CN107550863B - 一种禽鼻气管鸟疫杆菌a/b血清型二价灭活疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫学领域，具体公开了一种禽鼻气管鸟疫杆菌疫苗，以鼻气管鸟疫杆菌2个主要的流行血清型的分离株为抗原，通过血液肉汤培养基培养后，经过甲醛灭活，2个血清型的抗原以1:1等比例混合，然后加入液体抗原体积1～5％的泊洛沙姆和1～4％的β葡聚糖制备为水相，最后按照水相：油相比例4:6经过乳化制备而成。本发明所提供的疫苗可用于预防由当前流行的家禽鼻气管鸟疫杆菌引起的呼吸道病、生长缓慢和产蛋下降等病症。

Description

一种禽鼻气管鸟疫杆菌A/B血清型二价灭活疫苗

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体地说，涉及一种禽鼻气管鸟疫杆菌疫苗。

背景技术

鼻气管炎鸟疫杆菌病是由鼻气管鸟疫杆菌(Ornithobacteriumrhinotracheale，ORT)引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病，主要感染肉鸡和火鸡，表现为呼吸困难、生长迟缓、产蛋率下降和高死亡率。剖检呈现单侧或双侧纤维素性化脓性肺炎和气囊炎，70％肉鸡呼吸道病与ORT感染相关联。ORT最早在1981年由德国学者从5周龄患面部肿胀、严重气囊炎火鸡分离而来，以后德国 (1996)、以色列(1997)、南非(1996)、以色列(1997)、英国(1997)、荷兰(1997)、比利时(2001)、巴西(2003)、加拿大(1999)、法国(1998)、美国(1997)相继有分离到ORT的相关报道，该菌于1994年被正式命名为鼻气管鸟疫杆菌。近年来，ORT分别在比利时、法国、荷兰、匈牙利、芬兰、埃及、土耳其、马来半岛、伊朗、巴西和秘鲁以及中国台湾地区均有该病爆发的报道。根据现有的文献报道，禽肺炎病毒感染后，启动了ORT的进一步发病。如果与临床其它细菌病出现混合感染后，如致病性大肠杆菌、鹦鹉热衣原体、巴士杆菌、波士杆菌，发病率和死亡率显著性增加。临床上常常与鸭疫巴士杆菌、大肠杆菌、链球菌感染相混淆。

鼻气管鸟疫杆菌感染的对象，包括肉鸡、火鸡、肉鸭、鸽子、珍珠鸡、海鸥、乌鸦、鸵鸟、山鹑和雉鸡等，具有广泛的宿主。ORT血清型分为A-I，共计18种血清型，其中血清A型在肉鸡、蛋鸡占96％，火鸡占54％。来源肉鸡分离株主要以A和C型常见，火鸡检测到B、D、E血清型，这些血清对肉鸡、蛋鸡和火鸡具有相同的致病性。但是不同宿主的致病力与血清型间的关系尚不清楚。研究发现40株中国台湾 ORT分离株(28株来源于鸡，12株来源于鸽子)，鸽子分离株和28株鸡源分离株属于血清A型。16株德国火鸡分离株10株属于血清B，5株属于血清A型，1株属于血清E型。本实验室研究证实，鸽子、肉鸡、肉鸭和蛋鸡20株分离株，主要属于血清型A和B型。本实验室研究发现ORT单独感染就可以诱发死亡，死亡率10-20％。如果与H9N2禽流感亚型、兽疫链球菌、大肠杆菌混合感染，造成夏季肉杂鸡、育成鸡的急性死亡，死亡集中在7-10天内，一周内的死亡率累计达到10-20％。本实验室通过SPF模型、肉鸡模型证明鼻气管鸟疫杆菌感染可以造成死亡，28-32日龄肉鸡、SPF鸡死亡率高达80-100％。因此，鼻气管鸟疫杆菌与其它继发感染的细菌，如禽流感H9N2、兽疫链球菌、大肠杆菌混合感染可能是导致家禽呼吸道病严重恶化的主要因素。因此，疫苗的研究和推广使用成为防治ORT可能的技术手段。以鼻气管鸟疫杆菌主要流行的血清型制成全菌灭活疫苗，不但可以有效预防ORT引起的呼吸道病，并可有效减少抗生素的使用，有利于食品安全。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种禽鼻气管鸟疫杆菌A/B血清型二价疫苗。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种禽鼻气管鸟疫杆菌A/B血清型二价灭活疫苗，其抗原分别为A血清型禽鼻气管鸟疫杆菌菌株和B血清型禽鼻气管鸟疫杆菌菌株，二者在疫苗中的含菌量均不小于1.0x10⁹CFU/mL。

作为优选，所述A血清型禽鼻气管鸟疫杆菌菌株为ORT-98株，所述B血清型禽鼻气管鸟疫杆菌菌株为ORT-SD株。

进一步地，所述疫苗中两种抗原以等比例混合。

进一步地，所述疫苗的佐剂包括泊洛沙姆407和β葡聚糖。

泊洛沙姆407(Poloxamer407，P407)是由聚氧乙烯与聚丙乙烯以 7∶3的比例构成，平均相对分子质量为11500，其水溶液具有温度敏感性质。注射给药可减少普通植入剂带来的创伤，且能达到缓释效果，形成药物储藏库。β葡聚糖是一种优质的免疫佐剂，单独使用后可以提高禽流感灭活的抗体水平和攻毒保护力。泊洛沙姆407加入某种添加剂(如乳糖、葡萄糖、甘油、磷酸钠)后，对相转变温度和流变学性质的影响，所研究的处方均在家禽生理条件下(40-42℃)形成凝胶，药物释放大大改善。利用泊洛沙姆407储藏药物特性和热敏缓释性质，结合β葡聚糖的免疫佐剂特性，组成热敏缓释免疫佐剂，本发明将泊洛沙姆407与β葡聚糖组合，开发一种新型畜禽疫苗的缓释佐剂。

作为优选，所述疫苗的剂型为油包水型。

本发明所述疫苗的制备方法为：

(1)利用A、B血清型禽鼻气管鸟疫杆菌菌株制备液体抗原；

(2)向液体抗原中加入1～5％(w/v)的泊洛沙姆407和1～4％(w/v) 的β葡聚糖佐剂制备成水相；

(3)按照水相：油相的体积比为4:6的比例经过乳化制备而成。

其中，所述缓释佐剂为泊洛沙姆407、β葡聚糖为β-1，3/1，6 葡聚糖。

所述油相为以下重量份的原料制备得到的混合物：10号轻质白油 94份、硬脂酸铝2份、span80 6份。所述油相的制备方法为：白油加热并加入硬脂酸铝搅拌至透明，再加入span80，高压灭菌。

所述步骤(2)优选为向液体抗原中加入1％(w/v)泊洛沙姆407、 1％(w/v)的β葡聚糖佐剂制备成水相。

更为具体的，本发明所述疫苗的制备方法为：

(1)将两株禽鼻气管鸟疫杆菌种子菌0RT-SD、ORT-98株分别接种在含有4％绵羊血琼脂平板上，后挑取单个菌落接种于含有 5％～10％鸡血清的TSB培养基中，37℃，200rpm/min条件下培养12～24h后收集菌液，灭活备用；

(2)选择1～5％泊洛沙姆和1-4％β葡聚糖作为缓释佐剂，与灭菌吐温80进行乳化后，取抗原ORT-98A型和ORT-SD B型抗原制成每ml 抗原液以上2种抗原均不少于1.0x10⁹CFU的菌落数。将制备好的油相和水相等体积混合，低速 搅拌1000rpm/min-3000rpm/min，5-10min，高速乳化6000rpm/min-8000rpm/min，3-5分钟，制备获得灭活疫苗。

其中，鼻气管鸟疫杆菌A型ORT-98株，经鉴定为鼻气管鸟疫杆菌(Ornithobacterium rhinotracheale)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期为2017年8月16日，保藏编号为CGMCC No.14528。

鼻气管鸟疫杆菌B型为ORT-SD株，经鉴定为鼻气管鸟疫杆菌 (Ornithobacteriumrhinotracheale)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期为2017年8月16日，保藏编号为CGMCC No.14529。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了禽鼻气管鸟疫杆菌A/B血清型二价油乳剂灭活疫苗，以鼻气管鸟疫杆菌2个主要的流行血清型的分离株为抗原，通过血液肉汤培养基培养后，经过甲醛灭活，2个血清型的抗原以1:1等比例混合，然后加入液体抗原体积1～5％的泊洛沙姆、1～4％的β葡聚糖佐剂制备成水相，最后按照水相：油相比例4:6经过乳化制备而成。疫苗用于预防由当前流行的家禽鼻气管鸟疫杆菌引起的呼吸道病、生长缓慢和产蛋下降等病症。

附图说明

图1为本发明鼻气管鸟疫杆菌A型ORT-98株，B型为ORT-SD株的生化鉴定。

图2为本发明鼻气管鸟疫杆菌A型ORT-98株血清型鉴定。

图3为本发明鼻气管鸟杆菌B型ORT-SD株的血清型鉴定。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1鼻气管鸟疫杆菌的鉴定和灭活疫苗的制备

1.材料

生产种子菌株：ORT-SD(B型)、ORT-98(A型)来自本课题组分离和鉴定；

攻毒菌株：ORT-98，血清型A，北京市农林科学院陈小玲研究员惠赠；

佐剂：10号轻质白油：购自中国石化集团杭州炼油厂；

水溶性β-1，3/1，6葡聚糖：购自安琪酵母股份有限公司，含量为 90％。

泊洛沙姆407：购自巴斯夫(中国)有限公司。

2.方法

疫苗抗原制备：将本发明所述的两株禽鼻气管鸟疫杆菌种子菌 0RT-SD、ORT-98株首先进行生化鉴定，结果如图1所示，ORT分离株对葡萄糖、乳糖、果糖、半乳糖等糖苷类显阳性，所有菌株均对对氧化酶以及尿素酶显阳性，对过氧化氢酶、硝酸盐还原反应、VP 实验以及鸟氨酸、赖氨酸脱氢酶反应呈阴性，由图1可知属于鼻气管鸟疫杆菌。其次，利用SPF鸡制备的标准阳性血清A和B型，以琼脂扩散试验结果如图2、图3所示，抗原孔分别与各自的抗体孔之间产生了相匹配的沉淀线，种子菌ORT-98株属于血清A型，种子菌 ORT-SD株属于血清B型。

分别接种在含有4％绵羊血琼脂平板上，后挑取单个菌落接种于含有5％-10％小牛血清或者鸡血清的TSB培养基中，37℃， 200rpm/min条件下培养12-24h后收集菌液，以平板涂布法进行菌落计数，最后测得菌液的含量，活菌数目均可达到45亿CFU/mL。按照菌液的总体积加入0.3％的甲醛溶液，置于37℃恒温培养箱震荡灭活 48h，确认无细菌生长后4-8℃保存和备用。

疫苗的配制：选择1-5％泊洛沙姆407、1-4％β-1，3/1，6葡聚糖佐剂(90％含量)，与灭活抗原、灭菌吐温80进行乳化后，取抗原 ORT-A和B型抗原数量按照1:1混合，每ml中以上2种抗原均不少于 1.0x109CFU的菌落数。将制备好的油相(含10号轻质白油94份，硬脂酸铝2份、硬脂酸铝span80 6份)和水相按体积比＝4:6混合，低速 搅拌1000rpm/min-3000rpm/min，5-10min，高速乳化 6000rpm/min-8000rpm/min，3-5分钟，制备获得灭活疫苗。

具体制备方法详述如下：

疫苗1：ORT油佐剂疫苗制备

水相：总量为30毫升(取96份ORTA、B型灭活抗原、加入4份灭菌吐温80、1％泊洛沙姆407、1％β-1，3/1，6葡聚糖)。

油相：总量为70毫升(10号轻质白油94份，硬脂酸铝2份，白油加热并加入硬脂酸铝搅拌至透明，再加入span80 6份，高压灭菌)；

配制、乳化：白油佐剂相：抗原相按照7:3或6:4比例进行乳化，乳化过程为3000rpm/min低速搅拌5min，8000rpm/min高速搅拌3min 后制得。

疫苗2：ORT油佐剂疫苗配制

水相：总量为30毫升(取抗原ORTA和B型96份，分别含有菌落数不少于1.0x10⁹CFU，加入灭菌吐温80 4份、1％泊洛沙姆407、2％β-1，3/1，6葡聚糖)。

油相：总量为7毫升(10号轻质白油94份，硬脂酸铝2份，白油加热并加入硬脂酸铝搅拌至透明，再加入span80 6份，高压灭菌)；

将制备好的疫苗水相与油相以30:70，或40:60体积比混合，以高剪切乳化剂进行入乳化，乳化过程为3000rpm/min低速搅拌5min， 8000rpm/min高速搅拌3min后制得。

疫苗3：ORT油佐剂疫苗制备

水相：总量为30毫升(取96份ORTA、B型灭活抗原、加入4份灭菌吐温80、2％泊洛沙姆407、1％β-1，3/1，6葡聚糖)。

油相：总量为70毫升(10号轻质白油94份，硬脂酸铝2份，白油加热并加入硬脂酸铝搅拌至透明，再加入span80 6份，高压灭菌)；

配制、乳化：白油佐剂相：抗原相按照7:3或6:4比例进行乳化，乳化过程为3000rpm/min低速搅拌5min，8000rpm/min高速搅拌3min 后制得。

疫苗4：ORT油佐剂疫苗制备

水相：总量为30毫升(取96份ORTA、B型灭活抗原、加入4份灭菌吐温80、2％泊洛沙姆407、2％β-1，3/1，6葡聚糖)。

油相：总量为70毫升(10号轻质白油94份，硬脂酸铝2份，白油加热并加入硬脂酸铝搅拌至透明，再加入span80 6份，高压灭菌)；

配制、乳化：白油佐剂相：抗原相按照7:3或6:4比例进行乳化，乳化过程为3000rpm/min低速搅拌5min，8000rpm/min高速搅拌3min 后制得。

疫苗5：ORT油佐剂疫苗制备(葡聚糖佐剂对照组)

水相：总量为30毫升(取96份ORTA、B型灭活抗原、加入4份灭菌吐温80、1％β-1，3/1，6葡聚糖)。

油相：总量为70毫升(10号轻质白油94份，硬脂酸铝2份，白油加热并加入硬脂酸铝搅拌至透明，再加入span80 6份，高压灭菌)；

配制、乳化：白油佐剂相：抗原相按照7:3或6:4比例进行乳化，乳化过程为3000rpm/min低速搅拌5min，8000rpm/min高速搅拌3min 后制得。

疫苗6：ORT油佐剂疫苗制备(泊洛沙姆对照组)

水相：总量为30毫升(取96份ORTA、B型灭活抗原、加入4份灭菌吐温80、1％泊洛沙姆407)。

油相：总量为70毫升(10号轻质白油94份，硬脂酸铝2份，白油加热并加入硬脂酸铝搅拌至透明，再加入span80 6份，高压灭菌)；

配制、乳化：白油佐剂相：抗原相按照7:3或6:4比例进行乳化，乳化过程为3000rpm/min低速搅拌5min，8000rpm/min高速搅拌3min 后制得。

疫苗7：ORT油佐剂疫苗对照组制备(不含葡聚糖、泊洛沙姆佐剂)

水相：总量为30毫升(取96份ORT A型、B型灭活抗原、加入4 份灭菌吐温80)。

油相：总量为70毫升(10号轻质白油94份，硬脂酸铝2份，白油加热并加入硬脂酸铝搅拌至透明，再加入span80 6份，高压灭菌)；

配制、乳化：白油佐剂相：抗原相按照7:3或6:4比例进行乳化，乳化过程为3000rpm/min低速搅拌5min，8000rpm/min高速搅拌3min 后制得。

表1疫苗稳定性、粘度系数和pH值的测定结果

按照中华人名共和国兽药典三部2015年版，油佐剂灭活疫苗【性状】检查剂型、稳定性、粘度规定，疫苗2(1％泊洛沙姆407+2％葡聚糖疫苗)、疫苗4(2％泊洛沙姆407+2％葡聚糖)水相体积大于0.5ml, 判断其稳定性较差。

因此，确定优化的泊洛沙姆407为抗原水相体积占1％，β-1，3/1， 6葡聚糖添加剂量为抗原水相体积占1％。

实施例2鼻气管鸟疫杆菌免疫佐剂的筛选

本实施例旨在以白油和/或β-1，3/1，6葡聚糖为免疫佐剂，与鼻气管鸟疫杆菌A、B型抗原乳化制备成疫苗，评价免疫佐剂配合后的免疫效力。

1、材料

1.1菌株与实验动物

生产种子菌株：ORT-SD(B型)、ORT-98(A型)来自本课题组分离和鉴定；

攻毒菌株：ORT-98，血清型A，北京市农林科学院陈小玲研究员惠赠；

试验动物：3周龄SPF鸡70只，购自北京维通梅里亚实验动物有限公司

1.2主要试剂与试剂盒

鸡细胞因子ELISA抗体检测试剂盒:购自美国Kingfisher Inc公司；

ORT抗体检测ELISA试剂盒，购自美国IDEXX公司；

对照组疫苗Nobilis OR Inac：购自荷兰Intervet公司，主要含A血清型ORT。

2、方法

2.1菌株的培养及灭活

以复苏后的生产种子菌ORT-SD以及ORT-98型标准株，先在5％绵羊血琼脂培养基上37℃、5％CO2条件下孵育48h，然后挑取单个菌落，传代至TSB培养基(添加5％-10％鸡血清)，160rpm/min，37℃孵育24h，以平板稀释涂布法做菌落计数，按菌液量的0.3％加甲醛震荡灭活48h，然后离心浓缩，使其抗原量能够达到 1.0x10⁹CFU/0.25ml，作为制苗用抗原。乳化过程见附录。

2.2疫苗制备方法

疫苗1、疫苗3、疫苗5、疫苗6和疫苗7：按照实施例1的方法制备。

油佐剂对照组(白油佐剂组)疫苗制备：水相总量为30毫升(取 96份灭菌生理盐水、加入4份灭菌吐温80)。油相总量为70毫升(10号轻质白油94份，硬脂酸铝2份，白油加热并加入硬脂酸铝搅拌至透明，再加入span80 6份，高压灭菌)；抗原相按照7:3或6:4比例进行乳化，乳化过程为3000rpm/min低速搅拌5min，8000rpm/min高速搅拌3min后制得。

2.3动物分组及免疫

选取SPF白色来航鸡60只，分为6组，按照表2分组和剂量进行免疫，每羽鸡注射剂量为0.5ml，Intervet疫苗对照，10只鸡在21日龄的时候颈部皮下注射0.25ml Intervet公司生产的ORT单价油乳剂灭活疫苗，免疫后14d、21d、28d，分别采血测抗体。

表2分组及免疫

3、评价指标

3.1抗体水平测定

分别于免疫后第14d、21d和28d翅静脉窦采血分离血清以IDEXX 公司的ELISA试剂盒测定抗体水平。

3.2攻毒保护试验

免疫后28天后以ORT-98攻毒感染，ID50＝1.1x10⁸CFU/ml，喉头气管接种，感染后第10天处死全部鸡只，评价靶器官细菌载量。肺脏/脾脏无菌称取1g，以1mlPBS匀浆，取一定量的匀浆涂板，鉴别方法同上。同时采集血液和分离血清，以Kingfisher公司鸡细胞因子检测试剂盒测定几种细胞因子的含量。

另外，剖检存活鸡只和观察靶器官肺脏、胸气囊、腹气囊、气管、支气管以及肾脏，进行相应的评分。

病变评价标准：胸腔气囊：无异常病变＝0；一侧气囊有纤维素性渗出物＝1；两侧气囊有纤维素性渗出物＝2。腹腔气囊：无异常病变＝0；一侧气囊有纤维素性渗出物＝1；两侧气囊有纤维素性渗出物＝2。肺脏：无异常病变＝0；单侧性肺炎＝1；双侧性肺炎＝ 2。气管：无异常病变＝0；气管环出血＝1。

4、结果

相对增重率的比较：经SPSS分析免疫后第28天疫苗1、疫苗3、疫苗5、疫苗7、Intervet对照组相对增重明显高于白油佐剂对照组，进口疫苗Intervet组与疫苗1、疫苗3、疫苗5、疫苗6和疫苗7组差异不显著(P>0.05)。如下表3所示，28日龄后疫苗1、疫苗3、疫苗5、疫苗6 和疫苗7组与Intervet对照组差异不显著，但是显著性高于佐剂对照组 (P<0.05)。

表3不同佐剂疫苗对相对增重的影响

分组	免疫0d体重	14d相对增重率	28d相对增重率
				疫苗1	217.58±21.38	177％<sup>a</sup>	123％<sup>a</sup>
疫苗3	208.30±21.51	172％<sup>a</sup>	128％<sup>a</sup>
				疫苗5	206.1±21.51	170％<sup>a</sup>	120％
疫苗7	213.66±17.54	160％<sup>a</sup>	135％<sup>a</sup>
				Intervet疫苗	209.66±21.51	192％<sup>a</sup>	131％<sup>a</sup>
油佐剂对照组	209.08±13.15	100％<sup>b</sup>	100％<sup>b</sup>

注：同一列中^a-b，b-c显示差异显著P<0.05^；a-c显示差异极其显著P<0.01。

抗体水平的比较：免疫后疫苗1、疫苗3、疫苗5、疫苗7和Intervet 对照组抗体水平在14天、21天呈现逐渐增长趋势，其中疫苗7(白油佐剂疫苗)诱导抗体与疫苗1、疫苗3和疫苗5相比，呈现显著性降低。 28天后，疫苗1显著性高于疫苗3、疫苗5、疫苗7、Intervet疫苗组，如下表4所示。

表4不同免疫佐剂对ORT抗体水平的影响

注：同一列中^a-b，b-c显示差异显著P<0.05；^a-c显示差异极其显著P<0.01。

淋巴细胞增殖比较：刺激指数＝实验组OD值/不免疫对照组OD 值。免疫后第18天测定外周血液中淋巴细胞的增殖指数，结果显示疫苗1、疫苗2组诱导的淋巴细胞增殖指数显著性高于疫苗5、疫苗6组和进口Intervet疫苗(P<0.05)，但是疫苗1和疫苗3组差异性不显著，如下表5所示。

表5不同免疫佐剂组诱导的淋巴细胞增殖结果

分组	28d测定OD值	刺激指数
			疫苗1	0.623±0.09	2.67<sup>a</sup>
疫苗3	0.581±0.05	2.49<sup>a</sup>
			疫苗5	0.485±0.05	2.08<sup>b</sup>
疫苗7	0.310±0.05	1.33<sup>b</sup>
			Intervet疫苗	0.338±0.03	1.45<sup>b</sup>
油佐剂对照组	0.233±0.06	1.0<sup>c</sup>

注：同一列中^a-b，b-c显示差异显著P<0.05；^a-c显示差异极其显著P<0.01。

靶器官指数的比较：经SPSS独立秩和检验SPSS分析发现：肺脏病变指数方面，疫苗1、疫苗3显著性低于疫苗5、疫苗7和进口Intervet 组(P<0.05)。

在气囊病变指数方面，疫苗1、疫苗3、疫苗5显著性低于疫苗7 和Intervet疫苗组(P<0.05)。

在气管病变指数方面，疫苗1、疫苗3与疫苗5、疫苗7和Intervet 对照组相比，病变指数显著性降低(P<0.05)，具体见下表6。

表6不同免疫佐剂组对肺脏、气囊和气管病变指数的影响

注：同一列中^{a-b，b-c，c-d}显示差异显著P<0.05；^a-c，a-d显示差异极其显著P<0.01。

对肺脏组织ORT分离率的影响：表7显示攻毒后从疫苗1、疫苗3、疫苗5、疫苗7和Intervet对照组ORT病原分离率分别为0、20％、20％、 20％和20％。经SPSS分析，疫苗1与疫苗3、疫苗5、疫苗7和进口Intervet 三个组的分离率之间差异显著。

表7靶器官载量及分离率

分组	数量	分离数	分离率
				疫苗1	5	0	0
疫苗3	5	1	20％
				疫苗5	5	1	20％
疫苗7	5	1	20％
				Intervet疫苗	5	1	20％
油佐剂对照组	5	4	80％

注：同一列中^{a-b，b-c，c-d}显示差异显著P<0.05；^a-c，a-d显示差异极其显著P<0.01。

5、结论

ORT不同佐剂疫苗免疫后，以相对体重、抗体水平、淋巴细胞增殖、靶器官病变指数和病原分离5个指标进行评价，1％泊洛沙姆407+1％葡聚糖为佐剂，免疫效力优于白油佐剂和进口Intervet对照疫苗。

实施例3鼻气管鸟疫杆菌对鸭子的免疫保护试验

本实施例旨在评价白油+葡聚糖为佐剂制备的ORT二价灭活油乳剂疫苗对鸭的免疫效力。

1、材料

1.1试剂及培养基：

5％绵羊血琼脂平板或巧克力琼脂平板和血琼脂培养基：购自北京广大恒益科技有限公司；

对照组疫苗：购自以色列ABIC公司，主要含A、B、C三种血清型ORT。

1.2实验动物：1日龄健康北京鸭40只，品种北京金星鸭，鼻气管鸟疫杆菌检测阴性，购自北京南口农场养鸭场。

1.3菌株：

攻毒菌株：ORT-98，血清型A，北京市农林科学院陈小玲研究员惠赠；

攻毒菌株：ORT Germany株，血清型B，德国柏林自由大学 Hafez教授赠送；

1.4 ELISA抗体检测试剂盒：美国IDEXX公司生产的ELISA抗体检测试剂盒。

2、方法

2.1白油+葡聚糖佐剂灭活疫苗的制备

按照实施例1的方法制备获得疫苗1。

2.2免疫接种

30只饲养至10日龄的肉鸭随机分成3组，每组10只，A组为免疫 ABIC阳性疫苗组，B组为免疫自制疫苗0.5ml/羽份组，C组为免疫 PBS单独饲养在独立的隔离器内苗作为攻毒对照组。免疫接种途径全部为颈部皮下。免疫后14、21天采血，每组10只，以Biochek公司的抗体ELISA试剂盒测定抗体水平。

2.3免疫后攻毒

2.3.1攻毒菌液的制备

挑取单个攻毒菌株的菌落接种胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基，37℃培养12-24h，菌液浑浊后经行菌落计数，并以PBS洗涤重悬后，以10LD50的参考剂量作为攻毒菌液。

攻毒剂量和方法

免疫接种21天后，分别经喉头接种ORT A型和B型攻毒菌株 0.5ml/只(10ID50)参照实施例2的攻毒剂量，攻毒后连续观察。10 天后存活的鸡只称重，剖检检查气囊、气管和肺脏等潜在的靶器官的病理学变化。

表8免疫分组和接种

表9攻毒情况

注：参考ORT-98菌株的ID50实验得出的结论ID50＝1.1x10⁸CFU/ml

2.3.4器官病变指数

参照实例一中的器官评价标准，对攻毒后各个组的鸭进行靶器官病变评分。

3、结果

相对增重：经过SPSS对免疫后21d的各个组鸭子的相对增重进行差异性分析，显示三个组之间无显著性差异(P>0.05)。

表10免疫后体重变化

，注：同一列中^{a-b，b-c，c-d}显示差异显著P<0.05；^a-c，a-d显示差异极其显著P<0.01。

如下表11所示，ABIC疫苗组与自制疫苗组之间无论是在免疫后第14天，还是在免疫后第21天，组间抗体水平无显著性差异。

表11抗体滴度变化规律

注：同一列中^{a-b，b-c，c-d}显示差异显著P<0.05；^a-c，a-d显示差异极其显著P<0.01。

观察靶器官病变，攻毒A型ORT的各个组中，自制疫苗组的胸气囊病变和肺脏病变，分别与攻毒对照组相比表现为差异极显著 (P<0.01)和差异显著(P<0.05)，自制疫苗组的病变指数最为轻微。攻毒B型ORT的各个组中，只有ABIC组胸气囊的病变指数与攻毒对照的相比有显著性差异(P<0.05)，而ABIC疫苗组与自制疫苗组相比无显著性差异。

表12 ORT A型攻毒后靶器官的病变指数

注：同一列中^a-b，b-cP<0.05，^a-cP<0.01

表13 ORT B型攻毒后靶器官病变指数

注：同一列中^a-b，b-cP<0.05，^a-cP<0.01

4、结论

以白油+葡聚糖为佐剂与ORT两种血清型的抗原配制成的疫苗，以0.25ml/羽份，免疫鸭子，同样能够对鸭子产生良好的免疫保护效果。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种禽鼻气管鸟疫杆菌A/B血清型二价灭活疫苗，其特征在于，其抗原分别为A血清型禽鼻气管鸟疫杆菌菌株和B血清型禽鼻气管鸟疫杆菌菌株，二者在疫苗中的含菌量均不小于1.0x10⁹ CFU/mL；

所述疫苗的佐剂由泊洛沙姆407和β葡聚糖组成；

所述疫苗的剂型为油包水型。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述A血清型禽鼻气管鸟疫杆菌菌株为保藏编号为CGMCC No.14528的ORT-98株，所述B血清型禽鼻气管鸟疫杆菌菌株为保藏编号为CGMCC No.14529的ORT-SD株。

3.根据权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗中两种抗原以等比例混合。

4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于，其制备方法为：

(1)利用A、B血清型禽鼻气管鸟疫杆菌菌株制备液体抗原；

(2)向液体抗原中加入1～5％(w/v)的泊洛沙姆407和1～4％(w/v)的β葡聚糖制备成水相；

(3)按照水相：油相的体积比为4:6的比例经过乳化制备而成。

5.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述泊洛沙姆407由聚氧乙烯与聚丙乙烯以7∶3的比例构成；所述β葡聚糖为β-1，3/1，6葡聚糖。

6.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述油相为以下重量份的原料制备得到的混合物：10号轻质白油94份、硬脂酸铝2份、span80 6份。

7.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述步骤(2)为向液体抗原中加入1％(w/v)的泊洛沙姆407、1％(w/v)的β葡聚糖佐剂制备成水相。

8.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，其制备方法为：

(1)将两株禽鼻气管鸟疫杆菌种子菌0RT-SD、ORT-98株分别接种在含有4％绵羊血琼脂平板上，后挑取单个菌落接种于含有5％～10％鸡血清的TSB培养基中，37℃，200rpm/min条件下培养12～24h后收集菌液，灭活备用；

(2)选择1～5％的泊洛沙姆和1-4％β葡聚糖作为缓释佐剂，与灭菌吐温80进行乳化后，取抗原ORT-98A型和ORT-SD B型抗原制成每ml抗原液以上2种抗原均不少于1.0x10⁹CFU的菌落数；将制备好的油相和水相等体积混合，低速搅拌1000rpm/min-3000rpm/min，5-10min，高速乳化6000rpm/min-8000rpm/min，3-5分钟，制备获得灭活疫苗。

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