CN102154184B

CN102154184B - 减毒沙门氏菌及其应用

Info

Publication number: CN102154184B
Application number: CN201110061628A
Authority: CN
Inventors: 刘思国; 刘慧芳; 王秀梅; 于申业; 王牟平; 司薇; 杨志
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2011-03-15
Filing date: 2011-03-15
Publication date: 2012-09-26
Anticipated expiration: 2031-03-15
Also published as: CN102154184A

Abstract

本发明公开了减毒沙门氏菌及其应用。本发明应用基因敲除技术，删除掉沙门氏菌(Salmonella pullorum)的体内定植基因和主要毒力基因，获得了双基因缺失的减毒沙门氏菌SM091-DED株，其微生物保藏号是：CGMCC NO.4604。本发明减毒沙门氏菌毒力呈显著降低，接种后在宿主体内定植时间短；同群感染试验表明其无水平传播能力；对同型和异型强毒力沙门氏菌提供完全的交叉保护作用，SPF雏鸡免疫后可有效清除强毒力菌株感染，而且不引起同群感染，本发明为预防禽沙门氏菌病提供了安全、免疫原性好、低毒力的禽沙门氏菌病的减毒活疫苗。

Description

减毒沙门氏菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株沙门氏菌，尤其涉及一株经基因敲除后获得的减毒沙门氏菌(Salmonella pullorum)SM091-DED及其构建方法，本发明还涉及该减毒沙门氏菌作为制备预防禽沙门氏菌病的药物中的用途，属于禽沙门氏菌病的防治领域。

背景技术

动物性食品安全问题不仅关系到消费者的健康问题，也影响着社会公共卫生安全。沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一，其病原沙门氏菌属肠道细菌科，沙门氏菌不但引起禽类感染，也会引起人的细菌性感染，进而导致食物中毒和急性肠胃炎等疾病。沙门氏菌在鸡、鸭、猪、牛、羊等各种动物肉类中都有存在，特别是鸡的沙门氏菌的携带率高达50％。据统计，在世界各国细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。中国内陆地区也以沙门氏菌为首位，沙门氏菌已经变成了食品中毒的同义词。在20世纪80年代早期到晚期，有五分之一的传染病是在家禽中产生，而一半以上零售的禽肉被沙门氏菌污染。据世界卫生组织报告，1985年以来，在世界范围内，由沙门氏菌引起的已确诊的人类患病人数显著增加，在一些欧洲国家已增加五倍以上。在美国，1983至1987年之间，有超过三分之一的人类沙门氏菌病的爆发与家禽肉和蛋有关。1985至1996年之间，可归因于特定食品媒介所致的肠炎沙门氏菌病的爆发中，有79％的病例与鸡蛋有关。每年因食物源性沙门氏菌感染人所造成的损失高达35亿美元，单纯由肠炎沙门氏菌一个血清型所致的损失也有8.7亿美元之多，尤其是2010年8月份美国召回沙门氏菌污染的3.8亿枚鸡蛋，更凸显了沙门氏菌在食品安全方面的重要性。因此，研制安全有效的疫苗被认为是控制和减少禽沙门氏菌污染的最有效和安全的方法。

与常规的灭活疫苗或亚单位疫苗相比，减毒活疫苗具有使用方便及免疫原性好等优点。在减毒活疫苗的研究方面，国外已经做了很多工作。最早的减毒沙门菌活疫苗是鸡伤寒沙门菌9R突变株，该株是野生型鸡伤寒沙门菌9R株的粗糙型突变体，该突变株可诱导成年鸡对鸡伤寒沙门菌野生型感染的保护性免疫反应，但具残余毒性，可致肝、脾损害，并可在体内滞留数周、数月并经蛋进行传播。Barroow等进一步将野生型9R株的毒力质粒消除，肌注免疫后可诱导对野生型菌株的口服攻击，但效果不如9R株。Cooper等对肠炎沙门菌aroA突变株对家禽的免疫效果进行了系统的试验研究，aroA突变株经口感染1日龄雏鸡后可在小肠定居，并可在盲肠繁殖，但不引起病症，同时诱导抗野生型的保护性免疫反应。Tan等以鼠伤寒沙门菌的aroA突变活疫苗免疫鸡，然后再以野生型鼠伤寒沙门菌或肠炎沙门菌攻毒，发现疫苗株在粪便中存活不超过26d，但免疫后不能减少粪便中野生型鼠伤寒沙门菌或肠炎沙门菌的排出量。Parker等以aroA鼠伤寒沙门菌疫苗接种鸡，然后以致病性肠炎沙门菌攻毒，免疫鸡与未免疫鸡相比，免疫鸡的卵巢、输卵管和盲肠内容物中的细菌数更少，但差异不显著。目前研制出的Megan Vac I疫苗是cya和crp基因突变的鼠伤寒沙门菌，家禽口服接种疫苗后，可以特异性地降低沙门菌感染，产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答，显著降低野生型菌株在禽体内的重新定殖，而且还可以产生交叉保护。种鸡群接种Megan Vac I疫苗后，可产生持久的、具有保护性的母源抗体，大大降低了沙门菌污染鸡蛋的可能性。X3985是cya/crp基因缺失的菌株，这种突变株已被美国农业部做为抗鸡的沙门菌感染的疫苗。鼠伤寒的purE株在家禽表现出良好的免疫效果，目前在德国较为广泛地使用。

现有的这些疫苗株均能够在宿主体内定植，这仍对环境和食品安全造成一定的影响。因此，研制和开发一种在宿主体内定植时间短、免疫原性好的安全活疫苗是非常重要的。

发明内容

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一株在宿主体内定植时间短、免疫原性好的减毒沙门氏菌；

本发明所要解决的另一个技术问题是将构建得到的减毒沙门氏菌作为疫苗株应用于预防禽沙门氏菌病。

本发明所要解决的上述技术问题是通过以下技术方案来实现的：

本发明以禽白痢沙门氏菌为研究对象，应用基因敲除技术，删除掉沙门氏菌的体内定植基因和主要毒力基因，获得了减毒沙门氏菌(Salmonellapullorum)SM091-DED株，其微生物保藏号是：CGMCC NO.4604；其分类命名是：鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是：2011年2月23日。

本发明通过试验发现，该沙门氏菌(Salmonella pullorum)SM091-DED株毒力显著降低，接种后在宿主体内定植时间短，为10天左右，远低于国外报道；同群感染试验表明无水平传播能力，达到或超过国外的同类产品水平；对同型和异型强毒力沙门氏菌提供完全的交叉保护作用，SPF雏鸡免疫后可有效清除强毒力菌株感染，而且不能够引起同群感染，为预防禽沙门氏菌病，提供安全、免疫原性好、低毒力的禽沙门氏菌病的减毒活疫苗。

将本发明减毒禽沙门氏菌(Salmonella pullorum)SM091-DED株经过LB培养基37℃后，收集细菌，冻干后得到减毒禽沙门氏菌疫苗。此外，本发明所制备的疫苗不需要进行浓缩即可应用。而且，本发明制备疫苗可以使用发酵罐，经过程序的设定，可以完全达到自动化和规模化生产。

安全性实验结果表明，本发明所制备的禽减毒沙门氏菌疫苗安全性好，接种后的各鸡只无不良反应。

免疫保护试验结果表明，接种本发明禽减毒沙门氏菌疫苗后，可显著提高各免疫雏鸡体内的抗体含量，能有效保护各免疫雏鸡不受禽沙门氏菌的攻击，说明本发明禽沙门氏菌减毒疫苗具有良好的免疫保护效果。

附图说明

图1禽减毒沙门氏菌(Salmonella pullorum)SM091-DED株的生化试验观察结果；A：突变株；B：亲本株；C：对照管；1.葡萄糖；2.赖氨酸；3.鸟氨酸；4.氨对；5.硫化氢；6.乳酸；7.卫矛醇；8.枸橼酸盐；9.甲基红；10.VP。

图2禽减毒沙门氏菌(Salmonella pullorum)SM091-DED株的生长曲线观察结果；每隔30min取样一次，进行OD600的测定，突变株与亲本株相比变化不大。

图3融合PCR扩增产物的电泳鉴定；(A)，重组菌(SM091ΔCpxr::cat)的PCR鉴定(B)第一次同源重组菌(SM091ΔCpxr::cat)的PCR鉴定；(C)第二次位点特异性重组菌SM091ΔCpxr的鉴定；A1：阴性对照，A2：PCR产物；B1：重组(SM091ΔCpxr::cat)菌株；B2：野生菌株SM091；B3：阴性对照；C1：野生型SM091，C2：重组菌株(SM091ΔCpxr::cat)，C3：SM091ΔCpxr突变株，M：DL2000。

图4免疫后第2天细菌的分离情况：亲本株的肝脏和脾脏都分离到菌，基因缺失株的肝脏、脾脏和盲肠也分离到菌。

图5免疫后第4天细菌的分离情况：亲本株的肝脏和脾脏都分离到菌，基因缺失株的只在脾脏分离到菌。

图6免疫后第6天细菌的分离情况：亲本株的脾脏分离到菌，基因缺失株的肝脏和脾脏分离到菌。

图7免疫后第8天细菌的分离情况：亲本株的脾脏分离到菌，基因缺失株也是脾脏也分离到菌。

图8免疫后第10天细菌的分离情况：亲本株的脾脏和盲肠分离到菌，基因缺失株已经分离不到菌。

图9免疫后第12天细菌的分离情况：亲本株的脾脏和盲肠分离到菌，基因缺失株没有分离到菌。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1双基因缺失减毒沙门氏菌(Salmonella pullorum)SM091-DED株的构建

1、试验材料和方法

1.1菌株与质粒

禽沙门氏菌菌株由本发明人实验室分离鉴定，命名为SM091。质粒pKD46(温度敏感型，含有受阿拉伯糖启动子调控的gam，bet和exo基因，Ampr)，pKD3(含有两边带有FRT位点的氯霉素抗性基因，Cmr)，pCP20(温度敏感型，编码FLP重组酶，可专一识别FLP位点)。

1.2试剂

dNTP、Taq DNA聚合酶购自MBI公司，质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司，DNA胶回收试剂盒购自上海华舜公司，L-阿拉伯糖购自Sigma公司，引物合成由南京博亚公司完成。

1.3双基因缺失减毒沙门氏菌的构建方法

1.3.1引物设计

用于同源重组的引物P1-C1、P2-C2(SEQ ID No.1：P1-C1-F：

5-ATGAATAAAATCCTGTTAGTTGATGATGACCGAGAGCTGACTTCCCTGTTAAAAGAGCGATTGTGTAGGCTGGAG-3；SEQ ID No.2：P2-C2-R：

5-TCATGAAGCGGAAACCATCAGATAGCCGCGACCACGCAATGTTTTAAACCACGGGTTAACGGCTGACATGGGAATTAG-3)分别由两部分组成，5’端加下划线的序列与Cpxr基因两翼序列同源，3’端未加下划线的序列与质粒pKD3上氯霉素抗性基因cat两侧序列互补，产物片段长度为1149bp，胶回收后用于电转化。在沙门氏菌染色体上Cpxr基因同源重组区域外侧，设计引物P3(SEQ IDNo.3：5-TTGATGATGACCGAGAGCTGAC-3)；P4(SEQ ID No.4：5-GAAGCGGAAACCATCAGATAGC-3)用于鉴定Cpxr基因缺失突变菌株，该引物之间的序列在野生菌株中是699bp，Cpxr被氯霉素抗性基因置换后应为1239bp，氯霉素抗性基因被敲除后长309bp，通过此引物作PCR扩增可初步鉴定菌株的基因型。

1.3.2感受态细胞制备和电击转化

将编码Red重组系统的pKD46质粒转化到沙门氏菌SM091中，构建成SM091/pKD46菌株。将菌株于30℃培养过夜后，按1∶100转接到含氨苄青霉素的LB培养基中于30℃继续培养至OD600nm为0.5～0.6。培养过程中，在终止前不同时间加入不同浓度的L-阿拉伯糖来诱导Red重组系统的表达，离心收集菌体，用高压灭菌去离子水洗涤1次，再用10％的灭菌甘油洗涤2次，最后以1∶200体积的10％的灭菌甘油重悬细胞。制备好的感受态细胞直接用于转化实验。

用浓度不低于200ng/uL的线性DNA片段转化感受态细胞。电击参数为：电阻200Ω，电容25uF，电压1.8KV。向电击后的细胞中快速加入1mL SOC培养基，160r/min培养1.5h，然后涂布培养于含有氯霉素的LB平板上。12h后用PCR法鉴定长出的氯霉素抗性克隆。得到的重组菌命名为SM091ΔCpxr::cat。

1.3.3氯霉素抗性基因的去除

将编码FLP位点特异性重组酶的pCP20质粒导入氯霉素抗性的感受态细胞，于含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆，然后转入42℃培养12h左右，即可获得不含质粒pCP20和氯霉素基因的缺失突变体。该沙门氏菌突变体命名为SM091ΔCpxr。

2试验结果

2.1融合PCR产物的制备

以质粒pKD3做为模板，P1-C1、P2-C2为引物，扩增出两端与Cpxr基因上下游序列同源，中间为氯霉素抗性基因cat的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳鉴定大约为1149bp，与预期值一致，如图3(A)所示。

2.2第一次同源重组菌(SM091ΔCpxr::cat)的PCR鉴定

融合PCR产物电转化至已含有pKD46的大肠杆菌中，在含有氯霉素的平板上，37℃培养筛选阳性克隆.然后挑选具有氯霉素抗性的克隆，以P3和P4为引物进行PCR扩增，结果扩增出约1239bp的片段，而野生型为699bp。如图3(B)所示。

2.3第二次位点特异性重组菌SM091ΔCpxr的鉴定

质粒pCP20表达的FLP重组酶能够识别氯霉素抗性基因两侧的FRT位点，通过位点特异性重组将中间的抗性基因去除，仅在作用位点处留下1个单拷贝FRT位点。将pCP20电击转化入SM091ΔCpxr::cat的突变体中，于含氨苄青霉素的平板上30℃培养筛选阳性转化子，然后转接无抗性的培养基中，42℃培养数小时以消除温度敏感型质粒pCP20，这样获得的突变体不仅敲除了相应的基因，而且细胞内仅残留FRT位点，从而使后续研究的结果更为可靠。

用鉴定引物P3和P4作PCR对氯霉素抗性消失的克隆进行鉴定，结果扩出了309bp的片段，野生型为699bp，如图3(C)所示。

2.4双缺失沙门氏菌突变株的获得

在沙门氏菌突变体SM091ΔCpxr单基因缺失基础上，应用上述同样方法，制备沙门氏菌双基因突变体SM091ΔCpxr:ΔX，从而获得双基因缺失的减毒沙门氏菌SM091-DED株，其微生物保藏号是：CGMCC NO.4604。

实施例2减毒沙门氏菌疫苗的制备

1、试验材料：实施例1所构建的减毒沙门氏菌SM091-DED株；

2、试验方法

将冻存的减毒沙门氏菌菌株用灭菌的生理盐水稀释，划线培养在LB琼脂平板上，37℃培养过夜。次日，挑取单个菌落接种到无抗性的LB液体培养基中，37℃培养18-20小时。3000rpm离心，用灭菌的PBS洗涤3次，去除培养基成分，然后进行细菌计数为10⁷CFU，分装到冻存管中，冻干后保存，即制成减毒沙门氏菌疫苗。

试验例1减毒沙门氏菌宿主体内定植试验

1、试验材料：

供试样品：实施例2所制备的禽沙门氏菌疫苗；

2、试验方法

选择40只7日龄SPF雏鸡，随机分为2组，每组20只鸡，1组为实验组(禽沙门氏菌减毒疫苗组)，1组为对照组(禽沙门氏菌亲本组)。实验组分别皮下注射0.1ml(10⁷)实施例2所制备的禽沙门氏菌疫苗。免疫后每隔2天剖杀，每组2只鸡，分别于免疫后的第2、4、6、8、10、12和14天无菌取鸡的肝脏、脾脏和盲肠，称重、研磨、涂板和计数，计算每g组织所含有的细菌数，并对菌落进行PCR扩增和鉴定。

3、试验结果

试验结果见图4-9。免疫后第30天，亲本株分离到菌，而基因缺失株则没有分离到沙门氏菌。

表1 PCR鉴定结果

试验结果表明，减毒沙门氏菌SM091-DED株只能够在雏鸡体内存留10天，而亲本菌株则超过30天以上。

试验例2减毒沙门氏菌水平传播能力试验

1、试验材料：

供试样品：本发明禽沙门氏菌减毒株SM091-DED株；

2、试验方法

选择30只7日龄SPF雏鸡，随机分为3组，每组10只鸡，1个实验组(禽沙门氏菌减毒株免疫鸡(10只)+非免疫鸡(10只))，置于同一隔离其中饲养，2组为对照组(非免疫鸡，10只)。免疫鸡分别皮下注射0.1ml(10⁷)疫苗。免疫后每隔3天剖杀，每组2只鸡，分别于免疫后的第3、6、9和12天无菌取鸡的肝脏、脾脏和盲肠，称重、研磨、涂板和计数，计算每g组织所含有的细菌数，对进行抗体检测。

3、试验结果

表2免疫后第3天同群感染情况和抗体检测

表3免疫后第9天同群感染情况和抗体检测

表4免疫后第12天同群感染情况和抗体检测

试验结果表明，免疫鸡不能通过水平传播途径感染非免疫雏鸡，因此，对环境是安全的。

试验例4减毒沙门氏菌免疫途径试验

1、试验材料：

供试样品：实施例2所制备的禽沙门氏菌疫苗；

2、试验方法

口服免疫、腹腔注射免疫和肌肉注射免疫三种不同的免疫途径，每种免疫途径用免疫剂量为10⁷每只鸡分别免疫7日龄的SPF鸡，2周之后进行加强免疫，2周后用白痢沙门氏菌攻毒，5x10⁹每只鸡。观察2周，记录鸡只的死亡情况

3试验结果

口服免疫组10⁷有4只鸡死亡；腹腔注射免疫组没有鸡只死亡；肌肉注射免疫组无死亡。结果表明，腹腔注射效果优于口服免疫组和肌肉注射免疫组，口服免疫组效果最差。结果见表5。

表5不同免疫途径的比较研究

试验例5禽沙门氏菌疫苗的安全性试验

1、试验材料：

(1)阴性对照：生理盐水；

(2)供试样品：实施例2所制备的禽沙门氏菌疫苗；

2、试验方法

选择50只7日龄雏鸡，随机分为5组，每组10只鸡，4个实验组，1组为对照组；4个实验组分别皮下注射0.1ml(10⁹)、0.1ml(10⁸)、0.1ml(10⁷)、0.1ml(10⁶)实施例2所制备的减毒沙门氏菌疫苗，对照组注射0.1ml生理盐水，分别在10天剖杀各组5只雏鸡和20天剖杀各组剩余的5只组雏鸡，取肝脏、肺脏和小肠等脏器进行病理组织学观察。试验结果见表6。

3、试验结果

试验结果表明，4个实验组雏鸡各脏器与对照组相同，均无病变，表明本发明所制备的禽沙门氏菌疫苗对7日龄的雏鸡是安全性的。

表6禽沙门氏菌疫苗的安全性试验

试验例6禽沙门氏菌疫苗的免疫效率试验

1、试验材料：

(1)对照：生理盐水；

(2)供试样品：本发明实施例2所制备的禽沙门氏菌疫苗；

2、试验方法

选择20只1日龄雏鸡，随机分为2组，每组10只鸡，1个实验组(实验组1：本发明禽沙门氏菌疫苗组)，1组为对照组(生理盐水)。3个实验组分别皮下注射0.1ml(10⁹)疫苗，对照组注射0.1ml生理盐水。3周后进行2次免疫，剂量和途径与第一次相同。分别在1免后2周和2免后2周采集血清，测定抗体情况。在2免2周后，每组鸡只分别接种10⁹的禽沙门氏菌，进行免疫效率的评价。观察攻毒后各组鸡只的发病和死亡情况，存活鸡只在攻毒后10天剖杀，取肝脏、肺脏和小肠等脏器进行病理组织学观察。

3、试验结果

试验结果分别见表7、表8和表9。

表7禽沙门氏菌疫苗免疫雏鸡的抗体变化(OD490)

从表7看见，接种本发明禽沙门氏菌疫苗后，可显著提高各免疫雏鸡体内的抗体含量，与对照组相比差异显著。

表8禽沙门氏菌疫苗的免疫效率对比试验

从表8和表9看见，本发明禽沙门氏菌疫苗可有效保护各免疫雏鸡不受

禽沙门氏菌的攻击，说明本发明禽沙门氏菌疫苗具有良好的免疫保护效果。

表9禽沙门氏菌疫苗的病理学观察结果

试验例7减毒沙门氏菌的交叉保护试验

1、试验材料：

供试样品：本发明实施例2所制备的禽白痢沙门氏菌疫苗；禽肠炎沙门氏菌；

2、试验方法

选择40只1日龄雏鸡，随机分为2组，每组20只鸡，1个实验组(实验组1：禽沙门氏菌活苗组)，1组为对照组(生理盐水)。实验组分别皮下注射0.1ml(10⁷)疫苗，对照组注射0.1ml生理盐水。3周后进行2次免疫，剂量和途径与第一次相同。在2免2周后，每组10只鸡分别接种10⁹的禽白痢沙门氏菌，每组另外10只分别接种10⁹的禽肠炎沙门氏菌。观察攻毒后各组鸡只的发病和死亡情况，存活鸡只在攻毒后10天剖杀，取肝脏、肺脏和小肠等脏器进行细菌的分离和鉴定。

3、试验结果

试验结果分别见表10和表11。

表10 禽沙门氏菌疫苗的免疫效率对比试验

从表10看见，本发明禽沙门氏菌疫苗可提供有效的交叉保护，说明本发明禽沙门氏菌疫苗具有良好的免疫保护效果。

表11 禽沙门氏菌疫苗的病理学观察结果

试验例8免疫SPF雏鸡的清除强毒力沙门氏菌感染试验

1、试验材料：

供试样品：本发明实施例2所制备的禽沙门氏菌疫苗；

2、试验方法

选择40只1日龄雏鸡，随机分为2组，每组20只鸡，1个实验组(实验组1：禽沙门氏菌活苗组)，1组为对照组(生理盐水)。实验组分别皮下注射0.1ml(10⁷)疫苗，对照组注射0.1ml生理盐水。3周后进行2次免疫，剂量和途径与第一次相同。在2免2周后，每组10鸡只分别接种10⁹的禽白痢沙门氏菌，每组的另10只鸡分别接种10⁹的禽肠炎沙门氏菌，进行清除强毒力沙门氏菌感染的效率评价。观察攻毒后各组鸡只的发病和死亡情况，存活鸡只在攻毒后2、6、10和14天和30剖杀，取肝脏、肺脏和小肠等脏器进行细菌学和PCR检测。

3、试验结果

试验结果分别见表12、表13和表14。

表12 细菌分离鉴定结果(禽白痢沙门氏菌)

表13 细菌分离鉴定结果(禽肠炎沙门氏菌)

试验结果表明，攻毒的沙门氏菌只能够在免疫组的雏鸡体内存留10天，而在对照组雏鸡体内则超过30天以上。

表14 PCR鉴定结果

PCR检测结果表明，攻毒的沙门氏菌只能够在免疫雏鸡体内存留10天，而在对照组雏鸡体内则超过30天以上。表明本发明减毒沙门氏菌免疫的雏鸡能够诱导产生强的免疫保护效果，能够有效清除强毒沙门氏菌的感染。

Claims

1.一株鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)SM091-DED株，其特征在于：其微生物保藏号是CGMCC NO.4604。

2.减毒禽沙门氏菌疫苗，包括以下步骤制备得到：将权利要求1所述鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)SM091-DED株经过培养基培养，收集细菌，冻干，即得。

3.一种预防禽沙门氏菌病的疫苗组合物，其特征在于：含有权利要求1所述的鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)SM091-DED株。

4.权利要求1所述的鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)SM091-DED株在制备预防沙门氏菌病的药物的用途。