CN101368167A - 共表达猪瘟病毒t细胞表位与猪细小病毒vp2蛋白的重组干酪乳杆菌及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌及其制备方法，它涉及一种共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组菌及其制备方法。共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌为重组载体质粒pPG－2－VP2－E290转化的干酪乳杆菌。制备方法：一、PCR扩增VP2－E290基因；二、得到重组载体质粒；三、电转化干酪乳杆菌；四、诱导。本发明共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌可作为多价、多联，同时防治猪细小病毒和猪瘟的口服疫苗。本发明针对病毒经黏膜感染的特点，能有效的刺激黏膜免疫系统产生局部免疫应答，进而引起全身性系统免疫反应的疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及一种共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组菌及其制备方法。
背景技术
猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)属于细小病毒科、细小病毒属的成员，是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一。病毒经口、鼻等黏膜感染是其主要感染途径，可引起怀孕母猪流产、产死胎、木乃伊胎等临床症状。猪瘟(classical swine fever，CSF)则是由猪瘟病毒引起的一种高度接触性、热性传染病，是危害养猪业的主要传染病之一。这两种疾病在世界范围内广泛分布，危害严重，给养猪业带来重大经济损失。
但是多价、多联，可同时防治猪细小病毒和猪瘟的口服疫苗还未见报道。
发明内容
本发明提供了一种共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌及其制备方法，可作为同时防治猪细小病毒和猪瘟的口服疫苗。
本发明共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌为重组载体质粒pPG-2-VP2-E290转化的干酪乳杆菌；其中重组载体质粒pPG-2-VP2-E290基因克隆有VP2-E290基因。
本发明上述共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌按以下步骤制备：一、以质粒pMelBacA-VP2-E29为模板、P1和P2为引物PCR扩增VP2-E290基因；二、对扩增得到的VP2-E290基因进行BamHI和XhoI双酶切，然后克隆到分泌表达型载体pPG-2中，得到重组载体质粒pPG-2-VP2-E290；三、用重组载体质粒pPG-2-VP2-E290电转化干酪乳杆菌；四、重组干酪乳杆菌乳糖诱导，即得到共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌。
本发明共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌可作为多价、多联，同时防治猪细小病毒和猪瘟的口服疫苗。本发明针对病毒经黏膜感染的特点，能有效的刺激黏膜免疫系统产生局部免疫应答，进而引起全身性系统免疫反应的疫苗。
乳酸菌是人和大多数动物肠道内的常见细菌，被公认为安全级(generallyrecognized as safe，GRAS)微生物。乳酸菌具有免疫佐剂、吸附黏膜、抗胆汁酸能力，而本身又具有低免疫原性。因此，本发明选用干酪乳杆菌为活载体作为外源抗原的传递和表达系统，可刺激黏膜免疫系统产生有效的免疫应答。
本发明共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌依靠乳酸菌天然的抗菌、抗腹泻作用、猪瘟病毒T细胞表位E290多肽及猪细小病毒主要免疫保护性抗原VP2蛋白刺激的特异性粘膜免疫作用，达到同时预防猪细小病毒和猪瘟的目的，本发明对猪细小病毒和猪瘟的防治具有重要意义。
本发明共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌pPG-2-VP2-E290/L.casei393属于乳杆菌属(Lactobacillus)，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉大学，保藏日期为2008年09月02日，保藏号为CCTCC M 208125。
附图说明
图1是具体实施方式八中PCR鉴定结果图，图2是具体实施方式八重组蛋白诱导表达SDS-PAGE鉴定的结果图，图3是具体实施方式八重组蛋白诱导表达Western-blot分析的结果图，图4是具体实施方式八目的蛋白分泌性表达SDS-PAGE鉴定的结果图，图5是具体实施方式八目的蛋白分泌性表达Western-blot分析的结果图，图6是具体实施方式八共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌的ELISA检测结果图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌为重组载体质粒pPG-2-VP2-E290转化的干酪乳杆菌；其中重组载体质粒pPG-2-VP2-E290基因克隆有VP2-E290基因。
本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌中可以同时表达猪瘟病毒T细胞优势表位E290多肽和猪细小病毒起主要免疫保护作用的VP2蛋白。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：干酪乳杆菌为L.casei 393。其它与实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌按以下步骤制备：一、以质粒pMelBacA-VP2-E29为模板、P1和P2为引物PCR扩增VP2-E290基因；二、对扩增得到的VP2-E290基因进行BamHI和XhoI双酶切，然后克隆到分泌表达型载体pPG-2中，得到重组载体质粒pPG-2-VP2-E290；三、用重组载体质粒pPG-2-VP2-E290电转化干酪乳杆菌；四、重组干酪乳杆菌乳糖诱导，即得到共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌。
本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均容易购得，若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。本实施方式中的操作步骤参见试剂盒使用操作手册。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三的不同点是：步骤一中引物的基因序列为：
P1：5’-CGATGGGGATCCTATGAAACACAAAGTTCGTAACGAAGTTATGGTTCACTGGTTCGACGACCGCGAG-3’，
P2：5’-AGCTTCTCGAGCCATGCTACCTGATTAACCGAGTAACTG-3’。
其它步骤及参数与实施方式三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式三的不同点是：步骤一中扩增VP2-E290基因的PCR反应体系为50μL：pMelBacA-VP2-E290模板1μL、TaqDNA聚合酶0.5μL、10×PCR Buffer 50μL、浓度为25pmol/μL的引物P1 1μL、浓度为25pmol/μL的引物P2 1μL、dNTP 4μL和去离子水37.5μL；PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性1min、58.3℃退火1min20s、72℃延伸2min、30个循环，72℃延伸10min。其它步骤及参数与实施方式三相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式三的不同点是：步骤三中电转化的干酪乳杆菌为L.casei 393。其它步骤及参数与实施方式三相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式三的不同点是：步骤四重组干酪乳杆菌乳糖诱导按以下步骤进行：A、将重组干酪乳杆菌接种于氯霉素(Cm)浓度为10μg/mL的MRS液体培养基，置于37℃环境中振荡摇床培养过夜；B、按1∶10的体积比将过夜培养液接种于氯霉素(Cm)浓度为10μg/mL、乳糖质量浓度为2％、不含Glucose的MRS液体培养基中，置于37℃的环境中诱导20±2h。其它步骤及参数与实施方式三相同。
具体实施方式八：本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌按以下步骤制备：一、以质粒pMelBacA-VP2-E29为模板、P1和P2为引物PCR扩增VP2-E290基因；二、对扩增得到的VP2-E290基因进行BamHI和XhoI双酶切，然后克隆到分泌表达型载体pPG-2中，得到重组载体质粒pPG-2-VP2-E290；三、用重组载体质粒pPG-2-VP2-E290电转化感受态细胞干酪乳杆菌L.casei 393；四、重组干酪乳杆菌L.casei 393乳糖诱导，即得到共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌L.casei 393；其中步骤一中引物P1的基因序列如SEQ ID NO：1所示，引物P2的基因序列如SEQ ID NO：2所示；步骤一中扩增VP2-E290基因的PCR反应体系为50μL：pMelBacA-VP2-E290模板1μL、Taq DNA聚合酶0.5μL、10×PCR Buffer 50μL、浓度为25pmol/μL的引物P1 1μL、浓度为25pmol/μL的引物P2 1μL、dNTP 4μL和去离子水37.5μL；PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性1min、58.3℃退火1min20s、72℃延伸2min、30个循环，72℃延伸10min；步骤四重组干酪乳杆菌L.casei 393乳糖诱导按以下步骤进行：A、将重组干酪乳杆菌L.casei 393接种于Cm浓度为10μg/mL的MRS液体培养基，置于37℃环境中振荡摇床培养过夜；B、按1∶10的体积比将过夜培养液接种于Cm浓度为10μg/mL、乳糖质量浓度为2％、不含Glucose的MRS液体培养基中，置于37℃的环境中诱导20h。
本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均容易购得，若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。本实施方式中的操作步骤参见试剂盒使用操作手册。
本实施方式步骤二中经BamHI和SalI双酶切的VP2-E290基因片段(约1.8kb)与经BamHI和SalI双酶切的分泌表达型载体pPG-2片段连接；然后通过步骤三电转化感受态细胞干酪乳杆菌L.casei 393进行表达。进行阳性重组质粒单酶切、双酶切和PCR鉴定，鉴定结果如图1所示；图1中“1”泳道标样为DNAMarker 15000，“2”泳道标样为重组载体质粒pPG-2-VP2-E290经BamHI单酶切获得的基因片段(大小约5100bp)，“3”泳道标样为重组载体质粒pPG-2-VP2-E290经XhoI单酶切获得的基因片段(大小约5100bp)，“4”泳道标样为重组载体质粒pPG-2-VP2-E290经BamHI和XhoI双酶切获得的基因片段(大小分别约3300bp和1800bp)，“5”泳道标样为以重组载体质粒pPG-2-VP2-E290为模板、P1和P2为引物PCR扩增获得的基因片段(大小约1800bp)——本实施方式目的基因片段，“6”泳道标样为PCR阴性对照，“7”泳道标样为DNA Marker 2000。序列测定结果分析表明VP2-E290基因已插入到重组载体质粒pPG-2-VP2-E290中。
本实施方式以未经乳糖诱导的重组干酪乳杆菌作为对照，进行重组蛋白诱导表达SDS-PAGE鉴定及Western-blot分析。重组蛋白诱导表达SDS-PAGE鉴定结果如图2所示，图2中“1”泳道标样为标准蛋白分子量(97kD-14kD)，“2”泳道标样为未经乳糖诱导的重组干酪乳杆菌pPG-2-VP2-E290/L.casei 393菌体蛋白，“3”和“4”泳道标样都为本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌L.casei 393菌体蛋白，图2中箭头所示蛋白带约70kD。SDS-PAGE鉴定结果表明本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌L.casei 393有约70kD的蛋白泳带出现，证明目的蛋白获得表达。将本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌L.casei 393菌体裂解物经SDS-PAGE电泳后转印NC膜，再分别与鼠源抗PPV高免血清和羊抗鼠IgG/HRP作用，Western-blot分析结果如图3所示；图3中“1”泳道标样为本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌L.casei 393菌体蛋白，“2”泳道标样为未经乳糖诱导的重组干酪乳杆菌pPG-2-VP2-E290/L.casei 393菌体蛋白。本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌Lcasei 393出现预期大小的免疫反应带(分子量约70KD)，而未经乳糖诱导的重组干酪乳杆菌pPG-2-VP2-E290/L.casei 393未出现预期的反应带，Western-blot分析结果说明目的蛋白获得了有效表达，表达的蛋白能被抗血清所识别。
对本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌L.casei 393目的蛋白分泌性表达的鉴定：
将本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌L.casei 393培养基上清液透析浓缩，透析浓缩物在质量浓度为10％的SDS-PAGE上进行电泳分析，SDS-PAGE分析结果如图4所示；图4中“1”泳道标样为标准蛋白分子量(97kD-14kD)，“2”和“3”泳道标样都为本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌L.casei 393培养基上清液透析浓缩物，“4”和“5”泳道标样都为未经乳糖诱导的重组干酪乳杆菌pPG-2-VP2-E290/L.casei 393培养基上清液透析浓缩物，图4中箭头所示蛋白带约70kD。SDS-PAGE鉴定结果表明本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌L.casei 393有约70kD的蛋白泳带出现，证明目的蛋白获得表达和分泌。将上述SDS-PAGE凝胶电泳中的蛋白转印到硝酸纤维素膜上，再以鼠源抗PPV高免血清作为第一抗体，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG为第二抗体，4-氯-1-萘酚底物显色溶液中显色5min，Western-blot分析结果如图5所示；图5中“1”泳道标样为本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌L.casei 393培养基上清液透析浓缩物，“2”泳道标样为未经乳糖诱导的重组干酪乳杆菌pPG-2-VP2-E290/L.casei 393培养基上清液透析浓缩物。本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌L.casei 393出现分子量约70KD的反应带，而未经乳糖诱导的重组干酪乳杆菌pPG-2-VP2-E290/L.casei 393未出现反应带，Western-blot分析结果证明目的重组蛋白在干酪乳杆菌中获得了有效表达，且所表达的蛋白既存在于菌体中，又可分泌到培养液中，表达的蛋白和天然蛋白一样具有良好的抗原特异性，可被抗血清识别。
间接ELISA方法：
以本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌L.casei 393培养基上清液作为抗原包被ELISA反应板，分别以鼠源抗PPV高免血清和兔抗猪瘟血清为一抗，相应HRP标记的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG为二抗，ELISA检测结果如图6所示；图6中“A”柱形代表兔抗猪瘟血清在490nm的吸光度值，“B”柱形代表兔阴性血清在490nm的吸光度值，“C”柱形代表鼠源抗PPV高免血清在490nm的吸光度值，“D”柱形代表鼠阴性血清在490nm的吸光度值。结果表明，本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌L.casei 393培养基上清液中均检测到了猪瘟病毒T细胞优势表位E290多肽和猪细小病毒起主要免疫保护作用的VP2蛋白的表达。
动物实验证明按约5×108cfu/kg活菌剂量服用(或投喂)本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌的猪对猪细小病毒和猪瘟病毒具有免疫效果。
序列表
<110>东北农业大学
<120>共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌及其制备方法
<160>2
<210>1
<211>67
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR扩增VP2-E290基因用引物P1。
<400>1
<210>2
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR扩增VP2-E290基因用引物P2。
<400>2
Claims (7)
1.共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌，其特征在于共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌为重组载体质粒pPG-2-VP2-E290转化的干酪乳杆菌；其中重组载体质粒pPG-2-VP2-E290基因克隆有VP2-E290基因。
2.根据权利要求1所述的共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌，其特征在于干酪乳杆菌为L.casei 393。
3.如权利要求1所述共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌的制备方法，其特征在于共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌按以下步骤制备：一、以质粒pMelBacA-VP2-E29为模板、P1和P2为引物PCR扩增VP2-E290基因；二、对扩增得到的VP2-E290基因进行BamHI和XhoI双酶切，然后克隆到分泌表达型载体pPG-2中，得到重组载体质粒pPG-2-VP2-E290；三、用重组载体质粒pPG-2-VP2-E290电转化干酪乳杆菌；四、重组干酪乳杆菌乳糖诱导，即得到共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌。
4.根据权利要求3所述的共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌的制备方法，其特征在于步骤一中引物的基因序列为：
P1：5’-CGATGGGGATCCTATGAAACACAAAGTTCGTAACGAAGTTATGGTTCACTGGTTCGACGACCGCGAG-3’，
P2：5’-AGCTTCTCGAGCCATGCTACCTGATTAACCGAGTAACTG-3’。
5.根据权利要求3所述的共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌的制备方法，其特征在于步骤一中扩增VP2-E290基因的PCR反应体系为50μL：pMelBacA-VP2-E290模板1μL、Taq DNA聚合酶0.5μL、10×PCR Buffer50μL、浓度为25pmol/μL的引物P1 1μL、浓度为25pmol/μL的引物P2 1μL、dNTP 4μL和去离子水37.5μL；PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性1min、58.3℃退火1min20s、72℃延伸2min、30个循环，72℃延伸10min。
6.根据权利要求3所述的共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌的制备方法，其特征在于步骤三中电转化的干酪乳杆菌为L.casei 393。
7.根据权利要求3所述的共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌的制备方法，其特征在于步骤四重组干酪乳杆菌乳糖诱导按以下步骤进行：A、将重组干酪乳杆菌接种于Cm浓度为10μg/mL的MRS液体培养基，置于37℃环境中振荡摇床培养过夜；B、按1∶10的体积比将过夜培养液接种于Cm浓度为10μg/mL、乳糖质量浓度为2％、不含Glucose的MRS液体培养基中，置于37℃的环境中诱导20±2h。
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2008
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20090218 |