JP2010516713A - 腸チフス菌および他の腸内細菌病原体に対するパパイアモザイクウィルスベースのワクチン - Google Patents

腸チフス菌および他の腸内細菌病原体に対するパパイアモザイクウィルスベースのワクチン Download PDF

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Abstract

１または２以上の抗原を、パパイアモザイクウィルス（ＰａｐＭＶ）またはパパイアモザイクウィルス由来のウィルス様粒子（ＶＬＰ）を組み合わせて含む、抗原提示系（ＡＰＳ）が提供される。ＡＰＳに含まれるＰａｐＭＶまたはＶＬＰは、前記１または２以上の腸内細菌抗原に対する免疫反応を増強することができる。ＡＰＳは、例えば、腸内細菌疾患、例えば腸チフスに対するワクチンとして用いることができる。ＡＰＳに含まれる１または２以上の抗原は、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ ＶＬＰの外被タンパク質に複合することができ、または非複合であってよく（すなわち、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ ＶＬＰから分離されている）、またはＡＰＳは複合および非複合抗原の両方を含むことができる。複合は例えば、外被タンパク質との遺伝子融合、または共有結合、非共有結合、もしくは親和性手段を介した結合であってよい。

Description

発明の分野
本発明は、ワクチン製剤とアジュバントの分野に関し、特に、植物ウィルス粒子に基づくワクチンに関する。
腸内細菌科はグラム陰性菌の大きな系統群を含み、ヒトおよび獣医学について臨床的に重要な多数の病原体を含む。腸内細菌病原体は、腸および全身の感染の両方に対する原因剤であり、Salmonella enterica（腸チフスおよび食品媒介性胃腸炎）、病原性大腸菌（種々の食品媒介性腸感染症、尿路感染症、髄膜炎、および敗血症）、赤痢菌種（細菌性赤痢）、エルシニア種（ペストおよび全腸炎）、クレブシエラ種およびエンテロバクター種（肺炎および血液感染）を含む。これらの腸内細菌種はまた、院内感染症およびグラム陰性敗血症にも関与する。さらに、抗生物質への多耐性は、腸内細菌が引き起こす疾患の処置における主要な問題となっている（Paterson, 2006, AJIC 34:20-28）。
ヒトの少なくとも５種類の消化器疾患は大腸菌により引き起こされる。大腸菌株の病原性は、１または２以上の毒性因子の存在による。これらには、侵襲性因子（インベーシン）、易熱性腸毒素および耐熱性腸毒素、ベロ毒素、およびコロニー形成因子または付着因子が含まれる。最も最近になって同定された大腸菌疾患は、０１５７：Ｈ７血清型の株による出血性大腸炎である。これらの株はベロ毒素を産生し、この疾患は腹部痙攣痛および出血性の下痢を特徴とする。同じ株は、ヒトにおける溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）にも関与する。
Yersinia enterocolitica（エンテロコリチカ菌）はまた、ヒトに下痢を起こさせる。さらに、下痢はEdwardsiella tardaおよびCitrobacter株によって生じる感染症とも関連する。Klebsiella pneumoniaeおよびEnterobacter cloacaeは、熱帯性スプルーの患者から単離された。
重篤な全身性感染症である腸チフスは、腸内細菌である腸チフス菌（Salmonella enterica serovar Typhi）（S. typhi）による、細網内皮系の急性感染により引き起こされる。毎年少なくとも１６００万人が腸チフスに感染し、６００，０００人が死亡する。感染は糞口経路によって広がり、通常は汚染した食物または水の摂取によって身体に入る。腸壁を貫通した後に増殖し、２４〜７２時間後に血流に入り、腸チフスおよび菌血症を引き起こす。１０〜１４日以内に起こる腸チフスの初期症状は、頭痛、発熱、便秘、腹痛、食欲不振および筋肉痛などである。
腸内細菌科はまた、非ヒト動物においても病原体の主要な群を表す。例えば、Klebsiella pneumoniaeはしばしば霊長類における呼吸器疾患の原因となり、Yersinia pseudotuberculosisは腸炎および腹膜炎に関与する。霊長類において最も高頻度で診断される下痢性疾患は、赤痢菌（Shigella）、大腸菌およびサルモネラ菌により引き起こされる。ネコやイヌなどの家庭のペット類は、膀胱炎および他の泌尿生殖器感染などの疾患にかかりやすく、これらは全て大腸菌により引き起こされる。プロテウス種はネコやイヌの他の疾患を引き起こす。
子牛などの農場の動物は、全身性大腸菌症および早発性下痢症（新生子ウシの下痢症）の両方にかかりやすく、これらは、Ｋ９９線毛付着因子を含有する耐熱性腸管毒素性大腸菌血清型により引き起こされる。ウシの乳房炎は、大腸菌およびセラシア菌種感染の結果によって最も頻繁に引き起こされ、これより低頻度で、クレブシエラ種およびCitrobacter freundii. Salmonella dublinおよびS. typhimuriumもまた、ウシにおける重要な病原体である。大腸菌感染は子ブタに下痢を引き起こし、または中程度の下痢に続いて浮腫を引き起こす。ブタ大腸菌株は、Ｋ８８線毛付着因子の存在を特徴とし、これは、上記のＫ９９抗原とは抗原性的に異なる。ブタの乳腺炎および子宮筋層炎はK. pneumoniaeにより引き起こされ、腸炎およびリンパ節炎はYersinia enterocoliticaにより引き起こされる。S. choleraesuisおよびS. typhisuisもブタに疾患を引き起こす。
ウマにおいて、サルモネラ種、例えばS. typhimurium、S. newportおよびS. anatumは腸炎を引き起こし、これは高い致死率および敗血性流産をもたらす。子馬および雌馬はK. pneumoniaeに感染し、これは子宮炎（雌馬）および肺炎（子馬）を引き起こす。ヒツジもまた腸内細菌科が引き起こす種々の病気に罹患する。耐熱性腸毒素を産生する大腸菌株は、例えば子ヒツジに乳児下痢症を引き起こす。これらの株のほとんどはＫ９９線毛付着因子を含む。サルモネラ性流産は通常、Salmonella abortusovis、S. typhimuriumまたはS. dublinにより引き起こされ、これはまた、死産および羊毛損傷（wool damage）をもたらし得る。
ニワトリにおいて、大腸菌による敗血症は重要な死因である。Salmonella entericaおよびSalmonella pullorum、Salmonella gallinarumの血清型はまた、家禽類における重要な病原体である。
水産業での大きな損失も、種々の腸内細菌による感染が原因となりえる。例えば、サケおよびマスの孵化場におけるレッドマウス病の大発生はYersinia ruckeriにより引き起こされる。Edwardsiella tardaは、ウナギ、ナマズ、および金魚に病原性であり、Edwardsiella ictaluriはナマズに病原性である。
抗生物質により腸内細菌感染症の処置が可能であるが、腸内細菌科での抵抗性の発現および広がりが、感染症の処置を複雑化し、現在利用可能な全ての剤に対して抵抗性である種の生成は脅威である（Paterson, 2006, AJIC 34:20-28）。そのため、細菌感染に対する予防的および治療的処置のためのワクチンの開発が研究されている。米国特許第10/394,517（2003/0215464として公開）には例えば、機能性リポタンパク質（ＬＰＳ）を欠いた弱毒化腸内細菌が記載されている。これらの弱毒細菌は免疫反応を誘発できず、したがって潜在的なワクチン候補である。
腸チフスに対するワクチンも開発されてきた。経口用弱毒化生ｇａｌＥ変異体（Vivotif（登録商標）ワクチン；Berna Biotech, Ltd., Berne, Switzerland）は流行地域で有効であるが、６歳未満の小児での使用については認可されていない。また、部分的な保護免疫反応に到達するためには、３〜４回の投与が必要である（Levine et al., 1999, Vaccine 1: S22-S27）。Ｖｉカプセル状多糖類ワクチン（ＶｉＣＰＳ）（Typhim Vi（登録商標）；Aventis Pasteur）は、２歳を超える小児に対して認可されている；Ｖｉの１回の注射は、Ｔｙ２１ａワクチンと同様の防御を提供するが、ただし短期間のみである。長く継続する免疫性の欠如は、このワクチンの主な欠点である（Lin et al., 2001, N Engl J Med. 344:1263-9；Sabitha et al., 2004, Indian J. Med. Sci. 58:141-149）。さらに、これらのワクチンについて実現される最良の防御は、一般にレシピエントの５０〜８０％の範囲である（Crump et al., 2004, Bulletin of the World Health Organisation, 82; 346-353；Levine et al., 1999, Vaccine 1: S22-S27；Lin et al., 2001, N Engl J Med. 344:1263-9；Sabitha et al., 2004, Indian J. Med. Sci. 58:141-149）。S. typhi（Ｔｙ−８００）の弱毒化株に基づく新しい候補ワクチンが、Emergent BioSolutions, Inc. (Gaithersburg, MD)により開発された。このワクチン候補は現在、流行地域であるベトナムにおいて第ＩＩ相の臨床試験中である（Crump et al., 2004、同上）。Ｔｙ２１ａワクチンと同様に、このワクチンは経口経路により投与され、小児への投与に適さないであろう。
感染症の予防および処置のための、ワクチンまたはワクチンベクターとしての弱毒化細菌の潜在的な広範な使用は、他のワクチンより顕著な利点を有しているが、弱毒化細菌の使用に関する安全性の問題は、小さい問題ではない。特異的抗原と組み合わせた新規なワクチンプラットフォームを含む、感染症に対する代替的処置の開発は、したがって、次の５〜１０年にわたり、グローバルな健康の改善に対して優先順位が高いと考えられる（Nikaido, 2003, Microbiol Mol Biol Rev. 67:593-656）。この点において、表在性の細菌抗原に対するヒト免疫反応の研究が既に報告されている。Ｖｉ（カプセル多糖類）、Ｈ（鞭毛要素）、およびＯ（リポ多糖類［ＬＰＳ］）細菌抗原の、例えば腸チフス菌への抗体反応を誘発する能力は、特異的抗原を用いる代替的療法の開発には推進する価値があるという証拠を提供する（Calderon et al., 1986, Infection and Immunity, 52:209-212; Ortiz, et al., 1989, J Clin. Microbiol. 27:1640-1645に検討されている）。さらに最近では、研究者らはポリンもまた、数種のグラム陰性細菌により引き起こされる感染に対する、特異的な防御免疫反応を誘発する重要な抗原であることを見出した（Humphries et al., 2006, Vaccine 24:36-44；Kim et al., 1999, J Immunol. 162:6855-6866）。ポリンは、相対的に非特異的チャネルとして機能する、グラム陰性細菌の三量体露出外膜タンパク質（ＯＭＰ）であり、小さな親水性分子の外膜の通過を許容する（Nikaido, 2003, Microbiol Mol Biol Rev. 67:593-656）。
ポリンに対する免疫反応には、体液性および細胞媒介性の免疫経路の両方が関与するようである。腸チフスの急性期および回復期の患者は、例えば、高レベルのポリン特異的抗体を示す（Calderon et al., 1986, Infect. Immun. 52:209-212；Ortiz, et al., 1989, J Clin. Microbiol. 27:1640-1645）。さらに、Ｔｙ２ａ経口ワクチンで免疫化された腸チフス患者およびヒトのボランティアは、ポリン特異的細胞免疫反応を示した（Salerno-Goncalves, et al., 2002, J Immunol. 169:2196-203）。２つの重要な腸チフス菌ポリンであるＯｍｐＣおよびＯｍｐＦは、マウスにおいて長期の抗体反応を引き起こすことが示された（Secundino et al., 2006, Immunology 117:59）。したがってこれらを合わせると、これらのデータは、ポリンが、腸内細菌感染症については、細胞性および体液性免疫反応の両方に対する重要な標的であることを示す。
ワクチン開発の多くの新しいアプローチの中で、ウィルス性ヌクレオカプシドから作られたウィルス様粒子（ＶＬＰ）が、期待される戦略として現れた。これまで、２種のＶＬＰワクチン、すなわちＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）およびヒト乳頭腫ウィルス（ＨＰＶ）が、ヒトにおいて効率的に機能することが示された（Fagan et al., 1987, J. Med. Virol., 21:49-56；Harper et al., 2004, Lancet, 364:1757-1765）。ヒト乳頭腫ウィルス（ＨＰＶ）主カプシドタンパク質Ｌ１から作製されたＶＬＰは、例えば、女性の子宮頸癌の発生に対して１００％の防御を提供することが示された（Ault, K.A., 2006, Obstet. Gynecol. Surv. 61:S26-S31；Harper et al., 2004, Lancet 364:1757-1765；また国際特許出願PCT/US01/18701 (WO 02/04007)も参照のこと）。バクテリオファージＱβなどのプラットフォーム（Maurer et al., 2005, Eur. J. Immunol. 35:2031-2040）、ウィルスコアタンパク質から作られたＢ型肝炎ウィルスＶＬＰ（Mihailova et al., 2006, Vaccine 24:4369-4377；Pumpens et al., 2002, Intervirology 45:24-32）、およびパルボウィルスＶＬＰ（Antonis et al., 2006, Vaccine 24:5481-5490；Ogasawara et al., 2006, In Vivo 20:319-324）もまた、エピトープを担持し、強力な抗体反応を誘発する能力を示した。同様に、米国特許第6,627,202号には、種々のウィルスおよび細菌を標的とした、またはこれに由来する抗原を含むエピトープ送達システムとして用いるための、ＨＢＶカプシド結合ペプチドにより架橋された抗原を含む、ＨＢＶコアタンパク質が記載されている。
植物ウィルスからのＶＬＰの、エピトープ提示系としての使用が記載されている。植物ウィルスは主に高い免疫原性のタンパク質から構成され、複雑な反復性の結晶機構を有する。さらにこれらは、動物免疫系とは系統学的に離れており、このことが、これらをワクチン開発の良好な候補にしている。例えば、ササゲモザイクウィルス（ＣＰＭＶ）、セイバンモロコシ（Johnson grass）モザイクウィルス（ＪＧＭＶ）、タバコモザイクウィルスＸ（ＴＭＶＸ）、およびアルファルファモザイクウィルス（ＡＩＭＶ）が、目的エピトープの提示のために改変された（Canizares, M. C. et al., 2005, Immunol. Cell. Biol. 83:263-270；Brennan et al., 2001, Molec. Biol. 17:15-26；Saini and Vrati, 2003, J. Virol. 77:3487-3494）。国際特許出願PCT/GB97/01065 (WO 97/39134)には、外被タンパク質および非ウィルスタンパク質を含み、例えばペプチドエピトープの提示に用いることができる、キメラウィルス様粒子が記載されている。国際特許出願PCT/US01/07355 (WO 01/66778)には、植物ウィルス外被タンパク質、および特に、リンカーを介したＮ末端において目的のポリペプチドに融合したトバモウィルス外被タンパク質であって、病原性微生物のエピトープを含むことができるものが、記載されている。国際特許出願PCT/US01/20272 (WO 02/00169)には、異質ペプチドに、具体的にはニューカッスル病ウィルスまたはヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）エピトープに融合した、ジャガイモウィルスＹ外被タンパク質または切断型インゲンマメ黄斑モザイクウィルス外被タンパク質のどちらかを含むワクチンが記載されている。また米国特許第6,042,832号には、病原エピトープなどのポリペプチドと、アルファルファモザイクウィルスまたはイラルウィルス（ilarvirus）カプシドタンパク質との融合物を、動物に対して、免疫反応を高めるために投与する方法が記載されている。
パパイアモザイクウィルス（ＰａｐＭＶ）由来ＶＬＰ、およびそれらの免疫増強剤としての使用が記載されている（国際特許出願PCT/CA03/00985 (WO 2004/004761)）。ＰａｐＭＶ外被タンパク質の大腸菌における発現は、反復性かつ結晶様式での数百のＣＰサブユニットから構成されるＶＬＰの自己集合（self-assembly）をもたらす（Tremblay et al., 2006, FEBS J 273:14）。ＰａｐＭＶ ＣＰ欠失コンストラクトの発現および精製の研究はさらに、ＣＰサブユニットの自己集合（または多量体化）が、機能に重要であることを示す（Lecours et al., 2006, Protein Expression and Purification, 47:273-280）。ｇｐ１００またはインフルエンザウィルスＭ１タンパク質のどちらかからのエピトープを含むＰａｐＭＶ ＶＬＰの能力は、エピトープのＭＨＣクラスＩ交差提示を誘発し、特定のヒトＴ細胞の増幅（expansion）をもたらすことが示された（Leclerc, D., et al., J. Virol, 2007, 81(3):1319-26; Epub. ahead of print November 22, 2006）。
ジャガイモウィルスＸ（ＰＶＸ）由来で、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＥＢＶまたはインフルエンザウィルスからの種々の抗原決定基を担持するＶＬＰが記載された（欧州特許出願第1 167 530号）。ＨＩＶエピトープを担持するＰＶＸ ＶＬＰの、マウスにおいてホルモンおよび細胞媒介性経路を介して抗体産生を誘発する能力が記載され、追加のアジュバントをＰＶＸ ＶＬＰと組み合わせて用いて、この効果が増強された。
Ｂ型肝炎コアタンパク質またはパルボウィルスＶＬＰは、遺伝子情報を有さない場合でも、ＣＴＬ反応を誘発することが報告され（Ruedl et al., 2002, Eur. J. Immunol. 32; 818-825；Martinez et al., 2003, Virology, 305; 428-435）、これらは、陥入された細胞において活発に複製されない。リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）またはin vivoの樹状細胞による鶏卵アルブミンからのエピトープを担持する、かかるＶＬＰの交差提示も記載された（Ruedl et al., 2002, ibid.; Moron, et al., 2003, J. Immunol. 171:2242-2250）。ＬＣＭＶからのエピトープを担持するＢ型肝炎コアタンパク質ＶＬＰの、ＣＴＬ反応をプライミングする能力も記載されたが、しかし、このＶＬＰは、それのみで投与された場合にＣＴＬ反応を誘発することができず、ウィルスチャレンジに対して効果的な防御を媒介できなかった。効果的なＣＴＬ反応は、ＶＬＰが抗ＣＤ４０抗体またはＣｐＧオリゴヌクレオチドと共に用いられた場合にのみ、誘発された（Storni, et al., 2002, J. Immunol. 168:2880-2886）。初期の報告には、ＬＣＭＶからのペプチドを担持するブタのパルボウィルス様粒子（ＰＰＭＶ）が、マウスを致死的なＬＣＭＶチャレンジから保護することが示されている（Sedlik, et al., 2000, J. Virol. 74:5769-5775）。
Plasmodiophora brassicaeの休眠胞子を結合可能な親和性ペプチドに融合した、パパイアモザイクウィルスＶＬＰの使用も、記載されている（Morin et al., 2007, J. Biotechnology, 128: 423-434）。ＶＬＰは、P. brassacae胞子を高アビディティで結合可能であることが示され、P. brassacaeの検出についての代替的な抗体として提唱された。
この背景情報は、出願人が既知と考える情報を、本発明との潜在的関連のものとする目的で提供される。前述の情報のいずれもが、本発明に対する先行技術を構築するとの認定は必ずしも意図されず、またそう解釈されるべきではない。
本発明の目的は、腸チフス菌（Salmonella typhi）および他の腸内細菌病原体に対する、パパイアモザイクウィルスベースのワクチンを提供することである。本発明の１つの側面により、１または２種以上の腸内細菌抗原を、パパイアモザイクウィルス（ＰａｐＭＶ）またはＰａｐＭＶ外被タンパク質由来ＶＬＰと組み合わせて有する、抗原提示系が提供され、ここで、該ＰａｐＭＶまたはＶＬＰは、前記１または２種以上の腸内細菌抗原に対する免疫反応を増強することができる。
本発明の他の側面により、本発明の１または２種以上の抗原提示系、および薬学的に許容し得る担体を含む、ワクチン組成物が提供される。
本発明の他の側面により、腸内細菌抗原を結合可能な１または２種以上の親和性ペプチドに融合したパパイアモザイクウィルス外被タンパク質を含む、ポリペプチドが提供される。
本発明の他の側面により、１または２種以上の腸内細菌抗原に融合したパパイアモザイクウィルス外被タンパク質を含む、ポリペプチドが提供される。
他の側面により、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。
他の側面により、本発明の抗原提示系の、腸内細菌に対する免疫反応を必要とする動物において腸内細菌に対する免疫反応を誘発するための、使用が提供される。
他の側面により、本発明のワクチンの、腸内細菌に対する免疫反応を必要とする動物において腸内細菌に対する免疫反応を誘発するための、使用が提供される。
他の側面により、本発明の抗原提示系の、ワクチンの調製における使用が提供される。
本発明の他の側面により、腸チフス菌感染に対して動物を免疫化するためのワクチンであって、前記ワクチンが、腸チフス菌ＯｍｐＣまたはＯｍｐＦに由来する抗原を含む抗原提示系を、パパイアモザイクウィルス（ＰａｐＭＶ）またはＰａｐＭＶ外被タンパク質由来ＶＬＰと組み合わせて含み、ここで前記ＰａｐＭＶまたはＶＬＰが、動物における前記抗原に対する免疫反応を増強可能である、前記ワクチンが提供される。
本発明の他の側面により、動物において腸内細菌に対する免疫反応を誘発するための方法であって、前記方法が、前記動物に対して、本発明の抗原提示系の有効量を投与することを含む、前記方法が提供される。
本発明の他の側面により、動物において腸内細菌に対する免疫反応を誘発するための方法であって、前記方法が、前記動物に対して、本発明のワクチンの有効量を投与することを含む、前記方法が提供される。
本発明のこれらおよび他の特徴は、添付の図面を参照した以下の詳細な説明においてより明確となる。
図１は、（Ａ）パパイアモザイクウィルス外被（またはカプシド）タンパク質のアミノ酸配列（GenBasnkアクセッション番号NP_044334.1；配列番号１）、（Ｂ）パパイアモザイクウィルス外被タンパク質をコードするヌクレオチド配列（GenBasnkアクセッション番号NC_001748（ヌクレオチド５８８９〜６５３６）；配列番号２）、および（Ｃ）改変ＰａｐＭＶ外被タンパク質ＣＰΔＮ５のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。 図２は電子顕微鏡写真であり、ここでバーは２００ｎｍを示し、（Ａ）ＷＴ ＰａｐＭＶウィルス、（Ｂ）ＣＰΔＮ５ ＰａｐＭＶウィルス様粒子（ＶＬＰ）、（Ｃ）Ｅ１２８Ａ ＶＬＰ、（Ｄ）Ｋ９７Ａ精製タンパク質、（Ｅ）組換えＣＰΔＮ５ ＶＬＰの、６ＸＨタグで増殖させた抗体による免疫金標識、および（Ｆ）ＰａｐＭＶウィルスおよび組換えＶＬＰ ＣＰΔＮ５およびＥ１２８Ａの平均の長さ（ｎ＝１５０）である。
図３は、野生型（ＷＴ）ＰａｐＭＶおよび、組換え変異ＰａｐＭＶ外被タンパク質ＣＰΔＮ５、Ｅ１２８ＡまたはＫ９７Ａを含むＰａｐＭＶウィルス様粒子（ＶＬＰ）の、円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを示す；（Ａ）は、ＷＴウィルス（黒線）、ＣＰΔＮ５（点線）およびＥ１２８Ａ ＶＬＰ（灰色線）の遠紫外線スペクトルを示し、（Ｂ）は、酢酸法により（黒線）、およびＣＰΔＮ５タンパク質の高速上清により（点線）、ＷＴウィルスから単離されたディスクの遠紫外線スペクトルを示し、（Ｃ）は、ＣＰΔＮ５タンパク質（ディスク）（点線）およびＫ９７Ａタンパク質（灰色線）の遠紫外線スペクトルを示す。 図３（続き）は、野生型（ＷＴ）ＰａｐＭＶおよび、組換え変異ＰａｐＭＶ外被タンパク質ＣＰΔＮ５、Ｅ１２８ＡまたはＫ９７Ａを含むＰａｐＭＶウィルス様粒子（ＶＬＰ）の、円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを示す；（Ｄ）は、２５０〜３５０ｎｍの間のＣＰΔＮ５およびＥ１２８Ａ ＶＬＰの遠紫外線スペクトルを示し、（Ｅ）は、２５０〜３５０ｎｍの間のＣＰΔＮ５およびＫ９７Ａディスクの遠紫外線スペクトルを示す。 図４は、組換え変異ＰａｐＭＶ外被タンパク質、ＣＰΔＮ５およびＫ９７Ａのゲルろ過解析の結果を示す；（Ａ）は、ＣＰΔＮ５精製タンパク質のタンパク質溶出プロファイル（黒線；灰色線は分子量マーカー）、および（Ｂ）は、ＣＰΔＮ５精製タンパク質（黒線）とＫ９７Ａ精製タンパク質（灰色線）の、タンパク質溶出プロファイルを示す。
図５は、組換え変異体および野生型（ＷＴ）ＰａｐＭＶ外被タンパク質についての、円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルの温度誘発性変性曲線を示す；（Ａ）は、ＣＰΔＮ５およびＥ１２８Ａの変異体ＶＬＰならびにＷＴウィルスについてのプロファイルを示し、（Ｂ）は、ＣＰΔＮ５およびＷＴディスクについてのプロファイルを示す。スペクトルは、平均残基楕円率（mean residue ellipticity）の単位で表す。アンフォールディングは、２２２ｎｍにおける［Ｑ］を温度の関数として記録することによりモニタリングした。全てのＣＤスペクトルは、ｐＨ７．２の１０ｍＭのＮａＰ緩衝液中の、濃度１ｍｇ／ｍｌのタンパク質により生成した。 図６は、（Ａ）ＰａｐＭＶ外被タンパク質（ＰａｐＭＶ）のＣ末端配列のアラインメント、およびインフルエンザＭ１タンパク質（５７位〜６５位；ＰａｐＭＶ Ｆｌｕと呼ぶ）から、またはｇｐ１００（２０９位〜２１７位、Ｍを２１０位にて；ＰａｐＭＶ ｇｐ１００と呼ぶ）からの、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限エピトープを含有する改変ＰａｐＭＶコンストラクトのＣ末端配列のアラインメントを示し、（Ｂ）は、それぞれの組換え自動集合ＰａｐＭＶ調製物の電子顕微鏡写真を示す。 図７は、組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質（ＰａｐＭＶ）および外被タンパク質融合物（ＰａｐＭＶ−ｇｐ１００およびＰａｐＭＶ−Ｆｌｕ）の、それらの合成の２ヵ月後および７ヵ月後における安定性のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示す。さらに、７ヶ月のタンパク質調製物を、追加の７日間、２３℃または３７℃でインキュベーションし、プロテイナーゼＫで５分間処理し、その後負荷緩衝液を添加して沸騰水中でインキュベーションした結果を示す。 図８は、両方の抗原からのＭＨＣクラスＩエピトープが、２種の異なるＡＰＣ供給源によりパルスされた場合に、交差提示可能であることを示す。ＣＤ４０活性化Ｂリンパ球およびＤＣを、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１ドナーから調製し、指示された調製物の種々の濃度で１８時間パルスした。パルスした細胞を洗浄し、ｇｐ１００−（Ａ）またはＦＬＵ−（Ｂ）特異的Ｔ細胞をさらに１８時間加えた。Ｔ細胞活性化の証拠は、ＥＬＩＳＡアッセイにより決定されるＩＦＮ−γ分泌により明らかとなった。
図９は、（Ａ）は、ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性または陰性ドナーから調製された、ＰａｐＭＶ ＦｌｕまたはＰａｐＭＶ ｇｐ１００でパルスしたＣＤ−４０活性化Ｂリンパ球を、ＦＬＵ−（左パネル）またはｇｐ１００（右パネル）特異的Ｔ細胞と共培養した結果を示し、（Ｂ）は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋およびｇｐ１００＋黒色腫株、またはＰａｐＭＶ ＦｌｕでパルスしたＨＬＡ−Ａ＊０２＋ ＣＤ４０活性化Ｂ細胞を、ＭＨＣクラスＩ、クラスＩＩまたはＨＬＡ−ＤＲ提示をブロックする抗体と共にインキュベートした結果を示す。ＦＬＵ−またはｇｐ１００−特異的Ｔ細胞を次に加えた。結果は、ＩＦＮ−γ分泌アッセイに基づく認識のパーセントとして、１００％を陽性対照により分泌される量に対応させて示す。 図９（続き）は、（Ａ）は、ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性または陰性ドナーから調製された、ＰａｐＭＶ ＦｌｕまたはＰａｐＭＶ ｇｐ１００でパルスしたＣＤ−４０活性化Ｂリンパ球を、ＦＬＵ−（左パネル）またはｇｐ１００（右パネル）特異的Ｔ細胞と共培養した結果を示し、（Ｂ）は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋およびｇｐ１００＋黒色腫株、またはＰａｐＭＶ ＦｌｕでパルスしたＨＬＡ−Ａ＊０２＋ ＣＤ４０活性化Ｂ細胞を、ＭＨＣクラスＩ、クラスＩＩまたはＨＬＡ−ＤＲ提示をブロックする抗体と共にインキュベートした結果を示す。ＦＬＵ−またはｇｐ１００−特異的Ｔ細胞を次に加えた。結果は、ＩＦＮ−γ分泌アッセイに基づく認識のパーセントとして、１００％を陽性対照により分泌される量に対応させて示す。
図１０は、ＰａｐＭＶが媒介するＭＨＣクラスＩ交差提示は、プロテアソーム独立性であることを示す。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋およびｇｐ１００＋黒色腫株、またはＰａｐＭＶ ＦｌｕでパルスしたＨＬＡ−Ａ＊０２＋ ＣＤ４０活性化Ｂ細胞を、ＭＨＣクラスＩ、クラスＩＩまたはＨＬＡ−ＤＲ提示をブロックする抗体と共にインキュベートした。ＦＬＵ−またはｇｐ１００−特異的Ｔ細胞を次に加えた。結果は、ＩＦＮ−γ分泌アッセイに基づく認識のパーセントとして、１００％を陽性対照により分泌される量に対応させて示す。
図１１は、インフルエンザＭ１タンパク質からのＨＬＡ−Ａ＊０２０１エピトープに特異的なＴリンパ球の、ＰａｐＭＶ ＦｌｕでパルスしたＡＰＣによる増幅の解析を示す。（Ａ）ＨＬＡ−Ａ＊正常ドナーからのＰＢＭＣを、自己由来ＣＤ４０−活性化Ｂ細胞（ニセ（mock））または、ＰａｐＭＶ、ＰａｐＭＶ ＦｌｕもしくはＰａｐＭＶ ｇｐ１００のいずれかでパルスしたＣＤ４０−活性化Ｂ細胞とともに共培養した。培養細胞を７日目に再刺激し、ＩＬ−２を異なる時点で加えた。増幅細胞の特異性を、１５日目に、Ｆｌｕまたはｇｐ１００からのＨＬＡ−Ａ＊０２０１ペプチドによりパルスしたＴ２細胞で共培養して評価した。ＩＦＮ−γ分泌細胞の頻度を、ＥＬＩＳＰＯＴにより決定した。（Ｂ）増幅した培養Ｔ細胞を、パルスしたＣＤ４０活性化Ｂリンパ球と共に共培養した。
図１２は、図１１のようにして処理した増幅Ｔ細胞のＩＦＮ−γ分泌の解析結果を示す。 図１３は、ＣＤ−１マウスで生じた背部空気嚢でのＰａｐＭＶ外被タンパク質およびＬＰＳの、前炎症反応の比較を示す。データは、５匹のマウスの平均±ＳＥＭである。結果は２つの同一で独立した実験の代表例である。 図１４は、多量体ＰａｐＭＶＣＰ−Ｅ２、一量体対応物（ＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５−Ｅ２）、ＨＣＶ Ｅ２ペプチドのみ、またはＰＢＳ（ＥＬＩＳＡプレートはＰａｐＭＶ−ＣＰまたはＰａｐＭＶ２７−２１５で被覆）を皮下注射したＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスにおける、ＰａｐＭＶ外被タンパク質に特異的なＩｇＧ抗体反応を示す。データは、４匹のマウスからの抗体価の平均を示す。これらの結果は、２つの同一で独立した実験の代表例である。黒の矢印は、１５日目におけるブースター注射を示す。
図１５は、ＰａｐＭＶの、モデル抗原（Ａ）鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）および（Ｂ）オブアルブミン（ＯＶＡ）に対する、次のＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗体反応を増強する能力を示す：ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたり３匹）は、０日目に、抗原のみ、抗原プラスＰａｐＭＶ、フロインド完全アジュバント（ＦＣＡ）または大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４からのＬＰＳにより免疫化した。２つの実験の代表的な結果を示す。免疫化動物からの収集した血清の抗体の型を、ＥＬＩＳＡにより、モデル抗原上（ＨＥＬまたはＯＶＡ）で、（Ｃ）ＩｇＧ１、（Ｄ）ＩｇＧ２ａおよび（Ｅ）ＩｇＧ２ｂについて同定した。
図１６は、（Ａ）野生型ＰａｐＭＶ外被タンパク質および、親和性ペプチドのＰａｐＭＶ外被タンパク質のＣ末端において、ＯｍｐＣまたはＯｍｐＦへの融合（それぞれ、ＰａｐＭＶ ＯｍｐＣおよびＰａｐＭＶ ＯｍｐＦコンストラクト）を含む組換えコンストラクトの、Ｃ末端のアミノ酸配列；（Ｂ）精製したタンパク質ＰａｐＭＶ、ＰａｐＭＶ ＯｍｐＣ、ＰａｐＭＶ ＯｍｐＦ、ＯｍｐＣおよびＯｍｐＦ［第１レーン：分子量マーカー、第２レーン：ＰａｐＭＶ ＶＬＰ、第３レーン：ＰａｐＭＶ ＯｍｐＣ ＶＬＰ、第４レーン：ＰａｐＭＶ ＯｍｐＦ ＶＬＰ、第５レーン：精製ＯｍｐＣ、第６レーン：精製ＯｍｐＦ］のプロファイルを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および（Ｃ）組換えＰａｐＭＶ ＯｍｐＣ ＶＬＰおよびＰａｐＭＶ ＯｍｐＦ ＶＬＰの高速ペレットの電子顕微鏡写真を示す。
図１７は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ類の、それらの抗原に対する高アビディティ結合を示す；（Ａ）は、高アビディティＰａｐＭＶ ＯｍｐＣ ＶＬＰの、ＯｍｐＣ抗原への結合を示すＥＬＩＳＡであり、（Ｂ）は、高アビディティＰａｐＭＶ ＯｍｐＦ ＶＬＰの、ＯｍｐＦ抗原への結合を示すＥＬＩＳＡである。 図１８は、マウスにおける腸チフス菌チャレンジに対する防御アッセイの結果を示す；（Ａ）は、ＯｍｐＣのみで免疫化したマウスおよびＯｍｐＣ＋ＰａｐＭＶ ＯｍｐＣ ＶＬＰ含有調製物で免疫化したマウスにおいて、１００ＬＤ５０の腸チフス菌に対する防御能力を示す；（Ｂ）は、ＯｍｐＦのみで免疫化したマウスおよびＯｍｐＦ＋ＰａｐＭＶ ＯｍｐＦ ＶＬＰ含有調製物で免疫化したマウスにおいて、１００ＬＤ５０の腸チフス菌に対する防御能力を示す；（Ｃ）は、ＯｍｐＣのみで免疫化したマウスおよびＯｍｐＣ＋ＰａｐＭＶ ＯｍｐＣ ＶＬＰ含有調製物で免疫化したマウスにおいて、５００ＬＤ５０の腸チフス菌に対する防御能力を示す；（Ｄ）は、ＯｍｐＦのみで免疫化したマウスおよびＯｍｐＦ＋ＰａｐＭＶ ＯｍｐＣ ＶＬＰ含有調製物で免疫化したマウスにおいて、５００ＬＤ５０の腸チフス菌に対する防御能力を示す。
図１９（Ａ〜Ｄ）は、ＯｍｐＣに対する抗体反応の評価を示す；イソタイプＩｇＧ１（Ａ）、ＩｇＧ２ａ（Ｂ）、ＩｇＧ２ｂ（Ｃ）およびＩｇＧ３（Ｄ）の、ＯｍｐＣに対するＩｇＧ反応は、ＯｍｐＣまたはＯｍｐＣ＋ＰａｐＭＶ ＯｍｐＣ ＶＬＰを含むワクチンで免疫化したマウスの間で測定し、（Ｅ）ＯｍｐＣとＰａｐＭＶ ＯｍｐＣとで共免疫化したマウスに腸チフス菌チャレンジを行うと、ＯｍｐＣのみまたはＰａｐＭＶ ＯｍｐＣのみでの免疫化に比べて、腸チフス菌感染に対するマウスの長期間活性化された防御を支援する（生存％により示す）。
図２０は、ＰａｐＭＶウィルスが、マウスにおけるＯｍｐＣポリンの防御能力を増加させることを示す；（Ａ）１０匹の雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスの群を、１０μｇのＯｍｐＣのみで、または３０μｇのＰａｐＭＶと共に、腹腔内に免疫化した。１５日目に、ＯｍｐＣのみでブースターを与えた。対照マウスは、生理食塩水（ＩＳＳ）またはＰａｐＭＶを注射した。実験群のチャレンジは、２１日目に、腸チフス菌１００ＬＤ５０（中黒の印）または５００ＬＤ５０（中白の印）で行い、生存率をチャレンジ後１０日間記録した。対照群は、２０ＬＤ５０の腸チフス菌でチャレンジした。３回の実験の代表的な結果を示す。（Ｂ）５匹の雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスの群を、０日目に、１０μｇのＯｍｐＣのみで、または３０μｇのＰａｐＭＶもしくはフロインド不完全アジュバント（ＩＦＡ）（１：１、ｖ／ｖ）と共に、腹腔内に免疫化した。１５日目に、全マウスに１０μｇのＯｍｐＣのみでブースターを与えた。対照マウスは、生理食塩水のみ（等張食塩水（ＩＳＳ））を注射した。抗体価を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）にて初めの免疫化の２１日後に測定した。
図２１は、（Ａ）腸チフス菌（Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhi）Ｔｙ２（GenBankアクセッション番号P0A264）からのＯｍｐＣ前駆体のアミノ酸配列（配列番号３９）を示し；（Ｂ）は、腸チフス菌（Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhi）ＣＴ１８（GenBankアクセッション番号CAD05399）からのＯｍｐＦ前駆体タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４０）を示す。 図２２は、（Ａ）ＯｍｐＣへの結合のための親和性ペプチドを含む、ＰａｐＭＶ外被タンパク質のアミノ酸配列［配列番号４２］、および（Ｂ）ＯｍｐＦへの結合のための親和性ペプチドを含む、ＰａｐＭＶ外被タンパク質のアミノ酸配列［配列番号４３］を示す。クローニングした配列と、野生型配列の違いを、太字体および下線で示す；親和性ペプチド配列を下線で、およびヒスチジンタグはイタリック体で示す。
図２３は、（Ａ）野生型ＰａｐＭＶ外被タンパク質および、ＰａｐＭＶ外被タンパク質とタンパク質のＣ末端に位置する６ｘＨｉｓタグ（６Ｈｉｓ）との間で融合している腸チフス菌ポリンループ６ペプチド（太字体および下線で示す）を含む組換えコンストラクトの、Ｃ末端のアミノ酸配列を示す；（Ｂ）組換えタンパク質の精製の結果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。１．分子量マーカー、２．タンパク質ＰａｐＭＶ−ループ６の発現の誘発前の全細菌溶解物、３．ＩＰＴＧによるタンパク質ＰａｐＭＶ−ループ６の発現の誘発後の全細菌溶解物、４．精製ＰａｐＭＶ−ループ６タンパク質のＶＬＰを含む高速ペレット、および（Ｃ）ＰａｐＭＶウィルス、融合なしのＰａｐＭＶ組換えＶＬＰ、およびループ６ペプチドを含むＰａｐＭＶ組換えＶＬＰ（ＰａｐＭＶ−ループ６）を示す電子顕微鏡写真である。
図２４は、（Ａ）腸チフス菌ポリンループ６ペプチドを含むＰａｐＭＶ外被タンパク質（ＰａｐＭＶ−ｌｏｏｐ６）からの外被タンパク質のアミノ酸配列を示し［配列番号４６］、ここでループ６ペプチド配列を下線で、ヒスチジンタグをイタリック体で示し；（Ｂ）は、ＰａｐＭＶ−ｌｏｏｐ６タンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す［配列番号４７］。 図２５は、ＰａｐＭＶ−ループ６コンストラクトへの抗体反応を示す結果である。５匹のＢａｌｂ／Ｃマウスを、１００μｇのＰａｐＭＶ−ループ６で皮下的に２週間の間隔で免疫化した。最後の放血を２８日目に行い、ＥＬＩＳＡを、次を用いて行った：（Ａ）合成および精製ループ６ペプチド、（Ｂ）ＰａｐＭＶプラットフォーム、および（Ｃ）腸チフス菌からの精製ＯｍｐＣ。
図２６は、マウスにおける、腸チフス菌チャレンジに対する防御アッセイの結果を示す；（Ａ）は、マウスにおける、７７ＬＤ５０の腸チフス菌チャレンジに対する、ＯｍｐＦのみ、およびＯｍｐＦ＋ＰａｐＭＶ ＯｍｐＦ ＶＬＰまたはＯｍｐＦ＋ＰａｐＭＶのいずれかを含有する調製物の防御能力を示し、（Ｂ）は、マウスにおける、３７８ＬＤ５０の腸チフス菌チャレンジに対する、ＯｍｐＦのみ、およびＯｍｐＦ＋ＰａｐＭＶ ＯｍｐＦ ＶＬＰまたはＯｍｐＦ＋ＰａｐＭＶのいずれかを含有する調製物の防御能力を示す。 図２７は、（Ａ）ＰａｐＭＶ外被タンパク質および、親和性ペプチドのＰａｐＭＶ ＳＭ外被タンパク質のＣ末端においてＯｍｐＣへの融合を含む組換えコンストラクトの、Ｃ末端のアミノ酸配列；（Ｂ）精製したタンパク質ＰａｐＭＶ ＳＭ ＯｍｐＣのプロファイルを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ［第１レーン：分子量マーカー、第２レーン：ＩＰＴＧでの誘発前の細菌溶解物、第３レーン：大量のＰａｐＭＶ ＳＭ ＣＰを発現する細菌の溶解、第４レーン：精製ＰａｐＭＶ ＳＭ ＯｍｐＣタンパク質。ＰａｐＭＶ ＯｍｐＦ］、および（Ｃ）１００，０００Ｘ倍率での、組換えＰａｐＭＶ ＳＭ ＯｍｐＣの高速ペレットの電子顕微鏡写真を示す。
図２８は、（Ａ）ＯｍｐＣへの結合のための親和性ペプチドを含む、ＰａｐＭＶ ＳＭ外被タンパク質（ＰａｐＭＶ ＳＭ ＯｍｐＣ）のアミノ酸配列を示し［配列番号４８］；（Ｂ）ＰａｐＭＶ ＳＭ ＯｍｐＣタンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す［配列番号４９］。 図２９は、マウスにおける、腸チフス菌チャレンジに対する防御アッセイの結果を示す；（Ａ）は、マウスにおける、１０５ＬＤ５０の腸チフス菌に対する、ＯｍｐＣのみ、または、ＯｍｐＣ＋ＰａｐＭＶ ＳＭ ＯｍｐＣ ＶＬＰもしくはＯｍｐＣ＋ＰａｐＭＶ ＶＬＰのいずれかを含有する調製物の防御能力を示し、（Ｂ）は、マウスにおける、５２０ＬＤ５０の腸チフス菌に対する、ＯｍｐＣのみ、またはＯｍｐＣ＋ＰａｐＭＶ ＳＭ ＯｍｐＣ ＶＬＰもしくはＯｍｐＣ＋ＰａｐＭＶ ＶＬＰのいずれかを含有する調製物の防御能力を示す。
図３０は、腸チフス菌ポリンの安定性の評価結果を示す。（Ａ）は、精製ポリン（ＯｍｐＣ＋ＯｍｐＦ）（５μｇ）、１９９９年１１月９日作製のロットＩＳＩＰＯＲ（Salazar-Gonzales et al., 2004, Immunology Letters 93）のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルを示す；（Ｂ）は、２００８年１月における、同一のＩＳＩＰＯＲロット（０．２μｇ；レーン２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルを示し、（Ｃ）は、２００７年４月３０日精製のロット１２３９の、精製ＯｍｐＣタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルを示す［左側パネル：ゲルは２００７年４月３０日にランさせた；レーン１：分子量マーカー、レーン２：ＯｍｐＣ（１０μｇ）。右側パネル：ゲルは２００８年１月１８日にランさせた、レーン１：ＯｍｐＣ（１０μｇ）。
図３１は、ＰａｐＭＶが、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージおよびＢ細胞においてin vivoで、共刺激分子の上方調節を誘発することを実証する。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、腹腔内で３０μｇの生理食塩水希釈のＰａｐＭＶ（灰色線）または５０ｌｇのポリＩ：Ｃ（黒線）で免疫化し、対照マウスには生理食塩水を注射した（黒色のヒストグラム）。免疫化の２４時間後に、リンパ節および脾臓細胞を収集して染色した。フローサイトメトリを行って細胞密度を解析し、これは以下のように定義した：ＣＤ１１ｃ＋ ＣＤ１１ｂ−（ＤＣ）、ＣＤ１１ｃ− ＣＤ１１ｂ＋（マクロファージ）およびＣＤ１１ｃ− Ｂ２２０＋（Ｂ細胞）。２つの実験の代表的な結果を示す。ＦＩＴＣ、フルオレセインイソチオシアネート；ＭＨＣＩＩ、主要組織適合性複合体クラスＩＩ。
発明の詳細な説明
腸内細菌科細菌からの１または２種以上の抗原を、パパイアモザイクウィルス（ＰａｐＭＶ）またはパパイアモザイクウィルス由来のＶＬＰと組み合わせて含有する、抗原提示系（ＡＰＳ）が提供される。本発明の１態様により、ＡＰＳは、動物に体液性および／または細胞性免疫反応を誘発することができる。したがってＡＰＳは、細菌性疾患または状態に対するワクチンとして用いるのに適し、これは、免疫系のこれらの２つのブランチの、片方または両方の活性な関与を必要とする。
本発明の１つの態様において、ＡＰＳは、１または２種以上の腸チフス菌（S. typhi）抗原を含み、腸チフスの処置および／または予防用のワクチンとして用いるのに適する。
本発明の他の態様において、ＡＰＳは、１または２種以上の外膜タンパク質（Ｏｍｐ）抗原を含む。特定の態様において、ＡＰＳは、１または２種以上のＯｍｐＣおよび／またはＯｍｐＦ抗原を含む。当分野に知られているように、これら２つのタンパク質の領域は、腸内細菌科のメンバー全体で保存されている。したがって、他の態様において、本発明は、１または２種以上のＯｍｐＣおよび／またはＯｍｐＦ抗原を含むＡＰＳを提供し、これは多価ワクチンとして、複数の腸内細菌種による感染に対して防御を与えるために用いるのに好適である。さらなる態様において、本発明は、１または２種以上のＯｍｐＣおよび／またはＯｍｐＦ抗原を含むＡＰＳを提供し、これは、単価ワクチンとして用いるのに適する。
定義
別に定義されない限りにおいて、本明細書で用いる全ての技術的および科学的用語は、この発明が属する分野の当業者により、一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書において、用語「約」とは、与えられた値からおよそ＋／−１０％の変動を指す。かかる変動は、具体的に言及されていてもいなくても、本明細書に提供される全ての与えられた値に、常に含まれるものと理解される。
本明細書において用語「アジュバント」は、動物の免疫反応を増大、刺激、作動、増強、および／または調節する剤を指す。アジュバントは、免疫反応そのものに対して効果を有しても有していなくてもよい。
本明細書において「キメラタンパク質」は、通常は２つの別のタンパク質またタンパク質断片をコードする２または３以上の遺伝子が、天然にかまたはヒトの介入の結果により再結合して、その２つのタンパク質それぞれの全てまたは一部の組合せである１つのタンパク質（「キメラタンパク質」）をコードするポリヌクレオチドを提供する場合に、作製されるタンパク質である。本発明の文脈において、「融合タンパク質」は、「キメラタンパク質」と考えられる。
本明細書において、表現「融合外被タンパク質」は、融合したタンパク質の１つが、ＰａｐＭＶ外被タンパク質である、融合タンパク質を指す。
本明細書において用語「免疫反応」は、抗原または抗原性物質に対する応答における動物の免疫系の反応性の変化を指し、これは、抗体産生、細胞媒介性免疫性の誘発、補体活性化、免疫学的耐性の発達、またはこれらの組合せを含むことができる。
本明細書において用語「有効免疫防御反応」および「免疫防御」とは、１または２種以上の抗原に向けられた免疫反応であって、これにより、ワクチン接種した動物において、病原体による疾病および／または感染に対して防御することを意味する。本発明の目的のために、病原体による疾病および／または感染に対する防御には、疾病または感染の絶対的な防御だけでなく、ワクチン接種されておらず、かつ感染または疾病にかかった動物と比べて、ワクチン接種された動物における、疾病または感染の程度または割合における任意の検出可能な低下、または、病原体による感染から生じる疾病または任意の症状もしくは状態の重篤度における、任意の検出可能な低下も含む。有効免疫防御反応は、以前に当該疾病に罹患していない、以前に当該病原体に感染していない、および／またはワクチン接種の時に当該疾病または感染を有していない動物において、誘発可能である。有効免疫防御反応はまた、ワクチン接種の時に当該病原体による疾病または感染に既に罹患している動物においても、誘発可能である。免疫防御は、体液性および／または細胞性免疫性を含む、１または２以上のメカニズムの結果として生じることができる。
本明細書において同義で用いられる用語「免疫刺激（immuno stimulation）」および「免疫刺激（immunostimulation）」とは、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ ＶＬＰなどの、動物病原体または疾病と関連しない分子の能力であって、免疫系を刺激することによる、および／または前記感染または疾病に応答する免疫系の容量を改善することによる、前記病原体による感染に対する、または前記疾病に対する、防御を提供する前記能力を指す。免疫刺激は、予防効果、治療効果、またはこれらの組合せを有することができる。
「組換えウィルス」とは、その中で、天然のウィルスの遺伝物質が、他の遺伝物質と組み合わされているウィルスである。
本明細書において「天然の」とは、対象に適用する場合、対象が自然界で見出せるとの事実を指す。例えば、生物（ウィルスを含む）、または生物に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列であって、天然の給源から単離でき、研究室でヒトによって意図的に改変されていないものは、天然である。
本明細書において「ポリペプチド」または「ペプチド」は、ペプチド結合により結合された少なくとも４個のアミノ酸が存在する分子を意味することを意図する。
本明細書における表現「ウィルス核酸」とは、ゲノム（またはその主要部分）またはウィルス、またはこのゲノムに対して塩基配列が相補的である核酸分子であってよい。ウィルスＲＮＡに相補的なＤＮＡ分子も、ウィルス核酸と考えられ、ウィルスＤＮＡに対して塩基配列が相補的なＲＮＡ分子も同様である。
本明細書において用語「ウィルス様粒子」（ＶＬＰ）とは、ウィルス粒子と類似の物理的外観を有する、自己集合性（self-assembling）粒子を指す。ＶＬＰは、ウィルス核酸を含んでも、含まなくてもよい。ＶＬＰは一般に複製が不可能である。
本明細書において用語「偽ウィルス」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡなど、プラスミド形態の核酸を含む核酸配列を含むＶＬＰを指す。偽ウィルスは一般に複製が不可能である。
本明細書において用語「ワクチン」とは、免疫反応を生成することができる物質を指す。
本明細書において用語「免疫原」および「抗原」とは、１つの分子、複数の分子、分子の一部分、分子の複数部分、または分子の組合せであって、全細胞および組織までを含み、それのみで、またはアジュバントとの組合せで、対象に対して免疫反応を誘発することができるものを指す。免疫原／抗原は、単一のエピトープを含んでよく、または複数エピトープを含んでもよい。したがってこの用語は、ペプチド、炭水化物、タンパク質、核酸、および種々の微生物で、その全体または一部を包含し、これには、ウィルス、細菌および寄生生物を含む。ハプテンもまた、本明細書において用語「免疫原」および「抗原」に包含されると考えられる。
本明細書において同義で用いられる用語「免疫化」および「ワクチン接種」は、ワクチンを対象に対して免疫反応を惹起する目的のために投与することを指し、予防効果、治療効果、またはこれらの組合せを有することができる。免疫化は、処置する対象に依存して種々の方法を用いて実現することができ、これには、腹腔内注射（ｉ．ｐ．）、静脈内注射（ｉ．ｖ．）、筋肉内注射（ｉ．ｍ．）、経口投与、鼻腔内投与、スプレー投与および液浸を含むが、これらに限定しない。
本明細書において用語「プライムする」およびその文法的な変形は、動物において、抗原によるブースターワクチン接種の投与前に、免疫反応を刺激するおよび／または作動させることを意味する。
本明細書において疾病または病原体に関連して用いる用語「処置する」、「処置された」、または「処置している」とは、対象の、疾病または病原体の感染に対して抵抗性を増加させる処置（すなわち、該対象が疾病にかかるかまたは病原体に感染する可能性を低下させる）を指し、およびまた、対象が疾病にかかったか、病原体に感染した後に、疾病または感染と闘うための処置（例えば、疾病または感染を低減させ、消滅させ、改善させ、または安定化させる）を指す。
本明細書において用語「対象」または「患者」とは、処置が必要な動物を指す。
本明細書において用語「動物」とは、ヒトおよび非ヒト動物の両方を指し、限定されずに哺乳類、鳥類および魚類を含み、家庭用、農場用、動物園、実験用、および野生の動物を包含し、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、および他の有蹄動物、イヌ、ネコ、ニワトリ、アヒル、非ヒト霊長類、モルモット、ウサギ、クロアシイタチ（フェレット）、ラット、ハムスターおよびマウスである。
本明細書において核酸またはアミノ酸配列との関連で用いる用語「実質的に同一」とは、例えば以下に記載の方法を用いて最適に整列させた場合に、核酸またはアミノ酸配列が、規定の第２の核酸またはアミノ酸配列（または「参照配列」）と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有することを示す。「実質的な同一性」とは、配列の種々の型および長さを指すことができ、例えば全長配列、機能ドメイン、コードおよび／または制御配列、プロモーター、およびゲノム配列などである。２つのアミノ酸または核酸配列間のパーセント同一性は、当分野の業者の技能内である種々の方法により決定することができ、例えば、次のような公開されたコンピューターソフトウェアを用いて決定可能である：Smith Waterman Alignment（Smith, T. F. and M. S. Waterman (1981) J Mol Biol 147:195-7）；「BestFit」（Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489 (1981)）、これはGeneMatcher Plus（商標）, Schwarz and Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof, M. O., Ed pp 353-358に組み込まれている；BLASTプログラム（Basic Local Alignment Search Tool (Altschul, S. F., W. Gish, et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10）、およびこれの変法であって、BLAST-2、BLAST-P、BLAST-N、BLAST-X、WU-BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、CLUSTAL、およびMegalign（DNASTAR）ソフトウェアを含むもの。
さらに当業者は、アラインメントの測定のための、比較する配列の長さ全体での最大のアラインメントを実現するのに必要なアルゴリズムを含む、適切なパラメータを決定することができる。一般に、アミノ酸配列について、比較配列の長さは少なくとも１０アミノ酸である。当業者は、実際の長さは比較する配列全体の長さに依存し、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、もしくは少なくとも２００アミノ酸であってよく、または、アミノ酸配列の全長であってもよいことを理解する。核酸については、比較配列の長さは一般に少なくとも２５ヌクレオチドであるが、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、もしくは少なくとも６００ヌクレオチドであってもよく、または、核酸配列の全長であってもよいことを理解する。
用語「に一致している」または「に一致する」とは、核酸配列が、参照核酸配列の全体または一部と同一であることを指す。これと対照的に、用語「に相補的」とは、本明細書において、核酸配列が、参照核酸配列の相補鎖の全体または一部と同一であることを指す。実例としては、核酸配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に一致し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。
抗原提示系（ＡＰＳ）
本発明の抗原提示系（ＡＰＳ）は、１または２種以上の腸内細菌抗原を、パパイアモザイクウィルス（ＰａｐＭＶ）またはＰａｐＭＶ外被タンパク質に由来するＶＬＰと組み合わせて含む。「に由来する」の用語により、ＶＬＰが、野生型外被タンパク質の配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する外被タンパク質を含み、任意に、外被タンパク質に結合した１または２以上の抗原を含んでよいことを意味し、これは以下にさらに詳細に記載する。ＰａｐＭＶ外被タンパク質は、野生型外被タンパク質またはこれの改変型であって、多量体化および自己集合が可能でＶＬＰを形成するものであることができる。本発明の１つの態様において、以下にさらに詳細に記載するように、ＡＰＳは、腸内細菌である腸チフス菌（S. typhi）からの１または２以上の抗原を含む。他の態様において、ＡＰＳは、腸内細菌科の異なる細菌からの１または２以上の抗原を含む。
ＡＰＳが含む１または２以上の抗原は、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ ＶＬＰの外被タンパク質に複合することができ、または、非複合であってもよく（すなわち、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ ＶＬＰとは分離されている）、または、ＡＰＳは、複合抗原および非複合抗原の両方を含んでいてもよい。この後者の状況において、非複合抗原を、付加的単離抗原（additional isolated antigen）（ＡＩＡ）と呼ぶ。ＡＩＡは、複合抗原と同じでも異なっていてもよい。複合は、例えば、外被タンパク質への遺伝子融合により、または共有的、非共有的もしくは親和性の手段を介した結合によることができる。
ＡＰＳに含まれるＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ ＶＬＰは、したがって、動物の免疫反応を増強することができる免疫増強剤として、および任意に、ＡＰＳが含む１または２以上の抗原の担体として、作用する。本発明の１つの態様により、ＡＰＳは、動物に、体液性および／または細胞性の免疫反応を誘発することができ、したがって、例えば腸内細菌感染症に対するワクチンとして用いるのに適している。
パパイアモザイクウィルス（ＰａｐＭＶ）およびＰａｐＭＶ ＶＬＰ
本発明のＡＰＳは、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ ＶＬＰのいずれかを含む。ＰａｐＭＶ ＶＬＰは、ＶＬＰを形成するために多量体化および自己集合した、組み換えＰａｐＭＶ外被タンパク質から形成される。集合すると、各ＶＬＰは外被タンパク質サブユニットの長いらせん配列（helical array）を含む。野生型ウィルスは、１２００個を超える外被タンパク質サブユニットを含み、約５００ｎｍの長さである。しかし、野生型ウィルスより短いかまたは長いＰａｐＭＶ ＶＬＰも有効であることができる。本発明の１つの態様において、ＶＬＰは少なくとも４０個の外被タンパク質サブユニットを含む。他の態様において、ＶＬＰは、約４０〜約１６００個の外被タンパク質サブユニットを含む。代替的態様において、ＶＬＰは、少なくとも４０ｎｍの長さである。他の態様において、ＶＬＰは、約４０ｎｍ〜約６００ｎｍの長さである。
本発明のＶＬＰは、同一のアミノ酸配列を有する複数の組み換え外被タンパク質から、集合した場合の最終的なＶＬＰが同一の外被タンパク質サブユニットを含むように調製することができ、または、ＶＬＰは、異なるアミノ酸配列を有する複数の組み換え外被タンパク質から、集合した場合の最終的なＶＬＰが外被タンパク質サブユニットにおける変化を含むように調製することができる。
ＶＬＰを形成するために用いる外被タンパク質は、ＰａｐＭＶ外被タンパク質全体、もしくはこれの一部であってよく、または、外被タンパク質が、多量体化しＶＬＰ内に集合する能力を保持している限りにおいて、ＰａｐＭＶ外被タンパク質の遺伝子改変型であってもよく、例えば、１または２以上のアミノ酸の欠失、挿入、置き換えなどを含む。野生型ＰａｐＭＶ外被（またはカプシド）タンパク質のアミノ酸配列は、当分野に知られており（Sit, et al., 1989, J. Gen. Virol., 70:2325-2331およびGenBankアクセッション番号NP_044334.1を参照）、本明細書において、配列番号１（図１Ａ参照）として提供される。ＰａｐＭＶ外被タンパク質のヌクレオチド配列も、当分野に知られており（Sit, et al.,上記、およびGenBankアクセッション番号NC_001748（ヌクレオチド５８８９−６５３６）を参照）、本明細書において、配列番号２（図１Ｂ参照）として提供される。
上に述べたように、ＶＬＰが含む、組み換えＰａｐＭＶ外被タンパク質のアミノ酸配列は、親配列に正確に一致する必要はなく、すなわち、改変または「変異体配列」であってよい。例えば、組み換えタンパク質は、１または２以上のアミノ酸残基の置換、挿入または欠失によって変異させられていてもよく、そのためその部位の残基は親（参照）配列に一致しない。当業者はしかし、かかる変異は拡張的（extensive）ではなく、組み換え外被タンパク質の、多量体化しＶＬＰに集合する能力に大きな影響を与えないことを理解する。ＰａｐＭＶ外被タンパク質の変異型の、多量体やＶＬＰに集合する能力は、例えば、標準の技術による電子顕微鏡法により評価することができ、例示の方法は、本明細書の実施例に提供される。
多量体化しＶＬＰに集合する能力を保持する野生型タンパク質断片である、組み換え外被タンパク質（すなわち、「機能性」断片）は、したがって、本発明により意図される。例えば、断片は、タンパク質のＮ末端、Ｃ末端または内部からの１または２以上のアミノ酸の欠失、またはその組み合わせを含んでよい。一般に、機能性断片は、少なくとも１００アミノ酸の長さである。本発明の１つの態様において、機能性断片は、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１７０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、および少なくとも１９０アミノ酸の長さである。タンパク質のＮ末端での欠失は一般に、多量体化するタンパク質の能力を保持するために、２５アミノ酸より少ないアミノ酸を除去すべきである。
本発明により、組換え外被タンパク質が変異体配列を含む場合、この変異体配列は、参照配列と少なくとも約７０％同一である。１つの態様において、変異体配列は、参照配列と少なくとも約７５％同一である。他の態様において、変異体配列は、参照配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、および少なくとも約９７％、同一である。特定の態様において、参照アミノ酸配列は配列番号１である。
本発明の１つの態様において、ＶＬＰは、ＰａｐＭＶ外被タンパク質の遺伝子改変された（すなわち、変異体の）型を含む。他の態様において、ＰａｐＭＶ外被タンパク質は、タンパク質のＮまたはＣ末端からアミノ酸を除去されるか、および／または、１または２以上のアミノ酸置換を含むよう、遺伝子改変されている。さらなる態様において、ＰａｐＭＶ外被タンパク質は、タンパク質のＮまたはＣ末端から約１〜約１０個のアミノ酸を除去するよう、遺伝子改変された。
特定の態様において、ＰａｐＭＶ外被タンパク質は、タンパク質のＮ末端近傍（すなわち、配列番号１の１位および６位）で生じる２つのメチオニンコドンの１つを除去するよう、遺伝子改変され、翻訳を開始することができる。翻訳開始コドンの１つの除去は、タンパク質の均一な集団の産生を可能とする。選択されたメチオニンコドンを除去することができ、これは例えば、コドンを作っている１または２以上のヌクレオチドを、コドンがメチオニン以外のアミノ酸をコードするように、またはナンセンスコドンとなるように、置換することによる。代替的に、コドンの全部もしくは一部を、または、選択されたコドンを含むタンパク質をコードする核酸の５’領域を、除去することができる。本発明の特定の態様において、ＰａｐＭＶ外被タンパク質は、タンパク質のＮ末端から１〜５個のアミノ酸を除去するよう、遺伝子改変された。さらなる態様において、遺伝子改変されたＰａｐＭＶ外被タンパク質は、配列番号３と実質的に同一のアミノ酸配列を有する。
組換え外被タンパク質が、１または２以上のアミノ酸置換を含む変異体配列を含む場合、これらは、「保存的」置換または「非保存的」置換であることができる。保存的置換は、１つのアミノ酸残基を、類似の側鎖特性を有する他の残基と置き換えることを含む。当分野で知られているように、２０種の天然のアミノ酸は、それらの側鎖の物理化学的特性に従って分類可能である。適切な分類は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニンおよびトリプトファン（疎水性側鎖）；グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミン（極性の非荷電側鎖）；アスパラギン酸およびグルタミン酸（酸性側鎖）およびリシン、アルギニンおよびヒスチジン（塩基性側鎖）を含む。アミノ酸の他の分類は、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン（芳香族側鎖）である。保存的置換は、１つのアミノ酸を、同じ群の別のアミノ酸で置換することが関与する。非保存的置換は、１つのアミノ酸残基を、異なる側鎖特性を有する別の残基で置き換えることが関与し、例えば、酸性残基の中性または塩基性の残基による置き換え、中性残基の酸性または塩基性残基による置き換え、疎水性残基の親水性残基による置き換えなどである。
本発明の１つの態様において、変異体配列は、１または２以上の非保存的置換を含む。１つのアミノ酸を、異なる特性を有するもので置き換えることは、外被タンパク質の特性を改善し得る。例えば、本明細書に記載するように、外被タンパク質の残基１２８の変異は、タンパク質のＶＬＰへの集合を改善する。したがって本発明の１つの態様において、外被タンパク質は、外被タンパク質の残基１２８における変異を含み、ここで、この位置のグルタミン酸残基が、中性残基と置換される。さらなる態様において、１２８位のグルタミン酸残基は、アラニン残基と置換される。
同様に、組換え外被タンパク質をコードする核酸配列は、親参照配列に正確に一致する必要はないが、遺伝子コードの縮退のために、および／または、上記の変異体アミノ酸配列をコードするように、変化し得る。本発明の１つの態様において、したがって、組換え外被タンパク質をコードする核酸配列は、参照配列と少なくとも約７０％同一である。他の態様において、組換え外被タンパク質をコードする核酸配列は、参照配列と少なくとも約７５％同一である。他の態様において、組換え外被タンパク質をコードする核酸配列は、参照配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％同一である。特定の態様において、参照核酸配列は、配列番号２である。
ＰａｐＭＶ ＶＬＰ外被タンパク質は任意に、１または２以上の抗原、親和性ペプチドまたは他の短ペプチド配列に遺伝子的に融合してよく、こうして、以下にさらに詳細に記載するように１または２以上の抗原の結合を促進する。
抗原
本発明のＡＰＳは、腸内細菌科のグラム陰性細菌からの１または２以上の抗原を含む。好適な腸内細菌の例としては、エシェリキア（大腸菌）属（Escherichia）、サルモネラ属（Salmonella）、エルシニア属（Yersinia）、赤痢菌属（Shigella）、プロテウス属（Proteus）、クレブシエラ属（Klebsiella）およびエンテロバクター属（Enterobacter）の種が挙げられるが、これに限定しない。抗原は、免疫原、エピトープ、ミモトープ、または腸内細菌からの抗原決定基であってよく、例えば、ペプチド、タンパク質、核酸または表在性細菌性抗原成分（ＳＢＡＣ）であってよく、例えばリポ多糖類（ＬＰＳ）、莢膜抗原（本来、タンパク質様または多糖類）、もしくは鞭毛成分であり、または、細菌の不活性型もしくは弱毒型であってもよい。
候補となる抗原は、ＡＰＳの所望の最終用途、例えば対抗する細菌種の種類、多価ワクチンもしくは単価ワクチンどちらとしての使用が望まれているか、および／または投与される動物の種類などに基づく。適当な候補抗原は、当業者が容易に選択することができる。多数の腸内細菌性抗原成分が当分野に知られており、これらは本発明のＡＰＳに含めるための、好適な候補抗原である。当業者は、好適な１または２以上の候補抗原を、当分野に知られている標準の免疫学的技法を用いた、動物において免疫反応を誘発するそれらの能力の試験に基づき、本発明のＡＰＳに用いるために選択可能であることを理解する。
本発明の１つの態様において、候補抗原は、エシェリキア属、サルモネラ属、エルシニア属、赤痢菌属、プロテウス属、クレブシエラ属またはエンテロバクター属の種から選択される。本発明の他の態様において、候補抗原は、エシェリキア属、サルモネラ属、エルシニア属、赤痢菌属、クレブシエラ属またはエンテロバクター属の種から選択される。さらなる態様において、候補抗原は、エシェリキア属またはサルモネラ属の種から選択される。他の態様において、候補抗原は、サルモネラ属の種から選択される。特定の態様において、候補抗原は腸チフス菌抗原である。
好適な表在性細菌性抗原成分（ＳＢＡＣ）の候補としては、種々の腸内細菌Ｈ（鞭毛成分）抗原およびＯ（ＬＰＳ）抗原、腸チフス菌Ｖｉ（莢膜多糖）抗原、大腸菌ＫおよびＣＦＡ（莢膜成分）抗原および大腸菌海馬采付着因子抗原（fimbrial adhesion antigen）（Ｋ８８およびＫ９９）を含む。好適な抗原性タンパク質の候補としては、ポリンとしても知られている（Secundino et al., 2006, Immunology 117:59）、外膜タンパク質（Ｏｍｐｓ）；関連するポリンであって、例えば腸チフス菌の鉄調節性外膜タンパク質（IROMP, Sood et al., 2005, Mol Cell Biochem 273:69-78）、および、限定することなく腸チフス菌ＨＳＰ４０（Sagi et al., 2006, Vaccine 24:7135-7141）を含む、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）が挙げられる。好適なポリンの非限定的な例はＯｍｐＣおよびＯｍｐＦを含み、これらは多くのサルモネラおよび大腸菌種に見出されている。ＯｍｐＣおよびＯｍｐＦのオルソログも他の腸内細菌科において見出されており、本発明の目的に対して好適な抗原性タンパク質の候補である。さらに、Ｏｍｐ１Ｂ（Shigella flexneri）、ＯｍｐＣ２（Yersinia pestis)、ＯｍｐＤ（S. enterica）、ＯｍｐＫ３６（Klebsiella pneumonie）、ＯｍｐＮ（E. coli）およびＯｍｐＳ（S. enterica）は、腸内細菌科のポリンタンパク質内に見出された配列の保存領域に基づく（Diaz-Quinonez et al., 2004, Infect. and Immunity 72:3059-3062）、好適な候補である。
さらに好適な候補抗原は、金属輸送体タンパク質、例えば大腸菌のＳｉｔＡＢＣＤ、ＭｎｔＨおよびＦｅｏＢ金属輸送体である（Sabri, et al, 2008, Infect. Immun. 76:601-611；Epub ahead of print November 19, 2007）。
種々の腸内細菌からの抗原性タンパク質の配列が当分野で知られており、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）が維持するGenBankデータベースから容易にアクセス可能である。例えば、GenBankアクセッション番号P0A264（配列番号３９；図２１Ａにも示す）およびGenBankアクセッション番号NP_804453：ＯｍｐＣ（S. enterica subsp. enterica serovar Typhi Ty2）；GenBankアクセッション番号CAD05399（配列番号４０；図２１Ｂにも示す）：ＯｍｐＦ前駆体タンパク質（S. enterica subsp. enterica serovar Typhi CT18）；GenBankアクセッション番号16761195：ＯｍｐＣ（S. enterica serovar Typhimurium）；GenBankアクセッション番号47797：ＯｍｐＣ（S. enterica serovar Typhi）； GenBankアクセッション番号8953564：ＯｍｐＣ（S. enterica serovar Minnesota）； GenBankアクセッション番号19743624：ＯｍｐＣ（S. enterica serovar Dublin）； GenBankアクセッション番号19743622：ＯｍｐＣ（S. enterica serovar Gallinarum）；GenBankアクセッション番号26248604：ＯｍｐＣ（大腸菌）；GenBank アクセッション番号24113600：Ｏｍｐ１Ｂ（Shigella flexneri）；GenBankアクセッション番号16764875：ＯｍｐＣ２（Yersinia pestis）；GenBankアクセッション番号16764916：ＯｍｐＤ（S. enterica Serovar Typhimurium）；GenBankアクセッション番号151149831：ＯｍｐＫ３６（Klebsiella pneumonie）； GenBankアクセッション番号3273514：ＯｍｐＮ（大腸菌）、およびGenBankアクセッション番号16760442：ＯｍｐＳ（S. enterica serovar Typhi）。
本発明の１つの態様において、ＡＰＳに含まれる１または２以上の抗原は、タンパク質抗原である。タンパク質抗原は、全長タンパク質、実質的に全長タンパク質（例えばＮ末端および／またはＣ末端での約２５アミノ酸以下の欠失を含むタンパク質）、タンパク質の抗原性断片、またはこれらの組合せである。全長タンパク質は、適用可能である場合は、タンパク質の前駆体形態またはタンパク質の成熟（処理）形態であってよい。抗原性断片は、１または複数のエピトープを含むことができ、したがって数個のアミノ酸（例えば、少なくとも４個のアミノ酸）の１ペプチドから、数百のアミノ酸長のポリペプチドまでの大きさであってよい。本発明の１つの態様において、抗原性断片は、約４個のアミノ酸〜約２５０個のアミノ酸の長さである。他の態様において、抗原性断片は、約５個のアミノ酸〜約２００個のアミノ酸の長さである。他の態様において、抗原性断片は、約５個のアミノ酸〜約１５０個のアミノ酸の長さ、約５個のアミノ酸〜約１００個のアミノ酸の長さ、約５個のアミノ酸〜約７５個のアミノ酸の長さ、約５個のアミノ酸〜約７０個のアミノ酸の長さ、約５個のアミノ酸〜約６０個のアミノ酸の長さ、および、約５個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸の長さである。
本発明の１つの態様において、ＡＰＳに含まれる抗原は、全長または実質的に全長のタンパク質である。他の態様において、ＡＰＳに含まれる抗原は、全長または実質的に全長のポリンタンパク質である。さらなる態様において、ＡＰＳに含まれる抗原は、全長もしくは実質的に全長のＯｍｐＣおよび／もしくはＯｍｐＦタンパク質、または、全長もしくは実質的に全長のＯｍｐＣおよび／もしくはＯｍｐＦオルソログである。
表１に示すように、腸チフス菌ＯｍｐＣタンパク質および他の腸内細菌からのＯｍｐＣオルソログの配列は、高度に保存されている。配列は、サルモネラ種の間でさらに高度に保存されている（表１参照）。同様に、腸チフス菌ＯｍｐＦタンパク質および他のサルモネラ種からのＯｍｐＦオルソログも、高度に保存されている（表２参照）。したがって、本発明の１つの態様において、ＡＰＳに含まれる抗原の少なくとも１つは、図２１Ａ［配列番号３９］に示す腸チフス菌ＯｍｐＣタンパク質の配列と少なくとも約７５％同一のアミノ酸配列を有する、全長または実質的に全長のＯｍｐＣまたはＯｍｐＣオルソログである。他の態様において、ＡＰＳに含まれる抗原の少なくとも１つは、図２１Ａ［配列番号３９］に示す腸チフス菌ＯｍｐＣタンパク質の配列と少なくとも約７８％同一のアミノ酸配列を有する、全長または実質的に全長のＯｍｐＣまたはＯｍｐＣオルソログである。本発明のさらなる態様において、ＡＰＳに含まれる抗原の少なくとも１つは、図２１Ａ［配列番号３９］に示す腸チフス菌ＯｍｐＣタンパク質の配列と少なくとも約８０％同一のアミノ酸配列を有する、全長または実質的に全長のＯｍｐＣまたはＯｍｐＣオルソログである。
本発明の他の態様において、ＡＰＳに含まれる抗原の少なくとも１つは、図２１Ｂ［配列番号４０］に示す腸チフス菌ＯｍｐＦタンパク質の配列と少なくとも約７５％同一のアミノ酸配列を有する、全長または実質的に全長のＯｍｐＦまたはＯｍｐＦオルソログである。本発明のさらなる態様において、ＡＰＳに含まれる抗原の少なくとも１つは、図２１Ｂ［配列番号４０］に示す腸チフス菌ＯｍｐＦタンパク質の配列と少なくとも約７８％同一のアミノ酸配列を有する、全長または実質的に全長のＯｍｐＦまたはＯｍｐＦオルソログである。本発明の他の態様において、ＡＰＳに含まれる抗原の少なくとも１つは、図２１Ｂ［配列番号４０］に示す腸チフス菌ＯｍｐＦタンパク質の配列と少なくとも約８０％同一のアミノ酸配列を有する、全長または実質的に全長のＯｍｐＦまたはＯｍｐＦオルソログである。
本発明の特定の態様において、ＡＰＳに含まれる抗原は、全長または実質的に全長の腸チフス菌ＯｍｐＣおよび／またはＯｍｐＦタンパク質である。
表１：種々の腸内細菌からのＯｍｐＣおよびＯｍｐＣオルソログの配列同一性
１％同一性は、腸チフス菌ＯｍｐＣタンパク質（GenBankアクセッション番号P0A264）に対するパーセントであり、BLASTP 2.2.3 [Apr-24-2002]プログラム（Altschul, S.F., et al., (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）を用いて決定した。
２Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, Database issue D296-D299.
３GL numbers as of January 23, 2007
表２：種々の腸内細菌からのＯｍｐＦおよびＯｍｐＦオルソログの配列同一性
１％同一性は、腸チフス菌ＯｍｐＦタンパク質（GenBankアクセッション番号CAD05399）に対するパーセントであり、BLASTP 2.2.3 [Apr-24-2002]プログラム（Altschul, S.F., et al., (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）を用いて決定した。
２Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, Database issue D296-D299.
３GL numbers as of January 23, 2007
代替的な態様において、ＡＰＳに含まれる抗原は、タンパク質の抗原性断片である。上記タンパク質の種々の抗原性領域が同定され、これらは本発明のＡＰＳにおいて用いるのに好適な候補抗原である。例えば外膜タンパク質（Ｏｍｐ類）の表面露出ループは、本発明のＡＰＳに組み込むのに好適な候補抗原性断片である。腸チフス菌から単離されたＯｍｐＣのループ６（Ｌ６）およびループ７（Ｌ７）ペプチドは、これらの非限定的な例である。腸チフス菌ＯｍｐＣのＬ６およびＬ７ペプチドの配列は、それぞれ、GTSNGSNPST（配列番号４）およびKDISNGYGASYGDQ（配列番号５）として同定および報告されている（Paniagua-Solis et al., 1996, FEMS 141:31-36）。配列番号４および配列番号５に示された配列の全てまたは一部を含む抗原性断片も、好適な候補である。例えば、配列GTSNGSNPSTSYGFAN（配列番号５０）を有するポリン断片（これはＬ６ペプチドの重要なアミノ酸を含む）、および配列QSKGKDISNGYGASYGDQD（配列番号５４）を有するポリン断片（これはＬ７ペプチドの重要なアミノ酸を含む）などである。
他の抗原性エピトープもまた知られている。例えば、Ｌ６およびＬ７ペプチド以外の特定のＯｍｐＣ断片を、本発明のＡＰＳに含有するための候補抗原として用いることができ、これには、ＯｍｐＣ−７３ペプチド（配列番号６）およびＯｍｐＣ−１３２ペプチド（配列番号７）（表３参照）を含む（Diaz-Quinonez et al., 2004, Infect. and Immunity 72:3059-3062）。これらのペプチドの配列は腸内細菌科の異なる細菌の間で高度に保存され、これらのペプチドを、多価ワクチンを意図するＡＰＳへの含有についての、好適な候補抗原としている。他のエピトープ配列の例を、表３に配列番号８、９および１０として示す。腸チフス菌ＯｍｐＣタンパク質の種々の領域が、腸チフス菌にユニークな、潜在的なＢ細胞エピトープとして同定された（Arockiasamy and Krishnaswamy, 1995, J. Biosci, 20:235-243）（表３、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７および１８参照）。これらの領域を含む抗原性断片もまた、本発明のＡＰＳに含有するための候補抗原である。
表３：ＯｍｐＣおよび他の腸内細菌ポリンからの候補エピトープの配列
本発明の１つの態様において、ＡＰＳは、上記のエピトープのいくつかを含有する全長Ｏｍｐまたは断片を含む。他の態様において、抗原は、変異体にわたり保存されている配列を含み、例えば、アミノ酸TRXXFAGL（配列番号１９、ここでＸはＶ、ＬまたはＧであってよい）、またはアミノ酸RNXDFFGL（配列番号２０、ここでＸはＴまたはＳであってよい）により規定される保存領域である。
本発明の１つの態様において、ＡＰＳに組み込むために選択される少なくとも１つの抗原は、ポリンタンパク質抗原である。他の態様によれば、少なくとも１つの抗原は完全ポリンタンパク質(whole porin protein)である。さらに他の態様によれば、ＡＰＳに組み込むための候補抗原は、ＯｍｐＣおよび／またはＯｍｐＦ抗原である。さらなる態様において、ＡＰＳに組み込むための候補抗原は、ＯｍｐＣまたはＯｍｐＦのペプチドであり、例えば、ループ６、ループ７、ＯｍｐＣ−７３もしくはＯｍｐＣ１３２ペプチド、またはこれらの変異体である。他の態様において、候補抗原は、次に示す配列またはその断片と実質的に同一のアミノ酸配列を含む：配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、または配列番号２０。さらなる態様において、候補抗原は、配列番号４または配列番号５に示す配列またはその断片と、実質的に同一のアミノ酸を含む。
上記のように、選択された１または２以上の抗原のサイズは変更可能であり、選択された抗原のサイズは本発明の実施に重要ではない。抗原は、特異的であるか、またはＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびマクロファージ上の表面構造により、またはクラスＩもしくはクラスＩＩのＡＰＣ関連細胞表面構造により、認識されてよい。１つの態様において、本発明は、小さく弱い免疫原性の抗原に対して、特に有用である。選択された１または２以上の抗原は、ＰａｐＭＶもしくはＰａｐＭＶ ＶＬＰの集合を、または、免疫反応を免疫増強するＰａｐＭＶもしくはＰａｐＭＶ ＶＬＰの能力を妨害すべきではない。上記の候補抗原からの好適な抗原を、以下および実施例に記載されたものなどの標準の技法を用いて、当業者は容易に選択することができる。
本発明のＡＰＳは、それぞれが特定の免疫反応の引き金を引くことができる単一エピトープを有する、１または２以上の抗原を含むことができる。または、ＡＰＳは、各抗原が複数のエピトープを含む、１または２以上の抗原を含むことができる。ＡＰＳが含有する抗原は、同一であることができ、またはこれらは違っていてもよく、複数のタンパク質抗原が存在する場合、それらは単一タンパク質由来であるか、または複数のタンパク質由来であってよく、これには、２種類以上のタンパク質に由来する抗原を含む（例えば、ＯｍｐおよびＨＳＰ由来の抗原など）。腸内細菌抗原性タンパク質の組合せを提示する抗原を含むＡＰＳも意図され（例えば、２種以上の腸内細菌に由来する抗原）、同様に、タンパク質の同一の保存領域からの、ただし異なる腸内細菌に見られる該タンパク質の変異を提示する、抗原を含むＡＰＳも意図される。
本発明の特定の態様において、ＡＰＳは、腸内細菌科の異なるメンバーにわたって、または腸内細菌科のサブグループにわたって保存されている、１または２以上の抗原を含む。例えば、ＯｍｐＣまたはその断片、および／またはＯｍｐＦまたはその断片である。かかる抗原は、多価ワクチンとして用いることを意図するＡＰＳに含むのに、好適である。配列の比較により、ＯｍｐＣ／ＯｍｐＦおよび同一アミノ酸の範囲を含む、その腸内細菌オルソログの中で高度の保存が示唆された。事実、すべてのサルモネラ種のうち、ＯｍｐＣおよびＯｍｐＦは９８〜１００％同一性を示す（表１参照）。これらのタンパク質と、大腸菌、赤痢菌種、Klebsiella pneumoniaeおよびEnterobacter aerogenesを含む他の腸内細菌からのオルソログの比較では、腸チフス菌からのタンパク質配列との７５〜８５％の同一性が実証されている（表２参照）。
本発明はさらに、ＡＰＳが、完全タンパク質またはその断片である抗原を、１または２以上の表在性細菌性抗原成分（ＳＢＡＣ）（例えば、Ｏ抗原）と組み合わせて含むことができることを意図する。したがって、１つの態様により、ＡＰＳは１または２以上のＳＢＡＣと、１または２以上の抗原性タンパク質、ペプチドまたはその断片との組合せを含んでよい。
上述のように、本発明のＡＰＳは１または２以上の複合抗原(conjugated antigen)および１または２以上の付加的単離抗原（ＡＩＡ）を含むことができる。ＡＩＡは、ＡＰＳの複合抗原と同一でもよく、異なっていてもよい。複合抗原とＡＩＡの種々の組合せが意図され、これには次の非限定的例が含まれる：第１腸内細菌種からの１または２以上の複合抗原、および同じ腸内細菌種からの１または２以上のＡＩＡ；第１腸内細菌種からの１または２以上の複合抗原、および別の腸内細菌種からの１または２以上のＡＩＡ；１または２以上の複合タンパク質抗原またはタンパク質断片抗原、および１または２以上の完全タンパク質ＡＩＡまたはタンパク質断片ＡＩＡ；１または２以上の複合ＳＢＡＣ抗原、および１または２以上のＳＢＡＣ ＡＩＡ；１または２以上の複合タンパク質抗原またはタンパク質断片抗原、および１または２以上のＳＢＡＣ ＡＩＡ（または、その逆）；１または２以上の複合完全タンパク質抗原、および１または２以上の完全タンパク質ＡＩＡ；１または２以上の複合完全タンパク質抗原、および１または２以上の、該完全タンパク質のペプチドであるＡＩＡ。１または２以上の複合抗原およびＡＩＡは、同一のタンパク質の科（例えばＯｍｐ）に属していてもよく、またはこれらは異なる科（例えば、ＯｍｐおよびＨＳＰ）に属していてもよい。
本発明の１つの態様において、ＡＰＳは、１または２以上の複合抗原および、完全タンパク質である１または２以上のＡＩＡを含む。他の態様により、少なくとも１つのＡＩＡは、完全ポリンタンパク質である。他の態様において、少なくとも１つのＡＩＡは、ＯｍｐＣまたはＯｍｐＦである。さらなる態様において、少なくとも１つのＡＩＡは、ＯｍｐＣのペプチド、例えば、ループ６、ループ７、ＯＭＰＣ−７３もしくはＯＭＰＣ−１３２ペプチド、またはこれらの変異体、またはＯｍｐＦのペプチドである。他の態様において、少なくとも１つのＡＩＡは、次に示す配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む：配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、または配列番号２０。さらなる態様において、ＡＰＳが含む１または２以上の複合抗原およびＡＩＡは、同一である
抗原−ＰａｐＭＶおよび抗原ＰａｐＭＶ−ＶＬＰの組合せ
上述のように、ＡＰＳが含む１または２以上の抗原は、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ ＶＬＰの外被タンパク質に複合可能であり、またはこれらは、非複合形態でＡＰＳに存在してもよく（すなわち、単純にＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ ＶＬＰと混合されている）、またはこれらは、複合形態および非複合形態の両方で存在してもよい。複合は、例えば外被タンパク質との遺伝子融合、または共有結合、非共有結合もしくは親和性手段を介する結合による。しかし、１または２以上の抗原とＰａｐＭＶまたはＶＬＰとの組合せは、宿主の免疫系による抗原の認識、またはＰａｐＭＶもしくはＶＬＰの免疫反応を増強する能力を、妨害すべきではない。
本発明の１つの態様により、１または２以上の抗原は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰの外被タンパク質に複合している。ＶＬＰが自己集合外被タンパク質の複数の複製を含むため、抗原が外被タンパク質に結合すると、抗原をＶＬＰの表面上で、組織的な様式で提示することが可能となる。この態様によれば、ＶＬＰは外被タンパク質を含み、該外被タンパク質は第１部分を含み、この第１部分は、１または２以上の抗原を含む第２部分に複合している組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質である。抗原が複合した外被タンパク質は、他の融合外被タンパク質または野生型外被タンパク質を集合させて、免疫原担体ＶＬＰを形成する能力を保持するため、抗原は、この能力に影響しないで複合するように選択される。
ＶＬＰの表面上での抗原の提示を可能とするため、および抗原の免疫認識を増強するため、抗原は好ましくは、ＶＬＰの外表面上にある外被タンパク質の領域に結合する。したがって、抗原は、外被タンパク質のアミノ−（Ｎ−）またはカルボキシ−（Ｃ−）末端近くに挿入されるか、またはここにおいて結合することができ、または、ＶＬＰの外表面上にある外被タンパク質の内部ループ内に挿入されるか、またはこれに結合されてもよい。かかるループの１例は、配列番号１で示される、ＰａｐＭＶ外被タンパク質のアミノ酸４９〜５２により構成される領域である。本発明の１つの態様において、抗原は、ＰａｐＭＶ外被タンパク質のＣ末端に存在する。
本発明の１つの態様により、ＡＰＳは、１または２以上の抗原に遺伝子融合したＰａｐＭＶ外被タンパク質を含む。抗原が、ＰａｐＭＶ外被タンパク質−抗原融合物の、ＶＬＰに自己集合する能力を妨害する可能性を避けるために、ＰａｐＭＶ外被タンパク質への遺伝子融合のために選択される抗原は、一般に、約５０アミノ酸長より短い。本発明の１つの態様において、ＰａｐＭＶ外被タンパク質への遺伝子融合のために選択される抗原は、一般に、約４５アミノ酸長より短い。
より長い抗原も、以下にさらに詳細に記載されるように、ＰａｐＭＶもしくはＶＬＰとの単純な組合せにより、または化学的架橋または親和性結合により、ＡＰＳに容易に組み入れることができる。これらの後者の結合方法は、抗原のＰａｐＭＶへの結合を促進し、動物に投与された場合に、抗原に対する改善された免疫反応を導く。
他の態様において、１または２以上の抗原は、例えば、共有または非共有結合により（例えば、イオン性、疎水性、水素結合など）、外被タンパク質に化学的に架橋される。抗原および／または外被タンパク質は、当分野で知られているようにしてかかる架橋を促進するよう改変することができ、例えば、官能基または化学部分を、例えばＣ−またはＮ−末端または中間の位置においてタンパク質および／または抗原に付加することによる。例示の改変には、Ｓ−アセチルメルカプト無水コハク酸（ＳＡＭＳＡ）もしくはＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）などの官能基の付加、または１もしくは２以上のシステイン残基の付加を含む。他の架橋試薬は当分野に知られており、多数が市販されている（例えば、Pierce Chemical Co.およびSigma-Aldrichからのカタログ参照）。例としては以下が挙げられるが、これに限定されない：ジアミン類、例えば１，６−ジアミノヘキサン、１，３−ジアミノプロパンおよび１，３−ジアミノエタン；ジアルデヒド類、例えばグルタールアルデヒド；スクシンイミドエステル類、例えばエチレングリコール−ビス（コハク酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、グルタル酸ジスクシンイミジル、スベリン酸ジスクシンイミジル、Ｎ−（ｇ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステルおよびエチレングリコール−ビス（スクシンイミジルスクシネート）；ジイソシアン酸エステル類、例えばヘキサメチレンジイソシアネート；ビスオキシラン類、例えば１，４−ブタンジイルジグリシジルエーテル；ジカルボン酸類、例えば二サリチル酸スクシニル（succinyidisalicylate）；３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、など。上記の多くの架橋剤は、抗原をＶＬＰから隔てるためのスペーサーを組み込む。他のスペーサーの使用も本発明により意図される。種々のスペーサーが当分野に知られており、例えば６−アミノヘキサノン酸；１，３−ジアミノプロパン；１，３−ジアミノエタン；および、短いアミノ酸配列、例えば１〜５アミノ酸のポリグリシン配列を含むが、これに限定はしない。
１または２以上の抗原の、ＶＬＰの外被タンパク質への共有結合を促進するために、外被タンパク質は、ＶＬＰの表面に露出している短ペプチドもしくはアミノ酸リンカーに遺伝子融合でき、抗原の化学結合のための適切な部位を提供する。例えば、システイン残基または、共有結合を形成することができる側鎖か（たとえば、酸性または塩基性残基）、または当分野で知られているように、共有結合を形成するように容易に改変できる側鎖を有する他のアミノ酸残基を含む短ペプチドである。アミノ酸リンカーまたはペプチドは、例えば、１〜約２０アミノ酸長であってよい。１つの態様において、外被タンパク質は、１または２以上のリジン残基を含む短ペプチドに融合し、これは、上記のような好適な架橋剤の使用を通して、例えば抗原のシステイン残基と共有結合することができる。特定の態様において、外被タンパク質は、グリシンおよびリジン残基の短ペプチド配列に融合する。他の態様において、ペプチドは、GGKGGの配列を含む。
本発明のさらなる態様において、抗原は、外被タンパク質に存在する親和性部分を介して結合する。この態様により、ＰａｐＭＶ ＶＬＰは、自己集合の後にＶＬＰの表面に露出された、例えばペプチドなどの親和性部分を含み、これは、抗原に特異的に結合することができる。親和性部分は、ＰａｐＭＶまたはＶＬＰに、遺伝子融合（ペプチドまたはタンパク質断片の場合）、または共有結合もしくは非共有結合してよい。抗原の、親和性部分への結合は、宿主の免疫系による抗原の認識を妨害してはならない。本発明の１つの態様により、ＰａｐＭＶ ＶＬＰは、完全タンパク質を結合することができる、親和性部分を含む。本発明の他の態様により、ＰａｐＭＶ ＶＬＰは、タンパク質断片またはペプチドを結合することができる、親和性部分を含む。本発明のさらなる態様により、ＰａｐＭＶ ＶＬＰは、表在性細菌性抗原成分（ＳＢＡＣ）を結合することができる、親和性部分を含む。
本発明の特定の態様において、ポリンタンパク質に結合する親和性ペプチドを含むＰａｐＭＶ ＶＬＰを含むＡＰＳが提供される。本発明の他の態様において、ＯｍｐＣまたはＯｍｐＦに結合する親和性ペプチドを含むＰａｐＭＶ ＶＬＰを含むＡＰＳが提供される。
好適な親和性部分の例としては、抗体および抗体断片（例えばＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、二機能性抗体（diabody）および単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子）、ストレプトアビジン（ビオチン標識抗原を結合する）、抗原に特異的に結合する親和性ペプチドまたはタンパク質断片が挙げられるが、これに限定されない。
親和性部分として用いるのに好適なペプチドまたは抗体（抗体断片を含む）は、当分野で知られている技法、例えばファージまたは酵母提示技術により、選択することができる。ペプチドは、天然、組換え、合成またはこれらの組合せであってよい。例えば、ペプチドは天然のタンパク質またはポリペプチドの断片であってよい。用語ペプチドはまた、ペプチドアナログ、ペプチド誘導体およびペプチド模倣化合物も包含する。かかる化合物は当分野に知られており、天然のペプチドに対して利点を有する可能性があり、これには例えば、より大きな化学的安定性、タンパク質分解に対する抵抗性の増加、薬理学特性の増強（例えば、半減期、吸収、作用強度および有効性）および／または抗原性の低下などを含む。
好適なペプチドは、約３アミノ酸長〜約５０アミノ酸長であってよい。本発明の１つの態様により、親和性結合ペプチドは、少なくとも５アミノ酸長である。本発明の他の態様により、親和性結合ペプチドは、少なくとも７アミノ酸長である。本発明の他の態様により、親和性結合ペプチドは、約５アミノ酸長〜約５０アミノ酸長である。本発明の他の態様により、親和性結合ペプチドは、約７アミノ酸長〜約５０アミノ酸長である。本発明の他の態様により、親和性結合ペプチドは、約５アミノ酸長〜約４５アミノ酸長、約５アミノ酸長〜約４０アミノ酸長、約５アミノ酸長〜約３５アミノ酸長、および約５アミノ酸長〜約３０アミノ酸長である。本発明の特定の態様により、親和性結合ペプチドは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸長である。当業者により理解されるように、抗原を親和性部分に結合するために選択されたペプチドの長さは、ＰａｐＭＶ ＶＬＰの自己集合の能力、または一度結合された抗原の宿主の免疫系による認識を、妨害すべきではない。
ＰａｐＭＶまたはＶＬＰが含む親和性部分は、単一ペプチドであるか、またはペプチドの縦列もしくは複数配置であってよい。所望の場合は、大きな抗原の結合を促進するために、親和性部分と外被タンパク質の間にスペーサーを含むこともできる。好適なスペーサーは、例えばグリシンなどの中性アミノ酸の短い範囲を含む。例えば、約３〜約１０個の中性アミノ酸の範囲である。
ファージ提示を用いて、目的の抗原性タンパク質に結合する特定のペプチドを選択することができ、ここで標準の技法（例えば、Current Protocols in Immunology, ed. Coligan et al., J. Wiley & Sons, New York, NY参照）、および／または市販のファージ提示キット（例えば、New England Biolabsから入手可能なPh.Dシリーズのキット、およびNovagenより入手可能なT7-Select（登録商標）キット）を用いて行う。ファージ提示によるペプチドの選択の例は、以下の例ＶＩＩにも提供される。
ファージ提示により同定される、ポリンタンパク質を結合する代表的なペプチドを、表４に示す。当業者は、これらのペプチドが例示のみであり、目的のポリンへの親和性を有する他のペプチドも、当分野で知られている技法を用いて容易に同定可能であることを理解する。切断型、例えば、表４に示す配列の少なくとも４つの連続するアミノ酸を含み、ポリンタンパク質を結合する能力を保持している切断型も、意図される。本発明の特定の態様により、次に示す配列：配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５または配列番号２６の、全てまたは一部を含む１または２以上の親和性ペプチドを含むＰａｐＭＶ ＶＬＰを含むＡＰＳが、提供される。
表４：ファージ提示により選択される親和性ペプチドおよびその頻度
ＡＰＳの調製
本発明は、組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質由来のＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ ＶＬＰを含むＡＰＳを提供する。本発明はさらに、１または２以上の抗原または親和性部分を、外被タンパク質との遺伝子融合で含む、組換えＰａｐＭＶ ＶＬＰを提供する。これらの組換え外被タンパク質は、多量体化およびＶＬＰへの集合が可能である。抗原または親和性ペプチドを、抗原へ、また外被たんぱく質への結合のために遺伝子融合する方法は、以下および実施例に記載される。種々の分子をタンパク質に化学的に架橋する方法は当分野で知られており、用いることができる。
パパイアモザイクウィルス
ＰａｐＭＶは当分野で知られており、例えば、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）からＡＴＣＣ番号PV-204（登録商標）として入手可能である。ウィルスは、パパイア（Carica papaya）およびキンギョソウ（snapdragon (Antirrhinum majus)）などの宿主植物で維持でき、これらから、標準のプロトコル（Erickson, J. W. & Bancroft, J. B., 1978, Virology 90:36-46）に従って精製することができる。
ＰａｐＭＶ ＶＬＰ
本発明のＶＬＰを製造するために用いる組換え外被タンパク質は、標準の遺伝子操作技術により、当業者によって、野生型タンパク質の配列を得れば容易に調製可能である。遺伝子操作の方法は当分野に知られており（例えば、Ausubel et al. (1994 & updates) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New Yorkを参照）、野生型ＰａｐＭＶ外被タンパク質の配列も知られている（配列番号１および２を参照）。
野生型タンパク質をコードする核酸配列の単離およびクローニングは、標準の方法を用いて（例えば、Ausubel et al.、同上、などを参照）行うことができる。例えば、核酸配列は、ＰａｐＭＶから、標準の方法でＲＮＡを抽出し、次にＲＮＡテンプレートからｃＤＮＡを合成する（例えば、ＲＴ−ＰＣＲにより）ことにより、得ることができる。ＰａｐＭＶは、モザイク症状を示す感染植物の葉から、標準の方法により（例えば、本明細書に記載の例Ｉを参照）精製することができる。
次に、外被タンパク質をコードする核酸配列を、好適な発現ベクターに、直接、または１もしくは２以上のサブクローニングステップの後に、挿入する。当業者は、用いる正確なベクターは本発明に対して重要ではないことを理解する。好適なベクターの例は、プラスミド、ファージミド、コスミド、バクテリオファージ、バキュロウィルス、レトロウィルスまたはＤＮＡウィルスを含むが、これに限定しない。次に外被タンパク質を、以下にさらに詳細に記載するように、発現および精製することができる。
代替的に、外被タンパク質をコードする核酸配列をさらに操作して、当分野で知られている標準のin vitro部位特異的突然変異誘発技術により、上記のものなどの１または２以上の変異を導入することができる。突然変異は、コード配列を作っている１または２以上の適切なヌクレオチドの、欠失、挿入、置換、逆位、またはこれらの組合せにより、導入可能である。これは例えば、１または２以上のヌクレオチドミスマッチ、挿入または欠失を組み込んだプライマーを設計する、ＰＣＲに基づく技法により、実現することができる。突然変異の存在は、多くの標準技法、例えばＤＮＡ配列決定による制限解析により、確認可能である。
上述のように、外被タンパク質はまた、外被タンパク質に融合した１または２以上の抗原または親和性ペプチドを含む、融合タンパク質を産生するよう、操作することもできる。融合タンパク質を作製するための方法は、当業者によく知られている。融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、上記のように、好適な発現ベクターに挿入することができる。
当業者は、外被タンパク質または融合タンパク質をコードするＤＮＡを、コードされたタンパク質の活性に影響を与えることなく、種々の方法で変更できることを理解する。例えば、ＤＮＡ配列の変化を用いて、タンパク質を発現する宿主細胞のコドンの選好を最適化することができ、またはＤＮＡ配列の変化は、発現を促進する他の配列の変化を含むことができる。
当業者は、発現ベクターは、外被もしくは融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列の効率的な転写に必要な調節要素、例えば転写要素などをさらに含んでよいことを理解する。ベクターに組み込むことができる調節要素の例は、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、およびポリアデニル化シグナルを含むが、これに限定しない。したがって本発明は、遺伝子操作された外被タンパク質をコードする核酸配列に動作可能に結合された、調節要素を含むベクターを提供する。当業者は、好適な調節要素の選択は、遺伝子操作外被タンパク質の発現に選択された宿主細胞に依存し、かかる調節要素は、細菌、真菌、ウィルス、哺乳類または昆虫の遺伝子を含む種々の源に由来し得ることを理解する。
本発明の状況において、発現ベクターは、発現されたタンパク質の精製を促進する異種(heterologous)核酸配列をさらに含んでよい。かかる異種核酸配列の例は、金属親和性タグなどの親和性タグ、ヒスチジンタグ、アビジン／ストレプトアビジンコード配列、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）コード配列およびビオチンコード配列を含むが、これに限定しない。異種核酸配列によりコードされるアミノ酸は、当分野に知られている方法に従って用いる前に、発現された外被タンパク質から除去することができる。代替的に、異種核酸配列の発現に対応するアミノ酸は、続くＶＬＰへの集合を妨害しない場合には、外被タンパク質上に保持することもできる。
本発明の１つの態様において、外被タンパク質はヒスチジンタグ・タンパク質として発現される。ヒスチジンタグは、外被タンパク質のカルボキシル末端またはアミノ末端に位置させることができる。
発現ベクターは、好適な宿主細胞または組織内に、当分野で知られている種々の方法の１つを用いて、導入することができる。かかる方法は、Ausubel et al（同上）に一般的に記載されており、例えば、安定または過渡的なトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、および組換えウィルスベクターによる感染を含む。当業者は、外被タンパク質の発現のための適切な宿主細胞の選択は、選択したベクターに依存することを理解する。宿主細胞の例は、細菌、酵母、昆虫、植物および哺乳類細胞を含むが、これに限定しない。用いる正確な宿主細胞は、本発明に重要ではない。外被タンパク質は、原核生物宿主（例えば、大腸菌、A. salmonicidaまたはB. subtilis）または真核生物宿主（例えば、SaccharomycesまたはPichia；哺乳類細胞、例えばＣＯＳ，ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、またはＨｅＬａ細胞；昆虫細胞または植物細胞）において産生することができる。
必要に応じて、外被タンパク質は宿主細胞から、当分野で知られている標準の技法により（例えば、Current Protocols in Protein Science, ed. Coligan, J.E., et al., Wiley & Sons, New York, NYを参照）精製でき、標準のペプチド配列決定技法により、無傷のタンパク質またはそのタンパク質分解断片を用いて配列決定して、タンパク質の同一性を確認することができる。
本発明の組換え外被タンパク質は、多量体化およびＶＬＰへの集合が可能である。一般に、集合は、外被タンパク質を発現する宿主細胞内で起こる。ＶＬＰは宿主細胞から、本明細書に記載の実施例の節に記載されているような標準の技法により単離可能である。ＶＬＰは、クトマトグラフィなどの標準の技法によりさらに精製して、含有する宿主細胞タンパク質またはＬＰＳなどの他のタンパク質を除去することができる。本発明の１つの態様において、ＶＬＰを精製してＬＰＳを除去する。
本発明の１つの態様において、外被タンパク質は集合して宿主細胞内に組換えウィルスを提供し、核酸および融合タンパク質を含む感染ウィルス粒子の産生に用いることができる。これにより、感染ウィルス粒子による隣接する細胞の感染、およびその中の融合タンパク質の発現が可能である。この態様において、ウィルスを複製するために用いる宿主細胞は、ウィルスの複製を可能とする、植物細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞または細菌細胞であることができる。これらの細胞は、ウィルスに対する天然の宿主細胞であって、これからウィルス様粒子が導出されるものであってよいが、しかし必ずしもそうである必要はない。宿主細胞は、初めに粒子形態のウィルス（すなわち、核酸およびタンパク質を含む集合したロッド）により感染されるか、または代替的に、初期感染に用いるウィルス核酸が複製可能であり、キメラタンパク質を有する全ウィルス粒子の産生をもたらす場合には、核酸形態（すなわち、ウィルスＲＮＡなどのＲＮＡ；ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡから調製されるランオフ転写物）において感染されることができる。
組換えおよび改変外被タンパク質の特徴
組換え外被タンパク質および、抗原または親和性ペプチドが共有結合で結合した外被タンパク質を、それらの多量体化およびＶＬＰへ自己集合する能力について、標準の技法により解析することができる。例えば、精製タンパク質を電子顕微鏡法により視覚化することによる（例えば、例Ｉを参照）。さらに、超遠心分離法を用いてＶＬＰをペレットとして単離し、一方より小さな凝集物（２０マー以下）は上清中に残すことができ、円偏光二色性（ＣＤ）分光法を用いて、組換えもしくは改変タンパク質とＷＴウィルスの二次構造を比較することができる（例えば、例Ｉ参照）。
ＶＬＰおよびＰａｐＭＶの安定性を、必要に応じて、当分野で知られている技法、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびプロテイナーゼＫ分解分析（例ＩＩ参照）により決定することができる。本発明の１つの態様により、本発明のＰａｐＭＶおよびＰａｐＭＶ ＶＬＰは、高温において安定であり、室温で容易に保存可能である。
ＰａｐＭＶまたはＶＬＰのストックの産生
組換えＰａｐＭＶまたはＶＬＰのストックを、標準技法により製造する。例えば、組換え外被タンパク質を含むＰａｐＭＶまたは偽ウィルスを、例えば、Carica papaya（カリーカ・パパイア）またはAntirrhinum majus（キンギョソウ）などの適切な宿主内に、十分なＰａｐＭＶまたは偽ウィルスが収穫できるように、繁殖させることができる。
ＰａｐＭＶ ＶＬＰのストックは、適切は宿主細胞から、例えば、発現ベクターまたはＶＬＰを作る組換え外被タンパク質をコードするベクターにより、形質転換またはトランスフェクトされた大腸菌などから、調製することができる。宿主細胞は次に、当分野で知られているように、コードされたタンパク質の発現に有利な条件下で培養される。
発現された外被タンパク質は多量体化して宿主細胞のＶＬＰに集合し、これは標準の技法で、例えば、細胞を破壊して、細胞可溶化物を１または２以上のクロマトグラフィによる精製ステップに供することにより、細胞から単離することができる。
本明細書に提供される実施例において実証されるように、ＰａｐＭＶ ＶＬＰは安定な構造であり、ＶＬＰのストックは、したがって、室温または冷蔵庫で容易に保存することができる。
有効性の評価
本発明のＡＰＳの、ワクチンとしての有効性を評価するために、チャレンジ試験を実施することができる。かかる試験は、試験動物（例えばマウス）の群に、本発明のＡＰＳを標準技法により接種することを含む。非接種動物および／または市販のワクチンを接種された動物を含む対照群、または他の陽性対照を、平行して設定する。ワクチン接種後の好適な時間の後、動物を適切な腸内細菌によりチャレンジする。動物から、接種前および接種後、およびチャレンジ後に収集した血液試料を、ウィルスに対する抗体反応について分析する。抗体反応についての好適な試験は、ウェスタンブロット解析および酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）などを含むがこれに限定されない。
細胞免疫反応はまた、当分野で知られている技法により評価することができ、これには本明細書に示す実施例に記載のものを含む。例えば、ＰａｐＭＶ ＶＬＰに発現されたエピトープの、in vitroおよびin vivoでの、樹状細胞による特異的Ｔリンパ球へのプロセシングおよび交差提示（cross presentation）を介するなどの方法である。細胞性免疫（Ｔリンパ球）の誘発を評価する、他の有用な技法としては、Ｔ細胞増殖およびＩＦＮ−γ分泌放出のモニタリング、例えばＥＬＩＳＡによりサイトカインの誘発をモニタリングすること（例ＩＩＩ参照）などを含む。
ワクチン組成物
本発明は、腸内細菌感染症の処置および予防のためのワクチンとして用いるのに好適な本発明の１または２以上のＡＰＳを、１または２以上の無毒性の薬学的に許容し得る担体、希釈剤、および／または賦形剤と共に含む組成物を提供する。必要に応じて、他の活性成分、アジュバント、および／または免疫増強剤を組成物に含んでもよい。
組成物は、種々の経路による投与のために製剤化可能である。例えば、組成物は、経口、局所、鼻腔、直腸、または非経口投与用に製剤化でき、これには吸入またはスプレーによる投与を含む。本明細書において用いる用語、非経口的とは、皮下注射、静脈内、筋肉内、髄腔内、胸骨内注射または注入技法を含む。本発明の１つの態様において、組成物は局所、直腸もしくは非経口投与用に、または吸入もしくはスプレーによる投与用に製剤化される。他の態様において、組成物は非経口投与用に製剤化される。
組成物は好ましくは、本発明の１または２以上のＡＰＳの有効量を含む。本明細書において用いる用語「有効量」とは、検出可能な免疫反応を示すのに必要なＡＰＳの量をいう。与えられた適用に対してのＡＰＳの有効量は、初めは例えば細胞培養アッセイまたは動物モデルにおいて、通常はげっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ、または霊長類において、推定可能である。動物モデルはまた、好適な濃度範囲および投与経路を決定するために用いてもよい。かかる情報は次に、ヒトを含む処置する動物における、有用な用量および投与経路の決定に用いることができる。本発明の１つの態様において、単位用量は、約１０μｇ〜約１０ｍｇの外被タンパク質を含む。他の態様において、単位用量は、約１０μｇ〜約５ｍｇの外被タンパク質を含む。さらに他の態様において、単位用量は、約４０μｇ〜約２ｍｇの外被タンパク質を含む。１また２以上の用量を用いて動物を免疫化することができ、これらは、同じ日に投与することも、または数日もしくは数週間の期間にわたって投与することもできる。
上述のように、本発明のＡＰＳは複数の抗原（複合および／または非複合形態）を含んでよく、したがって単一のＡＰＳは、多価ワクチン製剤を提供することができる。多価ワクチンはまた、腸内細菌科の異なるメンバー内で保存されている、１つの抗原（複合および／または非複合形態）を含むＡＰＳの使用を通して提供することができる。また、複数のＡＰＳを含む多価ワクチン組成物であって、各ＡＰＳが異なる抗原を含むものも意図される。多価ワクチンは、例えば、腸内細菌科の２つ以上のメンバーに対する防御を提供するのに有用である。多価ワクチン製剤は、２価および３価の製剤を、より高い価のワクチンに加えて含む。本発明の１つの態様は、多価ワクチンを提供する。本発明の他の態様は、複数の腸内細菌種にわたって保存されている１つの抗原を含む、多価ワクチンを提供する。さらなる態様は、複数の（すなわち、２または３以上の）ＡＰＳを含み、各ＡＰＳが異なる抗原を含む、多価ワクチンを提供する。本発明のさらなる態様において、複合ＯｍｐＣまたはＯｍｐＦ抗原および非複合ＯｍｐＣまたはＯｍｐＦ抗原を含むＡＰＳを含む、多価ワクチンが提供される。
複数の（すなわち、２または３以上の）ＡＰＳを含み、各ＡＰＳが異なる抗原を含む、多価ワクチンはまた、製剤のエピトープのより大きな数によって、改善された防御を提供可能である。本発明の１つの態様は、したがって、２または３以上のＡＰＳを含み、各ＡＰＳが異なる抗原を含む、ワクチン製剤を提供する。他の態様において、ＯｍｐＣ抗原を含むＡＰＳおよびＯｍｐＦ抗原を含むＡＰＳを含む、ワクチン製剤が提供される。特定の態様において、ワクチン製剤が含む２または３以上のＡＰＳは、複合および非複合抗原の両方を含む。
経口使用のための組成物は、例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ、水性もしくは油性の懸濁液、分散粉末または顆粒、乳剤、硬質もしくは軟質カプセル、またはシロップまたはエリキシル剤として、製剤化可能である。かかる組成物は、当分野で知られている医薬組成物の製造の標準法により製造可能であり、甘味料、香味剤、着色剤および保存剤の群から選択される１または２以上の剤を、薬学的に洗練された口に合う調製物を提供するために、含んでよい。
錠剤は、ＡＰＳを、好適な無毒性の薬学的に許容し得る、例えば以下に記載の賦形剤と組み合わせて含む：不活性の希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウム；顆粒化または崩壊剤、例えばコーンスターチ、またはアルギン酸；結合剤、例えばスターチ、ゼラチンまたはアカシア、および湿潤剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク。錠剤は被覆されていなくてもよく、または、消化管での分解および吸収を遅延させ、これにより長期の持続作用を提供するために、既知の技術により被覆されてもよい。例えば、時間遅延材料、例えばモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどを用いてもよい。
経口使用のための組成物はまた、ＡＰＳが不活性の固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合される、硬質ゼラチンカプセルとして提供することもでき、あるいは、活性成分が水またはピーナツ油、液体パラフィンまたはオリーブ油などの油性媒体と混合される、軟質ゼラチンカプセルとしても提供可能である。
鼻腔内投与用の組成物は、例えば、鼻腔用スプレー、鼻腔用のドロップ、懸濁液、溶液、ゲル、軟膏、クリーム、および粉末を含むことができる。組成物は、例えばAccuspray（登録商標）（Becton Dickinson）などの好適な市販の鼻腔用噴霧器を通しての投与用に製剤化することができる。鼻腔内投与の他の方法は、当分野で知られている。
水性懸濁液として製剤化される組成物は、ＡＰＳを１または２以上の好適な賦形剤と組み合わせて含み、これは例えば、懸濁剤であって例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、トラガカント・ゴムおよびアカシア・ゴム；分散剤または湿潤剤、例えばレシチンなどの天然のホスファチド、または酸化アルキレンと脂肪酸との縮合生成物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、または酸化エチレンと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えばヘプタ−デカエチレンオキシセタノール、または酸化エチレンと脂肪酸／ヘキシトール由来の部分エステルとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、または酸化エチレンと脂肪酸／ヘキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合生成物、例えばポリエチレンソルビタンモノオレエートなどである。水性懸濁液はまた、１または２以上の保存剤、例えばエチル、またはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、１または２以上の着色剤、１または２以上の香味剤または１または２以上の甘味料、例えばスクロースもしくはサッカリンを含んでよい。
組成物は、油性懸濁液として、ＡＰＳを例えばラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油またはココナツ油などの植物油中に、または液体パラフィンなどの鉱油に懸濁させることにより、製剤化することもできる。油性懸濁液は、増粘剤、例えば蜜ろう、硬質パラフィンまたはセチルアルコールなどを含んでよい。上記などの甘味料、および／または香味剤を任意に加えて、口に合う経口製剤を提供することができる。これらの組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤の添加により、保存することができる。
組成物は、分散性の粉末または顆粒として製剤化でき、これは次に、水を添加して水性懸濁液の調製に用いることができる。かかる分散性の粉末または顆粒は、ＡＰＳを、１または２以上の分散剤または湿潤剤、懸濁剤および／または保存剤と組み合わせて提供する。好適な分散剤または湿潤剤、および懸濁剤は、上記で既に例示されている。追加の賦計剤、例えば甘味料、香味剤および着色剤もまた、これらの組成物に含むことができる。
本発明の組成物はまた、水中油型乳剤としても製剤化可能である。油相は、オリーブ油もしくはラッカセイ油などの植物油、または液体パラフィンなどの鉱油、またはこれらの油の混合物でもよい。これらの組成物に含めるのに好適な乳化剤は、天然のゴム、例えばアカシアゴムもしくはトラガカントゴム；天然のホスファチド、例えば大豆、レシチン；または脂肪酸とヘキシトール無水物由来のエステルもしくは部分エステル、例えばモノオレイン酸ソルビタン、および前記部分エステルと酸化エチレンとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートを含む。乳剤はまた、任意に甘味料および香味剤を含むことができる。
組成物は、シロップまたはエリキシル剤として、ＡＰＳを１または２以上の甘味料、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールまたはスクロースなどと混合することにより製剤化することができる。かかる製剤はまた、１または２以上の粘滑剤、保存剤、香味剤および／または着色剤を任意に含むことができる。
組成物は、無菌の注射可能な水性または油性懸濁液として、当分野で知られている方法により、上述のものなどの、好適な１または２以上の分散剤および／または湿潤剤および／または懸濁剤を用いて、製剤化することができる。無菌の注射用調製物は、無毒性の非経口的に許容し得る希釈剤または溶媒中の、無菌の注射用溶液または懸濁液であってよく、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液である。用いることのできる、許容し得るビヒクルおよび溶媒は、水、リンガー溶液、乳酸加リンガー溶液および等張食塩水を含むが、これに限定しない。他の例には、従来から溶媒または懸濁媒体として用いられている無菌の固定油、および種々の無刺激性の固定油であって、例えば合成モノ−およびジグリセリドなどを含む。オレイン酸などの脂肪酸もまた、注射物の調製に用いることができる。
任意に、本発明の組成物は、保存剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなど、および／または安定化剤、例えば炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、スターチ、スクロース、グルコース、またはデキストラン）、タンパク質（例えばアルブミンまたはカゼイン）、またはタンパク質含有剤（例えばウシ血清またはスキムミルク）を、好適な緩衝液（例えばリン酸緩衝液）と共に含んでよい。組成物のｐＨおよび種々の成分の正確な濃度は、周知のパラメータにしたがって調節してよい。
さらに、アジュバントの活性を有する１または２以上の化合物も、ワクチン組成物に任意に加えてよい。好適なアジュバントは、例えば、ミョウバンアジュバント（例えば水酸化、リン酸化、または酸化アルミニウム）；油型乳剤（たとえばBayol F（登録商標）またはMarcol52（登録商標））；サポニン、またはビタミンＥ可溶化物を含む。ビロソーム(virosome)もアジュバント特性を有するとして知られており（Adjuvant and Antigen Delivery Properties of Virosomes, Glueck, R., et al., 2005, Current Drug Delivery, 2:395-400）、本発明のＡＰＳと共に用いることができる。
前に本明細書に示し、実証したように、ＰａｐＭＶおよびＰａｐＭＶ ＶＬＰはアジュバント特性を有する。したがって、本発明の１つの態様において、ワクチン組成物は追加のＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ ＶＬＰをアジュバントとして含む。いくつかの態様において、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ ＶＬＰの使用は、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ ＶＬＰが注射により投与された場合に、明白な局所的毒性をもたらさないことが観察されているために、市販のアジュバントに対して利点を有する。
オプソニン化ワクチン組成物も、本発明により包含され、例えば、ワクチン、抗原またはＰａｐＭＶ ＶＬＰにより前もって免疫化された動物またはヒトから単離された抗体を含む、ワクチン組成物である。ワクチン、抗原またはＰａｐＭＶ ＶＬＰにより前もって免疫化された動物またはヒトから単離された抗体に基づく、組換え抗体も、ワクチン組成物のオプソニン化に用いることができる。
さらに本発明が包含するのは、本発明のＡＰＳと、市販の腸内細菌ワクチンとを含む、ワクチン組成物の組合せである。市販のワクチンには、ＶｉおよびＴｙ２１ａ腸チフスワクチンを含む。
他の薬学的組成物および医薬組成物を調製するための方法は、当分野で知られており、例えば“Remington: The Science and Practice of Pharmacy”（旧タイトル：“Remingtons Pharmaceutical Sciences”）；Gennaro, A., Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2000)に記載されている。
ワクチンの安定性
上述および本明細書に提供される実施例に記載されているように、ＰａｐＭＶ ＶＬＰは安定な構造であり、したがって安定なワクチン組成物を提供する。腸チフス菌からのポリンタンパク質も、冷蔵または室温のどちらにおいても、長期間安定であることが示された（例えば、以下の例ＸＩＩＩおよび図３０参照）。したがって、本発明の１つの態様は、ＰａｐＭＶ、またはＰａｐＭＶ ＶＬＰおよび１または２以上の腸チフス菌ポリンタンパクを含み、例えば６ヶ月以上などの長期間、冷蔵下（例えば約１℃〜約１０℃）にて、従来の保存剤の不在のもとか、または少量の好適な界面活性剤の存在下において安定である、ワクチン組成物を提供する。別の態様において、本発明は、ＰａｐＭＶ、またはＰａｐＭＶ ＶＬＰおよび１または２以上の腸チフス菌ポリンタンパクを含み、少なくとも６ヶ月〜約３６ヶ月の間冷蔵下で安定である、ワクチン組成物を提供する。さらなる態様において、本発明は、ＰａｐＭＶ、またはＰａｐＭＶ ＶＬＰおよび１または２以上の腸チフス菌ポリンタンパクを含み、約５年間冷蔵下で安定である、ワクチン組成物を提供する。さらなる態様において、本発明は、ＰａｐＭＶ、またはＰａｐＭＶ ＶＬＰおよび１または２以上の腸チフス菌ポリンタンパクを含み、少なくとも１ヶ月〜６ヶ月、室温で、従来の保存剤の不在のもとでか、または少量の好適な界面活性剤の存在下において安定である、ワクチン組成物を提供する。
用途および使用
本発明は、本明細書に記載のＡＰＳの、多数の用途および使用を提供する。非限定的な例は、ＡＰＳの、１または２以上の腸内細菌感染症に対するワクチンとしての使用、およびＡＰＳの、腸内細菌に対する抗体のスクリーニングのための使用を含む。本発明はしたがって、動物に１または２以上の腸内細菌抗原への免疫反応を誘発するための方法も提供する。さらに、本発明のＡＰＳの、アジュバント、ワクチンおよび／または医薬組成物などの医薬の製造のための使用も、本発明の範囲内である。
本発明のＡＰＳは、ヒトおよび家畜用および農場用動物を含む非ヒト動物における使用に好適である。ＡＰＳの投与形態は、任意の他の一般に認められたワクチンプログラムと違っている必要はない。効果的な免疫反応を誘発するのに十分な量でのＡＰＳの単回投与を用いてよく、または代替的に、ＡＰＳの初回投与に続き、抗原のみで、または抗原とＡＰＳでのブーストという別の形態を用いてもよい。同様に、ＡＰＳまたは抗原のどちらかによるブーストは、初回投与後に抗体価が許容レベルを下回った場合に行ってもよい。
ＡＰＳが１または２以上の非複合抗原を含む場合、ＰａｐＭＶまたはＶＬＰ成分は、１または２以上の抗原と同時に投与することができ、または、免疫反応を必要とする対象の必要性に応じて、抗原の投与の前に、またはこれに続いて、投与することができる。
本発明の１つの態様は、ＡＰＳを従来の腸内細菌ワクチン、例えばＶｉまたはＴｙ２１ａ腸チフスワクチンと共に含むワクチンの使用を提供する。この態様により、ＡＰＳワクチンを、従来のワクチンと同時に投与でき（例えば２つの組成物を混合することにより）、またはこれを、従来ワクチンの投与の前もしくはこれに続いて投与することができる。
本発明の１つの態様は、ＡＰＳの、ヒトに対する腸内細菌ワクチンとしての使用を提供する。本発明の他の態様は、ＡＰＳの、ヒトにおいて、次の属：エシェリキア属、サルモネラ属、エルシニア属、赤痢菌属、プロテウス属、クレブシエラ属またはエンテロバクター属の１または２以上の種に対する腸内細菌ワクチンとしての使用を提供する。本発明のさらに他の態様は、ＡＰＳの、ヒトにおける、サルモネラ種、大腸菌種、エルシニア種、赤痢菌種、クレブシエラ種またはエンテロバクター種に対する腸内細菌ワクチンとしての使用を提供する。さらなる態様は、ＡＰＳの、ヒトにおける、サルモネラ種、大腸菌種、または赤痢菌種対する腸内細菌ワクチンとしての使用を提供する。この目的のためのＡＰＳは、ポリン抗原、ＨＳＰ抗原およびＳＢＡＣ抗原から選択される、１または２以上の抗原を含む。
ＡＰＳに組み込まれる１または２以上の抗原に依存して、ワクチンは、腸内細菌により引き起こされる疾患または状態の処置および／または予防のために有用であり、例えば、腸チフス、食品媒介性胃腸炎、食品媒介性腸感染症、尿路感染症、髄膜炎、敗血症、細菌性赤痢、ペスト、全腸炎、肺炎、血液感染症、院内感染症およびグラム陰性菌敗血症である。
本発明の１つの態様において、ＡＰＳは、１または２以上の、ＯｍｐＣ抗原、ＯｍｐＦ抗原、ＯｍｐＣオルソログからの抗原、またはＯｍｐＦオルソログからの抗原を含む。本発明の１つの態様は、１または２以上のＯｍｐＣおよび／またはＯｍｐＦ抗原、またはこれらのオルソログを含むＡＰＳの、種々のサルモネラ種、大腸菌種および赤痢菌種に対する腸内細菌ワクチンとしての使用を提供する。本発明の特定の態様において、ＯｍｐＣもしくはこのオルソログを含むＡＰＳを、これのみで、またはＯｍｐＦもしくはこのオルソログを含むＡＰＳと組み合わせての、多価ワクチンとしての使用が提供される。
本発明の他の態様は、ＡＰＳの腸チフス菌に対するワクチンとしての、ヒトにおける腸チフスの処置または予防のための使用を提供する。１つの態様において、ワクチンは、成人および小児の両方に好適である。本発明の特定の態様において、腸チフス菌のポリンタンパク質由来の少なくとも１つの抗原を含むＡＰＳの、ヒト腸チフスワクチンとしての使用を提供する。ＡＰＳは、任意に、上記のようにポリンタンパク質抗原である１または２以上のＡＩＡ、および／または異なる腸チフス菌成分から（すなわち、例えばＨＳＰなど他のタンパク質から、および／またはＳＢＡＣから）の抗原を含むことができる。特定の態様において、ＯｍｐＣもしくはこのオルソログを含むＡＰＳを、これのみで、またはＯｍｐＦもしくはこのオルソログを含むＡＰＳと組み合わせた、腸チフスワクチンとしての使用が提供される。本発明の他の態様において、配列番号：４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８，１９、または２０のいずれかと実質的に同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの抗原、またはこの変異体を含むＡＰＳの、ヒトの腸チフスワクチンとしての使用を提供する。さらなる態様において、配列番号４または５と実質的に同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの抗原、またはこの変異体を含むＡＰＳの、ヒトの腸チフスワクチンとしての使用を提供する。
本発明の代替的態様は、ＡＰＳの、非ヒト動物、例えばウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、非ヒト霊長類、モルモット、ウサギ、フェレット、ラット、ハムスター、マウス、魚類または鳥類に対する、腸内細菌ワクチンとしての使用を提供する。ワクチンは、以下のような腸内細菌性の疾患または状態の処置および／または予防に有用である：呼吸器疾患、全腸炎、腹膜炎、膀胱炎およびその他の泌尿生殖器感染症、全身性大腸菌症、子牛下痢症、浮腫、乳腺炎、リンパ節炎、腸炎、感染流産、子宮炎、肺炎、下痢、死産、羊毛損傷（wool damage）および敗血症。
非ヒト動物において用いるために、ＡＰＳは、ヒトでの使用に上で同定された１または２以上の抗原を含むことができ、これには限定なく、ＯｍｐＣ抗原、ＯｍｐＦ抗原、ＨＳＰ抗原およびＳＢＡＣ抗原を含む。本発明のさらなる態様において、非ヒト動物における腸内細菌科に医学的に関連する１または２以上の種に対する、腸内細菌ワクチンとして用いる、ＡＰＳが提供される。かかる細菌種の例は、例えば以下を含む：霊長類において、Klebsiella pneumoniae、Yersinia pseudotuberculosis、赤痢菌種、大腸菌、サルモネラ種；ネコおよびイヌにおいて、大腸菌およびプロテウス種；ウマにおいて、S. typhimurium、S. newport、S. anatum、およびK. pneumoniae；鳥類において、大腸菌、Salmonella enterica、Salmonella pullorumおよびSalmonella gallinarum；ヒツジにおいて、大腸菌、Salmonella abortusovis、S. typhimuriumおよびS. dublin；ウシにおいて、大腸菌、セラシア種、クレブシエラ種、Citrobacter freundii、Salmonella dublinおよびS. typhimurium ；ブタにおいて、大腸菌、K. pneumoniae、Yersinia enterocolitica、S. choleraesuis、S. typhisuis、Salmonella typhimuriumおよびS. derby；および魚類において、Yersinia ruckeri、Edwardsiella tardaおよびEdwardsiella ictaluri。
本明細書に示すように、ＰａｐＭＶ ＶＬＰは、抗原に対する体液性および／またはＣＴＬ反応の両方を増強する能力を有する。したがって、本発明の１つの態様において、体液性および／またはＣＴＬ反応を誘発することができる腸チフス菌抗原を含むＡＰＳを含むワクチンを提供する。
本発明はまた、ＡＰＳの、スクリーニング剤としての使用、例えば、腸チフス菌などの腸内細菌に対する抗体をスクリーニングするための使用を提供する。ＡＰＳは、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）またはウェスターンブロッティングなどの従来の免疫学的技法に容易に適合させることができ、したがって診断および研究の文脈で有用である。
キット
本発明はさらに、腸内細菌ワクチンとして用いる１または２以上のＡＰＳを含むキットを提供する。１つの態様において、本発明は腸チフスに対するワクチンとして用いるための、腸チフス菌抗原を含む１または２以上のＡＰＳを含むキットを提供する。キットの個々の成分は別々の容器に入れられ、かかる容器に付随して、薬学的または生物学的製品の製造、使用または販売を規制している政府機関による所定の形態における、該機関による製造、使用または販売の承認を反映する注意書きがあってよい。キットは任意に、ワクチンの使用または投与の方法を概説する使用説明書または指示書を含んでよい。
キットの１または２以上の成分が溶液として、例えば水溶液、または無菌の水溶液として提供される場合、容器はそれ自体が、吸入器、シリンジ、ピペット、点眼容器、または他の類似の機器であって、これから溶液を対象に投与でき、またはこれを適用してキットの他の成分と混合することができる。
キットの成分はまた、乾燥または凍結乾燥形態で提供してもよく、キットは追加して凍結乾燥成分の再構成のための好適な溶媒を含むことができる。容器の数または種類と無関係に、本発明のキットはまた、患者への組成物の投与を支援するための機器も含んでよい。かかる機器は、吸入器、シリンジ、ピペット、鉗子、計量スプーン、点眼容器、または類似の医学的に承認された送達媒体であってよい。
抗体検出に用いるための、本発明の１または２以上のＡＰＳを含むスクリーニングキットも提供される。キットは、診断用キットまたは研究目的のキットであることができる。キットの個別の成分は別々の容器に入れられ、かかる容器に付随して、生物学的製品の製造、使用または販売を規制している政府機関による所定の形態における、該機関による製造、使用または販売の承認を反映する注意書きがあってよい。キットは任意に、ワクチンの使用または投与の方法を概説する使用説明書または指示書を含んでよい。
本明細書に記載の発明のよりよい理解を得るために、以下の実施例を設ける。これらの例は、本発明の例示の態様を記載することを意図し、本発明の範囲の限定を意図するものではない。
実施例
例Ｉ：ＰａｐＭＶ外被タンパク質のＲＮＡ結合および自己集合におよぼす変異の効果
アラニンの挿入を２位において含み、Ｎ末端において５つのアミノ酸がＷＴ配列から除去されているＰａｐＭＶ外被タンパク質（ＣＰΔＮ５；配列番号３に示す）を用いて、Tremblay, M-H., et al., 2006, FEBS J., 273:14-25に概説されている一連の変異体を作製した。ＰａｐＭＶ ＣＰの１２８位に対応するアミノ酸はほとんどのポテックスウィルス（potexvirus）においてはＡであるが、ＰａｐＭＶにおいてはＥであることを明らかにした、ＰａｐＭＶ ＣＰのアミノ酸９０〜１６９の間の１９個のポテックスウィルスＣＰのアミノ酸配列に基づき、また、荷電された残基Ｒ１０４、Ｋ１３３、Ｋ１３７およびＲ１６１はゲノムＲＮＡとの相互作用に関与し、ウィルスゲノムの集合およびパッケージングに重要な役割を果たす可能性があるとの報告（Abouhaidar, & Lai, 1989, J. Gen. Virol. 70, 1871-5)）に基づき、次の変異を作製した：Ｅ１２８Ａ；Ｋ９７Ａ；Ｒ１０４Ｋ１０５Ｒ１０８／Ａ；Ｒ１１８Ｄ１２０Ｋ１２１／Ａ；Ｋ１３３Ｋ１３７／Ａ；Ｄ１４２Ｄ１４５／Ａ；Ｅ１４８Ａ；Ｒ１６１ＡまたはＥ１６６Ｅ１６８／Ａ。
電子顕微鏡法および免疫金標識
ＶＬＰまたはウィルスを１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）に希釈し、炭素被覆ホルムバールグリッド上に３分間吸収させた。グリッドを８ｍＬのＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）で３０秒間ブロックし、ＰＢＳで洗浄した。グリッドを室温で３０分間、ＰＢＳに１：１０希釈したウサギの抗６ＸＨタグ抗体（Amersham, Pittsburgh, PA, USA）を用いてインキュベートした。次にグリッドをＰＢＳで３回洗浄し、室温で３０分間、６ｎｍの金粒子に複合させたロバ抗ウサギ抗体（Jackson Immuno Research, West Baltimore Pike, West Grove, PA, USA）を用いてインキュベートし、ＰＢＳに１：２０で希釈した。次にグリッドを脱イオン水で洗浄し、上記のように染色した。
円偏光二色性分光法
ＣＤスペクトルを、Olis RSM 1000（Olis, Conway DriveSuites A & B, Bogart, GA, USA）高速スキャナーモノクロメータに２０℃で記録した。遠紫外線ＣＤ（２６０〜１９０ｎｍ）については、０．１ｃｍの路長の恒温石英セルを用いた、平均残基楕円率の値（［６］ｍＲｗ、度数×ｃｍｚ×ｄｍｏｌ）を、次の式：［６］ＭＲｗ＝［６］＊ＭＲＷ／（１０×ｃ×ｌ）、式中［６］は度数表示の楕円率、ＭＲＷはタンパク質の残基の平均分子量（この試験では１０８を用いた）、ｃはタンパク質濃度（ｇ／ｍｌ）、およびｌは路長（ｃｍ）、を用いて計算した(Johnson, W. C. (1996) Circular Dichroism Instrumentation in Circular Dichroism and the Conformational Analysis of Biomolecules (Fasman, G. D., ed) pp. 635-652, Kluwer Academic / Plenum Publishers)。
近紫外線ＣＤスペクトルは、ＲＴでJasco Model J-710機器(Jasco, Commerce Dr. Easton, MD, USA)で記録した（２５０〜３５０ｎｍ）。記録は、石英キュベット（路長０．１ｃｍ）を用いて行った。スペクトルは、１００ｎｍ／分の速度で０．２ｎｍステップの１０回のスキャンを平均した。ロッドおよびディスク試料はそれぞれ、濃度１．５ｍｇ／ｍｌおよび５．５ｍｇ／ｍｌであった。
ＲＮＡ転写物および電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
ＲＮＡプローブを、RiboMAXTM Large Scale RNA Production System-T7 kit（Promega P1300, Madison, WI, USA）およびＴ７プロモーターの前のＰａｐＭＶの５’末端の８０ｎｔのクローンを用いて、in vitroでの転写により作製した。クローンは、in vitroでの転写の前に、ＥｃｏＲＩで直線化した。ＲＮＡ転写物を、ＤＮＡ／ＲＮＡ精製用のG50 Quick Spin Column（Roche 1273 965）上で精製した。同じ方法を用いて、in vitro集合アッセイ用のＰａｐＭＶの５’の１８００ヌクレオチドの転写物を作製した。ＲＮＡプローブは、エビのアルカリ性ホスファターゼ（Fermentas, Hanover, MD, USA, EFO51）を用いて脱リン酸化し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（NEB, Ipswich, MA, USA, M0201 S）を用いてガンマ３２Ｐ−ＡＴＰで標識した。
次にプローブを、前と同様にG-50 Quick Spin Columnを用いて精製した。標識ＲＮＡを組換えタンパク質と共に室温で６０分間インキュベートした。各反応に１６５ｆｍｏｌのＲＮＡを用い、および７．５ＵのＲＮアーゼ阻害剤（Amersham Biosciences 27-0816O1）を含むin vitro集合緩衝液中の種々の量の精製組換えタンパク質を用いた。反応物の最終容量は１０μＬであった；２μＬの負荷染料（loading dye）を試料に加え、その後５％の天然ポリアクリルアミドゲルに負荷した。電気泳動は、０．５Ｘのトリス−ホウ酸ＥＤＴＡ緩衝液中で、９０分間１０ｍＡにて行った。ゲルを乾燥し、Kodak BioMax MSフィルム（Amersham Biosciences V8326886）上で１６時間オートラジオグラフィに供し、現像した。
ＰａｐＭＶの精製およびディスクの単離
ＰａｐＭＶは、モザイク症状を示す感染したパパイアの葉から、分画遠心分離により精製した。感染した葉（１００ｇ）を、市販のブレンダーで、１０ｍＭのＥＤＴＡを含有する５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００ｍＬ中に粉砕した。粉砕した葉を、チーズクロスでろ過し、１％のトリトンＸ−１００をろ液に加え、このろ液を静かに１０分間撹拌した。クロロホルムを１滴ずつ、ろ液容量の１／４に等しい容量まで加えた。この溶液をさらに３０分、４℃で撹拌し、２０分間１００００ｇで遠心分離して、沈殿物を除去した。上清を１２０分間高速（１００ ０００ｇ）遠心分離にかけた。ウィルスペレットを懸濁させ、これをさらに、スクロースクッション（３０％スクロース）を通して１００ ０００ｇで３．５時間、高速遠心分離にかけた。最終ウィルスペレットを、１０ｍＬの５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）に懸濁させた。色が残る場合は、クロロホルムによる追加の浄化を行った。精製ウィルスを超遠心分離により収集した。酢酸分解法によるディスクの単離を、前に記載のようにして行った(Erickson, et al.,1976, Virology. 72, 514-7）。
トリプシン消化
１０μｇのタンパク質を、０．２μｇのトリプシン（Roche, Indianapolis, IN, USA, 1418475）を含む、１００ｍＭのトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）５０μｌを用いて、３７℃で１２０分間、インキュベートした。反応を、５％のＳＤＳ、５ｍＭのＤＴＴおよび４０％のグリセロールを含有する１０μＬの負荷染料を添加して停止させた。試料を５分間沸騰させ、ついでＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷した。タンパク質は、クーマシーブルー染色により視覚化した。
結果
ＰａｐＭＶ ＣＰは、２つのＭ残基をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の１および６位に含む。これらの開始コドンの両方がウィルス複製の間に用いられるかどうかは、明らかではない。しかし、精製ウィルスの大部分が、Ｎ末端において数個のアミノ酸を欠いていることが示された（Zhang, et al., 1993, J. Mol. Biol. 234, 885-7）。大腸菌で１つのみのオープンリーディングフレームの産生を確実にするために、Ｎ末端の５つのアミノ酸を除去して、Ｍ６が開始コドンとして機能するようにした。ＮｃｏＩ部位への開始コドンの導入は、全てのコンストラクトにおいて見出される追加のＡ（extra A）の導入をもたらした。６ＸＨタグをタンパク質のＣ末端に付加して、精製過程を促進した。組換えタンパク質ＣＰΔＮ５を、大腸菌ＢＬ２１（ｐＬｙｓＳ）に発現させ、これは、精製ウィルスから抽出したＷＴ ＣＰよりわずかに大きな分子量（ＭＷ）を示した。２つのタンパク質間に観察される差は、おそらくＣ末端に融合した６ＸＨタグにより引き起こされたものである。組換えタンパク質を、Ｎｉ２＋カラムを用いて親和性精製し、１Ｍのイミダゾールを用いて溶出した。精製した組換えタンパク質の産量は、４０〜５０ｍｇ／Ｌと推定された。ＷＴ ＰａｐＭＶ ＣＰに対して生成された抗体を用いたウェスターンブロットアッセイにより、精製されたタンパク質は確かにＰａｐＭＶ ＣＰであることが確認された。
１、２または３個のＡ置換を含む、９種の異なる変異体を産生した。５種の変異体Ｒ１１８−Ｄ１２０−Ｋ１２１／Ａ、Ｋ１３３−Ｋ１３７／Ａ、Ｄ１４２−Ｄ１４５／Ａ、Ｒ１６１ＡおよびＥ１６６−Ｅ１６７−Ｒ１６８／Ａは、不安定なタンパク質を産生し、これらは検出不能または非常に低レベルで発現された。この保存領域での変異誘発は、ＣＰの天然の折りたたみに影響すると推定される。変異体Ｋ９７Ａ、Ｒ１０４Ｋ１０５Ｒ１０８／Ａ、Ｅ１２８ＡおよびＥ１４８Ａは、ＣＰΔＮ５と同じレベルで発現することができ、ＣＰΔＮ５で示したように、６ｘＨタグを用いて容易に精製された。しかし、透析中のイミダゾールの除去は、変異体Ｒ１０４Ｋ１０５Ｒ１０８／ＡおよびＥ１４８Ａを凝集および沈殿させ、変異がタンパク質の折りたたみに影響したことが予想される。
コンストラクトＣＰΔＮ５は、精製組換えタンパク質の電子顕微鏡写真（図２Ｂ）により示されるように、大腸菌のＶＬＰに自己集合した。ＶＬＰは、天然ウィルス粒子と形状および直径が類似していた（図２Ａおよび２Ｂを比較のこと）。ＶＬＰとして見出された精製タンパク質の割合を解析して定量化するために、ＶＬＰおよび小さな凝集物を、１００，０００ｇでの２時間の超遠心分離により分離した。ＣＰΔＮ５タンパク質のほとんど（８０％）は、上清中に見出された。ＶＬＰはペレット中に見出され、全精製組換えタンパク質の２０％を占めた。しかし、精製タンパク質Ｋ９７Ａは、超遠心分離後に上清中に残留した。反対に、組換えタンパク質Ｅ１２８Ａは全て、超遠心分離後にペレット中に見出された。
電子顕微鏡法は、高速ペレットから単離されたＥ１２８Ａ ＶＬＰがＷＴウィルス（図２Ｃ）と類似していることを示した。各ＣＰΔＮ５およびＥ１２８Ａに対する１５０個のＶＬＰの長さを測定し、平均長を決定した（図２Ｆ）。予想されたように、ＣＰΔＮ５ ＶＬＰは、長さが５００ｎｍの天然ウィルスより１０倍短い（５０ｎｍ）ように見える。しかし、Ｅ１２８Ａ ＶＬＰは、ＣＰΔＮ５ ＶＬＰより約３倍長く（図２Ｃおよび２Ｆ）、この変異体は、集合の開始および延長をより効率的に支持できることを示唆する。最後に、精製Ｋ９７Ａタンパク質の電子顕微鏡写真は、直径が１５〜５０ｎｍの無秩序な凝集体を示した（図２Ｄ）。この凝集体の外形は不規則で、このタンパク質がそれ自体でＶＬＰに集合できないことを示した。
Ｎｉ２＋カラムを用いたＶＬＰの精製は効率的であり、６ＸＨタグが表面上に存在し、親和性カラムとの相互反応に利用可能であることを示唆する。この仮設を確認するために、免疫金標識実験を、抗６ＸＨｉｓタグウサギ抗血清と、次に金粒子で標識されたに二次ロバ抗ウサギを用いて、ＣＰΔＮ５ ＶＬＰで実施した。予想されたように、ＶＬＰは金粒子で修飾され（図２Ｅ）、したがってペプチド（６ＸＨ）のＣ末端への融合が耐容され、これがＶＬＰの表面の露出されていることを実証した。Ｃ末端融合ペプチドのこの表面露出は、免疫原が結合する適切な点としての、Ｃ末端の好適性を実証する。
円偏光二色性（ＣＤ）分光法を用いて、組換えタンパク質とＷＴウィルスの二次構造を比較した。ＣＰΔＮ５の二次構造は、４９％がαヘリックスで、１５％がランダムコイルであると推定された。ＣＰΔＮ５ ＶＬＰとＷＴウィルスのＣＤスペクトルは、わずかに異なるプロファイルを示した（図３Ａ）。２０８ｎｍで測定されたＣＤシグナルは、ＣＰΔＮ５ ＶＬＰよりＷＴウィルスについてより顕著であった（図３Ａ）。興味深いことには、Ｅ１２８Ａ ＶＬＰで２０８ｎｍにて測定されたＣＤシグナルは、ＷＴウィルスと重なった（図３Ａ）。
ＣＰΔＮ５の単離されたディスク（精製タンパク質の高速上清）のＣＤシグナルは、酢酸法を用いて精製ウィルスから単離されたディスクと同一であった（図３Ｂ）。一般に２０８ｎｍにおいてディスクで測定されたＣＤシグナルは、ＶＬＰで測定されたものより顕著ではないことは、興味深い。この結果は、αヘリックスにおける含量が、ディスクがＶＬＰ内に集合した場合に増加することを示唆する。最後に、Ｋ９７Ａの精製タンパク質の折りたたみを、ＣＰΔＮ５の高速上清と比較した。両方のタンパク質は、同一のＣＤプロファイルを示した（図３Ｅ）。
２５０〜３５０ｎｍの間のスペクトルを得て、タンパク質中の芳香族残基およびトリプトファン残基の吸収を測定した。これら残基の環境の変化は、記録されたシグナルに影響し、三次構造における変化を示した。ＣＰΔＮ５およびＥ１２８ＡのＶＬＰは似ているようであり（図３Ｄ）、両方のＶＬＰの三次構造が同一であることを示唆する。ＣＰΔＮ５ディスクおよびＫ９７Ａのスペクトルは非常に似ており、これは、両方のタンパク質が類似の三次構造を有することを示唆する（図３Ｅ）。試料間の曲線の強度におけるわずかな違いは、おそらく、タンパク質濃度の小さな変化によるものである。
精製組換えＣＰΔＮ５の８０％および全てのＫ９７Ａタンパク質は、多量体（ディスク）として超遠心分離後の上清に見出された。これらのタンパク質の多量体化のレベルを測定するために、ＣＰΔＮ５および精製タンパク質Ｋ９７Ａの高速上清を、SuperdexTM200を用いて解析した。ＣＰΔＮ５については、ほとんどのタンパク質が４５０ｋＤａの高分子量複合体として溶出し（図４Ａ）、これは、約２０サブユニットの多量体に対応する（タンパク質サブユニットの分子量は２３ｋＤａ）。８１．２７ｍｌで溶出した二次ピークを収集し、SuperdexTM75カラムに負荷して、解像度を改善した。タンパク質は、３９ｋＤａタンパク質として溶出した。このピークからの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけると、ユニークなバンド、すなわち、ＣＰΔＮ５の分解産物に対応する、ＣＰΔＮ５より小さいバンドを示した。この分解タンパク質は、高い分子量の複合体を形成することができず、溶液中で二量体として残る可能性がある。
Ｋ９７Ａの溶出プロファイルを、３つの主要ピークに分けることが出来る（図４Ｂ）。第２ピークは５０ｍｌで溶出され、ＣＰΔＮ５ディスクと重なり（図４Ａ）、これはおそらくディスク構造に対応する。第１ピークは４１〜４３ｍｌで溶出し、７００ｋＤａより大きな寸法の凝集物質に対応する。溶出パターンは幅広く、ショルダーを示し、この物質が均一ではなく、非特異的相互作用により一緒に凝集されたＫ９７Ａディスクの凝集体に対応する可能性がある。第３ピークはさらに解析しなかったが、おそらく、ＣＰΔＮ５コンストラクトについて示したような切断タンパク質に対応する。これらの結果は、Ｋ９７Ａが他のタンパク質サブユニットとディスクを形成することができるが、しかし大腸菌のＶＬＰ内に集合できないことを確認する。
ＣＰΔＮ５ディスクを、精製タンパク質の高速上清から、親和性クロマトグラフィにより単離して、in vitro集合アッセイに用いた。直径１７ｎｍのディスクをゲルろ過により単離した。１ｍｇ／ｍｌの濃度のＣＰΔＮ５ディスク５０ｍｌを、０．０５ｍｇのＲＮＡを用いて室温で３０分間インキュベートした。電子顕微鏡法により、ＲＮＡおよびタンパク質が、in vitro集合アッセイに用いたＲＮＡ（ＰａｐＭＶの５’の１８００ｎｔ）の長さに対応する通常長さ（１５０ｎｍ）のＶＬＰ内に集合したことが実証された。この結果は、約２０サブユニットのディスクが、in vitroでのＶＬＰの構成単位であることを明白に実証する。精製Ｋ９７Ａ組換えタンパク質は、これらの条件下でＲＮＡをＶＬＰ内に集合させられなかった。
Ｋ９７ＡおよびＥ１２８Ａ変異は、ＰａｐＭＶ ＣＰに対して正反対の効果を示した。ＣＰΔＮ５およびＥ１２８Ａ ＶＬＰがＲＮＡを含むかどうかを評価するために、２８０／２６０比の異なるＶＬＰを、分光光度計で測定し、精製ウィルスのタンパク質と比較した（表５）。予想通り、ＶＬＰは、その低いＲＮＡレベルのためにディスクより小さい２８０／２６０比を示した。Ｅ１２８Ａ ＶＬＰの２８０／２６０比は、精製ウィルスと同等であった。興味深いことには、この比率はＣＰΔＮ５ ＶＬＰで５０％高かった。ＣＰΔＮ５とＫ９７Ａの単離ディスクの２８０／２６０比は、精製ウィルスの酢酸により抽出されたディスクと同等であった。
表５：ＰａｐＭＶ ＶＬＰに対するＯＤ２８０／２６０
ＶＬＰを産生する能力が、ＣＰのＲＮＡへの親和性に直接関連するかどうかを評価するために、ＣＰΔＮ５およびＥ１２８Ａ変異体からディスクを単離してＫ９７Ａと比較した。ＣＰΔＮ５の高速上清を、４５０ｋＤａの多量体（ディスク）の単離に用いた。Ｅ１２８Ａ変異体は大腸菌においてＶＬＰのみを産生するため、これらを酢酸処理を用いて分裂させ、Ｅ１２８Ａディスクを単離した（Abouhaidar & Bancroft, 1978, Virology. 90, 54-9）。異なる量のディスクを、ＰａｐＭＶの５’非コード領域の８０個のヌクレオチドの転写体からの１６５ｆｍｏｌの３２Ｐ標識ＲＮＡプローブを含有する、１０μｌの容量内でインキュベートした。タンパク質−ＲＮＡ複合体を、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）により分離した。ＣＰΔＮ５のディスクはプローブと競合的に相互反応し、５００ｎｇ（２２ｐｍｏｌ）のタンパク質のシフトを誘発した。
この結果は、単離後にＲＮＡを有さないＣＰΔＮ５ディスクが、ＲＮＡについての弱い親和性に対応するモル比１，０００（ディスク／ＲＮＡ）を達成した時にのみ、in vitroでＲＮＡと反応可能であることを示す。同様の実験を変異体Ｅ１２８Ａの単離ディスクおよび同じプローブを用いて行った場合、Ｅ１２８ＡディスクはＣＰΔＮ５よりも効率的にＲＮＡに結合した。タンパク質ＲＮＡ複合体を作製するのに、５０ｎｇという少量のタンパク質で十分であった。同一条件で精製されたＫ９７Ａは、さらに高い濃度（１５００ｎｇまで）でも、タンパク質ＲＮＡ複合体の形成を誘発できなかった。ＥＭＳＡを、上記のように標識したＣＰΔＮ５ ＶＬＰから抽出したＲＮＡを用いて繰り返し、ＰａｐＭＶパッケージングシグナルを含まないＲＮＡで得たのと同じ結果を得た。
ＶＬＰの安定性を評価し、ディスクのロッド構造への集合が複合体の安定性を改善するかどうかを決定するために、これらの熱への抵抗性を、ＣＤ分光分析法によりモニタリングした。ＣＰΔＮ５ ＶＬＰおよびウィルスの両方とも、疲労の兆候を見せる前に、高温（６０℃を超える温度）に抵抗性であった（図５）。精製されたＰａｐＭＶは試験した中で最も安定な構造であり、１００℃に近い温度に抵抗可能であった。ＰａｐＭＶについて報告された不活性化の温度は７０℃であった。ＣＰΔＮ５ ＶＬＰはＷＴウィルスよりも感受性が高く、これはおそらく、Ｃ末端に位置する６ｘＨｉｓタグの存在によるものである。Ｅ２１８ ＶＬＰは、熱に対してより感受性であり、４２℃で疲労の兆候を示した（図５Ａ）。ディスクは４２℃で迅速に変性した（図５Ｂ）。この結果は、ロッド構造へのディスクのパッキングは、安定性をかなり改善することを示唆する。
トリプシンによるＰａｐＭＶの処理は、おそらくＣ末端のアミノ酸１９８において切断をもたらす。これらの条件下で、残りのタンパク質はプロテアーゼ抵抗性であった。同様のアッセイを精製ウィルス粒子、組換えＶＬＰおよびディスクに対して行い、ＰａｐＭＶがトリプシンにより影響されなかったようであることを示した。電子顕微鏡法により、処理されたウィルスは、未処理ウィルスと外観は同一であるが、しかしＣＰΔＮ５およびＣＰΔＮ５ ＶＬＰからの単離ディスク両方ともが、トリプシンに対して非常に感受性が高く、分解断片に対応する低い分子量の数個のバンドが生成され、これは、ＶＬＰの表面にいくつかの正に荷電された残基が露出されていて利用可能であることを示唆する。Ｅ１２８Ａは、トリプシンに対しＷＴウィルスと類似の抵抗性を示した。
例ＩＩ：ＰａｐＭＶ ｇｐ１００およびＰａｐＭＶ Ｆｌｕ ＶＬＰの産生および操作
ＰａｐＭＶ ＣＰ遺伝子のクローニング
ＣＰΔＮ５ ＰａｐＭＶ外被タンパク質（ＣＰ）遺伝子を以下の例に用いて、Tremblay, M-H., et al., 2006, FEBS J., 273:14-25の記載のようにして調製した。簡潔に述べると、ＣＰ遺伝子をＲＴ−ＰＣＲにより、単離されたウィルスＲＮＡから、次のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。
ＰＣＲ産物を、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ベクターｐＥＴ−３ｄに挿入して、Ｎ末端の５個のアミノ酸がＷＴ配列から除去されている、ＣＰΔＮ５ ＰａｐＭＶ ＶＬＰクローンを産生した。ＰａｐＭＶ ＶＬＰは、組換えタンパク質の２位においてアラニンの挿入を含む。ＣＰΔＮ５ ＰａｐＭＶ ＶＬＰクローンのアミノ酸配列を、図１Ｃに示す［配列番号３］。
ＰａｐＭＶ ｇｐ１００およびＰａｐＭＶ Ｆｌｕ コンストラクトのクローニングおよび操作
明確に規定されている腫瘍抗原ｇｐ１００（IMDQVPFSV；配列番号５１）およびインフルエンザＭ１タンパク質（GILGFVFTL；配列番号５２）からの９マーのＨＬＡ−Ａ＊０２０１エピトープを選択した。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１エピトープを、Ｎ末端およびＣ末端側にそれぞれの天然配列から５残基で隣接させて、プロテアソームによる天然のプロセッシングを有利にした（図６Ａ参照）。
ＰａｐＭＶ ｇｐ１００コンストラクトを産生するために、次のオリゴヌクレオチドを用いた：
これら２つのオリゴヌクレオチドをアニールし、同じ酵素で直線化されたＣＰΔＮ５ ＰａｐＭＶ ＣＰクローンのＳｐｅＩおよびＭｌｕＩ部位にクローニングした。
ＰａｐＭＶ ＦＬＵコンストラクトを産生するために、次のオリゴヌクレオチドを用いた：
ｇｐ１００コンストラクトについて上述したようにして、これら２つのオリゴヌクレオチドをアニールし、ＣＰΔＮ５ ＰａｐＭＶ ＣＰのＣ末端においてクローニングした。
得られたＰａｐＭＶ ｇｐ１００コンストラクトおよびＰａｐＭＶ ＦＬＵコンストラクトは、そのＣ末端においてそれぞれのペプチドが、続いて６ｘＨタグが、精製プロセスの容易化のために融合したＰａｐＭＶ ＣＰ遺伝子からなる。ＰａｐＭＶクローンの配列は、ＤＮＡ配列決定により確認した。
大腸菌におけるＰａｐＭＶ、ＰａｐＭＶ ＦＬＵ、ＰａｐＭＶ ｇｐ１００の発現
大腸菌発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ（Stratagene, La Jolla, CA）を、上記コンストラクトの１つを含有するプラスミドｐＥＴ−３ｄで形質転換し、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）含有の２ｘＹＴ培地中に維持した。細菌細胞を３７℃で６００ｎｍでの光学密度０．６まで増殖させ、タンパク質発現を１ｍｍのイソプロピル−ｂ−ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発した。誘発は、２５℃で１６時間持続させた。細菌を６００ｒｐｍで１５分間遠心分離して収穫した。ペレットを氷冷の溶解緩衝液（lysis buffer）（５０ｍｍのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０、３００ｍｍのＮａＣｌ、１０ｍｍのイミダゾール、２０μｍのフッ化フェニルメタンスルホニル、１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（lysosyme））中に再懸濁させ、細菌を加圧型細胞破壊装置（French press）を１回通過させて溶解した。溶解産物を１３ ０００ｒｐｍで３０分間、２回遠心分離して、細胞残屑を除去した。
上清を、４℃で４時間ゆっくり撹拌しつつ、１ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ（Qiagen, Valencia, CA）でインキュベートした。溶解産物をカラムに負荷し、ビーズを、増加濃度のイミダゾール（１０ｍｍ、２０ｍｍおよび５０ｍｍ）を含有する３×１５ｍＬの洗浄緩衝液（５０ｍｍのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０、３００ｍｍのＮａＣｌ）で洗浄した。次にビーズを１５ｍＬの加工緩衝液（working buffer）（１０ｍｍのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８または１０ｍｍのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２）で洗浄した。２回の洗浄ステップを行って、ＬＰＳ不純物を除去した：１回は１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのイミダゾール、０．５％のトリトンＸ１００、ｐＨ８；他の１回は１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのイミダゾール、１％の両性洗浄剤、ｐＨ８。タンパク質を、１Ｍのイミダゾールを含有する加工緩衝液中に溶出した。溶出したタンパク質を、Beckman 50.2 TIローターの高速超遠心分離（１００ ０００ｇ）に１２０分間かけた。ＶＬＰペレットをエンドトキシン非含有ＰＢＸ（Sigma）中に再懸濁させた。最後に、タンパク質溶液を０．４５ｕＭフィルタを用いてろ過した。タンパク質濃度をＢＣＡタンパク質キット（Pierce）で評価した。精製タンパク質のＬＰＳレベルを、リムルス試験により製造業者（Cambrex）の指示書に従って評価し、０．００５エンドトキシン単位（ＥＵ）／タンパク質１μｇ未満であった。この操作により、１リットルの細胞培養物当たり２０ｍｇを超える精製ＶＬＰが産出された。
電子顕微鏡法およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ
タンパク質をＰＢＣに希釈し、炭素被覆ホルムバールグリッド上に３分間吸収させた。このグリッドを脱イオン水で２回洗浄し、０．１％の酢酸ウラニルで室温で１０分間染色した。グリッドを次にJeol JEM220FS透過電子顕微鏡で観察した。１００個のＶＬＰの平均長をAdobe Photoshopソフトウェアを用いて評価した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を、Bio-Rad（Hercules, CA）からのミニプロテアン（mini-protean）システムを用いて、当分野で記載されているように（Lepage and Lapointe, 2006, Cancer Res. 66:2423-2432）実施した。タンパク質をクーマシーブルー染色（Bio-Rad）により評価した。いくつかの実験においては、プロテアーゼＫ（Invitrogen）を最終濃度１３μｇ／ｍｌで添加した。
結果
大腸菌の異なるＰａｐＭＶ ＶＬＰの電子顕微鏡解析（図６Ｂ）は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰについては、典型的な長いロッド形構造で、長さが８０〜２００ｎｍおよび直径が１５ｎｍのものが、および操作ＰａｐＭＶ ｇｐ１００およびＦＬＵ ＶＬＰについては同じく直径１６ｎｍのものが明らかとなった。ＰａｐＭＶ ＣＰは、ＰａｐＭＶ ＶＬＰと類似の大きさおよび形状である大腸菌のＶＬＰ内に、自発的に集合することができた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を、新鮮な７月齢のＶＬＰ調製物について、ＰＢＳ中４℃で実施した（図７）。ゲルには分解の証拠は検出されなかった。さらに、調製物を追加の７日間室温または３７℃でインキュベートしたが、検知できる分解はなかった。最後に、ＰａｐＭＶ調製物を分解の陽性対照としてプロテイナーゼＫと共にインキュベートし、その結果、操作ＰａｐＭＶ ＶＬＰの迅速な分解が生じた。融合ペプチドなしのＰａｐＭＶ ＶＬＰは、プロテイナーゼＫにより抵抗性であり、Ｃ末端での融合がおそらくこの領域を局所的に不安定化しており、この酵素への感受性を高めていることを示唆した。
例ＩＩＩ：ＰａｐＭＶ ＶＬＰに発現されたｇｐ１００およびインフルエンザＭ１エピトープのin vitroプロセッシングおよび交差提示
ペプチド
ｇｐ１００およびＦｌｕペプチドを、GLBiochem Shangai LTDにより合成し、ＤＭＳＯ（Sigma）に再懸濁させた。
培地および細胞培養
Ｔリンパ球、樹状細胞（ＤＣ）、およびＣＤ４０活性化Ｂリンパ球（ＣＤ４０−Ｂ）の培養は、当分野に記載のようにして（Lapointe et al., 2003, Can. Res. 63:653-662）、７．５％ヒト血清（熱により不活性化、正常なドナーより調製）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（後者３つはinvitrogen and Wisentより）を補足した完全培地中（Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium; Invitrogen; Carlsbad, CA；and Wisent; St-Bruno, Quebec, Canada）で行った。
ＣＤ４０活性化Ｂ細胞の増幅および培養は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、当分野に記載のようにして（Lapointe et al., 2003, Can. Res. 63:653-662；Lepage and Lapointe, 2006, Cancer Res. 66:2423-2432）、５００ｎｇ／ｍｌの可溶性三量体ＣＤ４０Ｌ（Immunex Corporation; Seattle, WA）および５００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−４（Peprotech; Rocky Hill, NJ）を添加して行った。
ＤＣは、Sallusto et al., 1994, J. Exp. Med. 179:1109-1118に記載の元のプロトコルを変更して、正常ドナーからのアフェレーシス調製によりＰＢＭＣから収集した（Lapointe et al., 2000, Eur. J. Immunol. 30:3291-3298）。簡潔に述べると、ＰＢＭＣを、リンパ球分離培地（Wisent）上で遠心分離により血液から豊富化した。単核細胞を、組織培養フラスコまたはプレートに３７℃で２時間付着させた後に（Ｔ−２５中３×１０７細胞、１．５×１０７細胞／ウェルで６個のウェルの平底プレートにて、または５×１０６細胞／ウェルで２４個のウェルの平底プレートにて；全てCostar Corning, NYより）、豊富化した。付着細胞をＰＢＳ（Wisent）で１回洗浄し、次に、１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（１，０００Ｕ／ｍｌ）および５００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４（１，０００Ｕ／ｍｌ）（両者ともにPeprotech, Rocky Hill, NJから）を補足した完全培地中で培養した。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を、３日目および５日目に再度添加した。ＰａｐＭＶ ＶＬＰＳ（例ＩＩに記載のようにして調製）を６日目に加え、７日目に収穫して、認識および増幅実験を行った。
黒色腫細胞株１０８８ｍｅｌはSurgery Branch (NCI/NIH)で確立された。ＳＫ２３、Ｔ２および乳癌細胞株ＭＤＡ２３１は、American Type Culture Collection（ATCC；Manassas, VA）から入手した。全ての腫瘍細胞株は、１０％熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを補足したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。
ＰａｐＭＶパルスＡＰＣからの交差提示
異なる標的細胞を、ｇｐ１００−またはインフルエンザＭ１−特異的Ｔ細胞を有する規定されたエピトープのＭＨＣクラスＩ提示について解析した。Ｇｐ１００特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンは、米国国立癌研究所；ＮＩＨ、Bethesda, MDから提供されたものであり、２０９〜２１７位における天然のＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限エピトープ（ＩＴＤ ＱＶＰ ＦＳＶ；配列番号５３）および、２１０位におけるＭの改変型（ＩＭＤ ＱＶＰ ＦＳＶ；配列番号５１）の両方に特異的であり、これはペプチド／ＭＨＣ複合体の安定性を増強した。Ｇｐ１００特異的Ｔ細胞を、Dudley et al., 1999, J. Immunother, 22:288-298に記載の高速増幅プロトコルを用いて増幅した。
インフルエンザＭ１由来ＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限エピトープ（５９〜６７；ＧＩＬ ＧＦＶ ＦＴＬ；配列番号５２）に特異的なＴ細胞株を、次のようにして産生した。ＨＬＡ−Ａ＊０２正常ドナーからのＰＢＭＣを、特異的抗体（OneLambda, Canoga Park, CA）を用いてフローサイトメトリー(FACScalibur; BD Biosciences, Mississauga, ON)で同定した。上述のように調製したＰＢＭＣを、４８ウェルプレートの複数のウェル内で、上述の培地中の１μＭの合成ＦＬＵペプチドで刺激した。培養物を７日後に、ペプチドでパルスした（１μＭで３時間、続いてＰＢＳで３回洗浄）自己由来ＰＢＭＣか、またはＣＤ４０で刺激したＢリンパ球培養物のどちらかで、再度刺激した。次にインターロイキン（ＩＬ）−２（Chiron, Emeryville, CA）を２〜３日毎に、１５０ＩＵ／ｍｌで添加し、培養物を０．５〜２×１０６細胞／ｍｌに維持した。個々の培養物の特異性を、ＥＬＩＳＡおよび結合抗体（Endogen; Woburn, MA）によるインターフェロン（ＩＦＮ）−γ分泌アッセイにより、当分野に記載のようにして（Lapointe et al., 2001, J. Immunol. 167:4758-4764）、ペプチドパルスＴ２細胞との共培養後に評価した。
ＰａｐＭＶ ＣＰが媒介する交差提示を評価するために、ＣＤ４０活性化Ｂ細胞またはＤＣを、改変ＰａｐＭＶ ＣＰの種々の型で、１０〜５０μｇ／ｍｌで２０時間、パルスした。細胞を収穫し、ＰＢＳで２回洗浄し、９６ウェルプレートの完全培地（４〜１０×１０４細胞／ウェル）中に播種した。ｇｐ１００−またはインフルエンザＭ１−特異的Ｔ細胞を、完全倍地中に２〜１０×１０４細胞／ウェルで２０時間添加した。培養物上清を収穫し、インターフェロン（ＩＦＮ）−γをＥＬＩＳＡにより当分野の記載（Lepage and Lapointe, 2006, Cancer Res. 66:2423-2432）に従って評価した。いくつかの実験においては、ＡＰＣを、５０〜７０μＭのクロロキン（Sigma）、または２０〜２５μｇ／ｍｌのラクタシスチンまたは１．３〜３．３μＭのＭＧ−１３２（これら後者２つはCalbiochem, San Diego, CAより）で、１時間前処理した。細胞をＰＢＳで洗浄し、元の阻害剤濃度の１/２０を含有する培地中に再懸濁させた。処理した細胞は異なるＰａｐＭＶ変異体でパルスし、ＭＨＣクラスＩ媒介性提示の解析を、上記のようにして実施した。
Ｔ細胞増幅
ＣＤ４０活性化Ｂ細胞またはＤＣを、ＰａｐＭＶ ＣＰの種々の型で（上の例ＩＩに記載のようにして）２０時間パルスした。細胞を収穫し、ＰＢＳで２回洗浄した。パルスＡＰＣ（２〜５×１０５）を、自己由来のＰＢＭＣと共に、５００μｌの完全培地中２×１０６細胞にて４８ウェルプレートの単一ウェル内で共培養した。培地が黄色に変化したら、２００μｌの培地を取り除き、４００μｌの新鮮な完全培地を加えた。７日〜１０日目に、新鮮なＰａｐＭＶパルスＡＰＣ（５×１０５；２０時間パルスし、ＰＢＳ中で２回洗浄）を個々の培養物に加えた。次にＩＬ−２を、１００ＩＵ／ｍｌで３日毎に加えた。
Ｔ細胞特異性を、次に、１５〜２０日目に評価した。簡潔に述べると、増幅細胞をペプチドでパルスしたＴ２細胞で、当分野に記載のようにして（Lapointe et al., 2001, J. Immunol. 167:4758-4764）、またはＰａｐＭＶでパルスしたＡＰＣを用いて、共培養した。次にＩＦＮ−γ分泌を、ＥＬＩＳＡおよび結合抗体（Endogen; Woburn, MA）により、当分野に記載のようにして（Lepage and Lapointe, 2006、同上）評価した。代替的に、抗原特異的Ｔ細胞の頻度を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、結合抗体（MABTECH）を用いて製造業者の指示に従って評価した。スポットは、自動カウンター（CTL Technologies, Cleveland, OH）で計数した。
結果
ＤＣは当分野において最適ＡＰＣとして定義され、本実験および当分野において、ＣＤ４０刺激後に増幅したＢリンパ球は、効率的なＡＰＣであることが実証された。これらのＡＰＣは、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ、ＰａｐＭＶ ｇｐ１００およびＰａｐＭＶ−Ｆｌｕでパルスし、ｇｐ１００およびインフルエンザＭ１タンパク質からのＭＨＣクラスＩエピトープに特異的な規定のＴ細胞と共培養した。図８Ａに示すように、ＰａｐＭＶ ｇｐ１００でパルスされたＡＰＣのみが、ｇｐ１００特異的Ｔ細胞クローンにより認識された。逆に、ＰａｐＭＶ ＦｌｕでパルスされたＡＰＣのみが、インフルエンザＭ１特異的Ｔ細胞により認識された（図８Ｂ）。各Ｔ細胞培養物の特異性を、ＣＤ４０活性化Ｂ細胞をそれぞれのエピトープに対応する合成ペプチドでパルスすることにより、確認した。また、ＰａｐＭＶ−Ｆｌｕの特異的Ｔ細胞への添加は、これらを刺激してＩＦＮ−γを分泌させることができず、ＡＰＣがペプチド認識に必須であることを示唆した。
ＨＬＡ−Ａ＊０２がペプチド提示に関与する制限要素であることを確認するため、同様の実験を、２つの追加のＨＬＡ−Ａ＊０２ドナー、およびこの対立遺伝子に対して陰性である他の２つから調製したＡＰＣを用いて実施した。図９Ａに示すように、ＦＬＵ特異的Ｔ細胞はほぼ、ＰａｐＭＶ−ＦｌｕでパルスしたＨＬＡ−Ａ＊０２ドナーに反応性であった（左の図）。ドナー＃３の弱い反応性は、ＦＬＵ Ｔ細胞株は不均一であり、他のＭＨＣクラスＩ対立遺伝子により提示される可能性のあるペプチドに特異的なＴ細胞もまた、培養物中に存在し得るとの事実により説明できる。さらに、ｇｐ１００特異的Ｔ細胞クローンは、ＰａｐＭＶ ｇｐ１００によりパルスされたＨＬＡ−Ａ＊０２＋ＡＰＣにのみ、反応性であり（図９Ａ；右の図）、関連する制限要素を発現するＡＰＣが抗原提示には必要であることを、さらに確認した。最後に、ＭＨＣクラスＩによる提示は、当分野で実施されたように（Lapointe et al., 2003, Can. Res. 63:2836-2843；Lapointe et al., 2001, J. Immunol. 167:4758-4764）、ＭＨＣクラスＩ、またはクラスＩＩまたはＨＬＡ−ＤＲ提示のいずれかをブロックする抗体を用いて制御された。
対照として、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１およびｇｐ１００の両方を発現する黒色腫株を、ｇｐ１００特異的Ｔ細胞クローンと共培養し、ＭＨＣクラスＩ提示をブロックする抗体のみが、予想通り認識を妨害した（図９Ｂ；右側）。ｇｐ１００特異的Ｔ細胞クローンの、ＨＬＡ−Ａ＊０２−／ｇｐ１００＋、または＋／−、または−／−のいずれかの株との共培養は、当分野で実証されているように、ＩＦＮ−γ分泌を誘発できなかった（Dudley et al., 1999, J. Immunother. 22:288-298; Lapointe et al., 2001、同上）。阻止抗体のパネルをＰａｐＭＶ ＦｌｕでパルスしたＡＰＣに適用した場合、抗ＭＨＣクラスＩのみが、特異的Ｔ細胞株による認識を低下させた（図９Ｂ、左側）。これらの最後のデータは、ＰａｐＭＶ−Ｆｌｕ由来のＦＬＵペプチドは、ＭＨＣクラスＩにより、特にＨＬＡ−Ａ＊０２により提示されることを実証する。
ＰａｐＭＶ ＶＬＰのプロセシングがプロテアソームにより媒介されるかどうかを決定するため、２つの異なるプロテアソーム阻害剤、すなわち、ラクタシスチンおよびＭＧ−１３２を用い、それらの活性を、黒色腫細胞によるｇｐ１００からのＨＬＡ−Ａ＊０２０１エピトープの、古典的ＭＨＣクラスＩ提示をブロックすることにより、制御した（図１０、右側）。ＰａｐＭＶ ＦｌｕでパルスしたＡＰＣを用いた場合、Ｍ１ペプチドの提示は、両方の阻害剤によって影響されなかった（図１０、左側）。エンドソームのｐＨを中性にするクロロキンによる前処理は、ＦＬＵエピトープの交差提示に弱い負の効果を有し、一方、同様の処理は予想通り、黒色腫細胞の典型的ＭＨＣクラスＩ提示を変化させなかった。全体として、これらのデータは、ＰａｐＭＶ ＶＬＰにより媒介されるＭＨＣクラスＩ交差提示は、プロテアソーム独立性であることを示唆する。
さらに評価したのは、ＰａｐＭＶ ＶＬＰでパルスしたＡＰＣが、ＰＢＭＣからの不均一なＴ細胞集団からの抗原特異的Ｔリンパ球を増幅する能力を有するかどうかである。ＤＣおよびＣＤ４０活性化Ｂリンパ球を、ＰａｐＭＶ ＶＬＰでパルスし、パルスされたＡＰＣを、上記のプロトコルに従って自己由来のＰＢＭＣと共培養した。特異的増幅Ｔ細胞の頻度を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより最初に評価した。図１１Ａに示すように、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１インフルエンザＭ１ペプチドに特異的な細胞を、ＰａｐＭＶ ＦｌｕでパルスしたＡＰＣをＰＢＭＣと用いて産生した。パルスなしＡＰＣ、またはＰａｐＭＶもしくはＰａｐＭＶ ｇｐ１００でパルスしたものは、予想通り、Ｆｌｕ特異的Ｔ細胞を産生できなかった。黒色腫を有さない健康な正常ドナーに対して予想されるように、ｇｐ１００特異的Ｔ細胞は産生されなかった。増幅されたＴ細胞は、次に、種々のパルスＡＰＣに対する活性について評価し、ＩＦＮ−γ分泌は、ＦＬＵペプチドまたはＰａｐＭＶ ＦｌｕでパルスしたＡＰＣで増幅したＴ細胞を用いた場合に、高いようであった（＞５０００；図１１Ｂ）。ＰａｐＭＶ、ＰａｐＭＶ ｇｐ１００またはＰａｐＭＶ ＦｌｕのいずれかでパルスしたＡＰＣは、ＰａｐＭＶ ＣＰに特異的なＴ細胞を産生できず、ＰａｐＭＶ ＣＰへの細胞の前免疫性は不十分であることを示唆した。最後に、増幅Ｔ細胞を、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１インフルエンザＭ１ペプチドの異なる量でパルスしたＴ２細胞と共培養した（図１２）。２つの独立した実験において、高いアビディティを有する高度に反応性のＴ細胞が産生されたが、これはＴ細胞が、０．１および０．０１ｎＭのペプチドでパルスしたＴ２細胞を認識する能力を有したためである。分泌はほぼ＞１００ ０００ｐｇ／ｍｌであり、これは非常に高く、インフルエンザＭ１ペプチドでパルスされたＡＰＣと増殖されたＴ細胞は、一般にアビディティがより低かった。これらの実験から、ＰａｐＭＶでパルスされたＡＰＣは、高いアビディティの特異的Ｔ細胞を増幅する能力を有すると結論される。興味深いことには、ＰａｐＭＶ ＣＰに対して細胞の前免疫性が存在しているとの証拠はない。
例ＩＶ：ＰａｐＭＶＣＰ−Ｅ２およびＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５−Ｅ２の産生および操作
この例は、ＰａｐＭＶ外被タンパク質の多量体化が、ＰａｐＭＶ ＶＬＰの免疫原性に対して必須であることを実証する。
ＰａｐＭＶ外被タンパク質のクローニングおよび操作
ＰａｐＭＶ ＣＰ遺伝子を例ＩＶに記載のようにしてクローニングした。ＰａｐＭＶＣＰ−Ｅ２コンストラクトを産生するために、次のオリゴヌクレオチドを用いた：
これら２つのオリゴヌクレオチドを一緒にアニールし、ＳｐｅＩおよびＭｌｕＩで消化し、次にＳｐｅＩ／ＭｕＩ直線化ＰａｐＭＶＣＰクローンに連結（ligation）した。
切断外被タンパク質Ｅ２融合のための発現ベクター、ＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５−Ｅ２を、ＰａｐＭＶＣＰ−Ｅ２プラスミドから、ＰａｐＭＶ ＣＰの最初の２６個のアミノ酸を削除するよう設計された次の２つのオリゴヌクレオチド（ＮｃｏＩ制限部位を含む）を初めに調製することにより構成し、これをＰＣＲに用いた：
ＰＣＲ産物を次に自己連結した（self-ligated）。ＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５の発現ベクターを、ＰａｐＭＶＣＰプラスミドから、ＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５−Ｅ２クローンの構成と同じ操作により得た。全ＰａｐＭＶクローンの配列は、ＤＮＡ配列決定により確認した。
ＰａｐＭＶＣＰ−Ｅ２およびＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５−Ｅ２の発現および精製
ＰａｐＭＶＣＰコンストラクトの発現および精製を、例ＩＶに記載のようにして行った。Ｅ２ペプチドはGLBiochem Shangai LTDにより合成され、エンドトキシン非含有ＰＢＳ（Sigma）に再懸濁させた。タンパク質溶液を０．４５μＭフィルタを用いて使用前にろ過した。タンパク質の量をＢＣＡタンパク質キット（Pierce）を用いて評価した。精製タンパク質のＬＰＳのレベルを、リムルス試験により製造業者の指示書に従って（Cambrex）評価し、これは０．００５エンドトキシン単位（ＥＵ）／タンパク質１μｇ未満であった。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、エレクトロブロッティングおよび電子顕微鏡法
ＳＤＳ−ＰＡＧＥとエレクトロブロッティングは、前の例に記載のようにして実施した。タンパク質をＰＢＳに希釈し、炭素被覆ホルムバールグリッド上で３分間吸収させた。グリッドを脱イオン水で２回洗浄し、０．１％酢酸ウラシルで１０分間、室温で染色した。次にグリッドをJeol220FS透過電子顕微鏡で観察した。平均ＶＬＰ長は、１００個のＶＬＰをAdobe Photoshopソフトウェアを用いて測定して評価した。
免疫化
４〜８月齢のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス（Charles Rivers Laoratories）に、２５μｇのＰａｐＭＶＣＰ−Ｅ２、ＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５−Ｅ２または当量のＥ２ペプチド（２μｇ）またはエンドトキシン非含有ＰＢＳ（Sigma）を皮下注射した。最初の免疫化に続いて、１回のブースター用量を２週間後に与えた。血液試料を異なる時点で得て、分析まで−２０℃で保存した。全ての実験プロトコルは、Laval大学動物保護委員会から承認を得た。
ＥＬＩＳＡ定量化
Costar High Binding９６ウェルプレート（Corning, NY, USA）を、一晩４℃にて、Ｐ３、Ｐ３Ｅ２、ＰａｐＭＶＣＰ、ＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５、またはＰａｐＭＶＣＰＥ２を０．１ＭのＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ９．６）に１μｇ／ｍｌの濃度まで希釈したもので１００〜２００μｌ／ウェルで被覆した。プレートを、ＰＢＳ／０．１％Tween-20／２％ＢＳＡ（１５０μｌ／ウェル）で３７℃で１時間ブロックした。ＰＢＳ／０．１％Tween-20で３回洗浄後、血清を、１：５０から開始した２倍連続希釈に加え、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを３回洗浄し、１００μｌのペルオキシダーゼ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ（すべてJackson Immunoresearchから）、ＩｇＧ３（Rockland）を、ＰＢＳ／０．１％Tween-20／２％ＢＳＡ中に１／１００，０００希釈で用いて３７℃で１時間インキュベートした。３回の洗浄後、ＩｇＧの存在を、１００μｌのＴＭＢ−Ｓで製造業者の指示に従って検出した；反応は、１００μｌの０．１８ｍＭのＨ２ＳＯ４を加えて停止させ、ＯＤを４５０ｎｍで読み取った。結果は抗体の終点力価（endpoint titer）で表し、これは、ＯＤ値が、ＰＢＳマウスからの血清の１：５０希釈により得た背景値の３倍となった時に決定した。
ヒト血清中の抗体レベルの決定のために同じ条件を適用したが、ただしペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ヒトＩｇＧを二次抗体として１／８００００の希釈で用いた。ＨＣＶ感染患者からの血清は、B. Willems（Hospital Saint Luc. CHUM）から提供された：結果は抗体の終点力価で表し、これは、ＯＤ値が、１５人の非感染患者からの血清のプールから１：２５希釈で得た背景値の３倍となった時に決定した。
脾細胞再刺激
ＣＤ−１マウス（２２週齢）をＰａｐＭＶＣＰ−Ｅ２（２５μｇ）で、０、１５、３０および４５日目に免疫化し、６５日目に殺処分にした。脾臓を摘出し、ＤＭＥＭ（２×１０５細胞／ウェル）に懸濁させた。赤血球を高張塩化アンモニウム溶液で除去した。脾細胞を洗浄し、２００μｌのＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭに、１０％ＦＢＳ［HyClone］、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および５０μＭのβ−メルカプトエタノールを補足したもの）に再懸濁させて、９６ウェルの平底マイクロプレート（Coster）に２．５×１０５細胞／ｍｌの濃度になるようにした。試料を、２５μｇ／ｍｌのＰａｐＭＶＣＰまたはＰａｐＭＶＣＰ−Ｅ２ ＶＬＰで４日間インキュベートした。コンカバリンＡ（concavalin A）（ＣｏｎＡ−１０μｇ／ｍｌ）およびＰＢＳを、陽性および陰性対照として用いた。細胞培養物上清を収集し、サイトカインをliquid mouse 10 cytokines kit（Qiagen）を用いて測定した。
マウスの空気嚢
１０〜１２週齢のＣＤ−１マウス（Charles River Laboratories）に空気嚢を生成した。空気嚢を、３ｍｌの無菌の空気を０および３日目に皮下注射することにより、背中に生成した。７日目に、１ｍｌの組換えＰａｐＭＶＣＰ（１〜１０μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）またはＰＢＳを空気嚢に注入した。この処置の６時間後、マウスをＣＯ２を用いて窒息死させた。空気嚢を１ｍｌのＰＢＳ−５ｍＭのＥＤＴＡで１回洗浄し、次に２ｍｌのＰＢＳ−５ｍＭのＥＤＴＡで２回洗浄し、滲出物を室温で５００×ｇで５分間遠心分離した。細胞を、酢酸ブルー染色後に血球計数器で計数した。
ＡＰＣでの骨髄細胞抽出および分化
骨髄前駆体細胞を、ＢＡＬＢ／ｃマウスの大腿骨から得て、樹状細胞分化骨髄培地（９５％ＲＰＭＩおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンに、５％のＸ６３−ＧＭ−ＣＳＦ上清培地培養物を補足したもの；Ｘ６３−ＧＭ２４７ ＣＳＦ細胞株は、B. Ludewig, Research Department, Kantonal Hospital St. Gallen, Switzerlandから提供された）中で６日間培養した。培地の一部を２および４日目に入れ替えた。６日目に、培地をＬＸ６３条件培地を含まない培地に置き換えた。７日目、ＡＰＣの濃縮を、ＦＩＴＣ抗ＣＤ１１ｃおよびＰＥ−Ｃｙ５．５抗ＣＤ１１ｂ表面マーカー（BD Biosciences）を用いたフローサイトメトリにより確認した。調製物は２５％のＣＤ１１ｃ＋Ｃｄ１１ｂ＋細胞および８０％を超えるＣＤ１１ｂ＋細胞を含んでいた。この調製物は、本明細書においてＡＰＣと呼ぶ。
フローサイトメトリ
ＰａｐＭＶＣＰ−Ｅ２またはＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５−Ｅ２のＡＰＣ内の内在化を評価するため、１００万個の骨髄由来のＡＰＣを、２５μｇのＰａｐＭＶＥ２またはＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５−Ｅ２のどちらかと、３７℃で２時間インキュベートした。簡潔に述べると、細胞を、ＰＢＳ１０％；ＦＢＳおよび抗ＣＤ１６／ＣＤ３２（１μｇ／細胞百万個）で、４℃で１５分間ブロックした。ＰＢＳで２回洗浄後、細胞をＰＢＳ／２％パラホルムアルデヒドで室温で１０分間固定した。浸透性緩衝液（ＰＢＳ１０％；ＦＢＳ０．２％；トリトンＸ−１００）で２回洗浄後、細胞を、浸透性緩衝液に１／２００希釈したウサギポリクローナル抗体で４℃で４５分間インキュベートした。浸透性緩衝液で２回洗浄後、細胞を、浸透性緩衝液に１／５０００希釈した二次抗体抗ウサギＩｇ、Ｇalexa488（Molecular Probes）で４℃で４５分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、細胞を直ちにＥＰＩＣＳ−ＸＬサイトフルオロメーターで解析した。データ解析はWINMDI2.8.を用いて行った。検出に用いたウサギポリクローナルＡｂは、我々の施設で作製した：ウサギ免疫前血清を陰性対照として用いた。
共焦点顕微鏡法
ＡＰＣを、無菌スライドを底に含んだ１２ウェルプレート（Corning, NY, USA）内で、前に記載したものと同じ分化プロトコルに従って増殖させた（２００，０００細胞／ウェル）。抗原内在化試験については、５μｇの抗原／２００，０００細胞を用いた。固定、浸透、一次および二次抗体インキュベーションのステップは、フローサイトメトリについて記載されたとおりである。スライドは直ちにFluoview Fv3000共焦点顕微鏡でＸ６０油浸対物レンズを用いて解析した。蛍光画像を連続して得て、非特異的チャネル干渉およびｘ−ｚセクショニングを回避した。画像は次にImage Jソフトウェアでデジタル的に加工した。
統計解析
ノンパラメトリックKrustal-Wallis and Dunnの多重比較試験を統計解析に用いた。Ｐ＜０．０５を統計的に有意とした。統計解析は、PRISM 3.03プログラムで行った。
結果
精製した組換えタンパク質は、予想分子量の２３ｋＤａ（ＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５−Ｅ２）を、および２６ｋＤＡをＰａｐＭＶＣＰおよびＰａｐＭＶＣＰ−Ｅ２について示し、エンドトキシンレベルは常に０．００５ＥＵ／タンパク質１μｇより下であった。電子顕微鏡（ＥＭ）観察により、Ｅ２ペプチドのＰａｐＭＶＣＰのＣ末端への付加は、タンパク質がＶＬＰに自己集合する能力に影響せず、組換えＰａｐＭＶＣＰ ＶＬＰと同様であった。予想通り、ＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５−Ｅ２はＶＬＰを形成することができず、前に示したように一量体形態のままであった（Leclerc et al., 1998, J Biol Chem, 273:29015-21）。ＶＬＰの長さは可変であり、大きさは２０１±８０ｎｍの範囲であった。２０１ｎｍの長さのタンパク質は、Ｅ２ペプチドを提示する５６０コピーのＣＰを、繰り返しの結晶様式で表す。
ＰａｐＭＶＣＰ ＶＬＰの炎症性特性を試験するために、マウスの空気嚢モデルを用いた。低いＬＰ含量（＜０．００５ＥＵ／μｇ）の１０μｇのＰａｐＭＶＣＰ ＶＬＰの注射は、処置後６時間のＣＤ１マウスの嚢に白血球の補充を誘発できなかった。対照的に、１，０００および１ＥＵ用量のＬＰＳの注射は、白血球の補充の誘発に非常に効果的であった（図１３）。この結果は、ＰａｐＭＶＣＰ ＶＬＰが６時間後に前炎症性ではなく、ＰａｐＭＶＣＰタンパク質試料の非常に低レベルのＬＰＳは、続く実験においていかなる注目すべき免疫原性効果も及ぼさないことを示唆する。
一量体（ＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５−Ｅ２）および多量体（ＰａｐＭＶＣＰ−Ｅ２）形態の、骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＤＣ）に豊富にある骨髄由来ＡＰＣ内で内在化する能力を、試験した。フローサイトメトリ解析により、ＡＰＣが、多量体および一量体形態両方によって効率的に免疫標識化されることが示された（ＰａｐＭＶＣＰ−Ｅ２ ＶＬＰについて９５．３％、およびＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５−Ｅ２ ＶＬＰについて９２．６％）。組換えタンパク質およびＡＰＣの間の相互作用を可視化するために、処置したＡＰＣを共焦点顕微鏡法により観察した。両方のケースにおいて、免疫標識ＰａｐＭＶＣＰシグナルは明らかに、小胞性、細胞質内、および核周囲性であった。両方の組換えタンパク質は効率的にＡＰＣ内に内在化された。
ＰａｐＭＶＣＰ ＶＬＰの、免疫反応を誘発する能力を試験するため、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスに、２５μｇの組換えＶＬＰ（ＰａｐＭＶＣＰ-Ｅ２）または２５μｇの一量体形態（ＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５−Ｅ２）を皮下注射した。各用量に存在するＥ２ペプチドの量は、２μｇと推定される。ブースター用量は、初期免疫化後１５日目に与えた。マウスの血清を、抗ＰａｐＭＶＣＰ、ＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５、および抗Ｅ２ペプチド抗体に対してアッセイした。抗体ＣＰ ＩｇＧは、ＰａｐＭＶＣＰ−Ｅ２で免疫化したマウスに１２日目に検出され、一方、ＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５−Ｅ２でワクチン接種したマウスの血清においては、１５日目のブースター後においても弱いレベルの抗ＣＰのみが検出されただけであった（図１４）。
例Ｖ：ＰａｐＭＶのアジュバント効果
ＰａｐＭＶを、例Ｉに記載のようにして精製した。
抗原
ＬＰＳ非含有ＯＶＡグレードＶＩは、Sigma-Aldrich Chemical Co., St Louis, MOから購入した。ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）は、Research Organics Inc. Cleveland, OHから購入した。大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４からのＬＰＳは、Sigma-Aldrich, St Louis, MOから購入した。
免疫化
６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを飼育し、Experimental Medicine Department, Faculty of Medicine, National Autonomous University of Mexico (UNAM)の動物施設内に維持して、医薬品安全性試験実施基準に準拠して飼育した。アジュバントの効果を試験するために、マウスの群を２ｍｇのＯＶＡもしくはＨＥＬのみ、または３０ｍｇのＰａｐＭＶ、ＣＦＡ１：１（ｖ／ｖ）、または５ｍｇの大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４からのＬＰＳ（Sigma-Aldrich）で、０日目に腹腔内で免疫化した。対照マウスは、生理食塩水のみを注射した。血液試料は、後方眼窩洞から図１５に示すように種々の時点で収集した。個々の血清試料は分析まで−２０℃で保存した。各実験に３匹のマウスを用いた。
ＥＬＩＳＡによる抗体価の決定
高結合９６ウェルポリスチレンプレート（Corning（登録商標）, New York, NY）を、０．１Ｍの炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）中の１ｍｇ／ｍＬのＰａｐＭＶ、１００ｍｇ／ｍＬのＨＥＬまたは１５０ｍｇ／ｍＬのＯＶＡで被覆した。プレートを３７℃で１時間、次に４℃で一晩インキュベートした。次の朝、使用前に、プレートを０．０５％Tween-20（Sigma-Aldrich）含有のＰＢＳ（ｐＨ７．２）（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した。非特異的結合を、ＰＢＳに希釈した５％の脱脂粉乳（ＰＢＳ−Ｍ）で、３７℃で１時間ブロックした。洗浄後、マウス血清をＰＢＳ−Ｍ中１：４０に希釈し、２倍連続希釈液をウェルに加えた。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、次にＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。ペルオキシダーゼ複合ウサギ抗マウスＩｇＭ（最適希釈１：１０００）ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ抗体（Zymed, San Francisco, CA）またはＩｇＧ３（最適希釈１：３１０００）（Rockland, Gilbertsville, PA）を加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。３０％過酸化水素含有の０．１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．６）中のオルトフェニレンジアミン（０．５ｍｇ／ｍＬ；Sigma-Aldrich）を、酵素基質として用いた。反応を２．５ＮのＨ２ＳＯ４で停止させ、吸収を、BIOLINX 2.22ソフトウェアと自動ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Dynex Technologies MRII, Chantilly, VA, USA）を用いて、４９０ｎｍにて決定した。抗体価は、−log2希釈×４０として与える。正の力価は、陰性対照の平均値の上の３ＳＤとして定義した。
結果
先天性免疫反応の抗体反応への翻訳は、アジュバントが不十分な免疫原性ワクチンと同時投与された場合に観察される。アジュバントは、抗原に対する抗体または細胞の免疫反応を強化または増強することができる物質である。ＰａｐＭＶが、他の抗原に対する長期の抗体反応を促進可能なアジュバントであるかどうかを決定するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスをＯＶＡまたはＨＥＬのみで、または次のアジュバント：ＰａｐＭＶ、ＣＦＡ、またはＬＰＳと共に免疫化した。ＯＶＡまたはＨＥＬに特異的なＩｇＧ抗体価は、示された時点において（図１５ＡおよびＢ）、ＥＬＩＳＡにより測定した。ＰａｐＭＶアジュバントの効果は、免疫化された動物において、ＯＶＡおよびＨＥＬへの総ＩｇＧ反応に観察された。ＰａｐＭＶにより誘発されたアジュバント効果は、免疫化後３０日に、ＨＥＬに対して観察され、抗体価はＨＥＬのみによって誘発された抗体価の８倍に増加した。抗体価におけるこの差は、１２０日目まで維持されたが、４００日目には維持されていなかった（図１５Ａ）。ＬＰＳは免疫化後の初めの３０日間のみにアジュバント効果を誘発したが、ＣＦＡは、免疫化後８日目から実験終了の４００日まで、最も強いアジュバント効果を示した（図１５Ａ）。
ＯＶＡでの免疫化については、総ＩｇＧ抗体価へのアジュバント効果は、最初の免疫化後１２０日まで観察され、その後、抗体価は時間と共に低下し、４００日目にはＯＶＡと比べて４倍高い値であった（図１５Ｂ）。さらなる解析を２０日目に行って、どのＩｇＧサブクラスが、ＯＶＡおよびアジュバントと共免疫化されたＯＶＡによって誘発されたかを同定した（ここでＰａｐＭＶは総ＩｇＧ反応に対してはアジュバント効果を示さなかった）。ＰａｐＭＶ、ＬＰＳおよびＣＦＡは、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ抗体価を誘発し、一方ＯＶＡのみでは、ＩｇＧ１特異的抗体価を誘発しただけであった（図１５Ｃ〜Ｅ）。ＯＶＡが用いた全てのアジュバントと共免疫化された場合には、ＩｇＧ１に対してアジュバント効果は観察されなかった。これらの結果は、ＰａｐＭＶ、ＬＰＳ、およびＣＦＡが、ＯＶＡに対するＩｇＧサブクラス反応にアジュバント効果を誘発することを示す。さらに、ＰａｐＭＶは、モデル抗原に対する特異的抗体価の長期の増加を誘発する、アジュバント特性を示す。これら考慮すると、これらのデータは、ＰａｐＭＶが、観察される抗原特異的な長期の抗体反応への、先天性免疫反応の翻訳を介在し得る内在性アジュバント特性を有することを示唆する。
例ＶＩ：腸チフス菌ポリンタンパク質の精製
以下の精製法を、ＯｍｐＣおよびＯｍｐＦの精製に用いた。精製法は、Secundino et al. (2006), Immunology 117:59の記載に基づく。
２種のタンパク質を腸チフス菌から共精製した。ＯｍｐＣおよびＯｍｐＦの個別の精製は、ＯｍｐＣ［ＳＴＹＣ１７１（ＯｍｐＣ）］またはＯｍｐＦの［ＳＴＹＦ３０２（ＯｍｐＦ）］のオープンリーディングフレームのどちらかが分断されている、腸チフス菌のノックアウト変異体を用いて行った。共精製については、細菌のノックアウト変異形態からの個別のタンパク質の精製法にしたがった。この方法を以下に概説する。
細菌株、Salmonella typhi 9, 12, Vi:d（ＡＴＣＣ９９９３）を、酵母抽出物、マグネシウム、およびグルコースを補足した最少培地Ａの中で３７℃、２００ｒｐｍで増殖させた。酵母抽出物、マグネシウム、およびグルコースを補足した１０Ｌの最少培地Ａの処方は、以下のとおりである：５．０ｇの無水Ｎａ−クエン酸塩（ＮａＣ６Ｈ５Ｏ７：２Ｈ２Ｏ）、３１．０ｇの一塩基性ＮａＰＯ４（Ｎａ２Ｈ２ＰＯ４）、７０．０ｇの二塩基性ＮａＰＯ４（Ｎａ２ＨＰＯ４）、１０．０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２００ｍＬの酵母抽出物溶液５％（３００ｍＬ中１５．０ｇ）。１．４３４Ｌの培地を４Ｌエルレンマイヤーフラスコに分散させた。滅菌を１２１℃、１５ｌｂｓpression／ｉｎ２で１５分間行った。次に各フラスコに以下を加えた：６．０ｍＬの無菌ＭｇＳＯ４溶液２５％、および６０．０ｍＬのグルコース溶液１２．５％。フラスコに腸チフス菌の一晩培養物を播種し、ＯＤ５４０が１．０に達した時にインキュベーションを停止し、培養物を７，５００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離した。ペレットを１００ｍＬの最終容量のトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．７（６．０ｇのトリス−塩基／Ｌ）に再懸濁させ、バイオマス（生物量）を氷上で９０分間超音波処理し、次に７，５００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離した。１０ｍＬの上清の各々に、２．７７ｍＬの１ＭのＭｇＣｌ２、２５ｍＬのＲＮアーゼＡ（１０，０００Ｕ／ｍｌ）、２５ｍｌのＤＮアーゼＡ（１０，０００Ｕ／ｍｌ）を加えた。混合物を次に１２０ｒｐｍ、３７℃で３０分間遠心分離した。
混合物からのポリン抽出は、次のようにして行った：
１．超遠心分離を、４５，０００ｒｐｍ、４℃で４５分間行い、ペレットを保持した。
２．ペレットを１０ｍＬの２％トリス−ＨＣｌ−ＳＤＳに再懸濁させ、均一化した。
３．インキュベーションを、１２０ｒｐｍ、３２℃で３０分間行った。
４．超遠心分離を、４０，０００ｒｐｍ、２０℃で３０分間行い、ペレットを保持した。
５．ペレットを５ｍＬの２％トリス−ＨＣｌ−ＳＤＳに再懸濁させ、均一化した。
６．インキュベーションを、１２０ｒｐｍ、３２℃で３０分間行った。
７．超遠心分離を、４０，０００ｒｐｍ、２０℃で３０分間行い、ペレットを保持した。
８．ペレットを２０ｍＬのNikaido緩衝液−ＳＤＳ、１％に再懸濁させ、均一化した。［１ＬのNikaido緩衝液に対して：６．０ｇのトリス−塩基、１０．０ｇのＳＤＳ、２３．４ｇのＮａＣｌ、１．９ｇのＥＤＴＡを水に溶解し、ｐＨを７．７に調整した。次に０．５ｍＬのβ−メルカプトエタノール溶液を加えた］。
９．混合物を１２０ｒｐｍ、３７℃で１２０分間インキュベートした。
１０．超遠心分離を、４０，０００ｒｐｍ、２０℃で４５分間行った。ポリン抽出物を含む上清を回収した。
ポリンを上清から高速タンパク質液体クロマトグラフィ（ＥＰＬＣ）で精製した。β−メルカプトエタノール非含有の０．５ＸNikaido緩衝液（上記参照）を、精製過程中用いた。タンパク質をセファクリルＳ−２００（FPLC WATERS 650E）を用いて１０ｍＬ／分のフラックス速度で分離した。カラムに２２ｍＬの上清を負荷した。溶出断片を２６０および２８０ｎｍでモニタリングした。精製ポリンを含有する主ピークを保持し、４℃で保管した。精製ポリンは長期に安定であった（１年間以上）。
結果：図１６Ｂは、上記の方法で精製したポリン、ＯｍｐＣおよびＯｍｐＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルを示す。
例ＶＩＩ：親和性ペプチドを含むＰａｐＭＶ ＶＬＰの産生および操作
親和性ペプチドの選択
精製ＯｍｐＣおよびＯｍｐＦに対する特異的ペプチドを、Ph.D-7 Phage Display Peptide Library Kit（New England Biolabs, Inc.）を用いて選択した。用いたプロトコルは、「パニング」として知られているin vitro選択法であり、これは製造業者のプロトコルに従って行った。簡潔に述べると、２×１０１１個のファージを、ＥＬＩＳＡプレートのウェルのベースに結合した１０μｇの精製ＯｍｐＣまたはＯｍｐＦに加え、ウェルの内容物をゆっくりと室温で１時間混合した。非結合ファージを１ｍｌの２００ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）で、室温で１０分間インキュベートすることにより溶出した。上清を中和するために、およびファージを殺さないために、１５０μｌの１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を加えた。溶出したファージを次に増幅し、追加の結合／増幅サイクルに供して、結合配列に利するようにプールを豊富化させた。洗浄緩衝液は、パニングの第１ラウンド用に０．１％のTween 20を含有し、これは次のラウンド用に０．５％に増加させた。選択したファージを大腸菌ＥＲ２７３８中、各パニングのラウンドの間、増幅させた。このサイクルを３回繰り返して、それぞれのポリンタンパク質に対して最高の親和性のペプチドを選択した。こうして同定したペプチドを表６に示す。
表６：ＯｍｐＣおよびＯｍｐＦ親和性ペプチドの配列および出現頻度
選択親和性ペプチドに融合した高アビディティＰａｐＭＶ ＶＬＰの操作、発現および精製
１つの親和性ペプチドは、ＯｍｐＣおよびＯｍｐＦの各ポリンについて上記パニング法において同定されたものから選択した。対応するＤＮＡ配列は、ＰａｐＭＶ外被タンパク質（ＣＰ）のＣ末端においてクローニングした。ＰａｐＭＶ ＣＰ ＣＰΔＮ５（Tremblay, M-H., et al., 2006, FEBS J., 273:14-25；例Ｉ参照）をテンプレートとして用いた。各選択したペプチドをコードする配列をＰＣＲを用いて導入し、ｐＥＴ−３Ｄ発現ベクターにクローニングした（Stratagene, La Jolla, CA）。簡潔に述べると、フォワードプライマー（配列番号３７；下記）およびプライマーＰａｐＯｍｐＣ（配列番号３８；下記）を、ＰａｐＭＶ ＣＰ遺伝子ＰａｐＭＶ ＣＰ ＣＰΔＮ５をテンプレートして、ＰＣＲ反応に用いた。
得られたＰＣＲ断片は、ＰａｐＭＶ ＣＰのＣ末端において、ペプチドＥＡＫＧＬＩＲの融合を含む。同じアプローチを用いて、フォワードプライマー（配列番号３７）およびプライマーＰａｐＯｍｐＦ（配列番号４１；下記）を、ＰａｐＭＶ ＣＰのＣ末端においてＰＣＲによりペプチドＦＨＥＮＷＰＳの融合を導入するために用いた。
２つのそれぞれのＰＣＲ断片は、制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化し、同じ酵素で消化されたｐＥＴ３−Ｄベクターにクローニングした。クローンの配列決定をして、ペプチドがＰａｐＭＶ ＣＰとのフレームに存在することを確認した。
親和性ペプチドを含有する操作ＰａｐＭＶ ＣＰを、大腸菌ＢＬ２１ＲＩＬに、前に記載のように発現させた（Tremblay, M-H., et al., 2006, FEBS J., 273:14-25；Secundino et al., 2006, Immunology 117:59）。簡潔に述べると、細菌を加圧型細胞破壊装置を通して溶解し、Ｎｉ２＋カラムに負荷し、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのイミダゾール、０．５％のトリトンＸ１００、ｐＨ８で洗浄し、次に１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのイミダゾール、１％の両性洗浄剤、ｐＨ８で洗浄して、エンドトキシン混入を除外した。溶出したタンパク質を、Beckman 50.2 TIローターの高速超遠心分離（１０００００ｇ）に１２０分間かけた。ＶＬＰペレットをエンドトキシン非含有ＰＢＸ（Sigma）中に再懸濁させた。使用の前に、タンパク質を０．４５μＭフィルタを用いてろ過した。タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定した。タンパク質の量を、ＢＣＡタンパク質キット（Pierce）で評価した。精製タンパク質のＬＰＳレベルを、リムルス試験により製造業者（Cambrex）の指示書に従って評価し、０．００５エンドトキシン単位（ＥＵ）／タンパク質１μｇ未満であった。
２つのＰａｐＭＶ外被タンパク質の配列は図２２のようであった（配列番号４２−ＯｍｐＣ親和性ペプチドを含むＰａｐＭＶ外被タンパク質（図２２Ａ）、および配列番号４３−ＯｍｐＦ親和性ペプチドを含むＰａｐＭＶ外被タンパク質（図２２Ｂ））。２つのアミノ酸の差は、野生型と比べた、ＯｍｐＣ親和性ペプチドを含むＰａｐＭＶ外被タンパク質の外被タンパク質配列において観察され（図２２Ａにおいて、太字および下線で示す）、これは、ＰＣＲ反応中に導入された可能性がある。
ＥＬＩＳＡ
各実験に対し、１０μｇのそれぞれの標的タンパク質（ＯｍｐＣまたはＯｍｐＦ）を用いてＥＬＩＳＡプレートを被覆した。増加量のＰａｐＭＶ ＶＬＰを結合アッセイに用いた。ＶＬＰの、それらの標的への親和性は、ＰａｐＭＶ ＣＰに向けられたマウスポリクローナル抗体、およびペルオキシダーゼに結合した二次抗マウス抗体を用いて明らかにした。
結果
親和性ペプチドの選択
ファージ提示を用いて、ＯｍｐＣまたはＯｍｐＦに結合する特異的ペプチドを選択した。ＯｍｐＣに結合する８つのファージ、およびＯｍｐＦに結合する５つのファージの配列を決定した。これらのペプチドの配列および出現頻度は表６に示す。ペプチドEAKGLIR［配列番号２２］は最高の頻度を示し、したがってＯｍｐＣに対する親和性ペプチドとして選択された。ペプチドFHENWPS［配列番号２３］はＯｍｐＦスクリーニングにおいて最も高頻度であり、したがってＯｍｐＦに対する親和性ペプチドとして選択された。興味深いことには、ＯｍｐＦに対する両方の親和性ペプチドは相同であり、その理由は、７つのアミノ酸のうち５つが同一であり、親和性ペプチドにおいて同じ位置に見出されるからである。
高アビディティＰａｐＭＶ ＶＬＰの合成
EAKGLIR［配列番号２２］およびFHENWPS［配列番号２３］のペプチド配列を、ＰａｐＭＶ外被タンパク質のＣ末端において融合させた（図１６Ａ）。融合ペプチドに続いて６×Ｈタグがあり、精製過程を促進した（(Tremblay, M-H., et al., 2006、同上）。組換えコンストラクトを大腸菌に発現させ、親和性クロマトグラフィによりＮｉ２＋カラム上で精製した。タンパク質を５００ｍＭイミダゾールで溶出し、透析し、１００，０００ｇで超遠心分離して、ＶＬＰをペレット化した（図１６Ｂ）。電子顕微鏡（ＥＭ）観察により、ＰａｐＭＶ ＣＰのＣ末端へのペプチドの付加は、タンパク質の、ＶＬＰに自己集合する能力に影響しないことが確認された（図１６Ｃ）。ＶＬＰの様々な長さが利用可能であり、大きさは２０１±８０ｎｍの範囲である。２０１ｎｍ長さのタンパク質は、繰り返しの様式でペプチドを提示する５６０コピーのＣＰを表す。
各ＰａｐＭＶ ＶＬＰのそれぞれの抗原に対する高アビディティを、ＥＬＩＳＡ型の結合アッセイにより示した。両方のＶＬＰに対して、それぞれの抗原への結合が明白に実証され、アッセイで用いるＶＬＰの量と共に増加した（図１７Ａ〜Ｂ）。したがって、ＰａｐＭＶ ＶＬＰは同属の抗原に結合して、溶液中１：１比率の場合に複合体を形成することが推測された。
例ＶＩＩＩ：腸チフス菌に対する高アビディティＰａｐＭＶ ＶＬＰによる免疫化
マウス
雌のＢＡＬＢ／ｃマウス、６〜８週齢（Harlan, Mexico または Charles River, Canada）を用い、Experimental Medicine Department, Medicine Faculty, National Autonomous University of Mexico (UNAM)の動物施設またはCentre Hospitalier de l’Universite Lavalの動物施設で飼育した。
チャレンジアッセイ
マウス（１群当たり１０匹）を、腹腔内（ｉ．ｐ）（０日目）で以下を用いて免疫化した：外在性アジュバントの不在にて、１０μｇのＯｍｐＣ、１０μｇのＯｍｐＣ＋１０μｇのＰａｐＯｍｐＣ、１０μｇのＯｍｐＦ、１０μｇのＯｍｐＦ＋１０μｇのＰａｐＯｍｐＦ、１０μｇのＰａｐＯｍｐＣ、１０μｇのＰａｐＯｍｐＦまたは生理食塩水（ＳＳＩ）。１５日目に、マウスに対して、１０μｇのＯｍｐＣまたは１０μｇのＯｍｐＦのｉ．ｐでのブーストをそれぞれアジュバントなしで与えた。２５日目または１４０日目に、マウスに対しｉ．ｐで次によるチャレンジを行った：５％の胃粘素（Sigma）を含有する５００μＬのＴＥ緩衝液（５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．２、５ｍＭのＥＤＴＡ）中に再懸濁させた１００または５００ＬＤ５０の腸チフス菌（ＡＴＣＣ９９９３）。防御（protection）は、チャレンジ後の１０日間の生存パーセントとして定義した。１ＬＤ５０は、９０，０００ＣＦＵにおいて決定した。
免疫化
５匹のマウスの群を、外在性アジュバントなしで１０μｇのＯｍｐＣ、１０μｇのＯｍｐＣ＋１０μｇのＰａｐＯｍｐＣ、１０μｇのＰａｐＯｍｐＣ、または等張生理食塩水（ＩＳＳ）により腹腔内（ｉ．ｐ）で免疫化した（０日目）。１５日目に、マウスに対してアジュバントなしの１０μｇのＯｍｐＣのブーストをｉ．ｐで与えた。血液試料を頚静脈から、図１８および１９に示した種々の時点において収集した。個々の血清試料は、分析まで−２０℃で保管した。
ＥＬＩＳＡ
高結合性９６ウェルポリスチレンプレート（Nunc）を、ｐＨ９．５の０．１Ｍ炭酸−重炭酸緩衝液中の１０μｇ／ｍｌのＯｍｐＣで被覆した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、次に４℃で一晩インキュベートした。プレートを、蒸留Ｈ２Ｏ−０．１％Tween 20で４回洗浄した。非特異的結合は、遮断緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４−２％ＢＳＡ（Sigma））で３７℃で１時間ブロックした。洗浄後、プールしたマウス血清を遮断緩衝液中に１：４０希釈し、２倍連続希釈液をウェルに加えた。プレートを３７℃で１．５時間インキュベートし、次に４回洗浄した：ＨＲＰ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ（Jackson Immunochemicals）またはＩｇＧ３（Rockland）（１：１００００）を加え、３７℃で１時間インキュベートし、次に４回洗浄した。検出システムとしては、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（Fitzgerald）を用いた。暗所にて３７℃で１０分間インキュベーション後、反応を２．５ＮのＨ２ＳＯ４で停止させ、自動ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで吸収を決定した。抗体価は、−log2希釈×４０で表した。正の力価は、陰性対照の平均値の３ＳＤより上として定義した。
受動免疫化およびチャレンジ
５匹のマウスの群を、外在性アジュバントなしで１０μｇのＯｍｐＣ、１０μｇのＯｍｐＣ＋１０μｇのＰａｐＯｍｐＣ、１０μｇのＰａｐＯｍｐＣ、または等張生理食塩水（ＳＳＩ）により腹腔内（ｉ．ｐ）で免疫化した（０日目）。１５日目に、マウスに対して、アジュバントなしの１０μｇのＯｍｐＣのブーストをｉ．ｐで与えた。２３日目に心穿刺を実施し、各群からの血液試料をプールして−２０℃で保管した。未処置（naive）マウス（１群あたり５匹）に対して、プールされた補体不活性化免疫血清２００μｌをｉ．ｐで与えた。３時間後、転移（transference）マウスは、上述のように粘素に再懸濁させた１００ＬＤ５０の腸チフス菌でチャレンジした。防御は、チャレンジ後の１０日目の生存パーセントとして定義した。
結果
ＰａｐＭＶ ＶＬＰはポリンの防御能力を改善する
精製タンパク質ＯｍｐＣおよびＯｍｐＦは、マウスでの腸チフス菌チャレンジに対して防御を提供することが前に示され、ここでＯｍｐＣのみでは１００ＬＤ５０に対して６０％の防御を提供した（Secundino et al., 2006, Immunology 117:59）。ＯｍｐＣおよびＯｍｐＦ各ポリンそれぞれの免疫原性を改善するために、ＰａｐＭＶ ＶＬＰを含むワクチン製剤を調製した。２つの異なる調製物、ＰａｐＭＶ ＯｍｐＣ ＶＬＰ＋ＯｍｐＣおよびＰａｐＭＶ ＯｍｐＦ＋ＯｍｐＦを、マウスにおいて、１００および５００ＬＤ５０の腸チフス菌に対してマウスを防御するその能力について試験し、結果を、ＯｍｐＣまたはＯｍｐＦのみで免疫化したマウスで得た結果と比較した。ＰａｐＭＶ ＶＬＰとそれらの対応するポリンの比率は、１：１に維持した。
ＰａｐＭＶ ＯｍｐＣ ＶＬＰをＯｍｐＣに添加すると、ＯｍｐＣの防御能力を、腸チフス菌の１００ＬＤ５０のチャレンジについて７０％から１００％へと改善した（図１８Ａ）。防御効率のこの改善は、マウスを５００ＬＤ５０でチャレンジした場合にはさらに大きく、ＯｍｐＣをＰａｐＭＶ ＯｍｐＣ ＶＬＰと組み合わせた場合に、観察される防御は３０％から９０％に増加した（図１８Ｃ）。同様に、ＰａｐＭＶ ＯｍｐＦ ＶＬＰは、ＯｍｐＦの防御能力を、腸チフス菌の１００ＬＤ５０のチャレンジについて６０％から９０％へと改善した（図１８Ｂ）が、しかし、チャレンジが５００ＬＤ５０の腸チフス菌で行われた場合には、マイナーな差のみが観察された（図１８Ｄ）。この結果は、ＯｍｐＣはＯｍｐＦより、腸チフス菌チャレンジに対する防御についてより優れた抗原であることを示唆する。両方のケースにおいて、ＰａｐＭＶ ＶＬＰはポリンの防御能力をかなり改善した。
ＰａｐＭＶ ＶＬＰがＯｍｐＣへの抗体価を改善するかどうかを決定するため、１０μｇＯｍｐＣで、または１０μｇＯｍｐＣおよび１０μｇＰａｐＭＶ ＯｍｐＣ ＶＬＰを含有する複合ワクチンでワクチン接種したマウスのＩｇＧ力価を測定した。異なるＩｇＧアイソタイプ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３の間の力価には、どの処置においても有意な差は認められず（図１９Ａ〜Ｄ）、ＰａｐＭＶ ＶＬＰで観察された防御の改善は、抗体それ自体の産生の増加よりも、ＣＴＬ反応の改善および／または腸チフス菌感染を中和化する抗体の結合有効性における改善に関連している可能性があることを示唆した。
ＰａｐＭＶ ＶＬＰによるワクチン接種は、ポリンへの記憶反応（memory response）を改善する
ＰａｐＭＶ ＶＬＰをＯｍｐＣと組み合わせて含むワクチン調製物の、記憶反応を評価するために、マウスを、ＯｍｐＣのみ、またはＰａｐＭＶ ＯｍｐＣ ＶＬＰとＯｍｐＣを含むワクチン調製物で、２週間の間隔で２回、免疫化し、次に１５日目にＯｍｐＣのみでブーストした。１４０日において、マウスを１００ＬＤ５０の腸チフス菌でチャレンジした。結果は、ＰａｐＭＶ ＯｍｐＣ ＶＬＰとＯｍｐＣを含むワクチン調製物でのプライミングは、ワクチン接種マウスの防御能力を有意に改善した（３倍の改善）ことを、明らかに示す（図１９Ｅ）。この実験はしたがって、ＰａｐＭＶ ＶＬＰが、腸チフス菌チャレンジに対するマウスの防御を改善するだけでなく、よりよい記憶反応も提供することを実証する。
例ＩＸ：ＰａｐＭＶおよびＯｍｐＣの組合せの腸チフス菌に対する防御能力
ＰａｐＭＶを例Ｉの記載のようにして精製した。
防御アッセイ
ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０匹の群）を、腹腔内で０日目に、１０μｇのＯｍｐＣまたは、前もって３０μｇのＰａｐＭＶと共に４℃で１時間インキュベートした１０μｇのＯｍｐＣで免疫化した。１５日目に１０μｇのＯｍｐＣのみでブーストを行った。対照マウスは生理食塩水のみを注射した。２１日目に、マウスを、５％の粘素に懸濁させた（上記）１００および５００ＬＤ５０の腸チフス菌（ＳＴＹＣ３０２DompF株）でチャレンジし、上述のように、生存率をチャレンジ後１０日間モニタリングした（Isibasi et al., 1992, Vaccine 10:811-813；Isibasi et al., 1988, Infect. Immun. 56:2953-2959）。
結果
感染植物から単離されたＰａｐＭＶウィルスの、ＯｍｐＣにより供給される防御の増加におけるアジュバント能力を試験するために、ＯｍｐＣで免疫化したマウスと、ＯｍｐＣとＰａｐＭＶ精製ウィルスを混合して免疫化したマウスを、次に腸チフス菌でチャレンジして比較した。ＯｍｐＣとＰａｐＭＶ精製ウィルスを混合して用いた場合、ＯｍｐＣのみと比較して、腸チフス菌の１００ＬＤ５０および５００ＬＤ５０のどちらでのチャレンジにおいても、３０％高い生存率が観察された（図２０Ａ）。０日目および１５日目にＰａｐＭＶのみで免疫化し、２１日目にチャレンジしたマウスにおいては、防御は観察されず（図２１Ａ）、また、ＰａｐＭＶで免疫化し、２４時間後にチャレンジしたマウスにおいても同様であった。これらのデータは、観察される防御が、ＰａｐＭＶが誘発した増強炎症の結果であるとの考えを否定する。増加した防御が、ＯｍｐＣに特異的な抗体価の増加と相関するかどうかを試験するために、ＯｍｐＣ特異的抗体価に対するＰａｐＭＶアジュバント効果を測定した。ＰａｐＭＶの、ＯｍｐＣとの共免疫化は、抗ＯｍｐＣ ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３力価の増加を誘発した（図２１Ｂ）。これらの結果はさらに、ＰａｐＭＶのアジュバント特性が、ＯｍｐＣにより誘発される先天的および適応的免疫反応の両方を増強し、腸チフス菌チャレンジに対する防御を実現することを証明する。ＰａｐＭＶおよび腸チフス菌ＯｍｐＣポリンの同時投与は、したがって、腸チフス菌チャレンジに対する防御能力を増加させることが示された。
例Ｖ〜ＩＸに概説した実験の結果は、ＰａｐＭＶが、抗原特異的免疫グロブリンの切換えを誘発し、モデル抗原に対する長期の抗体反応の持続を提供し、ＯｍｐＣまたはＯｍｐＦのみによる防御能力を増加させる、内在性のアジュバント特性を有することを示す。これらのデータは、ＰａｐＭＶおよびＰａｐＭＶ ＶＬＰが、ＯｍｐＣポリンにより誘発される先天的および適応的免疫反応の、腸チフス菌チャレンジに対する防御への翻訳を増強することを示す。
例Ｘ：腸チフス菌ポリンエピトープを含むＰａｐＭＶ ＶＬＰの免疫原性効果
細菌の表面に露出している腸チフス菌ポリンのループ６および７に対応する２つの小さなエピトープが、ポリンの免疫化により誘発される防御機構に関与することが示された(Panigua-Solis et al., 1995, Immunol Infect. Dis. 5:244-249）。これらの領域は腸チフス菌ポリンにのみ存在し、したがって、他のグラム陰性菌からのポリンとの交差反応性は見出されなかった。したがって、これらのエピトープを含むポリン断片は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰをアジュバント担体として利用する組換えサブユニットワクチンの開発のための、優れた候補抗原を表す。
組換えＰａｐＭＶ ＶＬＰの産生
ＰａｐＭＶ外被タンパク質を、そのＣ末端にアミノ酸配列GTSNGSNPSTSYGFAN［配列番号５０］を含むように操作し、これは腸チフス菌ポリンからの免疫優性ループ６エピトープを含む（図２３Ａ参照）。組換えタンパク質を、前の例に記載の方法を用いて大腸菌に発現させた（図２３Ｂ参照）。簡潔に述べると、フォワードプライマー（配列番号４４、下記）およびリバースプライマー（配列番号４５、下記）を、ＰａｐＭＶ ＣＰ ＣＰΔＮ５遺伝子をテンプレートとして、ＰＣＲ反応に用いた。
組換えタンパク質を大腸菌から、Ｎｉ２＋親和性タグクロマトグラフィにより、前の例における記述に従って精製し、これは、感染植物の葉から精製された天然のウィルス粒子と類似のＶＬＰに自己集合することが示された（図２３Ｃ参照）。
ループ６ペプチド（ＰａｐＭＶ−ループ６）を含むＰａｐＭＶ外被タンパク質のアミノ酸配列を、図２４Ａに示し（配列番号４６）、ＰａｐＭＶ−ループ６タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、図２４Ｂに示す（配列番号４７）。
Ｂａｌｂ／ＣマウスのＰａｐＭＶ−ループ６に対する免疫反応
雌のＢＡＬＢ／ｃマウス、６〜８週齢（Harlan, Mexico or Charles River, Canada）を用い、Centre Hospitalier de l’Universite Lavalの動物施設で飼育した。マウスを、皮下経路（ｓ．ｃ．）（０日目）で、外在性アジュバントなしで１００μｇのＰａｐＭＶ−ループ６で免疫化した。１５日目に、マウスに対して、ｓ．ｃ．で１００μｇのＰａｐＭＶ−ループ６のブーストを与えた。２８日目に、最終の放血を収集し、免疫反応を標準ＥＬＩＳＡによりループ６合成ペプチドおよび精製ＯｍｐＣタンパク質を用いて決定した。
結果は、ＰａｐＭＶプラットフォームは、５匹のうち４匹のマウスにおいてループ６特異的抗体の産生を引き起こしたことから、高度に免疫原性であることを確認した（図２５Ａ）。ＰａｐＭＶ−ループ６ ＶＬＰは５匹の処置したマウスにおいて多数の抗体をＰａｐＭＶプラットフォームに対して誘発したが（図２５Ｂ）、同じ血清は、精製ＯｍｐＣタンパク質に対しては反応を示さなかった（図２５Ｃ）。この結果は、ＰａｐＭＶ ＣＰ融合物のループ６ペプチドの構造が、ＯｍｐＣタンパク質内の天然の環境におけるペプチドのそれと、わずかに異なる構造（コンフォメーション）を採用している可能性があることを示唆する。
ループ６ペプチド配列が、ＰａｐＭＶ ＣＰに融合した場合にその天然の構造を採用できるようにするために、上記配列（配列番号５０）を、ＰａｐＭＶ ＣＰの残基４９〜５２の間の内部ループ内にクローニングする。このループは、この目的のために、バイオインフォマティクス技術を用いて同定された。
例ＸＩ：ＰａｐＭＶ ＶＬＰと腸チフス菌ＯｍｐＦの防御能力
例ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸに記載の以下のタンパク質を、この実験に用いた：
・ＰａｐＭＶ ＣＰΔＮ５ ＶＬＰ（「ＰａｐＭＶ」）（図１Ｃ参照）
・腸チフス菌ＯｍｐＦについての親和性ペプチドを含むＰａｐＭＶ ＯｍｐＦ ＶＬＰ（図２２Ｂ参照）
・ＯｍｐＦ（図２１Ｂ参照） Ｂａｌｂ／Ｃマウス（１群あたり１０匹）を腹腔内（Ｉ．Ｐ．）で０日目に以下で免疫化した：
第１群 １０μｇのＯｍｐＦ
第２群 １０μｇのＯｍｐＦ＋１０μｇのＰａｐＭＶ
第３群 １０μｇのＯｍｐＦ＋１０μｇのＰａｐＭＶ ＯｍｐＦ
第４群 １０μｇのＰａｐＭＶ
第５群 １０μｇのＰａｐＭＶ ＯｍｐＦ
２回目の免疫化（ブースト）を、１５日目に１０μｇのＯｍｐＦで、第１、第２および第３群において行った。第４群は、１０μｇのＰａｐＭＶでブーストし、第５群は、１０μｇのＰａｐＭＶ ＯｍｐＦでブーストした。腸チフス菌によるチャレンジは、２１日目に行った。粘素中の９０ ０００ＣＦＵの腸チフス菌は、１ＬＤ５０に相当することが、実験的に確立されていた。全てのマウスは３１日目に殺処分した。
結果
７７ＬＤ５０において（図２６Ａ）、ＯｍｐＦを含有する全ての調製物は、１００％の防御を与えた。予想通り、ＯｍｐＦを含有していない調製物でワクチン接種されたマウスは、１４ＬＤ５０という低い用量でのチャレンジから数日以内にすべて死亡した。しかし、マウスをより高い腸チフス菌用量（３７８ＬＤ５０）でチャレンジした場合には、ＯｍｐＦ含有調製物間に違いが観察された。図２６Ｂに示すように、この用量での最も効果的な調製物は、１回目の免疫化でＰａｐＭＶ ＯｍｐＦ＋ＯｍｐＦ（第３群）、およびＯｍｐＦのみでのブーストであった。ＰａｐＭＶ ＯｍｐＦ ＶＬＰの、標的であるＯｍｐＦに対する高アビディティは、ＯｍｐＦのアジュバントとしてＰａｐＭＶのみを用いた場合と比べて、防御能力を改善した可能性がある。
このデータは、例ＶＩＩＩに示したものと整合し、ＰａｐＭＶ ＯｍｐＦがＯｍｐＦの腸チフス菌チャレンジに対する防御能力を改善することを確認する。さらにデータは、ＰａｐＭＶ ＯｍｐＦが、親和性ペプチドなしのＰａｐＭＶ ＶＬＰよりも、ＯｍｐＦのアジュバントとして優れていることを示す。上述のように、ＰａｐＭＶ ＯｍｐＦ ＶＬＰの、ＯｍｐＦに対するより強い結合が、ＶＬＰ−ＯｍｐＦ複合体の形成を促進し、これはつぎに、ＶＬＰ分子のアジュバント能力を最大化する可能性がある。
例ＸＩＩ：ＰａｐＭＶ ＶＬＰと腸チフス菌ＯｍｐＣの防御能力
例ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸに記載の次のタンパク質を、この実験に用いた：
・ＰａｐＭＶ ＣＰΔＮ５ ＶＬＰ（「ＰａｐＭＶ」）（図１Ｃ参照）
・ＯｍｐＣ（図２１Ａ参照） ＯｍｐＣ親和性ペプチドEAKGLIR［配列番号２２］を含むさらなるＰａｐＭＶ ＣＰ融合物を作成し、これは、追加の４つのアミノ酸を、親和性ペプチドの各側に２つずつ含む（図２７Ａに示すように、Ｎ末端側にＴＲ、Ｃ末端側にＴＳ）。これらのアミノ酸は、ＰａｐＭＶ ＣＰとの融合物に親和性ペプチドをクローニングするために用いた制限部位ＳｐｅＩ−ＭｌｕＩの存在の結果である。コンストラクトを「ＰａｐＭＶ ＳＭ ＯｍｐＣ」と呼ぶ。ＰａｐＭＶ ＳＭ ＯｍｐＣタンパク質の完全なアミノ酸配列を図２８Ａ（配列番号４８）に示し、ＰａｐＭＶ ＳＭ ＯｍｐＣタンパク質をコードするヌクレオチド配列を図２８Ｂ（配列番号４９）に示す。
ＰａｐＭＶ ＳＭ ＯｍｐＣタンパク質は、前の例（図２７Ｂ参照）に記載のようにして精製した。精製タンパク質は、電子顕微鏡法により、予想通りＶＬＰ形成を示した（図２７Ｃ）。
免疫化
Ｂａｌｂ／Ｃマウス（１群あたり１０匹）を腹腔内（Ｉ．Ｐ．）で０日目に以下により免疫化した：
第１群 １０μｇのＯｍｐＣ
第２群 １０μｇのＯｍｐＣ＋１０μｇのＰａｐＭＶ
第３群 １０μｇのＯｍｐＣ＋１０μｇのＰａｐＭＶ ＯｍｐＣ
第４群 １０μｇのＰａｐＭＶ
第５群 １０μｇのＰａｐＭＶ ＯｍｐＣ
２回目の免疫化（ブースト）を、１５日目に１０μｇのＯｍｐＣで、第１、第２および第３群において行った。第４群は、１０μｇのＰａｐＭＶでブーストし、第５群は、１０μｇのＰａｐＭＶ ＯｍｐＣでブーストした。腸チフス菌によるチャレンジは、２１日目に行った。粘素中の９０ ０００ＣＦＵの腸チフス菌は、１ＬＤ５０に相当することが、実験的に確立されていた。全てのマウスは３１日目に殺処分した。
結果
１０５ＬＤ５０において（図２９Ａ）、ＯｍｐＣを含有する全ての調製物は、１００％の防御を与えた。予想通り、ＯｍｐＣを含有していない調製物でワクチン接種されたマウスは、２０ＬＤ５０という低い用量でのチャレンジから数日以内にすべて死亡した。しかし、マウスをより高い腸チフス菌用量（５２０ＬＤ５０）でチャレンジした場合には、ＯｍｐＣ含有調製物間に違いが観察された。図２９Ｂに示すように、この用量での最も効果的な調製物は、１回目の免疫化でＰａｐＭＶ＋ＯｍｐＣの組合せ（第２群）、およびＯｍｐＣのみでのブーストであった。ＯｍｐＣに複合したＰａｐＭＶ ＳＭ ＯｍｐＣ ＶＬＰを含む調製物（第３群）もまた良好であったが、ＰａｐＭＶ＋ＯｍｐＣの組合せよりわずかに非効率的であるように見える。しかし、有効性の差が統計的に有意であるかどうかは、この実験では決定できなかった。
結論として、例ＶＩＩ、ＸＩおよびＸＩＩに示すように、親和性ペプチド含有または非含有の組換えＰａｐＭＶ ＶＬＰはそれぞれ、腸チフス菌の２種の異なる抗原ＯｍｐＣおよびＯｍｐＦの防御能力を改善する、強力なアジュバントとして作用可能である。
例ＸＩＩＩ：腸チフス菌ポリンの安定性
腸チフス菌精製ポリンの安定性を、標準のＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した。ポリンの２つの試料を用いた。第１の試料はＯｍｐＣおよびＯｍｐＦ精製タンパク質両方を含み（ロットISIPOR）、１９９９年１１月９日に調製された（この調製は、図１（ｂ）に示したSalazar-Gonzales et al., 2004, Immunology Letters 93によるものと同じ方法である。第２の試料は、精製ＯｍｐＣタンパク質のみを含み（ロット1239）、２００７年４月３０日に調製された。
両試料ともＰＢＳ溶液中、ｐＨ７．４±０．１および４±３℃で暗所において保管した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、次の条件下で行った。
・１２％アクリルアミド
・全ての試料はβ−メルカプトエタノールを添加して変性させ、９５℃で５分間加熱した後ゲルに負荷した。
結果を図３０に示す。この図に示すように、両方のポリン調製物は非常に安定である。Isiporは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより劣化の兆候が全くないことから、９年以上（１９９９年〜２００８年）も非常に安定のようであった（図３０Ａと３０Ｂを比較のこと）。精製ＯｍｐＣはまた、９ヶ月の保管後にもタンパク質が無傷で残っており、高度に安定性であることが実証された（図３０Ｃの左および右の図を比較のこと）。
例ＸＩＶ：ＰａｐＭＶはＤＣ、マクロファージおよびＢ細胞にin vivoで活性化マーカーの上方調節を誘発する
ＰａｐＭＶを、例Ｉの記載のようにして精製した。
in vivoＤＣ、マクロファージおよびＢリンパ球活性化アッセイ
ＢＡＬＢ／ｃマウス（７週齢）を、５００μｌの生理食塩水にそれぞれ懸濁させた、３０μｇのＰａｐＭＶおよび５０μｇのポリＩ：Ｃでｉ．ｐ．で免疫化した。生理食塩水（５００μｌ）を対照として用い、免疫化の２４時間後にリンパ節および脾臓を得た。細胞懸濁液をこれらの器官から調製し、フローサイトメトリ染色を以下を用いて行った：フィコエリスリン（ＰＥ）−ＣＤ１１ｃ、アロフィコシアニン−ＣＤ１１ｂ、Ｂ２２０−ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）、ＦＩＴＣ−ＣＤ８０、ＦＩＴＣ−ＣＤ８６、ＦＩＴＣ−ＣＤ４０、ＦＩＴＣ−ＣＤ６９およびＦＩＴＣ−主要組織適合性複合体クラスＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）抗体（全て、BD Pharmingenから購入）。
結果
ＰａｐＭＶは免疫系により病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）として認識され、したがって、他のパターン認識受容体（ＰＲＲ）アゴニスト同様、未成熟なＤＣを成熟させ、またはＡＰＣを活性化させると考えられている。ＰａｐＭＶのin vivoでＡＰＣを刺激する能力を特徴付けるために、ＰａｐＭＶで免疫化したマウスのリンパ節および脾臓を単離し、共刺激および活性化分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ６９およびＭＨＣクラスＩＩ）の上方調節について解析した。図３１に示すように、ＰａｐＭＶは、リンパ節（ＬＮ）ＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ−）においてＣＤ８０とＣＤ６９の上方調節を誘発し、脾臓ＤＣにおいてＣＤ４０とＣＤ６９の上方調節を誘発した。マクロファージに対して（ＣＤ１１ｃ−ＣＤ１１ｂ＋）、ＣＤ８０とＣＤ６９の上方調節はＬＮにおいて観察され、一方、ＣＤ４０とＣＤ６９の上方調節は脾臓において観察された。ＣＤ６９はＬＮのＢリンパ球（ＣＤ１１ｃ−Ｂ２２０＋）において上方調節され、ＣＤ４０とＣＤ６９は、脾臓Ｂ細胞において上方調節された。ＴＬＲ−３アゴニストであるポリＩ：Ｃは、試験したマーカーの上方調節を誘発したが、観察されたプロファイルはＰａｐＭＶにより誘発されたものと顕著に異なっていた（図３１）。
ＡＰＣによるＴ細胞に対する抗原提示は、先天的な免疫系が、適応的免疫系を活性化する重要性を示した。ＰａｐＭＶを負荷したＡＰＣは、抗体反応を効率的に誘発することが観察された。これらのデータおよびＰａｐＭＶによりＡＰＣに誘発された効果（図３１）は、ＰａｐＭＶで刺激されたＡＰＣが、効率的なＴ細胞依存性抗体反応を促進するのに必要な環境を、抗原およびサイトカインに提供することを示唆し、これは、ＰａｐＭＶにより送達される内在性のアジュバントシグナルを、観察された長期の抗体反応に翻訳することに関与する機構である可能性がある。ＰａｐＭＶは、ＰＡＭＰとしておよび抗原としての両方で、免疫系により検知されるようであり（Pamptigen）、先天的および適合的免疫反応を同時に活性化し、これは、記憶コンパートメントの誘発に有利である。Pamptigenはまた、特定のＢ細胞上の、ＢＣＲおよびＰＲＲの両方、例えばＴＬＲなどにも結合でき、これにより、抗体分泌細胞の差別化、または記憶Ｂ細胞の生成をもたらす。Pamptigenは、免疫反応を活性化するのに必要な抗原閾値を低下することができる。したがって、少量の持続性抗原が、高い抗体価を維持することが可能である。
ＰａｐＭＶの強い免疫原性および内在性のアジュバント特性は、ＰａｐＭＶおよびモデル共免疫化抗原（例ＩＸ参照）の両方に対する、特異的で、長期の抗体反応を翻訳する。ＰａｐＭＶは安価な方法で産生でき、室温で安定であるため、長期の免疫性を誘発するための、新しいアジュバントおよびワクチンプラットフォームの開発に適している。
本発明を、ある特定の態様を参照して記載したが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、これの種々の改変が当業者には明らかである。当業者に明らかであるように、かかる改変の全ては、以下のクレームの範囲内に含まれることが意図される。

Claims (48)

  1. パパイアモザイクウィルス（ＰａｐＭＶ）またはＰａｐＭＶ外被タンパク質由来ＶＬＰと組み合わせて、１または２種以上の腸内細菌抗原を含む抗原提示系であって、前記ＰａｐＭＶまたはＶＬＰが、前記１または２種以上の腸内細菌抗原に対する免疫反応を増強することができる、前記抗原提示系。
  2. ＶＬＰが改変ＰａｐＭＶ外被タンパク質に由来し、前記改変ＰａｐＭＶ外被タンパク質は、多量体化して前記ＶＬＰを形成することができる、請求項１に記載の抗原提示系。
  3. 抗原提示系が、配列番号３に記載の配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬＰを含む、請求項２に記載の抗原提示系。
  4. １または２種以上の抗原が、ＰａｐＭＶまたはＶＬＰの外被タンパク質に複合している、請求項１〜３のいずれかに記載の抗原提示系。
  5. １または２種以上の抗原が、ＰａｐＭＶまたはＶＬＰに複合していない、請求項１〜３のいずれかに記載の抗原提示系。
  6. １または２種以上の抗原が、外被タンパク質に遺伝子的に融合している、請求項４に記載の抗原提示系。
  7. １または２種以上の抗原が、外被タンパク質に親和性結合により結合している、請求項４に記載の抗原提示系。
  8. 親和性結合が、外被タンパク質に遺伝子的に融合した親和性ペプチドを介したものであり、前記親和性ペプチドが、１または２種以上の抗原を結合可能である、請求項７に記載の抗原提示系。
  9. １または２種以上の抗原が、ポリンタンパク質またはその抗原性断片である、請求項１〜８のいずれかに記載の抗原提示系。
  10. １または２種以上の抗原が、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＣの断片、ＯｍｐＦ、およびＯｍｐＦの断片の群から選択される、請求項１〜９のいずれかに記載の抗原提示系。
  11. １または２種以上の抗原が、腸チフス菌抗原である、請求項１〜１０のいずれかに記載の抗原提示系。
  12. 抗原提示系が、配列番号４２、配列番号４３または配列番号４８に記載の配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬＰを含む、請求項１に記載の抗原提示系。
  13. 請求項１〜１２のいずれかに記載の抗原提示系、および薬学的に許容し得る担体を含む、ワクチン組成物。
  14. 腸内細菌抗原を結合可能な１または２種以上の親和性ペプチドに融合したパパイアモザイクウィルス外被タンパク質を含む、ポリペプチド。
  15. 抗原が、腸チフス菌抗原である、請求項１４に記載のポリペプチド。
  16. １または２種以上の親和性ペプチドが、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５に記載の配列から選択される配列を含む、請求項１４または１５に記載のポリペプチド。
  17. ポリペプチドが、配列番号４２、配列番号４３または配列番号４８に記載の配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む、請求項１４または１５に記載のポリペプチド。
  18. １または２種以上の腸内細菌抗原に融合したパパイアモザイクウィルス外被タンパク質を含む、ポリペプチド。
  19. １または２種以上の抗原が、腸チフス菌抗原である、請求項１８に記載のポリペプチド。
  20. １または２種以上の抗原が、ＰａｐＭＶ外被タンパク質のＣ末端においてまたはこの内部ループ内に融合している、請求項１８または１９に記載のポリペプチド。
  21. 請求項１３〜２０のいずれかに記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
  22. 請求項１〜１２のいずれかに記載の抗原提示系の、腸内細菌に対する免疫反応を必要とする動物において腸内細菌に対する免疫反応を誘発するための使用。
  23. 腸内細菌に対する免疫反応を必要とする動物において腸内細菌に対する免疫反応を誘発するための、請求項１３に記載のワクチンの使用。
  24. 腸内細菌が腸チフス菌である、請求項２２または２３に記載の使用。
  25. 動物がヒトである、請求項２２〜２４のいずれかに記載の使用。
  26. 動物が非ヒト動物である、請求項２２〜２４のいずれかに記載の使用。
  27. 請求項１〜１２のいずれかに記載の抗原提示系の、ワクチンの調製のための使用。
  28. ワクチンが、腸内細菌に対する免疫反応を必要とする動物において腸内細菌に対する免疫反応を誘発するためのものである、請求項２７に記載の使用。
  29. 腸内細菌が腸チフス菌である、請求項２７または２８に記載の使用。
  30. 動物がヒトである、請求項２７〜２９のいずれかに記載の使用。
  31. 動物が非ヒト動物である、請求項２７〜２９のいずれかに記載の使用。
  32. 腸チフス菌感染に対して動物を免疫化するためのワクチンであって、前記ワクチンが、腸チフス菌ＯｍｐＣまたはＯｍｐＦに由来する抗原を、パパイアモザイクウィルス（ＰａｐＭＶ）またはＰａｐＭＶ外被タンパク質由来ＶＬＰと組み合わせて含む抗原提示系を含み、ここで前記ＰａｐＭＶまたはＶＬＰが、動物における前記抗原に対する免疫反応を増強可能である、前記ワクチン。
  33. 抗原提示系が、配列番号４２、配列番号４３または配列番号４８に記載の配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬＰを含む、請求項３２に記載のワクチン。
  34. 動物において腸内細菌に対する免疫反応を誘発するための方法であって、前記方法が、前記動物に対して、請求項１に記載の抗原提示系の有効量を投与することを含む、前記方法。
  35. ＶＬＰが改変ＰａｐＭＶ外被タンパク質に由来し、前記改変ＰａｐＭＶ外被タンパク質は、多量体化して前記ＶＬＰを形成することができる、請求項３４に記載の方法。
  36. 抗原提示系が、配列番号３に記載の配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬＰを含む、請求項３５に記載の方法。
  37. １または２種以上の抗原が、ＰａｐＭＶまたはＶＬＰの外被タンパク質に複合している、請求項３４に記載の方法。
  38. １または２種以上の抗原が、ＰａｐＭＶまたはＶＬＰに複合していない、請求項３４に記載の方法。
  39. １または２種以上の抗原が、外被タンパク質に遺伝子的に融合している、請求項３７に記載の方法。
  40. １または２種以上の抗原が、外被タンパク質に親和性結合により結合している、請求項３７に記載の方法。
  41. 親和性結合が、外被タンパク質に遺伝子的に融合した親和性ペプチドを介した結合であり、前記親和性ペプチドは、１または２種以上の抗原を結合可能である、請求項４０に記載の方法。
  42. １または２種以上の抗原が、ポリンタンパク質またはその抗原性断片である、請求項３４に記載の方法。
  43. １または２種以上の抗原が、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＣの断片、ＯｍｐＦ、およびＯｍｐＦの断片の群から選択される、請求項３４に記載の方法。
  44. １または２種以上の抗原が、腸チフス菌抗原である、請求項３４に記載の方法。
  45. 抗原提示系が、配列番号４２、配列番号４３または配列番号４８に記載の配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬＰを含む、請求項３４に記載の方法。
  46. 腸内細菌が腸チフス菌である、請求項３４に記載の方法。
  47. 動物がヒトである、請求項３４に記載の方法。
  48. 動物が非ヒト動物である、請求項３４に記載の方法。
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