CN115851771B - 一种不表达Peg菌毛的鸡伤寒沙门菌弱毒分离株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种不表达Peg菌毛的鸡伤寒沙门菌弱毒分离株及其应用。本发明的分离株口服接种1×10¹⁰ CFU剂量的SGOP株对1日龄SPF鸡无任何致病性，并且SGOP株免疫接种1日龄SPF鸡，21天后免疫鸡群能抵抗鸡伤寒沙门菌野毒株U20的攻毒，70%的攻毒鸡群不发病而得到保护。本发明的SGOP株安全性较高，并且不会影响禽源沙门菌的监测净化程序，具有应用于临床防控鸡伤寒沙门菌感染及其标记性弱毒疫苗候选株较大潜力。

Description

一种不表达Peg菌毛的鸡伤寒沙门菌弱毒分离株及其应用

技术领域

本发明涉及动物细菌性疾病疫苗技术领域，具体涉及一种不表达Peg菌毛的鸡伤寒沙门菌弱毒株及其应用，其可以在标记性弱毒疫苗候选株中应用。

背景技术

菌毛是细菌表面一种特殊的细丝状结构，其顶端的黏附素蛋白可以结合宿主的特定组织细胞，是细菌黏附、定植致病的关键蛋白。peg基因操纵子编码的Peg菌毛主要表达在D群沙门菌中。peg基因操纵子主要由pegA、pegB、pegC和pegD 4个结构基因编码蛋白完成Peg菌毛的合成和组装。有研究报道，肠炎沙门菌P125109基因组中pegA基因全长534bp，编码Peg菌毛主要亚单位，分子量约为19ku；pegB位于pegA下游，全长732bp，编码分子量为27ku的伴侣蛋白；pegC全长2394bp编码分子量为89.2ku的推进蛋白；pegD全长1023bp，编码菌毛的顶端粘附素，分子量大小37.3ku，位于Peg菌毛结构的顶端。

沙门菌疫苗的免疫接种被认为是控制沙门菌感染的重要方式。禽源沙门菌传统疫苗分为3类：灭活疫苗、亚单位疫苗以及减毒活疫苗。理想的禽源沙门菌疫苗应该具备方便大规模接种，能强烈诱导体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫应答，持续性长时间免疫应答，较高安全性和不影响净化程序等特点。

沙门菌灭活疫苗大多采用肌内注射或皮下注射方式进行免疫接种。这些灭活疫苗能引起抗体免疫应答。然而，灭活疫苗不能诱导CD8⁺ T细胞免疫和黏膜免疫应答，并且灭活疫苗抗体免疫应答持续时间短，在宿主体内较易清除，因此灭活疫苗常需要多次加强免疫接种。此外，灭活疫苗还需要配合佐剂以获得最佳免疫效果。

沙门菌亚单位疫苗大多通过肌内注射或皮下注射途径进行免疫接种，其本身不能诱导机体产生CD8⁺ T细胞免疫和黏膜免疫应答。同灭活疫苗一样，亚单位疫苗也需要与合适的佐剂配合使用。考虑到沙门菌亚单位疫苗制备过程繁琐，成本昂贵，因此不适用于养禽场大规模免疫接种。

沙门菌减毒活疫苗能通过口服途径进行免疫接种，其能诱导较为强烈的体液免疫、CD8⁺ T细胞免疫和黏膜免疫应答，并且沙门菌减毒活疫苗株会在宿主肠道有限定植和增殖，能够引起较长时间的持续性免疫应答，不需要多次加强免疫接种。然而，减毒活疫苗株存在毒力返强的风险，需要持续的监测以确保不存在毒力返强的风险。而且，如果减毒活疫苗株不含有与田间野毒株相区分的基因标记(即无法区分疫苗株免疫鸡群和野毒株感染鸡群)，则会干扰到禽源沙门菌的净化程序。

鉴于3000种以上沙门菌血清型和多种不同的分离株和变异株，且每年不断增加，值得注意的是，人们在致弱多种沙门菌病原菌研究的同时，在自然界分离鉴定出不同的自然弱毒沙门菌，包括早在1970年分离报道的弱毒分离株Salmonella Sofia，已在澳大利亚、德国和以色列等国家研究报道。此外，国内也有鸡伤寒沙门菌自然弱毒分离株(SG01株)的相关报道。考虑到实际应用过程中人工减毒细菌活疫苗的安全性保障，将自然弱毒分离株作为沙门菌活疫苗候选菌株进行研发是较理想和安全的创新选择。

然而，已被报道的鸡伤寒沙门菌弱毒分离株SG01本身无生物标记，这会导致鸡群免疫接种SG01株后诱导宿主产生的血清抗体与鸡群感染鸡伤寒沙门菌野毒株后产生的血清抗体无法区分，干扰影响鸡群感染沙门菌的诊断，最终不可避免地影响禽源沙门菌的监测净化程序和效果。因此，SG01株作为活疫苗，若应用于养禽场鸡群免疫接种则具备上述存在的缺陷，需要进一步发掘免疫接种后能区分疫苗株免疫鸡群和野毒株感染鸡群的鸡伤寒沙门菌候选疫苗菌株。

发明内容

发明目的：针对实际应用过程中致弱细菌疫苗的安全性保障，靶向较为安全的弱毒分离株作为疫苗候选株，并且考虑到实际应用过程中区分疫苗接种鸡群和野毒感染鸡群的需求，本发明公开了一种不表达Peg菌毛的鸡伤寒沙门菌弱毒分离株及其标记性弱毒疫苗候选株的潜在应用。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明提供了一种Peg菌毛的操纵子peg基因，所述Peg菌毛的操纵子peg基因序列的第131～393位缺失。

本发明内容还包括含有所述的peg基因的表达盒、重组载体、重组菌株或细胞。

本发明内容还包括一种不表达Peg菌毛的鸡伤寒沙门菌弱毒分离株(SalmonellaGallinarum)SGOP，所述鸡伤寒沙门菌分离株(Salmonella Gallinarum)SGOP于2022年5月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2022580，保藏地址为中国武汉。

本发明还提供上述鸡伤寒沙门菌弱毒分离株SGOP的分离方法，包括步骤：在无菌培养皿中采集某规模化养殖场健康鸡心脏、肝脏、脾脏等脏器，研磨后进行选择性培养和纯培养，之后通过16S rDNA测序、血清型特异性PCR检测得到鸡伤寒沙门菌自然分离株SGOP。

其中，所述的鸡伤寒沙门菌弱毒分离株SGOP能在LB平板和木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)平板中培养，在LB平板中，形成黄白色边缘不平滑的粗糙型菌落；在XLD平板上，形成具有黑色中心的菌落。所述鸡伤寒沙门菌弱毒分离株(Salmonella Gallinarum)SGOP与沙门菌O1、O9和O12单因子血清均不产生凝集反应。

对鸡伤寒沙门菌弱毒分离株SGOP进行全基因组测序，测序结果表明该分离株编码Peg菌毛的操纵子peg基因部分序列缺失，编码基因不完整，无法表达Peg菌毛。其中，所述鸡伤寒沙门菌弱毒分离株(Salmonella Gallinarum)SGOP编码Peg菌毛的操纵子oeg基因序列第131～393位缺失。

本发明内容还包括所述的鸡伤寒沙门菌弱毒分离株(Salmonella Gallinarum)SGOP的培养方法，将鸡伤寒沙门菌弱毒分离株(Salmonella Gallinarum)SGOP的单菌落挑取少量划线于LB平板或木糖赖氨酸脱氧胆盐平板，培养温度为37℃，培养时间为36～48小时。

本发明内容还包括所述的Peg菌毛的操纵子peg基因、所述的表达盒、重组载体、重组菌株或细胞、所述的鸡伤寒沙门菌弱毒分离株(Salmonella Gallinarum)SGOP在制备预防或治疗动物的鸡沙门氏菌感染的禽伤寒的药物或药物组合物中的应用。

其中，所述药物或药物组合物为疫苗。

本发明内容还包括一种鸡伤寒沙门菌弱毒疫苗，所述鸡伤寒沙门菌弱毒疫苗包括所述的Peg菌毛的操纵子peg基因、所述的表达盒、重组载体、重组菌株或细胞、所述的鸡伤寒沙门菌弱毒分离株(Salmonella Gallinarum)SGOP。

其中，所述疫苗为口服疫苗或注射剂疫苗。

具体地，本发明通过对1日龄SPF鸡的感染性试验评估鸡伤寒沙门菌弱毒分离株SGOP的安全性，该分离株以口服途径，1×10¹⁰CFU剂量接种1日龄SPF鸡后14天内未出现临床症状，接种后第15天剖检未发现任何大体病理变化，采集心脏、肝脏和脾脏组织制备病理切片也未发现任何显微病理变化。

具体地，本发明以鸡伤寒沙门菌野毒株U20对上述鸡伤寒沙门菌弱毒分离株SGOP进行攻毒保护效力评估，该分离株以口服途径，5×10⁹CFU剂量接种1日龄SPF鸡21天后，以腹腔注射途径，1×10¹⁰CFU剂量接种鸡伤寒沙门菌野毒株U20。该分离株能提供70％的攻毒保护效力。

本发明还提供了鸡伤寒沙门菌弱毒分离株SGOP安全性和攻毒保护效力评估试验中临床症状、大体病理变化评分体系。

临床症状包括精神症状和腹泻症状，其中精神症状评分包括：0分：活跃且正常休眠；1分：对声音反应迟钝、喜卧；2分：易困倦、嗜睡、常静止不动；3分：虚弱无法站立、对声音无反应。腹泻症状包括：0分：鸡粪颜色正常并且成型；1分：肛周污染粪便；2分：灰白色黏液样稀粪；3分：绿色稀粪或封肛。

病理变化包括心脏结节、肝脏坏死点和脾脏坏死点。其中心脏结节病变评分包括：0分：0个；1分：1个；2分：1～5个；3分：大于5个。肝脏坏死点病变评分包括：0分：0个；1分：1个；2分：1～10个；3分：大于10个。脾脏坏死点病变评分包括：0分：0个；1分：1个；2分：1～5个；3分：大于5个。

本发明还提供鸡伤寒沙门菌弱毒分离株SGOP安全性和攻毒保护效力评估试验中的鸡伤寒发病观察参数及鸡伤寒发病判定标准。

鸡伤寒发病观察参数包括(1)死亡；(2)观察周期内有一天(或以上)临床症状(精神沉郁症状或腹泻症状)评分不低于2分或者观察周期内连续三天(或以上)临床症状(精神沉郁症状或腹泻症状)评分不低于1分；(3)大体剖检后心脏、肝脏或脾脏病理变化评分不低于1分。

鸡伤寒发病判定标准：出现(1)或者同时(2)和(3)即判定为发病。

本发明内容还包括饲料添加剂，所述饲料添加剂包括所述的Peg菌毛的操纵子peg基因、所述的表达盒、重组载体、重组菌株或细胞、所述的鸡伤寒沙门菌弱毒分离株(Salmonella Gallinarum)SGOP。

有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：本发明公开的靶向一种带有生物标记(不表达Peg菌毛)的鸡伤寒沙门菌弱毒分离株(SGOP)，其本身具备沙门菌弱毒活疫苗的优点(能诱导机体体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫应答，诱导持续性较长时间免疫应答)。在本发明中，口服接种1×10¹⁰CFU剂量的SGOP株对1日龄SPF鸡无任何致病性，并且SGOP株免疫接种1日龄SPF鸡(5×10⁹CFU剂量，口服途径)，21天后免疫鸡群能抵抗鸡伤寒沙门菌野毒株U20(1×10¹⁰CFU剂量，腹腔注射途径)的攻毒，70％的攻毒鸡群不发病而得到保护。此外，我们还能通过表达沙门菌Peg菌毛的凝集抗原，将不表达Peg菌毛的SGOP株免疫接种鸡群和表达Peg菌毛的鸡伤寒沙门菌野毒株(U20和U21)感染鸡群区分开来。综上所述，SGOP株安全性较高，并且不会影响禽源沙门菌的监测净化程序，具有应用于临床防控鸡伤寒沙门菌感染及其标记性弱毒疫苗候选株较大潜力。

附图说明

图1为本发明实施例1中16S rDNA引物扩增SGOP分离株基因组后电泳结果图；M泳道；Trans 5K DNA Marker；泳道1和2：鸡伤寒沙门菌分离株SGOP。

图2为本发明实施例1中SG引物扩增SGOP分离株基因组后电泳结果图；M泳道：DL500DNA Marker；泳道1：鸡伤寒沙门菌野毒株U20；泳道2：鸡伤寒沙门菌分离株SGOP。

图3为本发明实施例2中peg引物扩增SGOP分离株基因组后电泳结果图。M泳道：DL2000DNA Marker；泳道1：鸡伤寒沙门菌野毒株U20；2：鸡伤寒沙门菌弱毒分离株SGOP。

图4为本发明实施例3中SGOP分离株安全性评估试验的显微病理变化结果图。

图5为本发明实施例5中SGOP分离株攻毒保护效力评估试验的显微病理变化结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

本发明实施例中利用的表达沙门菌Peg菌毛的凝集抗原S9-P(专利号：ZL202010400163.4)由本发明申请人实验室提供。

实施例1鸡伤寒沙门菌SGOP株的分离与鉴定

本实施例分离一株鸡伤寒沙门菌自然弱毒株，包括步骤：无菌采集健康鸡(源自江苏省无锡市一规模化禽养殖场)心脏、肝脏、脾脏等脏器于无菌培养皿中，剪碎组织后研磨，并加入5mL 0.01M无菌PBS(pH7.2)，吸取1mL组织匀浆液加入9mL缓冲蛋白胨水(BPW)中，37℃过夜培养。吸取1mL培养液接种于9mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)中进行选择性培养过夜。吸取10μL培养液划线分别接种于木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)平板和LB平板上，37℃培养36～48小时。结果显示，该分离株能在XLD平板上形成针尖状并具有黑色中心的菌落，在LB平板上形成针尖状的黄白色粗糙型的菌落。分离株命名为SGOP，并记为第1代次。

制备SGOP分离株的DNA模板，采用已报道的16S rDNA基因通用引物进行扩增，引物序列见表1。扩增后电泳图见图1，扩增得到约1450bp产物。利用用琼脂糖凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化回收。将回收产物溶解于30μL的高压灭菌超纯水中，测其回收DNA浓度。回收产物进行T-A克隆后通过化学转化法转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞后于氨苄青霉素抗性LB固体培养基进行筛选。挑取氨苄抗性选择性平板长出的单菌落，接种4mL液体LB培养基，过夜摇菌，36℃过夜摇菌。提取质粒，并通过1.5％琼脂糖凝胶电泳验证，验证正确后用琼脂糖凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化回收，回收产物送测序。测序结果利用NCBI进行BLAST比对。测序结果显示，SGOP分离株16S rDNA序列与NCBI公布的鸡伤寒沙门菌(登录号：EU073018.1)16S rDNA序列同源性为99％。

本发明的鸡伤寒沙门菌弱毒分离株(Salmonella Gallinarum)SGOP已经保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2022580，保藏地址为中国武汉。

利用已报道的1对沙门菌种属鉴定引物(SG)对分离株进行特异性血清型鉴定，同时设置鸡伤寒沙门菌野毒株U20阳性对照，引物序列为见表1。血清特异性PCR鉴定结果见图2，SG引物对扩增出174bp相应片段，最终确定分离株为鸡伤寒沙门菌。

利用沙门菌菌属诊断血清对鸡伤寒沙门菌分离株SGOP进行血清学鉴定，并以鸡伤寒沙门菌野毒株U20作为对照。血清学鉴定结果见表2，鸡伤寒沙门菌野毒株U20与O1单因子血清、O9单因子血清和O12单因子血清均产生凝集反应，而鸡伤寒沙门菌分离株SGOP与以上血清均不产生凝集反应。

表1试验所用引物

表2分离株SGOP和野毒株U20与O单因子血清凝集结果

注：“-”表示阴性结果，不发生凝集反应。“+”表示阳性结果，发生凝集反应。

实施例2 SGOP分离株的全基因组测序及验证

挑取鸡伤寒沙门菌分离株SGOP单菌落(第1代次)，接种在8mL液体LB培养基中，置于37℃摇床，震摇过夜。次日取出后，将培养物全部转移至800mL液体LB培养基中，分装至50mL离心管中，4000rpm离心10min弃去上清，收集菌体。重复上述操作，直至收集到10g菌体。置于干冰中，运送至深圳千年盛世基因科技公司完成基因组DNA的提取。对鸡伤寒沙门菌分离株SGOP基因组DNA进行三代测序文库制备，使用PacBio RS II(PacificBiosciences，USA)进行测序、SMRT分析系统2.3.0(Pacific Biosciences，USA)对原始读长进行质量检测。使用Canu进行序列组装。拼接好的序列与NCBI上已上传的鸡伤寒沙门菌287/91株(GeneBank：GCA_000009525.1)基因组序列进行比较。其中测得的鸡伤寒沙门菌分离株SGOP编码Peg菌毛的操纵子peg基因序列见序列表SEQ ID NO：1所示。

鸡伤寒沙门菌分离株SGOP全基因组测序结果显示，编码Peg菌毛的操纵子peg基因序列第131～393位缺失，编码基因不完整，无法表达Peg菌毛。为验证测序结果，我们设计了一对扩增peg部分基因序列的引物对并以鸡伤寒沙门菌U20野毒株作为阳性对照进行验证，即上游引物：5’-ggagaagtggtgggaacatc-3’和下游引物：5’-cttacttgaattcagagtgt-3’。PCR扩增结果见图3，鸡伤寒沙门菌U20野毒株扩增出420bp片段，而鸡伤寒沙门菌分离株SGOP分离株扩增片段为158bp。

实施例3 SGOP分离株的安全性评估

取30只1日龄SPF鸡，其中10只鸡作为鸡伤寒沙门菌分离株SGOP接种组，10只鸡作为鸡伤寒沙门菌U20野毒株接种组，10只鸡作为PBS对照组。SGOP株接种组每只鸡口服途径接种1×10¹⁰CFU剂量SGOP株(第1代次)，U20株接种组每只鸡口服途径接种1×10¹⁰CFU剂量U20株，而PBS对照组每只鸡口服0.2mL 0.01M无菌PBS(pH7.2)。接种后连续观察14天是否出现临床症状(包括精神症状和腹泻症状)并记录、评分，于第15天进行处死所有鸡只并剖检，观察心脏、肝脏和脾脏组织大体病理变化并记录、评分。采集所有试验鸡的心脏、肝脏和脾脏组织制备病理切片观察显微病理变化。

临床症状和病理变化评分数据均以平均值±平均值标准误(SEM)表示。利用SPSS25.0软件中的One-way ANOVA统计学方法进行临床症状和病理变化显著差异分析；PBS对照组、鸡伤寒沙门菌弱毒分离株SGOP接种组和鸡伤寒沙门菌野毒株U20接种组的临床症状以及病理变化平均评分之间进行多重比较。

临床症状包括精神症状和腹泻症状，其中精神症状评分包括：0分：活跃且正常休眠；1分：对声音反应迟钝、喜卧；2分：易困倦、嗜睡、常静止不动；3分：虚弱无法站立、对声音无反应。腹泻症状包括：0分：鸡粪颜色正常并且成型；1分：肛周污染粪便；2分：灰白色黏液样稀粪；3分：绿色稀粪或封肛。病理变化包括心脏结节、肝脏坏死点和脾脏坏死点。其中心脏结节病变评分包括：0分；0个；1分：1个；2分：1～5个；3分：大于5个。肝脏坏死点病变评分包括：0分：0个；1分：1个；2分：1～10个；3分：大于10个。脾脏坏死点病变评分包括：0分：0个；1分：1个；2分：1～5个；3分：大于5个。

鸡伤寒发病观察参数包括(1)死亡；(2)观察周期内有一天(或以上)临床症状(精神沉郁症状或腹泻症状)评分不低于2分或者观察周期内连续三天(或以上)临床症状(精神沉郁症状或腹泻症状)评分不低于1分；(3)大体剖检后心脏、肝脏或脾脏病理变化评分不低于1分。鸡伤寒发病判定标准：出现(1)或者同时(2)和(3)即判定为发病。

结果显示，PBS对照组和鸡伤寒沙门菌弱毒分离株SGOP接种组鸡群均未出现临床症状(包括精神症状和腹泻症状)，精神症状评分和腹泻评分均为0(表3)，平均评分均为0.00±0.00(表5)。相比之下，鸡伤寒沙门菌野毒株U20接种组有9只鸡(9/10)表现出中度的精神沉郁和腹泻症状(表3和表5)，平均评分分别为0.24±0.04和0.52±0.33。

接种后第15天对所有鸡只进行剖检，结果显示U20株接种组有8只鸡(8/10)出现严重的心脏结节、肝脏坏死点或脾脏坏死点病理变化，平均评分分别为1.00±0.30、1.00±0.42和0.20±0.20。相比之下，PBS对照组和鸡伤寒沙门菌弱毒分离株SGOP接种组未表现任何心脏、肝脏或脾脏病理变化，平均评分均为0.00±0.00(表4和表5)。显微病理结果显示，PBS对照组和鸡伤寒沙门菌弱毒分离株SGOP接种组鸡群的心脏、肝脏和脾脏等组织未发现病理变化(图4)。鸡伤寒沙门菌野毒株U20接种组鸡群的心脏出现淋巴细胞浸润，肝脏出现肝细胞灶性坏死，淋巴细胞浸润肝实质以及脾红髓中出现多形核中性粒细胞等显微病理变化(图4)。

根据鸡伤寒发病判定标准，鸡伤寒沙门菌分离株SGOP接种组(口服途径接种)发病率为0％，而鸡伤寒沙门菌野毒株U20接种组(口服途径接种1×10¹⁰CFU剂量)发病率为90％。

表3分离株SGOP的安全性评估试验每日临床症状评分表

PBS对照组：动物编号1～10；

鸡伤寒沙门菌野毒株U20接种组：动物编号11～20；

鸡伤寒沙门菌分离株SGOP接种组：动物编号21～30。

表4分离株SGOP的安全性评估试验病理变化评分表

PBS对照组：动物编号1～10；

鸡伤寒沙门菌野毒株U20接种组：动物编号11～20；

鸡伤寒沙门菌分离株SGOP接种组：动物编号21～30。

表5分离株SGOP的安全性评估试验临床症状和病理变化平均评分

对同列三组数据进行单因素方差分析并进行多重比较，相同字母代表两数据之间至少5％的显著性差异。

实施例4 SGOP分离株体外传代不同代次菌株的安全性评估

挑取鸡伤寒沙门菌分离株SGOP单菌落(第1代次)，接种在4mL LB液体培养基，37℃条件下进行振摇培养，次日以1∶100比列吸取40μL SGOP菌液(第二代次)至新的4mL LB液体培养基进行连续传代，直至传到第20代次。

取50只1日龄SPF鸡，其中10只鸡作为鸡伤寒沙门菌分离株SGOP第5代次接种组；10只鸡作为鸡伤寒沙门菌分离株SGOP第10代次接种组；10只鸡作为鸡伤寒沙门菌分离株SGOP第15代次接种组；10只鸡作为鸡伤寒沙门菌分离株SGOP第20代次接种组，10只鸡作为PBS对照组。鸡伤寒沙门菌分离株SGOP第5、10、15和20代次接种组的每只鸡以口服途径接种1×10¹⁰CFU剂量相应代次的SGOP株，而PBS对照组每只鸡口服0.2mL 0.01M无菌PBS(pH7.2)。接种后连续观察14天是否出现临床症状(包括精神症状和腹泻症状)并记录、评分，于第15天进行处死所有鸡只并剖检，观察心脏、肝脏和脾脏组织大体病理变化并记录、评分。临床症状和病理变化评分标准、显著差异分析方法和鸡伤寒发病判定标准同实施例3中所述。

结果显示，PBS对照组和鸡伤寒沙门菌弱毒分离株SGOP第5、10、15和20代次接种组鸡群均未出现临床症状(包括精神症状和腹泻症状)，精神症状评分和腹泻评分均为0(表6)，平均评分均为0.00±0.00(表8)。接种后第15天对所有鸡只进行剖检，结果显示PBS对照组和鸡伤寒沙门菌弱毒分离株SGOP第5、10、15和20代次接种组所有鸡只未表现任何心脏、肝脏或脾脏病理变化，平均评分均为0.00±0.00(表7和8)。

表6分离株SGOP的安全性评估试验每日临床症状评分表

PBS对照组：动物编号31～40；

鸡伤寒沙门菌分离株SGOP第5代次接种组：动物编号41～50；

鸡伤寒沙门菌分离株SGOP第10代次接种组：动物编号51～60；

鸡伤寒沙门菌分离株SGOP第15代次接种组：动物编号61～70；

鸡伤寒沙门菌分离株SGOP第20代次接种组：动物编号71～80。

表7分离株SGOP的安全性评估试验病理变化评分表

PBS对照组：动物编号31～40；

鸡伤寒沙门菌分离株SGOP第5代次接种组：动物编号41～50；

鸡伤寒沙门菌分离株SGOP第10代次接种组：动物编号51～60；

鸡伤寒沙门菌分离株SGOP第15代次接种组：动物编号61～70；

鸡伤寒沙门菌分离株SGOP第20代次接种组：动物编号71～80。

表8分离株SGOP的安全性评估试验临床症状和病理变化平均评分

实施例5 SGOP分离株的攻毒保护效力评估

取30只1日龄SPF鸡，其中10只鸡作为鸡伤寒沙门菌分离株SGOP免疫组，10只鸡作为鸡伤寒沙门菌野毒株U20攻毒对照组，10只鸡作为PBS对照组。鸡伤寒沙门菌分离株SGOP免疫组每只鸡以口服途径接种5×10⁹CFU剂量SGOP株而PBS对照组每只鸡口服0.2mL 0.01M无菌PBS(pH7.2)。免疫接种21天后，鸡伤寒沙门菌分离株SGOP免疫组和鸡伤寒沙门菌野毒株U20攻毒对照组所有鸡通过腹腔注射途径接种1×10¹⁰CFU剂量的U20株。攻毒后连续观察14天是否出现临床症状(包括精神症状和腹泻症状)并记录、评分，于攻毒第15天进行处死所有鸡只并剖检，观察心脏、肝脏和脾脏组织大体病理变化并记录、评分。采集所有试验鸡的心脏、肝脏和脾脏组织制备病理切片观察显微病理变化。临床症状和病理变化评分标准、显著差异分析方法和鸡伤寒发病判定标准同实施例3中所述。

结果显示，PBS对照组鸡群未出现临床症状(包括精神症状和腹泻症状)，精神症状评分和腹泻评分均为0(表9)，平均评分均为0.00±0.00(表9)。鸡伤寒沙门菌分离株SGOP免疫组在U20株攻毒后有3只鸡(3/10)表现出轻度的精神沉郁和腹泻症状，平均评分分别为0.19±0.12和0.21±0.11，与PBS对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。相比之下，鸡伤寒沙门菌野毒株U20攻毒组有10只鸡(9/10)表现出中度的精神沉郁和腹泻症状(表9和表10)，平均评分分别为0.38±0.08和0.78±0.09。

攻毒后第15天对所有鸡只进行剖检，结果显示鸡伤寒沙门菌野毒株U20攻毒组有10只鸡(10/10)出现严重的心脏结节、肝脏坏死点或脾脏坏死点病理变化，平均评分分别为1.10±0.20、1.60±0.38和0.70±0.15。相比之下，鸡伤寒沙门菌分离株SGOP免疫组仅有3只鸡(3/10)表现出轻度的心脏结节、肝脏坏死点或脾脏坏死点病理变化，平均评分分别为0.50±0.21、0.40±0.33和0.30±0.22(表10和表11)。显微病理结果显示，PBS对照组鸡群的心脏、肝脏和脾脏等组织未发现病理变化(图5)。而鸡伤寒沙门菌野毒株U20攻毒对照组鸡群的心脏出现心肌细胞大量坏死并有淋巴细胞浸润到心脏实质，肝脏出现大量淋巴细胞浸润肝实质以及脾脏红髓中淋巴细胞点状聚集、条状分布等显微病理变化(图5)。相比之下，鸡伤寒沙门菌分离株SGOP免疫组鸡群无明显显微病理变化(图5)。

根据鸡伤寒发病判定标准，鸡伤寒沙门菌野毒株U20以腹腔注射途径，1×10¹⁰CFU剂量攻毒后，鸡伤寒沙门菌分离株SGOP株免疫组发病率为30％，而鸡伤寒沙门菌野毒株U20攻毒对照组鸡群发病率为100％。综上所述，1日龄SPF鸡口服免疫5×10⁹CFU剂量的鸡伤寒沙门菌SGOP株21天后能对鸡伤寒沙门菌野毒株U20的攻毒(腹腔注射途径，1×10¹⁰CFU剂量)提供70％的攻毒保护效力。

表9分离株SGOP的攻毒保护效力评估试验攻毒后鸡群每日临床症状评分表

PBS对照组：动物编号81～90；

鸡伤寒沙门菌野毒株U20接种组：动物编号91～100；

鸡伤寒沙门菌分离株SGOP接种组：动物编号101～110。

表10分离株SGOP的攻毒保护效力评估试验剖检后鸡群大体病理变化评分表

PBS对照组：动物编号81～90；

鸡伤寒沙门菌野毒株U20接种组：动物编号91～100；

鸡伤寒沙门菌分离株SGOP接种组：动物编号101～110。

表11分离株SGOP的攻毒保护效力评估试验临床症状和病理变化平均评分

对同列三组数据进行单因素方差分析并进行多重比较，相同字母代表两数据之间至少5％的显著性差异。

实施例6 SGOP分离株免疫血清与沙门菌野毒株感染血清鉴别检测

取40只1日龄SPF鸡，其中10只鸡作为鸡伤寒沙门菌分离株SGOP接种组(动物编号：111-120)，10只鸡作为鸡伤寒沙门菌野毒株U20接种组(动物编号：121-130)，10只鸡作为鸡伤寒沙门菌野毒株U21接种组(动物编号：131-140)，10只鸡作为PBS对照组(动物编号：141-150)。SGOP株接种组和U20株接种组鸡群分别以口服途径，接种5×10⁹CFU剂量的SGOP株和U20株，而PBS对照组每只鸡口服0.2mL 0.01M无菌PBS(pH7.2)。所有鸡群在接种后每周采血并分离血清，持续5周，并利用本发明申请人实验室提供的表达沙门菌Peg菌毛的凝集抗原S9-P(专利号：ZL202010400163.4)进行凝集反应测试。具体为：取5μL待检血清和5μL S9-P凝集抗原于干净载玻片上，混匀后2min内观察凝集反应结果，若出现凝集颗粒则记为阳性，反之则记为阴性。

结果显示，PBS对照组鸡群在接种后5周内均未与S9-P凝集抗原均出现阳性反应。SGOP分离株组、U20野毒株组和U21野毒株组接种鸡群在接种后1周采集的血清均未与S9-P凝集抗原出现阳性反应(表12)。值得注意的是，S9-P凝集抗原仅与U20和U21野毒株组鸡群接种后2～5周采集的血清呈现阳性反应，不与SGOP分离株组鸡群接种后采集的血清呈现阳性反应(表12)。上述结果表明，SGOP分离株免疫接种鸡群，2～5周后采集的免疫鸡群血清能与鸡伤寒沙门菌野毒株U20感染鸡群2～5周后采集的血清相区分。同样，SGOP分离株免疫接种后产生的血清抗体也能与其它鸡伤寒沙门菌野毒株(U21)感染鸡群的血清相区分。

表12利用S9-P凝集抗原对SGOP分离株免疫血清与沙门菌野毒株感染血清鉴别检测

“-”：阴性反应；“+”：阳性反应。

Claims (9)

1.一种不表达Peg菌毛的鸡伤寒沙门菌弱毒分离株（Salmonella Gallinarum）SGOP，其特征在于：所述鸡伤寒沙门菌分离株（Salmonella Gallinarum）SGOP于2022年 5月10日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：M 2022580，保藏地址为中国武汉。

2.根据权利要求1所述的鸡伤寒沙门菌弱毒分离株（Salmonella Gallinarum）SGOP，其特征在于，所述鸡伤寒沙门菌弱毒分离株（Salmonella Gallinarum）SGOP与沙门菌O1、O9和O12单因子血清均不产生凝集反应。

3.根据权利要求1所述的鸡伤寒沙门菌弱毒分离株（Salmonella Gallinarum）SGOP，其特征在于，所述鸡伤寒沙门菌弱毒分离株（Salmonella Gallinarum）SGOP编码Peg菌毛的操纵子peg基因序列的第131~393位缺失。

4.权利要求1所述的鸡伤寒沙门菌弱毒分离株（Salmonella Gallinarum）SGOP的培养方法，其特征在于，将鸡伤寒沙门菌弱毒分离株（Salmonella Gallinarum）SGOP的单菌落挑取少量划线于LB平板或木糖赖氨酸脱氧胆盐平板，培养温度为37℃，培养时间为36~48小时。

5.权利要求1 ~3任一项所述的鸡伤寒沙门菌弱毒分离株（Salmonella Gallinarum）SGOP在制备预防或治疗动物的鸡沙门氏菌感染的禽伤寒的药物或药物组合物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物或药物组合物为疫苗。

7.一种鸡伤寒沙门菌弱毒疫苗，其特征在于，所述鸡伤寒沙门菌弱毒疫苗包括权利要求1 ~3任一项所述的鸡伤寒沙门菌弱毒分离株（Salmonella Gallinarum）SGOP。

8.根据权利要求7所述的鸡伤寒沙门菌弱毒疫苗，其特征在于，所述疫苗为口服疫苗或注射剂疫苗。

9.饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂包括权利要求1~3任一项所述的鸡伤寒沙门菌弱毒分离株（Salmonella Gallinarum）SGOP。

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