CN104395346A - 重组木瓜花叶病毒外壳蛋白及其在流感疫苗中的应用 - Google Patents

重组木瓜花叶病毒外壳蛋白及其在流感疫苗中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104395346A
CN104395346A CN201380028970.6A CN201380028970A CN104395346A CN 104395346 A CN104395346 A CN 104395346A CN 201380028970 A CN201380028970 A CN 201380028970A CN 104395346 A CN104395346 A CN 104395346A
Authority
CN
China
Prior art keywords
vlp
papmv
seq
peptide
virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201380028970.6A
Other languages
English (en)
Inventor
丹尼斯·勒克莱尔
娜塔莉·马杰奥
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Folia Biotech Inc
Original Assignee
Folia Biotech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Folia Biotech Inc filed Critical Folia Biotech Inc
Publication of CN104395346A publication Critical patent/CN104395346A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0275—Salmonella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55516—Proteins; Peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6075—Viral proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6081—Albumin; Keyhole limpet haemocyanin [KLH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/26011—Flexiviridae
    • C12N2770/26023—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/26011—Flexiviridae
    • C12N2770/26034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/26011—Flexiviridae
    • C12N2770/26041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/26043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/40011—Tymoviridae
    • C12N2770/40034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

含有一种或多种抗原肽的重组木瓜花叶病毒(PapMV)外壳蛋白，其制备病毒样颗粒(VLPs)的用途及VLP在流感疫苗中的用途，所述抗原肽源自流感病毒抗原，如M2e抗原，其在外壳蛋白N-末端13个氨基酸的推测随机卷曲内的位置融合。

Description

重组木瓜花叶病毒外壳蛋白及其在流感疫苗中的应用
发明领域
本发明涉及免疫原性制剂的领域，并且特别地涉及含有重组木瓜花叶病毒外壳蛋白的制剂，用于诱导针对流感病毒的免疫反应。
发明背景
以下专利和专利申请描述了木瓜花叶病毒(PapMV)病毒样颗粒(VLP)作为免疫增强剂和佐剂的能力。
美国专利No.7,641,896、加拿大专利申请No.2,434,000和国际专利申请No.PCT/CA03/00985(WO2004/004761)描述了PapMV或来源于PapMV外壳蛋白的VLP用于在动物中加强免疫反应的用途。还描述了PapMV与免疫原的融合。
国际专利申请No.PCT/CA2007/002069(WO2008/058396)描述了基于PapMV和PapMV VLP的流感疫苗。所述疫苗包含与一种或更多种流感抗原联合或融合的PapMV或PapMV VLP。
国际专利申请No.PCT/CA2007/001904(WO2008/058369)描述了基于PapMV的免疫原性亲和-缀合抗原系统。该申请描述了PapMV外壳蛋白与能够结合目标抗原的多种亲和肽的融合体，其中，所述亲和肽通过化学方法或基因融合方法与外壳蛋白连接。
国际专利申请No.PCT/CA2008/000154(WO2008/089569)描述了基于PapMV的对抗伤寒沙门氏菌(S.typhi)和其他肠道菌病原体的疫苗。描述了PapMV外壳蛋白与一种或多种肠杆菌抗原的融合体。
国际专利申请No.PCT/CA2009/00636(WO2010/012069)描述了基于PapMV的多价疫苗，包括PapMV或VLP与市售流感疫苗的组合。
其它出版物已描述了PapMV VLP引起体液和细胞免疫反应的能力(Denis等,2007,Virology,363:59–68；Denis等,2008,Vaccine,26:3395-3403；Leclerc等,2007,J Virol.,81:1319-26，以及Lacasse等,2008,J.Virol.,2008；82:785-94)。
已描述了PapMV外壳蛋白的N-端突变体及其在PapMV-宿主互作中的作用(Ikegami,“Papaya Mosaic Potexvirus as an Expression Vectorfor Foreign Peptides,”M.Sc.Thesis,1995,加拿大国家图书馆,渥太华)。突变包括野生型序列的3位的赖氨酸替换为精氨酸保守替换，3位下游的18位氨基酸的缺失，以及作为N-端增加和野生型N-端序列替换的11位氨基酸的框内(in-frame)插入。所有三个突变可以在C.globosa上产生局部病变，并能影响系统性宿主木瓜(C.papaya)，表明所述突变可组装并可系统性地移动。
已经研究了HA11肽与PapMV外壳蛋白的几个推测的表面暴露位点的融合(Rioux等,2012,PLoS ONE,7(2),e31925)。该肽在外壳蛋白的12和187位的融合导致融合蛋白能够自我组装成VLP。含有所述肽与外壳蛋白的12位的融合的VLP是稳定的，且能诱导针对HA11肽的免疫反应。
提供该背景信息的目的是，为了告知本申请人认为的可与本发明相关的信息。既未必旨在承认也不应解释为，任何以上信息构成针对本发明的现有技术。
发明概述
本发明的目的在于提供重组木瓜花叶病毒外壳蛋白及其在诱导对象针对流感病毒的免疫反应中的应用。根据本发明的一个方面，提供一种含有肽抗原的融合蛋白，所述肽抗原源自流感M2e肽，其融合至木瓜花叶病毒(PapMV)外壳蛋白的SEQ ID NO:1的6-12位中任一氨基酸所对应的氨基酸之后，其中，所述融合蛋白可自我组装成病毒样颗粒(VLP)，并且，其中肽抗原长度为20个或更少的氨基酸，且含有一般序列：V-X1-T-X2-X3-X4-X5[SEQ ID NO:96]，其中X1为E或D；X2为P或L；X3为T或I；X4为R或K，且X5为N、S或K。
根据本发明的另一方面，提供含有所述融合蛋白的病毒样颗粒(VLP)。
根据本发明的另一方面，提供含有所述VLP以及药学可接受载体的药物组合物。
根据本发明的另一方面，提供一种诱导对象针对流感病毒的免疫反应的方法，其包括向对象给予有效量的VLP。
根据本发明的另一方面，提供一种降低对象发生流感的风险的方法，其包括向对象给予有效量的VLP。
根据本发明的另一方面，提供一种给对象免疫以对抗流感病毒感染的方法，其包括向对象给予有效量的VLP。
根据本发明的另一方面，提供一种含有上述融合蛋白的病毒样颗粒(VLP)，用于在有需要的对象中诱导针对流感病毒的免疫反应。
根据本发明的另一方面，提供一种含有所述融合蛋白的病毒样颗粒(VLP)在有需要的对象中诱导针对流感病毒的免疫反应的用途。
根据本发明的另一方面，提供一种含有所述融合蛋白的病毒样颗粒(VLP)在制备诱导对象针对流感病毒免疫反应的药物中的用途。
根据本发明的另一方面，提供一种含有所述融合蛋白的病毒样颗粒(VLP)，用于降低对象发生流感的风险。
根据本发明的另一方面，提供一种含有所述融合蛋白的病毒样颗粒(VLP)在降低对象发生流感的风险中的用途。
根据本发明的另一方面，提供一种含有所述融合蛋白的病毒样颗粒(VLP)在制备降低对象发生流感风险的药物中的用途。
根据本发明的另一方面，提供一种含有所述融合蛋白的病毒样颗粒(VLP)，用于给对象免疫以对抗流感病毒的感染。
根据本发明的另一方面，提供一种含有所述融合蛋白的病毒样颗粒(VLP)在给对象免疫以对抗流感病毒的感染中的用途。
根据本发明的另一方面，提供一种含有所述融合蛋白的病毒样颗粒(VLP)在制备给对象免疫以对抗流感病毒感染的药物中的用途。
根据本发明的另一方面，提供一种含有上述VLP以及使用说明书的药物试剂盒。
根据本发明的另一方面，提供一种含有一或多种肽抗原的融合蛋白，所述一或多种肽抗原融合至木瓜花叶病毒(PapMV)外壳蛋白的在SEQ ID NO:1中6-12位、185-192位以及197-214位中任一氨基酸所对应的氨基酸之后，其中所述融合蛋白能够自我组装成病毒样颗粒(VLP)，且其中肽抗原长度为20个或更少的氨基酸，并且其中VLP在至少25℃的温度下是稳定的。
根据本发明的另一方面，提供一种能够加强对象针对肽抗原的免疫反应的融合肽抗原的病毒样颗粒(VLP)鉴定方法，其包括如下步骤：提供含有与肽抗原融合的木瓜花叶病毒(PapMV)外壳蛋白的VLP，并确定VLP在至少25℃温度下的稳定性，其中，在至少25℃温度下的稳定性是VLP能加强针对肽抗原的免疫反应的指示。
附图简述
本发明的这些和其它特征将从参照附图的以下详述中变得更明显。
图1示出了(A)野生型PapMV外壳蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO：1)；(B)野生型PapMV外壳蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)；(C)修饰的PapMV外壳蛋白CPΔN5的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)；和(D)修饰的PapMV外壳蛋白PapMV CPsm的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。
图2示出了实施例部分所描述的重组PapMV外壳蛋白的核酸和氨基酸序列，相应抗原肽的插入序列用黑体和下划线标出：(A)PapMVNP-8的核酸和氨基酸序列[分别为SEQ ID NO:72和73]；(B)PapMVNP-183的核酸和氨基酸序列[分别为SEQ ID NO:74和75]；(C)PapMVNP-C的核酸和氨基酸序列[分别为SEQ ID NO:76和77]；(D)PapMVLoop6-8的核酸和氨基酸序列[分别为SEQ ID NO:78和79]；(E)PapMVLoop6-183的核酸和氨基酸序列[分别为SEQ ID NO:80和81]；(F)PapMV Loop6-C的核酸和氨基酸序列[分别为SEQ ID NO:82和83]；(G)PapMV 3NP-C的核酸和氨基酸序列[分别为SEQ ID NO:84和85]；(H)PapMV NP-8/183的核酸和氨基酸序列[分别为SEQ ID NO:86和87]；(I)PapMV NP-8/C的核酸和氨基酸序列[分别为SEQ ID NO:88和89]；(J)PapMV NP-183/C的核酸和氨基酸序列[分别为SEQ ID NO:90和91]；(K)PapMV 3NP-8的核酸和氨基酸序列[分别为SEQ ID NO:92和93]，以及(L)PapMV 3NP-8/183/C(PapMV三个NP)[分别为SEQ ID NO:6和94]。
图3示出了实施例1所述的PapMV外壳蛋白-M2e肽融合体的氨基酸序列：(A)#1构建体[SEQ ID NO:23]；(B)#2构建体[SEQ IDNO:24]；(C)#3构建体[SEQ ID NO:25]；(D)#4构建体[SEQ ID NO:26]；(E)#5构建体[SEQ ID NO:27]以及(F)#6构建体[SEQ ID NO:28]。插入的M2e肽序列用黑体表示。
图4示出了PapMV外壳蛋白(CP)的二级结构预测(参考Lecours等,2006,PEP,47:273-80)，Rioux等(2012,PLoS ONE,7(2),e31925)表明了HA11肽序列插入到PapMV CP氨基酸序列(SEQ ID NO:4)中的位置。
图5示出了实施例1中所述的构建体中，与PapMV外壳蛋白融合的M2e肽的位置和序列(插入序列用黑体和下划线表示)。
图6示出了通过将Sypro-Orange结合到疏水性残基，观察到的实施例1中PapMV-M2e构建体的变性。
图7示出了图5中的热稳定性构建体(#1、2、3、4、5、6、9和10)的透射电子显微图。
图8示出了实施例1中含有PapMV-M2e构建体的VLP的免疫原性评价结果。BALB/c小鼠，每组5只，用VLP免疫两次(第1天和第14天)。每次免疫的14天后收获血样，通过ELISA测定体液免疫反应。A)在第14天和第28天的抗-M2e IgG总滴度，B)在第14天和第28天的抗-M2e IgG2a总滴度。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.1。
图9示出了(A)融合伤寒沙门氏菌(S.typhi)环6肽位点处的PapMVCP氨基酸序列；(B)重组PapMV CP融合蛋白的SDS-PAGE分析：蛋白PapMV-loop-6-8诱导之前(泳道1)和表达之后(泳道2)的细菌裂解产物；泳道3：纯化的PapMV-loop-6-8；蛋白PapMV-loop-6-183诱导之前(泳道4)和表达之后(泳道5)的细菌裂解产物；泳道6：纯化的PapMV-loop-6-183；蛋白PapMV-loop-6-C诱导之前(泳道7)和表达之后(泳道8)的细菌裂解产物；以及泳道9：纯化的PapMV-loop-6-C；(C)含有PapMV loop-6-8、PapMV-loop-6-183和PapMV-loop-6-C的VLP的电子显微图，以及(D)含有PapMV loop-6-8、PapMV-loop-6-183和PapMV-loop-6-C的VLP的动态光散射(DLS)图。
图10示出了通过ELISA测定的，用于说明针对PapMV SM(或WT)、PapMV loop-6-8(loop6-8)、PapMV-loop-6-183(loop6-183)和PapMV-loop-6-C(loop6-C)的体液免疫反应的数据：总的IgG(A)；指向PapMV平台的IgG2a(B)；总的IgG(C)和指向环6肽的IgG2a(D)。
图11示出了(A)融合NP肽位点的PapMV CP氨基酸序列；(B)SDS-PAGE显示了融合至NP CTL表位的PapMV蛋白和VLP的表达；(C)含有PapMV NP-8、PapMV NP-183和PapMV NP-C的VLP的电子显微图，以及(D)PapMV NP-8、PapMV NP-183和PapMV NP-CVLP以及盘(disc)的动态光散射(DLS)。
图12示出了ELISPOT分析结果，展示了用含有融合至流感NP147-155肽的PapMV CP的PapMV VLP和盘免疫小鼠后的IFN-γ的分泌，(A)含有PapMV NP-12、PapMV NP-187、PapMV NP-C或PapMVCP的VLP(与所有组比较，***p≤0.001)；(B)含有PapMV NP-12或PapMV CP的VLP和盘(与所有组比较，***p≤0.001)，以及(C)含有与戊二醛(Glut)交联或不交联的PapMV NP-12、PapMV NP-C或PapMVCP的VLP(*p≤0.05 and**p≤0.01)。
图13示出了(A)NP147-155肽融合位置处的PapMV CP氨基酸序列；(B)SDS-PAGE显示了携带多拷贝的NP147-155肽的PapMV蛋白和VLP的表达，以及(C)PapMV VLPs 3NP-C、NP-8/183、NP-8/C、NP-8/C和三个NP的动态光散射(DLS)。
图14描述了PapMV CP与用PapMV VLP免疫过的小鼠血清杂交产生的27个重叠肽的微阵列分析结果：在肽1的相对荧光强度的位置标出临界值，因为其是已知被表面暴露的。
图15示出了经化学修饰的PapMV VLP的电子显微图和动态光散射分析结果，表明用DEPC或EDC处理VLP不会保持破坏它们的四级结构，如电子显微(A)和动态光散射所示(B)。
图16示出了野生型PapMV外壳蛋白的氨基酸序列[SEQ IDNO:1]，其中C-末端和N-末端涉及预测的随机卷曲的氨基酸残基用黑体和下划线标出。
图17示出了含有与多拷贝流感NP147-155肽融合的PapMV CP的PapMV VLP和盘的ELISPOT分析结果。
图18示出了描述通过动态光散射测定的含有与流感NP147-155肽融合的PapMV CP的VLP结构改变图：(A)含有重组PapMV CP NP147-155融合体的VLP与没有融合体的PapMV VLP相比，在低于小鼠体温的温度下表现出PapMV NP-187和NP-C VLP的聚集，(B)交联的PapMVNP-C VLP显示了高温稳定性；以及(C)含有经戊二醛交联或不交联的重组PapMV CP NP147-155肽的VLP进行胰蛋白酶裂解的结果。
图19示出了消化了的含有经EDC化学修饰的肽的MS/MS谱图：含有修饰物的区域为V16至K30(A)，M122至K137(B)，以及G199至R221(C)。下划线的产物离子含有EDC修饰物。
图20示出了消化了的含有经DEPC化学修饰的肽的MS/MS谱图：含有修饰物的区域为M122至K137(A)，以及G199至R221(B)。B中的DEPC修饰物不能精确定位，因此，在两个苏氨酸中的任一个位置。下划线的产物离子含有DEPC修饰物。
发明详述
本发明涉及含有在外壳蛋白(CP)“表面卷曲”区域内融合的一或多个抗原肽的重组PapMV外壳蛋白，具体地，在含有野生型CP的N-末端13个氨基酸的预测随机卷曲内(SEQ ID NO:1；见图16)。含有融合的抗原肽的重组PapMV CP能自我组装成病毒样颗粒(VLP)。
在某些实施方案中，一或多个抗原源自流感病毒，优选源自M2e肽，并且在SEQ ID NO:1的6-12位氨基酸中任一氨基酸之后，或其对应的位置，如SEQ ID NO:4的1-8位氨基酸中任一氨基酸之后，插入到PapMV CP中。这些重组外壳蛋白制备的病毒样颗粒(VLPs)可用于诱导针对流感病毒的保护性免疫反应。因此，一些实施方案涉及这些VLP在诱导哺乳动物，如人类针对流感病毒的保护性免疫反应中的应用。在某些实施方案中，其包括VLP可用作流感疫苗。
本发明的某些实施方案涉及含有抗原肽融合体的重组PapMV CP蛋白，所述抗原肽源自流感病毒，如M2e肽，其融合至如SEQ ID NO:1所示的PapMV CP序列的6、7或10位中任一氨基酸的对应位置之后，例如，如SEQ ID NO:4所示的PapMV CP序列的2、3或6位氨基酸之后。在一些实施方案中，所述抗原肽为M2e衍生肽，其含有一般序列：V-X1-T-X2-X3-X4-X5[SEQ ID NO:96]，其中X1为E或D；X2为P或L；X3为T或I；X4为R或K，且X5为N、S或K。如本申请所示，含有在如SEQ ID NO:1所示的PapMV CP序列的6、7或10位中任一氨基酸的对应位置之后融合M2e衍生肽(含有如SEQ ID NO:96所示的一般序列)的PapMV CP的VLP，能够通过单次免疫提供针对流感病毒的保护性免疫反应。
某些实施方案包括，重组PapMV CP还可进一步包含在CP的二级表面卷曲区域和/或C-末端的融合的一个或多个抗原肽。
如本申请所述，在一些实施方案中，可基于VLP的热稳定性预计含有重组CP的VLP引发针对融合肽的有效免疫反应的能力。因此，在某些实施方案中，所选择的含有重组CP的VLP，在至少30℃的温度下是稳定的。
定义
除非另有说明，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员所通常理解的含义。
本申请使用的术语“约”是指给定值的约+/-10％变化。应理解，这样的变化常常包括在本文所提供的任何给定值中，不论有没有特别指出。
本申请使用的术语“免疫原性”是指物质在动物中诱发可检测的免疫反应的能力。
本申请使用的术语“免疫反应”是指动物免疫系统响应物质(如化合物、分子、材料等)给予时反应性的改变，并可能涉及抗体产生、诱发细胞介导的免疫、补体激活、免疫耐受性的发展或其组合。
本申请使用的术语“疫苗接种”是指为产生有益免疫反应，向对象给予疫苗。疫苗接种可具有预防效果、治疗效果或其组合。依据待处理的对象，使用各种方法完成疫苗接种，包括但不限于肠胃外给药，如腹腔内注射(i.p.)、静脉内注射(i.v.)或肌肉内注射(i.m.)；口服给药；鼻腔给药；皮内给药；经皮给药和浸泡。
本申请使用的术语“疫苗”是指在能够产生有益免疫反应的组合物。
本申请使用的“天然产生的”(如用于指对象)是指对象可在自然中发现的事实。例如，可分离自天然来源并且未在实验室中被人有意地改造的生物体(包括病毒)或存在于生物体中的多肽或多核苷酸序列是天然的。
本申请使用的术语“多肽”或“肽”意指一种分子，其至少有两个通过肽键连接的氨基酸，例如至少4个氨基酸。
本申请使用的术语“病毒样颗粒”(VLP)是指自我组装颗粒，其具有病毒粒子相近的物理性质。VLP可含有或不含有核酸。VLP通常是可以复制的。
本申请使用的术语“盘”(disc)是指PapMV外壳蛋白的多聚体形式，其含有约18至约22个亚单位，并且分子量为约400kDa至约500kDa)(Tremblay等,2006,FEBS,273:14-25)。与不具有明确结构的非特定聚合物(aggregate)相比，盘大体上表现为球形结构，通过DLS测量的直径约为40nm或更小。
本申请使用的术语“抗原”是指一个分子、多个分子、分子的一个部分或多个部分，或分子的组合，直至包括整个细胞和组织，其能单独诱导或与佐剂共同诱导对象产生免疫反应。免疫原/抗原可含有一个表位或可含有多个表位。因此，该术语包括肽、碳水化合物、蛋白质、核酸和各种微生物(整体或部分)，包括病毒、细菌和寄生虫。半抗原也可被认为是包含在本申请使用的术语“抗原”内。
本申请使用的术语“对象”或“患者”是指有接种疫苗或治疗需要的动物。
本文中使用的术语“动物”是既指人也指非人动物，包括但不限于哺乳动物、鸟和鱼，并且包括家畜、农场动物、动物园动物、实验室动物和野生动物，例如牛、猪、马、山羊、绵羊或其他有蹄动物、狗、猫、鸡、鸭、非人灵长类、豚鼠、兔、雪貂、大鼠、仓鼠和小鼠。
本申请中关于核酸或氨基酸序列使用的术语“基本相同”是指，当最佳比对(例如，使用下述方法)时，核酸或氨基酸序列与限定的第二核酸或氨基酸序列(或“参考序列”)共有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。“基本的同一性”可用于指序列(例如全长序列、功能性结构域、编码和/或调控序列、启动子和基因组序列)的多种类型和长度。两条氨基酸或核酸序列之间的百分比同一性可以按本领域技术人员技术中的多种方式来确定，例如，使用可公开获得的计算机软件，例如Smith Waterman Alignment(Smith，T.F.和M.S.Waterman(1981)J Mol Biol147：195-7)；“BestFit”(Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics，482-489(1981))，合并到GeneMatcher PlusTM，Schwarz和Dayhof(1979)Atlas of Protein Sequence和Structure，Dayhof，M.O.编，第353-358页中；BLAST程序(基本局部比对检索工具(Altschul，S.F.，W.Gish，et al.(1990)J Mol Biol215：403-10)及其变体，包括BLAST-2、BLAST-P、BLAST-N、BLAST-X、WU-BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、CLUSTAL和Megalign(DNASTAR)软件。此外，本领域技术人员可确定用于测量比对的合适参数，包括在待比较序列长度上实现最大比对所需的算法。一般来说，对于氨基酸序列，比较序列的长度为至少10个氨基酸。本领域技术人员应理解，实际长度取决于待比较序列的总长度，并且可以是至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个、至少140个、至少150个或至少200个氨基酸，或者其可以是全长的氨基酸序列。对于核酸，比较序列的长度一般是至少25个核苷酸，但可以是至少50个、至少100个、至少125个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个、至少550个或至少600个核苷酸，或者其可以是全长的核酸序列。
本申请使用的术语“多数”是指多于一个，例如，两个或更多，三个或更多，四个或更多等。
当在本申请中术语“包含”与“一”或“一个”一起使用时可以表示“一”，但其也符合“一或更多”、“至少一”以及“一或多于一”的含义。
本申请使用的术语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”及其语法变体是包括性的或开放性的，并且不排除另外的、未引用的元件或方法步骤。当本申请术语“基本由……组成”与组合物、用途或方法一起使用时，表示还存在其它元件和/或方法步骤，但其对所述的组合物、方法或用途没有实质性作用。当本申请术语“由……组成”与组合物、用途或方法一起使用时，排除了存在其他元件和/或步骤。本申请中以包含某些元件和/或步骤描述的组合物、用途或方法，在某些实施方案中，也可基本由那些元件和/或步骤组成，且在其它实施方案中，由那些元件和/或步骤组成，不论这些实施方案有没有特别指出。
包括了本文所讨论的可针对本发明的任何方法、用途或组合物实施的任何实施方案，并且反之亦然。此外，本发明的组合物和试剂盒可用于实现本发明的方法和用途。
重组PapMV外壳蛋白
根据本发明，重组PapMV外壳蛋白(CP)包含一个或多个源自抗原的抗原肽，所述抗原肽在CP的N-末端表面卷曲区域内的某个位点与PapMV CP融合。
在一些实施方案中，重组CP还可包含多个抗原肽(即两个或更多)，并且多个肽可在N-末端表面卷曲区域内融合，或者它们各自在不同的表面卷曲区域内和/或在C-末端融合。
PapMV外壳蛋白
根据本发明，用于制备重组PapMV CP的PapMV外壳蛋白可以是完整的PapMV外壳蛋白或其一部分，或者其可以是野生型PaPMV外壳蛋白的经遗传修饰形式，例如，包含一个或更多个氨基酸缺失、插入、替换等，前提是所述外壳蛋白保留自组装成VLP的能力。野生型PapMV外壳(或衣壳)蛋白的氨基酸序列在本领域中是已知的(参见Sit等，1989，J.Gen.Virol.，70：2325-2331，和GenBank登录号NP_044334.1)，并且在本文中提供为SEQ ID NO：1(参见图1A)。PapMVCP的核苷酸序列在本领域中也是已知的(参见，Sit等，ibid.，和GenBank登录号NC_001748(5889-6536位核苷酸))并且在本文中提供为SEQ ID NO：2(参见图IB)。
如上所述，用于制备重组PapMV CP的PapMV CP氨基酸序列不需要精确对应于亲本(野生型)序列，即，其可以是“突变序列”。例如，PapMV CP可通过一个或更多个氨基酸残基的替换、插入或缺失来突变，使得该位点的残基不对应于亲本(参考)序列。但是，本领域技术人员应理解，这样的突变将不是广泛的，并且不会大大影响重组PapMV CP自我组装成VLP的能力。按照标准技术如本申请实施例中公开的例示性方法，可通过电子显微镜评估突变版本的PapMV CP自我组装成VLP的能力。
PapMV CP的天然突变体也是已知的。例如，据Noa-Carrazana&Silva-Rosales(2001，Plant Science，85：558)报道，鉴定了具有外壳蛋白的PapMV的两个墨西哥(Mexican)分离物，其具有与GenBank登录号No.D13957(即SEQ ID NO:1)88％的序列相似性，彼此序列相似性为94％。在本发明的某些实施方案中，也包括这些天然突变体。
因此，在一些实施方案中，还包括通过野生型CP的片段制备的重组PapMV CP，所述片段保留自我组装成VLP的能力(即，“功能性”片段)。例如，片段可以包含从蛋白质的N-末端、C-末端或内部或其组合中的一个或多个氨基酸的缺失。一般来说，功能性片段的长度为至少100个氨基酸，在本发明的一些实施方案中，功能性片段被定义为长度为至少150个氨基酸、至少160个氨基酸、至少170个氨基酸、至少180个氨基酸或至少190个氨基酸。
在本发明的某些实施方案中，当重组CP包含变体序列时，该变体序列与亲本(参考)序列具有至少约70％的同一性，例如与参考序列有至少约75％的同一性。在一些实施方案中，该变体序列与参考序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约98％的同一性，或它们之间的任何量。在一个实施方案中，参考氨基酸序列是SEQ ID NO：1(图1A)。
在本发明的某些实施方案中，用于制备重组PapMV CP的PapMVCP是PapMV外壳蛋白CP的经遗传修饰(即变体)形式。在一些实施方案中，对PapMV CP进行了遗传修饰以从所述蛋白质的N-末端或C-末端缺失氨基酸和/或包含一个或更多个氨基酸替换。在一些实施方案中，对PapMV CP进行了遗传修饰以从所述蛋白质的N-末端或C-末端缺失约1至约10个氨基酸，例如约1至约5个氨基酸。
在某些实施方案中，对PapMV CP进行了遗传修饰以移除接近野生型蛋白质N-末端存在的两个蛋氨酸密码子(即，在SEQ ID NO：1的第1位和6位)中的一个，并且可以起始翻译。翻译起始密码子中一个的移除使得产生同源蛋白质群体。可例如通过替换构成该密码子的一个或更多个核苷酸使得该密码子编码除蛋氨酸以外的氨基酸或者变为无义密码子来移除所选蛋氨酸密码子。可选地，可缺失密码子的全部或一部分，或包含所选密码子的编码所述蛋白质的核酸的5’区。在本发明的一些实施方案中，对PapMV CP进行了遗传修饰以在1位缺失蛋氨酸，例如从蛋白质的N-末端缺失1至5个氨基酸。在一些实施方案中，经遗传修饰的PapMV CP具有与SEQ ID NO：4(图1C)基本相同的氨基酸序列，并且可任选地包含多至6个组氨酸残基的组氨酸标签。在一些实施方案中，对PapMV CP进行了遗传修饰以在C-末端包括额外的氨基酸(例如，约1至约8个氨基酸)。引入所述的氨基酸，例如，可在编码核苷酸序列中产生一个或更多个特异性限制酶位点。在一些实施方案中，PapMV CP具有与SEQ ID NO：5(图1D)基本相同的氨基酸序列，有或没有组氨酸标签。
当使用包含一个或更多个氨基酸替换的变体PapMV CP序列制备重组PapMV CP时，这些替换可以是“保守”替换或“非保守”替换。保守替换涉及用具有相似侧链性质的另一个残基替换一个氨基酸残基。如本领域中已知的，可以根据其侧链的物理化学性质将20种天然氨基酸分组。合适的组包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸(疏水侧链)；甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺(极性，不带电侧链)；天冬氨酸和谷氨酸(酸性侧链)以及赖氨酸、精氨酸和组氨酸(碱性侧链)。另一组氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸(芳族侧链)。保守替换涉及用来自同组的另一氨基酸替换一个氨基酸。非保守替换涉及用具有不同侧链性质的另一个残基替换一个氨基酸残基，例如用中性或碱性残基替换酸性残基，用酸性或碱性残基替换中性残基，用亲水性残基替换疏水性残基等等。
在本发明的某些实施方案中，重组CP包含具有一个或多个非保守替换的变体序列。将一个氨基酸替换为具有不同性质的另一个氨基酸可以改进CP的性质。例如，如之前所述，CP的第128位残基的突变促进了所述蛋白质组装成VLP(Tremblay等，2006，FEBSJ.，273：14-25)。因此，在一些实施方案中，所述CP包含第128位残基处的突变，其中该位的谷氨酸残基被中性残基替换。在一个实施方案中，第128位处的谷氨酸残基被丙氨酸残基替换。
已表明，用另一个疏水性残基替换野生型PapMV CP的F13位处的苯丙氨酸残基，导致与使用野生型蛋白质序列相比，表达重组蛋白质时形成更高比例的VLP。在本发明的上下文中，认为下述氨基酸残基是适合于在F13位替换的疏水性残基：Ile、Trp、Leu、Val、Met和Tyr。在本发明的一些实施方案中，所述重组CP包含在13位用Ile、Trp、Leu、Val、Met或Tyr替换Phe。在一些实施方案中，所述重组CP包含在13位用Leu或Tyr替换Phe。
在某些实施方案中，所述CP的F13位的突变可以与E128位的突变、N-末端的缺失或其组合相组合。
同样地，用于制备重组PapMV CP的编码PapMV CP的核酸序列不需要精确对应于亲本参考序列，而是可通过遗传密码的简并性而不同，和/或使得其编码如上所述的变体氨基酸序列。因此，在本发明的某些实施方案中，编码变体CP的核酸序列与参考序列具有约70％的同一性。在一些实施方案中，编码重组CP的核酸序列与亲本(参考)序列具有至少约75％的同一性，例如，与参考序列具有至少约80％、至少约85％或至少约90％的同一性，或它们之间的任何量。在一个实施方案中，参考核酸序列是SEQ ID NO：2(图1B)。
抗原肽
根据本发明的重组PapMV CP包含在预测的CP N-末端表面卷曲内与CP融合的一个或多个抗原肽。优选地，抗原肽来源于流感抗原。抗原肽选自那些不干扰重组CP表达或自组装成CLP能力的抗原肽，二者均可通过如上所述的标准技术进行检测。
与CP融合的抗原肽大小可不同，但是一般来说长度为约3个氨基酸至约50个氨基酸，例如长度为约3个至约40个氨基酸，约3个至约30个氨基酸，约3个至约25个氨基酸，约3个至约20个氨基酸，约3个至约15个氨基酸，约3个至约12个氨基酸，或它们之间的任何量。在一些实施方案中，抗原肽的长度是至少5个，例如至少6个或至少7个氨基酸以及多至约10、11、12、15或20个氨基酸，或它们之间的任何量。在本发明某些实施方案中，抗原肽至少长度为25个或更少的氨基酸，例如20个或更少的氨基酸，15个或更少的氨基酸，14个或更少的氨基酸，13个或更少的氨基酸，12个或更少的氨基酸，范围的下限为例如3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在某些实施方案中，抗原肽长度为约5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸。
产生抗原肽的抗原可含有被T细胞、B细胞、NK细胞巨噬细胞上的表面结构，I类或II类APC(抗原递呈细胞)有关的细胞表面结构或其组合识别的表位。在某些实施方案中，抗原肽含有T细胞或CTL表位。如本领域已知的，T细胞表位和CTL表位被T细胞受体识别和结合，并且可位于抗原内部未暴露部位，在抗原蛋白酶解后成为T细胞受体可接近的。CTL表位还可在抗原表面被发现。各种与流感病毒有关的T细胞表位和CTL表位是本领域已知的。在一些实施方案中，所选的用于融合PapMV CP的抗原肽含有B细胞表位。如本领域已知的，B细胞表位被B细胞受体识别和结合。这种表位通常位于抗原表面上。各种与流感病毒有关的B细胞表位是本领域已知的。
在某些实施方案中，例如，当重组CP含有多于一个抗原肽时，所述抗原肽可含有T细胞表位或CTL表位与B细胞表位的组合。
已知的流感病毒抗原包括，例如那些来源于血细胞凝集素(HA)、神经醇胺酶(NA)、核蛋白(NP)、M1和M2蛋白的抗原。这些蛋白质的序列是本领域已知的，可便利地从美国国家生物信息中心(NCBI)维护的GenBank数据库处获得。适合的HA、NP和基质蛋白的抗原肽包括但不限于，含有一个或多个血细胞凝集素表位的片段：HA 91-108、HA 307-319和HA 306-324(Rothbard,Cell,1988,52:515-523)、HA458-467(J.Immunol.1997,159(10):4753-61)、HA 213-227、HA 241-255、HA 529-543和HA 533-547(Gao,al.,J.Virol.,2006,80:1959-1964)；核蛋白表位：NP 206-229(Brett,1991,J.Immunol.147:984-991)、NP335-350和NP380-393(Dyer和Middleton,1993,In:Histocompatibility testing,a practical approach(Ed.:Rickwood,D.andHames,B.D.)IRL Press,Oxford,p.292；Gulukota和DeLisi,1996,Genetic Analysis:Biomolecular Engineering,13:81)、NP305-313(DiBrino,1993,PNAS 90:1508-12)；NP 384-394(Kvist,1991,Nature 348:446-448)；NP 89-101(Cerundolo,1991,Proc.R.Soc.Lon.244:169-7)；NP 91-99(Silver等,1993,Nature 360:367-369)；NP380-388(Suhrbier,1993,J.Immunology 79:171-173)；NP 44-52和NP265-273(DiBrino,1993,ibid.)；和NP 365-380(Townsend,1986,Cell44:959-968)；基质蛋白(M1)表位：M1 2-22、M1 2-12、M1 3-11、M1 3-12、M1 41-51、M1 50-59、M1 51-59、M1 134-142、M1 145-155、M1 164-172、M1 164-173(所有描述见Nijman,1993,Eur.J.Immunol.23:1215-1219)；M1 17-31、M1 55-73、M1 57-68(Carreno,1992,MolImmunol 29:1131-1140)；M1 27-35、M1 232-240(DiBrino,1993,ibid.)、M1 59-68和M1 60-68(Eur.J.Immunol.1994,24(3):777-80)；和M1128-135(Eur.J.Immunol.1996,26(2):335-39)。
其它流感病毒蛋白的抗原区域和表位是已知的，例如，流感离子通道蛋白(M2)的片段，包括M2e肽(M2的胞外域)。该肽的序列在不同的流感毒株间是高度保守的。本发明的某些实施例中，抗原肽源自M2e肽。M2e肽序列的实例示于表1的SEQ ID NO：8。该序列的变体已被鉴定，该变体的一些实例也示于表1。
表1:M2e肽及其突变体
*见美国专利申请No.2006/0246092
A/马/马萨诸塞/213/2003(H3N8株)
#A/越南/1196/04(H5N1株)
在某些实施方案中，可使用整个的M2e的序列。在一些实施方案中，优选使用部分M2e序列，例如，在全部M2e变体中都保守的部分序列，如包含由2至10位氨基酸定义的区域的片段，或包含由6至13位氨基酸定义的区域的片段。
在某些实施方案中，抗原肽包含来自M2e的肽，所述M2e包含由6至13位氨基酸定义的区域，或其片段。由6至13位氨基酸定义的M2e的区域序列可被定义为：
E-V-X1-T-X2-X3-X4-X5[SEQ ID NO:95]，其中
X1为E或D；
X2为P或L；
X3为T或I；
X4为R或K，且
X5为N、S或K。
例如，在GenBank中可获得的84％的人类甲型流感毒株中发现了EVETPIRN表位[SEQID NO：13]。该序列的变体也已被鉴定，包括EVETLTRN[SEQID NO：14](9.6％)，EVETPIRS[SEQID NO：15](2.3％)，EVETPTRN[SEQID NO：16](1.1％)，EVETPTKN[SEQID NO：17](1.1％)以及EVDTLTRN[SEQID NO：18]，EVETPIRK[SEQID NO：19]和EVETLTKN[SEQ ID NO：20](每个0.6％)(参见Zou等,2005,Int Immunopharmacology,5:631-635；Liu等,2005,Microbes andInfection,7:171-177)。
因此，在某些实施方案中，抗原肽是M2e的衍生肽，包含一般序列E-V-X1-T-X2-X3-X4-X5[SEQ ID NO：95]，如上面所列举的那些或其片段。例示性的片段包括具有序列：V-X1-T-X2-X3-X4-X5[SEQ IDNO：96]的那些片段，例如，VETPIRN[SEQ ID NO:97]、VETLTRN[SEQID NO:98]、VETPIRS[SEQ ID NO:99]、VETPTRN[SEQ ID NO:100]、VETPTKN[SEQ ID NO:101]、VDTLTRN[SEQ ID NO:102]、VETPIRK[SEQ ID NO:103]和VETLTKN[SEQ ID NO:104]。
在某些实施方案中，选定的与PapMV CP融合的抗原肽包含长度为约5至约12，例如，约5至约10个氨基酸的M2e肽的部分。合适的M2e肽的部分包括如上所述的那些。在一些实施方案中，抗原肽包含长度为约5至约12，例如，约5至约10个氨基酸的M2e肽的部分。在一些实施方案中，抗原肽长度少于10个氨基酸，并且包含SEQ IDNO：95或96所示的一般序列，例如，序列EVETPIRNE[SEQ ID NO:21]或VETPIRN[SEQ ID NO:22]。在某些实施方案中，抗原肽可基本由序列EVETPIRNE[SEQ ID NO:21]或VETPIRN[SEQ ID NO:22]构成。
包含M2e肽的重组PapMV CP的非限制性例示实例包括，含有在SEQ ID NO：23中1-224位氨基酸；在SEQ ID NO：24中1-222位氨基酸；在SEQ ID NO：25中1-221位氨基酸；在SEQ ID NO：26中1-219位氨基酸；在SEQ ID NO：27中1-224位氨基酸；以及在SEQ IDNO：28中1-222位氨基酸中所公开的氨基酸序列的PapMV CP融合体；以及含有SEQ ID NO:23-28中任一序列所公开的氨基酸序列的那些。
在PapMV CP表面卷曲区域内的抗原肽融合体
根据本发明的某些实施方案，重组PapMV CP含有在预测的CP的N-末端的13个氨基酸内的随机卷曲内融合的一个或多个抗原肽(参见图16，其中CP的N-和C-末端的随机卷曲区域被标记为黑体)。
因此，本发明的某些实施方案提供重组PapMV CP，其中，一个或多个抗原肽融合在如SEQ ID NO:1所示的PapMV CP序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12位氨基酸所对应的位置之后。在一些实施方案中，用于融合蛋白制备的PapMV CP为突变体，其中，SEQ ID NO：l中1位的蛋氨酸已经被缺失或替换，从而表达出的CP的第一个残基为SEQ ID NO:1的5位的蛋氨酸。在这些实施方案中，包括在如SEQ ID NO:1所示的PapMV CP序列的6、7、8、9、10、11或12位氨基酸所对应的位置之后融合抗原肽。在某些实施方案中，可在如SEQ ID NO:1所示的PapMV CP序列的6、7、8、9或10位氨基酸所对应的位置之后融合抗原肽。在某些实施方案中，可在如SEQ IDNO:1所示的PapMV CP序列的6、7或10位氨基酸所对应的位置之后融合抗原肽。
在某些实施方案中，用于融合蛋白制备的PapMV CP具有如SEQID NO:4所公开的序列(图1C)，并且在SEQ ID NO:4的1、2、3、4、5、6、7或8位氨基酸之后融合一个或多个抗原肽。在一些实施方案中，融合蛋白可含有在如SEQ ID NO:4所示的PapMV CP序列的2、3、4、5或6位氨基酸之后融合的一个或多个抗原肽。在一些实施方案中，融合蛋白可含有在如SEQ ID NO:4所示的PapMV CP序列的2、3、4、5或6位氨基酸之后融合的一个或多个抗原肽。在一些实施方案中，融合蛋白可含有在序列如SEQ ID NO:4所示的PapMV CP的2、3或6位氨基酸之后融合的一个或多个抗原肽。
某些实施方案涉及在序列SEQ ID NO:1所示的PapMV CP的6、7或10位氨基酸所对应的位置之后，例如在序列如SEQ ID NO:4所示的PapMV CP的2、3或6位氨基酸之后融合M2e衍生肽的融合体。M2e衍生肽长度可为，如约5至10约个氨基酸，并且含有如上所述的序列。
某些实施方案涉及重组CP，其进一步包含在如SEQ ID NO:1所示的PapMV CP序列的185、186、187、188、189、190、191或192位氨基酸之后融合的抗原肽，和/或在位于CP的30个C-末端氨基酸内其他预测的随机卷曲中的一个内融合的抗原肽，和/或一或多个在CP的C-末端融合的抗原肽。
一些实施方案涉及重组CP，其进一步包含在如SEQ ID NO:1所示的PapMV CP序列的197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213或214位氨基酸之后融合的抗原肽，和/或在如SEQ ID NO:1所示的PapMV CP序列的185、186、187、188、189、190、191或192位氨基酸之后融合的抗原肽，和/或一或多个在CP的C-末端融合的抗原肽。
在某些实施方案中，重组CP含有在在单独的CP表面卷曲区域内融合至CP的一个抗原肽，或可选地，可含有在一个或多个CP表面卷曲区域的每个内融合的一个抗原肽，或它们可含有在二个或多个CP表面卷曲区域的每个内融合的一个抗原肽。任选地，重组CP可进一步含有在CP的C-末端融合的一个或多个抗原肽。
在某些实施方案中，重组PapMV CP包含在一或多个CP表面卷曲位点内与CP融合的不止一个相同抗原肽的拷贝，例如，不止一个相同抗原肽的拷贝可在单个的CP表面卷曲位点内融合，或不止一个相同抗原肽的拷贝可在一个或多个CP表面卷曲位点的每个内融合。任选地，重组CP可进一步含有在CP的C-末端融合的一个或多个抗原肽。
在那些实施方案中，其中，不止一个抗原肽与CP融合，所述抗原肽可相同或每个抗原肽均可不同。
在那些实施方案中，其中，在CP的一个位点融合抗原肽的多个拷贝，插入的总长度一般少于约50个氨基酸，例如，40个氨基酸或更少，35个氨基酸或少，30个氨基酸或更少，25个氨基酸或更少，20个氨基酸或更少，或15个氨基酸或更少。
在某些实施方案中，所选的抗原表位与一个或多个侧翼序列共同插入PapMV CP以辅助抗原肽的呈现。这种侧翼序列可存在于抗原肽的一侧或两侧。当侧翼序列位于两侧时，这些侧翼序列的氨基酸序列可相同或不同。侧翼序列使用时，长度通常为约1至约10个氨基酸，例如，约2至约10个氨基酸，约2至约9个氨基酸，约2至约8个氨基酸，约2至约7个氨基酸，约2至约6个氨基酸，约2至约5个氨基酸，或约3至约5个氨基酸。侧翼序列与含有CTL表位的抗原肽结合时可特别有用。一般来说，在那些使用侧翼序列的实施方案中，插入序列的整体长度保持在少于约50个氨基酸，例如，40个氨基酸或更少，35个氨基酸或更少，30个氨基酸或更少，25个氨基酸或更少，20个氨基酸或更少，或15个氨基酸或更少。
制备重组PapMV外壳蛋白
本发明提供含有一或多个抗原肽的重组PapMV CP。抗原肽与CP融合的遗传学方法是本领域已知的，包括在下文和实施例中描述的那些。将抗原肽交联到蛋白质上的化学方法也是本领域公知的，适合时可以使用。
重组PapMV外壳蛋白
根据本发明的重组PapMV CP可容易地由技术人员通过标准遗传工程技术，用野生型或亲本蛋白质序列来制备。基因工程改造蛋白质的方法是本领域所公知的(参见，例如Ausubel等(1994&更新)CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York)，野生型PapMV CP的氨基酸和核酸序列也是如此(参见，例如，SEQ ID NO：1和2)。
必要时，编码野生型蛋白质的核酸序列的分离和克隆可使用标准技术实现(参见，例如，Ausubel等，出处同上)。例如，核酸序列可经通过标准技术提取RNA，然后由RNA模板合成cDNA(例如，通过RT-PCR)，从PapMV中直接得到。PapMV可通过标准技术由显示出花叶症状的受感染植物叶片中纯化。
可选地，编码重组CP的核酸序列可通过已知的体外技术制备(参见，例如，Ausubel等，出处同上)。
然后将编码CP的核酸序列直接或再经一个或多个亚克隆步骤之后插入到适合的表达载体中。本领域技术人员应理解，所使用的确切载体对于本发明不是决定性的。合适载体的实例包括但不限于，质粒、噬菌粒、粘粒、噬菌体、杆状病毒、逆转录病毒或DNA病毒。
可选地，编码CP的核酸序列可通过本领域公知的标准体外定点诱变技术进一步工程化改造以引入一个或更多个突变，如以下所述的那些。可通过构成编码序列的适当核苷酸的一个或更多个缺失、插入、替换、倒位或其组合来引入突变。这可例如通过基于PCR的技术实现，针对其设计包含一个或更多个核苷酸错配、插入或缺失的引物。可通过多种标准技术来验证突变的存在，例如，通过限制性酶切分析或通过DNA测序来验证。
对重组PapMV CP进行工程化改造在所需位点插入一个或多个抗原肽，从而生产重组CP融合体。生产融合蛋白的方法是本领域技术人员公知的。编码融合蛋白的DNA序列可插入到上述的适合的表达载体。
本领域技术人员应理解，编码CP或融合蛋白的DNA可以以多种方式变化而不影响所编码蛋白质的活性。例如，DNA序列中的变化可用于根据表达蛋白质的宿主细胞中的密码子偏好性来进行优化，或者可包括有助于表达的其它序列改变。
本领域技术人员应理解，表达载体还可包含调控元件，例如有效转录编码衣壳蛋白或融合蛋白的DNA序列所需的转录元件。可合并到载体中的调控元件的实例包括但不限于，启动子、增强子、终止子和多腺苷酸化信号。因此，本发明的某些实施方案提供了包含与编码重组CP的核酸序列可操作性连接的调控元件。本领域技术人员应理解，合适调控元件的选择取决于为表达经遗传改造的CP所选的宿主细胞，并且这样的调控序列可源自多种来源，包括细菌、真菌、病毒、哺乳动物或昆虫基因。
在本发明的上下文中，表达载体可另外地包含有助于纯化所表达蛋白质的异源核酸序列。这些异源核酸序列可位于CP的羧基末端或者氨基末端。这些异源核酸序列的实例包括但不限于，亲和标签(例如，金属亲和标签)、组氨酸标签、亲和素/链霉亲和素编码序列、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)编码序列和生物素编码序列。核酸序列表达的相应氨基酸，可在使用之前根据本领域已知的方法从所表达的CP中移除。可选地，如果异源核酸序列表达的相应氨基酸不干扰到它的多聚化，则其可保留在CP上。
在本发明的一些实施方案中，CP表达为组氨酸标签化蛋白。所述组氨酸标签可位于CP的羧基末端或氨基末端。在某些实施方案中，所述组氨酸标签位于CP的羧基末端。
可通过本领域已知的多种方法之一将表达载体引入到合适的宿主细胞或组织中。这样的方法在Ausubel等(出处同上)中进行了一般性的描述，并且包括例如，稳定转染或瞬时转染、脂质体转染、电穿孔和用重组病毒载体感染。本领域技术人员应理解，用于表达CP的适当宿主细胞的选择取决于所选择的载体。宿主细胞的实例包括但不限于，细菌、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞。所使用的确切宿主细胞对于本发明不是决定性的。重组CP可在原核宿主(例如，大肠杆菌、杀鲑气单胞菌(A.salmonicida)或枯草杆菌(B.subtilis))中或在真核宿主(例如，酵母属(Saccharomyces)或毕赤酵母属(Pichia)；哺乳动物细胞，例如，COS、NIH3T3、CHO、BHK，293或HeLa细胞；或昆虫细胞)中表达。在一个实施方案中，重组CP在原核细胞中表达。
如果期望，则重组CP可通过本领域已知的标准技术从宿主细胞中纯化(参见，例如，Current Protocols in Protein Science，Coligan，J.E.等编，Wiley&Sons，New York，NY)，并且任选地，可通过标准肽测序技术使用完整蛋白质或其蛋白水解片段进行测序以确定蛋白质的身份。
制备VLP
可用于在本发明的上下文中的重组PapMV CP可组装成VLP。在本发明的某些实施方案中，重组CP可以在表达CP的宿主细胞内组装成VLP。可通过标准技术从宿主细胞中分离VLP，这些技术如描述于Denis等,2007,Virology,363:59–68；Denis等,2008,Vaccine,26；3395-3403，以及Tremblay等,2006,FEBS,273:14-25。一般情况下，从宿主细胞获得的分离物含有VLP、盘(disc)以及CP的较低组织性形式(例如，单体和二聚体)的混合物。
在某些实施方案中，PapMV VLP还可从宿主细胞中分离重组PapMV CP的低分子量形式(为主要的，但不是完全是单体)，并且可使CP在体外组装进行制备，如描述于国际专利申请No.PCT/CA2012/050279(WO 2012/155262)。根据这种方法，重组CP和ssRNAA在蛋白质：RNA重量比约1:1至50:1的比例，pH值为约6.0至约9.0，温度为约2℃至约37℃下结合足够时间，以使得组装成VLP。随后，用核酸酶处理VLP以去除颗粒上的任何RNA突起，然后，任选地与其他加工元件分离。这种体外的方法可提供多达约80％的重组CP转化成VLP。
VLP可从许多具有相同氨基酸序列的重组CP中制备，这样最终的VLP包含相同的CP亚单位，或者，VLP可从许多具有不同氨基酸序列的重组CP中制备，这样最终的VLP在其CP亚单位中包含突变。
需要时，可将VLP与其它CP元件分离，例如，通过超速离心法或凝胶过滤层析法(例如，使用Superdex G-200)以提供基本上纯的VLP产物。在这方面，“基本上纯”指该产物含有70％或更多的VLP，例如，75％或更多，80％或更多，85％或更多，或它们之间的任何量。然而，当考虑到各种形式的CP的混合物可用于最终的疫苗组合物中，优选地，使用基本上纯的VLP产物。
在某些实施方案中，使用含有VLP和盘的重组CP制备物(preparation)。这些可通过，例如利用表达的重组CP，其含有VLP和盘，经过或不经过透析和/或浓缩步骤进行制备。
VLP可通过标准技术，如色谱法，进一步纯化以去除污染性的宿主细胞蛋白或其他化合物如LPS。在本发明的一个实施方案中，纯化VLP以去除LPS。
表征重组外壳蛋白
可通过标准技术，例如用电子显微镜将纯化的重组蛋白可视化来分析重组CP组装成VLP的能力(参见，例如，本文提供的实施例)。也可通过超速离心法确定VLP的形成，并且如果需要，圆二色谱(CD)分光光度法也可用于比较重组蛋白与野生型病毒的二级结构。VLP的大小可以用动态光散射(DLS)来评估。
如果需要，可通过本领域已知技术，如SDS-P AGE和蛋白酶K降解分析技术，来确定VLP的稳定性。可通过，如CD分光光度法和/或DLS来评估VLP的热稳定性(如示例中所述)。
在本发明的某些实施方案中，重组PapMV VLP在升高的温度下是稳定的。在一些实施方案中，重组PapMV VLP在升高的温度下是稳定的，并且易于室温储存。在一些实施方案中，例如，如通过动态光散射(DLS)评估，重组PapMV VLP在25℃或更高温度下，例如，30℃或更高温度下，35℃或更高温度下，37℃或更高温度下是稳定的。
从重组PapMV CP中形成的PapMV VLP包含CP亚单位的长螺旋阵列。野生型病毒含有超过1200个CP亚单位，长度约为500nm。然而，短于或长于野生型病毒的PapMV VLP仍然能够是有效的。在本发明的一个实施方案中，从重组PapMV CP中形成的VLP包含至少40个CP亚单位。在另一个实施方案中，从重组PapMV CP中形成的VLP包含约40个至约1600个CP亚单位。在一个可选的实施方案中，从重组PapMV CP中形成的VLP长度至少为40nm。在另一个实施方案中，从重组PapMV CP中形成的VLP长度为约40nm至约600nm。
效力评价
含有重组PapMV CP的VLP在诱导针对重组CP所含抗原肽的免疫反应的效力，可通过各种本领域已知的体内和体外标准技术进行评估。
例如，对于体内测试，试验动物(如小鼠)组可通过标准技术接种VLP。平行设置对照组，所述对照组包括未接种动物和/或用抗原肽、市售疫苗或其他阳性对照接种的动物。接种前和接种后收集动物血样，然后分析针对抗原的抗体反应。适合的抗体反应的测试包括，但不限于Western印迹分析和酶联免疫吸附测定(ELISA)。
为进一步评估含有重组PapMV CP的VLP作为疫苗的效力，可进行激发研究。按如上所述接种动物，并且在接种疫苗适当时间之后，用引起疾病的目标药剂，如流感病毒对动物进行激发。收集血样并进行分析。还可监控动物与感染有关的其它疾病状况的发展，如体温、体重等。在某些情况下，例如，当使用特定的流感病毒毒株时，存活率也是一个合适的标记。屠宰动物后，还可用标准技术测量肺病毒滴度来评估感染的程度。
如果需要，还可通过本领域已知的技术评估细胞免疫反应。例如，通过体内和体外的树突细胞针对特异性T淋巴细胞加工和交叉递呈在PapMV VLP上表达的表位。其它用于评估诱导细胞免疫(T淋巴细胞)的有用技术包括监测T细胞扩张和IFN-γ分泌释放，例如，采用酶联免疫法监测细胞因子的诱导。
药物组合物和疫苗制剂
本发明某些实施方案涉及含有VLP以及一种或多种药学可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂的药物组合物，所述VLP包含重组PapMVCP。若需要，组合物中可包含其他活性成分、佐剂和/或免疫增强剂。在某些实施方案中，该药物组合物可并入或配制成疫苗。
药物组合物和/或疫苗可配制用于通过多种途径给药。例如，所述组合物可配制用于经口、局部(topical)、直肠、经鼻或胃肠外给药或者用于通过吸入或喷雾给药。本文中使用的术语胃肠外包括皮下注射、静脉内、肌内、鞘内、胸骨内注射或输注技术。向对象鼻内给药包括向对象的鼻道或鼻腔的黏膜给予药物组合物。在某些实施方案中，所述药物组合物配制用于胃肠外给药或通过吸入或喷雾给药，例如通过鼻内途径。在一些实施方案中，所述药物组合物配制成用于胃肠外给药。
所述组合物优选含有有效量的包含重组PapMV CP的VLP。本申请中所用的术语“有效量”是指能诱导可检测的免疫反应所需的VLP的量。用于给定适应证的VLP的有效量可进行初始评估，例如，在细胞培养试验或者动物模型，通常为啮齿动物、兔、狗、猪或灵长类中。还可用动物模型确定适合的浓度范围和给药途径。然后，可使用该信息确定在处理的动物包括人类中的有用给药剂量和给药途径。在本发明的一个实施方案中，单位剂量包括约10μg至约10mg的蛋白质。在另一个实施方案中，单位剂量包括约10μg至约5mg的蛋白质。在又一个实施方案中，单位剂量包括约40μg至约2mg的蛋白质。可用一种或多种剂量免疫动物，可在同一天或在几天或几周的过程中给药。在某些实施方案中，疫苗组合物的单次剂量足以提供保护作用。在某些实施方案中，还包括在合适间隔进行一次或多次加强注射。
口服的组合物还可配制成如片剂、锭剂、糖锭、水或油悬浮剂、可分散性粉剂或颗粒剂、乳化的硬或软胶囊剂、或糖浆剂或酏剂(elixir)。可根据本领域已知的用于制备药物组合物的标准方法制备该组合物，并且为提供药学高品质和可口的制剂，可包含一种或多种选自以下药剂：甜味剂、调味剂、着色剂以及防腐剂。片剂含有的VLP与包括下述的适合的无毒药学可接受的辅料混合：例如，惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；制粒剂和崩解剂，如玉米淀粉或海藻酸；粘结剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉等。片剂可未经包被，或用已知技术进行包被以延迟崩解和在胃肠道的吸收，并从而提供较长时期的持续作用。例如，可用延时材料，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
用于鼻腔给药的组合物可包括，例如喷鼻剂、滴鼻剂、悬浮液、溶液、凝胶剂、软膏剂、乳霜剂和粉剂。组合物可制备成通过合适的市售喷鼻设备给药的制剂，如AccusprayTM(Becton Dickinson)。其它鼻腔给药的方法是本领域已知的
配制成水性悬液的组合物可包含与一种或多种合适赋形剂相混合的PapMV VLP，例如，与助悬剂、分散剂或润湿剂相混合，所述助悬剂如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基-β-环糊精、黄蓍胶和阿拉伯胶，所述分散剂或润湿剂如天然磷脂例如卵磷脂，或环氧烷(alkylene oxide)与脂肪酸的缩合产物如硬脂酸聚氧乙烯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物如十七碳环氧乙烷基鲸蜡醇，或环氧乙烷与由脂肪酸和己糖醇衍生的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯，或环氧乙烷与由脂肪酸和己糖醇酐衍生的偏酯的缩合产物，如聚乙烯山梨醇酐单油酸酯。水性混悬剂还可包含一种或多种防腐剂(例如，对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯)、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂或者一种或多种甜味剂(例如，蔗糖或糖精)。
可通过将所述VLP悬浮于植物油(例如，花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(例如，液体石蜡)中将药物组合物配制成油性混悬剂。油性混悬剂可包含增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。这些组合物可通过添加抗氧化剂如抗坏血酸保存。
所述组合物可配制成可分散性粉剂或颗粒剂，其随后可通过添加水来用于制备水性悬液。所述可分散性粉剂或颗粒剂提供与一种或多种分散剂或润湿剂、助悬剂和/或防腐剂混合的所述VLP。合适的分散剂或润湿剂以及助悬剂已经通过上文提到的那些进行了示例。
本发明的药物组合物可配制成水包油乳剂。油相可以是植物油如橄榄油或花生油，或矿物油如液体石蜡，或者油相可以是这些油的混合物。这些组合物中包含的合适乳化剂包括天然树胶，例如阿拉伯胶或黄蓍胶；天然磷脂，例如大豆，卵磷脂；或由脂肪酸和己糖醇、酸酐衍生的酯或偏酯，例如山梨醇酐单油酸酯，以及所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。
可根据本领域中已知的方法，并使用一种或多种合适分散剂或润湿剂和/或助悬剂(例如上文提到的那些)将所述药物组合物配制成无菌可注射的水性或油性悬液。所述无菌可注射制剂可以是无毒的胃肠外可接受稀释剂或溶剂如1,3-丁二醇溶液中的无菌可注射的溶液或悬液。可使用的可接受载体和溶剂包括但不限于，水、林格氏液、乳酸林格氏液和等渗氯化钠溶液。其他实例包括无菌固定油(其通常用作溶剂或助悬介质)和各种温和固定油，包括例如合成的甘油一酯或甘油二酯。在可注射剂的制备中还可使用脂肪酸，例如油酸。
任选地，本发明的组合物可包含防腐剂(例如抗微生物剂)、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体和/或稳定剂，例如与合适缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)一起的碳水化合物(例如，山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖或葡聚糖)、蛋白质(例如，白蛋白或酪蛋白)或含蛋白质的试剂(例如，牛血清或脱脂乳)。可根据众所周知的参数调节组合物的pH和各种成分的确切浓度。
进一步地，一种或多种具有佐剂活性的化合物可任选添加到组合物中。适合的佐剂包括，例如明矾佐剂(如氢氧化铝、磷酸铝或氧化铝)；油乳剂(如Bayol或的油乳剂)；皂甙，或维生素E加溶物。根据本发明，病毒颗粒也已知具有佐剂特性(Adjuvant andAntigen Delivery Properties of Virosomes,Glück,R.,等,2005,CurrentDrug Delivery,2:395-400)，并且可与多聚体组合使用。
如前所示，PapMV和PapMV VLP具有佐剂特性。因此，在本发明一个实施方案中，所述组合物可包含额外的PapMV或PapMV VLP作为佐剂。在一些实施方案中，使用PapMV或PapMV VLP可提供的优于市售佐剂的优势在于，已经观察到当注射给药时，PapMV或PapMV VLP不会导致明显的局部毒性(参见，例如国际专利申请No.WO2008/058396)。
其他药物组合物和制备药物组合物的方法是本领域中已知的，并且描述在例如“Remington:The Science and Practice of Pharmacy”(原名“Remingtons Pharmaceutical Sciences”)；Gennaro,A.,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA(2000)中。
应用&用途
本发明涉及含有重组PapMV CP的VLP的多种应用和用途。本发明的某些实施方案涉及VLP在诱导针对流感病毒的保护性免疫中的用途。某些实施方案还提供用VLP免疫对象以抗流感的方法。本发明的一些实施方案涉及用于向对象预防性给药以降低感染流感风险的含有VLP的疫苗。
本发明一些实施方案涉及所述VLP在制备包括疫苗的药物，和/或药物组合物中的用途。
本发明的某些实施方案涉及含有重组CP的VLP在诱发对象针对流感病毒的体液免疫反应中的用途，例如，在一些实施方案中，重组CP含有包括B细胞表位的抗原肽，并且适用于诱发对象的体液免疫反应。
在一些实施方案中，所述重组CP含有包括B细胞表位或CTL表位的抗原肽，并且适用于作为疫苗诱发对象的细胞免疫反应
本发明的某些实施方案涉及包含VLP的疫苗，以提供针对不止一种流感毒株的保护性。
本发明的某些实施方案涉及VLP在诱发人的保护性免疫反应中的用途。本发明的一些实施方案涉及在诱发非人类动物，包括家养和农场动物的保护性免疫反应中的用途。VLP的给药方案无需有别于其它任意常规可接受的疫苗接种程序。可用足以引发有效免疫反应的量进行VLP的单次给药，任选地，还可使用其它方案：重组VLP的初始给药后，再用适合的单独抗原或用VLP进行一次或多次加强注射。同样地，如果抗体滴度低于可接受的水平，在初始给药之后，可多次进行适合的单独抗原或用VLP的加强注射。有经验的从业者可易于确定适合的给药方案。
药物包&试剂盒
本发明的一些实施方案涉及包含VLP的药物包或试剂盒，所述VLP含有重组CP。还提供含有编码一种或多种重组CP的核酸的试剂盒。试剂盒的各个组分可用单独的容器进行包装，并且与这些容器一起的可以是这样的形式的贴示(notice)，其由管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机关制订，所述贴示反映制造、使用或销售是经所述机关批准的。试剂盒可任选地包含指出VLP的使用方法或给药方案，或者从编码重组CP的核酸制备所述VLP的说明或指示。
当试剂盒的一种或多种组分以溶液，例如，水溶液或无菌水溶液的形式提供，容器器具本身可以是吸入器、注射器、移液管、滴眼器(eye dropper)等其他这样的装置，从其中溶液可给予至对象或者应用至药物试剂盒的其他成分并且与其混合。
试剂盒的成分还可以以干燥或冻干形式提供，并且试剂盒可额外包含用于重构冻干成分的合适溶剂。不论容器的数量或种类如何，本发明的试剂盒还可包含辅助向患者给予所述组合物的工具。这样的工具可以是吸入器、鼻喷雾装置、注射器、移液管、镊子、称量匙、滴眼器或类似的医学上批准的递送运载物。
为了更好的理解本文描述的本发明，给出了以下实施例。应理解，这些实施例旨在描述本发明示例的实施方案，而不是旨在以任何方式限制本发明的范围。
实施例
在实施例部分，描述了抗原肽在PapMV CP各个位置融合的融合体。这些实施例中提及的位置基于图1C(SEQ ID NO:4)中所示的N-末端缺失序列内的位置。涉及的位置8、29、80、118、130、158和183(参考SEQ ID NO:4)分别与野生型序列[SEQ ID NO:1；图1A]的位置12、33、84、122、134、162和187类似。
实施例1:融合流感M2e肽的重组PAPMV外壳蛋白的制备和评估
已经研究了在CP的不同区域与HA11表位融合时，PapMV外壳蛋白(CP)的表达能力，结果参见Rioux等(2012,PLoS ONE,7(2):e31925)。发现在PapMV CP[SEQ ID NO:4]的80位氨基酸或130位氨基酸之后融合HA11肽会导致蛋白的不稳定，而在29、118或158位氨基酸之后融合HA11肽会导致重组蛋白产量低下。然而，在PapMVCP的8位、183位氨基酸之后或在C-末端融合HA11肽，导致重组CP的产量高。这些重组蛋白还可自我组装成VLP，并且，含有在8位氨基酸之后的HA11融合体的VLP在小鼠中能引发针对HA肽的免疫反应。
此前已经描述了携带有在PapMV CP的C-末端融合的M2e肽(28a.a.)融合体的VLP(Denis等,2008,Vaccine 26:3395–3403)，并且表明引发了小鼠针对M2e肽的免疫反应，针对流感病毒激发产生了保护性水平，其进一步通过添加PapMV VLP(没有融合的肽)进行改良。通过动态光散射(DLS)分析PapMV-M2e-C VLP表明，这些VLP在超过30℃的温度下是不稳定的，表明在C-末端融合该肽不是最佳选择(见Rioux等，出处同上)。
为了增加携带有M2e肽的PapMV VLP的稳定性，Rioux等(出处同上)还制备了含有在CP[SEQ ID NO:4]的8位氨基酸之后融合的M2e肽(SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSS；SEQ ID NO:7)的构建体。虽然重组CP表现出稳定性，但不能组装成VLP。
据推测，更短的M2e肽的融合体对于CP自组装的影响更小，并且可生产稳定且具有免疫原性的VLP。为了研究这一推测，进行M2e肽中央部分的融合，特别使用序列EVETPIRNE[SEQ ID NO:21]和VETPIRN[SEQ ID NO:22]。制备了10个含有融合M2e衍生肽(EVETPIRNE[SEQ ID NO:21]或VETPIRN[SEQ ID NO:22])的PapMV外壳蛋白的构建体。8个构建体(构建体#1-8)含有外壳蛋白在N-末端区域的融合以及2个构建体(构建体#9和#10)含有在N-末端区域的融合(参见表2和图5)。8个构建体(构建体#1-6，#9和#10)表现出合适的大小，热稳定性和形成VLP的能力(参见图6和7)。将这8个构建体注射到小鼠中，以评估它们引起免疫反应的能力。出人意料地，除了构建体#9和#10，其它构建体仅一次免疫后就产生了强烈的体液免疫反应。相比之下，在第二次免疫之后，仅构建体#1观察到了抗体水平的增加。从这些结果中可以看出，对于M2e肽，融合的位置以及肽长度可导致外壳蛋白结构的改变，从而影响构建体对于免疫系统的刺激。
这些结果表明，构建体#1能引发最佳的体液免疫反应，可用作通用甲型流感疫苗的适合候选物。
表2：动态光散射(DLS)评估的VLP大小
*参考SEQ ID NO:4。
参见Denis等.2008,Vaccine,26:3395-3403。
方法:
使用pET3D载体，用1mM IPTG诱导，在E.coli BL219DE3中表达重组蛋白。用如上文所述的Denis等，2008，Vaccine,26；3395-3403中的方法纯化重组蛋白。在25℃下，蛋白的表达进行了16个小时。用French Press法裂解菌团，离心(20min，l0000g)澄清，并加载在Ni2+柱(IMAC)上。用500mM至1M的咪唑从IMAC柱上洗脱吸附的重组蛋白。使用去垢剂(TX-1001-2％+Zwittergent 1％)去除LPS。洗脱后，用10mM Tris HCl(pH8)透析去除咪唑。透析之后，以100 000g超速离心90min，恢复PapMV VLP。将含有VLP的团块重悬于10mMTris HCl(pH8.0)，浓度为lmg/ml。
为了确认所述蛋白质已经正确形成VLP，通过将染料(SyproOrange)结合到疏水残基上以测定蛋白的局部变性，当温度达到蛋白质的变性起始点，所述疏水残基就会暴露出来。为了还能进一步分析，VLP需要在37℃是稳定的。发现几个构建体均是稳定的，并列入下一步评估(图6)。通过电镜观察证实了不同构建体的杆状结构(图7)。
用VLP一次或两次肌肉内免疫小鼠，在体内评估了针对M2e肽的免疫反应。在第14天(一次免疫后)和第28天(两次免疫后)监测了体液免疫反应(总的IgG和IgG2a)。
结果：
构建体的评价结果示于表7和图6-8。表3提供了构建体#1-6的序列[SEQ ID NO:23-28]。
图6表明，构建体#1、#2、#3、#4、#5和#9具有高达40℃的热稳定性；#6和#10具有高达38℃的热稳定性，以及PapMV-M2e的稳定性达37℃。构建体#7和#8分别在32-34℃变得不稳定。
图7表明，所有热稳定的构建体(#1、#2、#3、#4、#5、#6、#9和#10)可形成VLP，且具有相似的大小和形状。
图8表明，除了构建体#9和#10，所有热稳定的构建体均可在一次免疫后产生强烈的体液免疫反应。仅构建体#1在二次免疫后，增加了IgG抗体水平(A)。大多数组在二次免疫后，观察到了IgG2a抗体亚型的水平增加(B)。
讨论:
所有构建体都形成VLP，除了构建体#7形成盘。这可能是由于M2e肽插入位置导致的，其可能改变了外壳蛋白的结构而阻止了其多聚化并形成VLP的能力。
为诱导针对融合肽的免疫反应，注射的蛋白质必须在动物体内温度(37℃-图6中红色标线表示的)下是热稳定。与Sypro Orange的反应使得通过荧光增加量的测量可鉴定蛋白变性的点。只有两个构建体，#7和#8，达到目标温度前就变性。
为确认表2所示通过DLS获得的结果并可视化颗粒的形态，获得了透射电子显微图像。所有的热稳定构建体均观察到了杆状结构(#1、#2、#3、#4、#5、#6、#9和#10)(图7)。杆状的VLP是所需的，因为它们更具有免疫原性。
为了比较每个融合体的免疫原性，用每次免疫后14天收集的血清，进行M2e肽的ELISA测定。与预期结果相反，除构建体#1外，二次免疫后没有增加IgG抗体水平(图8A)。大多数组在二次免疫后，观察到了IgG2a抗体亚型的水平增加(图8B)
最终，构建体#1-6，#9和#10满足了所有结构选择标准，但仅构建体#1-6能产生M2e表位特异性免疫反应。构建体#1产生针对M2e肽的更好的体液免疫反应，表明在SEQ ID NO:4的2位后融合M2e肽导致外壳蛋白中较少的结构改变。结果还表明，构建体#1中使用的最长表位EVETPIRNE[SEQ ID NO:21]，产生更多渴望的针对天然M2e抗原的抗体。
实施例2：在沙门氏菌微孔蛋白(porin)抗原肽的不同位置融合的重组PapMV CP的生物化学与生物物理表征
用伤寒沙门氏菌的B细胞表位制备CP重组融合蛋白：源自微孔蛋白OmpC的环6肽(GTSNGSNPSTSYGFAN[SEQ ID NO:29])。环6表位源自OmpC微孔蛋白，一种伤寒沙门氏菌的膜结合蛋白(伤寒热的药物)，其暴露在细菌的表面，并已被证明能够参与用微孔蛋白免疫引发的保护机制(Paniagua-Solís等,1996,FEMS Microbiol Lett.,14:31-6)。这些区域仅存在于伤寒沙门氏菌的微孔蛋白中，因此，没有发现与其它革兰氏阴性菌的微孔蛋白的交叉反应。
制备携带融合于PapMV CP的8位、183位或C-末端的环6肽融合体的蛋白(见表9A)。各个融合体命名为PapMV CP Loop6-8、PapMVCP Loop6-183以及PapMV CP Loop6-C。按下述方法进行克隆、在大肠杆菌中表达、纯化、SDS-PAGE、VLP分离以及重组蛋白的DLS分析。
用PCR方法，将环6肽融合于PapMV CP基因的不同位置，寡核苷酸示于下述表3中。简而言之，使用含有编码CP突变体“PapMVCPsm”的核酸序列的质粒pET-3D作为PCR模板。PapMV CPsm携带有5个N-末端氨基酸的缺失，并在C-末端包含6×His标签。在6×His标签和C-末端之间包含多克隆位点，从而包含SpeI和MluI限制性酶切位点，导致在这一位置增加5个氨基酸(TSTTR)(见图1D；SEQID NO:3)。
使用表3中所示的各个引物组合，用于诱导融合，并生产含有整个质粒(含有PapMV CPsm工程化蛋白)的PCR产物。所述PCR产物是线性dsDNA产物，进一步用限制性酶Acc651(New EnglandBiolabs,Ipswich,MA)(表3中下划线标出)消化。通过热处理或者酚/氯仿抽提使限制性酶失活。产生的消化后的DNA用T4 DNA连接酶自连。连接产物形成含有新的工程化PapMV CP的完全感受态的质粒。通过DNA测序确认序列。用质粒转化大肠杆菌BL21，用于表达和纯化蛋白。
表3.寡核苷酸序列
用前述方法，并作一些小的改动，表达和纯化PapMV构建体(Tremblay等,2006,FEBS,273:14-25)。简而言之，用French Press法裂解细菌，然后加载在Ni2+柱上，用10mM Tris–HCl/50mM咪唑/0.5％Triton X100(pH 8)洗涤，然后用10mM Tris–HCl/50mM咪唑/1％Zwittergent(pH 8)去除内毒素污染。蛋白洗脱以后，所述溶液再用6-8kDa截留分子量膜(Spectra)，对Tris-HCl 10mM(pH 8)透析12-16小时。在Beckman 50.2 TI转子中，对透析后的蛋白进行高速离心(100,000g)，45min。将VLP颗粒团重悬于无内毒素PBS(Sigma-Aldrich)中。使用前，用0.22-0.45μM过滤膜过滤蛋白溶液。通过SDS–PAGE确定蛋白纯度。使用BCA蛋白试剂盒(Pierce)评估蛋白的量。通过SDS–PAGE确定每个重组蛋白的表达水平。根据商家的使用说明书(Cambrex)，用鲎试验评估纯化的蛋白质中的LPS污染，结果少于5EU/mg重组蛋白。
通过在TEM(JEOL-1010,东京,日本)上的观察确认含有环6融合体的VLP的大小和结构。还使用动态光散射(DLS)确认VLP的平均尺寸。
结果
结果如图9所示。图9B描述了重组PapMV CP融合蛋白的SDS-PAGE分析，其中泳道1含有诱导前的细菌裂解物；泳道2含有表达蛋白PapMV Loop6-8后的细菌裂解物；泳道3含有纯化的PapMVLoop6-8；泳道4含有诱导前的细菌裂解物；泳道5含有表达蛋白PapMV Loop6-183后的细菌裂解物；泳道6含有纯化的PapMVLoop6-183；泳道7含有诱导前的细菌裂解物；泳道8含有表达蛋白PapMV Loop6-C后的细菌裂解物；泳道9含有纯化的PapMV Loop6-C；所有情况中，重组蛋白在大肠杆菌中都能很好地表达，并易于在Ni2+上通过亲和层析纯化。
图9C展示了含有PapMV Loop6-8、PapMV Loop6-183和PapMVLoop6-C的VLP的电镜图。图9D展示了含有PapMV Loop6-8、PapMVLoop6-183和PapMV Loop6-C的VLP的动态光散射(DLS)结果，确认了携带环6表位融合体的所有构建体的VLP平均尺寸约为80nm。
实施例3:含有重组PapMV CP-环6肽融合体的VLP引发体液免疫反应的能力
下述实验用于评估含有CP融合蛋白的PapMV VLP(实施例2所述)引发小鼠体液免疫反应的能力。
简而言之，每组5只小鼠，用每个不同VLP(实施例2所述)100μg进行免疫，除了用PapMV Loop6-C VLP免疫的组，其为4只小鼠。
在第28天，将小鼠放血，使用融合环6合成肽的GST蛋白，用标准的ELISA方法评估免疫反应。用PapMV VLP(0.1μg/mL)进行ELISA来评估抗PapMV反应，用环6肽进行ELISA来评估抗环6肽反应。随后进行常规程序，见Denis等(2008,Vaccine,26；3395-3403)。
结果
结果示于图10，确认了携带有环-6融合体的PapMV平台具有高度免疫原性。当用含有PapMV CPsm、PapMV CP Loop6-8、PapMV CPLoop6-183和PapMV CP Loop6-C中任一种的VLP免疫动物时，引发了PapMV特异性总IgG的产生(图10A)，尽管PapMV CP Loop6-183构建体指向平台的IgG2a滴度很低(图10B)。只有PapMV Loop6-C VLP引发了针对环-6肽的可检测的总IgG反应(图10C)。没有VLP引发了针对环-6肽的可检测的总IgG2a反应(图10D)。由于所有的VLP均具有高度免疫原性，因此，有可能是由于环-6肽融合至CP影响了肽的结构，所以针对融合肽的抗体不与游离的肽(ELISA中所使用的)反应。然而，在C-末端的融合似乎并没有影响肽的结构，从一些用PapMVLoop6-C VLP免疫的小鼠中获得的IgG差不多可以结合ELISA中的游离肽。由于并不是所有的PapMV Loop6-C VLP免疫的小鼠均可以增加免疫反应，有可能是由于小鼠的免疫组库彼此不同，这是在这种实验中经常观察到的影响。
实施例4:含有融合CTL表位的重组PAPMV外壳蛋白的VLP的制备
下述实验描述了融合CTL表位(源自流感病毒的高度保守的NP蛋白)的重组PapMV CP的制备。该肽(TYQRTRALV[SEQ ID NO:36]，也被称作NP147-155)为Balb/c的H-2d CTL表位，其可用于在小鼠模型中诱导流感病毒感染引起的保护性CTL反应(Fu等,1997,J.Virol.,71:2715-2721；Tao等,2009,Antiviral Research,81:253-160)。因此，选择该肽用来评估PapMV VLP在Balb/c小鼠模型中诱导IFN-γ细胞免疫反应的能力。
制备携带有在PapMV CP的8位、183位或C-末端融合NP CTL肽的蛋白质(分别为PapMV NP-8、PapMV NP-183和PapMV NP-C)。用PCR方法，将NP肽融合于PapMV CP基因的不同位置，寡核苷酸示于下述表4中。使用实施例2和3中所述的方法克隆、在大肠杆菌中表达、SDS-PAGE分析、VLP的纯化和制备。通过超高速离心从VLP中分离盘(如描述于Denis等,2007,Virology,363:59–68，以及Denis等,2008,Vaccine,26；3395-3403)。
表4.寡核苷酸序列
结果
结果示于图11。制备了在所述蛋白的8位、183位氨基酸之后以及C-末端插入CTL表位的三个不同的重组PapMV CP融合体(图11A)。如图11A所示，在CTL表位的每一侧添加5个侧翼氨基酸(NLNDA[SEQ ID NO:43]以及RTGMD[SEQ ID NO:44])，以确保在小鼠的抗原递呈细胞(APCs)中CTL表位的充分加工。
图11B展示了融合蛋白的SDS-PAGE分析，其中，各泳道含有下述：泳道1：诱导前的细菌裂解物；泳道2：表达了蛋白PapMV NP-8后的细菌裂解物；泳道3：纯化的PapMV NP-8；泳道4：诱导前的细菌裂解物；泳道5：表达了蛋白PapMV NP-183后的细菌裂解物；泳道6：纯化的PapMV NP-183；泳道7：诱导前的细菌裂解物；泳道8：表达了蛋白PapMV NP-C后的细菌裂解物；泳道9：纯化的PapMVNP-C。观察到三个构建体的高水平表达，并且所有的工程化PapMV融合体都能形成VLP(图11C)。通过DLS评估了每个融合蛋白所形成的盘和VLP的大小(图11D)。所有的VLP展现了期望的评价长度，约为90nm(例如，PapMV NP-8为80nm，PapMV NP-C为88nm)。所有构建体的盘展现了平均直径约为30nm(例如PapMV NP-8为28nm，PapMV NP-C为32nm)。
实施例5:含有重组PAPMV CP-NP融合体的VLP引发CTL免疫反应的能力
PapMV-NP构建体的免疫程序
5只6-8周大的BALB/c小鼠(Charles River,威明顿,MA)用100μg重组PapMV CPsm、PapMV NP-8、PapMV-NP-183和PapMV NP-C每隔两周腹腔内(i.p.)免疫，免疫3次。同样用携带有相同融合的VLP或者盘免疫小鼠。最后一次加强免疫后的两周，将小鼠处死，按如下所述移除脾脏，分离脾细胞。
ELISPOT和IFN-γ的分泌
在分离脾细胞的前一天，用100μl/孔的稀释于DPBS(Abcam,剑桥,MA,USA)中的捕获IFN-γ抗体于4℃包被乙醇处理的MultiScreen-IP不透明96孔板(高蛋白结合Immobilon-P膜,Millipore,贝德福德,MA)过夜，如鼠γ-干扰素试剂盒(Abcam,剑桥,MA,USA)制造商所建议的。过夜孵育后，用每孔200μl的PBS洗涤板三次，用每孔100μl的2％脱脂奶粉PBS溶液于37℃、5％CO2封闭2h。
最后一次加强免疫后的两周，将小鼠处死，无菌移除脾脏。在培养基中粉碎脾脏，使匀浆物通过100-μm的细胞过滤筛。将细胞离心5min，并移除红细胞。在氯化铵-钾裂解缓冲液(150mM NH4Cl,10mMKHCO3,0.1mM Na2EDTA(pH 7.2-7.4))中室温孵育。分离的无红细胞的脾脏细胞用PBS洗涤两次，并稀释于培养基(添加25mM HEPES、2mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸铵、1mM 2-巯基乙醇、10％热失活胎牛血清、100U/ml青霉素以及100μg/ml链霉素的RPMI 1640(Invitrogen,加拿大))。用仅培养基或NP147–155肽(5μg/ml)，每孔2.5×105个细胞，5％CO2将两份平板重新活化并培养36h。孵育结束后，每孔用200μl的PBS/0.1％Tween 20手动洗涤所述平板三次。每孔加入100μl的PBS/1％BSA中的生物素化的检测抗-鼠IFN-γ抗体，于37℃、5％CO2孵育平板90min。用PBS手动洗涤平板三次，每孔加入100μl的稀释于PBS/1％BSA的缀合有链霉素-碱性磷酸酶的二抗，于37℃、5％CO2持续1小时。用PBS/0.1％Tween 20最后洗涤平板三次。每孔加入100μl即用型BCIP/NBT缓冲液，持续2-15min进行斑点显影。双目显微镜下计数斑点。将用肽重新活化的孔内所见的斑点数减去仅培养基中的背景斑点数，以确定特异性T细胞的前体频率。
结果
由于纯化的脾细胞分泌的IFN-γ水平与对融合蛋白具有特异性的CD8+细胞毒性淋巴细胞前体的水平成比例，IFN-γ分泌的评估使得能够对每个重组VLP诱导BALB/c小鼠细胞免疫反应能力进行比较。如图12A所示的结果表明，尽管所有融合NP147-155肽的PapMV VLP能够诱导的IFN-γ分泌水平高于仅PapMV CP VLP诱导的，只有PapMVNP-12 VLP引发的IFN-γ分泌显著高于仅PapMV CP VLP引发的。出人意料地，尽管PapMV NP-C在免疫系统中有很好的免疫呈现，但PapMV NP-C VLP诱导的IFN-γ分泌没有显著区别于仅PapMV CP VLP诱导的，正如用PapMV NP-C VLP三次免疫后直接产生针对疫苗平台的抗体所证明。
如图12B所示，对PapMV NP-12 VLP具有特异性的脾细胞分泌的IFN-γ水平，显著高于PapMV NP-12盘引发的水平，表明自我组装成VLP是免疫系统强烈免疫刺激所需的，无论是对于体液还是细胞免疫反应。然而盘刺激低反应的能力表明，含有少量盘的VLP的制剂也可用于有效刺激免疫反应。
实施例6:含有重组PAPMV CP-NP融合体的VLP的稳定性
动态光散射
为了动态光散射(DLS)，用ZetaSizer Nano ZS(Malvern,乌斯特郡,英国)，在温度为10℃，于1×PBS中稀释为0.1mg/ml的浓度下，记录VLP的大小。在相同的实验条件下，在1℃的温度增量下，测量温度变化导致的VLP大小的变化。
用戊二醛化学交联
在终体积50μl中，使用0.1％的10mM Tris、50mM NaCl(pH 7.5)中的戊二醛。用于交联的最佳蛋白浓度为150ng/ml。加入戊二醛后，混合物在黑暗中室温孵育30分钟。用15μl的上样染料终止反应，95℃加热10分钟，通过SDS-PAGE分离蛋白。用于免疫的交联后的蛋白不添加上样染料，储存于4℃直至免疫。
胰蛋白酶消化
在50μl体积中，于37℃将10μg的蛋白在含0.2μg胰蛋白酶(Roche,1418475)的100mM Tris-HCl(pH 8.5)中孵育120分钟。加入10μl上样染料以终止反应。SDS-PAGE分析前，将样品95℃加热10分钟。
结果
DLS用于评估PapMV NP-12、PapMV NP-187、PapMV NP-C和PapMV CP VLP的稳定性(图18A)。PapMV NP-187 VLP和PapMVNP-C VLP在低于小鼠体温(36.9℃)的温度(分别约20℃和25℃)下开始聚集。相反，PapMV NP-12 VLP在37℃左右的温度下开始聚集，这与PapMV CP VLP相似(图18A)。PapMV NP-12 VLP较好的稳定性与它们刺激CTL免疫反应的能力(如实施例5所示)有很好的相关性。
经研究，用戊二醛交联重组PapMV NP-C VLP是一种稳定VLP以及潜在地，增加它们刺激免疫反应能力的方法。DLS用于评估交联的PapMV NP-C VLP的稳定性，并表明VLP在37℃下是稳定性的(图18B)。
也将交联的PapMV NP-C VLP(100μg)用于免疫小鼠，将未交联的PapMV NP-C VLP以及PapMV CP VLP(各100μg)作为对照组。按实施例5所述的方法测量特异性脾细胞分泌IFN-γ的水平。用NP147-155肽刺激脾细胞后，交联的PapMV NP-C VLP没有诱导高水平的IFN-γ(图12C)，其特异性脾细胞分泌的IFN-γ的量保持与未交联的PapMV NP-C VLP获得的量相似，表明仅在生理学温度下的稳定不足以赋予这种融合体刺激有效的细胞免疫反应的能力。
将PapMV CP-NP融合体的胰蛋白酶消化用于研究交联可抑制细胞蛋白酶裂解NP147-155肽的可能性。如图18C所示，用胰蛋白酶处理未交联的PapMV NP-C VLP和交联的PapMV NP-C VLP没有观察到区别(看到两者的条带强度相同)。这与PapMV NP-12和PapMV NP-CVLP被胰蛋白酶很好地消化的结果形成对照(参见图18C)。
这些结果表明，PapMV VLP的交联导致细胞蛋白酶接近NP147-155肽被位阻了，通过遮蔽肽和/或增加VLP的硬度使得不能发生蛋白酶的裂解。
实施例7:融合多拷贝流感病毒核壳体肽的重组PapMV外壳蛋白的制备
该实验描述了携带2个或3个CTL肽(CP中单个位点插入或不同位点插入)的重组PapMV外壳蛋白的制备和分析。实施例4中描述的NP147-155肽用于这些实验中。
制备的构建体为：
PapMV 3NP-C—C末端插入三个拷贝的NP CTL肽；
PapMV NP-8/183—8位氨基酸之后插入一个NP CTL肽以及183位氨基酸之后插入一个NP CTL肽；
PapMV NP-8/C—8位氨基酸之后插入一个NP CTL肽以及C末端插入一个NP CTL肽；
PapMV NP-183/C—183位氨基酸之后插入一个NP CTL肽以及C末端插入一个NP CTL肽；
PapMV 3NP-8—8位氨基酸之后插入三个拷贝的NP CTL，以及
PapMV 3NP-8/183/C(PapMV三个NP)—8位氨基酸之后插入一个NP CTL肽、183位氨基酸之后插入一个NP CTL肽以及C末端插入一个NP CTL肽。
用实施例2和3中所述的方法克隆、在大肠杆菌中表达、SDS-PAGE分析、纯化和VLP制备。通过超高速离心从VLP中分离盘(Denis等,2007,2008,出处同上)。
结果
图13A所示为插入位点的氨基酸序列。图13B描述了这些重组PapMV CP融合体表达的SDS-PAGE分析：泳道1：诱导前的细菌裂解物；泳道2：表达多融合蛋白PapMV-NP8/183的细菌裂解物；泳道3：诱导前的细菌裂解物；泳道4：表达多融合蛋白PapMV-NP8/C的细菌裂解物；泳道5：诱导前的细菌裂解物；泳道6：表达蛋白PapMV-NP183/C的细菌裂解物；泳道7：诱导前的细菌裂解物；泳道8：表达多融合蛋白PapMV-三个NP的细菌裂解物；泳道9：诱导前的细菌裂解物；泳道10：表达多融合蛋白PapMV-3NP/8的细菌裂解物；泳道11：诱导前的细菌裂解物，以及泳道12：表达多融合蛋白PapMV-3NP/C的细菌裂解物。
图13C描述了PapMV VLP 3NP-C、NP-8/183、NP-8/C、NP-8/C以及三个NP的动态光散射(DLS)分析。VLP的平均长度示于每个图中。这表明，只有当DLS测定的长度超过40nm，PapMV CP才能形成VLP。
图13B和C表明，所有的构建体都能在大肠杆菌中产生稳定的蛋白并组装成VLP。与仅携带相同的一个融合肽的PapMV VLP相比，可将这些构建体生产的VLP用来免疫小鼠，并评估它们改善针对NP肽的免疫反应的能力。
图17展示了各种构建体的VLP(V)和盘(D)的ELISPOT分析(基本按照实施例3中所述的方法进行)结果。
实施例8:PapMV外壳蛋白表面暴露区域的肽图谱
肽合成
通过GenScript(皮斯卡塔韦,NJ,USA)用短肽合成整个PapMV-CP的氨基酸序列，且这些不经HPLC纯化而作为粗肽使用。将所述肽设计成长度为12个氨基酸，每个用4个氨基酸的侧翼肽重叠(表5)。8号肽和13号肽中的半胱氨酸改成丝氨酸，以避免实验中其它化合物的可能的硫键干扰。GenScript(皮斯卡塔韦,NJ,USA)也测试了含有半胱氨酸的肽，结果表明它们不产生任何干扰肽，也未经HPLC纯化而用作粗肽。肽长12个氨基酸，之前和之后的肽在末端有4个氨基酸重叠(表5)。8号肽和13号肽中的半胱氨酸改成丝氨酸，以避免实验中其它化合物的可能的硫键干扰。也测试了含有半胱氨酸的肽，结果表明不产生任何干扰。
PapMV VLP的免疫以及免疫斑点印迹(immunodotblot)
5只6-8周大的BALB/c小鼠皮下199注射100μg的PapMV VLP。首次注射后的两周，进行加强免疫，在加强免疫后的两周，收获血样。按照制造商的使用说明，将肽一式两份加入到Nexterion-E载玻片MPX16(Schott,埃尔姆斯福特,NY,USA)。用PBS+20 0.05％+BSA1％于室温封闭载玻片1小时。合并5只免疫的小鼠的血清，用封闭缓冲液以1:100进行稀释，一式两份室温下置于阵列中1小时。用稀释度为1:800的Alexa-fluor 647抗-鼠IgG羊抗体(Invitrogen,卡尔斯巴德,CA,USA)检测所述肽抗体1小时。将载玻片洗涤三次，每个步骤中间用PBS-T室温处理3分钟。用ScanArray 4000XL(GSI Lumonics)读取载玻片，用GenePix 6.1.0.4(分子器件)进行分析。
表5:PapMV CP肽
肽# 序列 SEQ ID NO
1 MASTPNIAFPAI 45
2 FPAITQEQMSSI 46
3 MSSIKVDPTSNL 47
4 TSNLLPSQEQLK 48
5 EQLKSVSTLMVA 49
肽# 序列 SEQ ID NO
6 LMVAAKVPAASV 50
7 AASVTTVALELV 51
8 LELVNFSYDNGS 52
9 DNGSSAYTTVTG 53
10 TVTGPSSIPEIS 54
11 PEISLAQLASIV 55
12 ASIVKASGTSLR 56
13 TSLRKFSRYFAP 57
14 YFAPIIWNLRTD 58
15 LRTDKMAPANWE 59
16 ANWEASGYKPSA 60
17 KPSAKFAAFDFF 61
18 FDFFDGVENPAA 62
19 NPAAMQPPSGLT 63
20 SGLTRSPTQEER 64
21 QEERIANATNKQ 65
22 TNKQVHLFQAAA 66
23 QAAAQDNNFASN 67
24 FASNSAFITKGQ 68
25 TKGQISGSTPTI 69
26 TPTIQFLPPPE 70
27 PPETSTTR 71
结果
图14展示了免疫斑点分析的结果。不出所料，N-和C-末端所对应的肽被多克隆抗体检测。此外，PapMV多克隆抗体还能(以高亲和力)检测对应于肽15、16、18、22和24的5个其它区域。还用单只小鼠各自的血清进行相同的实验，获得了基本相似的结果，但肽18、22和24的记录信号的强度有变化。然而，在所有小鼠中一致的是：肽15和16都有很强的信号。
实施例9:PapMV外壳蛋白化学修饰的表面暴露残基的分析
用DEPC和EDC进行化学修饰
在溶液中用与某些氨基酸选择性相互作用的化学活性物质对PapMV纳米颗粒进行化学修饰：羧基用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺(EDC)修饰；而丝氨酸、苏氨酸、组氨酸和酪氨酸用焦炭酸二乙酯(DEPC)修饰。在100μl体积中，两个反应都用1mg/ml的PapMV VLP进行。简而言之，EDC反应按如下进行：加入EDC至50mM的甘氨酰胺盐酸盐缓冲液(pH 6.0)使浓度为2.0mM，将该反应液室温孵育1小时。DEPC反应按如下进行：在50mM乙酸铵+1％乙腈溶液中使DEPC浓度为0.4mM，于37℃持续1分钟。DEPC采用50mM乙酸铵，EDC采用10mM(pH 8.0)Tris-HCl，通过在Amicon Ultra10kDa MWCO 0.5ml(Millipore,比勒里卡,MA,USA)中两次以14 000g离心15分钟，洗涤VLP。通过电子显微镜和动态光散射确认VLP的完整性。在加拿大魁北克的魁北克东部基因组中心蛋白质组学平台(Proteomics platform of the Eastern Quebec Genomics Center)进行消化和质谱实验。
电子显微镜和动态光散射
VLP用水稀释至浓度0.03mg/ml，将10μl样品与10μl 3％乙酸铀酰暗处混合染色7分钟，然后将8μl该溶液置于碳-聚醋酸甲基乙烯脂栅网(grid)上5分钟。用JEOL-1010透射电子显微镜(东京，日本)观察栅网。4℃下用ZetaSizer Nano ZS(莫尔文,乌斯特郡,英国)记录VLP的大小，在1×PBS中稀释的浓度为0.1mg/ml。
胰蛋白酶消化蛋白
按照制造商的说明书和Shevchenko等(1996,Anal Chem68:850-858)的流程，还有Havlis等(2003,Anal Chem 75:1300-1306)建议的修改，在MassPrep液体处理机器人(Waters,米尔福德,USA)上进行胰蛋白酶消化。简而言之，用10mM DTT还原蛋白，并用55mM碘乙酰胺进行烷基化。用105mM修饰的猪胰蛋白酶(测序级,Promega,麦迪逊,WI)于58℃进行胰蛋白酶消化1小时。用1％甲酸、2％乙腈抽提消化产物，再用1％甲酸、50％乙腈抽提。将回收的抽提物合并，真空离心干燥，并重悬于7μl 0.1％甲酸中；用2μl进行质谱分析。
修饰的VLP的质谱分析
通过在线反相(RP)纳米级毛细管液相色谱(nanoLC)分离肽样品，用电喷雾质谱(ES MS/MS)进行分析。用连接配有纳升电喷雾离子源(ThermoFisher,圣何塞,Ca USA)的LTQ线性离子阱质谱仪(ThermoFisher,圣何塞,Ca USA)的Thermo Surveyor MS泵开展实验。在自我包装的装填有Jupiter(Phenomenex)5u、300A C18、内直径10cmx 0.075的PicoFrit柱(New Objective,沃本,MA)上进行肽分离。以线性梯度2-50％溶剂B(乙腈，0.1％甲酸)洗脱肽30分钟，流速200nL/min(通过分流获得)。用Xcalibur软件2.0版本，以数据依赖型捕获方式获取质谱。通过7个最强离子的碰撞诱导解离后，获取每个全扫描质谱(400至2000m/z)。激活动态排除(30秒动态排除时间)功能，相对碰撞碎片能量设置成35％。
数据库搜索
用Mascot(Matrix Science,265伦敦,UK；3.1.2版本)分析所有的MS/MS样品。Mascot设置成搜索PapMV-CP氨基酸序列，假定消化酶为胰蛋白酶。用0.05Da的碎片离子质量公差，2.0Da的母离子质量公差搜索Mascot。半胱氨酸的碘乙酰胺衍生物指定为固定修饰，蛋氨酸氧化指定为可变修饰。允许两个未酶切位点。
鉴定修饰的标准
用Scaffold(3.2.0,Proteome Software Inc.,波特兰,OR)验证基于MS/MS的肽和蛋白鉴定。如果肽鉴定能建立超过Peptide Prophetalgorithm(Keller等,2002,Anal Chem 74:5383-5392)指定的95.0％的概率，那它们就可被接受。修饰被定义为，对于EDC，肽质量56Da的改变，对于DEPC，72Da的改变。
结果
为了确认实施例8中描述的免疫原性结果，在表面暴露残基对PapMV VLP进行了化学修饰，并用质谱分析。修饰的VLP还用电子显微镜以及DLS进行分析，以确保它们的一般外形以及长度与那些未经处理的VLP相似(图15)。然后，再将VLP用胰蛋白酶消化，用电喷雾质谱分析。约70％的PapMV外壳蛋白的氨基酸序列可在胰蛋白酶消化后分析修饰情况。EDC和DEPC的修饰使肽的分子量分别增加56Da和72Da。如MS/MS谱图所示，EDC修饰发现位于D17、E128和E215位(图19)，而DEPC修饰位于S135和T219(图20)。N-末端和C-末端也都进行了化学修饰，因此确认位于PapMV VLP的表面。令人感兴趣的是，如免疫印迹和MS/MS所确认的，中心区域、E128和S135似乎暴露于VLP表面。
对于VLP的表面定位作图，免疫印迹肽阵列似乎比MS/MS质谱更为敏感。事实上，MS/MS仅能揭示样品中那些起主导作用的修饰，因此，可用于交联。即使采用这两种技术的组合，也不能鉴定所有在表面暴露的PapMV VLP区域，因为免疫印迹技术仅能与阵列呈现的线性表位反应，而MS/MS受限于化学交联的表面标记效率，也即必须优化所述技术以获得优良且敏感的解决方案。
实施例10:通过免疫小鼠来确认PapMV外壳蛋白的表面暴露残基偶联mcKLH佐剂蛋白的肽、免疫和ELISA
用mcKLH连接试剂盒(Pierce,罗克福德,IL,USA)将肽和mcKLH连接。按如下进行免疫：对于肽1、13、15、16、17、18、22、24以及26，以100μg连接的mcKLH和10μg Quil-A皂苷(Brenntag Biosector,丹麦)佐剂进行免疫，在加强免疫前间隔两周。在第28天，获取每个肽两只小鼠的血清，以0.1μg/ml天然PapMV VLP为抗原，按别处所述方法(Savard等,2011,PLoS ONE 6:e21522)进行天然蛋白ELISA试验。当光密度为免疫前血清的4倍，滴度就被认为是阳性的。
结果
为进一步确认，所述抗体和化学修饰物(实施例8和9)靶向的残基位于PapMV VLP表面，通过与mcKLH佐剂蛋白融合，生产出了针对肽1、15、16、18、22、24以及26的抗体。还制备了肽13和17的融合体作为阴性对照。用高的总IgG滴度确认了所有预期位于表面的肽，除了肽15外(表6)。如预期的，两个对照即肽13和肽17为阴性的。
表6:针对表面暴露的肽的抗体
本说明书中引用的全部专利、出版物(包括公开的专利申请)和数据库条目的公开内容通过引用整体明确地并入本文，其程度如同每一这些单独专利、出版物和数据库条目明确地并单独提到通过引用并入本文。
尽管参照某些特定实施方案描述了本发明，但是对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围下对本发明进行的各种修改将是显而易见的。对于本领域技术人员将是显而易见的所有这些修改旨在包含在所附权利要求的范围内。

Claims (31)

1.一种含有肽抗原的融合蛋白，所述肽抗原源自流感M2e肽，其融合至木瓜花叶病毒(PapMV)外壳蛋白的SEQ ID NO:1的6、7、8、9、10、11或12位氨基酸所对应的氨基酸之后，其中所述融合蛋白能够自我组装成病毒样颗粒(VLP)，且其中所述肽抗原长度为20个或更少的氨基酸，且包含一般序列：V-X1-T-X2-X3-X4-X5[SEQ ID NO:96]，其中X1为E或D；X2为P或L；X3为T或I；X4为R或K，且X5为N、S或K。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述肽抗原融合在SEQID NO:1的6、7或10位氨基酸所对应的氨基酸之后。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述肽抗原融合在SEQID NO:1的6位氨基酸所对应的氨基酸之后。
4.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述PapMV外壳蛋白含有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述肽抗原融合至PapMV外壳蛋白的SEQ ID NO:4的1、2、3、4、5、6、7或8位氨基酸之后。
5.如权利要求4所述的融合蛋白，其中，所述肽抗原融合至PapMV外壳蛋白的SEQ ID NO:4的2、3、或6位氨基酸之后。
6.如权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽抗原长度为约7至约12个氨基酸，或者长度为约7至约10个氨基酸。
7.如权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽抗原长度为约7至约9个氨基酸。
8.如权利要求1-8中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽抗原含有如SEQ ID NO:14-22和96-104中任一个所示的序列。
9.如权利要求1-8中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽抗原含有序列EVETPIRNE[SEQ ID NO:21]或VETPIRN[SEQ ID NO:22]。
10.如权利要求1-8中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽抗原基本上由序列EVETPIRNE[SEQ ID NO:21]或VETPIRN[SEQ IDNO:22]组成。
11.如权利要求4所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白含有如SEQ ID NO:23中的1-224位氨基酸；SEQ ID NO：24中1-222位氨基酸；SEQ ID NO：25中1-221位氨基酸；SEQ ID NO：26中1-219位氨基酸；SEQ ID NO：27中1-224位氨基酸；或SEQ ID NO：28中1-222位氨基酸所示的氨基酸序列。
12.如权利要求4所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白含有如SEQ ID NO:23中1-224位氨基酸所示的氨基酸序列。
13.如权利要求1-12中任一项所述的融合蛋白，其中，所述VLP在至少37℃的温度下是稳定的。
14.一种病毒样颗粒(VLP)，其含有权利要求1-13中任一项所述的融合蛋白。
15.一种药物组合物，其含有权利要求14所述的VLP和药学可接受的载体。
16.如权利要求15所述的药物组合物，其配制为疫苗。
17.一种诱导对象针对流感病毒的免疫反应的方法，其包括向对象给予有效量的权利要求14所述的VLP。
18.一种降低对象发生流感的风险的方法，其包括向对象给予有效量的权利要求14所述的VLP。
19.一种给对象免疫以对抗流感病毒感染的方法，其包括向对象给予有效量的权利要求14所述的VLP。
20.如权利要求17-19中任一项所述的方法，其中，所述VLP在对象中诱导体液免疫反应。
21.含有权利要求1-13中任一项所述的融合蛋白的病毒样颗粒(VLP)，用于在有需要的对象中诱导针对流感病毒的免疫反应。
22.含有权利要求1-13中任一项所述的融合蛋白的病毒样颗粒(VLP)在有需要的对象中诱导针对流感病毒的免疫反应的用途。
23.含有权利要求1-12中任一项所述的融合蛋白的病毒样颗粒(VLP)在制备诱导对象针对流感病毒的免疫反应的药物中的用途。
24.含有权利要求1-13中任一项所述的融合蛋白的病毒样颗粒(VLP)，用于降低对象发生流感的风险。
25.含有权利要求1-13中任一项所述的融合蛋白的病毒样颗粒(VLP)在降低对象发生流感的风险中的用途。
26.含有权利要求1-13中任一项所述的融合蛋白的病毒样颗粒(VLP)在制备降低对象发生流感风险的药物中的用途。
27.含有权利要求1-13中任一项所述的融合蛋白的病毒样颗粒(VLP)，用于给对象免疫以对抗流感病毒的感染。
28.含有权利要求1-13中任一项所述的融合蛋白的病毒样颗粒(VLP)在给对象免疫以对抗流感病毒的感染中的用途。
29.含有权利要求1-13中任一项所述的融合蛋白的病毒样颗粒(VLP)在制备给对象免疫以对抗流感病毒感染的药物中的用途。
30.如权利要求21、24或27中任一项所述的VLP，或如权利要求22、23、25、26、28或29中任一项所述的用途，其中，所述VLP诱导对象的体液免疫反应。
31.一种含有权利要求14所述的VLP以及使用说明书的药物试剂盒。
CN201380028970.6A 2012-04-02 2013-02-19 重组木瓜花叶病毒外壳蛋白及其在流感疫苗中的应用 Pending CN104395346A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261618972P 2012-04-02 2012-04-02
US61/618,972 2012-04-02
US201261694422P 2012-08-29 2012-08-29
US61/694,422 2012-08-29
PCT/CA2013/050127 WO2013149334A1 (en) 2012-04-02 2013-02-19 Recombinant papaya mosaic virus coat proteins and uses thereof in influenza vaccines

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104395346A true CN104395346A (zh) 2015-03-04

Family

ID=49299890

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380028970.6A Pending CN104395346A (zh) 2012-04-02 2013-02-19 重组木瓜花叶病毒外壳蛋白及其在流感疫苗中的应用

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20150056231A1 (zh)
EP (1) EP2834274A4 (zh)
JP (1) JP2015514097A (zh)
CN (1) CN104395346A (zh)
CA (1) CA2908414A1 (zh)
HK (1) HK1203983A1 (zh)
WO (1) WO2013149334A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016127262A1 (en) * 2015-02-12 2016-08-18 Folia Biotech Inc. Multimerized orthomyxovirus nucleoprotein and uses thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010012069A1 (en) * 2008-07-30 2010-02-04 Folio Biotech Inc. Multivalent vaccines based on papaya mosaic virus and uses thereof

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MXPA05000287A (es) * 2002-07-05 2005-09-08 Leclerc Denis Particula viral adyuvante.
US8101189B2 (en) * 2002-07-05 2012-01-24 Folia Biotech Inc. Vaccines and immunopotentiating compositions and methods for making and using them
CN106237316A (zh) * 2006-03-07 2016-12-21 法克斯因内特公司 包含血细胞凝集素的组合物、制造其的方法与使用其的方法
JP2010508860A (ja) * 2006-11-15 2010-03-25 フォリア バイオテック インコーポレイテッド パパイヤモザイクウイルスに基づくインフルエンザ用ワクチン
JP2010508857A (ja) * 2006-11-15 2010-03-25 フォリア バイオテック インコーポレイテッド パパイヤモザイクウイルスに基づく免疫原性の親和性で複合体化された抗原系及びその使用
HUE025149T2 (hu) * 2007-08-02 2016-01-28 Biondvax Pharmaceuticals Ltd Multimer multiepitóp influenza vakcinák

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010012069A1 (en) * 2008-07-30 2010-02-04 Folio Biotech Inc. Multivalent vaccines based on papaya mosaic virus and uses thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RIOUX.G等: "Engineering of Papaya Mosaic Virus (PapMV) nanoparticles through Fusion of the HA11 peptide to Several Putative surface-exposed sites", 《PLOS ONE》 *
TREMBLAY,M-H等: "Effect of mutations K97A and E128A on RNA binding and self assembly of papaya mosaic potexvirus coat protein", 《FEBS LETTER》 *
ZOU, P等: "The epitope recognized by a monoclonal antibody in influenza A virus M2 protein is immunogenic and confers immune protection", 《INTERNATIONAL IMMUNOPHARMACOLOGY》 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2015514097A (ja) 2015-05-18
CA2908414A1 (en) 2013-10-10
WO2013149334A1 (en) 2013-10-10
HK1203983A1 (zh) 2015-11-06
EP2834274A1 (en) 2015-02-11
US20150056231A1 (en) 2015-02-26
EP2834274A4 (en) 2015-11-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6655623B2 (ja) 新規多価ナノ粒子に基づくワクチン
Chroboczek et al. Virus-like particles as vaccine.
US9795666B2 (en) High-yield transgenic mammalian expression system for generating virus-like particles
Sui et al. Cross-protection against influenza virus infection by intranasal administration of M1-based vaccine with chitosan as an adjuvant
JP2013234198A (ja) パパイヤモザイクウイルスに基づくインフルエンザ抗原提示系及びそれを含むインフルエンザワクチン
Zheng et al. Influenza H7N9 LAH-HBc virus-like particle vaccine with adjuvant protects mice against homologous and heterologous influenza viruses
US9963490B2 (en) Influenza nucleoprotein vaccines
WO2023023940A1 (zh) 一种诱导广谱抗冠状病毒的t细胞疫苗免疫原及其应用
Lei et al. Artificially designed hepatitis B virus core particles composed of multiple epitopes of type A and O foot‐and‐mouth disease virus as a bivalent vaccine candidate
US10117923B2 (en) Production of an immunogen using a plant virus
CN109923125B (zh) 免疫原性组合物
Kalaiyarasu et al. Elicitation of Highly Pathogenic Avian Influenza H5N1 M2e and HA2-Specific Humoral and Cell-Mediated Immune Response in Chicken Following Immunization With Recombinant M2e–HA2 Fusion Protein
JP2023523423A (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチン及びその調製物
WO2011024748A1 (ja) インフルエンザm2由来の改変ペプチドワクチン
WO2017149054A1 (en) Novel influenza antigens
CN104395346A (zh) 重组木瓜花叶病毒外壳蛋白及其在流感疫苗中的应用
US9303070B2 (en) Multimeric multiepitope polypeptides in improved seasonal and pandemic influenza vaccines
EP4380951A1 (en) Vaccine construct and uses thereof
JP6622326B2 (ja) インフルエンザａ／上海／２／２０１３ ｈ７配列の改変ｈ７赤血球凝集素糖タンパク質
JP2018515074A5 (zh)
US20150274784A1 (en) Production of an Immunogen Using a Plant Virus
WO2023187366A1 (en) Immunogenic compositions for the prevention of influenza a
EP4337322A1 (en) Vaccine formulation comprising recombinant overlapping peptides and native proteins
WO2016127262A1 (en) Multimerized orthomyxovirus nucleoprotein and uses thereof
Zhang Development of Novel Subunit Vaccine against H5N1 Influenza

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20150304