CN104945489A - 罗非鱼源无乳链球菌重组BP-2b蛋白疫苗的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种罗非鱼源无乳链球菌重组BP-2b蛋白疫苗的制备及应用，属于分子疫苗学领域。本发明提供的罗非鱼源无乳链球菌重组BP-2b蛋白，是具有如序号1所示的氨基酸序列。本发明以来源于罗非鱼的无乳链球菌为研究对象，从来源于罗非鱼的无乳链球菌基因组中克隆到BP-2b基因，与pET28a(+)载体连接构建表达载体，在E.coli BL21(DE3)中进行原核表达和纯化后，经Western blot检测重组蛋白的免疫原性，并制备重组BP-2b蛋白疫苗研究其免疫保护力，获得一种特异性强、具有免疫保护效力为41.93％的重组蛋白疫苗，为罗非鱼无乳链球菌病的免疫防治奠定了基础。

Description

罗非鱼源无乳链球菌重组BP-2b蛋白疫苗的制备及应用

技术领域

本发明涉及分子疫苗学领域，具体的说是一种罗非鱼源无乳链球菌重组BP-2b蛋白疫苗的制备及应用。

背景技术

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)是一种人畜鱼共患革兰氏阳性菌，能引起新生儿脑膜炎、牛乳腺炎和鱼类脑膜脑炎。无乳链球菌能感染多种海、淡水鱼类并引起死亡，给我国乃至世界水产养殖业造成重大经济损失。

无乳链球菌编码许多与其致病性相关的毒力蛋白。这些蛋白在病原体感染宿主过程中起着重要的作用，也能够作为有效的疫苗候选分子(Johri et al.，2006)。目前，关于研究发现无乳链球菌毒力因子主要有以下几类：

穿孔毒素：已知的GBS编码的穿孔毒素有两种，即β-hemolysin/cytolysin和CAMP因子。宿主细胞粘附和入侵相关因子：参与此过程的毒力因子比较多，已知的有纤维蛋白原结合蛋白(Fibrinogen-binding protein A/B，FbsA/B)，层粘连蛋白(Laminin-binding protein，Lmb)，富含丝氨酸重复蛋白(Serine-rich repeatproteins，Srr)，免疫原性细菌粘附素(Immunogenic bacteria adhesin，BibA)和菌毛(Pili)等(Maisey et al.，2008)。免疫逃逸相关分子：这些因子包括唾液酸荚膜多糖(Sialic acid capsular polysaccharide，CPS)、C5a肽酶(C5a peptidase，ScpB)、丝氨酸蛋白酶(Serine proteinase，CspA)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SodA)等。以及其他毒力因子和表面蛋白：比如透明质酸裂解酶(Hyaluronatelyase，HlyB)和蛋氨酸转运调节子(Methionine transport regulator，MtaR)，还有一些附着在细胞表面的酶与细菌感染有关，比如烯醇化酶(Enolase)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)和葡萄糖-6-磷酸异构酶(Glucose phosphate isomerase，GPI)等。这些毒力因子都有作为蛋白疫苗的潜力，并且已有研究证明部分毒力因子作为重组蛋白疫苗具有一定的保护效果。

本试验选用的菌毛Pili，是暴露在细胞表面细长的附属结构，可以促进粘附和定植宿主细胞的，并介导无乳链球菌对抗菌肽AMPs的抗性(Sauer et al.，2000；Maisey et al.，2007)。多菌株基因组比较分析发现无乳链球菌存在3种类型的菌毛岛结构，即Pilus Island 1(PI-1)，Pilus Island 2a(PI-2a)和Pilus Island 2b(PI-2b)，其中PI-1基因位于独立的一个区域，而PI-2a和PI-2b在基因组同一区域的不同位点(Sharma et al.，2013)。菌毛蛋白包括一个主要的骨架蛋白(Backbone protein，BP)，一个主要的附属蛋白AP1和一个次级附属蛋白AP2。缺失BP的菌株毒力下降，且对吞噬作用和AMPs的易感性升高，而其具体机制并不清楚。由于菌毛蛋白可以在小鼠体内产生保护性抗体，因而，菌毛蛋白成为有效的疫苗候选分子(Margarit et al.，2009)。

重组蛋白的表达系统包括原核表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统等，其中原核表达系统因发展完善、流程简洁快速、表达成本低、产量高而成为疫苗制备的首选表达系统。原核表达系统常用菌株有E.coli和Bacillus，其中E.coli是目前发展最完善的蛋白表达系统，常用的菌株有BL21(DE3)、BL21(DE3)Star、B834(DE3)，这些菌株都是经过特定修饰的适合于表达重组蛋白的工程菌。原核表达载体有pCoE1、pUC、pMBI、pSC101、pET等，这些载体经修饰后与目的基因连接后导入原核表达菌株，经过表达条件的优化筛选从而得到完整的原核表达系统。

目前在国内已有一些与链球菌疫苗相关的专利。申请号：200580013779.X，发明名称：无乳链球菌疫苗公布了一种β溶血性无乳链球菌的完整灭活细胞和该菌培养物的浓缩提取物制备的组合疫苗通过注射和浸泡两种方式对罗非鱼抗无乳链球菌的免疫保护效果分别为80％和35％。申请号：200780025577.6，发明名称：抗链球菌的联合疫苗公布了一种联合疫苗，当难辨链球菌和海豚链球菌在疫苗制剂中的比例(基于细胞：细胞)为20∶1或40∶1时，可得到抗难辨链球菌的64％的相对保护率和抗海豚链球菌的71％的相对保护率。申请号：201080047156.5，发明名称：链球菌组合疫苗公布了一种组合疫苗，包含无乳链球菌生物型1血清型Ia细胞和血清型III细胞的组合疫苗提供针对罗非鱼抗无乳链球菌生物型1血清型Ia的88.9％保护率和抗罗非鱼无乳链球菌生物型1血清型III的92％的保护率。申请号：201010207289.6，发明名称：罗非鱼二联链球菌灭活疫苗的制备方法公布了一种罗非鱼无乳链球菌和海豚链球菌等体积混合二联疫苗的制备过程。申请号：201210337267.0，发明名称：一种预防罗非鱼链球菌病的疫苗，该发明公布了一种无乳链球菌全菌灭活疫苗通过浸泡、注射和口服免疫罗非鱼后最高分别能达到60％、90％和75％的免疫保护率。申请号：201410121138.7，申请名称：一种无乳链球菌的口服疫苗及其制备方法。该发明构建一种表达无乳链球菌sip蛋白的重组减毒沙门氏菌，将其拌料投喂罗非鱼后最高可获得63％的抗无乳链球菌免疫保护率。

以上公开使用的无乳链球菌疫苗均是单一或是二联全菌灭活疫苗，制备出的疫苗免疫效力与疫苗菌株的免疫原性直接相关，并且只对血清型一致的无乳链球菌有效，对海豚链球菌没有效果。而本发明希望获得一种有效的重组蛋白疫苗，能够对罗非鱼抗无乳链球菌不同血清型产生特异性的保护性。该重组蛋白疫苗的制备方法简单、制备过程安全，疫苗对罗非鱼抗无乳链球菌的免疫保护率达到41.93％。

发明内容

本发明目的在于提供一种来源于罗非鱼的无乳链球菌BP-2b基因编码的重组BP-2b蛋白的制备及应用，并作为重组蛋白疫苗来防治罗非鱼无乳链球菌病。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种来源于罗非鱼的无乳链球菌BP-2b基因编码的重组BP-2b蛋白，其特征在于：所述的BP-2b重组蛋白的编码基因是从罗非鱼的无乳链球菌中克隆得到的，所述罗非鱼的无乳链球菌重组BP-2b蛋白具有氨基酸序列为序号1。

一种来源于罗非鱼的无乳链球菌BP-2b基因编码的重组BP-2b蛋白，包括以下步骤：

(1)引物设计：

以来源于罗非鱼的无乳链球菌为模板，设计一对包含限制性内切酶的引物BP-2b-F和BP-2b-R，序列如下：

BP-2b-F：5’-CGCGGATCCGCTGAGACAGGGACAAT-3’

BP-2b-R：5’-CCGCTCGAGACCACCTGTTGAAGGCA-3’

上游引物BP-2b-F下划线部分是BamH I酶切位点，下游引物BP-2b-R下划线部分是Xho I酶切位点。

(2)BP-2b基因克隆

提取罗非鱼的无乳链球菌基因组DNA，以基因组DNA为模板进行PCR反应。PCR反应体系为：25μl反应体系含1μl模板DNA，1μl 10×PCR Buffer，1μlPCR反应。PCR反应体系为：25μl反应体系含1μl模板DNA，1μl 10×PCRBuffer，1μl dNTP，0.5μM BP-2b-F，0.5μM BP-2b-R，0.25μl rTaq，加灭菌蒸馏水至25μl。PCR条件为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸2min下作用30个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物回收纯化后与pMD18-T载体连接，16℃下连接12h。连接体系为：10μl体系内含4μl PCR产物，1μl pMD18-T Vector，5μl Solution I。将10μl连接产物转入50μl大肠杆菌TG1感受态细胞，冰浴30min，42℃热激60s，然后加入840μl LB液体培养基，37℃震荡培养2h，取100μl混合液加入含有100μg/ml氨苄青霉素(Amp⁺)的LB固体培养基上，涂布均匀后在37℃培养24小时。随机挑取平板上的10个单菌落进行菌落PCR鉴定，鉴定结果为阳性的单菌落即为BP-2b克隆菌株。

(3)重组质粒pET28-BP-2b的构建

提取BP-2b克隆菌株质粒，将质粒和表达载体pET28a(+)分别用BamH I和Xho I进行双酶切，双酶切体系为：100μl总体积含10μl 10×Buffer，5μl BamH I，5μl Xho I，30μl质粒或pET28a(+)，50μl不含核酸酶的水。37℃水浴12h。将酶切产物胶回收，连接BP-2b基因片段和pET28a(+)，16℃连接12h，连接体系为：10μl连接体系含4μl BP-2b基因片段、1μl pET28a(+)、0.5μl T4DNA连接酶、1μlT4 DNA连接酶缓冲液。将连接产物转入大肠杆菌TG1感受态细胞，经氨苄青霉素抗性筛选，挑取单菌落进行PCR鉴定，筛选出阳性克隆细胞即为含重组质粒pET28-BP-2b的工程菌。

(4)重组质粒pET28-BP-2b在E.coli BL21(DE3)中的表达和纯化：

提取重组质粒pET28-BP-2b，转化E.coli BL21(DE3)表达型感受态细胞，挑取单菌落进行PCR鉴定，筛选出阳性克隆菌株。将含有重组质粒pET28-BP-2b的E.coli BL21(DE3)单菌落接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基mmol/L的IPTG，24℃震荡培养12h。离心收集过夜诱导的菌体，灭菌PBS重悬，再加入终浓度1mg/mL的溶菌酶，冰浴30min后超声破碎15min，离心收集上清。用Ni-NTA纯化上清液中的重组蛋白BP-2b，先用含有20mmol/L咪唑的洗脱液洗去杂质，再用含200mmol/L咪唑的洗脱液洗脱重组蛋白。洗脱的重组蛋白用10ku超滤管超滤，除去洗脱液中的咪唑，得到纯化的重组BP-2b蛋白。所述来源于罗非鱼的无乳链球菌重组BP-2b蛋白具的氨基酸序列为序号1。

(5)Western blot检测

纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，100mA恒流条件下将胶上的蛋白电转至NC膜上，5％脱脂奶粉4℃封闭12h。用TBST洗膜后，依次加入无乳链球菌免疫后罗非鱼血清，鼠抗罗非鱼IgM单克隆抗体和HRP标记的兔抗鼠IgG单克隆抗体进行孵育。反应结束后，将NC膜放入新鲜配制的DAB显色液中，避光显色至条带出现，用ddH₂O中终止显色，

所述罗非鱼源无乳链球菌重组BP-2b蛋白作为抗罗非鱼无乳链球菌病疫苗用于注射免疫，包括以下步骤：

(1)疫苗制备：

将纯化的BP-2b重组蛋白用灭菌PBS稀释至50μg/mL，与弗氏完全或不完全佐剂按1∶1混合均匀制备成亚单位疫苗。取1mL制备好的疫苗，在3000×g下离心5min，疫苗无分层现象，则可用于后续免疫。

(2)免疫程序

初次免疫时，每尾鱼腹腔注射100μL疫苗，使用弗氏完全佐剂亚单位疫苗。两周后，每尾鱼腹腔注射100μL疫苗进行加强免疫，使用弗氏不完全佐剂亚单位疫苗。加强免疫两周后，用LD₅₀剂量进行细菌攻毒实验。

(3)免疫保护率测定

细菌攻毒后记录罗非鱼的死亡情况，若连续7天不死鱼，则停止观察，实验结束。计算罗非鱼的相对保护率＝(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×100％。重组BP-2b蛋白作为抗罗非鱼无乳链球菌病疫苗用于注射免疫可获得41.93％的免疫保护率。

附图说明

图1为来源于罗非鱼的无乳链球菌BP-2b基因PCR扩增产物。

其中，泳道M：DL2000 Marker；泳道1：PCR扩增产物

图2为Western blot检测重组蛋白的免疫原性。

其中，泳道M：预染蛋白Marker；泳道1：纯化的重组BP-2b蛋白

图3为重组BP-2b蛋白疫苗免疫罗非鱼后攻毒的存活曲线

图4为血清抗体滴度。横坐标为初免后第1、2、3、4周的血清。抗体滴度用产生阳性结果的最大稀释倍数表示。

图5为血清抑菌活性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

1、引物设计：

设计一对包含限制性内切酶的引物对，如下所示：

BP-2b-F 5’-CGCGGATCCGCTGAGACAGGGACAAT-3’(下划线为BamHI酶切位点)

BP-2b-R 5，-CCGCTCGAGACCACCTGTTGAAGGCA-3’(下划线为Xho I酶切位点)

引物由上海生工生物工程有限公司完成。

2、BP-2b基因克隆

提取罗非鱼的无乳链球菌基因组DNA，以基因组DNA为模板进行PCR反应。PCR反应体系为：25μl体系含1μl模板DNA，1μl 10×PCR Buffer，1μl dNTP，0.5μM BP-2b-F，0.5μM BP-2b-R，0.25μl rTaq，加灭菌蒸馏水至25μl。PCR反应条件为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸2min下作用30个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增结果如图1所示，PCR产物经回收纯化后与pMD18-T载体连接，16℃下连接过夜。连接体系为：10μl体系内含4μl DNA，1μl pMD18-T Vector，5μl Solution I。将10μl连接产物转入50μl大肠杆菌TG1感受态细胞后在含有100μg/ml氨苄青霉素(Amp⁺)的LB固体培养基上37℃培养24小时后，挑取平板上的单菌落于10μl含Amp⁺的液体LB培养液中，混匀后，吸取1μl菌液为模板，按上述PCR条件进行PCR扩增，并向剩余菌液中加入840μl LB培养液，置于37℃，200rpm振荡培养2小时以备送测。电泳鉴定后，挑取3个以上阳性克隆进行测序。

3、重组质粒pET28-BP-2b的构建

将测序正确的克隆载体和表达载体pET28a(+)分别用BamH I和Xho I进行双酶切，双酶切体系为：100μl总体积含10μl 10×Buffer，5μl BamH I，5μlXho I，30μl质粒或pET28a(+)，50μl不含核酸酶的水。再分别电泳回收BP-2b基因片段以及pET28a(+)线性载体，然后用T4DNA连接酶16℃下过夜连接，连接体系为：10μl体系中含4μl BP-2b基因片段、1μl pET28a(+)线性载体、0.5μl T4 DNA连接酶、1μl T4 DNA连接酶缓冲液。将连接产物转入大肠杆菌TG1感受态细胞，经氨苄青霉素抗性筛选，挑取单菌落进行PCR鉴定，方法同上，将阳性重组质粒pET28-BP-2b送公司测序。

4、重组质粒pET28-BP-2b在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达和纯化：

取测序正确的重组质粒pET28-BP-2b转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑取阳性克隆接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，24℃，200r/min震荡培养至OD₆₀₀约为0.6，取出1mL菌液作为阴性对照，向剩余菌液中加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，24℃震荡培养过夜。离心收集过夜诱导的菌体，灭菌PBS重悬，再加入终浓度1mg/mL的溶菌酶，冰浴30min后超声破碎15min，离心收集上清。用Ni-NTA纯化上清液中的重组BP-2b蛋白，先用含有20mmol/L咪唑的洗脱液洗去杂质，再用含200mmol/L咪唑的洗脱液洗脱重组蛋白。洗脱的重组蛋白用10ku超滤管超滤，除去洗脱液中的咪唑，得到纯化的重组BP-2b蛋白。

5、Western blot检测：

纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，100mA恒流条件下将胶上的蛋白电转至NC膜上，5％脱脂奶粉4℃封闭过夜。用TBST洗膜后，依次加入无乳链球菌免疫后罗非鱼血清，鼠抗罗非鱼IgM单克隆抗体和HRP标记的兔抗鼠IgG单克隆抗体进行孵育。反应结束后，将NC膜放入新鲜配制的DAB显色液中，避光显色至条带出现，用ddH₂O中终止显色，结果如图2所示。

6、免疫保护实验

尼罗罗非鱼购自广东省番禺罗非鱼良种场，规格为(35±5.0)g，实验前暂养两周。随机选取5尾罗非鱼，通过细菌学方法检测该批鱼是否感染细菌。免疫实验时，将罗非鱼随机分为4组，即rBP-2b组、灭活全菌(Inactivated WholeCell，IWC)组、佐剂组和PBS组，每组20尾，每组设三个平行。rBP-2b组和佐剂组分别腹腔注射100μL与弗氏佐剂等体积混合的重组抗原rBP-2b以及PBS，IWC组注射100μL灭活无乳链球菌全菌细胞，PBS组注射100μL的灭菌PBS。灭活全菌细胞的制备方法：将无乳链球菌培养至对数生长期，加入0.5％(V/V)的福尔马林溶液灭活，10000×g离心30min，弃上清，用灭菌PBS重悬菌体，洗去残留的福尔马林溶液，再用PBS调整菌液至终浓度为1×10⁹CFU/mL。对罗非鱼进行两次免疫，初次免疫用弗氏完全佐剂，加强免疫用弗氏不完全佐剂。初免后第1、2、3和4周，每组选3尾鱼采血，室温放置2h后，4℃、10000×g离心10min，收集上清，分装后-80℃保存，用于免疫指标的测定。

初免四周后进行攻毒实验，每尾鱼腹腔注射100μL无乳链球菌菌液(3×10⁹CFU/mL)。攻毒后，每天观察罗非鱼的状况，及时捞出死鱼，并记录14天内的死亡情况。按照下面公式计算试验组的相对保护率(Relative Percent Survival，RPS)：

攻毒后罗非鱼死亡情况如图3所示。初次免疫后第四周，用无乳链球菌进行攻毒。罗非鱼从攻毒后第1天开始就出现死亡，死亡主要集中在攻毒后的前5天。此外，攻毒罗非鱼表现出一些患链球菌病的临床症状，如眼球突出且浑浊，离群独游和身体蜷曲等。以PBS为对照，rBP-2b组、全菌组和佐剂组的相对保护率分别为41.93％，90.23％和9.67％。

7、ELISA检测抗体效价

用ELISA法检测蛋白免疫后收集血清的抗体效价。

包被：用包被液稀释重组BP-2b蛋白至10μg/mL，加入96孔酶标板内，100μL/孔，4℃包被过夜。(2)洗涤：弃去96孔中的包被液，用PBST清洗3次，5min×3次，每次100μL/孔，并用200rpm的速度缓和振荡，拍干。(3)封闭：加入5％封闭液进行封闭，200μL/孔，37℃封闭2h或者4℃过夜。按上述条件进行洗涤，拍干。(4)一抗反应：将采集的抗血清用洗涤液按2倍逐级稀释(如稀释倍数：100、200、400、800和1600)，按100μL/孔加入，每个样品设置三个平行，37℃，孵育1-2h。洗涤，拍干。(5)二抗反应：将鼠抗罗非鱼Ig M用PBST稀释1000倍，按100μL/孔加入，37℃孵育1-2h。洗涤，拍干。(6)三抗反应：将兔抗鼠IgG-HRP标记的抗体用PBST稀释5000倍，按100μL/孔加入，37℃内反应1-2h。洗涤，拍干。(7)显色：将TMB底物溶液按100μL/孔加入，室温孵育。30min后，加入50μL 2M H₂SO₄/孔终止反应。(8)读数：将此96酶标板置于酶标仪上进行读数，测定450nm处的吸光值，即OD₄₅₀。若试验组的读数大于或等于对照组的两倍，则记为阳性，否则为阴性。抗体滴度以阳性结果的最大稀释倍数表示。

结果如图4所示，免疫后血清抗体效价出现不同程度的增长，且在第四周达到峰值，为1∶640。

8、血清抑菌活性

将无乳链球菌培养至对数生长期，5,000×g，离心10min后，用灭菌PBS重悬菌体，定容到1.0×10⁶CFU/mL。取10μL重悬后的细菌悬浮液与50μL采集的抗血清混合，对照组用灭菌PBS代替。将混合液37℃孵育1-2h后，用灭菌的培养基稀释至相应倍数，再涂布到BHI平板上，28℃倒置培养24h。对平板进行菌落计数，记录菌落数。另外，在与细菌孵育前，先将血清热处理以灭活血清中的补体成分，再按上述步骤与无乳链球菌进行孵育，记录菌落数。

试验发现，无乳链球菌与IWC组和rBP-2b组血清孵育后，平板上长出菌落的克隆数分别为17±6.03，158±50.56，而相应的阴性对照组的克隆数为302±24.09(图5)，说明免疫组血清可以杀死无乳链球菌，即免疫后血清具有一定的抑菌活性。

Claims (3)

1.一种来源于罗非鱼的无乳链球菌BP-2b基因编码的重组BP-2b蛋白，其特征在于：所述的BP-2b重组蛋白的编码基因是从罗非鱼的无乳链球菌中克隆得到的，所述罗非鱼的无乳链球菌重组BP-2b蛋白具有氨基酸序列为序号1。

2.一种如权利要求1所述的来源于罗非鱼的无乳链球菌重组BP-2b蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)引物设计：

以来源于罗非鱼的无乳链球菌为模板，设计一对包含限制性内切酶的引物BP-2b-F和BP-2b-R，序列如下：

BP-2b-F：5’CGCGGATCC GCTGAGACAGGGACAAT-3’

BP-2b-R：5’-CCGCTCGAG ACCACCTGTTGAAGGCA-3’

上游引物BP-2b-F下划线部分是BamH I酶切位点，下游引物BP-2b-R下划线部分是Xho I酶切位点。

(2)BP-2b基因克隆

提取来源于罗非鱼的无乳链球菌基因组DNA，以基因组DNA为模板进行PCR反应。PCR反应体系为：25μl反应体系含1μl模板DNA，1μl 10×PCR Buffer，1μl dNTP，0.5μM BP-2b-F，0.5μM BP-2b-R，0.25μl rTaq，加灭菌蒸馏水至25μl。PCR条件为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸2min下作用30个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物回收纯化后与pMD18-T载体连接，16℃下连接12h。连接体系为：10μl体系内含4μl PCR产物，1μl pMD18-T Vector，5μl Solution I。将10μl连接产物转入50μl大肠杆菌TG1感受态细胞，冰浴30min，42℃热激60s，然后加入840μl LB液体培养基，37℃震荡培养2h，取100μl混合液加入含有100μg/ml氨苄青霉素(Amp⁺)的LB固体培养基上，涂布均匀后在37℃培养24小时。随机挑取平板上的10个单 鉴定，鉴定结果为阳性的单菌落即为BP-2b克隆菌株。

(3)重组质粒pET28-BP-2b的构建

提取BP-2b克隆菌株质粒，将质粒和表达载体pET28a(+)分别用BamH I和Xho I进行双酶切，双酶切体系为：100μl总体积含10μl 10×Buffer，5μl BamH I，5μlXho I，30μl质粒或pET28a(+)，50μl不含核酸酶的水。37℃水浴12h。将酶切产物胶回收，连接BP-2b基因片段和pET28a(+)，16℃连接12h，连接体系为：10μl连接体系含4μl BP-2b基因片段、1μl pET28a(+)、0.5μl T4DNA连接酶、1μl T4 DNA连接酶缓冲液。将连接产物转入大肠杆菌TG1感受态细胞，经氨苄青霉素抗性筛选，挑取单菌落进行PCR鉴定，筛选出阳性克隆细胞即为含重组质粒pET28-BP-2b的工程菌。

(4)重组质粒pET28-BP-2b在E.coli BL21(DE3)中的表达和纯化：

提取重组质粒pET28-BP-2b，转化E.coli BL21(DE3)表达型感受态细胞，挑取单菌落进行PCR鉴定，筛选出阳性克隆菌株。将含有重组质粒pET28-BP-2b的E.coli BL21(DE3)单菌落接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，24℃下200r/min震荡培养至OD₆₀₀约为0.6，向菌液中加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，24℃震荡培养12h。离心收集过夜诱导的菌体，灭菌PBS重悬，再加入终浓度1mg/mL的溶菌酶，冰浴30min后超声破碎15min，离心收集上清。用Ni-NTA纯化上清液中的重组BP-2b蛋白，先用含有20mmol/L咪唑的洗脱液洗去杂质，再用含200mmol/L咪唑的洗脱液洗脱重组蛋白。洗脱的重组蛋白用10ku超滤管超滤，除去洗脱液中的咪唑，得到纯化的重组BP-2b蛋白。所述鱼源无乳链球菌重组BP-2b蛋白具的氨基酸序列为序号1。

(5)Western blot检测

纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，100mA恒流条件下将胶上的蛋白电 转至NC膜上，5％脱脂奶粉4℃封闭12h。用TBST洗膜后，依次加入无乳链球菌免疫后罗非鱼血清，鼠抗罗非鱼IgM单克隆抗体和HRP标记的兔抗鼠IgG单克隆抗体进行孵育。反应结束后，将NC膜放入新鲜配制的DAB显色液中，避光显色至条带出现，用ddH₂O中终止显色。

3.如权利要求1或2所述的来源于罗非鱼的无乳链球菌重组BP-2b蛋白的应用，其特征在于：重组BP-2b蛋白作为抗罗非鱼无乳链球菌病疫苗用于注射免疫，包括以下步骤：

(1)疫苗制备：

将纯化的重组BP-2b蛋白用灭菌PBS稀释至50μg/mL，与弗氏完全或不完全佐剂按1∶1混合均匀制备成亚单位疫苗。取1mL制备好的疫苗，在3000×g下离心5min，疫苗无分层现象，则可用于后续免疫。

(2)免疫程序

初次免疫时，每尾鱼腹腔注射100μL疫苗，使用弗氏完全佐剂亚单位疫苗。两周后，每尾鱼腹腔注射100μL疫苗进行加强免疫，使用弗氏不完全佐剂亚单位疫苗。加强免疫两周后，用LD₅₀剂量进行细菌攻毒实验。

(3)免疫保护率测定

细菌攻毒后记录罗非鱼的死亡情况，若连续7天不死鱼，则停止观察，实验结束。计算罗非鱼的相对保护率＝(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×100％。重组BP-2b蛋白作为抗罗非鱼无乳链球菌病疫苗用于注射免疫可获得41.93％的免疫保护率。