CN106754984A - 表达猪流行性腹泻病毒s318基因的重组乳酸乳球菌及应用 - Google Patents

表达猪流行性腹泻病毒s318基因的重组乳酸乳球菌及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表达猪流行性腹泻病毒S318基因的重组乳酸乳球菌及应用。其应用乳酸乳球菌MG1363的组成型表达载体pMG36e进行表达，乳酸乳球菌是公认的安全级(GARS)微生物，对动物的生长具有有益的调节作用，乳酸菌组成型表达系统表达目的蛋白不需要诱导剂，在自身生长分裂过程中合成外源目的蛋白，可消除产品中诱导剂带来的毒性及副作用。将猪流行性腹泻新型粘膜免疫疫苗与饲料混合，饲喂妊娠母猪和仔猪一段时间即可预防和控制由猪流行性腹泻病毒引起的猪病毒性腹泻等疾病。

Description

表达猪流行性腹泻病毒S318基因的重组乳酸乳球菌及应用
技术领域
本发明涉及家畜基因工程疫苗领域，具体地指一种表达猪流行性腹泻病毒S318基因的重组乳酸乳球菌及应用。
背景技术
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是一种由冠状病毒科冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种高度接触性肠道传染病，以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征。PED于1971年在英国的养殖场首次出现，随后传遍整个欧洲大陆，以冬季零星暴发为主要特征。猪流行性腹泻病毒使各个年龄阶段的猪频繁发生水样腹泻，尤其是新生仔猪出现高死亡率。包括美洲与亚洲在内的多个国家都检测到PEDV的阳性抗体，并通过体外培养分离到病毒。近几年来，该病在世界范围内广泛流行，以韩国和中国为主的多个亚洲国家暴发了高致死率的PED，造成养猪业巨大的经济亏损。
本病的传染源主要是病猪的排泄物，病毒存在于肠系膜淋巴结和肠绒毛上皮细胞中，随粪便排出体外，排出物能污染水源、饲料、周围环境及交通工具，如果卫生条件不达标，很容易造成病毒传播；利用病原学检测母猪的乳汁，也能检测到PEDV病毒，所以大多自然感染的病例都是经口摄入而染病。各个年龄段的猪都能被感染而发病，哺乳仔猪发病率严重时能高达100％，致死率也能高达100％。冬季从12月至第二年2月为本病高发季节，夏季也可以发生。PEDV与其他冠状病毒相比其传播方式有特异性，急性暴发后更容易持续存在，种猪场暴发该病后可能自然消失，也可能呈区域性流行。
该病对哺乳仔猪的危害最严重，发病后出现呕吐和水样腹泻典型症状；新生仔猪感染后会发生严重脱水而死亡，致死率较高；对于断奶猪和育肥猪的危害不大，会出现持续4～6天的腹泻，大多数病猪都能够自愈，但是生长发育会受到影响，育肥猪后期的体重出现明显下降；母猪感染此病后，会出现精神萎靡、厌食，伴有持续大约一周的下痢。此病的传播常有自限性，有的猪场在4～5周内便可传遍。
PEDV S基因编码的S蛋白是种位于病毒粒子表面的纤突Ⅰ型糖蛋白，由1383个氨基酸(aa)组成，分子量为150-220kDa之间。从N端到C端分成4个主要结构：包含一个信号肽区(1-18aa)，4个中和位点区域(499-638aa、748-755aa、764-771aa和1368-1374aa)，1个跨膜区(1334-1356aa)和1个较短的胞内区(Sato et al.,2011)。根据冠状病毒S蛋白的同源性可以将其分为S1(1-789aa)和S2(790-1383)2个结构域，通过序列比对发现，S2更为保守。S1负责识别和结合特异性受体，因病毒多样性而变化结构域，S2负责融合病毒膜与细胞膜，使得其结构相对单一。S蛋白位于病毒粒子的表面，当位于细胞表面上的受体与病毒粒子结合后，S蛋白就会通过膜融合方式侵入到宿主细胞内并在感染宿主体内介导产生中和抗体。此外，利用病毒在体外进行细胞培养，适应增殖，体内培养使之毒力减弱这一特性，S蛋白成为研制防疫PEDV新型有效疫苗主要的目的蛋白。同时，科学家们还利用S基因的结构来探究PEDV各病毒株之间的遗传关系、流行性病学以及基因突变和病毒遗传进化等多个功能方面的研究。
研究发现自然感染或实验室感染的血清中均可检测到特异性抗体，但sIgA是保护猪不被感染发病的关键因素。Kedam等(1980)和Sprino等(1982)的研究都证实了sIgA抗体产生后会转移到乳腺部位，然后分泌到初乳和常乳内。sIgA含有分泌片，能够避免被肠胃部的酶消化，从而持续存在于肠道中，中和猪流行性腹泻病毒，保护小肠上皮细胞不受损伤，起到保护哺乳仔猪的作用。由于口服疫苗无早期干扰作用，感染PEDV后5天才能诱导主动免疫，所以不能寄希望于给新生仔猪接种疫苗，而是重点放在如何使哺乳仔猪头几天内就可以快速得到保护；因此口服、鼻腔或肌肉注射灭活苗效果均不理想。
动物感染猪流行性病毒(PEDV)后前期主要通过粘膜免疫的途径清除病原体，粘膜免疫是区别于全身免疫的局部免疫，是指动物机体与外界相通的腔道(消化道、呼气道及泌尿生殖道等)粘膜表面的免疫，粘膜不仅是动物机体与外界环境的防御屏障，同时还兼有明显的体液及细胞免疫功能，局部抗原刺激更能有效地激发机体粘膜分泌大量的分泌型免疫球蛋白A(sIgA)，作为粘膜免疫系统或局部免疫系统,特别在呼吸道、消化道、泌尿生殖道及乳腺等粘膜内所发生的免疫活性成份,对机体感染的防御作用越来越引起人们的重视，粘膜免疫系统在抵抗感染方面起着极其重要的作用,粘膜表面与外界抗原直接接触,是机体抗感染的第一道防线，研究粘膜免疫无论在理论上还是在生产实践上均具有重要而深远的意义。
乳酸杆菌是人体和动物体内的益生菌，能够诱导机体产生非特异性及特异性免疫应答，有效地拮抗消化道内的致病菌。科学家利用乳酸杆菌为载体构建可以表达外源基因的质粒，在机体黏膜中增殖(姜艳平等，2010)，达到持续不断表达病原微生物的保护性抗原基因的目的，为多功能黏膜免疫口服疫苗提供了广阔的研究前景。葛俊伟等(2009)将含有PEDV的N基因和中和抗原位点的重组质粒构建到干酪乳杆菌中，使保护性抗原基因表达产物得到有效的表达，口服免疫外源蛋白，刺激小鼠肠道产生局部的黏膜免疫应答反应，从而达到防治PEDV的作用。他们利用PEDV的主要防治途径是黏膜免疫这一特性，初次探究了PEDV乳酸杆菌基因工程疫苗，取得良好的进展。
发明内容
本发明提供了一种表达猪流行性腹泻病毒S318基因的重组乳酸乳球菌及应用。其应用乳酸乳球菌MG1363的组成型表达载体pMG36e进行表达，乳酸乳球菌是公认的安全级(GARS)微生物，对动物的生长具有有益的调节作用，乳酸菌组成型表达系统表达目的蛋白不需要诱导剂，在自身生长分裂过程中合成外源目的蛋白，可消除产品中诱导剂带来的毒性及副作用。
为实现上述目的，本发明提供了一种密码子优化的猪流行性腹泻病毒PEDV的重组衣壳蛋白S318基因，该S318基因表达的蛋白具有COE(499-638aa)、SS2(748-755aa)、SS6(764-771aa)三个抗原中和位点，可有效刺激动物机体产生中和抗体；所述重组衣壳蛋白S318基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。该基因表达蛋白的氨基酸序列SEQ IDNO.1所示。
该重组衣壳蛋白S318基因是以SEQ IDNO.3所示的表达靶基因为参照，然后根据乳酸乳球菌MG1363密码子的偏爱性进行密码子优化处理得到，该靶基因表达的蛋白序列来自于NCBI(ACESSION：AFV59239)公开的猪流行性腹泻病毒(PEDV)的S蛋白序列，由于COE(499-638aa)、SS2(748-755aa)、SS6(764-771aa)三个抗原中和位点位于PEDV S基因的第474-792氨基酸残基内，具体来说中和位点COE位于PEDV S基因的第1497-1914bp，中和位点SS2位于PEDV S基因的2244-2265bp，中和位点SS6位于PEDV S基因的2292-2313bp，故选取PEDV S蛋白的第474-792位氨基酸残基，即PEDV S基因全长的第1422-2376bp基因序列作为目标基因序列并命名为PEDV-S318。
本发明还提供了一种组成型重组表达载体PEDV-S318-pMG36e，所述组成型重组表达载体PEDV-S318-pMG36e是在表达载体pMG36e(载体图谱如图4所示)的Sal Ⅰ酶切位点和Kpn Ⅰ酶切位点间插入衣壳蛋白S318基因构建而成，其中衣壳蛋白S318基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，上述组成型重组表达载体PEDV-S318-pMG36e的制备方法，包括以下步骤：
1)根据密码子优化合成的衣壳蛋白S318基因的核苷酸序列和pMG36e载体多克隆位点(如图5所示)设计一对引物，上游和下游分别为：
PEDV-F：GGGTCGACCATGCAAGTTGCTTTTGAT，
Sal Ⅰ
PEDV-R：GGGGTACCTTAAATTGACATTGAA；
Kpn Ⅰ
其中，上述引物分别含有Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ的限制性内切酶，且在引物PEDV-R的限制性内切酶Kpn Ⅰ结尾加一个终止密码子TAA；
2)扩增含有上述限制性内切酶的衣壳蛋白S318基因片段；
以合成的S318基因作为模板进行Prime-STAR扩增，
Prime-STAR扩增体系：
Prime-STAR扩增反应程序：
预变性：98℃，2min；变性：98℃，10sec；退火：55℃，15sec；延伸：72℃，1min；后延伸：72℃，10min；cycle：30；
纯化含有上述限制性内切酶的衣壳蛋白S318基因片段；
3)上述PCR得到的衣壳蛋白S318基因片段和表达载体pMG36e的双酶切
用Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ两种限制性内切酶分别同时酶切衣壳蛋白S318基因片段和表达载体pMG36e，酶切反应体系如下：
纯化回收得到线性化的衣壳蛋白S318基因片段和线性化的表达载体pMG36e；
4)重组表达载体PEDV-S318-pMG36e
将纯化回收得到线性化的衣壳蛋白S318基因片段和线性化的表达载体pMG36e用T4DNA连接酶连接，得到重组表达载体PEDV-S318-pMG36e。
本发明提供一种表达猪流行性腹泻病毒S318基因的重组乳酸乳球菌PEDV-S318-MG1363，所述重组乳酸乳球菌PEDV-S318-MG1363的基因组中含有上述重组表达载体PEDV-S318-pMG36e。
本发明提供了一种上述表达猪流行性腹泻病毒S318基因的重组乳酸乳球菌PEDV-S318-MG1363的制备方法，包括以下步骤：
1)根据密码子优化合成的衣壳蛋白S318基因的核苷酸序列和pMG36e载体多克隆位点设计一对引物，上游和下游分别为：
PEDV-F：GGGTCGACCATGCAAGTTGCTTTTGAT，
Sal Ⅰ
PEDV-R：GGGGTACCTTAAATTGACATTGAA；
Kpn Ⅰ
其中，上述引物分别含有Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ的限制性内切酶，且在引物PEDV-R的限制性内切酶Kpn Ⅰ结尾加一个终止密码子TAA；
2)扩增含有上述限制性内切酶的衣壳蛋白S318基因片段；
以合成的S318基因作为模板进行Prime-STAR扩增，
Prime-STAR扩增体系：
Prime-STAR扩增反应程序：
预变性：98℃，2min；变性：98℃，10sec；退火：55℃，15sec；延伸：72℃，1min；后延伸：72℃，10min；cycle：30；
纯化含有上述限制性内切酶的衣壳蛋白S318基因片段；
3)上述PCR得到的衣壳蛋白S318基因片段和表达载体pMG36e的双酶切
用Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ两种限制性内切酶分别同时酶切衣壳蛋白S318基因片段和表达载体pMG36e，酶切反应体系如下：
纯化回收得到线性化的衣壳蛋白S318基因片段和线性化的表达载体pMG36e；
4)重组表达载体PEDV-S318-pMG36e
将纯化回收得到线性化的衣壳蛋白S1基因片段和线性化的表达载体pMG36e用T4DNA连接酶连接，得到重组表达载体PEDV-S318-pMG36e。
5)制备重组乳酸乳球菌PEDV-S318-MG1363
使用电转化的方法将重组表达载体PEDV-S318-pMG36e电转至乳酸乳球菌MG1363中，得到重组乳酸乳球菌PEDV-S318-MG1363。
本发明提供了一种表达猪流行性腹泻病毒S318基因的重组乳酸乳球菌PEDV-S318-MG1363制备猪流行性腹泻新型粘膜免疫疫苗的方法，包括以下步骤：
1、将重组乳酸乳球菌PEDV-S318-MG1363活化培养，得到种子菌液，加入终浓度为25％无菌甘油，混合均匀，置于-80℃低温保存，备用；
2)将种子菌液加入灭菌M17培养基中培养，得到一级种子液；
3)再将一级种子液加入灭菌M17培养基中培养，得到二级种子液；
4)将二级种子液置于发酵罐中发酵，得到发酵产物，即为猪流行性腹泻新型粘膜免疫疫苗，将发酵产物冷冻干燥后装袋制成猪流行性腹泻新型粘膜免疫疫苗成品。
猪流行性腹泻新型粘膜免疫疫苗在治疗仔猪病毒性腹泻中的应用。将上述猪流行性腹泻新型粘膜免疫疫苗与饲料混合，饲喂妊娠母猪和仔猪一段时间即可预防和控制由猪流行性腹泻病毒引起的猪病毒性腹泻等疾病。
本发明的有益效果在于：
1、表达的PEDV S318蛋白与微生态制剂乳酸乳球菌MG1363的有机结合，重组菌经消化道进入动物的肠粘膜既可刺激肠道产生足量特异性sIgA保护肠道免受PEDV的入侵，又可发挥微生态制剂的多种肠道益生功能，二者联合可有效预防猪的流行性腹泻等腹泻疾病，共同保障动物肠道健康；
2、猪流行性腹泻新型粘膜免疫疫苗所用的载体pMG36e为一种组成型表达载体，蛋白的表达无需IPTG的诱导，可避免IPTG等诱导剂对动物的毒性作用；
3、猪流行性腹泻新型粘膜免疫疫苗以活菌为主要应用形式，主要与饲料混合饲喂，无需蛋白的纯化工艺，可很大程度上节约成本，也无需注射使用，避免了对动物的应激等不良因素；
4、脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁上特有成分，又称内毒素，可引起动物发热、微循环障碍、休克等不良反应，而乳酸乳球菌MG1363为革兰氏阳性菌，细胞壁没有LPS内毒素，饲喂后不会对动物产生任何不良影响；
5、重组乳酸乳球菌PEDV-S318-MG1363以活菌的形式饲喂妊娠母猪和仔猪，重组活菌耐受胃酸和消化酶后到达猪的肠道后在一定程度上定殖并增殖于肠道粘膜上，不断表达猪流行性腹泻病毒的S318蛋白，激活肠道粘膜免疫系统产生足量的特异性和非特异性sIgA抗体保护肠道健康。
附图说明
图1为筛选S318基因与pMG36e载体连接的阳性克隆子电泳图(引物PEDV-F和PEDV-R，产物约954bp)；
图2为S318基因与pMG36e载体连接的阳性克隆质粒用限制性内切酶Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ分别同时酶切的琼脂糖凝胶电泳图(S318基因为954bp，pMG36e载体约3.6kb)；
图3为MG1363表达S318蛋白的WB图(蛋白大小在37KD左右)；
图4为pMG36e载体图谱；
图5为pMG36e载体的多克隆位点图谱；
图6为PEDV-S318-MG1363重组乳酸菌饲喂昆明鼠后血清IgG抗体水平随饲喂时间变化情况；
图7为PEDV-S318-MG1363重组乳酸菌饲喂昆明鼠后肠道sIgA抗体水平随饲喂时间变化情况。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规实验方案，所述实际，如未特别说明，均为商业化或是已公开的试剂材料。
实施例1
目的基因及引物的合成
1.目的基因的合成
根据NCBI上发表的PEDV S基因序列(ACESSION：AFV59239)取S基因全长的的第1422-2376bp基因序列(见序列表3)，通过MG1363乳酸乳球菌的密码子偏好性表进行密码子优化(见序列表2)
MG1363乳酸乳球菌的密码子偏好性表
Codon Frequency Table Used Lactococcus lactis subsp.Cremoris MG1363
2.引物合成
2.1.基因合成引物
根据密码子优化合成的基因序列(见序列表1)和pMG36e载体多克隆位点设计一对引物，上游和下游分别为：
PEDV-F：GGGTCGACCATGCAAGTTGCTTTTGAT，
Sal Ⅰ
PEDV-R：GGGGTACCTTAAATTGACATTGAA；
Kpn Ⅰ
限制性内切酶分别为Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ，因上游会产生移码现象故在酶切位点后加一个碱基C，并且在Sal Ⅰ酶切位点后加入一个起始密码子ATG，Kpn Ⅰ酶切位点后加一个终止密码子TAA。
2.2转化子鉴定引物
由于合成的S318基因只有954bp，基因片段不长，故依旧用基因合成引物PEDV-F和PEDV-R来鉴定重组载体，该引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列如下：
PEDV-F：GGGTCGACCATGCAAGTTGCTTTTGAT
Sal Ⅰ
PEDV-R：GGGGTACCTTAAATTGACATTGAA
Kpn Ⅰ
2.3测序引物
在pMG36e载体的起始密码子上游设计一个鉴定引物，根据引物设计原则，用Prime5.0软件设计，得到引物序列如下：
cexu001：GGCTTAATAAAGCGGTTACT
实施例2
重组载体PEDV-S318-pMG36e的构建
1.目的基因片段的扩增
按照质粒小量抽提试剂盒说明书对含有合成的S318基因的质粒和pMG36e载体进行快速抽提
用Prime-STAR扩增密码子优化的S318基因序列一共扩增6管，每管50μl，Prime-STAR扩增体系：
Prime-STAR扩增反应程序：
预变性：98℃，2min；变性：98℃，10sec；退火：55℃，15sec；延伸：72℃，1min；后延伸：72℃，10min；cycle：30
扩增完成后加入5.5μl10×loading buffer，用1％的琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带用凝胶回收试剂盒回收目的片段。
2.S318基因和pMG36e载体的双酶切
用Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ两种限制性内切酶分别同时酶切S318基因片段和pMG36e载体，酶切反应体系如下：
混合充分后37℃反应2h，加入5μl 10×loading buffer，1％琼脂糖凝胶电泳分别切下954bp的S318基因和3.6kb的pMG36e载体，用凝胶回收试剂盒回收目的片段。
3.S318基因与pMG36e表达载体的连接
将酶切后纯化回收的S318基因和pMG36e载体用T4DNA连接酶连接(S318基因与pMG36e载体摩尔数比值为10:1左右)。
T4DNA连接酶连接体系：
体系混合均匀，4℃冰箱静置反应16h。
4.连接产物转化至Trans1-Blue感受态细胞中
转化步骤与方法：
4.1-80℃冰箱取出一支Trans1-Blue感受态细胞(100μl装)，置冰上融化(约5min)；
4.2用移液枪取10μl连接产物轻轻加至融化的Trans1-Blue感受态细胞中，冰浴30min；
4.3 42℃水浴热击90sec，迅速放置冰上3min；
4.4加入LB培养基500μl，37℃摇床培养50min；
4.5各取300μl涂2个LA平板(含300μg/ml的红霉素)，37℃避光倒置培养36-48h。
5.转化子的鉴定
5.1PCR菌落鉴定
用引物PEDV-F和PEDV-R这对引物鉴定扩增转化子
PCR鉴定扩增体系如下：
Easy-Taq扩增反应程序：
预变性：95℃，5min；变性：94℃，30sec；退火：55℃，30sec；延伸：72℃，1min；后延伸：72℃，5min；cycle：30
扩增完成加入2μl 10×loading buffer，混合均匀，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定有约954bp的目的条带的疑似阳性菌落见图1所示；
5.2双酶切鉴定
用质粒小量提取试剂盒抽提疑似阳性菌的质粒，用Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ两种限制性内切酶酶切疑似阳性菌质粒，得到大小分别为954bp和3.6kb的DNA条带见图2所示；
5.3将PCR鉴定为阳性的转化子扩大培养后，用质粒小量提取试剂盒抽提质粒，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序引物为cexu001：GGCTTAATAAAGCGGTTACT，测序结果与预期100％匹配，无突变和移码现象。将测序正确的菌株用终浓度为25％的灭菌甘油-80℃保存。
实施例3
重组菌PEDV-S318-MG1363重组菌的构建
1.相关培养基及试剂的配制
SGM17培养基：10mlM17培养基，1562μl50％蔗糖，200μl50％葡萄糖，100μl2mol/LMgCl2，40μl 0.5mol/LCaCl2。
Solution Ⅰ：84mlM17培养基，1ml50％葡萄糖，10ml 10％甘氨酸，5ml ddH2O
Solution Ⅱ：34ml50％蔗糖，10ml甘油，56ml ddH2O
2.MG1363乳酸乳球菌感受态的制备(现制现用)
MG1363乳酸乳球菌感受态的制备步骤如下：
2.1用移液枪取50μl MG1363种子液，加入至灭菌的5ml M17培养基中，30℃静置培养10h；
2.2将培养10h的MG1363种子液以2％的接种量接至灭菌的15ml Solution Ⅰ培养基中，30℃静置培养；
2.3在波长600nm下测定菌液的吸光度，当OD600＝0.8时4℃3000r/m离心10min，弃上清，置冰上；
2.4用灭菌的Solution Ⅱ轻洗沉淀，4℃3000r/m离心10min，弃上清，置冰上；
2.5重复步骤2.4两次；
2.6用200μl的无菌Solution Ⅱ重悬MG1363沉淀，置冰上待后续用。
3.重组载体PEDV-S318-pMG36e电转至乳酸乳球菌MG1363中
用质粒小量提取试剂盒提取PEDV-S318-pMG36e重组质粒
MG1363感受态的电转化步骤：
3.1取浸泡在无水乙醇中的1mm电转杯置超净台中，待电转杯中无水乙醇充分挥发后移至冰上15min；
3.2用移液枪分别取3μl的PEDV-S318-pMG36e重组质粒和pMG36e质粒，加入至制备好的MG1363感受态细胞中，冰浴5min；
3.3用移液枪轻轻吸取混合液于预冷的1mm电转杯中，轻轻在超净台台面敲击电转杯，使混合液均匀进入电转杯底部，冰浴10min；
3.4取2×600μl SGM17灭菌培养基于1.5mlEP管中，冰浴10min；
3.5打开电转仪，设置参数：电压1100V、电容25μF、电阻250Ω，将预冷的电转杯放入，按下Pulse键，待蜂鸣声停止后，迅速加入600μl预冷的SGM17培养基，混合均匀，转移至1.5mlEP管中，30℃温箱静置复苏2h；
3.6用移液枪分别取300μl复苏的乳酸乳球菌细胞涂布含15μg/ml红霉素的M17平板，30℃倒置培养，2-3天后观察电转结果，挑取转化子PCR菌落鉴定得到阳性的PEDV-S318-MG1363重组菌和pMG36e-MG1363空载菌。
实施例4
PEDV-S318-MG1363重组菌的表达及WB鉴定
1.相关试剂的配制
1.1SDS-PAGE分离胶的制备
1.2SDS-PAGE浓缩胶的制备
1.3考马斯亮蓝染色液
称取1.0g考马斯亮蓝R-250，加入50ml冰醋酸、25ml无水乙醇和425mlddH2O，搅拌溶解后过滤；
1.4考马斯亮蓝脱色液
50ml冰醋酸、25ml无水乙醇，用ddH2O定容至500ml；
1.5 1×Tris-Glycine电泳缓冲液(0.5L)
1.51gTris粉末、9.4g甘氨酸、0.5gSDS、ddH2O定容至0.5L；
1.6转膜缓冲液(1L)
3.03gTris粉末、14.4g甘氨酸、200ml甲醇、ddH2O定容至1000ml；
1.7 5×SDS-PAGE loading buffer
ddH2O溶解后定容至5ml，室温保存。
1.8 1.0mol/L Tris-HCl
30.29gTris粉末、200ml ddH2O，溶解后用浓盐酸调节PH至所需点(下表所示)，最后用ddH2O定容至250ml，高压蒸汽灭菌后室温保存；
1.9 0.01mol/LPBS(pH＝7.2-7.4)
19ml 0.2mol/LNaH2PO4、81ml0.2mol/L Na2HPO4、17gNaCl、ddH2O定容至2L；
1.10TBS缓冲液
10ml 1mol/LTris-HCl(pH＝7.5)、8.8gNaCl、ddH2O定容至1L；
1.11TBST缓冲液
1.65ml20％Tween20、700mlTBS；
1.12 1％BSA封闭液
0.1gBSA粉末、10mlTBST缓冲液；溶解后4℃保存；
2.PEDV-S318-MG1363重组菌的表达及Western blot鉴定
以2％接种量分别接种PEDV-S318-MG1363重组菌和pMG36e-MG1363空载菌于100mlM17培养基中，30℃温箱静置培养约12h，12000r/m离心5min，弃上清，用500μl的无菌PBS重悬，取80μl的重悬液，加入20μl的5×SDS-PAGE loading buffer，煮沸5min，迅速置冰上2min，再煮沸5min，如此重复3次，12000r/m离心5min，取25μl上样，以蛋白质标准分子量为参考，在分离胶为10％的SDS-PAGE蛋白胶上进行电泳分析；
组装好蛋白电泳槽，按配方配制好10％的分离胶，各成分加入后迅速混匀，用移液器加入已封闭固定好的胶板中，用500μl甲醇封闭上层，待分离胶凝固后(约40min)用滤纸吸干，按配方配制浓缩胶，混合均匀加入分离胶之上，插上上样梳，静置45min，待浓缩胶完全凝固后拔出梳子，注入1×Tris-Glycine电泳缓冲液，在上样孔中依次加入样品，浓缩胶80V、分离胶120V电泳至溴酚蓝迁移至凝胶底部，停止电泳，卸下胶板，切下合适大小的蛋白胶，用直尺量胶的尺寸，剪下6张同样大小的滤纸和一张同样大小的硝酸纤维膜，打开转膜用的夹子，依次在上面放一张海绵垫、3张取剪好的用转膜液浸润的滤纸、蛋白胶、转膜液浸润的硝酸纤维膜、3张取剪好的用转膜液浸润的滤纸，注意在添加过程中要檊走气泡，最后盖上另外一块海绵垫，两边的滤纸不能接触，不然会产生短路，将夹子放入移液槽中，蛋白胶在负极，硝酸纤维膜在正极，在转膜缓冲液中加入冰袋降温，100V电泳1.5h，预测蛋白37KD左右。
将转好的硝酸纤维膜放入1％BSA封闭液中室温摇床封闭30min；室温摇床孵育用TBST稀释好的一抗2h，TBST洗涤5次，每次6min；孵育二抗1h，TBST洗涤5次，每次6min；显膜观察结果见图3所示，结果表明PEDV-S318-MG1363重组乳酸乳球菌成功表达目的蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
实施例5
PEDV-S318-MG1363重组乳酸菌的小鼠安全性实验及免疫保护力试验
1.实施方案
1.1实验动物
4周龄的雌性昆明鼠，购自湖北省疾病预防控制中心。
1.2实验分组
PBS对照组28只4周龄昆明雌鼠；
pMG36e-MG1363空载菌组28只4周龄昆明雌鼠；
PEDV-S318-MG1363重组菌组28只4周龄昆明雌鼠。
1.3免疫方法自灌胃之日算起，每4天灌胃一次，每只小白鼠灌胃约100μl(107cfu)，分别于第7天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天、第49天每组随机取4只小白鼠眼球放血并颈部脱臼处死，收取小白鼠血清及肠粘膜刮取液，用ELISA分别测特异性IgG和肠道特异性sIgA抗体水平。
1.4血清收集方法将小白鼠用乙醚麻醉后摘取眼球，血液收集于1.5ml的无菌EP管中，37℃恒温箱静置1h，4℃冰箱过夜后3000rpm离心15min，用移液器收集血清于1.5mlEP管中-20℃暂存待后续ELISA抗体检测及血清中和实验。
1.5肠粘膜刮取液收集方法
采血完成后将小白鼠颈部脱臼致死，打开腹腔，剪开小肠，用无菌PBS缓冲液冲洗小肠后刮取0.5g肠道表面粘液于500μl无菌PBS缓冲液，混合均匀于-20℃暂存待后续ELISA抗体检测及肠粘液中和实验。
2.ELISA香港相关试剂配方：
2.1包被液配方25mmol/L的碳酸盐缓冲液(调节pH至9.6)
2.2洗涤液配方含0.05％吐温-20的PBS(pH7.4)
3.ELISA检测的步骤与方法
3.1抗原包被
用PET32a表达载体表达纯化S318蛋白，并测定纯化后的蛋白浓度为1.1mg/ml，采用方阵滴定的方法确定重组蛋白的最佳包被浓度为200ng/100μl，稀释蛋白至2ng/μl，向96孔ELISA板每孔加入100μl蛋白稀释液，37℃包被2h或4℃冰箱包被过夜；
3.2洗涤用排枪向每孔加入200μl的PBST洗涤液，37℃静置5min，然后倒掉洗涤液，重复操作5次；
3.3封闭向每孔中加入100μl含2％BSA或5％脱脂奶粉的PBST缓冲液，37℃封闭2h或4℃封闭过夜；
3.4洗涤操作见步骤3.2；
3.5一抗孵育向酶标板第一列和第七列加入195μl的PBST缓冲液，其余每孔加入100μl的PBST，将采集的不同样品(抗体)加入至第一和第七列，每孔5μl，并以2倍稀释度依次倍比稀释至第6个孔和第12个孔,37℃静置1h；
3.6洗涤操作见步骤3.2；
3.7二抗孵育向每孔中加入100μl用TBST适当比例稀释的HRP标记的二抗(羊抗猪或羊抗鼠)，37℃孵育30min；
3.8洗涤操作见步骤3.2；
3.9显色向每孔中加100μl由底物A和B等体积混合的混合液，室温静置10min后向每孔加入50μl终止液，读取OD630值。
4.特异性抗体的检测
由于PEDV感染后动物机体主要通过粘膜免疫的途径来消除病原体，故本实验主要用ELISA的方法来检测血清中的特异性IgG抗体水平和肠道内的特异性sIgA抗体水平。
4.1抗体的检测结果
4.1.1血清中的特异性IgG抗体检测结果(1:40稀释)
由图6可知小鼠灌服重组乳酸乳球菌后血清中特异中和抗体滴度随着时间逐渐升高，并在第28d达到最高峰，随后逐渐降低并维持在中等水平，有助于中和进入血液中的PEDV病毒。
4.1.2肠道sIgA抗体测定结果(1:10稀释)
由图7可知小鼠灌服重组乳酸乳球菌后肠道特异sIgA抗体滴度随着时间逐渐升高，并在第28d基本保持不变并维持在中高等水平，有助于清除肠道内PEDV病毒。
5.小鼠血清中和PEDV试验
由于PEDV是典型的“粪－口－肠”途径传染，肠道黏膜感染是本病突出的特征，局部黏膜免疫是抵抗病原的第一道防线，也是最重要的免疫途径，并且血清中IgG抗体水平对感染的抵抗力并不相关，因此能否刺激肠道产生足量的特异性sIgA抗体是预防本病的关键。
5.1测PEDV的TCID50
5.1.1将消化好的Vero细胞接96孔板，放37℃5％CO2的恒温培养箱培养至长出单层细胞；
5.1.2在灭菌EP管中用DMEM将PEDV病毒液连续10倍稀释，从10-1至10-10；
5.1.3将稀释好的病毒接种到长有单层Vero细胞的96孔板中，每一稀释度接种一纵排，共8个孔，每孔接种病毒量为100μl，第11纵排和第12纵排接无病毒的DMED对照，放37℃5％CO2的恒温培养箱孵育2h；
5.1.4用移液器小心吸出液体，加入100μl细胞培养液(含2％的血清)，放37℃5％CO2的恒温培养箱培养96h；
5.1.5观察并记录结果，按Reed-Muerch两氏法计算PEDV的TCID50
lgTCID50＝-6.33，TCID50＝10-6.33/0.1ml
5.2细胞中和实验
5.2.1细胞中和实验步骤
5.2.1.1将PEDV原毒稀释成200TCID50/50μl
5.2.1.2将存放于-20℃的肠道粘液置4℃12000r/min离心机离心20min，取上清用0.22μm的滤器过滤后置于无菌EP管中；
5.2.1.3取10个无菌EP管，各管加入90μl无菌PBS，向第一管加入90μl肠道粘液上清，混合均匀后取90μl加入第二管，依次类推至第十管，再向各管加入360μlPBS和450μl稀释好的200TCID50/50μl病毒液，涡旋仪上混匀，37℃恒温箱孵育1.5h；
5.2.1.4取长有单层Vero细胞的96孔细胞培养板，用无菌PBS洗两遍，每管加孵育好的病毒肠粘液混合液一纵排共8孔，每孔100μl，第11纵排加稀释好的病毒液50μl作对照，第12纵排加100μl无菌PBS作对照，放置于37℃5％CO2的恒温培养箱孵育2h；
5.2.1.5取出96孔细胞培养板，用移液器吸出液体，加入配好的DMEM细胞培养液(含2％血清)，放置于37℃5％CO2的恒温培养箱培养96h，观察并记录细胞病变结果；
5.2.2细胞中和实验结果及分析(细胞未病变孔数)
根据中和试验结果，如下表所示，第7d、14d、21d和21d重组菌在肠道粘液稀释到160倍，100％能有效抵抗200TCID50病毒对细胞的攻击，而对照组在稀释160倍时，仅有25％能抵抗病毒对细胞的攻击，由此可以看出饲喂重组乳酸乳球菌后小鼠肠道分泌的特异性sIgA抗体在一定程度上能中和PED病毒。
实施例6
上述重组乳酸乳球菌PEDV-S318-MG1363制备猪流行性腹泻新型粘膜免疫疫苗的方法，包括以下步骤方法：
1、重组乳酸乳球菌PEDV-S318-MG1363构建完成后得到种子菌液放-80℃低温保存；
2、取出15μl种子液加15ml灭菌M17培养基中，放置30℃温箱培养10h，作为发酵的一级种子液；
3、取10ml一级种子液，加入1L无菌M17培养基中，放置30℃温箱培养10h，作为发酵的二级种子液；
4、将二级种子液加入100L发酵罐中发酵约48h，得到发酵产物即为猪流行性腹泻新型粘膜免疫疫苗，将发酵产物冷冻干燥后装袋制成猪流行性腹泻新型粘膜免疫疫苗成品。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
<110>华中农业大学
<120>表达猪流行性腹泻病毒S318基因的重组乳酸乳球菌及应用
<211> 318aa
<212> PRT
<213>衣壳蛋白S318
<400> 1
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<210>2
<211> 957bp
<212>cDNA
<213>重组衣壳蛋白S318基因
<400> 2
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CAATTTCATTTGTTACATTACCATCTTTCAATGATCATTCATTTGTTAATATTACAGTTTCAGCTTCATTTGG
AGGACATTCAGGCGCTAACCTAATTTCATCAGATACAACAATTAACGGGTTTTCATCATTTTGTGTTGATACA
CGTCAATTCACAATTTCATTATTTTATAATGTTACAAATTCATACGGATATGTTTCAAAATCACAAGATTCAA
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<210>3
<211> 954bp
<212>cDNA
<213>衣壳蛋白S318基因
<400> 3
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TAGTGCCTGTACCATAGATCTTTTTGGTCACCCTGCGTTTGGTAGTGATGTTAAGTTTACGTCCCTTTACTTT
CAATTCACAAAGGGTGAGTTGATTACTGGCACGCCTAAACCACTTGAAGGTGTCACGGACGTTTCTTCAATGA
CTCTGGATGTGTGTACCAAGTATACTATCTATGGCTTTAAAGGTGAGGGTATCATTACCCTTACAAATTCTAG
CTTTTTGGCAGGTGTTTATTACACATCTGATTCTGGACAGTTGTTAGCCTTTAAGAATGTCACTAGTGGTGCT
GTTTATTCTGTTACGCCATGTTCTTTTTCAGAGCAGGCTGCATATGTTGATGATGATATAGTGGGTGTTATTT
CTAGTTTGTCTAGCTCCACTTTTAACAGTACTAGGGAGTTGCCTGGTTTCTTCTACCATTCTAATGATGGCTC
TAATTGCACAGAGCCTGTGTTGGTGTATAGTAACATAGGTGTTTGTAAATCTGGCAGTATTGGCTACGTCCCA
TCTCAGTCTGGCCAAGTCAAGATTGCACCCACGGTTACTGGGAATATCAGTATTCCCACCAACTTTAGTATGA
GTATT

Claims (7)

1.一种密码子优化的猪流行性腹泻病毒PEDV的重组衣壳蛋白S318基因，其特征在于：所述重组衣壳蛋白S318基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
2.组成型重组表达载体PEDV-S318-pMG36e，其特征在于：所述组成型重组表达载体PEDV-S318-pMG36e是在表达载体pMG36e的Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ引物间插入衣壳蛋白S318基因构建而成，其中，重组衣壳蛋白S318基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
3.一种权利要求2所述组成型重组表达载体PEDV-S318-pMG36e的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)根据密码子优化合成的衣壳蛋白S318基因的核苷酸序列和pMG36e载体多克隆位点设计一对引物，上游和下游分别为：
PEDV-R：GGGTCGACCATGCAAGTTGCTTTTGAT，
Sal Ⅰ
PEDV-F：GGGGTACCTTAAATTGACATTGAA；
Kpn Ⅰ
其中，上述引物分别含有Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ的限制性内切酶，且在引物PEDV-F的限制性内切酶Kpn Ⅰ结尾加一个终止密码子TAA；
2)扩增含有上述限制性内切酶的衣壳蛋白S318基因片段；
以合成的基因作为模板进行Prime-STAR扩增，
Prime-STAR扩增体系：
预变性：98℃，2min；变性：98℃，10sec；退火：55℃，15sec；延伸：72℃，1min；后延伸：72℃，10min；cycle：30；
纯化的含有上述限制性内切酶的衣壳蛋白S318基因片段；
3)上述PCR得到的衣壳蛋白S318基因片段和表达载体pMG36e的双酶切
用Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ两种限制性内切酶分别同时酶切衣壳蛋白S318基因片段和表达载体pMG36e，酶切反应体系如下：
纯化回收得到线性化的衣壳蛋白S318基因片段和线性化的表达载体pMG36e；
4)重组表达载体PEDV-S318-pMG36e
将纯化回收得到线性化的衣壳蛋白S318基因片段和线性化的表达载体pMG36e用T4 DNA连接酶连接，得到重组表达载体PEDV-S318-pMG36e。
4.一种表达猪流行性腹泻病毒S318基因的重组乳酸乳球菌PEDV-S318-MG1363，其特征在于：所述重组乳酸乳球菌PEDV-S1-MG1363中含有权利要求2所述重组表达载体PEDV-S318-pMG36e。
5.一种权利要求4所述表达猪流行性腹泻病毒S318基因的重组乳酸乳球菌PEDV-S318-MG1363的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)根据密码子优化合成的衣壳蛋白S318基因的核苷酸序列和pMG36e载体多克隆位点设计一对引物，上游和下游分别为：
PEDV-R：GGGTCGACCATGCAAGTTGCTTTTGAT，
Sal Ⅰ
PEDV-F：GGGGTACCTTAAATTGACATTGAA
Kpn Ⅰ
其中，上述引物分别含有Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ的限制性内切酶，且在引物PEDV-R的限制性内切酶Kpn Ⅰ结尾加一个终止密码子TAA；
2)扩增含有上述限制性内切酶的衣壳蛋白S318基因片段；
以合成的S318基因作为模板进行Prime-STAR扩增，
Prime-STAR扩增体系：
Prime-STAR扩增反应程序：
预变性：98℃，2min；变性：98℃，10sec；退火：55℃，15sec；延伸：72℃，1min；后延伸：72℃，10min；cycle：30；
纯化的含有上述限制性内切酶的衣壳蛋白S318基因片段；
3)上述PCR得到的衣壳蛋白S318基因片段和表达载体pMG36e的双酶切
用SalⅠ和KpnⅠ两种限制性内切酶分别同时酶切衣壳蛋白S318基因片段和表达载体pMG36e，酶切反应体系如下：
纯化回收得到线性化的衣壳蛋白S318基因片段和线性化的表达载体pMG36e；
4)重组表达载体PEDV-S318-pMG36e
将纯化回收得到线性化的衣壳蛋白S318基因片段和线性化的表达载体pMG36e用T4DNA连接酶连接，得到重组表达载体PEDV-S318-pMG36e
5)制备重组乳酸乳球菌PEDV-S318-MG1363
使用电转化的方法将重组表达载体PEDV-S318-pMG36e电转至乳酸乳球菌MG1363中，得到重组乳酸乳球菌PEDV-S318-MG1363。
6.表达猪流行性腹泻病毒S318基因的重组乳酸乳球菌PEDV-S318-MG1363制备猪流行性腹泻新型粘膜免疫疫苗的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1、将重组乳酸乳球菌PEDV-S318-MG1363活化培养，得到种子菌液，加入终浓度为25％甘油，混合均匀，置于-80℃低温保存，备用；
2)将种子菌液加入灭菌M17培养基中培养，得到一级种子液；
3)再将一级种子液加入灭菌M17培养基中培养，得到二级种子液；
4)将二级种子液置于发酵罐中发酵，得到发酵产物，即为猪流行性腹泻新型粘膜免疫疫苗，将发酵产物冷冻干燥后装袋制成猪流行性腹泻新型粘膜免疫疫苗成品。
7.基于权利要求6制备猪流行性腹泻新型粘膜免疫疫苗在预防和控制仔猪病毒性腹泻中应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108743624A (zh) * 2018-06-19 2018-11-06 华中农业大学 植物乳杆菌zn-3在制备治疗或预防猪流行性腹泻病毒感染的药物中的应用
CN114854783A (zh) * 2022-05-19 2022-08-05 吉林农业科技学院 一种表达pedv流行毒株s1基因重组乳酸乳球菌及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104120142A (zh) * 2014-06-30 2014-10-29 华南农业大学 一种分泌表达pedv核心抗原coe蛋白重组乳酸乳球菌及其制备方法和应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104120142A (zh) * 2014-06-30 2014-10-29 华南农业大学 一种分泌表达pedv核心抗原coe蛋白重组乳酸乳球菌及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WANG,C.Q.: "JX501317.1", 《GENBANK》 *
王树坤等: "猪流行性腹泻病毒S基因片段的克隆及原核表达", 《生物技术进展》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108743624A (zh) * 2018-06-19 2018-11-06 华中农业大学 植物乳杆菌zn-3在制备治疗或预防猪流行性腹泻病毒感染的药物中的应用
CN114854783A (zh) * 2022-05-19 2022-08-05 吉林农业科技学院 一种表达pedv流行毒株s1基因重组乳酸乳球菌及其制备方法和应用

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