KR102047911B1

KR102047911B1 - 어류의 연쇄구균증 예방용 불활성화 백신, 그 제조방법 및 투여방법

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Publication number: KR102047911B1
Application number: KR1020190049050A
Authority: KR
Inventors: 한현자; 정승희; 최혜승; 조미영; 김명석; 김광일; 민은영
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2019-04-26
Filing date: 2019-04-26
Publication date: 2019-11-28

Abstract

본 발명은 신규 스트렙토코커스 균주 및 이를 이용한 연쇄구균증 예방용 백신에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 신규 스트렙토코커스 균주, 불활성화된 스트렙토코커스 파라우베리스 균주를 포함하는 어류의 연쇄구균증 예방용 불활성화 백신, 그 제조방법 및 투여방법에 관한 것이다. 본 발명은 어류, 특히 양식 넙치의 연쇄구균증을 효과적으로 예방하여 연쇄구균증으로 인한 어류의 폐사를 현저하게 줄일 수 있는 효과를 가진다. 따라서, 어류의 생산성 증대는 물론, 항생제 사용으로 인한 비용을 절감시킬 수 있다. 또한 본 발명은 어류의 세균성 질병을 예방할 수 있는 백신을 사용함으로써, 항생제를 사용하지 않은 건강한 어류 생산을 가능하게 하여, 양식업의 발전에 이바지하고 어류 소비를 크게 향상시킬 수 있다.

Description

어류의 연쇄구균증 예방용 불활성화 백신, 그 제조방법 및 투여방법{Inactivated Vaccine Against Streptococcal Disease in Fish, Preparing Method Thereof and Administrating Method Thereof}

본 발명은 신규 스트렙토코커스 균주 및 이를 이용한 연쇄구균증 예방용 백신에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 신규 스트렙토코커스 균주, 불활성화된 스트렙토코커스 파라우베리스 균주를 포함하는 어류의 연쇄구균증 예방용 불활성화 백신, 그 제조방법 및 투여방법에 관한 것이다.

연쇄구균증(Streptococcosis)은 자연산 및 양식산 담수어 및 해산어의 패혈증을 유발하는 질병이다. 해산어류인 방어(Yellowtail; Seriolae spp.), 뱀장어(Eel; Anguilla japonica) 등 전세계적으로 다양한 어종에 감염되어 질병을 유발한다. Streptococcus parauberis, Streptococcus iniae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae 종은 전세계 어느 지역에 상관없이 어류에 발생하여 심각한 피해를 주고 있다.

2014년 세계 수산물 생산량은 1억9,572만톤이며 그 중 어획생산량은 9,463만톤으로 최근 몇 년간 비슷한 수준을 보이고 있는 반면, 양식생산량은 1억109만톤으로 해마다 증가하여, 2025년 양식 생산량은 1억200만톤으로 2013~2015년 수준에서 39% 증가할 것으로 예상하고 있다(FAO). 2017년 국내 어류양식 생산량은 86,387톤으로, 어종별 생산량은 2017년도에 넙치가 41,207톤(전체 생산량의 47.7%)이었으며, 같은 해 생산금액 역시 넙치가 5,845억원(57.9%)을 기록하여 넙치가 가장 대표적인 우리나라 어류 양식 품종임을 알 수 있다(어업생산통계, 통계청, 2018). 넙치는 해양수산부가 추진하는 수산분야의 10대 수출전략 품목으로 지정되었으며, 현재 양식 수산물 전략품목육성 연구개발 사업으로 추진되는 부가가치가 높은 품종이다.

양식 넙치의 질병으로 인한 피해는 연중 생산량의 30%에 달하는 연간 1.2만여톤 정도로 추정되며, 2018년 양식 넙치에 폐사를 가장 많이 유발한 질병으로 기생충성 질병인 스쿠티카병(44.5%), 여윔증(12%), 바이러스성출혈성패혈증(16.6%), 세균성 질병인 연쇄구균증(9.7%)으로 확인되고 있다(양식생물 폐사동향 조사 및 활어수송용 소독장치 효과 검증 연구, 국립수산과학원 연구용역, 2018). 최근 우리나라 넙치에 가장 많이 발생하는 질병으로 기생충성 질병인 스쿠티카병(61%), 바이러스성출혈성 패혈증(10.6%), S. parauberis의 의해 발생하는 연쇄구균증(9.8%)이 보고되어 있다(양식장 폐사현황 및 폐사체 처리방안 연구, 2014-2016, 국립수산과학원). 넙치 양식에서 문제가 되는 연쇄구균은 S. iniae, S. parauberis로 알려져 있으며, 2003년에서 2005년 제주지역 양식 넙치에서 분리된 연쇄구균을 동정한 결과, S. parauberis 54%, S. iniae 46%의 비율로 분리되었다. 그러나 2000년대 후반부터 현재까지 병든 넙치에서 S. iniae의 비율이 낮아져 최근에 거의 분리되지 않고 있으며, 대부분 S. parauberis가 분리되고 있는 실정이다.

양식 어류의 병원체 검출률이 매년 지속적으로 증가하고 있으며, 현재 넙치에 상용화되어 있는 연쇄구균(S. parauberis) 백신 보급에도 불구하고 지속적으로 해당 질병이 발생하고 있어, 현 백신 항원의 개량이 필요한 실정이다. 항생·항균제의 오남용에 의한 약제 내성균 및 다제 내성균 출현으로 치료효능이 감소되고 있어, 질병이 발생한 후 화학요법제로 치료하는 것은 점차 어려운 실정이므로 질병을 사전 예방할 수 있는 백신개발이 필요하다. 실제로 우리나라에서는 넙치의 S. parauberis의 백신은 2009년부터 상업화되어 보급되었으나, 백신 보급 이후에도 S. parauberis는 지속적으로 발생하고 있다(수산생물질병특성연구, 2012-2017). 일반적으로 넙치에 가장 높은 폐사를 유발하는 스쿠티카병은 치어기에 발생하지만, 연쇄구균증은 중간육성어, 성어 등에 발생하여 보다 큰 경제적인 피해를 유발하고 있다. 최근 양식 넙치에 발생한 질병에 의한 폐사 원인 분석 결과, 세균성 질병에 의한 폐사가 13%로 이중 연쇄구균증에 의한 폐사가 67.1%로 가장 높게 나타났다.

국내에서는 S. parauberis 불활화 백신, 재조합 단백질백신, 약독화 백신 등의 다양한 연구가 꾸준히 진행되고 있으나, 현재 다른 세균 병원체와 혼합백신 형태로 제작된 불활화 백신만이 상용화되어 시판되고 있다(6개사 9개 제품). 스페인에서 터봇 대상으로 S. parauberis를 항원으로 하는 Hipra사의 ICTHIOVACⓡ-STR 불활화 주사 백신이 개발되어 판매되고 있으나 국내에서는 S. parauberis에 대한 단독백신은 판매되고 있지 않다. 어류 양식 산업의 특성상 저비용의 어류 백신 개발이 필수적이므로 여러 가지 세균 병원체를 한꺼번에 예방 가능한 혼합 백신이 상용화되어 있으나, 실제로 혼합 백신 사용 이후에 백신 효과에 대한 조사는 미미한 실정이다. 넙치에서 S. parauberis에 의한 연쇄구균증은 백신 보급 이후에도 지속적으로 발생하고 있어, 현재 상용화된 백신의 효능에 대한 검증이 필요하다.

사람의 인플루엔자백신이나 폴리오백신과 같이 동종(同種)의 많은 형, 즉 인플루엔자의 경우 A1, A2, B형, 폴리오의 경우 I, I, III형을 섞어서 만드는 백신을 다가백신(polyvalent vaccine)이라고 하며, 이러한 병원체는 항원형이 몇 개로 나뉘어 있어, 따로 포함되어 있는 백신(단가백신)으로 예방접종한 경우, 질병 유형이 백신과 전혀 다른 유형으로 발생한다면 도움이 되지 않기 때문에 다가백신을 활용하고 있다. 사람에서 폐렴을 유발하는 연쇄구균인 S. pneumoniae의 경우 다양한 혈청형이 있어 이를 모두 예방할 수 있는 23가 다가 피막다당류 백신이 사용되고 있다(송준영, 정희진 2014 폐렴구균백신, J. Korean Med Assoc 57(9), 780-788).

이에, 본 발명자들은 넙치에서 질병을 유발하는 S. parauberis에 대하여 Multilocus sqquecne typing(MLST) 방법을 통해 분자역학 및 혈청형 조사를 실시하여, 국내 발생하는 넙치 연쇄구균 S. parauberis 백신에 적합한 균주를 선정하기 위한 기초자료를 확보하였으며, 혈청형별 포르말린 불활화 백신을 제작하여 교차 백신 효능을 평가하고, 본 발명을 완성하였다.

본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 목적은 연쇄구균증에 감염된 넙치에서 분리된 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) 균주를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 불활성화된 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) 균주를 항원으로 포함하는 연쇄구균증 예방용 불활성화 백신을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 연쇄구균증에 감염된 넙치로부터 분리된 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) 균주를 포르말린으로 불활성화시켜 백신을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 연쇄구균증 예방용 불활성화 백신의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 백신을 어류에 투여하는 것을 포함하는 어류를 면역시키는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여, 연쇄구균증에 감염된 넙치에서 분리된 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) KCTC 13800BP 균주, KCTC 13801BP 균주, KCTC 13802BP 균주 및 KCTC 13803BP 균주를 제공한다.

본 발명은 또한, 불활성화된 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) KCTC 13800BP 균주, KCTC 13801BP 균주, KCTC 13802BP 균주 또는 KCTC 13803BP 균주를 항원으로 포함하는 연쇄구균증 예방용 불활성화 백신을 제공한다.

본 발명은 또한, 연쇄구균증에 감염된 넙치로부터 분리된 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) KCTC 13800BP 균주, KCTC 13801BP 균주, KCTC 13802BP 균주 또는 KCTC 13803BP 균주를 포르말린으로 불활성화시켜 백신을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 연쇄구균증 예방용 불활성화 백신의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 백신을 어류에 투여하는 것을 포함하는 어류를 면역시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 어류, 특히 양식 넙치의 연쇄구균증을 효과적으로 예방하여 연쇄구균증으로 인한 어류의 폐사를 현저하게 줄일 수 있는 효과를 가진다. 따라서, 어류의 생산성 증대는 물론, 항생제 사용으로 인한 비용을 절감시킬 수 있다. 또한 본 발명은 어류의 세균성 질병을 예방할 수 있는 백신을 사용함으로써, 항생제를 사용하지 않은 건강한 어류 생산을 가능하게 하여, 양식업의 발전에 이바지하고 어류 소비를 크게 향상시킬 수 있다.

도 1은 S. parauberis 64개 균주의 유전자 5종[DNA gyrase subunit B(gyrB), Surface M-protein(simA), autolysin, capsular polysaccharide biosynthesis protein, tyrosine-protein kinase(wze)]에 대한 염기서열(약 4,120bp)의 계통 주 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 S. parauberis 혈청형 분석을 나타낸 것으로, 도 2(A)는 슬라이드 응집반응(I: 양성반응, II: 음성반응), 도 2(B)는 Microtiter 응집반응을 나타낸 도면이다.
도 3은 국내 2002년-2017년 S. parauberis 균의 혈청형 분포를 나타낸 그래프이다.
도 4는 국내 2002년-2017년 S. parauberis 균의 지역별, 분리연도별 분리 비율을 나타낸 도면이다.
도 5는 국내 시판되고 있는 S. parauberis 항원을 포함하는 불활화 백신의 serotype-PCR 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 S. parauberis 7개 균주의 인위감염 후 넙치의 누적폐사량을 나타낸 그래프이다.
도 7은 S. parauberis 4개 균주의 농도별 넙치의 누적폐사량을 나타낸 그래프이다.
도 8은 넙치의 S. parauberis 백신 접종 및 인위감염 실험 일정을 도식화한 도면이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명의 일 실시예에서, 연쇄구균증에 감염된 넙치에서 분리된 Streptococcus parauberis 19FBSPa0003(PR5) 균주, Streptococcus parauberis FP2331 균주, Streptococcus parauberis FPa4365 균주 및 Streptococcus parauberis FPa4870 균주를 불활성화시킨 후, 이를 항원으로 포함하는 백신을 어류에 접종한 결과, 모든 백신접종구에서 낮은 폐사율을 나타냈으며, 혈청형별 교차 백신 효능도 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 연쇄구균증에 감염된 넙치에서 분리된 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) KCTC 13800BP 균주에 관한 것이다.

본 발명은 다른 관점에서, 연쇄구균증에 감염된 넙치에서 분리된 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) KCTC 13801BP 균주에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 연쇄구균증에 감염된 넙치에서 분리된 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) KCTC 13802BP 균주에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 연쇄구균증에 감염된 넙치에서 분리된 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) KCTC 13803BP 균주에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 KCTC 13800BP 균주는 한국생물자원센터(Korean Collection for Type Culture)에 2019년 1월 30일자로 기탁된 Streptococcus parauberis 19FBSPa0003 균주이며, 본 명세서에서 19FBSPa0003는 PR5와 동일한 균주를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 KCTC 13801BP 균주는 한국생물자원센터에 2019년 1월 30일자로 기탁된 Streptococcus parauberis FP2331 균주이며, 상기 KCTC 13802BP 균주는 한국생물자원센터에 2019년 1월 30일자로 기탁된 Streptococcus parauberis FPa4365 균주이고, 상기 KCTC 13803BP 균주는 한국생물자원센터에 2019년 1월 30일자로 기탁된 Streptococcus parauberis FPa4870 균주이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 불활성화된 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) KCTC 13800BP 균주, KCTC 13801BP 균주, KCTC 13802BP 균주 및 KCTC 13803BP 균주로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 항원으로 포함하는 연쇄구균증 예방용 불활성화 백신에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 백신의 항원 농도는 0.5 내지 2mg/fish인 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 0.5 내지 1.5mg/fish, 더욱 바람직하게는 1mg/fish인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서, Streptococcus parauberis 19FBSPa0003(PR5) 균주, FP2331 균주, FPa4365 균주 또는 FPa4870 균주를 포함하는 백신접종 후 항원 종류별(혈청형 Ia~II)로 혈청의 항체가를 측정한 결과, 대조구(PBS)와 비교하여 모두 유의적으로 높은 항체가를 형성하였으며, 각각의 백신구는 동일한 혈청형의 항원으로 항체가를 측정할 경우 가장 높은 항체가를 나타냈다.

본 발명에서 용어, “백신”이란 감염 질환을 예방하기 위한 면역을 위하여 쓰이는 항원으로서, 약독화시킨 미생물 또는 바이러스로 제조되며, 특정 감염증에 대해 인공적으로 면역원성을 획득하기 위하여 약화시키거나 사멸시킨 병원 미생물을 개체 내에 투여하는 것을 의미한다. 백신에 의해 자극을 받으면 개체 내의 면역 시스템이 작동하여 항체를 생성하게 되고, 그 감수성을 유지하다가 재감염이 일어나는 경우, 빠른 시간 내에 항체를 효과적으로 생성함으로써 질환을 극복할 수 있게 된다.

상기 불활성화 백신은 당해 기술분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있으며, 예를 들어, 당해 기술분야에 알려진 불활성화제를 사용하여 제조될 수 있다. 바람직하게는 포르말린 처리에 의해 불활성화시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 혼합 불활성화 백신은 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 몬타나이드(Montanide) ISA35 또는 Gel01이 사용될 수 있다.

또한, 안정화제 또는 첨가제로서, 당류나 아미노산류, 광물유, 식물유, 백반, 인산알루미늄, 벤토나이트, 실리카, 무라밀디펩티드(muramyl dipeptide) 유도체, 사이모신, 인터류킨 등이 사용될 수도 있다.

본 발명에 있어서, 상기 백신은 적당한 용적의, 예를 들어 약 10~500㎖ 부피의 바이알에 백신액을 분주한 다음, 밀봉하여 사용될 수 있다. 이러한 백신은 액상뿐만 아니라, 나누어 주입한 다음에 동결건조함으로써 건조 제제로 사용될 수도 있다. 상기 건조 제제는 사용 직전에 첨가한 감균액으로 건조물질을 완전하게 재용해하여 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 혼합 불활성화 백신은 감염의 위험성이 있는 임의의 연령의 어류에 사용할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 치어를 포함한 중간육성어, 성어에 사용 가능하다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 연쇄구균증에 감염된 넙치로부터 분리된 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) KCTC 13800BP 균주, KCTC 13801BP 균주, KCTC 13802BP 균주 및 KCTC 13803BP 균주로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포르말린으로 불활성화시켜 백신을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 연쇄구균증 예방용 불활성화 백신의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 백신은 Streptococcus parauberis KCTC 13800BP 균주, KCTC 13801BP 균주, KCTC 13802BP 균주 또는 KCTC 13803BP 균주를 배양한 후 불활성화시킨 다음, 농도를 조절하여 제조한다. 본 발명의 일 실시예에서, 동결 보존된 S. parauberis 4개 균주를 배양하고, 배양된 균액에 37%(v/v) 포르말린(Merck, Germany)을 각 배양액의 0.5%(v/v)가 되도록 첨가하여 교반 배양기에서 150rpm, 20℃로 24시간 동안 불활화하였다. 불활화가 확인된 균액을 원심분리한 다음, 멸균 생리 식염수로 세척한 후, 균체를 수거하고 최종적으로 습균체 무게를 측정하여 실험구에 따라 농도를 달리하여 백신을 제조하였다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 연쇄구균증 예방용 불활성화 백신을 어류에 투여하는 것을 포함하는 어류를 면역시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 백신을 어류의 복강에 주사하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 어류는 감염의 위험성이 있는 넙치 등의 어류를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서, 4가지 S. parauberis 백신 처리 후, 각각의 혈청형에 대한 인위감염 시험을 수행한 결과, 백신을 접종하지 않은 대조구에 비하여 모든 백신접종구에서 낮은 폐사율을 나타냈으며, 혈청형별 교차 백신 효능도 있음을 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 연쇄구균 S. parauberis 의 분리 및 동정

국립수산과학원 병리연구과에서 보존하고 있던 2002년~2017년 국내의 병든 양식 넙치에서 분리된 S. parauberis 199개 균주 중에서 분리연도 및 지역별로 대표균주 64개 균주를 선정하여 분석에 사용하였다.

균주를 1% NaCl을 첨가한 tryptic soy agar(TSA, Becton Dickinson, USA) 또는 brain heart infusion agar(BHIA, Becton Dickinson, USA) 배지에 도말한 후, 25℃에서 24시간 배양하여 균의 성상을 확인하고 이를 계대배양하여 표현형, 혈청형, 유전학적 분석 등을 실시하였다.

분석한 균주의 분리지역 및 연도를 표 1에 나타내었다.

S. parauberis 균주의 분리 지역 정보

년도	균주(수)
년도	제주	완도	포항	울산	거제	통영	총계
2002	1						1
2003			1				1
2004	1	1					2
2005	1	2					3
2006			4	1			5
2007			1	1			2
2008		5	1				6
2010						2	2
2012	2		3		4		9
2013					1		1
2014	8		4				12
2015	9						9
2016	2		1	2			5
2017	1	1	2	2			6
총계	25	9	17	6	5	2	64

실시예 2: S. parauberis 의 표현형 분석

생화학적 특성을 분석하기 위해 S. parauberis 균주를 1% NaCl이 첨가된 BHIA배지에서 25℃, 24시간 배양하였다. API 20strep kit(BIOMERIEUX, France)와 API ZYM kit(BIOMERIEUX, France) 실험방법은 순수배양된 균 집락을 제조사의 방법에 따라 스트립에 접종 배양하여 시험하였다.

S. parauberis 64개 균주의 API 20strep, API zym kit 분석 결과, 조사한 모든 균주는 비운동성의 gram-positive cocci로 catalase, oxidase 음성으로 확인되었다(표 2).

넙치 유래 S. parauberis 64개 균주의 생화학적 특성 분석 결과

API20stretp(양성반응 균주수)									APIzym(양성반응 균주수)
PA	AD	RI	MA	SO	LA	TR	IN	AM	2	3	4	5	7	8	10	11	14	16
3	5	7	13	12	17	51	7	1	43	1	43	2	21	11	25	61	5	23

PA: alkaline phospatase, AD: arginine dihydrorase, RI: ribose acidification, MA: mannitol acidification, SO: sorbitol acidification, LA: lactose acidification, TR: trehalose acidification, IN: inulin acidification, AM: starch acidification, 2: alkaline phospatase, 3: esterase(C4), 4: esterase lipase(C8), 5: lipase(C14), 7: valine arylamidase, 8: crystine arylamidase, 10: α-chymotrypsin, 11: acid phosphatase, 14: β-galactosidase, 16: α-glucosidase.

API 20strep 생화학적 특성 분석한 결과 모든 균주는 pyruvate acetoin production(VP), hippurate hydrolysis(HIP), β-glucosidase(ESC), pyrrolidonyl arylamidase(PYRA), leucine arylamidase(LAP) 양성, α-galactosidase(αGAL), β-galactosidase(βGUR), L-arabinose acidification(ARA), Raffinose acidification(RAF), Glycogen acidification(GLYG) 음성 반응을 보였다(표 3).

S. parauberis 64개 균주의 API 20strep 생화학적 특성 분석 결과

No.	FP No.	VP	HIP	ESC	PYRA	αGAL	βGUR	βGAL	PAL	LAP	ADH	RIB	ARA	MAN	SOR	LAC	TRE	INU	RAF	AMD	GLYG	βHEM
1	FPa2041^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	+	+	+	+	-	-	-	-
2	FPa3132	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
3	FP4076	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	+	-	+	+	-	+	+	-	-	-
4	FP4114	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
5	FP2199	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
6	FP5042	+	+	+	+	-	-	-	+	+	-	+	-	+	+	-	+	-	-	-	-
7	FP3197	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-
8	FP2333	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	+	-	-	+	-	-	-	-
9	FP3335	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
10	FP3380	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
11	FP3441	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
12	FP3446	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
13	FP3826^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	+	-	+	+	+	+	+	-	-	-
14	FPa4365^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-
15	FPa4369^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-
16	FPa4403^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	+	+	+	+	-	-	-	-
17	FPa4404^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	+	+	+	+	-	-	-	-
18	Fpa4290^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
19	Fpa4293^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
20	Fpa4325	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	+	-	-	+	+	-	+	-
21	Fpa4406^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
22	Fpa4407	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
23	Fpa4599^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
24	Fpa4616^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
25	Fpa4624^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
26	Fpa4658	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
27	Fpa4660^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
28	Fpa4661	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
29	Fpa4683^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
30	Fpa4710^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	+	+	-	+	+	+	+	+	-	-	-
31	Fpa4743^II	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
32	Fpa4804^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	+	-	-	+	+	-	+	-	-	-	-
33	Fpa4805^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
34	Fpa4806^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
35	Fpa4807^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
36	Fpa4850	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
37	Fpa4860^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
38	Fpa4870	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
39	Fpa4894	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
40	BS1K(포항-부성1K)^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	+	+	+	-	-	-
41	DK14(대관수산14)^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-
42	DW C7-3(9월 대원C7-3)	+	+	+	+	-	-	-	+	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
43	DW1 (9월 대원병어1)	+	+	+	+	-	-	-	+	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
44	YL3(제주영림3)	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
45	PR 5KJK(늘푸른5KJK)	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
46	FP3825^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-
47	FPa4577^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
48	FPa4578^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
49	FPa4586^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	+	-	-	-	+	+	+	-	-	-	-
50	FPa4587	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	+	-	-	+	-	-	-	-
51	SPOF3K^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-
52	KSP28	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
53	PH0710^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-
54	FP2331^II	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
55	FP2332^II	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
56	YJ3(거제육종센터3)^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	+	+	-	+	+	+	+	+	-	-	-	-
57	YJ7(거제육종센터7)^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	+	+	-	+	+	+	+	+	-	-	-	-
58	DB1^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-
59	FP2313	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
60	FP3439	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
61	FP3440	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
62	DK-M3	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
63	DK-L2^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
64	best7-1^Ia	+	+	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-	-

^Ia는 serotype Ia이며, ^II는 serotype II이다.

API zym kit 생화학적 특성 분석한 결과, 모든 균주는 leucine acrylamidase, Naphtol-AS-BI-phosphohydrolase 양성, typsin, β-galactosidase, β-glucuronidase, β-glucosidase, N-acetyl-β-glucosaminidase, α-mannosidase, α-fucosidase 음성 반응을 보였다(표 4).

S. parauberis 64개 균주의 API zym kit 생화학적 특성 분석 결과

No.	FP No.	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20
1	FPa2041^Ia	C	+	-	+	-	++	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
2	FPa3132	C	+	-	+	-	++	-	-	-	+	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
3	FP4076	C	+	-	+	-	++	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
4	FP4114	C	+	-	+	-	++	-	-	-	+	++	+	-	-	-	-	-	-	-	-
5	FP2199	C	+	-	+	-	++	-	-	-	+	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
6	FP5042	C	+	+	+	-	++	+	+	-	-	++	+	-	-	-	+	-	-	-	-
7	FP3197	C	+	-	+	-	++	-	-	-	+	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
8	FP2333	C	+	-	+	-	++	+	-	-	+	++	+	-	-	-	-	-	-	-	-
9	FP3335	C	+	-	+	-	++	-	-	-	+	++	+	-	-	-	+	-	-	-	-
10	FP3380	C	+	-	+	-	++	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
11	FP3441	C	+	-	+	-	++	+	-	-	+	++	+	-	-	-	+	-	-	-	-
12	FP3446	C	+	-	+	-	++	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
13	FP3826^Ia	C	+	-	+	-	++	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
14	FPa4365^Ia	C	+	-	+	-	++	-	-	-	+	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
15	FPa4369^Ia	C	+	-	+	-	++	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
16	FPa4403^Ia	C	+	-	+	-	++	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
17	FPa4404^Ia	C	+	-	+	-	++	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
18	Fpa4290^Ia	C	+	-	+	-	++	+	+	-	+	++	+	-	-	-	-	-	-	-	-
19	Fpa4293^Ia	C	+	-	-	-	++	+	-	-	+	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
20	Fpa4325	C	-	-	-	-	++	-	-	-	+	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
21	Fpa4406^Ia	C	+	-	+	-	++	+	-	-	+	++	+	-	-	-	-	-	-	-	-
22	Fpa4407	C	-	-	-	-	++	-	-	-	+	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
23	Fpa4599^Ia	C	-	-	-	-	++	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-
24	Fpa4616^Ia	C	-	-	-	-	++	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-
25	Fpa4624^Ia	C	-	-	-	-	++	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-
26	Fpa4658	C	+	-	+	-	++	-	-	-	-	++	+	-	-	-	-	-	-	-	-
27	Fpa4660^Ia	C	+	-	+	-	++	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
28	Fpa4661	C	+	-	+	-	++	-	-	-	-	++	+	-	-	-	+	-	-	-	-
29	Fpa4683^Ia	C	-	-	+	-	++	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
30	Fpa4710^Ia	C	-	-	+	-	++	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
31	Fpa4743^II	C	-	-	-	-	++	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
32	Fpa4804^Ia	C	-	-	+	-	++	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
33	Fpa4805^Ia	C	+	-	+	-	++	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
34	Fpa4806^Ia	C	-	-	+	-	++	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
35	Fpa4807^Ia	C	-	-	+	-	++	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
36	Fpa4850	C	-	-	-	-	++	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
37	Fpa4860^Ia	C	-	-	+	-	++	-	-	-	-	+	+	-	-	-	+	-	-	-	-
38	Fpa4870	C	-	-	-	-	++	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
39	Fpa4894	C	-	-	-	-	++	-	-	-	+	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
40	BS1K(포항-부성1K)^Ia	C	+	-	+	-	++	-	-	-	-	+	+	-	-	-	+	-	-	-	-
41	DK14(대관수산14)^Ia	C	-	-	+	-	++	-	-	-	+	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
42	DW C7-3(9월 대원C7-3)	C	-	-	-	-	++	-	-	-	+	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
43	DW1 (9월 대원병어1)	C	-	-	-	-	++	-	-	-	+	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
44	YL3(제주영림3)	C	+	-	+	-	++	+	-	-	+	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
45	PR 5KJK(늘푸른5KJK)	C	+	-	+	-	++	-	-	-	-	+	+	-	+	-	+	-	-	-	-
46	FP3825^Ia	C	+	-	-	-	++	+	-	-	-	+	+	-	-	-	+	-	-	-	-
47	FPa4577^Ia	C	+	-	+	-	++	+	+	-	+	+	+	-	-	-	+	-	-	-	-
48	FPa4578^Ia	C	+	-	+	+	++	+	+	-	+	++	+	-	-	-	+	-	-	-	-
49	FPa4586^Ia	C	-	-	-	-	++	-	-	-	-	+	+	-	-	-	+	-	-	-	-
50	FPa4587	C	-	-	-	-	++	+	+	-	+	++	+	-	+	-	+	-	-	-	-
51	SPOF3K^Ia	C	+	-	+	-	++	+	+	-	+	++	+	-	+	-	+	-	-	-	-
52	KSP28	C	+	-	-	-	++	+	-	-	+	+	+	-	-	-	+	-	-	-	-
53	PH0710^Ia	C	+	-	+	+	++	+	+	-	+	++	+	-	-	-	+	-	-	-	-
54	FP2331^II	C	+	-	-	-	++	+	-	-	-	++	+	-	-	-	+	-	-	-	-
55	FP2332^II	C	+	-	-	-	++	+	-	-	-	++	+	-	-	-	+	-	-	-	-
56	YJ3(거제육종센터3)^Ia	C	+	-	+	-	++	+	+	-	-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
57	YJ7(거제육종센터7)^Ia	C	+	-	+	-	++	+	+	-	-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
58	DB1^Ia	C	+	-	+	-	++	+	+	-	-	+	+	-	-	-	+	-	-	-	-
59	FP2313	C	+	-	-	-	++	-	-	-	-	+	+	-	+	-	+	-	-	-	-
60	FP3439	C	-	-	-	-	++	-	-	-	-	+	+	-	-	-	+	-	-	-	-
61	FP3440	C	+	-	+	-	++	-	-	-	-	+	+	-	-	-	+	-	-	-	-
62	DK-M3	C	+	-	+	-	++	+	+	-	+	+	+	-	+	-	+	-	-	-	-
63	DK-L2^Ia	C	+	-	-	-	++	-	-	-	-	+	+	-	-	-	+	-	-	-	-
64	best7-1^Ia	C	+	-	+	-	++	+	-	-	-	++	+	-	-	-	-	-	-	-	-

^Ia는 serotype Ia이며, ^II는 serotype II이다.

실시예 3: S. parauberis 의 유전형 분석

실시예 3-1: primer 제작 및 유전자 염기서열 분석

유전적 특성 분석을 위하여 각 분리 균주를 1% NaCl이 첨가된 BHIB배지에서 24시간 배양한 후 13,000rpm에서 2분간 원심분리, 상층액을 제거하여 세균 pellet을 제작하였다. 세균 pellet은 Promega Genomic DNA purification kit(Promega, USA)를 사용하여 DNA를 추출하였다. Housekeeping gene groEL, gyrB는 기 보고된 Primer를 사용하였으며, S. parauberis KCTC 11537(Nho et al., 2011) 및 KCTC 11980(Park et al., 2013) genomes에서 항원성·병원성 관련이 있을 것으로 추정되는 유전자 6종(capsule polysaccharide 4종, autolysin 1종, M-like protein 1종)을 선정하여 특이적으로 증폭할 수 있는 primer를 제작하여 분석하였다(표 5).

S. parauberis의 housekeeping·항원·병원성관련 유전자의 PCR primer 정보

유전자	Targets	Primer	Sequence (5´to 3´)	PCR product size (bp)	References (Genbank accession no./protein ID)
16S rRNA	16S rRNA	63F	5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’ (서열번호 1)	1,343	Han et al. (2015) Fisheries and aquatic sciences 18(3): 333-339
		1406R	5’-ACGGGCGGTGTGTRC-3’ (서열번호 2)
groEL	Molecular chaperon GroEL	StreptogroELd	5’-GAHGTNGTiGAAGGiATGCA-3’ (서열번호 3)	796	Glazunova et al. (2009) Int J Syst Evol Microbiol 59, 2317-2322
		StreptogroELr	5’-ATTTGRCGiAYWGGYTCTTC-3’ (서열번호 4)
gyrB	DNA gyrase subunit B	StreptogyrBd	5’-GGTTCiTCNGTiGTTAATGC-3’ (서열번호 5)	498	Glazunova et al. (2009) Int J Syst Evol Microbiol 59, 2317-2322
		StreptogyrBr	5’-GTTCRTGNGTTCCiCCTTCAT-3’ (서열번호 6)
simA	Surface M-protein	simAF	5’-GCTAAGGTCATGACCCATTC-3’ (서열번호 7)	800	This study (CP002471.1/AEF25898.1)
		simAR	5’-AGGCGTGCAATTTCAGCTTG-3’ (서열번호 8)
atlI	Autolysin (type I)	autoF	5’-CTCAAACTGAGGCTAGTAAT-3’ (서열번호 9)	1,360	This study (CP002471.1/AEF25898.1)
		autoR	5’-GTCCCGGCTAATCCAACTGT-3’ (서열번호 10)
cpb	Capsular polysaccharide biosynthesis protein	CPB-F	5’-CTTGGTGGATCCCAAGCAC-3’ (서열번호 11)	428	This study (CP002471.1/AEF25344.1)
		CPB-R	5’-CCAAACAACCACTCTCCAGC-3’ (서열번호 12)
Soa	Sugar O-acyltransferase, sialic acid	SOA-F	5’-GCAAGCGGTCACGGAAAAGT-3’ (서열번호 13)	559	This study (CP002471.1/AEF25347.1)
		SOA-R	5’-CACCTACATAGGTTCCACTA-3’ (서열번호 14)
cpb	Polysaccharide biosynthesis protein	PB-F	5’-GCAAATCTGTCGGCTTTTCG-3’ (서열번호 15)	1,290	This study (CP002471.1/AEF25350.1)
		PB-R	5’-ACGACTACCAAGGACGTTAC-3’ (서열번호 16)
Wze	Tyrosine-protein kinase	TPK-F	5’-CCGAAGAGTACTATAACTCC-3’ (서열번호 17)	641	This study (CP002471.1/AEF25351.1)
		TPK-R	5’-TGGCTTACCATAATTCCCGT-3’ (서열번호 18)
Wzy	Polysaccharide polymerase gene	For-Ia	ATTGTTAGTCATTCAGTTGT (서열번호 19)	213	Tu et al., (2015) Fish Pathology. 50(4), 213-215
		Rev-Ia	AATTATAGTCAACAGTCCAG (서열번호 20)
		For-Ib/c	ATTTCTACCAGGTTACTTTG (서열번호 21)	303
		Rev-Ib/c	ATTTCTACCAGGTTACTTTG (서열번호 21)
		For-II	GAACTACTTAGGTTTAGCAT (서열번호 22)	413
		Rev-II	AACTTGTAAATAGGATTGCT (서열번호 23)

상기 표 5에서 염기서열은 IUPAC nucleotide code(Nucleotide ambiguity code)로 표시하였으며, R은 A 또는 G, i(서열목록에는 S로 표기)는 Inosine, H는 A, C 또는 T를 의미한다. N은 any base, Y는 C 또는 T, W는 A 또는 T를 의미한다.

제작한 primer로 PCR 증폭하였으며 PCR 산물은 EtBr이 포함된 1.5% agarose gel(Bioneer, Korea)을 사용하여 전기영동한 후 UV transilluminator(Alpha Innotech, USA)를 이용해 band를 확인하였고, 염기서열을 분석하였다(표 6 내지 표 14).

넙치에서 분리된 Streptococcus parauberis 64개 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열(1,287bp)

유전자명
(Type)

염기서열(5’→3’)

16S rRNA

GCCTAGTCAGATGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATGACAATTAAGTACTCATGTACTAAATTTAAAAGGAGCAATTGCTTCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGCAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAACGGTAATGGGAGTGGAAAATCCATTACGTGACGGTAACTAACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCTCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTATTTAAGTCTGAAGTTAAAGGCCGTGGCTCAACCATGGTTCGCTTTGGAAACTGGATAACTTGAGTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTAGGCCCTTTCCGGGGCTTAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCTCTGACCGTCCTAGAGATAGGACTTTCCTTCGGGACAGAGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGTAATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTTGGTACAACGAGTCGCAAGCCGGTGACGGCAAGCTAATCTCTTAAAGCCAATCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGC (서열번호 24)

넙치에서 분리된 Streptococcus parauberis 64개 균주의 gyrB 유전자 염기서열(465bp)

유전자 typing	염기서열(5’→3’)
gyrB-A	TCATCTCAGTTAGATGTTCGTGTCTTCAAAAATGGTAGCATTCATTATCAAGAGTTTAAACGTGGAATCGTTTATGATGATTTGAAAATTATTGGAGAAACGGATTTAACAGGAACAACAGTTCACTTTACTCCGGACCCAGAAATTTTTACAGAAACAGTTGAATTTGATTTTGAAAAGCTTGCTAAGCGTGTCCAAGAATTAGCATTTTTAAACCGTGGATTACGAATCTCAATTGCCGATAAACGTAATGGAATTGAACAAGTCAAAGATTACCATTATGAAGGTGGTATCGCTAGCTATGTTGAATTTTTAAATGAGAAAAAAGATGTTATTATCGAACATCCTATCTTTACTGATGGAGAGATGGATGGCATTGCTGTCGAAGTTGCGATGCAATATACAACAGGCTATCATGAAAATGTAATGAGTTTTGCCAACAATATTCATACACATGAAGGCGGA (서열번호 25)
gyrB-B	TCATCTCAGTTAGATGTTCGTGTCTTCAAAAATGGTAGCATTCATTATCAAGAGTTTAAACGTGGAATCGTTTATGATGATTTGAAAATTATTGGAGAAACGGATTTAACAGGCACAACAGTTCACTTTACTCCGGACCCAGAAATTTTTACAGAAACAGTTGAATTTGATTTTGAAAAGCTTGCTAAGCGTGTCCAAGAATTAGCATTTTTAAACCGTGGATTACGAATCTCAATTGCCGATAAACGTAATGGAATTGAACAAGTCAAAGATTACCATTATGAAGGTGGTATCGCTAGCTATGTTGAATTTTTAAATGAGAAAAAAGATGTTATTATCGAACATCCTATCTTTACTGATGGAGAGATGGATGGCATTGCTGTCGAAGTTGCGATGCAATATACAACAGGCTATCATGAAAATGTAATGAGTTTTGCCAACAATATTCATACACATGAAGGCGGA (서열번호 26)

넙치에서 분리된 Streptococcus parauberis 64개 균주의 groE 유전자 염기서열(769bp)

유전자
typing

염기서열(5’→3’)

groE-A

GGATGCAGTTTGACCGTGGTTACCTTTCTCAATACATGGTAACAGATAACGAAAAAATGGTTGCTGACTTAGAAAATCCATTTATTTTGATCACTGATAAAAAAGTATCAAACATTCAAGAAATTCTTCCACTCTTAGAAGAAGTCTTAAAAACAAACCGCCCATTATTGATTATTGCTGATGATGTTGATGGTGAAGCCTTACCAACATTAGTTTTAAATAAAATTCGCGGAACATTTAATGTTGTTGCCGTTAAAGCACCAGGATTTGGCGACCGTCGTAAGGCTATGTTAGAGGATATTGCCATTCTAACAGGTGGAACTGTGATTACTGAAGATCTTGGTTTAGAGCTTAAGGATGCGACAATAGCAGCGCTAGGCCAAGCAGCTAAAATCTCTGTGGATAAAGATTCAACAGTTATTGTTGAAGGTTCTGGCGGTGCGGATGCTATTGCCAATCGTGTTGGCCTAATTAAATCCCAATTAGAAACAACAACGTCTGAGTTCGACCGTGAGAAATTGCAAGAACGTCTAGCTAAGTTAGCGGGTGGTGTGGCAGTTATCAAGGTTGGTGCTGCGACAGAAACTGAGTTGAAAGAAATGAAGCTCCGCATTGAAGATGCTTTGAATGCTACTCGTGCTGCTGTTGAAGAAGGGATCGTAGCTGGTGGAGGAACTGCCTTTATTTCAGTGATTGAGAAAGTGCAAGCTCTAGAACTTGAAGGTGATAATGCGACTGGTCGTAACATTGTCCTTCGTGCCCTTGAAGA (서열번호 27)

넙치에서 분리된 Streptococcus parauberis 64개 균주의 simA 유전자 염기서열(714bp)

유전자 typing	염기서열(5’→3’)
simA-A	GCTAAAGAGGCTGAAGTTGCTAACAATCGTGTTATTGTTTTAAGTAATGCTTTAAATCAAGCTAAAGAAGAATTTGATTTGAAAGCTGCTGAAGCACAAAAACTGAATAATAACGTCACTGTATTATCAAATGCCCTACAACAAGCTAAAGAAGAATTTGACAAAAAAGCCCAGGACTATCAAGCAGCTCTTGCAGAAAAAGATGCTATTGACGGACAATTAGAAACTGCTTTGACTAAAGTTTCAGACCTAGAAAGTCAATTGGCAAGTTTAAAAGAAGCTAATGAAGCTGCTAATCAAAAGATTACTCAATTAGAACAAGAAGTTGCTGATGGTGGGGTTGCCTTTAAAGACCTTAAAGGGCAAAAAGAAAAATCAGACGCACAAGTTAAAGCTCAAGCAGATAAGATTAAAGAACTGGAATCTGACTTAGAAGCGACTCAATCAGAATTAAACCAGGTGAAAGAGCAACGTGCTAATTTAGAACAAGAAGTTGCTGAGCTTGGAACTAAGGTAAAAGATTTAGAAAAAGAAAAAGCTGATTTAGAGAAAAAAGCGATAGACTTGGAAGCTGACAAAGCGGAATTTGAAGCAGAAATGGATCGTTTAAAAGCCTTACTAGCTGATAAAGACTTAGCAAATGATAAATTACTTAAAGAAATGGAAGATCTACAAAAAGACTTTGATACTAAGAAAAATCATAGTGACAGAGAA (서열번호 28)
simA-B	GCTAAAGAGGCTGAAGTTGCTAACAATCGTGTTATTGTTTTAAGTAATGCTTTAAATCAAGCTAAAGAAGAATTTGATTTGAAAGCTGCTGAAGCACAAAAACTGAATAATAACGTCACTGTATTATCAAATGCCCTACAACAAGCTAAAGAAGAATTTGACAAAAAAGCCCAGGACTATCAAGCAGCTCTTGCAGAAAAAGATGCTATTGACGGACAATTAGAAACTGCTTTGACTAAAGTTTCAGACCTAGAAAGTCAATTGGCAAGTTTAAAAGAAGCTAATGAAGCTGCTAATCAAAAGATTACTCAATTAGAACAAGAAGTTGCTGATGGTGGGGTTGCCTTTAAAGACCTTAAAGGGCAAAAAGAAAAATCAGACGCACAAGTTAAAGCTCAAGCAGATAAGATTAAAGAACTGGAATCTGACTTAGAAGCGACTCAATCAGAATTAAACCAGGTGAAAGAGCAACGTGCTAATTTAGAACAAGAAGTTGCTGAGCTTGGAACCAAGGTAAAAGATTTAGAAAAAGAAAAAGCTGATTTAGAGAAAAAAGCGATAGACTTGGAAGCTGACAAAGCGGAACTTGAAGCAGAAATGGATCGTTTAAAAGCCTTACTAGCTGATAAAGACTTAGCAAATGATAAATTACTTAAAGAAATGGAAGATCTACAAAAAGACTTTGATACTAAGAAAAATCATAGTGACAGAGAA (서열번호 29)

넙치에서 분리된 Streptococcus parauberis 64개 균주의 autolysin 유전자 염기서열(1237bp)

유전자 typing	염기서열(5’→3’)
autolysin-A	GTGAAGCAATTGCTATTGATGCATCTACTCAAAAGTCAGAACTAAATAGTAATACAGAAAGTTCAACTCCCGAAATAGAATCAGTTCCAAGTGCTCCAACTGAAGTCACAAATCAGGTTCAAACTCAAACTGCTATCCAGTCAAAAAGTGTCGCACCAGTCGAAACAGTCGAAACAGTCTCAGCTGATGTGAGTGGTCATGTTTTAAAAATTGTCTATAATGGGCAACTAGAACCAACTAAGAAGATAAAGTATGCAGTTTGGACAGATAATGCTGGCCAAGATGATTTAGTTTGGTATACTGCTGATCAAGTTGGTGCGGCATATATTGATTTATCTAAAAAACATAGAGCATATGGGCTATATAATATTCATACCTATTCGCAAGATGTAACAGGTAAGATGTCTGGCTTAAATGCGAGACAATTTACTATTCTTAAACCAACAGTAAGTACATCGTTTAACGTACAAACTAATGGTCTTGTTGATATTGTCGTTTCAAATGTGAGAGGTGATATTAGCTCAATTAAAGTTCCTGTTTGGTCAGATTTAGGTGGCCAAAACGATATTAAATGGTATCAAGCTACTCAATCAACTGATGGAACATACAAAGTTTCAGTAAAGATTTCAGATCATTCAAATGATACTGGCCATTTTGCTGTTCATGTTTATGGGAATAGTACAATCACGAATAGTCAAATCGGATTAGGGACAACAGAAGGTTTTACAATTGCTACCCCAGACCCCCAAAATGTAGTGTCAGTCGTAGTAGCTAATGATGGTTTCCACCTAGCATTAAATTCGAATGTTGTTAAAGAATTTACCAAAGTGAAATTTGCTGTTTGGTCGGATCAAGCTGGTCAAGATGACCTTCATTGGTACACAGCCAATGCTCAGGGTCAAGTCATTGTTCCTTATGTTAATCATAGTAATTATGGTCTATACAACATCCATACCTATAGTTTTGAGTCGGGAAGTGCTAAAGGTCTAAATACAAGAACAATTACAGTACCAAATCCAACTGCTAGCGCAGCCATTACACAGAAATCAGATCTTGAATTTTTAGTATCAGTTACGAATGTCCCAGCTTATATCACAAAAGTTATGTTACCAAGTTGGAGTGAAATTAATGGCCAAGATGATATCAAGTGGGTGACGGCAAGTAAGCTAGCTGATAATAGTTACCAAGCCATTATTAATATTGGAGATCATAAGTATAATTTAGGTCATTATTTAGT (서열번호 30)
autolysin-A1	GTGAAGCAATTGCTATTGATGCATCTACTCAAAAGTCAGAACTAAATAGTAATACAGAAAGTTCAACTCCCGAAATAGAATCCCTTCCAAGTGCTCCAACTGAAGTCACAAATCAGGTTCAAACTCAAACTGCTATCCAGTCAAAAAGTGTCGCACCAGTCGAAACAGTCGAAACAGTCTCAGCTGATGTGAGTGGTCATGTTTTAAAAATTGTCTATAATGGGCAACTAGAACCAACTAAGAAGATAAAGTATGCAGTTTGGACAGATAATGCTGGCCAAGATGATTTAGTTTGGTATACTGCTGATCAAGTTGGTGCGGCATATATTGATTTATCTAAAAAACATAGAGCATATGGGCTATATAATATTCATACCTATTCGCAAGATGTAACAGGTAAGATGTCTGGCTTAAATGCGAGACAATTTACTATTCTTAAACCAACAGTAAGTACATCGTTTAACGTACAAACTAATGGTCTTGTTGATATTGTCGTTTCAAATGTGAGAGGTGATATTAGCTCAATTAAAGTTCCTGTTTGGTCAGATTTAGGTGGCCAAAACGATATTAAATGGTATCAAGCTACTCAATCAACTGATGGAACATACAAAGTTTCAGTAAAGATTTCAGATCATTCAAATGATACTGGCCATTTTGCTGTTCATGTTTATGGGAATAGTACAATCACGAATAGTCAAATCGGATTAGGGACAACAGAAGGTTTTACAATTGCTACCCCAGACCCCCAAAATGTAGTGTCAGTCGTAGTAGCTAATGATGGTTTCCACCTAGCATTAAATTCGAATGTTGTTAAAGAATTTACCAAAGTGAAATTTGCTGTTTGGTCGGATCAAGCTGGTCAAGATGACCTTCATTGGTACACAGCCAATGCTCAGGGTCAAGTCATTGTTCCTTATGTTAATCATAGTAATTATGGTCTATACAACATCCATACCTATAGTTTTGAGTCGGGAAGTGCTAAAGGTCTAAATACAAGAACAATTACAGTACCAAATCCAACTGCTAGCGCAGCCATTACACAGAAATCAGATCTTGAATTTTTAGTATCAGTTACGAATGTCCCAGCTTATATCACAAAAGTTATGTTACCAAGTTGGAGTGAAATTAATGGCCAAGATGATATCAAGTGGGTGACGGCAAGTAAGCTAGCTGATAATAGTTACCAAGCCATTATTAATATTGGAGATCATAAGTATAATTTAGGTCATTATTTAGT (서열번호 31)
autolysin-B	GTGAAGCAATTGCTATTGATGCATCTACTCAAAAGTCAGAACTAAATAGTAATACAGAAAGTTCAACTCCCGAAATAGAATCAGTTCCAAGTGCTCCAACTGAAGTCACAAATCAGGTTCAAACTCAAACTGCTATCCAGTCAAAAAGTGTCGCACCAGTCGAAACAGTCTCAGCTGATGTGAGTGGTCATGTTTTAAAAATTGTCTATAATGGGCAACTAGAACCAACTAAGAAGATAAAGTATGCAGTTTGGACAGATAATGGTGGCCAAGATGATTTAGTTTGGTATACTGCTGATCAAGTTGGTGCGGCATATATTGATTTATCTAAAAAACATAGAGCATATGGGCTATATAATATTCATACCTATTCGCAAGATGTAACAGGTAAGATGTCTGGCTTAAATGCGAGACAATTTACTATTCTTAAACCAACAGTAAGTACATCGTTTAACGTACAAACTAATGGTATTGTTGATATTGTCGTTTCAAATGTGAGAGGTGATATTAGCTCAATTAAAGTTCCTGTTTGGTCAGATTTAGGTGGCCAAAACGATATTAAATGGTATCAAGCTACTCAATCAACTGATGGAACATACAAAGTTTCAGTAAAGATTTCAGATCATTCAAATGATACTGGCCATTTTGCTGTTCATGTTTATGGGAATAGTACAATCACGAATAGTCAAATCGGATTAGGGACAACAGAAGGTTTTACAATTGCTACCCCAGACCCCAAAAATGTAGTGTCAGCCGTAGTAGCTAATGATGGTTTCCACCTAGCATTAAATTCGAATGTTGTTAAAGAATTTACCAAAGTGAAATTTGCTGTTTGGTCGGATCAAGCTGGTCAAGATGACCTTCATTGGTACACAGCCAATGCTCAGGGTCAAGTCATTGTTCCTTATGTTAATCATAGTAATTATGGTCTATACAACATCCATACCTATAGTTTTGAGTCGGGAAGTGCTAAAGGTCTAAATACAAGAACAATTACAGTACCAAATCCAACTGCTAGCGCAGCCATTACACAGAAATCAGATCTTGAATTTTTAGTATCAGTTACGAATGTCCCAGCTTATATCACAAAAGTTATGTTACCAAGTTGGAGTGAAATTAATGGCCAAGATGATATCAAGTGGGTGACGGCAAGTAAGCTAGCTGATAATAGTTACCAAGCCATTATTAATATTGGAGATCATAAGTATAATTTAGGTCATTATTTAGT (서열번호 32)
autolysin-B1	GTGAAGCAATTGCTATTGATGCATCTACTCAAAAGTCAGAACTAAATAGTAATACAGAAAGTTCAACTCCCGAAATAGAATCCGTTCCAAGTGCTCCAACTGAAGTCACAAATCAGGTTCAAACTCAAACTGCTATCCAGTCAAAAAGTGTCGCACCAGTCGAAACAGTCTCAGCTGATGTGAGTGGTCATGTTTTAAAAATTGTCTATAATGGGCAACTAGAACCAACTAAGAAGATAAAGTATGCAGTTTGGACAGATAATGGTGGCCAAGATGATTTAGTTTGGTATACTGCTGATCAAGTTGGTGCGGCATATATTGATTTATCTAAAAAACATAGAGCATATGGGCTATATAATATTCATACCTATTCGCAAGATGTAACAGGTAAGATGTCTGGCTTAAATGCGAGACAATTTACTATTCTTAAACCAACAGTAAGTACATCGTTTAACGTACAAACTAATGGTATTGTTGATATTGTCGTTTCAAATGTGAGAGGTGATATTAGCTCAATTAAAGTTCCTGTTTGGTCAGATTTAGGTGGCCAAAACGATATTAAATGGTATCAAGCTACTCAATCAACTGATGGAACATACAAAGTTTCAGTAAAGATTTCAGATCATTCAAATGATACTGGCCATTTTGCTGTTCATGTTTATGGGAATAGTACAATCACGAATAGTCAAATCGGATTAGGGACAACAGAAGGTTTTACAATTGCTACCCCAGACCCCAAAAATGTAGTGTCAGCCGTAGTAGCTAATGATGGTTTCCACCTAGCATTAAATTCGAATGTTGTTAAAGAATTTACCAAAGTGAAATTTGCTGTTTGGTCGGATCAAGCTGGTCAAGATGACCTTCATTGGTACACAGCCAATGCTCAGGGTCAAGTCATTGTTCCTTATGTTAATCATAGTAATTATGGTCTATACAACATCCATACCTATAGTTTTGAGTCGGGAAGTGCTAAAGGTCTAAATACAAGAACAATTACAGTACCAAATCCAACTGCTAGCGCAGCCATTACACAGAAATCAGATCTTGAATTTTTAGTATCAGTTACGAATGTCCCAGCTTATATCACAAAAGTTATGTTACCAAGTTGGAGTGAAATTAATGGCCAAGATGATATCAAGTGGGTGACGGCAAGTAAGCTAGCTGATAATAGTTACCAAGCCATTATTAATATTGGAGATCATAAGTATAATTTAGGTCATTATTTAGT (서열번호 33)

넙치에서 분리된 Streptococcus parauberis 64개 균주의 capsular polysaccharide biosynthesis protien 유전자 염기서열(465bp)

유전자
typing

염기서열(5’→3’)

CPB-A

CCAAGCACTAATAATGAATATTTACAGAAATATTGATCGTACACAAATTCAATTTGATTTTATAATCGATCATCCAAGTATGAACTACTATCAGGATGAAATAGAAAGACTAGGTGGACGAGTATATTCTTTTCCAACATTTACAGGAAGAAATGTTCGTAATGTGCGTAATGAATGGGATAAGTTTTTTAAAGAACATGTAGAGTACTCGATTATTCATTTTCATGTTAGAAGTTATATTTCTTTATTAATTCCTATTGCAAAAAGATACGGTTTAATAACAATATCACATAGTCATAGTATTTCTAATGGACTAGGACTAAAATCAAAGATTAAGAATCTTTTACAAATTCCGATTAGATATCAAGCTGATTATCTTTTTGCTTGCTCTAAAGAGGCTGGAGA (서열번호 34)

넙치에서 분리된 Streptococcus parauberis 64개 균주의 sugar-O-acyltransferase sialic acid 유전자 염기서열(533bp)

유전자
typing

염기서열(5’→3’)

SOA-A

GAAAAGTTGTTGCAGAAATTGCTAAATTATCTGGTTATAACGACATTATTTTTCTTGATGATTATTCTAACGAAAAACTTTGTTCTGGTTATCCAGTTGTCGGAAAAGTTTCTGAAATTGTTAATTTCAAAAATGAAGATGTTTTTATAGCTATTGGATCAAGTGCTGTTAGAGAGAAAATTGCTAAACATTTGAAGGACCACAAAATAGTATCCTTAATACATCCGGCCGCAGTTGTAAGTGAAAAAGCTAAAATTGGCAAAGGGAGTGTTATTATGGCTGGTGCTGTAGTAAACCCTGATACTGAAATTGGTGAATTTTGTATAGTCAATACTTGTTCTTCTGTAGATCATGATTGTATTATAGGTGATTTTTCACACGTCTCAGTTGGCAGTCACGTTGCAGGAACAGTAACAGTTGGTTCTCATGTATGGATAGGTGCTGGGGCGACAATAATTAATAACATCGAAACACACAATAATATTTGTATTGGAGCAGGAGCAACGGTTATAAATAATTTAGTAGATAGTGGA (서열번호 35)

넙치에서 분리된 Streptococcus parauberis 64개 균주의 polysaccharide biosynthesis protein 유전자 염기서열(1119bp)

유전자 typing	염기서열(5’→3’)
PB-A	AATAAGAGCTCGAATCTTTTCCATTATCAATCGCTTTACCGATTATAAAGTCATCTTTATCCTAATAGCTAACATGTTCTTCGCATCCCTATTAAGTTATTTGGTGGACGTTCTTTTCCTAGATACATTCAGTCGTCGTTTTCTTTTCTTATCATTCCTTTTTGGAACATTTTTAATTATCCTTCCTCGGATGATTTGGCGGATGTGGCATGAACAAAATTTGTTTGTCAAACATAATAAAAAAGACCAAAAGACAAAAATGTTGGTTGTTGGTGCTGGTGAAGGTGGTAGTGCCTTTATTCAAACAATTCTGAATAAGAGTAAAGATATTGACATTGTCGGTATTGTTGATGCTGATATCAATAAATTAGGCACCTACTTACACGGGATTAAAGTACTGGGAAATAAAAATTCCATTCCAAGATTACTAGCAGAATATGAAGTTAAACAGGTTACGATTGCCATCCCAAGTTTATCTGGGGAAGAACGAGAATCAATCTTAGATATCTGCCGTAACGCAAACGTTCACGTAAACAATATGCCTAGTATTGAGAATATCGTTCTAGGTAATGTGTCACTTAATAAATTTAAAGAAATTGAGATTGCTGACTTACTTGGACGAAAGGAAGTAGTATTAGATCAAACGTCTTTAAATTCATTCTTTAACGGGAAAACAGTTCTTGTAACTGGTGCAGGAGGATCAATTGGTTCAGAAATCTGTCGTCAAGTTTCTAAATTTAATCCAGCACGCATTTTACTTTTAGGGCATGGTGAAAATTCCATTTATCTGATTCATCGTGAATTATCAGCACTGTTAAAGGGACGAATTGACATTGTCCCAATTATCGCGGACATTCAAGATCGAGACTTGATTTTTGAAATTATGGCGAATTATCGACCTGATATAGTCTATCATGCTGCAGCACATAAACATGTGCCATTGATGGAATACAATCCAAAAGAAGCTGTTAAAAATAATATCTTTGGGACAAAAAATGTGGCGGAAGCAGCCAAGGCTGCTGGGATTCCTAAATTTATCATGGTCTCAACTGACAAAGCTGTTAACCCACCTAATGTGATGGGTGCAACTAAGCGCTTCGCTGAAATGATCGTCACTGG (서열번호 36)
PB-A1	AATAAGAGCTCGAATCTTTTCCATTATCAATCGCTTTACCGATTATAAAGTCATCTTTATCCTAATAGCTAACATGTTCTTCGCATCCCTATTAAGTTATTTGGTGGACGTTCTTTTCCTAGATACATTCAGTCGTCGTTTTCTTTTCTTATCATTCCTTTTTGGAACATTTTTAATTATCCTTCCTCGGATGATTTGGCGGATGTGGCATGAACAAAATTTGTTTGTCAAACATAATAAAAAAGACCAAAAGACAAAAATGTTGGTGCTGGTGAAGGTGGTAGTGCCTTTATTCAAACAATTCTGAATAAGAGTAAAGATATTGACATTGTCGGTATTGTTGATGCTGATATCAATAAATTAGGCACCTACTTACACGGGATTAAAGTACTGGGAAATAAAAATTCCATTCCAAGATTACTAGCAGAATATGAAGTTAAACAGGTTACGATTGCCATCCCAAGTTTATCTGGGGAAGAACGAGAATCAATCTTAGATATCTGCCGTAACGCAAACGTTCACGTAAACAATATGCCTAGTATTGAGAATATCGTTCTAGGTAATGTGTCACTTAATAAATTTAAAGAAATTGAGATTGCTGACTTACTTGGACGAAAGGAAGTAGTATTAGATCAAACGTCTTTAAATTCATTCTTTAACGGGAAAACAGTTCTTGTAACTGGTGCAGGAGGATCAATTGGTTCAGAAATCTGTCGTCAAGTTTCTAAATTTAATCCAGCACGCATTTTACTTTTAGGGCATGGTGAAAATTCCATTTATCTGATTCATCGTGAATTATCAGCACTGTTAAAGGGACGAATTGACATTGTCCCAATTATCGCGGACATTCAAGATCGAGACTTGATTTTTGAAATTATGGCGAATTATCGACCTGATATAGTCTATCATGCTGCAGCACATAAACATGTGCCATTGATGGAATACAATCCAAAAGAAGCTGTTAAAAATAATATCTTTGGGACAAAAAATGTGGCGGAAGCAGCCAAGGCTGCTGGGATTCCTAAATTTATCATGGTCTCAACTGACAAAGCTGTTAACCCACCTAATGTGATGGGTGCAACTAAGCGCTTCGCTGAAATGATCGTCACTGG (서열번호 37)
PB-B	AATAAGAGCTCGAATCTTTTCCATTATCAATCGCTTTACCGATTATAAAGTCATCTTTATCCTAATAGCTAACATGTTCTTCGCATCCTTATTAAGTTATTTGGTCGACGTTCTTTTCCTAGATACATTCAGTCGTCGTTTTCTTTTCTTATCATTCCTTTTTGGAACATTTTTAATTATCCTTCCTCGGATGATTTGGCGGATGTGGCATGAACAAAATTTGTTTGTCAAACATAATAAAAAAGACCAAAAGACAAAAATGTTGGTTGTTGGTGCCGGTGAAGGTGGTAGTGCCTTTATTCAAACAATTCTGAATAAGAGTAAAGATATTGACATTGTCGGTATTGTTGATGCTGATATCAATAAATTAGGCACCTACTTACATGGGATTAAAGTACTGGGAAATAAAAATTCCATTCCAAGATTAGTAGCAGAATATGAAGTTAAACAAGTTACGATTGCCATCCCAAGTTTATCTGGGGAAGAACGAGAATCAATCTTAGATATTTGCCGTAACGCAAATGTTCACGTAAACAATATGCCTAGTATTGAGAATATCGTTCTAGGTAATGTGTCACTTAATAAATTTAAAGAAATTGAGATTGCTGACTTACTTGGACGAAAGGAAGTAGTATTAGATCAAACGTCTTTAAATTCATTCTTTAACGGGAAAACAGTTCTTGTAACTGGTGCAGGAGGATCAATTGGTTCAGAAATCTGTCGTCAAGTTTCTAAATTTAATCCAGCACGCATTTTACTTTTAGGGCATGGTGAAAATTCCATTTATCTGATTCATCGTGAATTATCAGCACTGTTAAAGGGACGAATTGACATTGTCCCAATTATCGCGGACATTCAAGATCGAGACTTGATTTTTGAAATTATGGCGAATTATCGACCTGATATAGTCTATCATGCTGCAGCACATAAACATGTGCCATTGATGGAATACAATCCAAAAGAAGCTGTTAAAAATAATATCTTTGGGACAAAAAATGTGGCGGAAGCAGCCAAGGCTGCTGGGATTCCTAAATTTATCATGGTCTCTACTGACAAAGCAGTTAATCCGCCTAATGTGATGGGTGCAACTAAGCGCTTCGCTGAAATGATCGTCACTGG (서열번호 38)
PB-B1	AATAAGAGCTCGAATCTTTTCCATTATCAATCGCTTTACCGATTATAAAGTCATCTTTATCCTAATAGCTAACATGTTCTTCGCATCCTTATTAAGTTATTTGGTCGACGTTCTTTTCCTAGATACATTCAGACGTCGTTTTCTTTTCTTATCATTCCTTTTTGGAACATTTTTAATTATCCTTCCTCGGATGATTTGGCGGATGTGGCATGAACAAAATTTGTTTGTCAAACATAATAAAAAAGACCAAAAGACAAAAATGTTGGTTGTTGGTGCCGGTGAAGGTGGTAGTGCCTTTATTCAAACAATTCTGAATAAGAGTAAAGATATTGACATTGTCGGTATTGTTGATGCTGATATCAATAAATTAGGCACCTACTTACATGGGATTAAAGTACTGGGAAATAAAAATTCCATTCCAAGATTAGTAGCAGAATATGAAGTTAAACAAGTTACGATTGCCATCCCAAGTTTATCTGGGGAAGAACGAGAATCAATCTTAGATATTTGCCGTAACGCAAATGTTCACGTAAACAATATGCCTAGTATTGAGAATATCGTTCTAGGTAATGTGTCACTTAATAAATTTAAAGAAATTGAGATTGCTGACTTACTTGGACGAAAGGAAGTAGTATTAGATCAAACGTCTTTAAATTCATTCTTTAACGGGAAAACAGTTCTTGTAACTGGTGCAGGAGGATCAATTGGTTCAGAAATCTGTCGTCAAGTTTCTAAATTTAATCCAGCACGCATTTTACTTTTAGGGCATGGTGAAAATTCCATTTATCTGATTCATCGTGAATTATCAGCACTGTTAAAGGGACGAATTGACATTGTCCCAATTATCGCGGACATTCAAGATCGAGACTTGATTTTTGAAATTATGGCGAATTATCGACCTGATATAGTCTATCATGCTGCAGCACATAAACATGTGCCATTGATGGAATACAATCCAAAAGAAGCTGTTAAAAATAATATCTTTGGGACAAAAAATGTGGCGGAAGCAGCCAAGGCTGCTGGGATTCCTAAATTTATCATGGTCTCTACTGACAAAGCAGTTAATCCGCCTAATGTGATGGGTGCAACTAAGCGCTTCGCTGAAATGATCGTCACTGG (서열번호 39)
PB-B2	AATAAGAGCTCGAATCTTTTCCATTATCAATCGCTTTACCGATTATAAAGTCATCTTTATCCTAATAGCTAACATGTTCTTCGCATCCTTATTAAGTTATTTGGTCGACGTTCTTTTCCTAGATACATTCAGTCGTCGTTTTCTTTTCTTATCATTCCTTTTTGGAACATTTTTAATTATCCTTCCTCGGATGATTTGGCGGATGTGGCATGAACAAAATTTGTTTGTCAAACATAATAAAAAAGACCAAAAGACAAAAATGTTGGTTGTTGGTGCCGGTGAAGGTGGTAGTGCCTTTATTCAAACAATTCTGAATAAGAGTAAAGATATTGACATTGTCGGTGTTGTTGATGCTGATATCAATAAATTAGGCACCTACTTACATGGGATTAAAGTACTGGGAAATAAAAATTCCATTCCAAGATTAGTAGCAGAATATGAAGTTAAACAAGTTACGATTGCCATCCCAAGTTTATCTGGGGAAGAACGAGAATCAATCTTAGATATTTGCCGTAACGCAAATGTTCACGTAAACAATATGCCTAGTATTGAGAATATCGTTCTAGGTAATGTGTCACTTAATAAATTTAAAGAAATTGAGATTGCTGACTTACTTGGACGAAAGGAAGTAGTATTAGATCAAACGTCTTTAAATTCATTCTTTAACGGGAAAACAGTTCTTGTAACTGGTGCAGGAGGATCAATTGGTTCAGAAATCTGTCGTCAAGTTTCTAAATTTAATCCAGCACGCATTTTACTTTTAGGGCATGGTGAAAATTCCATTTATCTGATTCATCGTGAATTATCAGCACTGTTAAAGGGACGAATTGACATTGTCCCAATTATCGCGGACATTCAAGATCGAGACTTGATTTTTGAAATTATGGCGAATTATCGACCTGATATAGTCTATCATGCTGCAGCACATAAACATGTGCCATTGATGGAATACAATCCAAAAGAAGCTGTTAAAAATAATATCTTTGGGACAAAAAATGTGGCGGAAGCAGCCAAGGCTGCTGGGATTCCTAAATTTATCATGGTCTCTACTGACAAAGCAGTTAATCCGCCTAATGTGATGGGTGCAACTAAGCGCTTCGCTGAAATGATCGTCACTGG (서열번호 40)
PB-B3	AATAAGAGCTCGAATCTTTTCCATTATCAATCGCTTTACCGATTATAAAGTCATCTTTATCCTAATAGCTAACATGTTCTTCGCATCCTTATTAAGTTATTTGGTCGACGTTCTTTTCCTAGATACATTCAGTCGTCGTTTTCTTTTCTTATCATTCCTTTTTGGAACATTTTTAATTATCCTTCCTCGGATGATTTGGCGGATGTGGCATGAACAAAATTTGTTTGTCAAACATAATAAAAAAGACCAAAAGACAAAAATGTTGGTTGTTGGTGCCGGTGAAGGTGGTAGTGCCTTTATTCAAACAATTCTGAATAAGAGTAAAGATATTGACATTGTCGGTATTGTTGATGCTGATATCAATAAATTAGGCACCTACTTACATGGGATTAAAGTACTGGGAAATAAAAATTCCATTCCAAGATTAGTAGCAGAATATGAAGTTAAACAAGTTACGATTGCCATCCCAAGTTTATCTGGGGAAGAACGAGAATCAATCTTAGATATTTGCCGTAACGCAAATGTTCACGTAAACAATATGCCTAGTATTGAGAATATCGTTCTAGGTAATGTGTCACTTAATAAATTTAAAGAAATTGAGATTGCTGACTTACTTGGACGAAAGGAAGTAGTATTAGATCAAACGTCTTTAAATTCATTCTTTAACGGGAAAACAGTTCTTGTAACTGGTGCAGGAGGATCAATTGGTTCAGAAATCTGTCGTCAAGTTTCTAAATTTAATCCAGCACGCATTTTACTTTTAGGGCATGGTGAAAATTCCATTTATCTGATTCATCGTGAATTATCAGCACTGTTAAAGGGACGAATTGACATTGTCCCAATTATCGCGGACATTCAAGATCGAGACTTGATTTTTGAAATTATGGCGAATTATCGACCTGATATAGTCTATCATGCTGCAGCACATAAACATGTGCCATTGATGGAATACAATCCAAAAGAAGCTGTTAAAAATAATATCTTTGGGACAAAAAATGTGGCGGAAGCAGCCAAGGCTGCTGGGATTCCTAAATTTATCATGGTCTCTACTGACAAAGCAGTTAATCCGCCTAATGTGATGGGTGCAACTAAGCGCTTCGCTGAAATGATCGTCACTGG (서열번호 41)

넙치에서 분리된 Streptococcus parauberis 64개 균주의 tyrosin-protein kinase 유전자 염기서열(594bp)

유전자 typing	염기서열(5’→3’)
Wze-A	CTCCATTCGGACTAACATCCAATTTAGTGGTCGAGATTTAAAAGTTATCACCTTAACATCAGTACAACCTGGTGAAGGGAAATCGACAACATCCGCAAATATTGCTATCTCATTTGCTAAAGCAGGTCTAAAAACCCTATTAATCGATGCAGACATCCGTAATTCAGTTATGTCTGGTACATTTAAAGCTGATGAAAAGTATGAAGGTCTATCAAGTTACCTGTCAGGTAATGCAGAATTATCAGCAGTTATCTCTCATACAAATATTGAAAACTTAATGTTGATTCCAGCAGGACATGTTCCTCCTAATCCAACAACTTTACTCCAAAATAGCAATTTTAATTTCATGATTGATACTGTAAAAGAGTTATTTGATTATGTGATTATCGATACCCCACCTATTGGCCTTGTTATCGACTCAGCGATTATTTCACAAAAAGCTGACGCAAACATCTTAGTAACAGAAGCTGGGGCTATTAAACGACGCTTTATCCAAAAAGCAAAAGAACAAATGGAACAAAGTGGTGCTTTGTTCTTGGGTGTTATTTTAAATAAAGTAGAAGAAACACTTGATTCATATGGTGGTTATGGTAG (서열번호 42)
Wze-A1	CTCCATTCGGACTAACATCCAATTTAGTGGTCGAGATTTAAAAGTTATCACCTTAACATCAGTACAACCTGGTGAAGGGAAATCGACAACATCCGCAAATATTGCTATCTCATTTGCTAAAGCAGGTCTAAAAACCCTATTAATCGATGCAGACATCCGTAATTCAGTTATGTCTGGTACATTTAAAGCTGATGAAAAGTATGAAGGTCTATCAAGTTACCTGTCAGGTAATGCAGAATTATCAGCAGTTATCTCTCATACAAATATTGAAAACTTAATGTTGATTCCAGCAGGACATGTTCCTCCTAATCCAACAACTTTACTCCAAAATAGCAATTTTAATTTCATGATTGATACTGTAAAAGAGTTATTTGATTATGTGATTATCGATACCCCACCTATTGGCCTTGTTATCGACTCAGCGATTATTTCACAAAAAGCTGACGCAAACATCTTAGTAACAGAAGCTGGGGCTATTAAACGACGCTTTATCCAAAAAGCAAAAGAACAAATGGAACAAAGTGGTGCTTTGTTCTTGGGTGTTATTTTAAATAAAGTAGAAGAATCACTTGATTCATATGGTGGTTATGGTAG (서열번호 43)
Wze-B	CTCCATTCGGACTAACATCCAATTTAGTGGTCGAGATTTAAAAGTTATCACCTTAACATCAGTACAACCTGGTGAAGGGAAATCGACATTATCCGCAAATATTGCTATCTCATTTGCTAAAGCAGGTCTTAAAACCCTATTAATCGATGCAGACATCCGTAATTCAGTTATGTCTGGTACATTTAAAGCTGATGAAAAGTATGAAGGTCTATCAAGTTACCTATCAGGTAATGCAGAATTATCAGCAGTTATTTCTCATACAAATATTGAAAACTTAATGTTGATTCCAGCAGGACATGTTCCTCCTAATCCAACAACTTTACTCCAAAATAGCAATTTTAATTTCATGATTGATACTGTAAAAGAGTTATTTGATTATGTGATTATCGATACCCCACCTATTGGCCTTGTTATAGACTCAGCGATTATTTCACAAAAAGCTGACGCAAACATTTTAGTAACAGAAGCAGGGGCTATTAAACGACGCTTTATCCAAAAAGCAAAAGAACAAATGGAACAAAGTGGTGCCTTGTTCTTGGGTGTTATTTTAAATAAAGTAGAAGAAACACTTGATTCATATGGTGGTTATGGTAG (서열번호 44)
Wze-B1	CTCCATTCGGACTAACATCCAATTTAGTGGTCGAGATTTAAAAGTTATCACCTTAACATCAGTACAACCTGGTGAAGGGAAATCGACATTATCCGCAAATATTGCTATCTCATTTGCTAAAGCAGGTCTTAAAACCCTATTAATCGATGCAGACATCCGTAATTCAGTTATGTCTGGTACATTTAAAGCTGATGAAAAGTATGAAGGTCTATCAAGTTACCTATCAGGTAATGCAGAATTATCAGCAGTTATTTCTCATACAAATATTGAAAACTTAATGTTGATTCCAGCAGGACATGTTCCTCCTAATCCAACAACTTTACTCCAAAATAGCAATTTTAATTTCATGATTGATACTGTAAAAGAGTTATTTGATTATGTGATTATCGATACCCCACCTATTGGCCTTGTTATAGACTCAGCGATTATTTCACAAAAAGCTGACGCAAACATTTTAGTAACAGAAGCAGGGGCTATTAAACGACGCTTTATCCAAAAAGCAAAAGAACAAATGGAACAAAGTGGTACCTTGTTCTTGGGTGTTATTTTAAATAAAGTAGAAGAAACACTTGATTCATATGGTGGTTATGGTAG (서열번호 45)

유전자 염기서열분석은 MEGA6 program과 GENETYX Ver.8.0(SDC Software Development, Japan)을 사용하였으며, 결정된 각 염기서열은 National Center for Biotechnology Institute(NCBI)에서 제공하는 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)을 이용하여 기존에 보고된 S. parauberis 균주의 유전자 및 본 실시예에서 분석한 균주의 유전자를 비교 분석하였다. Blast search의 염기서열 정보를 바탕으로 Bioedit Ver.7.2.1를 사용하여 multiple alignments를 실시하였고, MEGA6 program(http://www.megasoftware.net; Tamura et al., 2013)을 사용한 근린결합분석(NJ; neighbor-joining analysis, 1,000 rounds of boostrap)을 통하여 각 염기서열간 유전적 거리와 계통도(phylogenetic tree)를 작성하였다(도 1).

실시예 3-2: 유전형 분석 결과

넙치에서 분리된 64개 균주의 16S rRNA 분석결과 S. parauberis로 확인되었으며, 동일한 염기서열로 확인되었다. S. parauberis 64개 균주에 대한 multilocus sequence typing(MLST) 분석을 실시하였다. Sugar O-acryltransferase sialic acid(Soa), Polysaccharide biosynthesis protein(PB) 유전자는 일부 균주에서는 증폭이 되지 않았다. 분석한 64개 균주에서 16S rRNA, groEL 유전자는 모두 염기서열이 동일하였으며, 균주마다 염기서열이 차이가나는 gyrB 및 항원성·병원성 관련 유전자 4종에 대해서만 MLST 분석을 수행하였다. 넙치에서 분리되는 S. parauberis 64개 균주는 크게 2가지 MLST 유전형으로 나누어지며, MLST-1 group 36개 균주, MLST-2 group 28개 균주로 확인되었다(도 1). 균주별 유전형 분석결과는 하기 표 15에 나타내었다.

S. parauberis 64개 균주별 유전형 분석

serotype PCR

Serotype

슬라이드 응집반응

No.

FP No.

자원채집지역

채집일

16S rRNA

groEL

gyrB

simA

auto

CPB

SOA

PB

TPK

Ia

Ib/c

II

I

II

1

FPa2041

제주도

2002-07-03

A

B

-

B

++

Ia

+

2

FPa3132

경북 포항

2003-08-

A

++

Ib

+

3

FP4076

전남 완도

2004-08-06

A

++

Ib

+

4

FP4114

제주(북)

2004-08-31

A

++

Ib

+

5

FP2199

전남 완도

2005-05-31

A

++

Ib

+

6

FP5042

제주도

2005-06-15

A

++

Ib

+

7

FP3197

경남 울산

2006-10-01

A

++

Ib

+

8

FP2333

연우수산

2006-12-01

A

++

Ib

+

9

FP3335

경북 포항

2007-08-01

A

A1

++

Ib

+

10

FP3380

경남 울산

2007-10-01

A

A1

A

++

Ic

X

11

FP3441

전남 완도

2008-05-06

A

++

Ib

+

12

FP3446

경북 포항

2008-07-01

A

++

Ib

+

13

FP3826

양식환경연구소(통영)

2010-01-04

A

B

-

B

+

Ia

+

14

FPa4365

경북 포항

2012-07-14

A

B

-

B3

B

+

Ia

+

15

FPa4369

경북 포항

2012-07-14

A

B

-

B3

B

+

Ia

+

16

FPa4403

경남 거제육종센터

2012-09-05

A

B

-

B

+

Ia

+

17

FPa4404

경남 거제육종센터

2012-09-05

A

B

-

B

+

Ia

+

18

Fpa4290

제주도

2012-04-18

A

B

-

B

+

Ia

+

19

Fpa4293

제주도

2012-04-18

A

B

-

B

+

Ia

+

20

Fpa4325

경북 포항

2012-05-08

A

++

Ib

+

21

Fpa4406

경남거제

2012-09-10

A

B

-

B

+

Ia

+

22

Fpa4407

경남거제

2012-09-10

A

++

Ib

+

23

Fpa4599

제주도

2014-04-14

A

B

-

B

+

Ia

+

24

Fpa4616

경북 포항

2014-05-26

A

B

-

B

+

Ia

+

25

Fpa4624

경북 포항

2014-05-14

A

B

-

B

+

Ia

+

26

Fpa4658

제주도

2014-07-25

A

++

Ib

+

27

Fpa4660

제주도

2014-07-25

A

B

-

B

+

Ia

+

28

Fpa4661

제주도

2014-07-25

A

++

Ib

+

29

Fpa4683

경북 포항

2014-09-26

A

B

-

B

+

Ia

+

30

Fpa4710

경북 포항

2014-09-15

A

B

-

B

+

Ia

+

31

Fpa4743

제주도

2015-03-05

A

B

-

B2

B

++

II

+

32

Fpa4804

제주도

2015-07-15

A

B

-

B

+

Ia

+

33

Fpa4805

제주도

2015-07-15

A

B

-

B

+

Ia

+

34

Fpa4806

제주도

2015-07-15

A

B

-

B

+

Ia

+

35

Fpa4807

제주도

2015-07-15

A

B

-

B

+

Ia

+

36

Fpa4850

제주도

2015-09-16

A

++

Ib

+

37

Fpa4860

제주도

2015-10-14

A

B

-

B

+

Ia

+

38

Fpa4870

제주도

2015-10-14

A

++

Ic

X

39

Fpa4894

제주도

2015-11-18

A

++

Ib

+

40

BS1K(포항-부성1K)

경북 포항

2016-06-21

A

B

-

B

+

Ia

+

41

DK14(대관수산14)

경북 포항

2016-08-21

A

B

-

B

+

Ia

+

42

DW C7-3(9월 대원C7-3)

경남 울산

2016-09-08

A

++

Ib

+

43

DW1 (9월 대원병어1)

경남 울산

2016-09-08

A

++

Ib

+

44

YL3(제주영림3)

제주도

2016-11-00

A

++

Ib

+

45

PR 5KJK(늘푸른5KJK)

제주도

2016-12-23

A

++

Ib

+

46

FP3825

양식환경연구소(통영)

2010-01-04

A

B

-

B

+

Ia

+

47

FPa4577

제주도

2014-03-20

A

B

-

B

+

Ia

+

48

FPa4578

제주도

2014-03-20

A

B

-

B

+

Ia

+

49

FPa4586

제주도

2014-03-20

A

B

-

B

+

Ia

+

50

FPa4587

제주도

2014-03-20

A

+

Ic

X

51

SPOF3K

거제도

2013년

A

B

-

B

+

Ia

+

52

KSP28

전남 완도

2005년

A

+

Ib

+

53

PH0710

A

B

-

B

B1

+

Ia

+

54

FP2331

2006-11-01

A

B

-

B2

B

+

II

+

55

FP2332

2006-12-01

A

B

-

B2

B

+

II

+

56

YJ3(거제육종센터3)

2017-05-17

A

B

-

B

+

Ia

+

57

YJ7(거제육종센터7)

2017-05-17

A

B

-

B

+

Ia

+

58

DB1

제주도

2017-07-18

A

B

-

B

+

Ia

+

59

FP2313

경북 포항

2006년

A

B

-

B2

B

II

60

FP3439

전남 완도

2008년

A

+

Ib

+

61

FP3440

전남 완도

2008년

A

+

Ib

+

62

DK-M3

부산 기장

2017-08-17

A

+

Ib

+

63

DK-L2

전남 완도

2017-09-07

A

B

-

B

+

Ia

+

64

best7-1

부산 기장

2017-08-17

A

B

-

B

+

Ia

+

CPB 및 SOA 항목에서 -로 표시된 것은 PCR 증폭이 되지 않은 것이다.

실시예 4: S. parauberis 의 혈청형 분석

실시예 4-1: 혈청형 분석 방법

슬라이드 응집반응으로 혈청형을 분석하였으며, 참조균주(S. parauberis serotype I FPa4164 및 S. parauberis serotype O2 S53)에 대한 토끼항혈청을 제작하여 분석에 사용하였다. 슬라이드글라스에 S. parauberis에 대한 2종류의 토끼 항혈청을 각각 70μL씩 떨어뜨리고 넙치 유래 S. parauberis 64개 균주를 McFarland no. 6 standard로 멸균 생리식염수에 현탁한 균액을 각 10μL 떨어뜨려 잘 섞어 30초 이내에 응집 형성 유무를 확인하였다(도 2(A)). 응집은 어두운 배경에서 슬라이드를 측면에서 관찰하였으며, 대조군은 균을 현탁하지 않은 멸균 생리식염수를 사용하였다.

S. parauberis의 serotype I 안에 subserotypes을 구분하기 위해서 microtiter 응집반응을 통해 S. parauberis 64개 균주의 혈청형 분석을 시도하였다(도 2(B)). S. parauberis 유전형과 표현형의 특성이 다른 4가지 균주 DK14, DW1, FPa4870, FP4743에 대한 토끼 항혈청을 제작하여 Kanai et al.(2015)의 방법으로 microtiter 응집반응을 통한 sub-serotyping을 수행하였다. 96 well plates에 토끼항혈청을 PBS로 2배씩 순차적으로 희석한 후 4가지 S. parauberis FKC 현탁액(2mg/mL PBS)을 동일한 용량 25㎕씩 첨가 후 혼합 4℃에서 O/N incubation한 후 응집항체가를 측정하였다. 항혈청의 cross-absorbed test를 위하여 absorbed-항혈청을 제작하였으며(Kanai at al., (2015) Fish pathology 50(2), 75-80), absorbed-항혈청은 응집항체가 4 미만으로 제작하였다. Tu et al.(2015)의 방법에 따라 S. parauberis에 대한 serotyping PCR을 실시하였다. PCR primer의 염기서열은 상기 표 2에 나타낸 바와 같다.

실시예 4-2: 혈청형 분석 결과

슬라이드 응집반응 결과, S. parauberis 균주는 serotype I 58개 균주, serotype II 4개 균주, untypable serotype 2개 균주로 확인되었다. 64개 균주의 Serotyping-PCR 결과는 상기 표 15에 나타낸 바와 같다.

S parauberis 4가지 균주 DK14, DW1, FPa4870, FP4743에 대한 토끼 항혈청을 제작하여 microtiter 응집반응을 통한 sub-serotyping을 수행한 결과, Serotype I 58개 균주는 anti-DK14, anti-DW1, anti-FPa4870 항혈청과 응집반응을 나타내지만, 응집가는 항혈청 종류에 따라 차이가 있어 serotype I 안에 subserotype의 존재하는 것이 시사되었다. 응집가에 따라 S. parauberis serotype I의 subserotyping한 결과, Ia 25개 균주, Ib 25개 균주, Ic 8개 균주, Non-typeable 2개 균주로 확인되었다(표 16).

토끼 항혈청에 대한 응집가에 따른 S. parauberis 혈청형 분류

항혈청 (Antiserum)	응집가(Agglutination titers)
항혈청 (Antiserum)	Subserotype Ia (n=25)	Subserotype Ib (n=25)	Subserotype Ic (n=8)	serotype II (n=4)	Non-typeable (n=2)
Anti-DK14 (Ia)	64	16-32	≤64	＜2	32-2048
Anti-DW1 (Ib)	≤32	64	≤64	＜2	32-2048
Anti-FPa4870 (Ic)	≤32	8-64	≥128	＜2	64-1028
Anti-FP4743 (II)	＜2	＜2	＜2	128	32-2048

S. parauberis serotype I 안에서 subserotype의 분류를 위하여 anit-DK14, anti-DW1, anti-FPa4870 항혈청을 교차응집소흡수방법으로 균주별 흡수 항혈청(absorbed-antiserum)을 제작하여 다시 응집가를 측정하였다. 교차응집소흡수방법을 통해서 분석한 결과, serotype I에서 3가지 subtype 존재하며, subserotype Ic type의 경우 Ia type 보다 Ib type에서 높은 응집가를 나타내었다(표 17).

Absorbed, unabsorbed 토끼 항혈청에 대한 응집가 결과 비교

항혈청 (Antiserum)	Absorbed FKC	각 균주별 FKC에 대한 응집가(Agglutination titers)
항혈청 (Antiserum)	Absorbed FKC	DK14 (Ia)	DW1 (Ib)	FPa4870 (Ic)
Anti-DK14 (Ia)	Unabsorbed	64	32	32
	DK14	＜2	＜2	＜2
	DW1	8	＜2	＜2
	4870	16	16	＜2
Anti-DW1 (Ib)	Unabsorbed	32	64	64
	DK14	＜2	8	8
	DW1	＜2	＜2	＜2
	4870	16	16	＜2
Anti-FPa4870 (Ic)	Unabsorbed	64	64	128
	DK14	＜2	8	32
	DW1	＜2	＜2	64
	4870	＜2	＜2	＜2

Serotype Ib의 균주는 모두 MLST-2 group에 포함되었으며, serotype II 및 Ia은 MLST-1 group에 포함되었고, serotype Ic는 유전형과 상관성이 없었다(도 1).

S. parauberis 분리지역에 따른 혈청형(유전형) 분포를 분석한 결과, 분리지역에 따른 특정 혈청형을 확인할 수 없었으며, 분리 지역에 관계없이 다양한 혈청형이 확인되었다(표 18, 도 3 및 도 4).

2002년-2017년 S. parauberis 균 분리지역에 따른 혈청형 분포

지역	제주	전남	경북		경남
지역	제주	완도	포항	부산·울산	거제	통영
균주 수	25	9	17	6	5	2
혈청형	Ia=9, Ib=9, Ic=5, II=1, NT=1	Ia=1, Ib=8	Ia=9, Ib=5, II=3	Ia=1, Ib=2, Ic=1, NT=1	Ia=1, Ib=4	Ia=1, Ic=1

S. parauberis 분리 연도에 따른 혈청형 분포를 분석한 결과, 2010년 이전에는 serotype Ib가 우점적이며, 2010년 이후에는 serotype Ia(MLST-1 group)가 지속적으로 분리되었고, 최근에 serotype Ic 분리율이 증가함을 확인하였다(표 19).

2002년-2017년 S. parauberis 균 분리 시기별 혈청형 분포

연도	2002	2003	2004	2005	2006	2007	2008	2010	2012	2013	2014	2015	2016	2017
균주수	1	1	2	3	5	2	6	2	10	1	12	9	4	6
혈청형	Ia=1	Ib=1	Ib=2	Ib=3	Ib=2, II=3	Ib=1, NT=1	Ib=6	Ia=1, Ic=1	Ia=5 Ib=5	Ia=1	Ia=10, Ib=2	Ic=5, Ib=3, II=1	Ia=1, Ib=3	Ia=4, Ic=1, NT=1

특히 serotype Ia와 Ic의 경우, 2009년 S. parauberis의 넙치 백신이 상용화된 이후부터 분리비율이 증가하는 것으로 나타났다. 이는 상용화된 백신의 효과가 없다기 보다는 백신의 사용으로 인한 S. parauberis의 혈청형의 변화로 추정된다(도 3 및 도 4).

실시예 5: 시판 상업용 백신의 혈청형 조사

2018년 우리나라에서 판매되고 있는 넙치 S. parauberis 항원을 포함하는 불활화 백신 7종을 구입하였다. 원심분리하고 Promega Genomic DNA purification kit(Promega, USA)를 사용하여 DNA를 추출한 후, serotype-PCR(Tu et al., 2015)로 혈청형을 분석하였다. PCR 증폭하였으며 PCR 산물은 EtBr이 포함된 1.5% agarose gel(Bioneer, Korea)을 사용하여 전기영동한 후 UV transilluminator(Alpha Innotech, USA)를 이용해 band를 확인하였다.

그 결과, 모두 serotype Ib과 serotype Ib+II으로 확인되었다(도 5 및 표 20).

국내 시판되고 있는 Streptococcus parauberis 항원을 포함하는 불활화 백신의 serotype-PCR 결과

	제품명	회사명	Serotype PCR 결과
	제품명	회사명	Ⅰa	Ⅰb/c	Ⅱ
1	포세이돈4	녹십자수의약품	-	+	+
2	프로백 펜타	코미팜	-	+	-
3	프로백-3ST	코미팜	-	+	-
4	어질방ES3플러스	고려비엔피	-	+	-
5	윌로마린 엠백SIP3	유한양행	-	+	+
6	스트렙-키퍼3	우성양행	-	+	+
7	대성 연쇄,에드 피쉬백	대성미생물연구소	-	+	-

실시예 6: S. parauberis 의 병원성 분석

혈청형이 다른 대표 균주 7개 균주(FPa4870, FP4743, FP2331, FPa4365, PR5(19FBSPa0003), DK14, DW)를 선정하여 넙치(16.5±0.7cm)에 10⁶cfu/fish 농도로 인위감염실험(수온 23±1℃, 피하주사법, 시험구당 10마리)을 수행하였다. 피하주사를 통한 인위감염 실험은 Mori et al. (2010) Fish Pathology, 45(1), 37-42의 방법으로 수행하였다.

1차 감염실험에서 혈청형별로 폐사율이 비교적 높게 나타난 PR5, FPa4365, FPa4870, FP2331 균주를 가지고 2차 감염실험을 수행하였다(도 6). 4개 균주를 넙치(11.6±0.5cm)에 10⁵~10¹⁰cfu/fish 인위감염(수온 25±0.5℃, 피하주사법)시킨 후 2주간의 누적 폐사율을 측정하였다. 그 결과 S. parauberis의 serotype I에 포함되는 FPa4365(Ia), PR5(Ib), FPa4870(Ic)는 모두 넙치에 높은 병원성을 나타냈다(도 7). Serotype II의 FP2331(II) 균주를 10¹⁰cfu/fish로 넙치에 피하주사하였으나, 고농도에서도 넙치에서는 폐사가 발생하지 않았으므로, FP2331균주는 넙치에 병원성이 없거나 낮을 것으로 판단된다. 최종적으로 혈청형 Ia, Ib, Ic 균주는 10⁸cfu/fish, 혈청형 II는 10¹⁰cfu/fish의 농도를 백신 효능 검증을 위한 인위감염 농도로 설정하였다.

실시예 7: 혈청형간 S. parauberis 백신의 효능 분석

실시예 7-1: 백신 제작 및 효능 분석 방법

S. parauberis 혈청형 Ia, Ib, Ic, II 균주(FPa4870, FP2331, FPa4365, PR5(19FBSPa0003))에 formalin을 처리한 불활화 백신(FKC) 제작하여 넙치에 복강 접종(1mg/fish)하고, 대조구는 PBS를 복강 주사하였다.

동결 보존된 S. parauberis 4개 균주를 1.5%(v/v) NaCl이 첨가된 BHIA 배지에서 30℃ 온도로 24시간 동안 배양하였다. 배양된 평판배지의 집락을 무균적으로 1.5% NaCl이 첨가된 BHIB에 접종 후 교반 배양기(JS Research Inc.)에서 150rpm, 30℃ 온도로 48시간 동안 배양하였다. 배양된 균액에 37%(v/v) 포르말린(Merck, Germany)을 각 배양액의 0.5%(v/v)가 되도록 첨가하여 교반 배양기에서 150rpm, 20℃로 24시간 동안 불활화하였다. 배양균의 불활화를 BHIA(Difco, USA)에서 최종 확인하였다. 불활화가 확인된 균액을 12,000RCF로 원심분리한 다음, 멸균 생리 식염수로 3회 세척한 후 균체를 수거하고 최종적으로 습균체 무게를 측정하여 실험구에 따라 농도를 달리하여 현탁하였다. 백신접종 2주 후에 미부정맥에서 혈액을 채취하여 ELISA법으로 항체가를 측정하였다. ELISA법을 이용한 항체가 조사 방법으로 96-well plate에 S. parauberis FKC를 10μg/well의 농도가 되도록 조절하여 분주하고 4℃ over night하여 plate 바닥에 항원을 부착하였다. S. parauberis 혈청형별 ELISA값을 측정하기 위하여 4가지 다른 혈청형의 S. parauberis의 FKC를 제작하여 각각의 혈청에 대한 항체가를 조사하였다. 3% skim milk를 이용하여 실온에서 1시간 동안 blocking을 수행하고, 1차 항체로 넙치 혈청과 장 점액을 10배 희석하여 분주한 후 1시간 동안 반응시킨다. 그 후, PBST를 이용하여 3회 세척한 뒤 2차 항체는 Anti-Japanese flounder IgM Mab를 1:1000로 희석하여 분주한 후 1시간 동안 37℃에서 반응시킨다. 세척 후, AP-conjugated anti-mouse IgG(whole molecule)를 1:1000으로 희석하여 분주한 후 37℃에서 1시간 반응시키고, 세척한 다음, 기질(PNPP substrate solution)을 첨가하여 20분 후 405nm에서 흡광도를 확인하였다. 백신 접종 4주 후 각각의 백신접종구에 혈청형 Ia, Ib, Ic, II 균주로 각각 인위감염 실험하여 3주간 누적폐사율을 측정하였다(도 8). 상대생존율은 아래와 같이 계산하였다.

상대생존율(%) = {1-(시험구의 누적폐사율/대조구의 누적폐사율)} × 100

실시예 7-2: 혈청형별 백신의 효능 및 교차 백신 효능 분석

혈청형별 백신접종 2주 후 채혈하여 항원 종류별(혈청형 Ia~II)로 혈청의 항체가를 측정한 결과, 대조구와 비교하여 모두 유의적으로 높은 항체가를 형성하였으며, 각각의 백신구는 동일한 혈청형의 항원으로 항체가를 측정할 경우 가장 높은 항체가를 나타내었다(표 21).

혈청형별 백신 접종 2주 후 항체가 측정 결과

항원(serotype)	ELISA의 흡광도(OD)
항원(serotype)	FPa4365(Ia) 백신구	PR5(Ib) 백신구	FPa4870(Ic) 백신구	FP2331(II) 백신구	대조구 (PBS)
FPa4365(Ia)	0.469±0.219	0.376±0.134	0.866±0.227	0.409±0.199	0.144±0.063
PR5(Ib)	0.249±0.12	0.473±0.180	0.837±0.278	0.421±0.212	0.161±0.072
FPa4870(Ic)	0.223±0.14	0.386±0.106	1.078±0.251	0.332±0.197	0.156±0.067
FP2331(II)	0.2±0.133	0.392±0.094	0.823±0.261	0.446±0.159	0.159±0.074

넙치에 대한 4가지 혈청형이 다른 S. parauberis 백신 처리 후, 각각의 혈청형에 대한 인위감염 시험을 수행한 결과, 백신을 접종하지 않은 대조구에 비하여 모든 백신접종구에서 낮은 폐사율을 나타내었다(표 22).

S. parauberis 4가지 혈청형의 백신 접종 후 인위감염 실험에 따른 누적 폐사율

실험구	인위감염 실험에 따른 폐사율(%)
실험구	FPa4365 감염(Ia)	PR5 감염(Ib)	FPa4870 감염(Ic)	FP2331 감염(II)
FPa4365 백신(Ia)	33.3	61	33.3	0
PR5 백신(Ib)	66.6	15.4	16.6	0
FPa4870 백신(Ic)	75	23	16.6	0
FP2331 백신(II)	66.6	26.5	16.6	0
대조구(PBS)	75	88.2	66.6	0

혈청형간 교차 백신 효능을 대조구와 비교한 상대생존율을 비교한 결과 모든 시험구에서 동일한 혈청형의 백신 접종 후 동일한 혈청형의 균주를 인위감염하였을 때 가장 높은 상대생존율을 나타내었다(표 23). 혈청형 Ib와 Ic는 상호 간의 교차 백신 효능 반응이 높은 것(상대생존율: 73.9~82.5%)으로 확인되었으나, Ia와 Ib, Ic와는 비교적 낮은 교차 백신 효능(상대생존율: 0~30.8%)을 나타내었다(표 23).

S. parauberis 4가지 혈청형의 백신접종 후 인위감염에 대한 상대생존율

실험구	상대생존율(%)
실험구	FPa4365감염(Ia)	PR5감염(Ib)	FPa4870감염(Ic)
FPa4365백신(Ia)	55.6	30.8	49.5
PR5백신(Ib)	11.2	82.5	75.1
FPa4870백신(Ic)	0	73.9	75.1
FP2331백신(II)	11.2	70.0	75.1

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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<110> Republic of Korea(National Institute of Fisheries Science) <120> Inactivated Vaccine Against Streptococcal Disease in Fish, Preparing Method Thereof and Administrating Method Thereof <130> P19-B016 <160> 45 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 caggcctaac acatgcaagt c 21 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 acgggcggtg tgtrc 15 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gahgtngtsg aaggsatgca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 atttgrcgsa ywggytcttc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggttcstcng tsgttaatgc 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gttcrtgngt tccsccttca t 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gctaaggtca tgacccattc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> 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Claims

삭제
연쇄구균증에 감염된 넙치에서 분리된 혈청형 II의 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) KCTC 13801BP 균주.
연쇄구균증에 감염된 넙치에서 분리된 혈청형 Ia의 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) KCTC 13802BP 균주.
연쇄구균증에 감염된 넙치에서 분리된 혈청형 Ic의 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) KCTC 13803BP 균주.
불활성화된 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) KCTC 13801BP 균주, KCTC 13802BP 균주 및 KCTC 13803BP 균주로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나를 항원으로 포함하는 연쇄구균증 예방용 불활성화 백신으로, 상기 KCTC 13801BP 균주, KCTC 13802BP 균주 또는 KCTC 13803BP 균주는 각각 혈청형 II, 혈청형 Ia 또는 혈청형 Ic의 균주인 것을 특징으로 하는 연쇄구균증 예방용 불활성화 백신.
제5항에 있어서, 상기 백신의 항원 농도는 0.5 내지 2mg/fish인 것을 특징으로 하는 연쇄구균증 예방용 불활성화 백신.
연쇄구균증에 감염된 넙치로부터 분리된 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) KCTC 13801BP 균주, KCTC 13802BP 균주 및 KCTC 13803BP 균주로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나를 포르말린으로 불활성화시켜 백신을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 연쇄구균증 예방용 불활성화 백신의 제조방법으로, 상기 KCTC 13801BP 균주, KCTC 13802BP 균주 또는 KCTC 13803BP 균주는 각각 혈청형 II, 혈청형 Ia 또는 혈청형 Ic의 균주인 것을 특징으로 하는 연쇄구균증 예방용 불활성화 백신의 제조방법.
제5항의 백신을 어류에 투여하는 것을 포함하는 어류를 면역시키는 방법.
제8항에 있어서, 상기 백신을 어류의 복강에 주사하는 것을 특징으로 하는 어류를 면역시키는 방법.