PARTÍCULA VIRAL ADYUVANTE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a una partícula viral que contiene inmunógenos y que tiene inmunopotenciación o actividad adyuvante. La invención se relaciona particularmente a partículas virales recombinantes y un método para mejorar una respuesta inmune en un ser humano o un animal por medio de estas partículas . La vacunación es el método más eficiente para luchar contra enfermedades infecciosas . La aparición de nuevas enfermedades virales (por ejemplo, virus de la Hepatitis C, virus de inmunodeficiencia humana) , y la resistencia de bacterias patogénicas {Salmonella typhii) a antibióticos son alarmantes. La vacunación de este modo llega a ser una alternativa eficiente para ayudar a controlar estas enfermedades . Durante los últimos 15 años, la ingeniería genética permitió la identificación precisa de fragmentos de proteína que son responsables para la respuesta inmune protectora. Por lo tanto, nuevas estrategias de vacunación emergieron. La inmunización de animales con péptidos inmunogénicos apropiados permitió . la producción de anticuerpos neutralizantes que pueden controlar enfermedades. La expresión de aquellos péptidos inmunogénicos en sistemas heterólogos proporciona la base de vacunas de subunidad.
Aunque se ha demostrado que los oligopéptidos químicamente sintetizados son capaces de estimular la producción de anticuerpos contra la proteína a partir de la cual se derivan, los péptidos mismos se ha encontrado generalmente que son insuficientemente inmunogénicos para servir como vacunas . Esto es porque ha habido considerable interés en desarrollar sistemas de presentación de epítope, en donde la secuencia de péptido se combina a una molécula transportadora capaz de ensamblarse en una estructura macromolecular . Puede mejorarse la inmunidad específica por el uso de inmunopotenciadores , tales como adyuvantes, cuando se administra un antígeno a un huésped. La respuesta inmune se media por una variedad de células en el sistema inmune. Existen dos tipos de respuestas inmune: la inmunidad humoral mediada por anticuerpos, y la inmunidad celular mediada principalmente por linfocitos T citotóxicos. El proceso de células que presentan antígeno ("APC") y antígeno presente tanto a células B y T. Las células B secretan anticuerpos específicos como un resultado de la activación y las células T llegan a ser ya sea células auxiliadoras a la respuesta umoral o células citotóxicas y atacan directamente al antígeno. Los adyuvantes han demostrado que aumentan estas respuestas inmunes. La presentación inicial de un antígeno induce ambos anticuerpos IgM e IgG, formando la respuesta primaria. Esta producción de anticuerpos puede descender sin embargo, con el tiempo. Una repuesta secundaria, que implica principalmente la producción de anticuerpos IgG, puede accionarse por la respuesta secundaria o posterior en presentación de tiempo del antigeno. Una respuesta secundaria o aún primaria, sin embargo, no se garantiza simplemente cebando el huésped con un antigeno. Una dificultad con frecuencia encontrada en la administración de un antigeno es la extensión a la cual el sistema inmune responderá. Ciertos antigenos no son muy inmunogénicos en cuanto a que hasta la administración provocan una respuesta primaria débil o sin respuesta del todo. En tales casos, el sistema inmune no puede responder a un desafio secundario, y por ejemplo, el huésped puede sufrir de la enfermedad o condición cuando la inmunización con el antigeno se diseñará para evitarla. En tales situaciones, es común dar un modulador de respuesta fisiológica ("PRM") . Un PRM generalmente se define como un compuesto inmunopotenciado . Este puede derivarse de bacterias, tales como Bordella pertussis o Corynebacterxum parvum. El PRM también puede incluir químicos, tales como polinucleótidos , moléculas fisiológicamente activas, tales como hormonas tímicas y adyuvantes. Los adyuvantes son compuestos que mejoran la respuesta del sistema inmune cuando se administran con concentraciones de anticuerpo más elevadas que producen antigeno y respuesta prolongada al huésped. Los adyuvantes comúnmente utilizados incluyen Adyuvante de Freund Incompleto, que consiste de una emulsión de agua en aceite, El adyuvante completo de Freund que comprende lo anterior con la adición de Mycobacterium tuberculosis, y alumbre. La dificultad, sin embargo, para utilizar estos materiales en seres humanos, por ejemplo es que son tóxicos o pueden provocar al huésped desarrollar lesiones en el sitio de inyección . Otro método se describió por Kawamura and Berzofsky en J. Immunol . , 136:58 (1986) . En este método, los anticuerpos anti-Ig, que son reactivos con inmunoglobulinas presentes en ciertas células B, se conjugaron a ferritina y mioglobina, y se administraron a ratones con Adyuvante de Freund Incompleto. La inmunogenicidad de la mezcla se mejoró, pero no hubo indicación de la inmunogenicidad de la mezcla sin la adición del adyuvante. También, mientras los adyuvantes tales como adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund y Montanide pueden mejorar grandemente la respuesta inmune a un antigeno, estos sufren de algunas desventajas. Cuando se utilizan con un antigeno en una forma inyectable, lesiones grandes con frecuencia forman en el sitio de inyección, una situación que los hace insatisfactorios para tal uso en seres humanos, mascotas o en animales cárnicos. Además, estos adyuvantes fallan al actuar como agentes inmunopotenciados cuando se administran oral o enteralmente . Se conoce en la técnica que los portadores de inmunógeno o antigenos de diferentes naturalezas pueden relativamente diseñarse de manera fácil genéticamente. Los virus de plantas son aquellos sistemas que pueden producirse en plantas y son fácilmente adaptados a esta aplicación. El virus de mosaico de Capui (CPMV) , virus de mosaico X de tabaco (TMVX) , y virus de mosaico de alfalfa (AIMV) se conocen por haber sido modificados por la presentación de epitopes de interés. Otro vector viral de planta, virus X de papa (PVX) , un miembro del grupo potexvirus, se conocen para tolerar el acarreo de un recubrimiento de proteina completa. También, las Patentes Norteamericanas 6,232,099 y 6,042,832, las solicitudes de Patente Internacional publicadas bajo el número WO 97/39134, O 02/04007, WO 01/66778, WO 02/00169, y solicitud EP 1167530, todas describen diferentes variaciones de partículas similares a virus que transportan proteínas extrañas en fusión con proteínas endógenas. Sin embargo, en ningún lado en estas referencias se menciona que tales partículas tienen cualesquiera propiedades de inmunopotenciacion o adyuvantes . Considerando el estado de la técnica descrito en la presente, existe todavía una gran necesidad para compuestos y partículas portadoras que permitan una inmunización fuerte de seres humanos y animales mientras se evita el uso de adyuvantes y segundas vacunaciones como se practica actualmente . Un objetivo de la presente invención es proporcionar un complejo portador de inmunógeno que tiene una propiedad de inmunopotenciación, que consiste de una partícula similar a virus (VLP) que porta al menos un inmunógeno en fusión con una proteína o fragmento del mismo de VLP, que puede utilizarse en la preparación de una composición para inducir una respuesta inmune contra la proteína o fragmento del mismo. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar una composición que comprende una partícula similar a virus (VLP) y una proteína o un extracto derivado de un virus, bacteria o parásito, que puede utilizarse como una vacuna . De acuerdo con la presente invención, se proporciona también un método para inmunopotenciar una respuesta inmune en un ser humano o un animal que comprende administrar al ser humano o animal un portador de inmunógeno que consiste de una partícula similar a virus (VLP) que porta al menos un inmunógeno en fusión con una proteína o fragmento del mismo de la VLP, o administrando una VLP o un fragmento del mismo concomitantemente con un antigeno no directamente unido a la VLP. La presente invención se relaciona también al polinucleótido que codifica un complejo portador de inmunógeno que consiste de una partícula similar a virus (VLP) que porta al menos un inmunógeno en fusión con una proteina o un polinucleótido A que codifica un complejo portador de inmunógeno que consiste de un fragmento del mismo de la VLP, o una VLP sola, el complejo portador de inmunógeno que tiene la capacidad de ensamblarse cuando se expresa en una célula de planta, una célula de animal o un microorganismo . La invención se proporciona también para el uso de un virus de mosaico de papaya como un adyuvante. Para el propósito de la presente invención, se definen los siguientes términos posteriormente. La expresión "proteina quimérica" se crea cuando dos o más genes que normalmente codifican para dos proteínas separadas recombinan, ya sea naturalmente o como el resultado de intervención humana, para codificar para una proteína que es una combinación de todo o parte de cada una de aquellas dos proteínas . La expresión "proteína de cápsida de fusión" significa una proteína de fusión en donde uno de los genes en la fusión codifica para una proteína de cápsida del virus de planta . La expresión "inmunidad protectora" como se utiliza en la presente se pretende para significar la capacidad de un animal, tal come un mamífero, ave, o pez, para resistir
(inicio retrasado de los síntomas o severidad reducida de síntomas), como un resultado de su exposición al antígeno de un patógeno, enfermedad o muerte que de otra manera sigue el contacto con el patógeno. Se logra la inmunidad protectora por uno o más de los siguientes mecanismos: inmunidad mucosal, humoral o celular. La inmunidad mucosal es principalmente el resultado de anticuerpos IgA secretorios
(sIGA) en superficies mucosales de los tractos respiratorio, gastrointestinal y genitourinario. Los anticuerpos sIGA se generan después de una serie de eventos mediados por células que procesan el antígeno, linfocitos B y T, que resultan en la producción de sIGA por linfocitos B en tejidos revestidos con mucosa del cuerpo. La inmunidad mucosal puede estimularse por una vacuna oral. El resultado primario de la inmunidad protectora es la destrucción del patógeno o inhibición de su capacidad para replicarse. La expresión "inmunidad humoral" como se utiliza en la presente significa el resultado de los anticuerpos IgG y anticuerpos IgM en suero. La expresión "inmunidad celular" como se utiliza en la presente puede lograrse a través de linfocitos T citotóxicos o a través de hipersensibilidad del tipo retrasada que implica macrófagos y linfocitos T, asi como otros mecanismos que implican células T sin un requerimiento para anticuerpos. Un "virus recombinante" es uno en donde el material genético de un virus ha sido combinado con otro material genético . Los términos "polipéptido" o "péptido" como se utiliza en la presente se pretende para significar una molécula en donde existen al menos cuatro aminoácidos unidos por uniones de péptido. La expresión "ácido nucleico viral" como se utiliza en la presente puede ser el genoma (o una mayoría del mismo) de un virus, o una molécula de ácido nucleico complementaria en secuencia base a ese genoma. Una molécula de ADN que es complementaria al ARN viral se considera también ácido nucleico viral . Una molécula de ARN que es complementaria en secuencia base al ADN viral se considera también ser ácido nucleico viral. El término "partícula similar a virus" (VLP) como se utiliza en la presente se refiere partículas auto-ensambladas que tienen una aparición física similar a partículas de virus e incluye pseudovirus . Las partículas similares a virus pueden carecer o poseer copias disfuncionales de ciertos genes del virus de tipo silvestre, y esto puede resultar en la partícula similar a virus que es incapaz de alguna función que es característica del virus de tipo silvestre, tal como replicación y/o movimiento de célula-célula . El término "vacuna" como se utiliza en la presente, se pretende significar la proteína de fusión, cualquier partícula de la cual esa proteína es una parte, o cualquier preparación tal como material de planta del cual esa proteína es una parte. El término "inmunopotenciador" como se utiliza en la presente se pretende para significar una sustancia que, cuando se mezcla con un antígeno, mejora la inmunogenicidad o antigenicidad y proporciona una respuesta inmune superior. Se reconocerá que esto puede mejorar la expresión de co-estimuladores en macrófagos y otras células que presentan antígeno . BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ilustra un micrófago de electrón de PapMV purificado; La Figura 2 ilustra análisis SDS-PAGE de tricina del PapMV CP (A) y la etiqueta de inmunoro que muestra que la fusión se expone a la superficie del PapMV VLP (B) ; Las Figuras 3A a 3G ilustran micrófagos de electrón de PapMV y PapMV VLP ensamblados in vitro; La Figura 4 ilustra la acumulación de leucocito inducida por PapMV en el modelo de bolsa de aire; La Figura 5 ilustra la respuesta inmune a PapMV. Los ratones (6 para cada concentración) que se inyectaron IP una vez con PaPMV o con ISS (solución salina isotónica) ; La Figura 6 ilustra una respuesta inmune a PapMV. Los ratones (6 para cada concentración) que se inyectaron IP una vez con PapMV o con ISS (solución salina isotónica) ; La Figura 7 ilustra una evaluación de potencia PapMV como adyuvante a la ovalbumina; Las Figuras 8A y 8B ilustran la caracterización de la respuesta inmune al PapMV y a péptidos HCV derivados de El y E2 de glicoproteina de superficie HCV; y La Figura 9 ilustra transferencia Western que muestra la migración especifica de PapMV CP a ganglio linfático y bazo con una inyección intraperitoneal . De acuerdo con la presente invención, se proporciona una partícula similar a virus que porta inmunógeno en fusión con proteínas virales endógenas, formando por lo tanto un nuevo tipo de portador de inmunógeno que es también capaz de inmunopotenciación o que tiene un efecto adyuvante. En una modalidad de la presente invención, se proporciona una clase de portadores que cuando se unen genéticamente a un inmunógeno o hapteno pueden mejorar la respuesta inmune del huésped del inmunógeno o hapteno a pesar de si el complejo se administra parenteral, enteral u oralmente. Además, su uso no resulta en la formación de grandes lesiones en sitios de inyección. Las células accesorias tales como macrófagos, linfocitos B y células dendriticas son esenciales para la inducción de respuestas inmunes dependientes de célula T. Las células accesorias presentan antigenos a células T restringidas con MHC y producen co-estimuladores asociados y secretados a membrana que mejoran la proliferación y diferenciación de linfocitos T. Por lo tanto, la presencia de células accesorias competentes estimulan las respuestas inmunes dependientes de célula T, y su ausencia conduce a respuestas deficientes. Los macrófagos de reposo y simples, linfocitos B no estimulados remitidos por tales células que presentan antigeno (las APC) pueden fallar en estimular las células CD4+T simples, y pueden aún inducir la tolerancia de célula T. En contraste, las células dendriticas y macrófagos activados y células B expresan co-estimuladores, asi como niveles elevados de las APC. Un mecanismo de acción del portador de inmunógeno de la presente invención, es mejorar la expresión de co-estimuladores en macrófagos y otras APC Debido a esto, la administración de inmunógenos o antigenos de proteina con los portadores de inmunógeno de la invención, que actúan simultáneamente como un adyuvante, promueve la inmunidad mediada por célula y la producción de anticuerpo dependiente de célula T. Los inmunógenos son más efectivos para generar inmunidad sistémica cuando se administran acoplados juntos con un portador de inmunogeno de la presente invención . En una primera modalidad, la invención proporciona un complejo que comprende un inmunogeno acoplado a una partícula similar a virus portadora (VLP) , de manera que la molécula portadora provoca la respuesta inmune de un huésped al inmunogeno para mejorarse cuando el complejo se administra al huésped, en donde el inmunogeno puede comprender tanto un antigeno o un hapteno y la molécula portadora comprende una partícula integral de un virus. Más particularmente, el virus de la presente invención es un virus de planta. Una manera para obtener una buena respuesta de células B es presentar el antígeno en una manera organizada. Se muestra que los epítopes repetitivamente dispuestos reticulan al receptor de célula B eficientemente e inducen una respuesta de IgM independientemente de indicador T seguido más tarde por una respuesta de IgG. Por lo tanto, una buena estrategia para incrementar la inmunogenicidad de los epítopes y el reconocimiento y presentación al sistema inmune es la expresión de los epítopes inmunodominantes en una forma organizada como en la superficie de un virus de planta como PapMV. Particularmente, PapMV cumple varias características de un buen adyuvante y portador debido a que es un antígeno filogenéticamente distante, es exógeno al sistema inmune de mamífero, es molecularmente muy complejo y es una estructura organizada que tiene un peso molecular elevado. Ha sido sorprendentemente reconocido por el solicitante que una estructura cristalina y repetitiva no se reconoce únicamente por el sistema inmune innato, pero tiene en adición un efecto adyuvante en el sistema inmune de un huésped inmunizado. En una modalidad de la presente invención, se proporciona un método en donde el uso de virus en forma de bastoncillo de número de copias elevado benigno, preferiblemente virus de planta tal como virus del mosaico de papaya (PapMV) , produce inmunógeno conectado a las subunidades de proteina recubierta viral. Cuando se ensambla, las partículas virales comprenden largas disposiciones helicoidales de más de 1000 proteínas de fusión idénticas (que son moléculas de fusión de proteína extraña-de proteína recubierta normalmente) por viríón. Generalmente, la porción del inmunógeno será desplegada en la superficie externa de las partículas virales . De acuerdo a la presente invención, la estructura de las proteínas de cápsida de los virus de plantas y animales cumple estos requerimientos y pueden diseñarse para presentar péptidos inmunogénicos derivados del patógeno u otras fuentes con las cuales se produce una vacuna-adyuvante.
La proteína recubierta del virus de mosaico de papaya (PapMV) , por ejemplo, pero sin limitar a la misma, es un excelente candidato para el desarrollo de tal inmunógeno-portador-inmunopotenciador . Este virus hospeda una forma de bastoncillo cristalina y es muy repetitivo (1200 copias de la misma subunidad por virión) . Los experimentos de inmunización reciente con PapMV indican que este virus induce una respuesta inmune muy fuerte en ratones y es un excelente vector para el desarrollo de una vacuna. Este virus portador de inmunógeno puede diseñarse con varios péptidos inmunogénicos de las proteínas de envoltura superficial HCV, tales como por ejemplo, péptidos Salmonella typhii derivados de la proteína porina, y con el péptido a.9-23 de insulina. El ensamble de proteínas de cubierta de fusión transportadas por partículas similares a virus (las VLP) se definen como un portador de inmunógeno que tiene propiedades de adyuvante o inmunopotenciación . De acuerdo a la presente invención, es posible inmunopotenciar, o estimular una reacción inmune contra un antígeno dado. Se sabe particularmente que moléculas pequeñas con frecuencia actúan únicamente de manera pobre como inmunógenos en su capacidad para producir anticuerpos en un sistema in vivo. Cuando se une a un virus portador de inmunógeno de la presente invención, ese mismo es antigénico, dará lugar a respuesta de anticuerpo mejorada a la molécula más pequeña. La molécula pequeña unida al portador de inmunogeno en este sistema, puede llamarse un hapteno o antigeno y puede variar en tamaño desde pequeño hasta muy grande. En un ejemplo de esta combinación, de interés al campo de cuidado de la salud, una pequeña porción del antigeno de superficie de Hepatitis B, que comprende una secuencia de aminoácidos determinados, que no es por si misma antigénica, puede unirse covalentemente a la VLP, portador de inmunogeno de lapas de bocallave y el conjugado resultante produce anticuerpos en un sistema in vivo que puede ser reactivo transversal con un antigeno de superficie nativa de las VLP y también fuertemente con el virus de la hepatitis completo. Este sistema de portador de inmunogeno puede ser la base para una vacuna efectiva contra una enfermedad para la cual codifica el hapteno o antigeno. En la presente invención, se proporcionan ciertos portadores de inmunogeno novedosos como se describe posteriormente, que se producen convenientemente por técnicas de ADN recombinantes, que son útiles para proporcionar vacunas inmunogénicas monovalentes asi como multivalentes , y que emplean el concepto de portador de inmunogeno descrito anteriormente . Un inmunogeno se acopla a un portador VLP para formar un complejo portador de inmunogeno y puede entonces utilizarse en un huésped para provocar una respuesta inmune.
El inmunógeno puede ser especifico o reconocido para estructuras superficiales en células T, células B, células NK y macrófagos, pero no para las estructuras de superficie celular asociadas con la Clase I o Clase II de APC . El inmunógeno al cual el portador VLP se acopla puede comprender péptidos, haptenos, carbohidratos, proteínas, ácidos nucleicos y parte de virus, bacterias, parásitos y otros microorganismos completos. A pesar del inmunógeno seleccionado, debe acoplarse al portador VLP de tal manera que no interfiere con el reconocimiento del inmunógeno por el sistema inmune del huésped como una entidad antigénica . El complejo portador de inmunógeno puede utilizarse como una vacuna para elevar una respuesta inmune en el huésped. El complejo inicialmente puede darse en una dosis apropiada para producir una respuesta inmune. Esto puede seguirse por el impulso del complejo o inmunógeno solo. Una variación de este método puede incluir la formación de uno o más complejos portadores de inmunógeno en donde una o más formas de un inmunógeno se acoplan a uno o más portadores de las VLP y una pluralidad de tales complejos se administra. El propósito de administrar el complejo portador de inmunógeno es proporcionar protección al huésped en la forma de inmunidad al antigeno y evitar el uso de adyuvantes que tienen efectos secundarios adversos .
En una modalidad, el antigeno puede ser tan pequeño como un inmunógeno como un hapteno o puede ser relativamente grande, tal como parte de un virus. El tamaño y tipo de antigeno no es critico a la práctica de esta invención. Cualquier antigeno puede utilizarse para lo cual se desea una respuesta inmune en un huésped. La invención es especialmente útil, sin embargo, para pequeños haptenos débilmente inmunogénicos . Una vez que el complejo o complejos portadores de inmunógeno se forman, el complejo o complejos pueden administra se al huésped. El régimen de administración necesita no diferir de cualesquiera programas de vacunación generalmente aceptados. Una sola administración en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune efectiva puede utilizarse. Alternativamente, otros regímenes de administración inicial del complejo seguido por impulso con antigeno solo o uno o más complejos puede utilizarse. De manera similar, el impulso con el complejo o antigeno puede ocurrir a tiempos que tienen lugar después de la administración inicial si las concentraciones de anticuerpo caen debajo de los niveles aceptables. Una modalidad adicional de la presente invención es que como las VLP tienen una estructura helicoidal verdadera y multivalente regular que puede ser más inmunogénica que la agregación de proteina o subunidades libres de proteínas, esto puede ensamblarse fácilmente a partir de un ácido nucleico de codificación. También, la estabilidad mayor de la partícula puede proporcionar una exposición perdurable de la porción de inmunógeno al sistema inmune. La porción de virus en donde se une el inmunógeno, se dispone preferiblemente en la superficie externa de la VLP . De este modo, cuando la partícula se deriva del PapMV, la porción del portador puede disponerse en el término amino o carboxi, o insertarse en un bucle interno dispuesto en la superficie externa de la CP. Esto puede resultar en un ensamble mejorado cuando se compara con el ensamble de partículas que tienen una segunda porción en otra ubicación de la CP, y puede mejorar el reconocimiento inmune de la segunda porción en la superficie de partícula. En una modalidad de la presente invención, el desarrollo de vacunas de péptido que utilizan un vector viral permite producir vacunas en masa bajo condiciones de seguridad. Tanto como 1 gramo de virus recombinante por kilogramo de hojas infectadas frescas se espera con el PapMV recombinante . En otra modalidad de la presente invención, la administración de 200 ]ig de virus recombinante, o complejo portador de inmunógeno, que corresponde a 14 g de péptido, puede ser suficiente para inmunización. Otra hectárea de papaya infectada puede potencialmente ser suficiente para la vacunación de 5 millones de pacientes. Además, cultivar plantas es barato y eficiente. La agricultura es la forma más barata para producir biomasa debido a que no necesita equipo sofisticado . El virus o pseudovirus puede ensamblarse en la célula huésped para producir partículas de virus infectivas que comprenden ácido nucleico y proteína de fusión. Esto puede facilitar la infección de células adyacentes por la partícula de virus o pseudovirus infectivos y la expresión de la proteína de fusión en la presente. La célula huésped puede infectarse inicialmente con virus o pseudovirus en forma de partícula (es decir, en bastoncillos ensamblados que comprenden ácido nucleico y una proteína) o alternativamente en forma de ácido nucleico (es decir, ARN tal como ARN viral; ADNc o copias de escurrimiento preparadas a partir del ADNc) siempre que el ácido nucleico de virus utilizado para infección inicial pueda replicarse y provocar la producción de partículas de virus completo que tienen la proteína quimérica. La primera porción (viral) de la proteína de fusión puede ser cualquier proteína, polipéptido o partes del mismo, derivado de una fuente viral que incluye cualesquiera versiones modificadas genéticamente de la misma (tales como eliminaciones, inserciones, reemplazos del aminoácido y similares). En ciertas modalidades, la primera porción se derivará de una proteína de cubierta viral (o una versión modificada genéticamente de la misma) . Puede hacerse mención de la proteína de cubierta del virus de Mosaico de Papaya como siendo adecuado para este propósito. Una molécula de proteína de fusión puede ensamblarse con otras moléculas de proteína de fusión o con proteína de cubierta del tipo silvestre en un virión portador de inmunógeno. En una modalidad preferida de la invención, la partícula se deriva de un potivirus o aún más preferiblemente un potexvirus tal como PapMV, y en tal modalidad, la segunda porción se dispone preferiblemente, en o adyacente al término C de la proteína de cubierta. En PapMV, el término C de la proteína de cubierta forma un dominio en el exterior del virión. Preferiblemente, el polinucleótido que codifica para la porción inmunogénica se inserta en, o adyacente a un término del polinucleótido que codifica para la porción viral, de manera que hasta la traducción, la proteína de fusión tiene la porción viral en un extremo y la porción de inmunógeno en el extremo opuesto. No es necesario para la porción viral comprender una proteína de costo de virus completo, pero queda una elección alternativa. Un virus o pseudovirus genéticamente modificado para expresar la proteína de fusión forma una modalidad adicional de la presente invención, como lo hace cualquier célula huésped infectada con tal virus o pseudovirus . Preferiblemente, la célula huésped utilizada para replicar el virus o pseudovirus es una bacteria, en donde el virus es un virus de planta, aunque las células de plantas, células de insectos, células de mamíferos y bacterias pueden utilizarse con virus que replicarán en tales células . La célula es preferiblemente una bacteria tal como E. coli aunque otras formas de bacterias y otras células pueden ser útiles, tales como las células mencionadas anteriormente. La célula puede ser una célula huésped natural para el virus a partir del cual se deriva la partícula similar a virus, pero esto no es necesario. De acuerdo a una modalidad particular de la presente invención, se utiliza la partícula similar a virus completa para presentación estable y perdurable de epítopes de péptido para la vacunación de animales . De acuerdo a otra modalidad de la presente invención, PapMV y partículas similares al virus PapMV parecen ser muy estables y pueden almacenarse fácilmente a temperatura ambiente. Estas resisten a condiciones adveras y a temperatura muy elevada ya que los virus de las plantas han evolucionado para resistir condiciones muy difíciles que se encuentran en el ambiente. Esta es una ventaja muy importante cuando la vacuna debe alcanzar a gente que está viviendo en países pobres, en regiones en donde el acceso es difícil o para el almacenamiento de una prueba de diagnóstico durante un periodo largo. Alternativamente, la VLP descrita en la presente puede utilizarse sola como inmunopotenciador o adyuvante para mejorar una respuesta inmune en seres humanos o animales contra antigenos objetivo. Es preferible que el adyuvante o la VLP inmunopotenciado se administre concomítantemente con el antígeno contra lo que una respuesta debe incrementarse. Sin embargo, el adyuvante de la VLP puede administrarse previa o subsecuentemente a, dependiendo de las necesidades, la administración del antígeno a pacientes, seres humanos o animales . La presente invención será más fácilmente entendida refiriéndose a los siguientes ejemplos que se dan para ilustrar la invención en lugar de limitar su alcance. EJEMPLO I Preparación de la VLP portadora de inmunogeno La urgencia de la afinidad de péptidos seleccionados a partir del proceso de lavado en batea descrito en la presente se mejorará por multimerización de los péptidos. La multimerización se hará en la superficie del virus de mosaico de papaya (PapMV) que es un miembro del grupo potexvirus . El PapMV tiene una estructura similar a bastoncillo que se hace por ensamble de las subunidades CP. Una partícula de virus contiene 1200 subunidades. Se hará una fusión del péptido seleccionado con el PapMV CP. La fusión se hará para exponer el péptido a la superficie de las partículas de PapMV después del ensamble in vitro a partir de PapMV expresado y purificado de un sistema de expresión E. coli. El ensamble de la CP viral asegura entonces la multimerización del péptido y tiene avidez considerablemente mej orada . El gen de proteína de cubierta (CP) se clonó y desarrollo en un sistema in vitro utilizando la proteína de cubierta (CP) del virus de mosaico de papaya (PapMV) (Figura 1) . La CP de PapMV se produjo en E. coli en una gran cantidad
(Figura 2a) y produjo partículas similares a virus PapMV in vitro que son muy similares al virus wt (Figura 2b) . Se muestra para la primera vez que un PapMV CP recombinante puede ensamblarse en partículas similares a virus in vitro. La fusión de varios péptidos al término C de la CP se permite por ensamble in vitro y da lugar a partículas similares a virus que son más amplias que el virus wt debido a la fusión
( Figura 3 ) . EJEMPLO II Efecto de inmunopotenciación de la VLP portadora de inmunógeno Un adyuvante con frecuencia utilizado para incrementar la respuesta inmune de una vacuna candidata. El mejoramiento de la respuesta inflamatorio favorece la migración de más fagocitos al sitio de inyección que, a su vez resulta en una presentación de antigeno mejorada por células que presentan antigeno (APC) . Allun, emulsiones microparticulas y citocinas tales como GM-CSF han sido todas utilizadas para incrementar la respuesta inmune de la vacuna candidata . Se confirmó que el PapMV indujo por si mismo un episodio inflamatorio, eliminando asi la necesidad para adyuvantes adicionales. El modelo de bolsa de aire se utilizó para examinar si PapMV indujo un evento proinflamatorio in vivo. En este modo, el aire estéril se inyectó bajo el dorso de ratones en los dias 0 y 3. En el dia 7, los agentes pro-inflamatorios pueden inyectarse en la bolsa de aire y se midió la respuesta inflamatoria. Este modelo representa estrechamente sitios de inyección subcutáneos. La inyección de PapMV en el la bolsa de aire de ratones resultó en la acumulación de aproximadamente 8.5 x 106 leucocitos, comparados a 0.8 x 106 leucocitos en ratones inyectados con vehiculo (PBS) (Figura 4). Los neutrófilos (85%) y los monocitos (15%) se acumularon en la bolsa de aire 6 horas después de la inyección de PapMV. Aunque cantidades tan bajas como 1 pg de PapMV fueron suficientes para inducir la acumulación de leucocitos, la acumulación máxima ocurrió cuando 100 ug de PapMV se inyectó. Esta acumulación fue similar a una inducida por la inyección de 1 pg de LPS, un factor proinflamatorio poderoso. Estos resultados claramente demuestran que PapMV puede eficientemente inducir un episodio inflamatorio. Esta observación muestra claramente que PapMV se percibe por el sistema inmune que, induce señalización y reclutamiento de células implicadas en la defensa de nuestro organismo. Es probable que PapMV induzca la señalización a través de la inmunidad innata. Además, se mostró en el presente experimento que PapMV induce una respuesta humoral fuerte y perdurable en ratones (Figura 5) . 10 ratones se inyectaron con tres concentraciones de PapMV; 1, 10 y 100 otg . La respuesta de anticuerpo primario en ratones BALB/c inmunizados con PapMV se indujeron eficientemente de manera independiente de la ruta de inmunización (Figura 5) . Se detectaron concentraciones elevadas en el dia 5 después de la inmunización. Una curva clásica de una respuesta de IgM primaria se observó. Alrededor del dia 20, la respuesta de IgM estuvo ausente, aún después de impulsar ratones con más virus. La respuesta IgG en ratones inmunizados sigue una cinética clásica. Las concentraciones elevadas de anti-PapMV se detectaron en el dia 12 después de la inmunización e incrementaron proporcionalmente después del impulso con este virus. El análisis de isotipos IgG mostró una preferencia en la producción de IgG2b e IgGl durante la fase primaria y secundaria de la respuesta Ab. IgG3 incrementó concentraciones durante la fase de memoria de la respuesta Ab . Estos datos muestran que PapMV es capaz de inducir una respuesta Ab eficiente en ratones . Las respuestas primarias y secundarias se indujeron eficientemente asi como una memoria Ab perdurable . La producción preferencial de IgGl sugiere una liberación preferencial de IL-4. IL-4 favorece el proceso de interrupción a esta clase de IgG. Por lo tanto un equilibrio hacia la respuesta TH2 podría concebirse en estos ratones. La falta de IgG2a indica la ausencia de liberación de IFN-a, ya que esta citosina ha sido implicada directamente en un proceso de interrupción hacia este isotipo IgG. Tomados juntos, estos datos mostraron la capacidad de PapMV para inducir una respuesta de anticuerpo eficiente y perdurable. Este resultado sugiere que las partículas de PapMv son excelentes vectores para el desarrollo de una vacuna humoral. La fusión de un inmunógeno de interés a la VLP entonces se reconocerá también por el sistema inmune y accionará una respuesta inmune fuerte al epitope de interés. También, se ha encontrado que los PapMV VLP migran específicamente a los ganglios linfáticos y el bazo después de la inyección intraperitoneal o subcutánea en ratones Balb/C (Figura 6) . Este resultado indica que los PapMV VLP son excelentes portadores debido a que migran eficientemente a los sitios de emergencia de la respuesta inmune. Los datos experimentales demuestran que el antígeno de PapMV induce una respuesta de anticuerpo eficiente en ratones (Figura 5) . De hecho, las respuestas primarias y secundarias se inducen eficientemente asi como una memoria de anticuerpo perdurable (Figura 6) . Varias rutas de inmunización producen cantidades eficientemente grandes de anticuerpos. Únicamente la inmunización oral no resultó en una respuesta inmune. Es probable que el NaHC03 utilizado para neutralizar el ácido del estómago dañe las partículas virales y afecte la inmunogenicidad de las partículas. IgGl, IgG2a, IgG2b e IgG3 se presentaron aún 350 días después de una inyección de 100 µg de PapMV (Figura 6) . Debido a que IgG2a e IgG3 se presentan y persisten, puede deducirse que una respuesta de TH1 se induce con PapMV. Esto sugiere que las partículas de PapMV son vectores excelentes para el desarrollo de una respuesta humoral inmune a un antígeno extraño. La fusión de un epítope de interés a la partícula de PapMV debe ayudar a accionar una respuesta inmune humoral contra el epítope de interés . Los datos experimentales que utilizan el modelo de bolsa de aire en el dorso de ratones demostraron que el PapMV mejora la respuesta inflamatoria y favorece la migración de fagocitos al sitio de inoculación (Figura 6) . Este resultado confirma que PapMv induce por sí mismo un episodio inflamatorio, eliminando de este modo la necesidad para estrategias adyuvantes adicionales que aspiran en el mejoramiento de la presentación de antígeno por células que presentan antigeno. Resultados similares se obtuvieron con partículas similares a virus (las VLP) que hospedan la fusión de péptidos específicos generados in vitro a partir de proteínas recombinantes (Figura 6) . El reclutamiento fue muy rápido ya que se observaron el máximo de células entre 6 a 9 horas después del tratamiento (datos no mostrados) . Además, las partículas de PapMV son eficientes para inducir una respuesta inmune a ovalbumina, una proteína conocida por no ser inmunogénica (Figura 7) . Esto se estableció inyectando ratones (BalB/C) por la ruta intraperitoneal con 2 mg de ovalbumina, una proteína conocida por ser un inmunogeno muy débil, o en combinación con 50 o 100 ag de PapMV. Se inyectaron 6 ratones por tratamiento y se recolectaron muestran a 0, 4, 8, 12 y 20 días después de la inyección. Únicamente una inyección se hizo para cada tratamiento. Se detecto una respuesta inmune más fuerte, dos veces a ovalbumina en presencia de PapMV aún si la ovalbumina es un inmunogeno débil. Estas observaciones demuestran que las partículas PapMv se perciben rápidamente como extrañas por el sistema inmune del mamífero, que a su vez induce señalización y reclutamiento de células implicadas en la defensa del organismo .
EJEMPLO III Virus de la Hepatitis C como Objetivo de Vacunación El virus de la hepatitis C (HCV) es un virus de ARN de hebra positiva que provoca enfermedades del hígado crónicas y agudas . La fase aguda de la infección se asocia generalmente con síntomas suaves, pero puede conducir a cirrosis y carcinoma hepatocelular . Más de 170 millones de gentes alrededor del mundo están infectadas, lo que es 4 veces tanto como para el VIH. En unos cuantos años siguientes, el número de muertes por enfermedades asociadas con HCV pueden aún sobrepasar los índices de muerte provocadas por el SIDA. En el tiempo presente, terapias actuales contra HCV son insatisfactorias . Únicamente la terapia disponible es interferón (IFN) , pero la mayoría de HCV son resistentes debido a una inhibición de la proteína quinasa inducible al interferón (PKR) por proteína HCV E2. Se sabe que el 20% de pacientes infectados con HCV eliminan el virus. Esta observación sugiere que el sistema inmune puede eliminar el virus si reacciona eficientemente. Se sugiere también que podría ayudar a los pacientes infectados crónicamente si se impulsa el sistema inmune con una vacuna terapéutica contra HCV que podría ayudar a eliminar la infección elevando los anticuerpos neutralizantes al virus . Los 2 epítopes elegidos se encuentran en la superficie del virion HCV. El epitope El (285-303 aminoácidos) y el epitope E2 (512-536 aminoácidos) se mostró que son fuertemente inmunogénicos en pacientes que han eliminado la infección viral (David et al., 2001) . El PapMV se diseñó para hospedar en su término C la fusión del péptido El y E2 de HCV que, puede ensamblarse en partículas similares a virus PapMV in vitro (Figura 3) . Tres epítopes que se encuentran en la superficie del virión HCV de El y E2 fuera de HVR-1 en región conservada de las glicoproteínas de envoltura viral se eligieron. Un epitope El (285-303 aminoácidos) y 2 epítopes E2 (512-536 y 528-546 aminoácidos) se mostró que son fuertemente inmunogénicos en pacientes que han eliminado la infección viral. Además, un epitope E2 (512-536) se mostró que accionan la producción de anticuerpos neutralizantes que se encuentran en el suero del paciente que eliminaron la infección. Estas tres regiones son buenos candidatos para el desarrollo de vacuna HCV debido a que se conservan a través de subtipos y cepas de HCV y se ubican fuera de la región hipervariable de las glicoproteínas de envoltura. Las construcciones PapMV-El y Pap V-E2 se expresaron en E. coli. Las proteínas recombinantes se purificaron y ensamblaron in vitro. El ensamble de la CP recombinante con las fusiones HCV E2 generan las rVLP que son similares a la CP wt recombinante control excepto que parecen ser ligeramente más grandes debido a la fusión. Los ratones se inmunizaron con las VLP recombinantes que se produjeron in vitro. Los LPS se removieron utilizando una columna de poliximina e inyectaron en ratones intraperitoneal y subcutáneamente. Se utilizaron 1, 10 y 100 ag de las VLP y tres ratones se inyectaron para cada tratamiento. La respuesta inmune al péptido y al PapMV se analizó por ELISA. Se observó que los IgG se dirigieron al péptido asi como a la superficie de las VLP (Figura 8) . Este resultado muestra que el PapMV recombinante puede utilizarse para accionar una excelente respuesta inmune en la superficie de los epitopes y pueden utilizarse como vacunas sin la ayuda del adyuvante . EJEMPLO IV Inmunización contra tifoidea La fiebre tifoidea es una infección aguda del sistema reticuloendotelial , el tejido linfoide intestinal y la vesícula biliar que se provoca por la bacteria Salmonella typhii. Es aún alrededor del mundo una enfermedad significativa que afecta más de 16 millones de personas de las cuales, 600,000 no sobreviven a la infección. La mayoría de la infección afecta niños y adulaos jóvenes, y puede evitarse por vacunación. Diferentes tipos de vacunas están actualmente disponibles: 1) vacuna parental de célula completa conservada con fenol inactivada con calor (Wyet-Ayerst) administrada intramuscular o subcutáneamente. 2) Vacuna parental de célula completa secada e inactivada con acetona. 3) Vacuna parental de polisacárido Vi (no desnaturalizado) purificada (Aventis) que se administra por inyección en las deltoides. 4) cepa Vi-negativa atenuada con gal E, Ty21a, utilizada como una vacuna oral viva. Las bacterias parenterales inactivadas (tipo 1-3) pueden conducir a respuestas inmunes indeseadas debido a la complejidad del lipopolisacárido (LPS) y el número de antigenos presentados que producen efectos secundarios indeseables. Además, los polisacáridos Vi son antigenos independientes del timo (Robins and Robins, 1984) que mostraron tener una buena eficiencia en las pruebas de campo pero, se conocen también ser ineficientes para inducir memoria inmunológica . Varias exposiciones al antigeno se necesitan para mantener la protección, haciendo este método apropiado únicamente para viajeros que visitan áreas endémicas. Las vacunas actualmente disponibles no se adaptan a gente que vive permanentemente en áreas contaminadas. La vacuna basada en bacterias atenuadas (tipo 4) puede provocar náusea, vómito y dolor abdominal. No se recomienda también administrar esta vacuna a pacientes que sufren de inmunosupresión, enfermedades intestinales, diarrea, toma de antibióticos o a mujeres embarazadas y niños menores de 6 años de edad. Esta vacuna debe almacenarse a 4°C debido a que es sensible al calor y no se debe congelar. La sensibilidad de ty21A a condiciones adversas es problemática cuando se quiere alcanzar poblaciones que viven en países pobres bajo climas tropicales que, son las regiones más afectadas por la tifoidea . Una proteína de membrana de S. Typhii llamada porina se mostró que es un buen inmunógeno debido a que produce tanto respuesta inmune celular como anticuerpo en ratones y seres humanos y puede proteger ratones contra S. typhi. Las porinas son las proteínas más abundantes en la membrana de la bacteria Gram-negativa que funciona como canales de difusión pasivos para moléculas de peso molecular bajo. Estas proteínas despliegan un grado elevado de homología estructural y funcional, y asumen por lo tanto tener un antepasado común. Dos epítopes pequeños que corresponden al bucle 6 y 7 de la porina S. typhii que se exponen a la superficie de la bacteria se mostró que se implican en mecanismos protectores producidos por inmunización con porinas. Aquellas regiones son específicas para S. typhii y son excelentes epítopes para el desarrollo de una vacuna de subunidad recombinante . Se ha clonado en el término C del bucle 6 de PapMV CP de la porina de S. typhii. La proteína recombinante se purificó y las partículas similares a virus PapMV se produjeron in vitro con ARN como se describe anteriormente (Figura 3F) .
Se entiende que la invención no se restringe a las modalidades preferidas anteriores, y que las modificaciones son posibles siempre que estén dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.