CN107384837B

CN107384837B - 一株鸡滑液支原体及其应用

Info

Publication number: CN107384837B
Application number: CN201710782422.2A
Authority: CN
Inventors: 朱文豪; 徐引弟; 王治方; 张青娴; 郎利敏; 张立宪; 李海利; 焦文强; 游一; 王克领
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine of Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine of Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-09-02
Filing date: 2017-09-02
Publication date: 2020-05-08
Anticipated expiration: 2037-09-02
Also published as: CN107384837A

Abstract

本发明公开了一株鸡滑液支原体及其应用，所述的鸡滑液支原体为鸡滑液支原体(Mycoplasma synoviae)HNMsy1，保藏编号：CGMCC NO：13860，保藏日期：2017年5月26日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京。本发明中的鸡滑液支原体菌株HNMsy1分离自发生典型关节肿胀、跛行的成年蛋鸡，具有稳定的生物学特性，对鸡具有较强的致病力，能够引起鸡发生典型的关节炎症状，且具有良好的免疫原性。利用本发明中的鸡滑液支原体菌株HNMsy1制备的疫苗安全可靠，对鸡的传染性滑膜炎具有较好的保护效果。

Description

一株鸡滑液支原体及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及一株鸡滑液支原体及其应用。

背景技术

鸡滑液支原体(Mycoplasma synoviae，MS)是引起鸡和火鸡的传染性滑膜炎(Avain infection synovitis)的一种急性或慢性传染病的病原。以渗出性关节滑膜炎、腱鞘滑膜炎和粘液囊炎为特征。临床上以关节肿大、滑液囊和腱鞘发炎为特征。

70年代我国就有鸡滑液囊支原体病的报道，近年来的发病率呈现了上升的趋势，在某些地区形成了区域性的流行，造成了较大的影响。本病可感染鸡、火鸡、珍珠鸡、鸭、鹅和鸽子等。该病以种蛋垂直传播为主，垂直传播率可达100％，也能水平接触传染，还可由非SPF鸡胚制造的疫苗感染。自然感染的潜伏期比较长，大约是24～80d。同舍不同笼的鸡能彼此水平传播，急性发病多在3～16周龄；经蛋传播的最早可见于1周龄，发病率一般介于5％～15％，死亡率通常少于1％。MS的发病特点：1、潜伏期长。2、对垂直传播的病鸡药物治疗效果差。3、水平传播感染率可达100％。鸡一旦感染滑膜囊支原体病，很难根除，并持续排毒。

近年来鸡传染性滑膜炎的危害逐步加重。目前本病无疫苗防控，传染性滑膜炎的感染最重要的是引起鸡群淘汰率高，鸡群没有产蛋高峰期，治疗效果差。因此亟需一种新的具有安全、免疫原性好的菌株制备的疫苗对该病进行防治。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一株鸡滑液支原体及其应用，该菌株毒力强，制备的疫苗安全、免疫性好。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一株鸡滑液支原体，所述的鸡滑液支原体为鸡滑液支原体(Mycoplasmasynoviae)HNMsy1，保藏编号：CGMCC NO：13860，保藏日期：2017年5月26日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京。

一种鸡滑液支原体在制备鸡滑液支原体灭活疫苗方面的应用。

所述的鸡滑液支原体灭活疫苗的制备方法为：将所述的鸡滑液支原体依次经过培养、收获和灭活得到疫苗原液后，加入佐剂即得疫苗。

所述的佐剂为氢氧化铝佐剂。

所述的鸡滑液支原体灭活疫苗的制备方法为：将鸡滑液支原体接种到PPLO液体培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，3d后收取培养物，测定浓度，调整培养物中鸡滑液支原体的菌量为2×10⁷CFU/mL，加入培养物体积分数0.2％的甲醛溶液，于37℃灭活12h，制得疫苗原液；再加入和疫苗原液等体积的氢氧化铝佐剂，混合制得鸡滑液支原体灭活疫苗。

本发明的有益效果：

1、本发明中的鸡滑液支原体菌株HNMsy1分离自发生典型关节肿胀、跛行的成年蛋鸡，在PPLO液体培养基上传代、固体培养基上分离得到，在PPLO液体培养基中增殖滴度高，达10⁷CFU/mL以上。

2、本发明中的鸡滑液支原体菌株HNMsy1具有稳定的生物学特性，对鸡具有较强的致病力，能够引起鸡发生典型的关节炎症状，且具有良好的免疫原性。

3、利用本发明中的鸡滑液支原体菌株HNMsy1制备的疫苗安全可靠，对鸡的传染性滑膜炎具有较好的保护效果。

附图说明

图1为菌株HNMsy1菌落4×显微镜下形态。

图2为菌株HNMsy1菌体吉姆萨染色100×显微镜下形态。

图3为菌株HNMsy1的PCR鉴定结果，图中的Marker为DL 2000bp，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，100bp；1为引物MB1，MB2对鸡滑液支原体标准株(CVCC385)的扩增结果；2，3为引物MB1，MB2对菌株HNMsy1的扩增结果；4为阴性对照；从图中可以看出，模板PCR扩增片段约为1483bp，证明扩增片段为目的片段，符合预期设计大小。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1、鸡滑液支原体的分离和鉴定

1.1病料采集

病料来自于2017年4月在河南省许昌市某大型蛋鸡场发生关节肿大的产蛋鸡的关节。

1.2培养基的制备

PPLO液体培养基：PPLO肉汤粉10.5g，葡萄糖2.5g，酵母粉2.5g，溶于440mL超纯水中，115℃灭菌15min，加入MEM培养基5mL、马血清50mL、青霉素8万单位、无菌质量分数10％精氨酸10mL和1％(w/v)酚红500μL。培养基于115℃灭菌15min后，于4℃保存备用。

PPLO固体培养基：加入1.5％(w/v)琼脂粉的PPLO液体培养基。培养基于115℃灭菌15min后，于4℃保存备用。

1.3支原体的分离培养

无菌抽取病变关节液，加入2mL的灭菌PBS缓冲液，5000r/min低速离心5min后，用针管取上清液，在针管部安装0.22μm滤膜过滤，加入至PPLO液体培养基中，在37℃、5％CO₂培养箱中培养。培养近一周后，取1mL转接10mL PPLO液体培养基中再次培养，传代2～5代后液体颜色由红色变为黄色，取100μL涂布PPLO固体培养基表面，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。3～10d后，肉眼观察可见有圆形、微小、光滑、透明、露珠状菌落，在低倍显微镜下观察固体培养基上菌落的形态，形态为典型的支原体“煎荷包蛋样”(见图1)。吉姆萨染色，油镜下观察菌体形态，为多形态，呈球形、卵圆形、弯曲的丝状、螺旋状(见图2)，命名为菌株HNMsy1。

1.4菌株的鉴定

1.4.1设计引物

根据鸡滑液支原体16S rRNA的序列设计一对通用引物，用于鸡滑液支原体的扩增，引物序列如下：

MB1：5’-ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT-3’(SEQ ID NO.1)

MB2：5’-CGCGGATCCGCTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO.2)

预期扩增片段大小为1483bp。

1.4.2 PCR鉴定

将菌株HNMsy1接种PPLO液体培养基，置于37℃5％CO₂培养箱中培养3d后，培养基由红色变为黄色，收集菌体，按照DNA提取试剂盒的操作步骤提取出菌株HNMsy1的DNA，分光光度计测定浓度为100μg/mL，用MB1，MB2扩增进行PCR鉴定。同时，设置鸡滑液支原体标准株(CVCC385)为阳性对照。

PCR扩增反应体系为25μL：10×缓冲液2.5μL，2.5mM dNTPs 0.5μL，10μM/L通用引物MB1，MB2各1μL，5U/μL rTaq 1μL，100μg/mL DNA模板1μL，加入ddH₂O至25μL。

反应条件：95℃预变性5min，进入循环：95℃30s，57℃30s，72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物4℃保存。

扩增产物进行电泳，每孔加样10μL，1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察结果(见图3)。图3看出，MB1，MB2扩增出符合预期大小片段，经测序与鸡滑液支原体标准株(CVCC385)同源性98％，测序结果如下。证明所分离的菌株HNMsy1为鸡滑液支原体(Mycoplasmasynoviae)。

CGCGGATCCGCTACCTTGTTACGACTTAACCCCAATCATGGACCCTACCTTAGACGGCTCCCTCCCTCTCGGGTTAGGCCACCGGCGTTGGGTATTGCCCACTTTCGTGGTTTGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCGAGAACGTATTCACCGCAACATGCCGATTTGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGAACTGAGACTGTTTTTGTGAGTTTCGCTCCAGGTCACCCTATCGCTTCTCTTTGTTCCAGCCATTGTATCACGTTTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCAATTTATCACTGGCAGTCTCGCTAGAGTCCCCAACTTAATGATGGTAACTAGCAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGAGGACAACCGTGCACCACCTGTACATCTGTTAGCCTCCGAACTTATTTCTAAGCCTTTGCAGAGTATGTCAAGACCTGGTAAGGTTTTTCGTGTATCTTCGAATTAAACAACATGATCCACCGCTTGTGCGGGGTCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCATACTTGCGTACGTACTACTCAGGCGGAGAACTTAATGCGTTAACTGCAGCACTGACCTTATGGCCAACACTTAGTTCTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCATCAGTGTCAGTATAGACCCAGCAAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATATTTACGCATTTTACCGCTACACATGGAATTCCACTTGCCTCTGTCTCACTCTAGTTATATAGTTTTCATAGCCTCACAGCGTTAAGCACTGCACTTACACCACAAACTTTTATAACCACCTACGCACCCTTTACGCCCAGTAAATCCGGATAACGCTCGCCCCCTATGTATTACCGCGGCTGCTGGCACATAGTTAGCCGGGGCTTATTCATATGGTACCGTCAATTTTTAATTTTTCTTCCCATATAAAAGAACTTTACATACCGAAGTACTTCGTCGTTCACGCGGCGTTGCTCGGTCAGGGTTTCCCCCATTGCCGAAAATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTTCTCAGTCCCAATGTGGCCGGTAGACCTCTCAGTCCGGCTACGCATCATCGTCTTGGTAGGCTCTTACCCCACCAACTAACTAATGCGCCGCAGACCCCTCTTAAACCGATAAATCTTTAAATGTGTTTTTTTCATGCACACATCCTATCCAGTATTAGCTCCAGTTTCCCGGAGTTATCCTCGAGTTAAAGGTAGGTTATCTACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTAAGCATCCGAAGATGCTTCGTTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCATCCTGAGCCAGGATCAAACTCTGTCGACGCGT(SEQ ID NO.3)

1.5毒力试验

试验鸡为45日龄健康的雏鸡20只，均为鸡滑液支原体ELISA抗体阴性。试验动物分为两组，对照组10只，试验组10只，两组试验动物随机分组。将HNMsy1接种PPLO液体培养基，37℃、5％CO₂培养箱中培养3d后，测定菌体浓度，连续10倍稀释涂布固体平板，低倍镜下活菌计数，计算HNMsy1培养物原液菌体浓度，调整至10⁷CFU/mL，试验组动物通过喉气管接种1mL HNMsy1培养物原液，对照组动物通过喉气管接种1mL灭菌的PPLO液体培养基。试验期为30d，每天观察试验动物的临床表现，测量体温，如试验动物死亡则立即进行剖杀，观察呼吸道病变病采集病料。于30d试验结束时，剖杀所有试验动物。

试验组动物在接种支原体12d后表现出临床症状：跛行，生长迟缓，跗关节和趾关节肿胀，共死亡3只。对照组动物在试验期间体温正常且无明显的呼吸道症状。试验结束后剖杀试验组动物，同时剖杀10只头对照组动物。采集病料，进行支原体分离。试验组剖检，肿胀关节有粘液性、纤维素性分泌物，关节有的有黄色干酪样渗出物。对照组剖检均未发生明显的病理变化，对照组的10份病料均未分离到支原体，试验组的10份病料中均分离到鸡滑液支原体，菌落形态表现为“煎荷包蛋样”，PCR鉴定结果与HNMsy1一致。

实施例2、疫苗的制备、安全性和效力试验

2.1疫苗的制备

将鸡滑液支原体菌株HNMsy1接种到PPLO液体培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，3d后收取培养物，测定浓度，调整HNMsy1培养物中鸡滑液支原体的菌数为2×10⁷CFU/mL，每1000mL培养物加2mL甲醛溶液(质量分数37％)，于37℃灭活12h，制得疫苗原液；再加入和疫苗原液等体积的氢氧化铝佐剂(Sigma公司，F5881)，混合制得鸡滑液支原体灭活疫苗，疫苗中鸡滑液支原体的菌数约为1×10⁷CFU/mL。

2.2疫苗的安全性试验：

选取45日龄健康鸡20只，均为鸡滑液支原体ELISA抗体阴性。分为4组，每组5只。疫苗组3组，每组分别颈部皮下注射0.5mL、1mL、2mL本疫苗；对照组1组，颈部皮下注射2mL灭菌生理盐水。观察30d。观察期间，疫苗组和对照组的鸡精神状况、采食正常，未见精神不振、采食减少、关节肿胀，跛行等不良反应。说明本发明的灭活疫苗安全。

2.3疫苗的效力试验

选取45日龄健康鸡100只，均为鸡滑液支原体ELISA抗体阴性。分为5组，每组20只。具体为：疫苗1-4组：每组分别注射本疫苗0.1mL、0.2mL、0.3mL和0.5mL，第5组为未免疫组，注射0.5mL灭菌生理盐水。疫苗组和未免疫组4周后二免注射同等剂量的疫苗和灭菌生理盐水。二免后30d用10⁷CFU的HNMsy1采取气管注射的攻毒方式进行攻毒。攻毒后30d内，观察所有鸡的临床症状。在攻毒后30d后，对所有鸡进行剖检，确定攻毒保护率，采集肺脏等器官进行鸡滑液支原体分离培养。

疫苗组与未免疫组鸡攻毒后有明显的差异，攻毒后，未免疫组第12d开始出现跛行、关节肿胀等临床症状，全部发病，共死亡7只。剖检结果：肿胀关节有粘液性、纤维素性分泌物，关节有的有黄色干酪样渗出物。而疫苗组中，0.1mL疫苗组的20只鸡中有3只出现临床症状和病例变化；0.2mL疫苗组的20只鸡中有1只出现临床症状和病例变化；0.3mL和0.5mL疫苗组的20只鸡没有发病。免疫攻毒保护情况见下表。

注：“—”表示不适用。

由上表可以看出，本疫苗的最小免疫保护剂量为0.1mL，含菌量为1×10⁷CFU/mL。说明本发明的灭活苗具有良好的保护效果。

以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一株鸡滑液支原体及其应用

<160> 3

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acgcgtcgac agagtttgat cctggct 27

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgcggatccg ctaccttgtt acgactt 27

<210> 3

<211> 1483

<212> DNA

<213> 鸡滑液支原体（Mycoplasma synoviae）

<400> 3

cgcggatccg ctaccttgtt acgacttaac cccaatcatg gaccctacct tagacggctc 60

cctccctctc gggttaggcc accggcgttg ggtattgccc actttcgtgg tttgacgggc 120

ggtgtgtaca aaccccgaga acgtattcac cgcaacatgc cgatttgcga ttactagcga 180

ttccgacttc atggagtcga gttgcagact ccaatccgaa ctgagactgt ttttgtgagt 240

ttcgctccag gtcaccctat cgcttctctt tgttccagcc attgtatcac gtttgtagcc 300

caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccaat ttatcactgg 360

cagtctcgct agagtcccca acttaatgat ggtaactagc aataagggtt gcgctcgttg 420

cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgaggaca accgtgcacc acctgtacat 480

ctgttagcct ccgaacttat ttctaagcct ttgcagagta tgtcaagacc tggtaaggtt 540

tttcgtgtat cttcgaatta aacaacatga tccaccgctt gtgcggggtc ccgtcaattc 600

ctttgagttt catacttgcg tacgtactac tcaggcggag aacttaatgc gttaactgca 660

gcactgacct tatggccaac acttagttct catcgtttac ggcgtggact accagggtat 720

ctaatcctgt ttgctcccca cgctttcgtg catcagtgtc agtatagacc cagcaagccg 780

ccttcgccac tggtgttcct ccatatattt acgcatttta ccgctacaca tggaattcca 840

cttgcctctg tctcactcta gttatatagt tttcatagcc tcacagcgtt aagcactgca 900

cttacaccac aaacttttat aaccacctac gcacccttta cgcccagtaa atccggataa 960

cgctcgcccc ctatgtatta ccgcggctgc tggcacatag ttagccgggg cttattcata 1020

tggtaccgtc aatttttaat ttttcttccc atataaaaga actttacata ccgaagtact 1080

tcgtcgttca cgcggcgttg ctcggtcagg gtttccccca ttgccgaaaa ttccctactg 1140

ctgcctcccg taggagtttg ggccgttctc agtcccaatg tggccggtag acctctcagt 1200

ccggctacgc atcatcgtct tggtaggctc ttaccccacc aactaactaa tgcgccgcag 1260

acccctctta aaccgataaa tctttaaatg tgtttttttc atgcacacat cctatccagt 1320

attagctcca gtttcccgga gttatcctcg agttaaaggt aggttatcta cgtgttactc 1380

acccgttcgc cactaagcat ccgaagatgc ttcgttcgac ttgcatgtat taggcacgcc 1440

gccagcgttc atcctgagcc aggatcaaac tctgtcgacg cgt 1483

Claims

1.一株鸡滑液支原体，其特征在于：所述的鸡滑液支原体为鸡滑液支原体(Mycoplasmasynoviae)HNMsy1，保藏编号：CGMCCNO：13860，保藏日期：2017年5月26日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京。

2.一种如权利要求1所述的鸡滑液支原体在制备鸡滑液支原体灭活疫苗方面的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的鸡滑液支原体灭活疫苗的制备方法为：将所述的鸡滑液支原体依次经过培养、收获和灭活得到疫苗原液后，加入氢氧化铝佐剂即得疫苗。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的鸡滑液支原体灭活疫苗的制备方法为：将鸡滑液支原体接种到PPLO液体培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，3d后收取培养物，测定浓度，调整培养物中鸡滑液支原体的菌量为2×10⁷CFU/mL，加入培养物体积分数0.2％的甲醛溶液，于37℃灭活12h，制得疫苗原液；再加入和疫苗原液等体积的氢氧化铝佐剂，混合制得鸡滑液支原体灭活疫苗。