippincott Williams & Wilkins, Filadélfia, 2001. pp. 15331579.). O vírus da influenza é conhecido por suas alterações genéticas e antigênicas contínuas, que impedem o controle eficaz do vírus (Wright et al. (2001 ), supra; Webster et al., Microbiol. Rev. 56: 152179 (1992)). De preocupação particular para a prevenção de epidemias e pandemias é a emergência de um novo subtipo do vírus por rear- ranjo genético ou transmissão interespécie (Wright et al. (2001), supra).

[009] Recentemente, surtos de influenza ocorreram em espécies, por exemplo, felina e canina, que historicamente não carregam o vírus da influenza (Keawcharoen et al., Emerg. Infect. Dis. 10: 2189-2191 (2004); Crawford et al., Science 310: 398-485 (October 21, 2005; publicado on-line em 29 de Setembro 2005); Dubovi et al., Isolation of equine influenza virus from racing greyhounds with fatal hemorrhagic pneumonia. In: Proceedings of the 47th Annual Meeting of American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Greensboro, NC, Outubro de 2005. p. 158; e Yoon et al., Emerg. Infect. Dis. 11(12): 1974-1976 (Dezembro de 2005)). Portanto, a variação de hospedeiro do vírus da influenza está se expandindo.

[0010] Surtos de doença respiratória em galgos de corrida causa dos pela infecção com vírus da influenza ocorreram na Flórida em 2004, no leste e oeste de Iowa em abril de 2005 e no Texas em 2005. A doença era caracterizada por início súbito com febre e tosse, respiração rápida e descarga nasal hemorrágica. A morbidade era de quase 100% em ambas as pistas de corrida em Iowa, embora a mortalidade fosse menor do que 5%. Apesar de um grande percentual de cães afetados terem se recuperado, muitos sucumbiram a pneumonia hemorrágica. A administração terapêutica de antibióticos de largo espectro reduziu a severidade da doença, mas não pôde controlá-la.

[0011] Em vista do acima, é um objetivo da presente invenção for necer o vírus da influenza que afeta os caninos. É outro objetivo da presente invenção fornecer materiais e métodos para induzir uma resposta imune ao vírus da influenza em caninos. Esses e outros objetivos e vantagens, assim como aspectos adicionais da invenção, se tornarão claros a partir da descrição detalhada fornecida aqui.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0012] A presente invenção fornece um vírus influenza canino iso lado de subtipo H3N8 que compreende uma HA que tem a SEQ ID NO: 4 ou uma seqüência de aminoácidos que é mais do que 99% idêntica a SEQ ID NO: 4, com a condição de que os aminoácidos nas posições 94 e 233 sejam idênticos a SEQ ID NO: 4. Em particular, a presente invenção fornece um vírus influenza canino isolado do subtipo H3N8 depositado na American Type Culture Collection (Manassas, VA) em 29 de junho de 2006, como Depósito de Patente N° PTA-7694. Conseqüentemente, a presente invenção também fornece uma composição que compreende um vírus atenuado assim como uma composição que compreende um vírus inativado.

[0013] A presente invenção também fornece proteínas isoladas ou purificadas. Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma HA isolada ou purificada, que (i) tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou (ii) é derivada de um vírus influenza e que tem uma seqüência de aminoácidos que é mais do que 99% idêntica a de SEQ ID NO: 4 nas posições de aminoácidos 94 e 233 ou um fragmento de (i) ou (ii), em que o fragmento compreende pelo menos nove aminoácidos contíguos, pelo menos um dos quais é idêntico ao aminoácido na posição 94 ou 233 de SEQ ID NO: 4.

[0014] Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma NM isolada ou purificada, que (i) compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou (ii) é derivada de um vírus influenza e que compreende uma seqüência de aminoácidos que mais do que 99% idêntica a SEQ ID NO: 2, com a condição de que a seqüência de aminoácidos seja idêntica a SEQ ID NO: 2 em aminoácidos nas posições 68 e 134, ou um fragmento de (i) ou (ii), em que o fragmento compreende pelo menos nove aminoácidos contíguos, pelo menos um dos quais é idêntico ao aminoácido na posição 68 ou 134 de SEQ ID NO: 2.

[0015] Ainda em outra modalidade, a presente invenção fornece uma NP isolada ou purificada, que (i) tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou (ii) é derivada de um vírus influenza e que tem uma seqüência de aminoácidos que mais do que 99% idêntica a SEQ ID NO: 6, com a condição de que a seqüência de aminoácidos seja idêntica àquela de SEQ ID NO: 6 na posição do aminoácido 402 ou um fragmento de (i) ou (ii), em que o fragmento compreende pelo menos nove aminoácidos contíguos, pelo menos um dos quais é idêntico ao aminoácido na posição 402 de SEQ ID NO: 6.

[0016] Ainda em outra modalidade, a presente invenção fornece uma M1 isolada ou purificada, que (i) tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou (ii) é derivada de um vírus influenza e que tem uma seqüência de aminoácidos que mais do que 99% idêntica a SEQ ID NO: 8, com a condição de que a seqüência de aminoácidos seja idêntica àquela de SEQ ID NO: 8 na posição do aminoácido 111 ou um fragmento de (i) ou (ii), em que o fragmento compreende pelo menos nove aminoácidos contíguos, pelo menos um dos quais é idêntico ao aminoácido na posição 111 de SEQ ID NO: 8.

[0017] Uma NS1 isolada ou purificada que tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 também é fornecida.

[0018] Também é fornecida uma proteína PA isolada ou purificada, que (i) tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 ou (ii) é derivada de um vírus influenza e que tem uma seqüência de aminoácidos que mais do que 98% (ou 99%) idêntica a SEQ ID NO: 12, com a condição de que a seqüência de aminoácidos seja idêntica àquela de SEQ ID NO: 12 na posição dos aminoácidos 233, 256, 327 e 561 ou um fragmento de (i) ou (ii), em que o fragmento compreende pelo menos nove aminoácidos contíguos, pelo menos um dos quais é idêntico ao aminoácido na posição 233, 256, 327 e 561 de SEQ ID NO: 12.

[0019] Ainda é fornecida uma PB1 isolada ou purificada, que (i) tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 ou (ii) é derivada de um vírus influenza e que tem uma seqüência de aminoácidos que mais do que 99% idêntica a SEQ ID NO: 14, com a condição de que a seqüência de aminoácidos seja idêntica àquela de SEQ ID NO: 14 na posição de aminoácido 200 e 213 ou um fragmento de (i) ou (ii), em que o fragmento compreende pelo menos nove aminoácidos contíguos, pelo menos um dos quais é idêntico ao aminoácido na posição 200 ou 213 de SEQ ID NO: 14.

[0020] Ainda é fornecida uma PB2 isolada ou purificada, que (i) tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 ou (ii) é derivada de um vírus influenza e que tem uma seqüência de aminoácidos que mais do que 99% idêntica a SEQ ID NO: 16, com a condição de que a seqüência de aminoácidos seja idêntica àquela de SEQ ID NO: 16 nas posições dos aminoácidos 107, 221, 292 e 661 ou um fragmento de (i) ou (ii), em que o fragmento compreende pelo menos nove aminoácidos contíguos, pelo menos um dos quais é idêntico aos aminoácidos nas posições 107, 221,292 e 661 de SEQ ID NO: 16.

[0021] Em vista do acima, a presente invenção ainda fornece uma composição que compreende uma proteína acima descrita, tal como HA ou NM ou um fragmento dessas, em uma quantidade suficiente para induzir uma resposta imune em um animal e um veículo biologicamente aceitável.

[0022] Também em vista do acima, a presente invenção fornece um método para induzir uma resposta imune ao vírus influenza canino em um animal. O método compreende administrar ao animal a composição que compreende uma proteína ou um fragmento desta.

[0023] Um ácido nucléico isolado ou purificado que codifica a pro teína acima descrita ou um fragmento desta, opcionalmente como parte de um vetor, também é fornecido, assim como uma composição que compreende o ácido nucléico isolado ou purificado, que expressa a proteína, tal como HA ou NM ou um fragmento destas, em uma quantidade suficiente para induzir uma resposta imune em um animal e um veículo biologicamente aceitável.

[0024] Conseqüentemente, a presente invenção também fornece outro método de induzir uma resposta imune ao vírus influenza canino em um animal. O método compreende administrar ao animal a composição que compreende um ácido nucléico.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0025] A Figura 1 é a seqüência de nucleotídeos parcial (SEQ ID NO: 1; vide também GenBank Ac. N° DQl 46420) da seqüência de domínio codificante (CDS) do gene de NM do subtipo H3N8 de vírus influenza canino. De acordo com a convenção, a seqüência é apresentada da esquerda para direita e de cima para baixo.

[0026] A Figura 2 é a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2; vide também GenBank Ac. N° DQ146420) codificada por SEQ ID NO: 1. De acordo com a convenção, a seqüência é apresentada no formato de uma letra da esquerda para direita e de cima para baixo.

[0027] A Figura 3 é a seqüência de nucleotídeos completa (SEQ ID NO: 3; vide também GenBank Ac. N° DQ l46419) da CDS do gene de HA do subtipo H3N8 de vírus influenza canino.

[0028] A Figura 4 é a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 4; vide também GenBank Ac. N° DQ14619) codificada por SEQ ID NO: 3.

[0029] A Figura 5 é a seqüência de nucleotídeos completa (SEQ ID NO: 5) da CDS do gene de NP do subtipo H3N8 de vírus influenza canino.

[0030] A Figura 6 é a seqüência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO: 6) codificada por SEQ ID NO: 5.

[0031] A Figura 7 é a seqüência de nucleotídeos completa (SEQ ID NO: 7) da CDS do gene da proteína M1 do subtipo H3N8 de vírus influenza canino.

[0032] A Figura 8 é a seqüência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO: 8) codificada por SEQ ID NO: 7.

[0033] A Figura 9 é a seqüência de nucleotídeos completa (SEQ ID NO: 9) da CDS do gene da proteína NS1 do subtipo H3N8 de vírus influenza canino.

[0034] A Figura 10 é a seqüência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO: 10) codificada por SEQ ID NO: 9.

[0035] A Figura 11 é a seqüência de nucleotídeos completa (SEQ ID NO: 11) da CDS do gene da proteína PA do subtipo H3N8 de vírus influenza canino.

[0036] A Figura 12 é a seqüência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO: 12) codificada por SEQ ID NO: 11.

[0037] A Figura 13 é a seqüência de nucleotídeos completa (SEQ ID NO: 13) da CDS do gene da proteína PB1 do subtipo H3N8 de vírus influenza canino.

[0038] A Figura 14 é a seqüência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO: 14) codificada por SEQ ID NO: 13.

[0039] A Figura 15 é a seqüência de nucleotídeos completa (SEQ ID NO: 15) da CDS do gene da proteína PB2 do subtipo H3N8 de vírus influenza canino.

[0040] A Figura 16 é a seqüência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO: 16) codificada por SEQ ID NO: 15.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0041] A presente invenção está relacionada com a descoberta de uma cepa de vírus influenza em caninos. A cepa foi isolada de galgos de corrida no leste e oeste de Iowa. A cepa foi classificada como um subtipo de H3N8 e foi designada A/canino/Iowa/13628/2005. Conseqüentemente, a presente invenção fornece um vírus que compreende uma HA que tem a SEQ ID NO: 4 ou uma seqüência de aminoácidos que é mais do que 99% idêntica a SEQ ID NO: 4, com a condição de que os aminoácidos nas posições 94 e 233 sejam idênticos a SEQ ID NO: 4. O vírus pode compreender ainda uma NM que compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou uma seqüência de aminoácidos que é mais do que 99% idêntica a SEQ ID NO: 2, com a condição de que os aminoácidos nas posições 68 e 134 sejam idênticos a SEQ ID NO: 2. O vírus que compreende a HA mencionada acima, sozinha ou em combinação com a NM mencionada acima, pode compreender ainda pelo menos um dos seguintes: uma NP que tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou uma seqüência de aminoácidos que é mais do que 99% idêntica a SEQ ID NO: 6, com a condição de que o aminoácido 402 seja idêntico àquele de SEQ ID NO: 6; uma M1 que tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou uma seqüência de aminoácidos que é mais do que 99% idêntica a SEQ ID NO: 8, com a condição de que o aminoácido 111 seja idêntico àquele de SEQ ID NO: 8; uma NS1 que tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; uma proteína PA que tem a seqüência de ami-noácidos de SEQ ID NO: 12 ou uma seqüência de aminoácidos que é mais do que 98% (ou 99%) idêntica a SEQ ID NO: 12, com a condição de que os aminoácidos 233, 256, 327 e 561 sejam idênticos àqueles de SEQ ID NO: 12; uma PB1 que tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 ou uma seqüência de aminoácidos que é mais do que 99% idêntica a SEQ ID NO: 14, com a condição de que os aminoácidos 200 e 213 sejam idênticos àqueles de SEQ ID NO: 14; e/ou uma PB2 que tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 ou uma seqüência de aminoácidos que é mais do que 99% idêntica a SEQ ID NO: 16, com a condição de que os aminoácidos 107, 221, 292 e 661 sejam idênticos aos da SEQ ID NO: 16. Em particular, a presente invenção fornece um vírus influenza canino isolado de subtipo H3N8 depositado na American Type Culture Collection 10801 University Blvd., Manassas, VA 21110-2209, EUA em 29 de junho de 2006, como Depósito de Patente N° PTA-7694.

[0042] O vírus influenza pode ser precipitado por submeter o vírus em meio aquoso a uma ou mais etapas de insolubilização induzidas pela presença de até 5% em peso de polietileno glicol (PEG) que tem um peso molecular entre 3000 e 20.000 ou outro polímero filamentar linear não carregado em uma quantidade equivalente ao poder de so- lubilização de PEG, separar uma fração insolubilizada de uma fração não insolubilizada e recuperar o vírus de uma das frações (vide, por exemplo, Patente U.S. N° 3.989.818). Preferivelmente, a temperatura não excede 35°C, o pH está entre 6 e 9 e a força iônica do meio aquoso está abaixo do ponto de dessalificação para o vírus. A concentração do vírus no meio aquoso antes da insolubilização corresponde a um título de hemaglutinação de pelo menos 1 em 32. Partículas virais agregadas são obtidas, que se acredita que forneçam um melhor efeito antigênico devido a liberação lenta das partículas virais após vacinação. Se, entretanto, partículas não agregadas ou menos agregadas forem desejadas, elas podem ser dissociadas usando qualquer méto- do adequado, tal como a sonicação.

[0043] O vírus pode ser atenuado pela passagem em um sistema celular até que o vírus tenha perdido sua habilidade de produzir doença, enquanto retém totalmente seu caráter imunogênico. Por exemplo, o vírus pode ser passado serialmente em uma cultura de células que se origina de uma espécie canina ou outra espécie adequada em uma temperatura de cerca de 37°C. A cada passagem, o vírus é coletado de uma cultura e inoculado em um meio contendo nova cultura celular de acordo com os métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o vírus pode ser coletado de fluidos de cultura celular de tecido e/ou células. Opcionalmente, durante a coleta a cultura celular pode ser sonica- da para promover a liberação do vírus. Vide, por exemplo, Patente U.S. Nos. 5.698.433 e 6.455.298.

[0044] Se desejado, uma cepa de influenza pode ser passada pelo menos uma vez na cavidade alantóide de ovos embrionados, tais como ovos de galinha, na presença de soro, para se obter vírus resistentes a soro (vide, por exemplo, Patente U.S. N° 3.953.592; Kilbourne et al., J.Exp. Med. 111: 387 (1960); Kilbourne, Science 160: 74-75 (abril de 1968); e Laver et al., Virology 30: 493-501 (1966)). Vacina de influenza de alta potência com baixa pirogenicidade e baixa endotoxicida- de pode ser obtida pelo tratamento do fluido alantóide concentrado que contem o vírus atenuado seqüencialmente com acetato de butila e acetato de etila, seguido por evaporação rápida (vide, por exemplo, Patente U.S. N° 4.000.257). Tal vírus pode ser administrado intrana- salmente como uma vacina.

[0045] Uma vez inoculado no hospedeiro, o vírus se multiplica em alguma proporção tal que apenas um pequeno inóculo inicial seja necessário. O vírus deve ser inócuo e a infecção de contatos suscetíveis deve ser mantida em um mínimo.

[0046] Alternativamente, o vírus pode ser inativado pela abolição da replicação e virulência. Isso pode ser feito por meios químicos ou físicos. A inativação química pode ser realizada pelo tratamento do vírus com uma enzima, formaldeído, β-propiolactona ou derivados desta, etilenoimina ou derivado desta, um solvente orgânico (por exemplo, hidrocarboneto halogenado) e/ou um detergente (por exemplo, Tween®, Triton X®, desoxicolato de sódio, sulfobetaína ou sais de ce- tiltrimetilamônio). Se necessário, composições ativadas quimicamente podem ser neutralizadas. Por exemplo, se formaldeído é usado para desativar a composição, a composição pode ser neutralizada com tio- sulfato. Se necessário, o pH pode subseqüentemente ser retornado para um valor de cerca de 7. Alternativamente, o vírus pode ser extraído com uma mistura de éter e etanol, as fases aquosa e orgânica podem ser separadas e o éter residual pode ser removido da suspensão viral sob pressão reduzida (vide, por exemplo, Patente U.S. N° 4.431.633). A inativação física pode ser realizada vantajosamente por submeter o vírus a radiação rica em energia, tal como luz ultra-violeta, radiação y ou raios X. As formas inativadas requerem uma quantidade relativamente alta de inóculo e, portanto uma quantidade correspon-dentemente grande de material antigênico, que tem que ser produzido, testado e distribuído.

[0047] Tendo em vista o exposto acima, a presente invenção tam bém fornece uma composição que compreende um vírus atenuado ou inativado. O vírus deve estar presente em uma quantidade suficiente para induzir uma resposta imune e, desejavelmente, deve fornecer proteção mediante desafio. Geralmente, um adjuvante, tal como Tween®, Span®, adjuvante completo de Freund, saponina, Coryne- bacterium parvum (Coparvax®), fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio ou uma mistura desses, é adicionado à composição, particularmente se a composição compreender vírus inativados. Hidrolisados de proteínas e/ou aminoácidos podem ser adicionados para estabilizar a composição (vide, por exemplo, Patente U.S. N° 4.537.769). Alternativamente, a composição pode ser formulada como uma emulsão óleo- em-água usando óleos tais como Marcol e/ou Arlacel.

[0048] Cepas recombinantes de influenza também podem ser pre paradas, tal como a combinação de uma cepa parental de influenza A, por exemplo A2, "superatenuada" (isto é, o número de passagens para atenuação é substancialmente maior do que é normalmente requerido para remover a patogenicidade), com uma cepa de influenza virulento como fornecida aqui (vide, por exemplo, Patente U.S. N° 3.991.179; vide, também, Patente U.S. N° 4.009.258; 4.278.662; 4.318.903; 4.338.296; e 4.693.893). Uma cepa recombinante preferivelmente tem as características de crescimento de uma cepa superatenuada acoplada com propriedades antigênicas, por exemplo, as proteínas HA e NM, da cepa virulenta. A seleção de cepas de vírus influenza para formulação de vacina é descrita na Patente U.S. N° 5.162.112. Cepas recombinantes podem ser formuladas como composições para induzir uma resposta imune.

[0049] Sacarose, monocloreto de arginina, o monoidrato monos- sódico de ácido glutâmico e hidrolisado de gelatina podem ser usados para estabilizar uma composição de vírus influenza para armazenamento em um refrigerador. Vide, por exemplo, Pedido de Patente Publicado U.S. N° 2006/0110406.

[0050] Tendo em vista o exposto acima, a presente invenção tam bém fornece uma HA isolada ou purificada. A HA tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 ou é derivada de um vírus influenza e tem uma seqüência de aminoácidos que é mais do que 99% idêntica a SEQ ID NO: 4, com a condição de que a seqüência de aminoácidos seja idêntica àquela da SEQ ID NO: 4 nas posições dos aminoácidos 94 e 233. Um fragmento de HA que compreende pelo menos nove aminoácidos contíguos (tais como 9, 12, 15, 18, 21 ou 24), pelo menos um dos quais é idêntico ao aminoácido na posição 94 ou 233 de SEQ ID NO: 4, também é fornecido.

[0051] Uma NM isolada ou purificada também é fornecida. A NM compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 ou é derivada de um vírus influenza e tem uma seqüência de aminoácidos que é mais do que 99% idêntica a SEQ ID NO: 2, com a condição de que a seqüência de aminoácidos seja idêntica àquela de SEQ ID NO: 2 nas posições dos aminoácidos 68 e 134. Um fragmento de NM que compreende pelo menos nove aminoácidos contíguos, pelo menos um dos quais é idêntico ao aminoácido na posição 68 ou 134 de SEQ ID NO: 2, também é fornecido.

[0052] Ainda é fornecida uma NP isolada ou purificada. A NP tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 ou é derivada de um vírus influenza e tem uma seqüência de aminoácidos que é mais do que 99% idêntica a SEQ ID NO: 6, com a condição de que a seqüência de aminoácidos seja idêntica àquela da SEQ ID NO: 6 na posição do aminoácido 402. Um fragmento de NP que compreende pelo menos nove aminoácidos contíguos, pelo menos um dos quais é idêntico ao aminoácido na posição 402 de SEQ ID NO: 6, também é fornecido.

[0053] Ainda é fornecida uma M1 isolada ou purificada. A M1 tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 ou é derivada de um vírus influenza e tem uma seqüência de aminoácidos que é mais do que 99% idêntica a SEQ ID NO: 8, com a condição de que a seqüência de aminoácidos seja idêntica àquela da SEQ ID NO: 8 na posição de aminoácido 111. Um fragmento de M1 que compreende pelo menos nove aminoácidos contíguos, pelo menos um dos quais é idêntico ao aminoácido na posição 111 de SEQ ID NO: 8, também é fornecido.

[0054] Ainda é fornecida uma NS1 isolada ou purificada, que tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 10.

[0055] Uma PA isolada ou purificada também é fornecida. A PA tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 12 ou é derivada de um vírus influenza e tem uma seqüência de aminoácidos que é mais do que 98% (ou 99%) idêntica a SEQ ID NO: 12, com a condição de que a seqüência de aminoácidos seja idêntica àquela da SEQ ID NO: 12 nas posições dos aminoácidos 233, 256, 327 e 561. Um fragmento de PA que compreende pelo menos nove aminoácidos contíguos, pelo menos um dos quais é idêntico ao aminoácido na posição 233, 256, 327 ou 561 de SEQ ID NO: 12, também é fornecido.

[0056] Uma PB1 isolada ou purificada também é fornecida. A PB1 tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 ou é derivada de um vírus influenza e tem uma seqüência de aminoácidos que é mais do que 99% idêntica a SEQ ID NO: 14, com a condição de que a seqüência de aminoácidos seja idêntica àquela da SEQ ID NO: 14 nas posições dos aminoácidos 200 e 213. Um fragmento de PB1 que compreende pelo menos nove aminoácidos contíguos, pelo menos um dos quais é idêntico ao aminoácido na posição 200 ou 213 de SEQ ID NO: 14, também é fornecido.

[0057] Uma PB2 isolada ou purificada também é fornecida. A PB2 tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 16 ou é derivada de um vírus da influenza e tem uma seqüência de aminoácidos que é mais do que 99% idêntica a SEQ ID NO: 16, com a condição de que a seqüência de aminoácidos seja idêntica àquela da SEQ ID NO: 16 nas posições de aminoácido 107, 221, 292, e 661. Um fragmento de PB2 que compreende pelo menos nove aminoácidos contíguos, pelo menos um dos quais é idêntico ao aminoácido na posição 107, 221, 292, ou 661 de SEQ ID NO: 16, também é fornecido.

[0058] As proteínas acima e os fragmentos dessas podem ser pu rificadas (acopladas com fragmentação química ou física para gerar fragmentos) ou sintetizadas de acordo com métodos conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Meienhofer, Hormonal Proteins and Pepti des 2: 46, Academic Press, NY (1973), para síntese de proteína em fase sólida, e Schroder et al., The Peptides, vol. 1, Academic Press, NY (1965), para síntese de proteína em fase de solução. Sistemas automatizados podem ser usados para realizar tais técnicas de acordo com as instruções do fabricante. Quantidades terapêuticas podem ser produzidas e purificadas recombinantemente.

[0059] Alternativamente, proteínas, em particular HA e NM, podem ser isoladas por solubilização seletiva, embora deixando partículas subvirais residuais que consistem na membrana de lipídio/proteína intacta que encerra todos os outros componentes virais não essenciais. A diferença em tamanho/densidade das proteínas solubilizadas e das partículas subvirais residuais permite a separação com base nas diferenças em propriedades físicas por gradiente de centrifugação e fracionamento, sedimentação, cromatografia de peneira molecular ou pele- tização em uma ultracentrífuga. A solubilização seletiva de HA e NM pode ser obtida pelo tratamento do vírus com um detergente catiônico (vide, por exemplo, a Patente U.S. N° 4.140.762; a patente '762). O fluido contendo o vírus inteiro obtido da cultura celular pode ser tratado com uma enzima de digestão de DNA seguido pela adição de um detergente catiônico e isolamento de proteínas de antígeno de superfície (vide, por exemplo, a Patente U.S. N° 5.948.410). O fluido pode ser submetido a várias etapas de ultracentrifugação ou o vírus pode ser fragmentado na presença de um detergente anfifílico não iônico seguido por filtração para remover substâncias indesejáveis (vide, por exemplo, a Patente U.S. N° 6.048.537). Alternativamente, filtração em membrana e separação química podem ser usadas para se obter uma proteína viral (vide, por exemplo, a Patente U.S. N° 4.327.182). Outros procedimentos estão descritos nas Patente U.S. Nos. 4.064.232 e 4.057.626. Preferivelmente, o vírus é multiplicado antes do tratamento como exemplificado na patente '762 (col. 2, 11. 10 et seq).

[0060] O mapeamento pode ser conduzido para identificar um epi- topo indutor de resposta imune de uma proteína viral, isto é "mapeamento de epitopo". Tal mapeamento envolve a fragmentação de uma proteína em peptídeos superpostos (tal como peptídeos que compreendem 9, 12, 15, 18, 21 ou 24 aminoácidos). A proteína pode ser fragmentada com uma enzima proteolítica. Os peptídeos individuais são então testados quanto a sua habilidade de se ligar a um anticorpo criado pela proteína nativa ou de induzir ativação de célula T ou célula B. Alternativamente, regiões hidrofílicas da proteína podem ser selecionadas, já que resíduos hidrofílicos estão freqüentemente sobre a superfície da proteína e, portanto, são acessíveis ao anticorpo. A análise cristalográfica por raio X do complexo antígeno-anticorpo também pode ser realizada. Motivos potenciais de ligação de âncora de HLA, que são seqüências de peptídeos que são conhecidas por estarem aptas a se ligar a moléculas de MHC, podem ser identificados a partir da seqüência de aminoácidos de uma proteína. Preferivelmente, o epitopo selecionado é um que partilha pouca ou nenhuma identidade de seqüência com seqüências amplamente encontradas no animal ao qual uma composição que compreende ou expressa um fragmento de proteína será administrada.

[0061] Um ácido nucléico isolado ou purificado que codifica uma proteína acima descrita ou fragmento dessa, opcionalmente como parte de um vetor, também é fornecido. O ácido nucléico que codifica a HA pode compreender a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 ou um fragmento dessa que codifica pelo menos nove (9, 12, 15, 18, 21 ou 24) aminoácidos contíguos. Se desejado, uma vacina trivalente baseada em HA pode ser preparada, em que uma das HAs compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (vide, por exemplo, Patente U.S. Nos. 5.762.939 e 6.245.532; vide, por exemplo, a Patente U.S. N° 6.740.325 para uma vacina tetravalente). O ácido nu- cléico que codifica NM pode ter a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou um fragmento dessa que codifica pelo menos nove aminoácidos contíguos (vide, por exemplo, Patente U.S. N° 6.605.457 e Ped. Patente Pub. U.S. N° 2003/0129197), enquanto que o ácido nu- cléico que codifica NP pode ter a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO:5 ou um fragmento dessa que codifica pelo menos nove aminoácidos contíguos, o ácido nucléico que codifica a proteína M1 pode ter a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO:7 ou um fragmento dessa que codifica pelo menos nove aminoácidos contíguos, o ácido nucléico que codifica a proteína NS1 pode ter a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 9, o ácido nucléico que codifica PA pode ter a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 11 ou um fragmento dessa que codifica pelo menos nove aminoácidos contíguos, o ácido nucléico que codifica PB1 pode ter a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO:13 ou um fragmento dessa que codifica pelo menos nove aminoácidos contíguos e o ácido nucléico que codifica PB2 pode ter a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 15 ou um fragmento dessa que codifica pelo menos nove aminoácidos contíguos. Uma pessoa versada na técnica perceberá, entretanto, que devido a degeneração do código genético, há várias outras seqüências de nucleotídeos que podem codificar tais seqüências de aminoácidos.

[0062] Os ácidos nucléicos acima, que podem ser DNA ou RNA e fragmentos desses podem ser sintetizados (vide, por exemplo, Oligonucleotide Synthesis, Gait, ed., 1984). Tais moléculas podem incluir nucleotídeos/bases que não ocorrem naturalmente que codificam a seqüência de aminoácidos desejada. Por exemplo, a base ou açúcar podem ser metilados. Além disso, a estrutura principal da molécula de ácido nucléico pode ser modificado, por exemplo, uma estrutura principal de fosforotioato, metilfosfonato, metilfosforotioato, fosforoditioato e combinações desses.

[0063] Alternativamente, vRNA isolado pode ser submetido a transcriptase reversa para produzir um híbrido de RNA/DNA, a partir do qual o RNA é digerido e o DNA residual é tratado para produzir um dsDNA que tem uma terminação em alça, que é tratado com uma nuclease fita-simples-específica para produzir uma cópia bimolecular de dupla fita do vRNA (vide, por exemplo, Patente U.S. N° 4.357.421). Vide, por exemplo, Ped. Patente Pub. U.S. N° 2006/0166321 para o uso de cassetes de transcrição em tandem para a preparação de influenza na ausência de vírus auxiliar.

[0064] O ácido nucléico é, opcionalmente, parte de um vetor de DNA que compreende pelo menos um promotor, em cujo caso cada seqüência de nucleotídeos está operativamente ligada a um promotor, que pode ser o mesmo ou diferente. Além dos promotores, outras se- qüências de controle, tais como sinais de terminação e semelhantes, podem ser parte do vetor de DNA.

[0065] Por exemplo, o ácido nucléico pode ser introduzido em um vetor de expressão recombinante adequado, tais como aqueles adaptados para bactérias, tais como E. coli e Salmonella typhi, levedura, tais como Saccharomyces cervisiae ou Pichia pastoris ou fungos filamentosos tal como Aspergillus nidulans. As bactérias, leveduras e fungos podem ser cultivados em cultura contínua. O polipeptídeo que é produzido durante a cultura pode então ser isolado e purificado. Alternativamente, a molécula de ácido nucléico pode ser introduzida em Poxviridae (por exemplo, vetores baseados em vírus da bouba aviária), Herpesviridae (por exemplo, vetores baseados em vírus da pseu- do-raiva, vetores baseados no vírus do herpes de peru, vetores base-ados no vírus do herpes de felinos, vetores baseados no vírus da la- ringotraqueíte infecciosa, vetores baseados no vírus do herpes de bovino), Adenoviridae (por exemplo, adenovírus bovino (por exemplo, sorotipo 3), adenovírus humano (por exemplo, sorotipo 4 ou 7) e ade- novírus canino (por exemplo, sorotipo 2; CAV2; vide, por exemplo, Patente U.S. N° 6.090.393) ou um vetor de expressão de vírus de inseto, tal como baculovírus recombinante (por exemplo, vírus da poliidrose nuclear de Autographa californica (AcNPV)), que, por sua vez, pode ser usado para infectar células SF9 cultivadas suscetíveis, que são derivadas do inseto Spodotera frugiperda. Outros vetores virais incluem vírus da vacínia (vide, por exemplo, Patente U.S. N° 4.722.848), adenovírus, vírus adeno-semelhante, vírus adeno-associado, retroví- rus e pox (vide, por exemplo, Hruby, Vet. Parasitol. 29: 281-282 (1988); Uiu, "AIDS Research Reviews," Dekker, Inc., 1991, 1: 403416), que podem ser administrados por uma abrasão da pele ou por injeção, opcionalmente como uma formulação lipossomal. Outros vetores incluem o Bacilo de Calmette-Guerin (BCG, Stover et al., Nature 351: 456-460 (1991)), vetores da toxina do antraz detoxificada e similares. Células de mamíferos, tais como células de ovário de hamster chinês (CHO) e até mesmo células de plantas podem ser usadas para expressar o polipeptídeo a partir do construto apropriado. O versado na técnica observará que a escolha da célula hospedeira afetará a natureza do processamento pós-traducional (por exemplo, glicosilação, enovelamento e similares), que, por sua vez, pode causar impacto na imunogenicidade do polipeptídeo e técnicas de purificação subseqüen- tes.

[0066] A expressão pode ser obtida em qualquer célula hospedeira apropriada transformada/transfectada com o vetor de expressão. Exemplos de células hospedeiras adequadas incluem, mas não são limitadas àquelas descritas acima. Assim, a presente invenção também fornece uma célula hospedeira transformada/transfectada com um vetor de expressão.

[0067] Sobrenadantes de sistemas hospedeiro/vetor que secretam a proteína ou fragmento dessa no meio de cultura podem ser aplica dos a uma matriz de purificação tal como uma coluna de afinidade ou uma coluna de troca de íon. Uma ou mais etapas de HPLC de fase reversa podem ser empregadas para purificar mais a proteína recom- binante ou fragmento dessa.

[0068] A produção de uma proteína ou fragmento dessa como uma proteína de fusão pode estabilizar a produção. Isso pode ser obtido pela ligação de seqüências de polinucleotídeos que codificam duas ou mais proteínas (ou fragmentos dessas) em um vetor de expressão apropriado com ou sem um ligante peptídico. Desejavelmente, as fases de leitura das seqüências de polinucleotídeos estão em fase, tal que uma única proteína de fusão que retém a atividade biológica de cada proteína (ou fragmento dessa) é produzida. Um ligante peptídico de 1 a cerca de 50 aminoácidos pode ser usado para separar as proteínas resultantes (ou fragmentos dessas) a fim de garantir que cada proteína (ou fragmento dessa) se envolve apropriadamente em suas estruturas secundária, terciária ou quaternária (vide, por exemplo, Ma- ratea et al, Gene 49: 39-46 (1985); Murphy et al., PNAS USA 83: 82588262 (1986); Patente U.S. N° 4.935.233; e Patente U.S. N° 4.751.180). A habilidade de adotar uma conformação estendida flexível, a incapacidade de adotar uma estrutura secundária que poderia interagir com aminoácidos funcionais em uma ou as proteínas e a ausência de resíduos hidrofóbicos ou carregados que poderiam reagir com uma ou as proteínas são fatores que são levados em consideração na seleção de um ligante peptídico. Ligantes não são necessários quando as terminações das proteínas a serem unidas não contêm regiões essenciais, tal que as terminações podem ser usadas para separar domínios funcionais e evitar interferência estérica. Seqüências ligantes de peptídeo preferidas contêm resíduos de Gli, Asn e Ser. Outros resíduos neutros próximos, tais como Thr e Ala, também podem ser usados.

[0069] Outra(s) seqüência(s) de aminoácidos adicional(ais) podem ser selecionadas para aumentar a expressão e/ou imunogenicidade da proteína ou fragmento dessa. Por exemplo, a proteína ou fragmento dessa pode ser fundida a cadeia pesada de imunoglobulina G (IgG) ou uma proteína de ligação a uma célula apresentadora de antígeno (APC) ou uma proteína de ligação a uma célula dendrítica, tal como ILD, GM-CSF, IL-I , TNF, IL-4, CD40L, CTLA4, CD28, ou ligante FLT-3. Técnicas, tais como o uso de agentes desidratantes, por exemplo, di- cicloexilcarbodiimida (DCCI) ou a criação de ligações entre grupos sul- fidrila, grupos épsilon amino, grupos carboxila e similares, podem ser usados. Se desejado, um sítio de clivagem pode ser introduzido na proteína de fusão para permitir a separação da proteína (ou fragmento dessa) da(s) seqüência(s) que não ocorre(m) naturalmente. Exemplos de sítios de clivagem incluem uma seqüência alvo para uma enzima proteolítica ou, se a metionina não estiver presente na proteína (ou fragmento dessa), metionina que por sua vez é clivada pelo brometo de cianogênio. Tais métodos são conhecidos na técnica. A proteína ou fragmento dessa pode ser modificada por glicosilação ou outra deriva- tização (por exemplo, acetilação ou carboxilação), também de acordo com métodos conhecidos na técnica.

[0070] A proteína (ou fragmento dessa) pode ser expressa in situ a partir de um sistema de expressão adequado. Qualquer construto de DNA, que é eficaz na produção da proteína codificada ou fragmento dessa no ambiente desejado, pode ser usado para expressar a proteína ou fragmento dessa como descrito acima.

[0071] Alternativamente, a molécula de ácido nucléico pode se comportar como um sistema de expressão eficaz in situ quando injetada em um animal como "DNA nu" (vide, por exemplo, Ulmer et al., Science 259: 1745-1749 (1993); e Cohen, Science 259: 1691-1692 (1993)). A liberação de DNA pode ser facilitada também através do uso de bupivacaína, polímeros e peptídeos; alternativamente, comple xos catiônicos lipídicos, partículas ou pressão (vide, por exemplo, Patente U.S. No.5.922.687) podem ser usados.

[0072] Exemplos de seqüências de aminoácidos que são pelo me nos cerca de ou mais do que 95% idênticas, tal como cerca de 96%, 97%, 98%, ou 99% idênticas a SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, ou 16 incluem seqüências de aminoácidos que contêm uma ou mais substituições, inserções, adições e/ou deleções. A identidade de seqüência pode ser determinada pelo alinhamento de seqüências de polipeptídeo e aplicação de algoritmos computadorizados disponíveis publicamente, tal como BLASTP (Pearson et al., PNAS USA 85: 2444-2448 (1988); Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); e Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). O programa BLASTP está disponível no servidor FTP do National Center for Biotechnology Information (NCBI) ou NCBI, National Library of Medicine, Edifício 38A, Sala 8N8O5, Bethesda, MD 20894. Uma vez que as seqüências de polipep- tídeos estejam alinhadas, o número de aminoácidos idênticos sobre as porções alinhadas é identificado, o número de aminoácidos idênticos é dividido pelo número total de aminoácidos do polipeptídeo de interesse e o resultado é multiplicado por 100 para determinar o percentual de identidade de seqüência.

[0073] Com relação a isso, uma pessoa versada na técnica obser vará que um fragmento de uma dada seqüência de aminoácidos pode ser pelo menos cerca de ou mais do que 95% idêntica, tal como 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à seqüência de aminoácidos. Assim, fragmentos são pretendidos por ser abrangidos por "uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos cerca de ou mais do que 95% (ou 96%, 97%, 98% ou 99%) idêntica a SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, ou 16." Tais fragmentos retêm desejavelmente a imunogenicidade da proteína de extensão completa. Fragmentos funcionais podem ser gerados por análise mutacional do ácido nucléico que codifica a proteína e subseqüente expressão da proteína mutante resultante ou por digestão química/enzimática da proteína em si.

[0074] Modificações, tais como substituições, inserções, adições e/ou deleções, podem ser introduzidas no ácido nucléico ou na proteína (ou fragmento dessa) de acordo com métodos conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Adelman et al., DNA 2: 183 (1983), para muta- gênese sítio-específica direcionada por oligonucleotídeo). Desejavelmente, a modificação não diminui substancialmente a imunogenicida- de do fragmento de proteína;ao invés disso, é preferido que a imuno- genicidade permaneça substancialmente à mesma ou aumente em relação a proteína não modificada.

[0075] Uma "substituição conservativa" é uma na qual um aminoá cido é substituído por outro aminoácido que tem propriedades similares, isto é, estrutura secundária similar e natureza hidropática. Substituições de aminoácidos podem ser feitas com base na similaridade em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou natureza anfipática dos resíduos. Por exemplo, aminoácidos carregados negativamente, tais como ácido aspártico e ácido glutâmico, podem ser trocados, enquanto que aminoácidos carregados positivamente, tais como lisina e arginina, podem ser trocados e aminoácidos com grupos de cabeça polar não-carregados que tem valores de hidrofilicidade similares podem ser trocados. Com relação a isso, leucina, iso- leucina e valina podem ser trocados, glicina e alanina podem ser trocados, asparaginase e glutamina podem ser trocados e serina, treoni- na, fenilalanina e tirosina podem ser trocados. Outros grupos de aminoácidos que podem ser trocados incluem: (1) ala, pro, gli, glu, asp, gln, asn, ser e thr; (2) cys, ser, tir e thr; (3) val, ile, leu, met, ala e phe; (4) lis, arg e his; e (5) phe, tir, trp, e his.

[0076] Tendo em vista o exposto acima, uma composição que compreende a proteína/ácido nucléico isolado ou purificado ou frag- mento de qualquer um dos anteriores e um veículo biologicamente aceitável também é fornecida. O ácido nucléico ou fragmento desse pode ser parte de um vetor. Vide, por exemplo, Patente U.S. N° 4.029.763, que está direcionada para uma vacina de influenza que compreende, como um ingrediente ativo, NM e Patente U.S. N° 4.140.762 que está direcionada para uma vacina de influenza que compreende como ingredientes ativos, HA e NM. A Patente U.S. N° 4.826.687 descreve a adição do dipeptídeo muramil a uma vacina que compreende HA e NM. Se desejado, polipeptídeos que correspondem substancialmente aos aminoácidos 148-162, 163-166, e/ou 215-239 de M1 podem ser adicionados a uma composição de um polinucleotí- deo/ácido nucléico ou fragmento desse (vide, por exemplo, Patente U.S. Nos. 5.136.019; 5.616.327; e 5.741.493). Qualquer veículo biologicamente aceitável adequado pode ser usado na composição. Por exemplo, a(s) proteína(s)/ácido(s) nucléico(s)/fragmento(s) desse(s) podem ser ressuspensos em um diluente, por exemplo, solução de cloreto de sódio 0,9%, que é opcionalmente tamponada com, por exemplo, tampão fosfato. Qualquer sacarose que permaneça da purificação do vírus pode ser reduzida por diálise. Diálise em cromatografia em gel pode ser usada para remover qualquer detergente catiônico remanescente. Preferivelmente, a proteína ou fragmento dessa está presente em uma quantidade suficiente para induzir uma resposta imune (isto é, celular ou humoral) em um animal. Um veículo freqüen- temente selecionado para fármacos e antígenos é poli(d,l-lactídeo-co- glicolídeo) (PLGA). PLGA é um poliéster biodegradável e pode ser usado para a liberação controlada de antígeno (Eldridge et al., Curr. Topics Micro. Immuno. 146: 59-66 (1989); vide também Patente U.S. No 6.090.393). A captura de antígenos em microesferas de PLGA de 1-10 μ de diâmetro tem mostrado ter um efeito adjuvante notável quando administradas oralmente.

[0077] Se desejado, um agente conservante ou um agente inati- vante, tal como formaldeído, pode ser adicionado. Uma quantidade convencional de agente conservante/inativante é de 1 parte por 10.000 partes.

[0078] Se desejado, uma ou mais proteínas (ou fragmentos imu- nogênicos dessas), tal como HA descrita acima, podem ser combinadas com proteossomos. Vide, por exemplo, Patente U.S. No 6.743.900 e Ped. Patente Pub. U.S. N° 2004/0156867.

[0079] A imunogenicidade pode ser melhorada pela inclusão de adjuvantes imunológicos convencionais, tais como hidróxido de alumínio (por exemplo, cerca de 0,2%) ou fosfato de alumínio, alumínio (vide, por exemplo, Patente U.S. Nos. 6.372.223. 6.635.246. 6.861.244 e 7.052.701 e Ped. Patente Pub. U.S. Nos. 2004/0096464 e 2006/0147468), quitosana (vide, por exemplo, Patente U.S. Nos. 6.136.606 e 6.534.065), alume, tal como na forma de hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio e óxido de alumínio, óleos minerais (por exemplo, Bayol F® e Marcol 52®), adjuvante completo de Freund, ad-juvante incompleto de Freund, dipeptídeo de muramil, monofosforil lipídio A, e saponinas incluindo o componente Quil A. A imunogenicidade também pode ser melhorada pela adição de uma citocina, tal como uma interleucina ou pela conjugação de proteínas ou fragmentos dessas. Preferivelmente, a proteína ou fragmento dessa é conjugada com um veículo macromolecular, tal como uma proteína (por exemplo, albumina sérica, hemocianina do molusco keyhole limpet (KLH), imuno- globulina, tiroglobulina e albumina do ovo), polissacarídeo (por exemplo, sefarose funcionalizada em látex, agarose, esferas de celulose e similares), fosfolipídio, aminoácidos poliméricos (por exemplo, ácido poliglutâmico, polilisina e similares) ou co-polímeros de aminoácidos (vide, por exemplo, Patente U.S. Nos. 5.136.019 e 5.612.037). Alternativamente, a proteína ou fragmento dessa pode ser encapsulada com um proteolipossoma ou vesícula lipídica.

[0080] A composição, que pode induzir uma resposta imune, pode ser preparada na forma de uma suspensão ou pode ser liofilizada. Se liofilizada, é preferível adicionar um ou mais estabilizadores. Estabilizadores adequados são, por exemplo, sacarose, fosfato, glutamato e albumina (SPGA; Bovarnick, J. Bacteriol. 59: 509 (1950)), carboidratos (por exemplo, sorbitol, manitol, amido, dextran e glicose), proteínas (por exemplo, albumina e caseína) ou produtos de degradação desses, agentes que contêm proteínas (por exemplo, soro bovino ou leite desnatado) e tampões (por exemplo, fosfatos de metal alcalino).

[0081] Alternativamente, a composição pode ser formulada como uma composição de liberação controlada. O vírus atenuado/inativado ou vetor recombinante pode ser microencapsulado com polímeros, tais como policarbonatos, poliésteres, poliuretanos, poliortoesteres e poli- amidas. O polímero particular selecionado depende de vários fatores incluindo a reprodutibilidade da síntese do polímero e microencapsula- ção, custo de materiais e processo, perfil toxicológico, necessidades de cinética de liberação variável e compatibilidade físico-química do polímero e do vírus/vetor.

[0082] As composições descritas aqui podem ser usadas sozinhas ou em combinação com outros ingredientes/composições ativas. Exemplos incluem composições, que podem induzir uma resposta imune contra cinomose canina, hepatite canina infecciosa (CAV-1 e CAV-2), raiva, parainfluenza, coronavírus canino, sarampo, leptospiro- se e Bordetella. Foi descrito que polifenóis inibem a infecção por influenza em seres humanos (vide, por exemplo, Patente U.S. N° 5.173.922; a patente '922). Conseqüentemente, a adição de um polife- nol, tal como galato de epigalocatequina, galato de epicatequina, epi- galocatequina, epicatequina, teaflavina livre, monogalato de teaflavina A, monogalato de teaflavina B e/ou digalato de teaflavina podem ser benéficos (vide a patente '922). Inibidores de NM são descritos na Patente U.S. N° 5.453.533. O uso de citocinas como imunopotencializa- dores e a encapsulação lipossomal são descritos na Patente U.S. N° 5.919.480.

[0083] A quantidade de ácido nucléico na composição pode variar amplamente. Por exemplo, a concentração pode variar de menos do que cerca de 0,1% até cerca de 20-50% ou mais em peso, geralmente pelo menos cerca de 2%. A concentração de proteína na composição também pode variar amplamente. Por exemplo, a concentração pode variar entre menos do que cerca de 0,1% até cerca de 20-50% ou mais em peso, geralmente pelo menos cerca de 2%. O volume e a viscosidade do fluido são levados em consideração quando se determinar a concentração final.

[0084] Conseqüentemente, um método de induzir uma resposta imune ao vírus influenza canino também é fornecido. A suscetibilidade de um animal à infecção pode ser avaliada usando o teste de neutralização por redução em placas (Patente U.S. N° 4.315.073) ou teste de hemaglutinação. O método compreende administrar ao animal uma composição acima mencionada que compreende uma proteína/ácido nucléico isolado ou purificado ou fragmento desses. Se a composição compreende um ácido nucléico (ou fragmento desse) como parte de um vetor, preferivelmente a proteína (ou fragmento dessa) é expressa em uma quantidade suficiente para induzir uma resposta imune em um animal. Por exemplo, uma dose única de cerca de 9 a cerca de 43 unidades internacionais por kg de peso corporal do animal pode ser administrada. Para mamíferos maiores, uma dose única pode compreender de cerca de 600 a cerca de 3000 unidades internacionais por kg de peso corporal. Para composições de vacina preparadas pelo cultivo de vírus na cavidade alantóide de ovos férteis, coleta do vírus e, se desejado, estabilização do vírus coletado com um estabilizante, tal como uma peptona ou sacarose, e então distribuição em frascos de vidro para subseqüente liofilização, uma unidade de dosagem de vacina eficaz pode conter pelo menos 107 EID50 (50% dose infectante de ovo) de vírus. Na última situação, a vacina liofilizada é reconstituída pela adição de água ou outro diluente farmaceuticamente aceitável antes da administração, tal como na forma de um spray nasal ou gotas nasais. Se desejado, a vacina pode ser administrada em duas dosagens sucessivas em um intervalo de uma semana.

[0085] A composição pode ser administrada a filhotes como dose única na idade de 12 semanas ou repetidamente começando na idade de 6 semanas (por exemplo, 6, 9 e 12 semanas) ou semanalmente a partir de 4 semanas. A dosagem eficaz e a via de administração são determinadas pela natureza da composição, natureza do produto de expressão, LD50 e, se o vetor recombinante é usado, do nível de expressão do vetor, assim como da raça do cão e sua idade, sexo, peso e condição. Dosagens de produto expresso podem variar de algumas a poucas centenas de microgramas, por exemplo, 5-500 μg. Dosagens preferidas de vírus ou vetor recombinante podem variar de cerca de 103 a cerca de 106 pfu. A dose para a cepa viva atenuada pode ser de pelo menos cerca de 103TCID50.

[0086] As composições podem ser administradas parenteralmente (isto é, por injeção (por exemplo, intradérmica, subcutânea ou intramuscular) ou pela via da infecção, nasalmente) ou enteralmente (isto é, por administração oral). O uso de um agente gelificante e um muco- ou bioadesivo para intensificar a resposta imune contra uma composição imunogênica administrada intradermicamente está descrito no Ped. Patente Pub. U.S. N° 2005/0255121. Se desejado, a composição para indução de resposta imune pode ser administrada através de água ou xarope de acordo com Chu et al. (Ped. Patente Pub. U.S. N° 2006/0171960, que foi publicado em 3 de agosto de 2006). A adminis- tração oral é vantajosa à medida que ela evita injeção intramuscular demorada e trabalhosa que, por sua vez pode criar estresse para o animal e desconforto. O desconforto, por sua vez, pode afetar o desempenho de cães de corrida. Alternativamente, a composição que compreende um vetor recombinante que expressa pelo menos um epi- topo indutor de resposta imune pode ser aplicado diretamente à pele para expressão localizada e indução de resposta imune.

[0087] A eficácia da composição, que pode induzir uma resposta imune, pode ser demonstrada pela exposição de filhotes a uma cepa virulenta de vírus influenza canino. Cães não tratados devem desenvolver sinais clínicos característicos de infecção viral por influenza canina enquanto que cães tratados não devem.

[0088] Os vetores recombinantes e produtos expressos a partir deles podem ser usados para produzir anticorpos, tais como anticorpos policlonais (pAb) e anticorpos monoclonais (mAb), de acordo com métodos conhecidos na técnica (Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988); Harlow & Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual (1998), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998); Shepherd & Dean, Monoclonal Antibodies: A Practical Approach, Oxford University Press, U.S.A. (2000)); e Harris & Adair, Antibody Therapeutics, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL (1997)). Os anticorpos, em particular mAbs, podem ser usados em ensaios de ligação e kits/testes de diagnóstico para determinar a presença/ausência de um vírus influenza canino ou se uma resposta imune ao vírus foi ou não estimulada. Os anticorpos também podem ser usados para recuperar material por cromatografia de imunoadsorção.

[0089] Anticorpos também podem fornecer imunização passiva. Por exemplo, soros imunes parcialmente purificados de animais hospedeiros ou de linhagens celulares de hibridoma podem ser injetados em um animal. Os anticorpos fornecem um efeito terapêutico pela ligação e neutralização de vírus de influenza infeccioso.

[0090] Uma composição que compreende um anticorpo antiidiotí- pico que tem uma imagem interna de um epitopo de uma proteína descrita acima, tal como uma proteína que consiste na seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, também é fornecida.

[0091] Uma pessoa versada na técnica apreciará que um anticor po antiidiotípico que tem uma imagem interna de um epitopo, tal como aqueles descritos aqui, pode ser preparado. Vide, por exemplo, Herlyn et al., Science 232: 100-102 (1986)). Métodos de preparação de anticorpos monoclonais e policlonais antiidiotípicos, que tem a imagem interna do polipeptídeo, estão descritos na Patente U.S. N° 5.053.224, por exemplo. Resumidamente, anticorpos policlonais antiidiotípicos podem ser produzidos por imunizar animais com anticorpos monoclonais idiotípicos surgidos contra o polipeptídeo e rastreados quanto a reatividade com o polipeptídeo e rastrear por anti-soros, que reagem com anticorpos idiotípicos ao polipeptídeo. Anticorpos monoclonais (mAbs) também podem ser preparados a partir de tais animais usando técnicas padronizadas de imortalização de células que secretam anti-corpos do animal e rastreamento de culturas com anticorpos idiotípicos em competição com o polipeptídeo. Apesar de mAbs serem preferidos, anticorpos policlonais (pAbs), que são preparados em uma variedade de sistemas de mamíferos, também podem ser usados.

[0092] Outro método para indução de uma resposta imune a CIV em um canino também é fornecido. Esse método compreende administrar ao canino uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um anticorpo antiidiotípico como descrito acima.

[0093] As moléculas de ácido nucléico isoladas ou purificadas ou vetores que as compreendem podem ser usadas para gerar son- das/iniciadores de DNA, que podem ser usados para detectar a pre sença ou ausência de DNA hibridizável ou amplificar DNA, tal como cDNA.

[0094] Proteínas marcadas ou fragmentos dessas, assim como ácidos nucléicos marcados ou fragmentos desses, podem ser usados em ensaios. Métodos de ensaio incluem fluoro-imunoensaios (Smith et al., Ann. Clin. Biochem. 18: 253-275 (1981)), radioimunoensaios (RIA), ensaios imunoabsorventes ligados à enzima (ELISA) e técnica de imu- noensaio multiplicado por enzima (EMIT; vide Enzyme Immunoassay, Maggio, ed., CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1980. pp. 141-150; 234-235,e 242-243). Tais métodos podem ser usados para detectar a presença do vírus e para diagnosticar o estado de infecção.

[0095] O próprio vírus pode ser usado como um vetor. O uso de vírus como vetores está dentro da técnica.

EXEMPLO

[0096] O seguinte exemplo serve para ilustrar a presente inven ção. O exemplo não pretende limitar o escopo da invenção de modo algum. O exemplo descreve a identificação e caracterização parcial de um vírus influenza canino.

[0097] Surtos de doença respiratória aguda, caracterizados por tosse, febre, respiração rápida e descarga nasal hemorrágica, ocorreram entre galgos de duas pistas de corrida no leste e oeste de Iowa em abril de 2005. Apesar de um grande percentual de cães ter se recuperado, muitos sucumbiram à pneumonia hemorrágica.

[0098] Pulmões de cães afetados exibiram extensa descoloração de vermelho a preto avermelhado com firmeza palpável de moderada a acentuada e pleurite fibrinosa leve. Seções de pulmão foram caracterizadas por hemorragia intersticial severa à pneumonia broncointers- ticial. Alteração intersticial desigual com espessamento septal alveolar, coágulos de resíduos nos alvéolos e atelectasia associada foram evidentes. Pneumonia broncointersticial piogranulomatosa focalmente extensa com dilatação de vias aéreas por células degeneradas e resíduos foi observada. Vasculite dispersa e tromos vasculares eram aparentes.

[0099] Testes microbiológicos para agentes virais e bacterianos convencionais não revelaram quaisquer patógenos significativos exceto Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, que estava presente em tecidos pulmonares de todos os animais examinados. Duas das quatro amostras de pulmão testadas foram positivas para vírus da influenza usando a reação em cadeia da polimerase com transcriptase reversa em tempo real (RT- PCR; Harmon et al., Development of a PCR-based differential test for H1N1 and H3N2 swine influenza viruses. In: Proceedings of the 42nd Annual Meeting of American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians. San Diego, CA. outubro de 1999. p. 44.). Imunohistoquímica usando anticorpo monoclonal (mAb) específico para NP de vírus influenza (Vincent et al., J. Vet. Diagn. Invest. 9: 191-195 (1997)) também foi positiva dentro de lesões pneumônicas virais em ambos os pulmões assim como o teste ELISA de captura de antígeno (Directgen® Flu A, Becton/Dickinson, Sparks, MD) das amostras. Amostras de lavagem broncoalveolar de dois pulmões positivos foram testadas para o vírus da influenza por PCR.

[00100] O isolamento do vírus foi tentado por que a detecção de vírus influenza em pulmões de caninos era uma observação inesperada, já que existia apenas um único relato de infecção por vírus da influenza em caninos (Dubovi et al., Isolation of equine influenza virus from racing greyhounds with fatal hemorrhagic pneumonia. In: Proceedings of the 47th Annual Meeting of American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians. Greensboro, NC. Outubro de 2004. p. 158.). Um vírus que era capaz de aglutinar células sangüíneas vermelhas de galo foi isolado em células de rim canino Madin-Darby (MDCK) a partir do pulmão e fluido de lavagem broncoalveolar de um dos dois animais nos quais o vírus influenza foi detectado por ensaio de imu- nohistoquímica (IHC) e PCR. O isolado foi determinado por PCR como sendo o vírus influenza do subtipo H3. O vírus isolado foi subtipado como H3N8 usando ensaios de inibição de HA e inibição de NM. O isolado de vírus foi reconhecido por anti-soros surgidos contra vários vírus influenza H3 de eqüino, incluindo Miami ((A/Eq/MI/1/63-H3N8) 640-1280), AK((A/Eq/AK/29759/91-H3N8) 320-640), e Kentucky ((A/Eq/Kentucky/81-H3N8) 160- 320).

[00101] O seqüenciamento dos genes de HA e NA de ambos os isolados revelou 100% e 99,8% de identidade, respectivamente, entre os dois isolados. Filogeneticamente, o gene de HA dos isolados era geneticamente próximo (96-98% de homologia de nucleotídeo) ao gene de HA dos vírus influenza H3N8 de eqüino recentes (Macken et al., The value of a database in surveillance and vaccine selection. In: Options for the. Control of Influenza IV. Osterhaus et al., eds. Elsevier Science, Amsterdam. 2001. pp. 103-106.). O gene de NA dos isolados também mostrou 96-98% de homologia com o gene de NA de vírus influenza H3N8 de eqüino recentes. Já que galgos de duas pistas de corrida diferentes, que estão em áreas geograficamente remotas em Iowa, sucumbiram simultaneamente à doença sem o envolvimento de cavalos doentes, demonstra-se que o isolado do vírus influenza é uma cepa adaptada a caninos que pode se perpetuar e disseminar entre cães. S. zooepidemicus, que tem sido implicado na doença respiratória e problemas associados a septicemia em várias espécies de animais diferentes (Wood et al., J. Clin. Microbiol. 43: 120-126 (2005); e Gillespie et al., The General Staphylococcus and Streptococcus. In: Hagan and Bruner's Infectious Diseases of Domestic Animals. 7a ed. Comstock/Cornell University Press. Ithaca, NY. 1981. pp. 164-180)), provavelmente contribuiu para a severidade da doença.

[00102] Todas as referências, incluindo publicações, pedidos de patente e patentes, citadas aqui estão incorporadas por referência na mesma extensão como se cada referência fosse individualmente e especificamente indicada por ser incorporada por referência e fossem descritas aqui em sua totalidade.

[00103] O uso dos termos "um", "uma", "a", "o" e referências similares no contexto da descrição da invenção (especialmente no contexto das seguintes reivindicações) deve ser considerado como cobrindo tanto a forma no singular como no plural, a menos que indicado aqui de outra maneira ou claramente contradito pelo contexto. A recitação de faixas de valores pretende meramente servir como método abreviado de se referir individualmente a cada valor separado que cai dentro da média, a menos que indicado de outra maneira, e cada valor separado está incorporado no pedido como se tivesse sido individualmente citado aqui. Todos os métodos descritos aqui podem ser realizados em qualquer ordem adequada a menos que indicado aqui de outra maneira ou a menos que contradito claramente pelo contexto. O uso de qualquer um e de todos os exemplos, ou da linguagem exemplar (por exemplo, "tal como") fornecidos aqui, pretende meramente esclarecer melhor a invenção e não impõe uma limitação ao escopo da invenção a menos que reivindicado de outra maneira. Nenhuma linguagem no pedido deve ser considerada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.

[00104] As modalidades preferidas dessa invenção estão descritas aqui, incluindo o melhor modo conhecido pelos inventores de realizar a invenção. Deve ficar compreendido que as modalidades ilustradas são apenas exemplares e não devem ser tomadas como limitantes do escopo da invenção.

Claims (8)

1. Vírus, caracterizado pelo fato de que é vírus influenza canino isolado de subtipo H3N8 depositado na American Type Culture Collection como Depósito de Patente N° PTA-7694, em que o vírus influenza canino isolado é inativado por tratamento com uma enzima, formaldeído, β-propiolactona ou um derivado da mesma, etilenoimina ou um derivado da mesma, ou um solvente orgânico.

2. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o vírus influenza canino como definido na reivindicação 1.

3. Composição de acordo com a reivindicação 2 caracterizada pelo fato de que o vírus influenza canino é inativado por tratamento com formaldeído, β-propiolactona ou um derivado da mesma, etilenoimina ou um derivado da mesma.

4. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o vírus influenza canino está presente em uma quantidade de 103 a 106 pfu por dose.

5. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a cepa inativada é pelo menos 103 TCID50 por dose.

6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um veículo biologicamente aceitável.

7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizada pelo fato de que é formulada como uma composição de liberação controlada.

8. Uso da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 2 a 7, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para tratar uma infecção por vírus influenza canino.