KR20050044886A

KR20050044886A - 면역보조 바이러스 입자

Info

Publication number: KR20050044886A
Application number: KR1020057000114A
Authority: KR
Inventors: 데니스 르클레르; 나탈리 마조; 필립 테시에르; 콘스탄티노 로베르토 로페즈-마시아스
Original assignee: 데니스 르클레르
Priority date: 2002-07-05
Filing date: 2003-06-30
Publication date: 2005-05-13
Also published as: EP1523329B1; BR0312474A; JP4953570B2; MXPA05000287A; WO2004004761A2; ES2431963T3; US20050048082A1; CA2434000A1; WO2004004761A3; US20090280145A1; US8282940B2; EP2272525A3; CN1665528A; PT1523329E; NO20050396L; EP2272525A2; CA2434000C; JP2006504644A; US7641896B2; DK1523329T3

Abstract

본 발명은 면역증강 또는 면역보조 성질을 갖는 면역원-운반체에 관한 것이다. 더욱 특히, 면역원-운반체는 포텍스바이러스계, 가장 특히 파파야 모자이크 파파야 모자이크 바이러스로부터의 유사바이러스 입자(VLP)이다. 재조합 기술로부터 제조된 VLP 는 자체 단백질들 중 하나인 단백질 면역원과 융합된다. 상기 VLP, 및 바이러스, 박테리아 또는 기생충 병원균으로부터의 단백질 또는 단백질 추출물은 백신으로서 사용될 수 있다.

Description

면역보조 바이러스 입자{ADJUVANT VIRAL PARTICLE}

본 발명은 면역증강 또는 면역보조 활성을 갖는 면역원을 보유하는 바이러스 입자에 관한 것이다. 본 발명은 특히 재조합 바이러스 입자, 및 그 입자를 이용하여 인간 또는 동물에서의 면역 반응을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

백신접종은 감염성 질병들을 저지하기 위한 가장 효율적인 방법이다. 새로운 바이러스 질병들(예컨대, C형 간염 바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스)의 출현, 및 항체에 대한 병원성 박테리아(살모넬라 타이피(Salmonella typhii))의 내성이 문제가 된다. 이에 따라, 백신접종은 상기 질병들을 억제하는데 도움이 되는 효율적인 대안책이 된다.

지난 15년간, 유전공학으로 인해 방어 면역 반응의 원인이 되는 단백질 단편을 정확히 규명할 수 있었다. 그러므로, 새로운 백신접종 방안이 나타났다. 적당한 면역원성 펩티드에 의한 동물의 면역화에 의해, 질병들을 억제할 수 있는 중화 항체를 생산할 수 있었다. 이종 시스템에서의 상기 면역원성 펩티드의 발현은 서브유니트 백신의 기초를 마련하였다.

화학적으로 합성된 올리고펩티드는, 그것의 유도 기원인 단백질에 대한 항체의 생산을 자극할 수 있음이 입증되었으나, 펩티드 자체는 일반적으로, 백신으로서 작용하기에는 면역원성이 불충분하다는 것이 밝혀졌다. 그 때문에, 거대분자 구조물로 조립될 수 있는 운반체 분자에 펩티드 서열이 융합된 에피토프-제시 시스템을 개발하는 것이 상당한 관건이 되어 왔었다.

특이적 면역은, 항원을 숙주에게 투여할 때, 면역보조제와 같은 면역증강제를 사용함으로써 증진될 수 있다. 면역 반응은 면역계 내의 다양한 세포들에 의해 중재된다. 면역 반응에는 2 가지 유형, 즉 항체에 의해 중재되는 체액성 면역 및 세포독성 T 림프구에 의해 일차적으로 중재되는 세포성 면역이 있다. 항원 제시 세포("APC")는 B 세포 및 T 세포의 양자 모두에 대해 항원을 가공하여 제시한다. B 세포는 활성화의 결과로서 특정 항체를 분비하고, T 세포는 체액성 반응에 대한 보조 세포 또는 세포독성 세포가 되어, 항원을 직접 공격한다. 면역보조제는 상기 면역 반응들을 증대시키는 것으로 나타났다.

항원의 초기 제시는 IgM 및 IgG 항체를 모두 유도하고, 1차 반응을 형성한다. 그러나 이 항체 생성은 시간 경과에 따라 감퇴될 수 있다. IgG 항체 생성에 주로 관련되는 2차 반응은 2차적이거나 시간적으로 나중인 항원 제시에 의해 촉발될 수 있다. 그러나 2차 반응, 또는 심지어 1차 반응은 단지 숙주를 항원으로 프라이밍하는 것만으로 확실히 일어나지 않는다.

항원 투여에 있어 빈번히 겪게 되는 난점은 면역계가 반응하게 되는 정도이다. 특정 항원은 면역원성이 매우 강하지 않아, 투여 시에 약한 1차 반응을 일으키거나, 전혀 반응을 일으키지 않는다. 그러한 경우에, 면역계는 2차 도전에 반응하지 않을 수 있고, 예를 들어 숙주가 항원을 이용한 면역화로써 방지하고자 하는 질병 또는 상태를 겪게 될 수 있다.

그러한 상황에서는, 생리학적 반응 조절제("PRM")를 제공하는 것이 통상적이다. PRM 은 일반적으로 면역증강 화합물로서 정의된다. 그것은 보르델라 페르투씨스(Bordella pertussis) 또는 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)과 같은 박테리아로부터 유도될 수 있다. PRM 은 또한 폴리뉴클레오티드, 흉선 호르몬과 같은 생리학적 활성 분자, 및 면역보조제와 같은 화학물질들을 포함할 수도 있다.

면역보조제는, 보다 높은 항체 역가 및 연장된 숙주 반응을 발생시키는 항원과 함께 투여될 때에 면역계 반응을 증진시키는 화합물이다. 통상적으로 사용되는 면역보조제는 수중유 에멀션으로 이루어진 불완전 프로인트 면역보조제, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 첨가와 함께 상기 것을 포함하는 프로인트 완전 면역보조제, 및 백반을 포함한다. 그러나 상기 물질들을 인간에게 사용함에 있어서의 문제점은, 그것들이 독성이거나, 숙주로 하여금 주사 부위에 병변을 일으키게 할 수 있다는 것이다.

또 다른 접근법이 가와무라(Kawamura) 및 베르조프스키(Berzofsky)의 [J. Immunol., 136:58 (1986)]에 기재되어 있다. 이 접근법에서, 특정 B 세포 상에 존재하는 면역글로불린과 반응성을 갖는 항-Ig 항체를 페리틴 및 미오글로빈에 복합시켜, 불완전 프로인트 면역보조제와 함께 마우스에 투여하였다. 그 혼합물의 면역원성은 향상되었으나, 면역보조제를 첨가하지 않은 경우에는 혼합물의 면역원성이 나타나지 않았다. 또한, 프로인트 완전 면역보조제, 프로인트 불완전 면역보조제 및 몬타나이드와 같은 면역보조제는 항원에 대한 면역 반응을 크게 증진시킬 수 있는 반면, 몇가지 결점들을 가진다. 주사가능한 형태의 항원과 함께 사용될 때, 주사 부위에 큰 병변이 종종 형성되어, 이 상황은 그것을 인간, 애완동물 또는 육류 동물에서의 그것의 사용을 불만족스럽게 한다. 또한 이 면역보조제는 경구 또는 장내 투여 시에 면역증강제로서 작용하지 못한다.

상이한 성질의 면역원 또는 항원의 운반체가 비교적 용이하게 유전공학 처리될 수 있음이 당업계에 알려져 있다. 식물 바이러스는 식물 내에 생산될 수 있고, 본 용도에 용이하게 채택되는 시스템이다. 동부 모자이크 바이러스(CPMV), 담배 모자이크 바이러스 X(TMVX) 및 알팔파 모자이크 바이러스(AIMV) 가 당해 에피토프를 제시하기 위해 변형된 것으로 알려져있다. 또 다른 식물 바이러스 벡터로서, 포텍스바이러스 군의 한 구성원인 감자 바이러스 X(PVX)가 완전한 단백질 오버코트의 운반을 견딜 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 미국 특허 제 6,232,099 호 및 제 6,042,832 호, 국제 특허 출원 공개번호 제 WO 97/39134 호, 제 WO 02/04007 호, 제 WO 01/66778 호, 제 WO 02/00169 호 및 EP 출원 제 1167530 호는 모두 외인성 단백질과 융합된 외래 단백질을 운반하는 유사바이러스 입자의 상이한 변형체들을 기재하고 있다. 그러나, 상기 참고문헌 중 그 어느 곳에서도, 상기 입자가 임의의 면역증강성 또는 면역보조성을 가진다고 언급되어 있지 않다.

본원에 기재된 당 기술 상태를 고려할 때, 면역보조제 및 실제로 사용되는 2차 백신접종의 사용을 피하면서 인간 및 동물을 강하게 면역화할 수 있도록 하는 화합물 및 운반체 입자가 여전히 절실히 요구된다.

발명의 개시

본 발명의 한 목적은 유사바이러스 입자(VLP)의 단백질 또는 그것의 단편과 융합된 하나 이상의 면역원을 운반하는 VLP로 이루어지는, 면역증강성을 갖는 면역원-운반체 복합체로서, 단백질 또는 그것의 단편에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물을 제조하는데 사용될 수 있는 면역원-운반체 복합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 유사바이러스 입자(VLP), 및 바이러스, 박테리아 또는 기생충으로부터 유도된 단백질 또는 추출물을 포함하는 조성물로서, 백신으로서 사용될 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에 따라서, 유사바이러스 입자(VLP)의 단백질 또는 그것의 단편과 융합된 하나 이상의 면역원을 운반하는 VLP로 이루어진 면역원-운반체를 인간 또는 동물에게 투여하거나, VLP 또는 그것의 단편을 상기 VLP 에 직접적으로 연결되지 않은 항원과 동시에 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 동물에서의 면역 반응을 면역증강시키는 방법도 또한 제공된다.

본 발명은 또한 유사바이러스 입자(VLP)의 단백질과 융합된 하나 이상의 면역원을 운반하는 VLP 로 이루어지는 면역원-운반체 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 유사바이러스 입자(VLP)의 단백질의 단편과 융합된 하나 이상의 면역원을 운반하는 VLP 로 이루어지는 면역원-운반체 복합체 또는 VLP 단독을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 면역원-운반체 복합체가 식물 세포, 동물 세포 또는 미생물 내에서 발현될 때 조립될 수 있는 능력을 갖는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

본 발명은 또한 파파야 모자이크 바이러스의 면역보조제로서의 용도를 제공한다.

본 발명의 목적을 위해, 하기 항목들이 이하에 정의된다.

"키메라 단백질"이라는 표현은 정상적으로 2 개의 분리된 단백질을 코딩하는 2 개 이상의 유전자가, 천연적으로 또는 인간 개입의 결과로서 재조합하여, 상기 각각의 2 개 단백질들의 모두 또는 일부의 조합물인 단백질을 코딩할 때 이용된다.

"융합 캡시드 단백질"이라는 표현은, 융합에서의 유전자들 중 하나가 식물 바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 융합 단백질을 의미한다.

본원에 사용된 "방어 면역"이라는 표현은, 병원균의 항원에 노출된 결과로서, 포유동물, 조류 또는 어류와 같은 동물들이 병원균에 접촉에 따른 질병 또는 사망에 저항할 수 있도록 하는 능력을 의미하기 위한 것이다. 방어 면역은 점막성, 체액성 또는 세포성 면역의 메커니즘들 중 하나 이상에 의해 달성된다. 점막성 면역은 주로 호흡관(기도), 위장관 및 비뇨생식관의 점막성 표면상에서의 분비된 IgA(sIGA) 항체의 결과이다. sIGA 항체는 항원-처리 세포, B 및 T 림프구에 의해 중재되는 일련의 발생건들의 후에 발생되며, 이는 체내의 점막이 정련된 조직상의 B 림프구에 의한 sIGA 생성을 초래한다. 점막성 면역은 경구용 백신에 의해 자극될 수 있다. 방어 면역의 1차적 결과는, 병원균의 파괴 또는 그 병원균의 자기 복제 능력의 억제이다.

본원에 사용된 "체액성 면역"이라는 표현은 혈청 내에서의 IgG 항체 및 IgM 항체의 결과를 의미한다.

본원에 사용된 "세포성 면역"이라는 표현은, 항체에 대한 요건없이 T 세포가 관련되는 다른 메커니즘뿐만 아니라, 세포독성 T 림프구를 통해, 또는 마크로파지 및 T 림프구에 관여하는 지연형 과민성을 통해 달성될 수 있다.

"재조합 바이러스"는 바이러스의 유전 물질이 다른 유전 물질과 함께 조합된 것이다.

본원에 사용된 용어 "폴리펩티드" 또는 "펩티드"라는 용어는 펩티드 결합에 의해 연결된 4 개 이상의 아미노산이 있는 분자를 의미하기 위한 것이다.

본원에 사용된 "바이러스 핵산"이라는 표현은 바이러스의 게놈(또는 그것의 주요부), 또는 염기 서열에 있어 그 게놈에 대해 상보적인 핵산 분자일 수 있다. 바이러스 RNA 에 대해 상보적인 DNA 분자도 또하 바이러스 핵산인 것으로 간주된다, 염기 서열에 있어 바이러스 DNA 에 대해 상보적인 RNA 분자도 또한 바이러스 핵산인 것으로 간주된다.

본원에 사용된 "유사바이러스 입자"(VLP)라는 용어는 바이러스 입자에 대해 유사한 물리적 외관을 갖는 자기 조립 입자를 가리키고, 슈도바이러스를 포함한다. 유사바이러스 입자는 야생형 바이러스의 특정 유전자의 비정상 복제물이 결여되거나 그것을 보유할 수 있으며, 이는 복제 및/또는 세포간 이동과 같은 야생형 바이러스의 특성인 일부 기능을 수행할 수 없는 유사바이러스-입자를 초래할 수 있다.

본원에 사용된 "백신"이라는 용어는 융합 단백질, 그 단백질이 일부인 임의의 입자, 또는 그 단백질이 일부인 식물 물질과 같은 임의의 제제를 의미하기 위한 것이다.

본원에 사용된 "면역증강제"라는 용어는, 항원과 혼합될 때 면역원성 또는 항원성을 증진시키고, 우수한 면역 반응을 제공하는 물질을 의미하는 것으로 의도된다. 그것은 마크로파지 및 다른 항원 제시 세포에 대한 보조자극제의 발현을 증진시킬 수 있음이 인지될 것이다.

도 1 은 정제된 PapMV 의 전자현미경사진을 보여주고;

도 2 는 PapMV CP(A)의 트리신 SDS-PAGE 분석을 보여주며, PapMV VLP(B)의 표면에서 융합물이 노출되는 것을 보여주는 면역금표지법을 설명하고;

도 3A 내지 3G 는 생체외 조립된 PapMV 및 PapMV VLP 의 전자현미경사진을 보여주며;

도 4 는 공기 파우치 모델에서의 PapMV 에 의해 유도된 백혈구 축적을 보여주고;

도 5 는 PapMV 또는 ISS(등장성 염액)을 한 번 복강내 주사한 마우스(각 농도에 대해 6 마리)에서 PapMV 에 대한 면역 반응을 보여주며;

도 6 은 PapMV 또는 ISS(등장성 염액)을 한 번 복강내 주사한 마우스(각 농도에 대해 6 마리)에서 PapMV 에 대한 면역 반응을 보여주고;

도 7 은 오브알부민에 대한 면역보조제로서의 PapMV 효능의 평가를 보여주며;

도 8A 및 8B 는 HCV 표면 당단백질의 E1 및 E2 로부터 유도된 HCV 펩티드 및 PapMV 에 대한 면역 반응의 특징화를 보여주고;

도 9 는 복강내 주사한 경우의, 림프절 및 비장으로의 PapMV CP 의 특이적 이동을 보여주는 웨스턴 블로팅을 보여준다.

본 발명을 수행하기 위한 방법

본 발명에 따라, 내인성 바이러스 단백질과 융합된 면역원을 운반하는 유사바이러스 입자가 제공되며, 이에 따라 면역증강 또는 면역보조 효과를 가질 수 있는 새로운 유형의 면역원-운반체가 형성된다.

본 발명의 한 구현예에서, 면역원 또는 합텐에 유전적으로 연결될 때, 복합체가 비경구, 장내 또는 경구적으로 투여되는지의 여부와 관계없이 면역원 또는 합텐에 대한 숙주의 면역 반응을 증진시킬 수 있는 한 분류의 운반체가 제공된다.

마크로파지, B 림프구 및 수상돌기 세포와 같은 부세포는 T 세포-의존성 면역 반응의 유도에 필수적이다. 부세포는 MHC-제한 T 세포에 대해 항원을 제시하고, T 림프구의 증폭 및 분화를 증진시키는, 막과 연합되어 분비된 보조자극제를 생산한다. 그러므로, 경쟁적 부세포의 존재는 T 세포-의존성 면역 반응을 자극하고, 그것의 부재는 결핍 반응을 초래한다. 그러한 항원 제시 세포(APC)에 의해 초래된 휴지기 마크로파지 및 미분화(naive) 비자극 B 림프구는 미분화 CD4+ T 세포를 자극하지 못할 수 있고, 심지어는 T 세포 내성을 유도할 수 있다. 대조적으로, 수상돌기 세포 및 활성화된 마크로파지 및 B 세포는 높은 수준의 APC 뿐만 아니라, 보조자극제를 발현한다. 본 발명의 면역원-운반체의 작용 메커니즘은 마크로파지 및 다른 APC 에 대한 보조자극제의 발현을 증진시키는 것이다. 이로 인해, 면역보조제로서 동시에 작용하는 본 발명의 면역원 운반체와 함께 면역원 또는 단백질 항원을 투여함으로써, 세포-중재 면역 및 T 세포-의존성 항체 생산이 촉진된다. 면역원은 본 발명의 면역원-운반체와 조합하여 투여될 때, 전신 면역을 발생시키는데 가장 효과적이다.

첫 번째 구현예에서, 본 발명은 복합체를 숙주에 투여될 때 복합체 분자가 면역원에 대한 숙주의 면역 반응이 증진되도록 하는, 운반체 유사바이러스 입자(VLP)와 결합된 면역원을 포함하는 복합체로서, 면역원이 항원 또는 합텐 중 하나를 포함할 수 있고, 운반체 분자가 바이러스의 일체적 입자를 포함하는 복합체를 제공한다. 더욱 특히, 본 발명의 바이러스는 식물 바이러스이다.

B 세포의 양호한 반응을 수득하기 위한 한 방법은, 조직화된 방식으로 항원을 제시하는 것이다. 반복 정렬된 에피토프는 B세포 수용체에 효율적으로 가교결합하여, 즉각적 T-비의존성 IgM 반응을 유도한 후에, IgG 반응을 유도하는 것임을 알 수 있다. 그러므로, 에피토프의 면역원성, 및 면역계에 대한 인식 및 제시를 증가시키기 위한 좋은 방안은 PapMV 와 같은 식물 바이러스의 표면 상에 유사조직화 방식으로 면역우성의 에피토프를 발현시키는 것이다. 특히, PapMV 는, 계통발생적으로 먼 항원이고, 포유동물 면역계에 대해 외인성이며, 분자적으로 매우 복잡하며, 고분자량을 갖는 조직화 구조물이기 때문에, 양호한 면역보조제 및 운반체의 수가지 특성들을 수행한다.

놀랍게도, 본 출원인들에 의해, 결정성인 반복적 구조물은 고유 면역계에 의해 인식될 뿐만 아니라, 부가적으로 면역화된 숙주의 면역계에 대해서도 면역보조 효과를 가진다는 것이 인식되었다.

본 발명의 한 구현예에서, 양성의 고 복제수의 막대형 바이러스, 바람직하게는 파파야 모자이크 바이러스(PapMV)와 같은 식물 바이러스의 사용이 바이러스 외피 단백질 서브유니트에 연결된 면역원을 생산하는 방법이 제공된다. 바이러스 입자들은 조립 시에, 1개의 비리온당, 1000개 초과의 동일한 융합 단백질(이들은 전형적으로 외피 단백질-외래 단백질 융합 분자임)의 나선형의 긴 배열을 포함한다. 일반적으로 면역원 부분은 바이러스 입자의 외부 표면 상에 표시되게 된다.

본 발명에 따라서, 식물 및 동물 바이러스의 캡시드 단백질의 구조물은 상기 요건들을 준수하고, 병원균 또는 백신-면역보조제가 부가 생성되게 되는 다른 기원으로부터 유도된 면역원성 펩티드를 제시하도록 공학처리될 수 있다. 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 파파야 모자이크 바이러스(PapMV)의 외피 단백질은, 그러한 면역원-운반체-면역증강제의 개발을 위한 우수한 후보물이다. 이 바이러스는 결정성 막대 모양을 가지고, 매우 반복적이다(1개 비리온 당, 1200 복제수의 동일 서브유니트). PapMV 를 이용한 최근 면역화 실험은, 이 바이러스가 마우스 내에 매우 강한 면역 반응을 유도하고, 백신 개발을 위한 우수한 벡터임을 가리킨다. 이 면역원 운반체 바이러스는, 예를 들어 포린 단백질로부터 유도된 살모넬라 타이피의 펩티드와 같은 HCV 표면 엔벨로프 단백질의 수개의 면역원성 펩티드, 및 인슐린의 펩티드 α9-23 로 처리될 수 있다. 유사바이러스 입자(VLP)에 의해 운반되는 융합 외피 단백질이 조합은 면역보조성 또는 면역증강성을 갖는 면역원-운반체로 정의된다.

본 발명에 따라, 소정의 항원에 대한 면역 반응을 강화시키거나 면역증강시키는 것이 가능하다. 작은 분자는 생체내 시스템에서 항체를 도출하는 능력에 있어 면역원으로서 종종 단지 불량하게 작용한다는 것이 특히 알려져 있다. 그것은 자체가 항원성인 본 발명에 따른 면역원-운반체 바이러스에 부착될 때, 보다 작은 분자들에 대한 향상된 항체 반응을 일으킬 것이다. 이 시스템에서 면역원-운반체에 부착된 작은 분자는 합텐 또는 항원으로 불릴 수 있고, 작은 크기에서 매우 큰 크기까지 그 크기가 다양할 수 있다. 건강 보호 분야에 대해 관건이 되는 상기 조합의 한 예에 있어서, 자체가 항원성이 아닌 결정된 아미노산의 서열을 포함하는 B형 간염 표면 항원의 작은 부분은 VLP, 즉 키홀 삿갓조개류(KL) 면역원-운반체에 공유 결합될 수 있고, 수득된 복합체는 VLP 의 천연 표면 항원과 상호 반응하고, 또한 전체 간염 바이러스와도 매우 강하게 상호 반응할 수 있는 생체내 시스템에서 항체를 도출한다. 면역원-운반체의 이 시스템은 합텐 또는 항원이 코딩하는 질병에 대해 효과적인 백신의 기초가 될 수 있다.

본 발명에 있어서, 다가 면역원성 백신뿐만 아니라, 단가 면역원성 백신을 제공하는데 유용하고, 상술한 면역원-운반체 개념을 이용하는, 재조합 DNA 기술에 의해 편리하게 제조되는, 이하 기술되는 특정의 신규 면역원-운반체가 제공된다.

면역원은 운반체 VLP 에 결합되어, 면역원-운반체 복합체를 형성하고, 이는 숙주 내에서 사용되어 면역 반응을 일으킬 수 있다. 면역원은 T 세포, B 세포, NK 세포 및 마크로파지상의 표면 구조물에 대해 특이적이거나 인식될 수 있으나, I-류 또는 II-류 APC 연합 세포 표면 구조물에 대해서는 그러하지 않다.

운반체 VLP 가 결합되는 면역원은 펩티드, 합텐, 탄수화물, 단백질, 핵산, 및 바이러스, 박테리아, 기생충 및 기타 전체 미생물의 일부를 포함할 수 있다. 선택된 면역원에 상관없이, 그것은 항원성 실체로서 숙주의 면역계에 의한 면역원의 인식을 간섭하지 않는 식으로 운반체 VLP 에 결합되어야 한다.

면역원-운반체 복합체는 숙수 내에서 면역 반응을 일으키는 백신으로서 사용될 수 있다. 초기에 복합체는 면역 반응을 도출하기 위한 적당량으로 주어질 수 있다. 그 후, 복합체 또는 면역원 단독으로 면역강화될 수 있다. 이 접근법의 다양한 형태는 하나 이상의 형태의 면역원이 하나 이상의 운반체 VLP 와 결합하고, 다수의 상기 복합체들이 투여되는, 하나 이상의 면역원-운반체 복합체의 형성을 포함할 수 있다.

면역원-운반체 복합체를 투여하는 목적은, 항원에 대한 면역 형태로 숙주에 대한 방어를 제공하고, 원치 않는 부작용을 갖는 면역보조제의 사용을 피하기 위한 것이다.

한 구현예에서, 항원은 합텐과 같이 작은 면역원일 수 있거나, 바이러스의 부분과 같이 비교적 클 수 있다. 항원의 크기 및 유형은 본 발명의 수행에 대해 결정적이지 않다. 면역 반응이 숙주 내에서 요망되는 항원이라면 어느 것이나 사용될 수 있다. 그러나 본 발명은 작은, 면역원성이 약한 작은 합텐에 특히 유용하다.

일단 면역원-운반체 복합체(들)가 형성되면, 복합체(들)는 숙주에 투여될 수 있다. 투여법은 임의의 다른 일반적으로 수용되는 백신접종 프로그램과 상이할 필요는 없다. 효과적인 면역 반응을 도출하기 위한 충분량의 단일 투여가 사용될 수 있다. 대안적으로, 초기에 복합체를 투여한 후, 항원 단독 또는 하나 이상의 복합체로 면역강화하는 다른 방식도 사용될 수 있다. 유사하게, 항체 역가가 허용가능한 수준 미만일 경우에 초기 투여 후에 잘 행해지는 복합체 또는 항원 중 하나로 면역강화하는 것이 종종 이루어질 수 있다.

본 발명의 다른 한 구현예는, VLP 가 단백질의 응집체 또는 단백질의 유리 서브유니트보다 더욱 면역원성을 가질 수 있는 정규 다가성이고 진정으로 나선형이 구조물을 가지므로, 그것이 코딩 핵산으로부터 용이하게 조립될 수 있다는 것이다. 또한, 입자의 보다 큰 안정성은 면역계에 대한 면역원 부분의 노출이 오래 지속되도록 할 수 있다.

면역원이 부착되는 바이러스 부분은 바람직하게 VLP 의 외부 표면 상에 배치된다. 이에 따라, 입자가 PapMV 로부터 유도될 경우, 운반체의 부분은 아미노 말단 또는 카르복시 말단 상에 배치될 수 있거나, CP 의 외부 표면상에 배치된 내부 루프에 삽입될 수 있다. 이는 CP 의 또 다른 한 위치상에 있는 두 번째 부분을 갖는 입자의 조립과 비교시에, 향상된 조립을 가져올 수 있고, 입자 표면 상에 두 번째 부분의 면역 인식을 증진시킬 수 있다.

본 발명의 한 구현예에서, 식물 바이러스 벡터를 이용한 펩티드 백신의 개발은 안전한 조건 하에서 백신의 대량 생산을 가능하게 한다. 새로운 감염된 잎 1 kg 당, 재조합 바이러스 1 g 만큼의 양이 재조합 PapMV 로 예상된다.

본 발명의 또 다른 한 구현예에서, 200 ㎍ 의 재조합 바이러스, 또는 14 ㎍ 의 펩티드에 상응하는 면역원-운반체 복합체의 투여가 면역화를 위해 충분할 수 있다. 이에 따라, 1 헥타아르의 감염 파파야는 5백만명 환자들을 백신접종하는데 가능히 충분할 수 있다. 또한, 식물 재배는 값싸고 효율적이다. 농업은 복잡한 장비를 필요로 하지 않기 때문에, 생물자원을 생산하는데 가장 값싼 방법이다.

바이러스 또는 슈도바이러스는숙주 세포 내에 조립되어, 핵산 및 융합 단백질을 포함하는 감염성 바이러스 입자를 생산할 수 있다. 이는 감염성 바이러스 또는 슈도바이러스 입자에 의한 인접 세포의 감염, 및 그 안의 융합 단백질의 발현을 가능하게 할 수 있다.

숙주 세포는 초기에 입자 형태(즉, 핵산 및 단백질을 포함하는 조립된 막대 형태), 또는 대안적으로 핵산 형태(즉, 바이러스 RNA 와 같은 RNA; cDNA 또는 cDNA 로부터 제조된 런-오프 전사체)로 바이러스 또는 슈도바이러스에 감염될 수 있으며, 단 초기 감염에 사용된 바이러스 핵산은 복제될 수 있고, 키메라 단백질을 갖는 전체 바이러스 입자가 생산되도록 할 수 있다.

융합 단백질의 첫 번째(바이러스)부분은, 임의의 유전적으로 변형된 형태(예컨대 결실, 삽입, 아미노산 치환 등)를 포함하는 바이러스 기원으로부터 유도된, 임의의 단백질, 폴리펩티드 또는 그것의 부분일 수 있다. 특정 구현예에서, 첫 번째 부분은 바이러스 외피 단백질(또는 그것의 유전적으로 변형된 형태)로부터 유도되게 된다. 이 목적에 적당한 것으로서, 파파야 모자이크 바이러스의 외피 단백질을 들 수 있다. 융합 단백질 분자는 다른 융합 단백질 분자나, 야생형 외피 단백질과 함께 면역원-운반체 비리온으로 조립될 수 있다.

본 발명의 한 바람직한 구현예에서, 입자는 포티바이러스, 또는 더욱 바람직하게는 PapMV 와 같은 포텍스바이러스로부터 유도되고, 그러한 한 구현예에서, 두 번째 부분은 바람직하게 외피 단백질의 C-말단에 또는 그와 인접한 곳에 배치된다. PapMV 에서, 외피 단백질의 C-말단은 비리온의 외부상에 도메인을 형성한다.

바람직하게, 면역원 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바이러스 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 말단에 또는 그와 인접한 위치에 삽입되므로, 번역 시에 융합 단백질은 한 끝에 바이러스 부분을 가지고, 반대 쪽 끝에 면역원 부분을 가진다. 바이러스 부분은 전체 바이러스 외피 단백질을 포함할 필요는 없으나, 이는 여전히 대안적 선택이 된다.

융합 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형된 바이러스 또는 슈도바이러스는, 그러한 바이러스 또는 슈도바이러스로 감염된 임의의 숙주 세포와 마찬가지로, 본 발명의 다른 한 구현예를 형성한다.

바람직하게, 식물 세포, 곤충 세포, 포유동물 세포 및 박테리아가 그러한 세포에서 복제하는 바이러스와 함께 사용될 수 있으나, 바이러스가 식물 바이러스인 경우, 바이러스 또는 슈도바이러스를 복제하는데 사용되는 숙주 세포는 박테리아이다. 상기 언급된 세포들과 같이, 다른 세포 및 다른 형태의 박테리아가 유용할 수 있으나, 세포는 바람직하게 E. 콜라이(E. coli)와 같은 박테리아이다. 세포는 유사바이러스 입자의 유도 기원인 바이러스를 위한 천연 숙주 세포일 수 있으나, 이는 필수적이지 않다.

본 발명의 한 특별한 구현예에 따라, 전체 유사바이러스 입자는 동물의 백신접종을 위한 펩티드 에피토프를 안정하고 장기 지속적으로 제시하는데 사용된다.

본 발명의 또 다른 한 구현예에 따라, PapMV 및 PapMV 유사바이러스 입자는 매우 안정한 것으로 보이며, 실온에서 용이하게 저장될 수 있다. 식물 바이러스가, 우리가 환경에서 찾게 되는 매우 어려운 조건에 대해 내성을 갖도록 진화되었기 때문에, PapMV 및 PapMV 유사바이러스 입자는 매우 높은 온도 및 역조건에 대해 내성을 가진다. 이는, 가난한 국가들에서, 접근이 곤란한 구역에 사는 사람들에게 도달해야만 할 때, 또는 장기간 진료 테스트의 저장 기간 동안에 백신을 도달시켜야 할 때 매우 중요한 이점이 된다.

대안적으로, 본원에 기재된 VLP 는 표적 항원에 대한 인간 또는 동물에서의 면역 반응을 증진시키기 위한 면역증강제 또는 면역보조제로서 단독 사용될 수 있다. 면역보조 또는 면역증강 VLP 는 면역 반응이 일어나야 하는 대상 항원과 동시에 투여되는 것이 바람직하다. 그러나 면역보조 VLP 는, 필요에 따라, 환자, 인간 또는 동물에 대한 항원 투여 전이나 그 후에 투여될 수 있다.

본 발명은 이하 본 발명의 범주를 제한하지 않으면서 상세히 설명하기 위해 제공된 실시예를 참조로 하여, 더욱 잘 이해되어진다.

실시예 I

면역원-운반체 VLP 의 제조

본원에 기재된 패닝(panning) 공정에서 선택된 친화성 펩티드의 강친화력(avidity)은 펩티드의 다량체화에 의해 향상되게 된다. 다량체화는 포텍스바이러스 군의 한 구성원인 파파야 모자이크 바이러스(PapMV)의 표면에서 행하여진다. PapMV 는 CP 서브유니트의 조립에 의해 만들어진 막대형 구조를 가진다. 한 바이러스 입자는 1200 개의 서브유니트를 가진다. 본인들은 선택된 펩티드를 PapMV CP 와 융합시킨다. E. 콜라이 발현 시스템으로부터 발현 및 정제된 PapMV CP 로부터의 생체외 조립 후에, PapMV 입자의 표면에 펩티드를 노출시키기 위해 융합시킨다. 이어서 바이러스 CP 의 조립은 펩티드를 확실히 다량체화시켰고, 강친화력을 상당히 향상시켰다.

파파야 모자이크 바이러스(PapMV)의 외피 단백질(CP)을 이용하여, 외피 단백질(CP) 유전자를 클로닝하여, 생체외 조립 시스템을 개발하였다 (도 1). PapMV 의 CP 는 E. 콜라이 내에서 다량으로 생성되었고 (도 2a), wt 바이러스와 매우 유사한 생체외 PapMV 유사바이러스 입자 내에서 생성되었다 (도 2b). 재조합 PapMV CP 는 유사바이러스 입자 내에서 생체외 조립될 수 있음을 처음으로 알 수 있다. 수개의 펩티드가 CP 의 C-말단에 융합되는 것은 생체외 조립에 의해 가능하고, 융합으로 인해 wt 바이러스보다 더 넓은 유사바이러스 입자를 발생시킨다 (도 3).

실시예 II

면역원-운반체 VLP 의 면역증강 효과

면역보조제는 후보 백신의 면역 반응을 증가시키기 위해 종종 사용된다. 염증 반응의 증진은 더 많은 식세포가 주사 부위로 이동하는 것을 선호하는데, 이로써 항원 제시 세포(APC)에 의한 항원 제시가 향상되게 된다. 백반, 에멀션, 마이크로입자 및, GM-CSF 와 같은 사이토킨은 모두 후보 백신의 면역 반응을 증가시키는데 사용되어져 왔다. PapMV 는 스스로 염증성 에피소드를 유도하였고, 이에 부가적 면역보조제의 필요가 없어졌음이 확인되었다. 공기 파우치 모델을 이용하여, PapMV 가 생체내 전염증 상황을 유도하였는지를 조사하였다. 이 모델에서는, 무균 공기를 0 및 3 일째에 마우스의 등 아래에 주사한다. 7 일째에, 전염증제를 공기 파우치에 주사하여, 염증 반응을 측정할 수 있다. 이 모델은 피하 주사 부위를 근접하게 나타낸다.

비히클-주사한 마우스(PBS)에서는 0.8 ×10⁶ 개의 백혈구가 축적된 것에 비해, PapMV 를 쥐과(科) 공기 파우치에 주사한 결과로서는 약 8.5 ×10⁶ 개의 백혈구가 축적되었다 (도 4). PapMV 를 주사한지 6 시간 후에, 호중구 (85%) 및 단핵구 (15%) 가 공기 파우치에 축적되었다. 1 ㎍ 정도의 낮은 양의 PapMV 은 백혈구의 축적을 유도하는데 충분했으나, 100 ㎍ 의 PapMV 를 주사한 때에 최대 축적이 일어났다. 이 축적은 강력한 전염증 인자인 LPS 를 1 ㎍ 주사함으로써 유도된 축적과 유사하였다. 이 결과는 PapMV 가 염증성 에피소드를 효율적으로 유도할 수 있음을 명백히 입증한다. 이 관찰은 PapMV 가 신호전달 및, 우리의 유기체 방어에 관련되는 세포의 동원을 유도하는 면역계에 의해 인지됨을 명백히 보여준다. PapMV 는 고유 면역을 통해 신호전달을 유도하는 것으로 보인다.

또한, 본 실험에 있어, 쥐에서 PapMV 는 강하고 장기 지속되는 체액성 반응을 유도함을 알 수 있었다 (도 5). 10 마리의 마우스에 3 가지 농도, 즉 1, 10 및 100 αg 의 PapMV 를 주사하였다. PapMV 로 면역화된 BALB/c 마우스에서의 1차 항체 반응은 면역화 경로와는 무관하게 효율적으로 유도되었다 (도 5). 면역화한 후 5 일째에 고 역가가 탐지되었다. 1차 IgM 반응의 정통적 곡선이 관찰되었다. 약 20 일째에, 심지어 더 많은 바이러스로 마우스를 면역강화한 후에도, IgM 반응이 없었다. 항-PapMV 의 고 역가가 면역화한 후 12 일째에 탐지되었고, 상기 바이러스로 면역강화한 후에 비례적으로 증가하였다. IgG 아이소타입의 분석은 Ab 반응의 1차 및 2차 시기 동안에 IgG2b 및 IgGl 의 생산이 우위적임을 보여주었다. IgG3 은 ab 반응의 기억 시기 동안에 역가를 증가시켰다. 이 데이터는 PapMV 가 쥐에서 효율적인 Ab 반응을 유도할 수 있음을 보여준다. 장기 지속되는 Ab 기억뿐만 아니라, 1차 및 2차 반응이 효율적으로 유도되었다. IgGl 의 우위적 생산은 IL-4 의 우위적 방출을 제시한다. IL-4 는 이러한 종류의 IgG 로 스위칭하는 분류군을 선호한다. 그러므로, 이 마우스들에서 TH2 반응으로의 균형을 구상할 수 있었다. IgG2a 에 대한 결여는, 이 사이토킨이 상기 IgG 아이소타입으로 스위칭하는 분류군에 직접적으로 관련되었기 때문에, IFN-α방출의 부재를 가리킨다. 모두 조합해 볼 때, 상기 데이터들은 효율적이고 장기 지속되는 항체 반응을 유도하는 PapMV 의 능력을 보여주었다. 이 결과는, PapMV 입자가 체액성 백신의 개발을 위한 우수한 벡터임을 제시한다. 이에, VLP 에 대한 당해 면역원의 융합은 면역계에 의해서도 인식되며, 이는 당해 에피토프에 대한 강한 면역 반응을 촉발한다.

또한, PapMV VLP 는 Balb/C 마우스에 복강내 또는 경피 주사된 후에 림프절 및 비장으로 특이적으로 이동함이 밝혀졌다 (도 6). 이 결과는 PapMV VLP 가 면역 반응의 출현 부위로 효율적으로 이동하기 때문에, 효과적인 운반체임을 가리킨다.

실험적 데이터는, PapMV-항원이 마우스에서 효율적인 항체 반응을 유도한다는 것을 입증한다 (도 5). 사실상, 장기 지속되는 항체기억뿐만 아니라, 1차 및 2차 반응이 효율적으로 유도된다 (도 6). 수개의 면역화 경로는 다량의 항체를 효율적으로 생산하였다. 오직 경구 면역화만이 면역 반응을 초래하지 않았다. 위산을 중화시키는데 사용된 NaHC0₃ 는 바이러스 입자들을 손상시켜, 입자의 면역원성에 영향을 준 것으로 보인다. IgGI, IgG2a, IgG2b 및 IgG3 는 100 ㎍ 의 PapMV 를 한 번 주사한 후 350 일째에도 존재하였다 (도 6). IgG2a 및 IgG3 이 존재하고, 지속되기 때문에, 본인들은 TH1 반응이 PapMV 로써 유도된다는 것을 추론할 수 있다. 이는 PapMV 입자가 외래 항원에 대한 면역 체액성 반응의 개발을 위한 우수한 벡터임을 제시한다. PapMV-입자에 대한 당해 에피토프의 융합은 댕해 에피토프에 대한 체액성 면역 반응을 촉발하는데 도움이 되어야 한다.

마우스 등에 공기 파우치 모델을 이용한 실험적 데이터는, PapMV 가 염증 반응을 증진시키고, 식세포의 접종 부위로의 이동을 선호함을 입증하였다 (도 6). 이 결과는, PapMV 가 스스로 염증성 에피소드를 유도하고, 이에 따라 항원 제시 세포에 의한 항원 제시를 향상시키기 위한 목적의 부가적 면역보조 방안을 필요로 하지 않아도 됨을 확인시켜준다. 유사한 결과가 재조합 단백질로부터 생체외 발생된 특정 펩티드의 융합을 갖는 유사바이러스 입자(VLP)에서도 수득되었다 (도 6). 처리한지 6 내지 9 시간째에 최대량의 세포가 관찰되기 때문에, 동원이 매우 빨랐다(데이터에 나와 있지 않음). 또한, PapMV-입자는, 비면역원성으로 알려져 있는 단백질인 오브알부민에 대한 면역 반응을 유도하는데 효율적이다 (도 7). 이는, 매우 약한 면역원인 것으로 알려져 있는 단백질인 오브알부민 2 mg, 또는 그것과 50 또는 100 αg 의 PapMV 의 조합물을 복강내 경로에 의해 마우스(Balb/C)에 대해 주사함으로써 달성되었다. 본인들은 각 처리 당, 6 마리의 마우스에 주사하였고, 주사한 후, 0, 4, 8, 12 및 20 일째에 샘플을 수집하였다. 각 처리에 대해 오직 한 번만 주사하였다. 본인들은 오브알부민이 약한 면역원일지라도, PapMV 의 존재 하에서 오브알부민에 대해 2배 더 강한 면역 반응을 탐지하였다.

이 관찰은, PapMV-입자가 포유동물 면역계에 의해 외래물로서 급속히 인식되고, 이에 따라 신호전달 및, 유기체의 방어에 관련되는 세포의 동원을 유도함을 입증한다.

실시예 III

백신접종 표적으로서의 C형 간염 바이러스

C형 간염 바이러스(HCV)는 급성 및 만성 간 질환을 유발하는 플러스 가닥의 RNA 바이러스이다. 감염의 급성 시기는 일반적으로 온화한 증상을 가져오나, 간경화증 및 간세포 암종을 초래할 수도 있다. HIV 감염자수의 4배인 전세계 1억7천만명 이상의 사람들이 감염되었다. 향후 수년간, HCV 관련 질환으로 사망하는 자의 수는 AIDS 에 의한 사망률을 초과할 수도 있다. 현 시점에서, HCV 에 대한 현 치료법은 만족스럽지 못하다. 유일하게 유용한 치료법이 인터페론(IFN)이나, HCV E2 단백질에 의한 인터페론 유동성 단백질 키나아제(PKR)의 억제로 인해, 대부분의 HCV 가 그에 대해 내성을 가진다.

HCV 감염 환자들 중 20% 가 본래 바이러스를 퇴치하는 것으로 알려져 있다. 이 관찰은 면역계가 효율적으로 반응한다면, 바이러스를 제거할 수 있음을 제시한다. 또한 그것은, 본인들이 바이러스에 대한 중화 항체를 증진시킴으로써 바이러스 감염 퇴치를 도울 수 있는 HCV 에 대한 치료 백신으로 면역계를 면역강화시킨다면, 만성 감염 환자를 도울 수 있음을 제시한다.

선택된 2개의 에피토프는 HCV 비리온의 표면에서 발견된다. E1 에피토프(아미노산 285 - 303) 및 E2 에피토프(아미노산 512 - 536)은, 바이러스 감염을 퇴치한 환자에게 있어 면역원성이 강하다는 것을 알 수 있다 ["David et al." (2001)]. PapMV 는 생체외 PapMV 유사바이러스 입자에서 조립할 수 있는 HCV 의 E1 및 E2 펩티드의 융합을 C-말단에서 가질 수 있도록 공학처리되었다 (도 3).

바이러스 엔벨로프 당단백질의 보존 영역에서 HVR-1 의 외부에 있는 E1 및 E2 의 HCV 비리온의 표면에서 발견된 3개의 에피토프가 선택되었다. E1 에피토프(아미노산 285 - 303) 및 2 개의 E2 에피토프(아미노산 512 - 536 및 528 - 546)는 바이러스 감염을 퇴치한 환자에게 있어 면역원이 강하다는 것을 알 수 있었다. 또한, 1개의 E2 에피토프(512 - 536)는 감염을 퇴치한 환자의 혈청액에서 발견되는 중화 항체의 생산을 촉발한다는 것을 알 수 있었다. 이 3 개의 영역들은 HCV 서브타입 및 균주들을 통해 보존되고 엔벨로프 당단백질의 초가변적 영역의 외부에 위치하기 때문에, HCV 백신의 개발을 위한 좋은 후보물이다. 구축물 PapMV-El 및 PapMV-E2 는 E. 콜라이 내에서 발현되었다. 재조합 단백질을 정제하여, 생체외에서 조립하였다. 재조합 CP 의 HCV E2 융합물과의 조립은, 융합으로 인해 약간 더 큰 것으로 나타나는 것을 제외하고는, 재조합 wt CP 대조군과 유사한 rVLP 를 발생시킨다.

마우스들을 생체외 생산된 재조합 VLP 로 면역화시켰다. 폴리믹신 칼럼을 이용하여 LPS 를 제거하여, 마우스에 복강내 및 경피 주사하였다. 본인들은 1, 10 및 100 αg 의 VLP 를 이용하여, 각 처리 당, 3 마리의 마우스에 주사하였다. 펩티드 및 PapMV 에 대한 면역 반응을 ELISA 에 의해 분석하였다. IgG 는 VLP 의 표면뿐만 아니라, 펩티드로 향함이 관찰되었다 (도 8). 이 결과는 재조합 PapMV 가 에피토프의 표면에서 우수한 면역 반응을 촉발하는데 사용될 수 있고, 면역보조제의 도움없이 백신으로서 사용될 수 있음을 보여준다.

실시예 IV

장티푸스에 대한 면역화

장티푸스(Typhoid fever)는 박테리아 살모넬라 타이피에 의해 유발되는 망상내피계, 장 림프조직 및 담낭의 급성 감염이다. 그것은 천6백만명 이상의 사람들이 감염되어 있고, 그 중 600,000명이 감염으로 인해 생존하지 못하는, 여전히 전세계적으로 중대한 질환이다. 감염 대상의 대부분은 어린이 및 청소년이고, 백신접종에 의해 예방될 수 있다. 상이한 유형들의 백신들이 현재 입수가능하다: 1) 근육내 또는 경피 투여되는, 열-불활성화되고 페놀-보존된 전세포(全細胞) 모백신(Wyet-Ayerst). 2) 아세톤-불활성화되고 건조된 전세포 모백신. 3) 삼각근에 주사 투여된 정제(비변성)된 Vi 다당류 모백신(Aventis). 4) 경구용 생백신으로 사용되는 약독화 gal E, Vi-음성 균주 Ty21a.

불활성화된 모박테리아(유형 1 - 3)는 지질다당류(LPS)의 복잡성 및, 바람직하지 못한 부작용을 도출하는 제시된 항원들의 수로 인해, 바람직하지 못한 면역 반응을 초래할 수 있다. 또한, Vi 다당류는 현장시험에서 양호한 효능을 갖는 것으로 나타난 흉선 비의존성 항원이나["Robins and Robins" (1984)], 면역기억을 유도하는데 비효율적인 것으로도 알려져 있다. 방어를 유지하기 위해서는 항원에 대한 수회 노출이 필요하며, 이 접근법은 풍토병성 지역을 방문하는 여행자들에게만 적당하다. 현재 입수가능한 백신은 오염된 지역에서 주로 사는 사람들에게는 채택되지 않는다. 약독화 박테리아(유형 4)에 기초한 백신은 욕지기, 구토 및 복통을 유발할 수 있다. 또한, 이 백신을 면역억제, 장 질환, 설사, 항생제 복용 환자에게 투여하거나, 임산부 및 6세 미만 어린이에게 투여하는 것은 권장되지 않는다. 이 백신은 열에 민감하고 냉동되어져서는 안되므로, 4℃에서 저장되어야 한다. ty2lA 의 역조건에 대한 민감성은, 장티푸스에 의해 가장 많이 영향을 받는 지역인 적도 기후의 후진국들에 사는 거주민들에게 도달하고자 할 때, 문제가 있다.

포린이라고 불리는 살모넬라 타이피로부터의 막 단백질은, 쥐 및 인간에 있어서 항체 및 세포성 면역 반응을 모두를 도출하기 때문에 양호한 면역원인 것을 알 수 있었으며, 살모넬라 타이피 포린으로부터 마우스를 보호할 수 있다. 포린은 저분자량 분자를 위한 수동적 확산 통로로 작용하는 그램-음성 박테리아의 막에 있는 가장 풍부한 단백질이다. 이 단백질은 고도의 구조적 및 기능적 동종성을 모두 가지며, 이에 따라 공통 조상을 가지는 것으로 추정된다. 박테리아의 표면에 노출된 살모넬라 타이피의 루프 6 및 7 에 상응하는 2 개의 작은 에피토프는, 포린을 이용한 면역화에 의해 도출된 방어 메커니즘에 관련된 것으로 보여졌다. 이 영역은 살모넬라 타이피에 대해 특이적이고, 재조합 서브유니트 백신의 개발을 위해 우수한 에피토프이다. 본인들은 살모넬라 타이피의 포린의 PapMV CP 루프 6 의 C-말단에서 클로닝하였다. 재조합 단백질을 정제하여, PapMV 유사바이러스 입자를 상술한 RNA 를 이용하여 생체외 생산하였다 (도 3F).

본 발명은 상기 바람직한 구현예에 한정되지 않으며, 첨부된 특허청구범위의 범주 내에 포함되는 한, 변형이 가능하다는 것을 이해하도록 한다.

Claims

유사바이러스 입자(VLP)의 단백질 및 그것의 단편과 융합된 하나 이상의 면역원을 운반하는 상기 VLP로 이루어지는, 면역증강성을 갖는 면역원-운반체 복합체.
제1항에 있어서,

상기 면역증강성이 면역보조의 효과, 세포-중재 의존성 항체 생산 또는 T-세포 의존성 항체 생산을 증진시키는 능력, 또는 마크로파지 또는 다른 항체 제시 세포에 대한 하나 이상의 보조자극제의 발현을 증진시키는 능력 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 면역원-운반체 복합체.
제1항에 있어서,

상기 면역원이 펩티드, 단백질, 합텐 및 알레르겐으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역원-운반체 복합체.
제1항에 있어서,

상기 면역원이 인간 또는 동물에서의 면역 반응을 유도할 수 있는, 바이러스, 박테리아 또는 기생충의 단백질 또는 그것의 단편인 것을 특징으로 하는 면역원-운반체 복합체.
제1항에 있어서,

상기 면역원이 상기 VLP 의 캡시드 단백질, 외피 단백질, 또는 막 단백질과 카르복시- 또는 아미노-말단 융합된 것을 특징으로 하는 면역원-운반체 복합체.
제1항에 있어서,

상기 VLP 가 바이러스, 바이러스 입자, 비리온 또는, 바이러스 외피 단백질의 조립으로부터 유도된 입자인 것을 특징으로 하는 면역원-운반체.
제1항에 있어서,

상기 VLP 가 식물 포텍스바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역원-운반체 복합체.
제7항에 있어서,

상기 포텍스바이러스가 파파야 모자이크 바이러스인 것을 특징으로 하는 면역원-운반체 복합체.
제1항에 있어서,

상기 면역원이 상기 VLP 의 외부 표면에서 융합되는 것을 특징으로 하는 면역원-운반체 복합체.
제1항에 있어서,

상기 면역원이 각기 특정 면역 반응을 촉발하는 하나 이상의 항원 도메인으로 구성되는 것을 특징으로 하는 면역원-운반체 복합체.
제1항에 있어서,

상기 VLP가 하나 초과의 특이성을 갖는 면역원을 운반하는 것을 특징으로 하는 면역원-운반체 복합체.
유사바이러스 입자(VLP)의 단백질 및 그것의 단편과 융합된 하나 이상의 면역원을 운반하는 상기 VLP 로 이루어진 면역원-운반체를 인간 또는 동물에게 투여하거나, VLP 또는 그것의 단편을 상기 VLP 에 직접적으로 연결되지 않은 항원과 동시에 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 동물에서의 면역 반응을 면역증강시키는 방법.
유사바이러스 입자(VLP)의 단백질과 융합된 하나 이상의 면역원을 운반하는 VLP 로 이루어지는 면역원-운반체 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 유사바이러스 입자(VLP)의 단백질의 단편과 융합된 하나 이상의 면역원을 운반하는 VLP 로 이루어지는 면역원-운반체 복합체 또는 VLP 단독을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 면역원-운반체 복합체가 식물 세포, 동물 세포 또는 미생물 내에서 발현될 때 조립될 수 있는 능력을 갖는 폴리뉴클레오티드.
유사바이러스 입자(VLP)의 단백질 및 그것의 단편과 융합된 하나 이상의 면역원을 운반하는 상기 VLP 로 이루어진 면역원-운반체 복합체의, 상기 단백질 또는 그것의 단편에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물의 제조에 있어서의 용도.
유사바이러스 입자(VLP), 또는 VLP 의 단백질 및 그것의 단편과 융합된 하나 이상의 면역원을 운반하는 상기 VLP 로 이루어진 면역원-운반체 복합체를 포함하는, 항원에 대한 면역 반응을 면역증강시키기 위한 조성물.
VLP 또는 그것의 단편을 포함하는 면역증강제.
유사바이러스 입자(VLP) 및 바이러스, 박테리아 또는 기생충으로부터 유도된 단백질 또는 추출물을 포함하는 조성물.
제17항에 있어서,

백신으로 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 조성물.
파파야 모자이크 바이러스의 면역보조제로서의 용도.