CN110862938B - 一株猪致病性大肠杆菌菌株及其灭活疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明从发病严重的猪场分离得到一株强致病性、高致死率的猪致病性大肠杆菌E.coli‑HuNHY19，并将其灭活制备得到灭活疫苗，所述疫苗对于仔猪具有良好的免疫保护效果，其能实现仔猪对于该大肠杆菌的完全保护，对于同血清型O8的毒株也具有很好的保护效果，对于其他血清型也具有一定的免疫交叉保护效果，通过母猪免疫试验发现，所述的灭活疫苗能够很好的刺激初产母猪产生抗体，其初乳中抗体水平和衰减速度都极优于现有分离的同血清型菌株，能够实现对于哺乳期的仔猪较好的保护。

Description

一株猪致病性大肠杆菌菌株及其灭活疫苗

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一株猪致病性大肠杆菌菌株及其灭活疫苗。

背景技术

大肠杆菌是人和动物肠道共生菌群的组成部分，部分致病性大肠杆菌能引起人和动物的腹泻、败血症等多种症状。猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的一种小猪肠道传染病，其中以仔猪黄痢、仔猪白痢和小猪水肿病为常见临床病症，以及由其他病因继发大肠杆菌后产生腹泻等情况。仔猪黄痢主要表现为拉黄色或黄绿色稀粪，粪内含凝乳片和小气泡，腥臭。仔猪腹泻后迅速消瘦、脱水和死亡，死亡率可高达50%以上。仔猪白痢主要表现为拉白色、黄白色稀粪，干涸后为瓷白色，病猪的体温和食欲一般无明显变化，但可看到仔猪皮毛粗糙，发育迟缓，经治疗后绝大多数可恢复正常，死亡率较低。

肠道致泻性大肠杆菌依其致病机制、临床表现、流行病学特征和血清学分型，可分为５个群：肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠产毒性大肠杆菌（ETEC）、肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）、肠出血性大肠杆菌（EHEC）、肠聚集性大肠杆菌（EAEC）.产肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxigenic E.coli，ETEC）是幼龄动物（仔猪、犊牛、羔羊等）腹泻中常见而且重要的致病菌之一，初生仔猪感染 ETEC 后，常因剧烈水样腹泻而迅速脱水死亡，ETEC引起仔猪腹泻的主要毒力因子包括具有宿主特异性的黏附素和肠毒素，通过细菌表面的黏附素吸附到宿主小肠上皮细胞，然后在小肠内定居和增殖，当由 ETEC 产生的肠毒素作用于小肠上皮细胞表面时，改变小肠吸收、分泌的功能，蓄积大量水、电解质，从而导致小肠上皮细胞的代谢功能发生紊乱，导致急性腹泻、脱水，最后衰竭死亡。ETEC 主要有不耐热性肠毒素（LT）和耐热性肠毒素（ST）。导致仔猪腹泻的ETEC主要包括O138、O139、O141等血清型，危害断奶后1-2周的仔猪，尤其是发育良好的仔猪群，导致腹泻、皮下组织水肿和神经系统病，造成很大的经济损失。然而，迄今国内尚无商品化的，能够针对多种血清型的ETEC具有防疫效果的大肠杆菌疫苗或相关药物。

发明内容

基于现有技术中猪大肠杆菌病防治中存在的难点，本发明通过分离获得了一株具有良好免疫原性的猪致病性大肠杆菌菌株E.coli-HuNHY19，并将其制备成灭活疫苗，对于猪致病性大肠杆菌感染引起的腹泻具有良好的预防作用。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术手段：

一株猪致病性大肠杆菌菌株，为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），命名为E.coli-HuNHY19，所述菌株已于2019年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏号为CGMCC No.17622。

本发明还请求保护E.coli-HuNHY19在制备用于预防猪腹泻的药物中的应用。

优选的，所述猪腹泻是由于猪致病性大肠杆菌感染所导致的。

优选的，所述猪腹泻是由于猪致病性大肠杆菌O8血清型感染所导致的。

本发明还涉及一种猪致病性大肠杆菌灭活疫苗，所述灭活疫苗是包含保藏编号为CGMCC No.17622的猪致病性大肠杆菌菌株E.coli-HuNHY19的灭活疫苗。

优选的所述猪致病性大肠杆菌灭活疫苗中，灭活的E.coli-HuNHY19菌株的抗原含量≥2.5×10⁸CFU/mL。

所述猪致病性大肠杆菌灭活疫苗还包含佐剂，所述猪致病性大肠杆菌灭活疫苗中E.coli-HuNHY19菌株与佐剂的体积比为1:1。

优选的，所述佐剂为Montanide ISA 206佐剂。

本发明还涉及猪致病性大肠杆菌灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：

第一步，制备猪致病性大肠杆菌E.coli-HuNHY19灭活抗原：

第二步，配制疫苗：向检验合格的灭活后的菌液中等体积加入32℃的ISA206 佐剂充分乳化，根据产品规格进行分装，即得到所述猪致病性大肠杆菌灭活疫苗。

优选的猪致病性大肠杆菌灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：

第一步，制备猪致病性大肠杆菌E.coli-HuNHY19灭活抗原：

（1）E.coli-HuNHY19的培养：将冻存的E.coli-HuNHY19经复苏、平板划线活化后，挑取单菌落接种至LB液体培养基的试管中，37℃摇床培养12-18小时得到种子液，而后按2%的体积比接种至三角瓶或者细胞培养容器中，培养至对数生长期；

（2）E.coli-HuNHY19的灭活：向培养至对数生长期的E.coli-HuNHY19培养液中加入0.3%的甲醛溶液，恒温摇床37℃ 120rpm的转速下灭活24h，将灭活后的E.coli-HuNHY19用pH=7.4的PBS洗涤3-5次后用PBS重悬浮，调整菌液浓度至5×10⁸CFU/mL；

（3）安全性检查：取100μL灭活后的菌液涂布于LB 平板培养24 h，观察是否有菌落生长，进行安全性检验，检验合格后置于4℃保存，备用；

第二步，配制疫苗：向检验合格的灭活后的菌液中等体积加入32℃的ISA206 佐剂充分乳化，根据产品规格进行分装，即得到所述猪致病性大肠杆菌灭活疫苗。

基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：

本发明从发病严重的猪场分离得到一株强致病性、高致死率的猪致病性大肠杆菌E.coli-HuNHY19，并将其灭活制备得到灭活疫苗，所述疫苗对于仔猪具有良好的免疫保护效果，其能实现仔猪对于该大肠杆菌的完全保护，对于同血清型O8的毒株也具有很好的保护效果，对于其他血清型也具有一定的免疫交叉保护效果，通过母猪免疫试验发现，所述的灭活疫苗能够很好的刺激初产母猪产生抗体，其初乳中抗体水平和衰减速度都极优于现有分离的同血清型菌株，能够实现对于哺乳期的仔猪较好的保护。

附图说明

图1：大肠杆菌的多重PCR鉴定图：M，Maker；1，E.coli-HuNHY17；2，E.coli-HuNHY18；3，E.coli-HuNHY19；4，E.coli-HuNHY20；5，ATCC25922。

图2：病死仔猪进行剖解图：图A可以看出，发病仔猪肠道胀气严重，其中含有黄绿色液体；图B可以看见肾弥散性出血斑。

具体实施例

实施例1：猪致病性大肠杆菌的分离、鉴定和保藏

1.1病料的采集

2016年7月在衡阳市郊某中型养殖场，在2个月内连续出现多栏仔猪发生严重腹泻，且经抗生素治疗未能控制病情，死亡率高达20%。无菌采集病死仔猪的肠道组织和肠道内容物，将样品分别进行MAC平板划线，倒置放于37℃恒温培养箱培养12-16h，然后挑取粉红色或红色疑似大肠杆菌单菌落接种于伊红美兰培养基上，37℃恒温培养箱培养12-16h，挑取紫黑色带金属光泽的单个菌落接种于LB试管中，37℃摇床160r/min培养16h，与50%甘油1:1混合后放于-40℃冻存，通过分离，得到4株大肠杆菌。

大肠杆菌的分离鉴定

采用多重PCR方法，快速对分离的4株大肠杆菌进行分类和筛选，不耐热肠毒素和耐热肠毒素是ETEC的重要毒力因子，编码 β-葡萄糖醛酸酶的 uidA 基因是大肠杆菌种所特有的，参照王涛（“生鲜猪肉中产肠毒素大肠杆菌多重PCR检测方法研究”，《西北农林科技大学》，2015年）构建的产肠毒素大肠杆菌多重PCR检测方法，采用其引物和相关检测方法（参见论文第三章）对分离的4株大肠杆菌进行检测，采用大肠杆菌ATCC25922作为对照，具体检测结果参见图1。从图1展示的结果可知分离得到的4株大肠杆菌均存在热不稳定肠毒素基因LT、耐热性肠毒素基因 sta 以及大肠杆菌特有的编码β-葡萄糖醛酸酶的uidA 基因，均为产肠毒素型大肠杆菌（ETEC），分别命名为：E.coli-HuNHY17、E.coli-HuNHY18、E.coli-HuNHY19、E.coli-HuNHY20。

小鼠致病性试验

采用LB培养基，将E.coli-HuNHY17、E.coli-HuNHY18、E.coli-HuNHY19、E.coli-HuNHY20分别培养至对数生长期，离心后用PBS洗菌3次后采用PBS重悬浮，调整期浓度为1×10⁹CFU/mL，分别将E.coli-HuNHY17、E.coli-HuNHY18、E.coli-HuNHY19、E.coli-HuNHY20悬浮菌液灌喂攻毒3周龄实验用昆明小鼠，每只小鼠接种1mL，每个菌株攻毒10只小鼠，选取PBS作为对照组，观察5天，记录小鼠致死情况，具体致死情况见下表1：

表1 小鼠致病性试验结果

通过以上表1的结果可知，分离得到的4株菌株均具有100%的致死率，在相同饲喂条件下，E.coli-HuNHY19最早达到半数致死（即死亡5只小鼠），可见，相比其他三株菌株，E.coli-HuNHY19属于优势的强毒菌株，采用玻片凝集试验进行血清型鉴定，其血清型为O8血清型。

菌株的保藏

对于分离得到的强毒菌株E.coli-HuNHY19，于2019年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏号为CGMCC No.17622。

实施例2：猪致病性大肠杆菌灭活疫苗的制备

2.1 灭活疫苗中最佳含菌量的选择

取4周龄仔猪40头，分为5组，每组8头，其中疫苗免疫试验组1-4以及对照实验组，免疫试验组分别接种的免疫剂量为1×10⁹CFU/头份、5×10⁸CFU/头份、2.5×10⁸CFU/头份、1.25×10⁸CFU/头份（疫苗制备方法参见以下2.2灭活疫苗的制备方法），对照组采用注射同样剂量的PBS，采用同样的饲喂管理条件，首免14天后加强免疫一次。在每次免疫后第10天分别静脉采血，分离血清，采用间接ELISA方法检测血清中的抗体水平，同时记录注射后仔猪的发热天数。二免后14天，试验动物分别采用1×10⁹CFU/头份的未灭活E.coli-HuNHY19进行攻毒，记录攻毒后14天内的发病情况，并且对于发病的仔猪及时采用抗生素治疗，记录14天后的存活情况，进而得到攻毒保护率，具体结果参见下表2.

表2 不同免疫剂量免疫后的血清效价和生长情况

注：以上血清稀释度是指同一批动物中，免疫后最低的血清稀释度。

基于以上表2的结果可知，当免疫剂量为1×10⁹CFU/头份、5×10⁸CFU/头份、2.5×10⁸CFU/头份、1.25×10⁸CFU/头份时，其均能起到100%的免疫保护作用；而1.25×10⁸CFU/头份的接种量，其不能实现动物的完全保护，在攻毒后仍表现出37.5%的仔猪腹泻发病，经治疗后其仍有1头仔猪死亡；但是由于大肠杆菌本身的刺激性，其会带来接种动物的高热反应，在试验期间，1×10⁹CFU/头份、5×10⁸CFU/头份均表现出较长的发热期，在发热期，仔猪的食欲下降、精神低落、应激反应明显，后期生长状况也相比组3和4略差，因此，综合考虑动物保护率、血清效价和接种后的应激反应，最终确定，对于仔猪，灭活疫苗最佳含菌量为2.5×10⁸CFU/头份。

对于组5的病死仔猪进行剖解发现，其表现出典型的大肠杆菌病症状，具体剖检结果参见图2，其中图2A可以看出，发病仔猪肠道胀气严重，其中含有黄绿色液体；图2B可以看见肾弥散性出血斑，均为典型的大肠杆菌病症状。

2.2 灭活疫苗的制备方法

猪致病性大肠杆菌灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：

第一步，制备猪致病性大肠杆菌E.coli-HuNHY19灭活抗原：

（1）E.coli-HuNHY19的培养：将冻存的E.coli-HuNHY19经复苏、平板划线活化后，挑取单菌落接种至LB液体培养基的试管中，37℃摇床培养12-18小时得到种子液，而后按2%的体积比接种至三角瓶或者细胞培养容器中，培养至对数生长期；

（2）E.coli-HuNHY19的灭活：向培养至对数生长期的E.coli-HuNHY19培养液中加入0.3-0.4%的甲醛溶液，恒温摇床37℃ 120rpm的转速下灭活24h，将灭活后的E.coli-HuNHY19用pH=7.4的PBS洗涤3-5次后用PBS重悬浮，调整菌液浓度至5×10⁸CFU/mL；

（3）安全性检查：取100μL灭活后的菌液涂布于LB 平板培养24 h，观察是否有菌落生长，进行安全性检验，检验合格后置于4℃保存，备用；

第二步，配制疫苗：向检验合格的灭活后的菌液中等体积加入32 ℃的ISA206 佐剂充分乳化，根据产品规格进行分装，即得到所述猪致病性大肠杆菌灭活疫苗。

实施例3：猪致病性大肠杆菌灭活疫苗免疫效力评价

3.1 灭活疫苗的免疫效力比较

3.1.1试验材料：E.coli-HuNHY19（CGMCC No.17622），E.coli-HuNHY18（自行分离），大肠杆菌CVCC1524（O8血清型，购自中国兽医微生物菌株保藏管理中心CVCC）。

试验方法：

（1）分别将E.coli-HuNHY19、E.coli-HuNHY18、大肠杆菌CVCC1524复苏活化后，按照本发明灭活疫苗的制备方法，相应制备得到灭活疫苗。

（2）取4周龄仔猪20头，分为4组，每组5头，其中疫苗免疫试验组1-3以及对照实验组，免疫试验组分别接种的免疫剂量为2.5×10⁸CFU/头份的相应的疫苗（疫苗制备方法参见以下2.2灭活疫苗的制备方法），对照组采用注射同样剂量的PBS，采用同样的饲喂管理条件，首免14天后加强免疫一次。在每次免疫后第10天分别静脉采血，分离血清，采用间接ELISA方法检测血清中的抗体水平。具体结果参见下表3.

表3 不同疫苗免疫后的血清效价

注：以上血清稀释度是指同一批动物中，免疫后最低的血清稀释度。

基于以上表3的结果可知，其相比现有分离的O8血清型大肠杆菌和本发明研发过程中分离的其他大肠杆菌，本发明分离保藏的E.coli-HuNHY19具有相对更好的免疫原性，其能免疫动物产生更高稀释度的血清抗体，对动物的保护性能更好。

进一步，对组1和组2的动物，在二免后14天，采用未灭活E.coli-HuNHY19和E.coli-HuNHY18进行攻毒，两种菌按1:1混合，攻毒剂量为1.5×10⁹CFU/头份，记录14天内的发病情况，对于发病的仔猪采用抗生素治疗，并记录14天后的最终存活情况。具体结果参见表4：

表4 不同疫苗攻毒后的生长和存活情况

基于以上表4结果可知，采用本发明分离保藏的E.coli-HuNHY19，其对于动物的保护效应优于分离自同一猪场的其他菌株，两者虽然都达到了100%的存活率，但是E.coli-HuNHY18灭活疫苗免疫以后，采用混合活菌攻毒，其存在较高的发病风险，且后期依赖于抗生素治疗，以上结果表明，本发明分离保藏的E.coli-HuNHY19所制备得到的疫苗具有很好的免疫保护效果，优于分离的同血清型大肠杆菌和同批次分离的其他菌株E.coli-HuNHY18。

母猪产前接种的保护效力评价

选择衡阳市某繁殖场的健康无病初产母猪6头，随机分为3组，颈部皮下多点注射大肠杆菌疫苗，产前28天进行首次免疫，免疫剂量为2头份（即2mL）；产前14天进行二次免疫，免疫剂量为4头份（即4mL），其中组1-2为试验组，分别注射E.coli-HuNHY19和CVCC1524制备得到的灭活疫苗，组3为对照组，注射生理盐水。采用试管稀释、平板反应法, 测定初乳抗体效价，以凝集反应(++)以上血清最高稀释倍数作为凝集价判定标准, 用nlog2表示。具体结果参见以下表5。

表5 免疫母猪初乳抗体效价变化情况

基于以上表5的结果可知，本发明分离保藏的E.coli-HuNHY19所制备的疫苗相比现有的大肠杆菌具有更好的免疫原性，能够更好的刺激初产母猪产生抗体。其初乳中抗体水平远高于CVCC1524所制备得到的疫苗，而初乳中的抗体水平的衰减更慢，第26天仍为7log2，相比现有分离的菌株，对仔猪具有更好的保护效应。

交叉保护效力评价

将100只4周龄昆明小鼠随机分为10组，其中组1-5为免疫组，组5-10为对照组，组1-5均采用本发明制备得到的E.coli-HuNHY19疫苗进行免疫接种，首次免疫后14天进行二次免疫（基于体重差异，每只小鼠接种量为0.5mL，即0.5头份）。对照组注射生理盐水。在同等饲喂条件下，在二免后14天，组1-4、6-9分别采用E.coli-HuNHY19、CVCC1524（O8：K91，K88ac，购自中国兽医微生物菌株保藏管理中心CVCC）、CVCC1510（O9：K88ac，购自中国兽医微生物菌株保藏管理中心CVCC）、CVCC200（O149：K91，K88ac，购自中国兽医微生物菌株保藏管理中心CVCC）进行攻毒，记录攻毒后第14天的存活率，具体结果参见下表6:

表6 交叉保护试验结果

基于以上表6的结果可知，本发明所制备得到的疫苗不仅对于E.coli-HuNHY19以及同血清型的CVCC1524具有良好的保护率，对于其他典型的血清型，如O9血清型的CVCC1510和O149血清型的CVCC200也都具有良好的免疫保护效果。

Claims (9)

1.一株猪致病性大肠杆菌菌株，为大肠埃希氏菌（ Escherichia coli） ，命名为E.coli-HuNHY19，所述菌株已于2019年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏号为CGMCC No.17622。

2.权利要求1所述的E.coli-HuNHY19在制备用于预防猪腹泻的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，所述猪腹泻是由于猪致病性大肠杆菌O8血清型感染所导致的。

4.一种猪致病性大肠杆菌灭活疫苗，所述灭活疫苗是包含保藏编号为CGMCC No.17622的猪致病性大肠杆菌菌株E.coli-HuNHY19的灭活疫苗。

5.根据权利要求4所述的猪致病性大肠杆菌灭活疫苗，所述猪致病性大肠杆菌灭活疫苗中，灭活的E.coli-HuNHY19菌株的抗原含量≥2.5×10⁸CFU/mL。

6.根据权利要求4所述的猪致病性大肠杆菌灭活疫苗，所述猪致病性大肠杆菌灭活疫苗还包含佐剂，所述猪致病性大肠杆菌灭活疫苗中抗原与佐剂的体积比为1:1。

7.根据权利要求6所述的猪致病性大肠杆菌灭活疫苗，所述佐剂为Montanide ISA 206佐剂。

8.权利要求7所述的猪致病性大肠杆菌灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：

第一步，制备猪致病性大肠杆菌E.coli-HuNHY19灭活抗原：

第二步，配制疫苗：向检验合格的灭活后的菌液中等体积加入32 ℃的ISA206 佐剂充分乳化，根据产品规格进行分装，即得到所述猪致病性大肠杆菌灭活疫苗。

9.根据权利要求8所述的猪致病性大肠杆菌灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：

第一步，制备猪致病性大肠杆菌E.coli-HuNHY19灭活抗原：

（1）E.coli-HuNHY19的培养：将冻存的E.coli-HuNHY19经复苏、平板划线活化后，挑取单菌落接种至LB液体培养基的试管中，37℃摇床培养12-18小时得到种子液，而后按2%的体积比接种至三角瓶或者细胞培养容器中，培养至对数生长期；

（2）E.coli-HuNHY19的灭活：向培养至对数生长期的E.coli-HuNHY19培养液中加入0.3%的甲醛溶液，恒温摇床37℃120rpm的转速下灭活24h，将灭活后的E.coli-HuNHY19用pH=7.4的PBS洗涤3-5次后用PBS重悬浮，调整菌液浓度至5×10⁸CFU/mL；

（3）安全性检查：取100μL灭活后的菌液涂布于LB 平板培养24 h，观察是否有菌落生长，进行安全性检验，检验合格后置于4℃保存，备用；

第二步，配制疫苗：向检验合格的灭活后的菌液中等体积加入32 ℃的ISA206 佐剂充分乳化，根据产品规格进行分装，即得到所述猪致病性大肠杆菌灭活疫苗。

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