KR101694427B1 - 신규한 에드워드시엘라 타르다 et-191 균주 및 상기 균주를 포함하는 어류의 에드워드 감염증 예방용 불활화 백신 - Google Patents

신규한 에드워드시엘라 타르다 et-191 균주 및 상기 균주를 포함하는 어류의 에드워드 감염증 예방용 불활화 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주, 상기 균주를 포함하는 어류의 에드워드 감염증 예방용 불활화 백신 및 어류의 에드워드 감염증 예방 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규한 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주를 이용한 어류의 에드워드 감염증 예방용 불활화 백신은 에드워드 감염증에 대해 효과적으로 면역을 증진시키는 효과를 나타냄으로써 이를 효과적으로 예방할 수 있어, 어류의 양식 산업등에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주 및 상기 균주를 포함하는 어류의 에드워드 감염증 예방용 불활화 백신{Novel Edwardsiella tarda ET-191 and inactivated vaccine against edwardsiellosis in fish comprising thereof}
본 발명은 신규한 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주, 상기 균주를 포함하는 어류의 에드워드 감염증 예방용 불활화 백신 및 어류의 에드워드 감염증 예방 방법에 관한 것이다.
뱀장어(Anguilla japonica)는 국내 양식어종 가운데 넙치에 이어 두 번째로 많이 생산되는 어종으로, 내수면 양식어종으로는 가장 높은 양식 비중을 차지하고 있다. 국내에서는 극동산 뱀장어를 주로 양식하고 있으며 (뱀장어 양식 표준지침서, 국립수산과학원, 2009), 주로 자연산 실뱀장어를 체포하거나 체포된 실뱀장어를 수입하고 기르고 있는 실정이다. 뱀장어 양식은 주로 30℃ 전후의 고온의 가온양식법을 사용하고 있으나, 연중 고온을 유지하며 양식하기 때문에 세균성 질병이 계절에 상관없이 발생한다. 뱀장어 양식 산업에서 경제적 피해를 초래하는 주요 세균성 질병으로는 에드워드 감염증(Edwardsiellosis), 에로모나스증 등이 있다(김진우 외, 한국어병학회지 25(3):271-277, 2012).
뱀장어에서 에드워드 감염증은 장내 세균의 일종인 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda)가 원인균으로서, 뱀장어 양만장의 사육 수조가 더럽거나 낮은 환수율 및 오염된 사료 공급과 같이 양식 환경이 나쁠 때 실뱀장어에서 성어에 이르기까지 모든 사육단계에서 발병하는 질병이다. 특히, 고온 가온 양식법을 이용하는 양만장에서는 연중 내내 상기 질병으로 인한 피해가 속출하고 있다. 뱀장어 에드워드 감염증의 주요 외부 증상은 복부 팽만; 지느러미 및 복부가 붉게 변함; 항문의 확대 또는 돌출; 항문의 붉어짐 및 종창이다. 감염된 어류를 부검하면 출혈성 복수가 고여 있고 복막염이 발생함을 관찰 할 수 있으며, 시장과 간장에 농양 병소를 형성함을 확인할 수 있다.
해산어 중 넙치의 에드워드 감염증과 관련하여 예방용 불활화 백신이 최근 개발되어 시판되고 있으나, 담수어류인 뱀장어에 대한 효과는 증명된 바가 없다. 게다가 개발된 넙치의 에드워드 감염증 예방용 백신은 복강 접종법을 권장하고 있으나, 뱀장어의 경우 종 특성상 몸체가 둥글고 마취 시 점액의 분비가 많아 넙치용 에드워드 감염증 백신 적용 및 효능조사의 어려움이 있다. 현재까지 뱀장어의 에드워드 감염증에 대한 백신개발이 이루어지지 않아 사양관리에 의존하여 질병의 피해를 줄이고 있는 실정이며, 사양관리 방법이 여의치 않을 경우에는 항생제를 사용하기 때문에 수산물 안전성 문제가 우려될 수 있다.
이에 본 발명자들은 뱀장어의 대표적인 세균성 질병인 에드워드 감염증의 예방에 대해 연구하던 중, 국내 뱀장어 양만장에서 주로 발생하는 신규 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주를 동정하였고, 이를 포함하는 불활화 백신 단독 또는 보조제(adjuvant)를 혼합한 백신이 뱀장어 에드워드 감염증 예방에 효과적임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 뱀장어로부터 분리된 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주(KCTC 18280P)를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주(KCTC 18280P)의 불활화 균체를 포함하는 어류의 에드워드 감염증 예방용 불활화 백신을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 불활화 백신을 어류에 투여하는 단계를 포함하는 어류의 에드워드 감염증 예방 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주(KCTC 18280P)의 불활화 균체를 유효성분으로 포함하는 어류의 에드워드 감염증의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 뱀장어로부터 분리된 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주(KCTC 18280P)를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주(KCTC 18280P)의 불활화 균체를 포함하는 어류의 에드워드 감염증 예방용 불활화 백신을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 불활화 백신을 어류에 투여하는 단계를 포함하는 어류의 에드워드 감염증 예방 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주(KCTC 18280P)의 불활화 균체를 유효성분으로 포함하는 어류의 에드워드 감염증의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 신규한 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주를 포함하는 어류의 에드워드 감염증 예방용 불활화 백신은 에드워드 감염증에 대해 효과적으로 면역을 증진시키는 효과를 나타냄으로써 이를 효과적으로 예방할 수 있어, 어류의 양식 산업등에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주의 TSA 및 SS 배지 성상 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 16S rRNA 유전자 서열을 기초로 하여, 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주와 표준주인 에드워드시엘라 타르다 ATCC15947를 포함하는 다른 에드워드시엘라 타르다 균주 간의 유전학적 근연관계를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 펄스장전기영동(PFGE; Pulsed-field gel electrophoresis)을 기초로 하여 에드워드시엘라 타르다 ET-191의 유전형을 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주와 표준주인 에드워드시엘라 타르다 ATCC15947를 포함하는 다른 에드워드시엘라 타르다 균주 간의 혈청 교차 응집 항체가를 나타낸 도이다.
도 5는 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주의 병원성 관여 유전자 분석 결과를 정성적으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 불활화 백신 단독 또는 보조제 혼합액을 뱀장어에 복강 접종 한 후 응집항체가 변화를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 불활화 백신 단독 또는 보조제 혼합액을 뱀장어에 복강 접종 한 후 넙치 및 뱀장어 유래 에드워드시엘라 타르다 균주에 대한 혈청 교차 응집반응의 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 불활화 백신 단독 또는 보조제 혼합액을 뱀장어에 복강 접종 한 후, 1 내지 14일 동안의 누적폐사율을 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 불활화 백신 단독 또는 보조제 혼합액을 뱀장어에 침지 접종을 하기 위한 백신프로그램의 모식도를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 백신 단독 또는 보조제 혼합액을 뱀장어에 침지 접종 후 혈청응집가의 변화를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 백신 단독 또는 보조제 혼합액을 도 9의 백신 프로그램에 따라 침지 접종한 후, 1 내지 14일 동안의 누적폐사율을 나타낸 도이다.
본 발명은 뱀장어로부터 분리된 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주(KCTC 18280P)를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주는 양식 뱀장어의 간장(肝臟) 병소 및 장출혈 증상을 보이는 간장에서 분리된 균주로, 그람 단간균이다.
본 발명의 일 실시예에서는, 국내산 뱀장어로부터 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주를 분리하였으며, 16S rRNA 유전자 서열을 통하여 동정한 결과 표준주인 에드워드시엘라 타르다 ATCC 15947과 99%의 상동성을 가져 에드워드시엘라 타르다로 동정하였다. 본 발명자들은 상기 에드워드시엘라 타르다 ET-191을 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC, korean collection for type cultures)에 2014년 04월 03일자로 기탁하여, 수탁번호 KCTC18280P를 부여 받았다.
본 발명에 있어서, 상기 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주는 통상의 배지에서 생육 가능하며, 상기 배지는 특정 미생물을 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다. 상기 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주는 통상의 배양방법에 따라 배양할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주(KCTC 18280P)의 불활화 균체를 포함하는 어류의 에드워드 감염증 예방용 불활화 백신을 제공한다.
상기 어류는 뱀장어, 넙치(광어), 조피볼락, 우럭, 감성돔, 참돔, 능성어, 숭어, 농어, 전어, 고등어, 전갱이, 쥐치 등을 의미하며, 바람직하게는 뱀장어과에 속하는 유럽뱀장어(Anguilla anguilla), 뱀장어(Anguilla japonica), 무태장어(Anguilla marmorata), 아메리카뱀장어(Anguilla rostrata)이나, 보다 바람직하게는 뱀장어(Anguilla japonica)이다.
본 발명에서 용어 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원성 물질을 함유한 생물학적인 제제(製劑)로서, 에드워드 시엘라증의 예방을 위하여 생물체에 주입 또는 주사하여 생체에 면역이 생기게 하는 면역원(免疫原)을 말한다. 생체 내 면역은 병원균의 감염 후에 생체 내 면역력이 자동으로 얻어지는 자동면역과 외부에서 주입한 백신에 의하여 얻어지는 수동 면역으로 크게 나누어진다.
상기 불활화 백신은 이 기술분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 불활화 백신을 제조하기 위해서는 불활성화제를 사용해야 하며, 이는 이 기술분야에 널리 공지된 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 불활화 백신은 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 몬타나이드(Montanide)가 사용될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 몬타나이드 ISA760, ISA763A, ISA780 및 IMS1312로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 보조제를 사용할 수 있다.
보조제로서 몬타나이드 ISA760, ISA763A 및 ISA780으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용 시, 본 발명의 불활화 백신과 상기 보조제는 3: 5-10의 중량 비율로 혼합할 수 있으며, 바람직하게는 3:7의 중량비율로 혼합할 수 있다. 또한, 상기 보조제를 이용 시, 어류의 복강 접종용으로 이용하는 것이 바람직하다.
또한, 보조제로서 몬타나이드 IMS1312를 사용 시, 본 발명의 불활화 백신과 상기 보조제를 1:0.5~1.5의 중량 비율로 혼합할 수 있으며, 바람직하게는 1:1의 중량 비율로 혼합할 수 있다. 또한, 상기 보조제를 이용 시, 어류의 침지 접종용으로 이용하는 것이 바람직하다.
또한, 안정화제 또는 첨가제로서, 당류나 아미노산류, 광물유, 식물유, 백반, 인산알루미늄, 벤토나이트, 실리카, 무라밀디펩티드(muramyl dipeptide) 유도체, 사이모신, 인터류킨 등이 사용될 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 불활화 백신은 적당한 용적의, 예를 들어 약 10~500 ㎖ 부피의 바이알에 백신액을 분주한 다음, 밀봉하여 사용될 수 있다. 이러한 백신은 액상뿐만 아니라, 나누어 주입한 다음에 동결 건조함으로써 건조 제제로 사용될 수도 있다. 상기 건조 제제는 사용 직전에 첨가한 감균액으로 건조물질을 완전하게 재용해하여 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 불활화 백신은 감염의 위험성이 있는 임의의 연령의 어류에 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 불활화 백신을 어류에 투여하는 단계를 포함하는 어류의 에드워드 감염증 예방 방법을 제공한다.
상기 불활화 백신은 어류에 복강 또는 침지 접종할 수 있다.
상기 어류는 뱀장어, 넙치(광어), 조피볼락, 우럭, 감성돔, 참돔, 능성어, 숭어, 농어, 전어, 고등어, 전갱이, 쥐치 등을 의미하며, 바람직하게는 뱀장어과에 속하는 유럽뱀장어(Anguilla anguilla), 뱀장어(Anguilla japonica), 무태장어(Anguilla marmorata), 아메리카뱀장어(Anguilla rostrata)이나, 보다 바람직하게는 뱀장어(Anguilla japonica)이다.
또한 본 발명은 상기 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주(KCTC 18280P)의 불활화 균체를 유효성분으로 포함하는 어류의 에드워드 감염증의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 사료 조성물은 어류에 허용되는 담체, 부형제, 안정제 등 공지의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 필요에 따라 비타민, 다른 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 어류에 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 사료 형태는 EP(압출 펠렛)와 같은 고형사료, MP(모이스트 펠렛) 사료, 또는 생사료 등 일반적인 사료 형태일 수 있다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 신규한 에드워드시엘라 타르다( Edwardsiella tarda ) 균주 분리 및 동정
신규한 에드워드시엘라 타르다 균주를 분리 및 동정하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 2010년 장흥 양식 뱀장어(극동산 뱀장어, Anguilla japonica)에서 간장(肝臟) 병소 및 장출혈 증상을 보이는 간장을 무균조건으로 적출하여 TSA(Tryptic Soy Agar)(Difco, USA) 배지에 도말한 후, 27℃에서 24시간 배양하여 분리하였다. 상기 배양된 군락 중 광택이 투명하고 약 0.5mm 크기인 콜로니를 순수 분리하여 그람염색을 수행하였고, 상기 콜로니를 관찰하여 그람 단간균임을 확인하였다. 또한, API20E(BioMerieux, France) 시험 및 선택배지인 SS(Difco, USA)배지에서 배양 성상 조사를 토대로(도 1), 상기 균주를 에드워드시엘라 타르다로 동정하였고 이를 ET-191로 명명하였다.
상기 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주를 보다 정밀하게 동정하기 위하여 TSB(Tryptic soy broth)(Difco, USA) 배지에서 배양하였으며, 상기 배양액으로부터 G-spin Total DNA 추출키트(Intron biotechnology, Korea)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 상기 추출된 DNA를 주형으로 하여 16S rRNA 유니버셜 프라이머(Macrogen, Korea)인 16S-F(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3', 서열번호 1) 및 16S-R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3', 서열번호 2)과 PCR-PreMix 키트(Bioneer, Korea)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 상기 증폭된 PCR 산물을 Hi Yield Gel/PCR DNA fragment 키트(RBC bioscience, Taiwan)을 이용하여 정제하였고, 마크로젠 사에 염기서열 분석을 의뢰하여 에드워드시엘라 타르다 ET-191의 16S rRNA 염기서열 정보를 얻었다. 상기 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주의 16S rRNA 염기서열은 표준주인 에드워드시엘라 타르다 ATCC 15947과 99%의 상동성을 보여 이를 에드워드시엘라 타르다로 동정하였으며, 염기서열 정보는 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI) 젠뱅크(GenBank)에 KF704699로 등록하고, 서열번호 3으로 나타내었다. 본 발명자는 상기 동정된 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC, korean collection for type cultures)에 2014년 04월 03일자로 기탁하여, 수탁번호 KCTC18280P를 부여 받았다.
실시예 2. 신규한 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주의 특성 조사
상기 실시예 1에서 동정된 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주의 특성을 조사하기 위하여, 생화학적, 유전학적 근연관계, 펄스장전기영동 유전형, 토끼 항혈청에 대한 교차 응집 반응, 병원성 유전자 프로파일 및 뱀장어에 대한 병원성을 분석하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
2-1. 생화학적 특성 조사
상기 실시예 1에서 동정된 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주의 생화학적 특성을 조사하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, API20E(BioMerieux, France)을 이용하여 각각 큐플에 상기 실시예 1에서 동정된 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주의 균액을 분주한 다음, 27℃에서 18~24시간 반응시키고, 표준주인 에드워드시엘라 타르다 ATCC 15947을 대조구로 사용하여 생화학적 특성을 확인하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
표준주
(ATCC15947)		 ET-191
오르토-니트로페닐-베타-D-갈락토피라노시드 - -
아르지닌디이미나아제 - -
라이신디카르복시라아제 + +
오르니틴디카르복시라아제 + +
시트르산 + -
황화수소 + +
우레아 - -
트립토판디아미나아제 - -
인돌 + +
포게스-프로스카우어반응 - -
젤라틴 - -
글루코오스 + +
만니톨 - -
이노시톨 - -
소르비톨 - -
람노오스 - -
수크로오스 - -
멜리바이오스 - -
아미그달린 - -
아라비노오스 - -
옥시다아제 - -
카탈라아제 + +
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주는 표준주인 에드워드시엘라 타르다 ATCC15947과 동일하게 라이신디카르복시라아제, 오르니틴디카르복시라아제, 카탈라제에 활성을 보였으며, 인돌 분해 및 황화수소를 형성하였으나, 상기 표준주와는 달리 시트르산 이용능이 있음을 확인하였다.
2-2. 유전학적 근연관계 분석
16S rRNA 염기서열을 기반으로 하여, 상기 실시예 1에서 동정된 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주와 표준주인 에드워드시엘라 타르다 ATCC15947를 포함하는 다른 에드워드시엘라 타르다 균주간의 유전학적 근연관계를 조사하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주와 표준주인 에드워드시엘라 타르다 ATCC15947를 포함하여, 다른 분리균주의 16S rRNA 염기서열을 BioEdit(Ver. 7.1.9, USA)를 이용하여 정렬하였고 MEGA 5 프로그램을 사용하여 계통발생학적으로 분석하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 에드워드시엘라 타르다 ET-191은 에드워드시엘라 타르다 아형 1 그룹에 속함을 확인하였다.
2-3. 펄스장전기영동(PFGE; Pulsed-field gel electrophoresis) 유전형 조사
상기 실시예 1에서 동정된 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주와 표준주인 에드워드시엘라 타르다 ATCC15947를 포함하는 다른 에드워드시엘라 타르다 균주의 펄스장전기영동 유전형을 조사하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 에드워드시엘라 타르다 ET-191균주를 BAP(Blood agar plate) 배지에 도말하여 27℃에서 24시간 동안 배양한 뒤, 루프를 이용하여 배양된 집락을 세포현탁액(100mM Tris:100mM EDTA, pH8.0) 2ml에 현탁하였다. 상기 현탁액 200 ㎕에 단백질가수분해효소(proteinase K) 10 ㎕를 첨가한 뒤, 1% 아가로즈액 200 ㎕와 고르게 섞어서 몰드에 넣고 얼음위에서 5분간 굳혀 플러그를 제작하였다. 이후, 2 ㎖ 튜브에 1.5 ㎖ 세포 용해액(50mM Tris: 50mM EDTA, pH8.0 + 1% Sarcosyl) 및 10 ㎕ 단백질가수분해효소를 상기 플러그에 넣고 55℃, 2시간 세포 용해 반응을 시켰다. 상기 세포 용해 반응된 시료를 멸균 증류수로 10-15분 간격으로 2회 세척하고, TE(10mM Tris:1mM EDTA, pH8.0) 버퍼로 10-15분 간격으로 2회 세척하였다. 이후, 1.5 ㎖ 튜브에서 I-Ceu 제한효소 10 유닛과 플러그를 섞은 뒤 37℃에서 4시간 동안 반응 시켰다. TBE 용액으로 제작한 1% 아가로즈 젤에 반응된 플러그를 넣고 CHEF MAPPER 시스템(Bio-Rad, UK)을 사용하여 14℃, 120°각도에서 18시간 동안 전기영동을 실시하였다. 이후, 상기 아가로즈 젤을 에티디움브로마이드(EtBr)로 30분간 염색하고, BioNumerics 프로그램(Applied Maths, Belgium)을 이용하여 분석을 실시하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 에드워드시엘라 타르다 ET-191의 유전형은 뱀장어에서 주로 유행하는 A형으로 분류됨을 확인하였다.
2-4 토끼 항혈청에 대한 교차 응집 반응 조사
상기 실시예 1에서 동정된 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주와 표준주인 에드워드시엘라 타르다 ATCC15947를 포함하는 다른 에드워드시엘라 타르다 균주간의 혈청 교차 응집 반응 수준을 조사하기 위하여, 펄스장전기영동형 A, B, C, I 및 J 균주들에 대한 토끼항혈청을 생산하고, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
Anti-rabbit ATCC15947은 펄스장전기영동형 J에 대한 토끼 항혈청이고, Anti rabbit ET114는 펄스장전기영동형 C에 대한 토끼 항혈청이고, Anti rabbit ET154는 펄스장전기영동형 A에 대한 토끼 항혈청이고, Anti rabbit ET088은 펄스장전기영동형 B에 대한 토끼 항혈청이며, Anti rabbit ET070은 펄스장전기영동형 I에 대한 토끼 항혈청이다. 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주와 각각의 토끼 항혈청의 혈청 교차응집 반응은 마이크로타이터법을 사용하여 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 에드워드시엘라 타르다 ET-191에 대한 교차응집 항체가는 21으로 나타났으며, 최대 23의 교차응집 항체가가 나타남을 확인하였다.
2-5. 병원성 유전자 프로파일 분석
상기 실시예 1에서 동정된 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주에 대한 병원성 유전자 프로파일을 분석하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주에 대해 하기 표 2에 기재된 에드워드시엘라 타르다균의 18개의 병원성 유전자들을 대상으로 분석하였다. 에드워드시엘라 타르다 ET-191 DNA를 주형으로 하여 하기 표 2에 나타난각 프라이머 및 PCR-PreMix 키트(Bioneer, Korea)를 이용하여 PCR 반응을 수행하고, 수득한 PCR 산물을 이용하여 전기영동을 통해 정성적 빈도를 조사하였다. 하기 표 2의 유전자들에 대한 정성적 빈도는 NTSYSpc 프로그램을 사용하여 클러스터 분석하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
유전자 이름 Primer 염기서열 서열번호
에드워드시엘라 타르다 병원성 관여 유전자 ank catE TTATCAAGCCTAATGGCG 4
catF AACGCTGTTGCCGTGAG 5
astA astA-F GGGTTGTACCATTCATAGCC 6
astA-R CCTACGATCCCAAAGATGAC 7
edwI edwI-F TCCCCCGGGGAGAGTATCGTCAGGATGAT 8
edwI-R TCCCCCGGGTTTCTGTCCTTTAACGCC 9
esaC esaC-IF TATGCCTGCCAGGTCCGC 10
esaC-IR CCTCGATATTGAGGATCAGCAAT 11
esaV esa-F GGTCAATAGCTGGCTACACAA 12
esa-R GCGCCTCAGCGAGTATGCGA 13
escA escA-IF GATCTCGCTACGCTGCATGGT 14
escA-IR GCCAGCAGCAGGTAAAAGCGT 15
eseB eseB-IF CTACGACAACAACCTGGATCGTCGCAT 16
eseB-IR GTCGATCTGATTAGCCACCTGCTG 17
eseC eseC-IF GGATCACGATCCTAAGCG 18
eseC-IR CTTGGCCGACATTTCGAC 19
eseD eseD-IF GGACGGCCATCGTTACGTTTCAC 20
eseD-IR TTTCCAGCGTTTCATCCG 21
esrA esrA-IF GGAGTAAGCCTTATCGCAG 22
esrA-IR CGTCAGGCGCTGCATAATG 23
esrB esrB-IF GATCATGCCTTGCTAGCC 24
esrB-IR TCGGCGACCAGCTTGAGA 25
eth-A ethA-F GATAATTAACCAGAACTACCG 26
ethA-R TGTTCACCACCCGATCGTCGATG 27
eth-B ethB-F CTGTATCTGGAGAAGGGCTA 28
ethB-R ACAGCGTGCCCCGCTTGAAT 29
evpP evp-F CGTCAGYGATGCATTTAAC 30
evp-R GTTCCAGCGTGATATTTCG 31
fimA fimA-F CTGTGAGTGGTCAGGCAAGC 32
fimA-R TAACCGTGTTGGCGTAAGAGC 33
gadB gadB-F ATTTGGATTCCCGCTTTGGT 34
gadB-R GCACGACGCCGATGGTGTTC 35
gyrB gyrB-F GCATGGAGACCTTCAGCAAT 36
gyrB-R GCGGAGATTTTGCTCTTCTT 37
katB kat-F CTCAATAAACCATCGCAACATGCC 38
Kat-R TGGATACCGCCATTAGGCTTGAT 39
luxS luxS-F TCCCCCGGGCTTTGTTAGGAAACCTTTTCCC 40
luxS-R TCCCCCGGGACGTGGGACAGTCACTTTT 41
도 5에 보는 바와 같이, 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주는 병원성 그룹에 속함을 확인하였다.
2-6. 뱀장어에 대한 병원성 시험
상기 실시예 1에서 동정된 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주와 다른 에드워드시엘라 타르다 균주의 뱀장어에 대한 병원성을 확인하기 위하여, 하기와 같이 수행하였다.
보다 구체적으로, 뱀장어 및 넙치에서 분리된 다른 에드워드시엘라 타르다 균주들과 함께 극동산 뱀장어(평균 체중 35.2±2.3g)를 대상으로 공격실험을 실시하였다. 하기 표 3의 각 균주들을 1 x 107cfu/fish가 되도록 복강 주사법으로 인위 감염 후 7일 간 폐사율 및 병원성 지수를 조사하였다.
균주 접종량
(cfu/fish)		 실험개체 폐사개체 비정상
개체a 		폐사율b
(%)		 병원성지수c 비고
ET-060 107 10 9 1 90 1.0 넙치 분리 주요 타입과 동일
ET-070 107 10 0 4 0 0.4
ET-159 107 10 0 6 0 0.6
ET-166 107 10 0 0 0 0.0
ET-175 107 10 0 3 0 0.3
ET-191 107 8 8 - 100 1.0 뱀장어 분리 주요 타입
a복부궤양, 항문충혈, 지느러미(가슴, 항문) 출혈
b7일간 관찰
c임상증상, 균 분리를 기준으로 병원성 지수 (1.0만점) 평가
상기 표 3에서 보는 바와 같이, 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주는 100%의 폐사율이 나타남을 확인하였으며, 살아남은 개체에서도 에드워드 감염증에 대한 임상증상을 보여 병원성 지수가 1.0임을 확인하였다.
실시예 3. 불활화 백신 조건 확인 및 제조
3-1. 포르말린 처리 농도, 시간 및 온도 조건에 따른 불활화 조건 확인
상기 실시예 1에서 동정된 에드워드시엘라 타르다 ET-191에 대한 포르말린 처리 농도, 시간 및 온도 조건에 따른 불활화 조건을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 동결 보존된 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주를 TSA 배지에서 27℃ 온도로 24시간 배양하였고, 배양된 평판 배지의 집락을 무균상태에서 TSB에 접종 후 27℃에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 균액에 37%(v/v) 포르말린(Sigma, USA)을 각 배양액의 0.05%(v/v), 0.1%(v/v) 및 0.2%(v/v) 농도로 첨가하였으며, 이를 하기 표 4에 나타낸 조건으로, 온도별(4℃, 25℃ 및 37℃) 및 시간별(4시간, 8시간 및 24시간)로 불활화하였다. 상기 배양균의 불활화는 TSA 배지에서 48시간 동안 배양하여, 최종 불활화 여부를 확인하였다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
포르말린
농도		 0.05% 0.10% 0.20%
처리시간 4℃ 25℃ 37℃ 4℃ 25℃ 37℃ 4℃ 25℃ 37℃
4h - - - - - - - + +
8h - - + - - + - + +
24h - - + - + + + + +
상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 에드워드시엘라 타르다 ET-191 배양균은 포르말린 0.2%(v/v), 25℃ 이상 반응 조건에서 4시간 이후 불활화됨을 확인하였다.
3-2. 백신의 제조
백신 제조에 사용되는 에드워드시엘라 타르다 ET-191 배양균의 농도를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 에드워드시엘라 타르다 ET-191 배양균을 10진 단계희석하여 TSA에서 27℃ 온도로 24시간 배양하여 평균 집락 수를 산출하였다. 이후, 배양균을 포르말린 1%(v/v), 37℃에서 24시간 동안 반응시켜 불활화하였다. 상기 불활화가 확인된 균액은 8,000 rpm에서 30분간 원심분리 한 다음, 멸균 생리식염수로 3회 세척한 후 균체를 1010-11cfu/ml 농도로 현탁하였다. 상기 조건으로 제조된 시험 백신은 멸균된 유리병에 분주하여 4℃에 보관하였다.
실시예 4. 불활화 백신 단독 또는 몬타나이드 보조제 혼합 백신의 복강 접종에 따른 면역원성 및 방어력 시험
4-1. 불활화 백신 단독 또는 몬타나이드 보조제 혼합 백신의 복강 접종에 따른 면역원성 시험
상기 실시예 3-2에서 제조한 불활화 백신 단독 또는 몬타나이드(Montanide) ISA 보조제(adjuvant)를 포함하는 혼합 백신의 복강 접종에 따른 면역원성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 하기 표 5에서 보는 바와 같이 백신 접종구 및 대조구를 설정하였다. 시험어로는 에드워드시엘라 타르다에 대한 항체가 없는 극동산 뱀장어(평균 체중 35±2.3g)를 이용하여, 얼음에서 마취한 후 하기 표 5의 A 내지 D의 조건인 시험 백신을 어체 당 100 ㎕씩 복강 주사하였으며, 대조구(PBS)는 멸균 생리 식염수를 동량으로 복강 주사하였다. 혈청은 접종 후 1, 3, 5 및 7 주째되는 시험어의 미부정맥에서 채혈하여 8,000 rpm, 10분간 원심분리하여 분리하였다. 상기 분리한 혈청을 96 웰 플레이트(SPL, Korea)에 넣고, 2진으로 단계 희석하고, 맥팔랜드(McFarland) No. 2의 탁도로 현탁한 불활화 항원을 첨가하여 24시간 동안 반응시켰다. 그 후, 응집괴 형성 유무를 관찰하고, 혈청 응집가는 마이크로타이터(microtiter)법을 사용하여 확인하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
또한, 상기 분리한 혈청과 넙치(ET-205) 및 뱀장어(ET-060) 유래 에드워드시엘라 타르다 불활화 항원과의 혈청 교차 응집을 확인하고자, 상기의 마이크로타이터(microtiter)법을 사용하여 확인하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
백신 실험구 시험 백신 농도 혼합 비율
(불활화 백신: 보조제)		 주사량
A 백신 단독(FKC) 1010cfu/ml - 100 ㎕
B 백신(FKC) +ISA760 1010cfu/ml 3:7 100 ㎕
C 백신(FKC) +ISA763A 1010cfu/ml 3:7 100 ㎕
D 백신(FKC) +ISA780 1010cfu/ml 3:7 100 ㎕
E 대조구(PBS) 멸균 식염수 - 100 ㎕
도 6에 나타난 바와 같이, 시험 백신을 단독으로 처리하였을 때, 투여 1주 후의 응집항체가가 27 이상으로 높게 나타났고, 3주 후 및 5주 후에도 25 이상임을 확인하였다. 불활화 백신 및 몬타나이드 ISA763A 보조제를 혼합하여 복강 접종한 시험구에서는 투여 1주 뒤에 응집 항체가가 증가하였고 3주째 28 이상으로 최고치에 도달하였으며, 응집항체가가 평균 26 이상으로 가장 높게 나타나, 면역을 유도 및 유지함에 있어서 효과적임을 확인하였다.
또한, 도 7에 나타난 바와 같이, 불활화 백신 단독 또는 보조제 혼합 투여로 형성된 항체는 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주 이외에 뱀장어 및 넙치 유래 에드워드시엘라 타르다 균주와 혈청 교차 응집반응을 보임을 확인하였다.
따라서, 에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주를 이용하여 제조한 불활화 백신은 접종 균주이외에 다른 유전형의 균주의 감염에도 방어력을 가질 수 있음을 확인하였다.
4-2. 불활화 백신 단독 또는 몬타나이드 보조제 혼합 백신의 복강 접종에 따른 방어력 시험
상기 실시예 3-2에서 제조한 불활화 백신 단독 또는 몬타나이드 ISA 보조제를 포함하는 혼합 백신의 복강 접종에 따른 에드워드 감염증에 대한 방어력을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 극동산 뱀장어(평균 체중 35±2.3g)에 상기 표 5와 같은 조건으로, 상기 실시예 4-1의 방법으로 백신 단독 또는 보조제 혼합액을 100 ㎕을 복강 접종하였고, 백신 접종 2주 후 에드워드시엘라 타르다 ET-191균주를 1.7 x 109 cfu/fish 농도로 공격 접종하였다. 그 후, 1 내지 14일 동안 백신 접종구와 대조구에서의 누적폐사율을 조사하였고, 상대생존율을 하기와 같은 수학식 1로 산출하였다. 그 결과를 하기 표 6 및 도 8에 나타내었다.
Figure 112014054107242-pat00001
백신 접종구 마리 공격 접종 농도 누적폐사율 (%) 상대생존율 (%)
A 백신 단독(FKC) 10 1.7x109cfu/fish 100 0
B 백신(FKC) +ISA760 10 1.7x109cfu/fish 50 50
C 백신(FKC) +ISA763A 10 1.7x109cfu/fish 20 80
D 백신(FKC) +ISA780 10 1.7x109cfu/fish 90 10
E 대조구(PBS) 10 멸균 생리식염수 100 -
상기 표 6 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 에드워드시엘라 타르다 ET-191에 대한 백신 접종구의 상대 생존율은 백신과 몬타나이드 보조제 ISA763A 혼합액을 투여한 실험구에서 80%로 다른 접종구보다 가장 높게 나타남을 확인할 수 있었다. 백신과 몬타나이드 보조제 ISA780 혼합액을 투여한 실험구의 상대생존율은 10% 수준으로 실질적인 방어 효과가 확인이 되지 않았다. 따라서 뱀장어 에드워드 감염증 예방에 있어서 불활화 백신을 복강 접종 시, 몬타나이드 ISA763A 보조제를 혼합하여 투여하는 것이 가장 효과적인 것으로 확인하였다.
실시예 5. 불활화 백신 단독 또는 몬타나이드 보조제 혼합 백신의 침지 접종에 따른 면역원성 및 방어력 시험
5-1. 뱀장어에 대한 백신 침지 접종
시험 백신 단독 또는 몬타나이드(Montanide) 보조제 혼합 백신의 침지 접종에 따른 효과적인 뱀장어 면역을 유도하기 위하여, 하기와 같이 수행하였다.
보다 구체적으로, 하기 표 7에 나타난 바와 같이 백신 접종구 및 대조구를 설정하였고, 시험어로는 에드워드시엘라 타르다에 대한 항체가 없는 극동산 뱀장어(평균체중 36±9.2g)를 이용하였다. 또한, 본 발명의 침지 접종에 사용된 몬타나이드 보조제는 수용성 성분으로 어류 적용에 적합한 IMS1312를 이용하였다. 뱀장어에 대한 침지 접종은 도 9에 나타낸 바와 같이, 첫 주에 1차 접종하고, 첫 접종한지 1-2주 뒤에 2차 접종하고, 첫 접종한지 3-4주 뒤에 3차 접종 하여 총 3회 실시하였으며, 시험 백신(1010cfu/ml) 또는 멸균 생리식염수 1l를 수조에 준비한 다음 28℃에서 1시간 동안 실시하였다.
백신 실험구 시험 백신 농도 혼합 비율
(불활화 백신: 보조제)		 침지량
A 백신 단독(FKC) 1010cfu/ml - 1l
B 백신(FKC) +IMS1312 1010cfu/ml 1:1 1l
C 대조구 멸균 생리식염수 - 1l
5-2. 불활화 백신 단독 또는 몬타나이드 보조제 혼합 백신의 침지 접종에 따른 면역원성 시험
불활화 백신 단독 또는 몬타나이드 보조제 혼합 백신의 침지 접종에 따른 면역원성을 확인하기 위하여, 하기와 같이 수행하였다.
보다 구체적으로, 혈청은 상기 표 7에 따른 단독 또는 혼합 백신 접종 후 1, 3, 5 및 7 주째 시험어의 미부정맥에서 채혈하여 8,000 rpm 10분간 원심분리하여 분리하였다. 혈청응집가는 상기 실시예 4-1에 기재된 마이크로타이터(microtiter)법을 이용하여 조사하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 응집항체가는 단독 또는 보조제 혼합 백신을 접종한 지 1주 뒤에 증가하였고, 2회 및 3회 추가 침지 접종에 따라 백신 접종구의 항체가는 증가하였다. 최종 침지 접종 2주 뒤(도 10에서 5주후 막대)에 항체가가 최고치임을 확인하였다.
따라서, 3회의 침지 접종 방법으로 효과적인 면역 반응을 유도 및 유지를 할 수 있으며, 시험 백신을 단독으로 사용하는 것; 또는 몬타나이드 보조제 IMS1312를 혼합하여 사용하는 것이 뱀장어 면역원성 유도에 효과적임을 확인하였다.
5-3. 불활화 백신 단독 또는 몬타나이드 보조제 혼합 백신의 침지 접종에 따른 방어력 시험
불활화 백신 단독 또는 몬타나이드 보조제 혼합 백신의 침지 접종에 따른 에드워드 감염증에 대한 방어력을 확인하기 위하여, 하기와 같이 수행하였다.
보다 구체적으로, 극동산 뱀장어(평균 체중 36±9.2g)에 상기 표 7과 같이 백신 단독 또는 보조제 혼합액을 1주 또는 2주 간격으로 3회 침지 접종하였고, 최종 백신 접종 2주 후 에드워드시에라 타르다 ET-191균주를 1.07 x 108cfu/fish 농도로 공격 접종하였다. 백신접종구(FKC, FKC+IMS1312)와 대조구에서 2주간 누적 폐사율을 조사하였고, 상대생존율은 상기 수학식 1의 방법으로 산출하였다. 그 결과를 하기 표 8 및 도 11에 나타내었다.
백신 접종구 마리 공격 접종 농도 누적폐사율 (%) 상대생존율 (%)
A 백신 단독 10 1.07x108cfu/fish 30 57.14%
B 백신 +IMS1312 10 1.07x108cfu/fish 10 85.71%
C 대조구 10 멸균 생리식염수 70 -
표 8 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 백신을 단독으로 투여한 접종구에서는 누적폐사율이 30%로 대조구보다 약 2배 이상 감소한 것으로 나타났으며, 상대생존률은 57.14%로 나타났다. 또한, 몬타나이드 보조제 IMS1312 혼합 백신을 투여한 접종구에서는 30%의 누적폐사율을 보여 대조구보다 7배 이상 감소한 것으로 나타났으며 85.71%의 상대 생존율을 나타남을 확인하였다. 따라서, 불활화 백신을 단독으로 처리하거나, 몬타나이드 보조제 IMS1312를 혼합하여 사용하여 처리하는 것은 대조구에 비해 에드워드 감염증에 대해 우수한 방어력을 가짐을 확인하였다.
이하 본 발명의 사료 조성물의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 사료용 조성물의 제조
에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주(KCTC 18280P)의 불활화 균체
0.1 ~ 20% 중량부
지방분해효소(Lipase) 0.001 ~ 0.01% 중량부
제 3 인산칼슘 1 ~ 20% 중량부
비타민 E 0.01 ~ 0.1% 중량부
효소 분말 1 ~ 10% 중량부
포도당 20 ~ 90% 중량부
에드워드시엘라 타르다 ET-191 균주(KCTC 18280P)의 불활화 균체를 포도당과 혼합하여 중량을 맞추고 여기에 기타 조성물인 지방분해효소, 제3인산칼슘, 비타민 E 및 효소 분말을 상기와 같은 조성으로 넣는다. 그 후, 전체 중량이 100%가 되도록 포도당을 섞은 후, 믹서기를 이용하여 충분히 혼합을 한다.
한국생명공학연구원 생물자원센터 KCTC18280P 20140403
<110> Animal and plant quaratine agency <120> Novel Edwardsiella tarda ET-191 and inactivated vaccine against edwardsiellosis in fish comprising thereof <130> 1.58P <160> 41 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA forward primer <400> 1 agagtttgat catggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA reverse primer <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19 <210> 3 <211> 1394 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Edwardsiella tarda strain ET191 16S ribosomal RNA gene, partial sequence <400> 3 tgacgagcgg cggacgggtg agtaatgtct ggggatctgc ctgatggagg gggataacta 60 ctggaaacgg tagctaatac cgcataacgt cgcaagacca aagtggggga ccttcgggcc 120 tcatgccatc agatgaaccc agatgggatt agctagtagg tggggtaatg gctcacctag 180 gcgacgatcc ctagctggtc tgagaggatg accagccaca ctggaactga gacacggtcc 240 agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc 300 catgccgcgt gtatgaagaa ggccttcggg ttgtaaagta ctttcagtag ggaggaaggt 360 gtgaacgtta atagcgctca caattgacgt tacctacaga agaagcaccg gctaactccg 420 tgccagcagc cgcggtaata cggagggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag 480 cgcacgcagg cggtttgtta agttggatgt gaaatccccg ggcttaacct gggaactgca 540 tccaagactg gcaagctaga gtctcgtaga gggaggtaga attccaggtg tagcggtgaa 600 atgcgtagag atctggagga ataccggtgg cgaaggcggc ctcctggacg aagactgacg 660 ctcaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgctgtaa 720 acgatgtcga tttggaggtt gtgcccttga ggcgtggctt ccgaagctaa cgcgttaaat 780 cgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca 840 caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc tactcttgac 900 atccagcgaa tcctgtagag atacgggagt gccttcggga acgctgagac aggtgctgca 960 tggctgtcgt cagctcgtgt tgtgaaatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1020 tatcctttgt tgccagcggt tcggccggga actcaaagga gactgccagt gataaactgg 1080 aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcatcat ggcccttacg agtagggcta cacacgtgct 1140 acaatggcgt atacaaagag aagcgaactc gcgagagcaa gcggacctca taaagtacgt 1200 cgtagtccgg 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27 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> esaC inner forward primer of esaC gene <400> 10 tatgcctgcc aggtccgc 18 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> esaC inner reverse primer of esaC gene <400> 11 cctcgatatt gaggatcagc aat 23 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> esa forward primer of esaV gene <400> 12 ggtcaatagc tggctacaca a 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> esa reverse primer of esaV gene <400> 13 gcgcctcagc gagtatgcga 20 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> escA inner forward primer of escA gene <400> 14 gatctcgcta cgctgcatgg t 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> escA inner reverse primer of escA gene <400> 15 gccagcagca ggtaaaagcg t 21 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eseB inner forward primer of eseB gene <400> 16 ctacgacaac aacctggatc gtcgcat 27 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eseB inner reverse primer of eseB gene <400> 17 gtcgatctga ttagccacct gctg 24 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eseC inner forward primer of eseC gene <400> 18 ggatcacgat cctaagcg 18 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eseC inner reverse primer of eseC gene <400> 19 cttggccgac atttcgac 18 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eseD inner forward primer of eseD gene <400> 20 ggacggccat cgttacgttt cac 23 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eseD inner reverse primer of eseD gene <400> 21 tttccagcgt ttcatccg 18 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> esrA inner forward primer of esrA gene <400> 22 ggagtaagcc ttatcgcag 19 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> esrA inner reverse primer of esrA gene <400> 23 cgtcaggcgc tgcataatg 19 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> esrB forward primer of esrB gene <400> 24 gatcatgcct tgctagcc 18 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> esrB reverse primer of esrB gene <400> 25 tcggcgacca gcttgaga 18 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eth-A forward primer of eth-A gene <400> 26 gataattaac cagaactacc g 21 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eth-A reverse primer of eth-A gene <400> 27 tgttcaccac ccgatcgtcg atg 23 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eth-B forward primer of eth-B gene <400> 28 ctgtatctgg agaagggcta 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eth-B reverse primer of eth-B gene <400> 29 acagcgtgcc ccgcttgaat 20 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> evp forward primer of evpP gene <400> 30 cgtcagygat gcatttaac 19 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> evp reverse primer of evpP gene <400> 31 gttccagcgt gatatttcg 19 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fimA forward primer of fimA gene <400> 32 ctgtgagtgg tcaggcaagc 20 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fimA reverse primer of fimA gene <400> 33 taaccgtgtt ggcgtaagag c 21 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gadB forward primer of gadB gene <400> 34 atttggattc ccgctttggt 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gadB reverse primer of gadB gene <400> 35 gcacgacgcc gatggtgttc 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gyrB forward primer of gyrB gene <400> 36 gcatggagac cttcagcaat 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gyrB reverse primer of gyrB gene <400> 37 gcggagattt tgctcttctt 20 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> kat forward primer of katB gene <400> 38 ctcaataaac catcgcaaca tgcc 24 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> kat reverse primer of katB gene <400> 39 tggataccgc cattaggctt gat 23 <210> 40 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> luxS forward primer of luxS gene <400> 40 tcccccgggc tttgttagga aaccttttcc c 31 <210> 41 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> luxS reverse primer of luxS gene <400> 41 tcccccggga cgtgggacag tcactttt 28

Claims (13)

  1. 삭제
  2. 펄스장 전기영동형(Pulsotype)이 A형이고, 서열번호 3으로 표시되는 16S rRNA의 염기서열을 포함하는, 뱀장어(Anguilla japonica)로부터 분리된 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda) ET-191 균주(KCTC 18280P)의 불활화 균체; 및 몬타나이드 ISA760 또는 ISA763A 보조제를 유효 성분으로 포함하는, 뱀장어의 에드워드 감염증 예방용 불활화 백신.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제2항에 있어서,
    상기 불활화 균체 및 보조제는 3 : 5-10의 중량 비율로 혼합되는 것을 특징으로 하는, 뱀장어의 에드워드 감염증 예방용 불활화 백신.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 불활화 백신은 복강 접종용인 것을 특징으로 하는, 뱀장어의 에드워드 감염증 예방용 불활화 백신.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제2항의 불활화 백신을 뱀장어에 투여하는 단계를 포함하는, 뱀장어의 에드워드 감염증 예방 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 펄스장 전기영동형(Pulsotype)이 A형이고, 서열번호 3으로 표시되는 16S rRNA의 염기서열을 포함하는, 뱀장어(Anguilla japonica)로부터 분리된 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda) ET-191 균주(KCTC 18280P)의 불활화 균체; 및 몬타나이드 ISA760 또는 ISA763A 보조제를 유효 성분으로 포함하는, 뱀장어의 에드워드 감염증 예방 또는 개선용 사료 조성물.
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