CN107446872A - 一种组成型表达兔病毒性出血症病毒vp60蛋白的重组乳酸菌疫苗株及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种组成型表达兔病毒性出血症病毒VP60蛋白的重组乳酸菌疫苗株及其制备方法和用途。所述的重组乳酸菌疫苗株含有EGFP标记的组成型表达兔病毒性出血症病毒VP60蛋白的乳酸菌表达质粒。本发明利用乳酸菌为疫苗抗原传递载体，以兔病毒性出血症病毒VP60蛋白为免疫原制备重组乳酸菌口服疫苗诱导动物机体产生免疫应答，能够有效地刺激机体产生局部黏膜免疫应答，又能刺激机体的体液免疫应答，以达到预防兔病毒性出血症病毒的感染的目的。此外，本发明以增强型绿色荧光蛋白EGFP作为筛选标记，构建非抗生素抗性筛选标记的基因工程乳酸菌，符合绿色、环保的发展理念。

Description

一种组成型表达兔病毒性出血症病毒VP60蛋白的重组乳酸菌 疫苗株及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种重组乳酸菌疫苗株及其制备方法和用途，特别涉及一种EGFP 标记的，能够组成型表达兔病毒性出血症病毒VP60蛋白的重组乳酸菌疫苗株及其制备方法和用途，本发明属于医药技术领域。
背景技术
兔病毒性出血症(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔病毒性出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起兔的一种以全身实质脏器水肿、淤血及出血性变化等为主要临床特征的急性、高度传染性、高度致死性传染病，是危害世界各国养兔行业发展最主要的传染病之一。目前对RHD的防控主要以疫苗接种免疫为主，所使用的疫苗主要为组织灭活疫苗。
体外繁殖RHDV较困难，尚未建立敏感的传代细胞系，因而使用的疫苗制品主要为RHDV感染组织的组织灭活苗，即添加甲醛等灭活剂将人工感染的实验兔肝脏制成的匀浆灭活进而制成灭活苗，采取皮下或肌肉注射的方式接种，对防控RHD 起到了积极作用。但是，由于非免疫兔数量的不断减少以及养殖实验兔成本的不断增加，导致RHDV组织灭活苗的价格也在不断上涨，同时由于组织灭活苗的使用存在生物安全隐患、污染物残留等问题，而且不符合动物福利的要求，迫使人们开始着眼于研制其他新型疫苗来替代组织灭活疫苗。RHDV衣壳蛋白VP60是RHDV唯一的结构蛋白，是诱导宿主免疫应答和抗病毒感染的主要免疫抗原。目前，多种不同的表达系统被用于表达VP60蛋白，包括细菌、酵母、植物、昆虫细胞和重组杆状病毒等，利用这些表达系统表达的VP60蛋白都能够刺激机体产生特异性抗体抵抗RHDV的感染。然而，这些表达系统存在目的蛋白表达量低、生产成本高或者转基因产品释放到环境中存在生物安全隐患等不足，这些问题成为该类制品批量生产及推广应用的瓶颈。
基于兔病毒性出血症病毒消化道和呼吸道感染致病的特点，研制口服疫苗制剂对预防兔病毒性出血症具有重要实践意义。乳酸菌是一类益生菌，具有固有免疫佐剂效应、黏膜粘附特性、动物肠道良好的定殖能力以及增强机体非特异性免疫等生物学特性，益生性良好，在传递疫苗抗原有效诱导机体免疫应答，特别是生物安全方面，具有显著的优势，顺应了当前养殖业注重绿色、安全和环保的发展理念，是其他类疫苗载体系统所不及的。
本发明以EGFP为筛选标记，利用干酪乳酸杆菌作为疫苗抗原的传递载体，成功构建了组成型表达RHDV-VP60蛋白的转基因乳酸菌口服疫苗，通过口服免疫可有效预防兔病毒性出血症病毒感染。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够稳定表达RHDV-VP60蛋白的重组乳酸菌疫苗株及其构建方法和应用。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种组成型表达兔病毒性出血症病毒VP60蛋白的重组乳酸菌疫苗株，所述重组乳酸菌疫苗株内含有EGFP标记的组成型表达兔病毒性出血症病毒 VP60蛋白的乳酸菌表达质粒。
其中，优选的，所述的重组乳酸菌为重组干酪乳杆菌L.casei 393。
其中，优选的，编码所述的兔病毒性出血症病毒VP60蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
其中，优选的，所述的EGFP标记的组成型表达兔病毒性出血症病毒VP60蛋白的乳酸菌表达质粒通过电转化方法转入乳酸菌的感受态细胞中。
其中，优选的，所述的EGFP标记的组成型表达兔病毒性出血症病毒VP60蛋白的乳酸菌表达质粒是通过以下方法制备得到：
(1)质粒pMD19-VP60的构建
将扩增得到的兔病毒性出血症病毒VP60的PCR产物插入pMD19-T simple载体中的SacI和ApaI酶切位点之间，得到质粒pMD19-VP60；
(2)乳酸菌组成型表达质粒pPG-T7g10-PPT的构建
在质粒pPG612的基础上进行改造，利用XbaI和XhoI对质粒pPG612进行双酶切，酶切后的载体片段与HCE-T7g10-PgsA anchor-MCS-rrnBT1T2序列连接，构建了乳酸菌组成型表达质粒，命名为pPG-T7g10-PPT，其中HCE为芽孢杆菌组成型分泌表达启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；T7g10为翻译增强子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，PgsAanchor的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；MCS为多克隆酶切位点，至少包括Sac I和Apa I限制性内切酶酶切位点； rrnBT1T2为大肠杆菌转录终止子序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；
(3)重组质粒pPG-T7g10-VP60的构建
利用限制性核酸内切酶Sac I和Apa I分别对质粒pMD19-VP60和乳酸菌组成型表达质粒pPG-T7g10-PPT进行双酶切处理，经DNA胶回收试剂盒纯化目的片段，将回收纯化的VP60基因片段与表达载体pPG-T7g10-PPT连接，得到重组质粒 pPG-T7g10-VP60；
(4)重组质粒pPG-T7g10-EGFP-VP60的构建
将编码EGFP基因连入质粒pPG-T7g10-VP60中VP60基因上游，构建融合表达EGFP和VP60的重组质粒，命名为pPG-T7g10-EGFP-VP60，然后，通过酶切方法将重组质粒pPG-T7g10-EGFP-VP60中的氯霉素抗性筛选基因切除，平端化自连后，获得EGFP标记的组成型表达兔病毒性出血症病毒VP60蛋白的乳酸菌表达质粒，命名为重组质粒pPG-T7g10-EGFP-VP60。
进一步的，本发明还提出了一种构建所述的重组乳酸菌疫苗株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)质粒pMD19-VP60的构建
将扩增得到的兔病毒性出血症病毒VP60的PCR产物插入pMD19-T simple载体中的SacI和ApaI酶切位点之间，得到质粒pMD19-VP60；
(2)乳酸菌组成型表达质粒pPG-T7g10-PPT的构建
在质粒pPG612的基础上进行改造，利用XbaI和XhoI对质粒pPG612进行双酶切，酶切后的载体片段与HCE-T7g10-PgsA anchor-MCS-rrnBT1T2序列连接，构建了乳酸菌组成型表达质粒，命名为pPG-T7g10-PPT，其中HCE为芽孢杆菌组成型分泌表达启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；T7g10为翻译增强子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，PgsAanchor的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；MCS为多克隆酶切位点，至少包括Sac I和Apa I限制性内切酶酶切位点； rrnBT1T2为大肠杆菌转录终止子序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；
(3)重组质粒pPG-T7g10-VP60的构建
利用限制性核酸内切酶Sac I和Apa I分别对质粒pMD19-VP60和乳酸菌组成型表达质粒pPG-T7g10-PPT进行双酶切处理，经DNA胶回收试剂盒纯化目的片段，将回收纯化的VP60基因片段与表达载体pPG-T7g10-PPT连接，得到重组质粒 pPG-T7g10-VP60；
(4)重组质粒pPG-T7g10-EGFP-VP60的构建
将编码EGFP基因连入质粒pPG-T7g10-VP60中VP60基因上游，构建融合表达EGFP和VP60的重组质粒，命名为pPG-T7g10-EGFP-VP60，然后，通过酶切方法将重组质粒pPG-T7g10-EGFP-VP60中的氯霉素抗性筛选基因切除，平端化自连后，获得EGFP标记的组成型表达兔病毒性出血症病毒VP60蛋白的乳酸菌表达质粒，命名为重组质粒pPG-T7g10-EGFP-VP60；
(5)电转化
将步骤(4)构建得到的重组质粒pPG-T7g10-EGFP-VP60电转入乳酸菌感受态细胞中，通过流式细胞术筛选带有EGFP荧光标记的重组菌，从而获得以EGFP为筛选标记的，组成型表达兔病毒性出血症病毒VP60蛋白的重组乳酸菌，命名为 pPG-T7g10-EGFP-VP60/L.casei 393’。
其中，优选的，所述的乳酸菌为干酪乳杆菌L.casei 393。
其中，优选的，编码所述的兔病毒性出血症病毒VP60蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
更进一步的，本发明还提出了所述的重组乳酸菌疫苗株在制备预防和治疗兔病毒性出血症药物中的用途。
再进一步的，本发明还提出了一种兔病毒性出血症口服疫苗，含有本发明所述的重组乳酸菌疫苗株。
本发明利用益生菌乳酸菌为疫苗抗原传递载体，以兔病毒性出血症病毒VP60 蛋白为免疫原制备重组乳酸菌口服疫苗诱导动物机体产生免疫应答，即能够有效地刺激机体产生局部黏膜免疫应答，又能刺激机体的体液免疫应答，以达到预防兔病毒性出血症病毒的感染的目的。此外，目前使用的乳酸菌表达载体系统都携带有抗生素抗性筛选标记如红霉素、氯霉素，以保持选择压力，有助于基因工程重组乳酸菌的构建。但随着这类重组菌株在实践中的应用，由于抗性因子的转移，将会造成生物安全隐患，不符合生物安全要求。基于此，本发明以增强型绿色荧光蛋白EGFP 作为筛选标记，构建非抗生素抗性筛选标记的基因工程乳酸菌，符合绿色、环保的发展理念。
附图说明
图1为乳酸菌组成型表达质粒pPG-T7g10-PPT的载体图谱；
图2为重组质粒pPG-T7g10-VP60双酶切鉴定结果；
1-8：SacI和ApaI双酶切质粒pPG-T7g10-VP60结果；M：DNA Marker 8000
图3为重组质粒pPG-T7g10-EGFP-VP60酶切鉴定结果；
1：SacI和ApaI双酶切结果；2：SacI和KpnI双酶切结果；3：KpnI和ApaI双酶切结果；M：DNA Marker 8000；
图4为无氯霉素抗性重组乳酸菌的鉴定结果；
1：pPG-T7g10-PPT/L.casei 393；2：pPG-T7g10-EGFP-VP60/L.casei393；3： pPG-T7g10-EGFP-VP60/L.casei393’；
图5为EGFP表达的Western blot鉴定结果；
M：预染蛋白Marker；1-2：重组菌pPG-T7g10-EGFP-VP60/L.casei 393’；3： pPG-T7g10-PPT/L.casei 393菌体沉淀；4：L.casei 393；
图6为EGFP表达的荧光显微镜检测结果；
a：荧光下的pPG-T7g10-PPT/L.casei 393；b：白光下的重组菌pPG-T7g10-EGFP-VP60/L.casei 393’；c：荧光下的重组菌 pPG-T7g10-EGFP-VP60/L.casei 393’
图7为VP60表达的Western blot鉴定结果；
M：预染蛋白Marker；1：L.casei 393；2：pPG-T7g10-PPT/L.casei 393；3-4：重组菌pPG-T7g10-EGFP-VP60/L.casei 393’
图8为间接免疫荧光检测VP60表达结果；
a：荧光下的pPG-T7g10-PPT/L.casei 393；b：白光下的重组菌 pPG-T7g10-EGFP-VP60/L.casei 393；c：荧光下的重组菌 pPG-T7g10-EGFP-VP60/L.casei 393’
图9为免疫兔粪便中sIgA抗体水平检测结果；
图10为免疫兔泪液中sIgA抗体水平检测结果；
图11为免疫组兔阴道黏液中sIgA抗体水平检测结果；
图12为免疫兔鼻腔洗液中sIgA抗体水平检测结果；
图13为免疫兔血清中抗RHDV-VP60特异性IgG水平。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。应当理解的是，以下所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
实施例1表达RHDV-VP60重组乳酸菌的构建
1、质粒pMD19-VP60的构建
利用病毒基因组RNA商品化试剂盒提取兔病毒性出血症病料总RNA，经反转录试剂盒合成cDNA，通过PCR方法扩增兔病毒性出血症病毒VP60基因(上游引物为GAGCTCATGGAGGGCAAAACCCGCACAGCGC，含SacI酶切位点；下游引物为GGGCCCTCAGACATAAGAAAAGCCATTGGCT，含ApaI酶切位点)。PCR反应体系(50μL)：10×ETaqPCR Buffer 5μL、ETaq酶0.5μL、cDNA模板5μL、引物对2μL、 dNTP 4μL、去离子水33.5μL。PCR反应条件为：95℃5min；94℃30 sec、55℃30sec、72℃1min，30个循环；72℃10min。将目的基因VP60的PCR 产物经胶回收后，测序正确，与pMD19-T simple载体连接，转化大肠杆菌TG1感受态细胞，经PCR鉴定阳性克隆，重组质粒命名为pMD19-VP60，其中VP60的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
(2)乳酸菌组成型表达质粒pPG-T7g10-PPT的构建
在质粒pPG612的基础上进行改造，利用XbaI和XhoI对质粒pPG612进行双酶切，将胶回收后获得的载体片段与HCE-T7g10-PgsA anchor-MCS-rrnBT1T2序列连接，构建了组成型分泌表达乳酸菌载体pPG-T7g10-PPT，其中芽孢杆菌 Geobacillus toebii组成型分泌表达启动子HCE的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示， T7g10翻译增强子的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，PgsA anchor的核苷酸序列如 SEQ ID NO.4所示，大肠杆菌rrnBT1T2转录终止子序列如SEQ ID NO.5所示。载体图谱如图1所示。
具体构建方法可参考文献(组成型乳酸菌表达载体的构建及表达效果的比较，鞠珑株，东北农业大学硕士学位论文)方法进行。该载体pPG-T7g10-PPT已记载在文献(融合表达TGEV 6Ds与PEDV ps420非抗性标记重组干酪乳杆菌表达系统，王玉赛，东北农业大学硕士学位论文)中，由东北农业大学保存并提供。
(3)重组质粒pPG-T7g10-VP60的构建
利用限制性核酸内切酶Sac I和Apa I分别对质粒pMD19-VP60和乳酸菌组成型表达质粒pPG-T7g10-PPT进行双酶切处理，经DNA胶回收试剂盒纯化目的片段。将回收纯化的VP60基因片段与表达载体pPG-T7g10-PPT连接，得到重组质粒 pPG-T7g10-VP60。
(4)重组乳酸菌pPG-T7g10-VP60/L.casei 393’的构建
制备干酪乳杆菌L.casei 393感受态细胞，经电转化技术将重组质粒 pPG-T7g10-VP60转入干酪乳杆菌L.casei 393感受态细胞，在含有氯霉素抗性的选择培养基平板中筛选阳性重组乳酸菌转化子，将鉴定正确的阳性重组菌命名为 pPG-T7g10-VP60/L.casei393。阳性重组质粒pPG-T7g10-VP60的酶切鉴定结果见图 2。
(5)重组乳酸菌pPG-T7g10-EGFP-VP60/L.casei 393’的构建
在pPG-T7g10-VP60(含氯霉素抗性)基础上，利用增强型绿色荧光蛋白EGFP 作为筛选标记，对重组质粒pPG-T7g10-VP60进行去除抗性基因改造。具体操作如下：将编码EGFP基因连入质粒pPG-T7g10-VP60中VP60基因上游，构建融合表达EGFP和VP60的重组质粒pPG-T7g10-EGFP-VP60，电转入干酪乳杆菌L.casei 393 感受态细胞，获得了阳性重组菌pPG-T7g10-EGFP-VP60/L.casei 393(重组质粒的酶切鉴定结果见图3)；然后，通过酶切方法将重组质粒pPG-T7g10-EGFP-VP60中的氯霉素抗性筛选基因切除，平端化自连后，电转入干酪乳杆菌L.casei 393感受态细胞，通过流式细胞术筛选带有EGFP荧光标记的重组菌，从而获得以绿色荧光蛋白 EGFP为筛选标记的重组乳酸菌pPG-T7g10-EGFP-VP60/L.casei 393’(无氯霉素抗性重组乳酸菌的鉴定结果见图4所示)。
实施例2目的蛋白的表达与鉴定
2.1Western blot鉴定EGFP的表达
过夜培养实施例1制备得到的重组乳酸菌pPG-T7g10-EGFP-VP60/L.casei 393’，12000rpm离心收集菌体并裂解，菌体蛋白经SDS-PAGE和PVDF膜转印后，先后与鼠源抗EGFP单抗和HRP标记羊抗鼠IgG作用，结果显示在表达蛋白的预期位置出现特异性免疫印迹(图5：泳道1-2)，对照组未出现(图5：泳道3-4)。
2.2荧光显微镜鉴定EGFP的表达
过夜培养实施例1制备得到的重组乳酸菌pPG-T7g10-EGFP-VP60/L.casei 393’，12000rpm离心收集菌体，用无菌PBS洗涤菌体三次，将菌体涂布于载玻片上，用丙酮固定后，置于荧光显微镜下观察，结果见图6所示，对照组乳酸菌 pPG-T7g10-PPT/L.casei 393菌体未见绿色荧光，重组乳酸菌 pPG-T7g10-EGFP-VP60/L.casei 393’菌体可见明显的绿色荧光，表明EGFP在重组菌中获得了表达。
2.3Western blot鉴定VP60的表达
过夜培养实施例1制备得到的重组乳酸菌pPG-T7g10-EGFP-VP60/L.casei 393’，12000rpm离心收集菌体并裂解，菌体蛋白经SDS-PAGE和PVDF膜转印后，分别与兔抗RHDV高免血清和HRP标记山羊抗兔IgG作用，结果显示目的蛋白VP60 获得表达，在预期位置出现特异性免疫印迹(图7：泳道3-4)，对照组乳酸菌未见相应条带(图7：泳道1-2)。
2.4间接免疫荧光鉴定VP60的表达
过夜培养实施例1制备得到的重组乳酸菌pPG-T7g10-EGFP-VP60/L.casei 393’，12000rpm离心收集菌体，用无菌PBS洗涤三次，将菌体涂布于载玻片上，用丙酮固定后，分别与兔抗RHDV高免血清和红荧光标记山羊抗兔IgG作用，置于荧光显微镜下观察，结果见图8所示，对照组乳酸菌pPG-T7g10-PPT/L.casei 393菌体未见红色荧光，重组菌pPG-T7g10-EGFP-VP60/L.casei 393’菌体可见明显的红色荧光，表明VP60在重组菌中获得了表达。
实施例3重组乳酸菌pPG-T7g10-EGFP-VP60/L.casei 393’的免疫原性评价
本发明以新西兰兔为试验动物评价构建的重组乳酸菌 pPG-T7g10-EGFP-VP60/L.casei 393’的免疫原性。新西兰兔随机分为3组，每组6只：实验组I每只兔口服接种5ml菌体浓度为1×1010CFU/mL的重组乳酸菌 pPG-T7g10-EGFP-VP60/L.casei 393’；实验组II每只兔皮下注射1ml兔病毒性出血症病毒组织灭活疫苗；实验组III每只兔口服接种5ml无菌PBS。免疫程序为：新西兰兔间隔2周免疫一次，共免疫3次(每次连续免疫3天，每天1次)。采用ELISA 方法检测试验兔粪便、阴道粘液、鼻腔洗液和泪液中sIgA抗体水平以及血清中IgG抗体水平，并对经免动物进行了攻毒保护性试验。具体结果如下：
3.1免疫兔粪便中特异性sIgA抗体检测
采集免疫兔粪便样本，用间接ELISA方法检测特异性黏膜抗体sIgA水平。结果见图9，免疫后不同时间点，疫苗免疫组和口服免疫重组乳酸菌组试验兔的粪便中均检测出了较高的sIgA抗体水平，显著于PBS对照组。
3.2免疫兔泪液中特异性sIgA抗体检测
于免疫第0、7、10、14、21和35d采集各组免疫兔眼冲洗液样本，以RHDV 全病毒为包被抗原，采用ELISA方法检测免疫兔泪液中sIgA抗体水平，检测结果见图10。免疫重组乳酸菌pPG-T7g10-EGFP-VP60/L.casei 393’兔在免疫后第7d即能检测到低水平的sIgA抗体，在21d时达到较高水平，28d时有所下降，三免后抗体水平又继续升高；疫苗组免疫后前14天抗体产生水平较低，21天后抗体维持在较高水平；与PBS组相比，均差异显著。
3.3免疫兔阴道黏液中特异性sIgA抗体检测
免疫前及每次免疫后第7d，分别收集每组试验兔阴道洗液，用以检测sIgA抗体水平。结果见图11所示，口服免疫重组乳酸菌后诱导兔体内产生了特异性sIgA 抗体，疫苗免疫组兔体内也产生较高水平的IgA抗体，但抗体水平要低于重组菌免疫组，与PBS组相比，均差异显著。
3.4免疫兔鼻腔洗液中特异性sIgA抗体检测
结果见图12所示，从整体来看，免疫后sIgA抗体在鼻黏膜洗液中的变化规律为每次免疫后抗体水平迅速上升，但随着时间推移则有所下降。在初次免疫后，重组乳酸菌组的sIgA抗体水平上升较快，在第l4d时其sIgA抗体水平有所下降，第二次免疫后又迅速升高。疫苗免疫组sIgA抗体在免疫后21时达到较高水平，且逐渐趋于稳定。
3.5免疫兔血清中特异性IgG抗体检测
检测结果见图13所示，口服免疫重组乳酸菌组及注射免疫组织灭活疫苗组均诱导试验兔产生了抗RHDV-VP60蛋白的特异性血清IgG抗体，其中重组乳酸菌免疫组在一免后第7d即检测到较高水平的IgG抗体，在第14d抗体水平有所下降，二免后抗体不断升高，而疫苗免疫组IgG抗体水平不断升高。
3.6保护性评价
在三免后第6天，以病毒RNA拷贝数为1.0×105.97的RHDV肝脏组织悬液1ml 进行攻毒试验，观察疫苗保护效果。PBS对照组的实验兔在76h内全部死亡，病死兔剖检后可见各脏器有不同程度的出血及水肿，肝脏呈现土黄色，肺脏有明显的出血点和出血斑。重组菌pPG-T7g10-EGFP-VP60/L.casei 393’免疫组和疫苗免疫组实验兔全部存活，获得了100％保护。
表1攻毒保护结果
综上，本发明以EGFP为筛选标记，成功构建了组成型表达RHDV-VP60蛋白的重组乳酸菌pPG-T7g10-EGFP-VP60/L.casei 393’，经口服途径免疫实验动物，既能有效诱导局部黏膜免疫应答，又可刺激机体产生系统的体液免疫应答，显示了良好的免疫保护作用。
序列表
<110> 东北农业大学
<120> 一种组成型表达兔病毒性出血症病毒VP60蛋白的重组乳酸菌疫苗株及其制备方法和用途
<130> klpi170631
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1740
<212> DNA
<213> VP60
<400> 1
atggagggca aaacccgcac agcgccgcaa ggcgaagcag caggcactgc taccacagca 60
tcagtccccg gaaccacgac cgacggtatg gaccctggcg tggtggccgc aactagtgtg 120
gtcactgcag aaaactcatc cgcatcggtt gcaacggcgg ggattggcgg cccaccccaa 180
caggtggatc aacaagagac atggaggaca aacttttact acaatgatgt tttcacttgg 240
tccgtcgcgg atgcgcccgg cagcattctc tacactgtcc aacactctcc acagaacaac 300
ccattcacag ccgtgctgag ccagatgtac gctggctggg ctgatggcat gcagttccgc 360
tttatagttg ccggatcagg tgtgtttggt gggcgactgg ttgcggctgt gataccgcca 420
ggcatcgaga ttggaccagg gttggaggtc aggcaattcc ctcatgttgt catcgacgcc 480
cgttcacttg aacctgttac catcaccatg ccggacttgc gtcccaacat gtaccatcca 540
actggtgacc ctggcctcgt ccccacacta gtccttagtg tctacaacaa cctcatcaac 600
ccgtttggtg ggtccaccag cgcaatccaa gtaacggtgg aaacaaggcc aagtgaggac 660
tttgagttcg tgatgattag agccccctcc agcaagactg ttgactcaat ctcacccgca 720
cgcctcctca cgaccccagt tctcactggg gttggcaatg ataacaggtg gaacggccaa 780
atagtgggac tgcaaccagt gcctggaggg ttttccacgt gcaacaggca ctggaactta 840
aacggcagca catacggctg gtcaagccct cggtttgccg acattgacca tcgaagaggc 900
agtgcaagtt attctgggaa caactcaacc aacgtgctcc agttttggta tgccaatgct 960
gggtctgcaa ttgacaaccc tatctcccag gttgcaccag acggctttcc tgacatgtca 1020
ttcgtgccct ttaacagccc caacattccg accgcagggt gggtcgggtt tggtggaatc 1080
tggaacagta acaacggtgc ccccgctgct acgactgtgc aggcctatga attaggtttt 1140
gccactgggg caccaaacaa cctccagccc accaccaaca cctcaggtgc acagactgtc 1200
gctaagtcca tttatgccgt ggtaaccggc acaatccaaa acccaaccgg actatttgtg 1260
atggccccgg gcattatctc caccccaaac gccaacgccg tcacatacac gccccaacca 1320
gacagaattg tgaccacacc cggtactcct gctgctgcac ctgtgggtaa gaacacaccc 1380
atcatgttcg cgtccgttgt caggcgcacc ggtgacgtca acgccgcagc tgggtcaagt 1440
aacgggaccc agtacggcac aggctcccaa ccactgccag taacaattgg actttcgctc 1500
aacaattact cgtcagcact catgcccgga cagtttttcg tttggcagtt aacctttgca 1560
tctggtttca tggagattgg tttgagtgtg gacgggtacc tttatgcagg aacaggagcc 1620
tcaactacgc tcattgactt gacagaactc attgatgtac gccccgtggg acccaggccg 1680
tccaaaagca cactcgtgtt caacctgggg ggcacagcca atggcttttc ttatgtctga 1740
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> HCE
<400> 2
gaaaaaagga gctggaaccg atg 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> T7g10
<400> 3
aataattttg tttaacttta ag 22
<210> 4
<211> 1143
<212> DNA
<213> PgsA anchor
<400> 4
atgaaaaaag aactgagctt tcatgaaaag ctgctaaagc tgacaaaaca gcaaaaaaag 60
aaaaccaata agcacgtatt tattgccatt ccgatcgttt ttgtccttat gttcgctttc 120
atgtgggcgg gaaaagcgga aacgccgaag gtcaaaacgt actctgacga cgtactctca 180
gcctcatttg taggcgatat tatgatggga cgctatgttg aaaaagtaac ggagcaaaaa 240
ggggcagaca gtatttttca atatgttgaa ccgatcttta gagcctcgga ttatgtagca 300
ggaaactttg aaaacccggt aacctatcaa aagaattata aacaagcaga taaagagatt 360
catctgcaga cgaataagga atcagtgaaa gtcttgaagg atatgaatct cacggttctc 420
aacagcgcaa acaaccacgc aatggattac ggcgttcagg gcatgaaaga tacgcttgga 480
gaatttgcga agcaaaacct tgatatcgtt ggagcgggat acagcttaag tgatgcgaaa 540
aagaaaattt tgtaccagaa agtcaacggg gtaacgattg caacgcttgg ctttaccgat 600
gtgtccggga aaggtttcgc ggctaaaaag aatacgccgg gcgtgctgcc cgcagatcct 660
gaaatcttca tccctatgat ttcagaagcg aaaaaacatg ctgacattgt tgttgtgcag 720
tcacactggg gacaagagta tgacaatgat ccaaatgacc gccagcgcca gcttgcaaga 780
gccatgtctg atgcgggagc tgacatcatc gtcggccatc acccgcacat cttagaaccg 840
attgaagtat ataacggaac cgtcattttc tacagcctcg gcaactttgt ctttgatcaa 900
ggctggacga gaacaagaga cagtgcactg gttcagtatc acctgaagaa aaatggaaca 960
ggccgctttg aagtgacacc gatcgatatc catgaagcga cacctgcacc tgtgaaaaaa 1020
gacagcctta aacagaaaac cattattcgc gaactgacga aagactctaa tttcgcttgg 1080
aaagtagaag acggaaaact gacgtttgat attgatcata gtgacaaact aaaatctaaa 1140
taa 1143
<210> 5
<211> 404
<212> DNA
<213> rrnBT1T2
<400> 5
ttggcttatg agagaagatt ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc agaagcggtc 60
tgataaaaca gaatttgcct cccggcagta gcgcggtggt cccacctgac cccatgccga 120
actcagaagt gaaacgccgt agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat gcgagagtag 180
ccaactgcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt 240
atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg agcggatttg 300
aacgttgcga agcaacggcc cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata aactgccagg 360
catcaaagga atcagaaggc catcctgacg gatggccttt ttgc 404

Claims (10)

1.一种组成型表达兔病毒性出血症病毒VP60蛋白的重组乳酸菌疫苗株，其特征在于，所述的重组乳酸菌疫苗株含有EGFP标记的组成型表达兔病毒性出血症病毒VP60蛋白的乳酸菌表达质粒。
2.如权利要求1所述的重组乳酸菌疫苗株，其特征在于，所述的重组乳酸菌为重组干酪乳杆菌L.casei 393。
3.如权利要求1所述的重组乳酸菌疫苗株，其特征在于，编码所述的兔病毒性出血症病毒VP60蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.如权利要求1所述的重组乳酸菌疫苗株，其特征在于，所述的EGFP标记的组成型表达兔病毒性出血症病毒VP60蛋白的乳酸菌表达质粒通过电转化方法转入乳酸菌的感受态细胞中。
5.如权利要求1所述的重组乳酸菌疫苗株，其特征在于，所述的EGFP标记的组成型表达兔病毒性出血症病毒VP60蛋白的乳酸菌表达质粒是通过以下方法制备得到：
(1)质粒pMD19-VP60的构建
将扩增得到的兔病毒性出血症病毒VP60的PCR产物插入pMD19-T simple载体中的SacI和ApaI酶切位点之间，得到质粒pMD19-VP60；
(2)乳酸菌组成型表达质粒pPG-T7g10-PPT的构建
在质粒pPG612的基础上进行改造，利用XbaI和XhoI对质粒pPG612进行双酶切，酶切后的载体片段与HCE-T7g10-PgsA anchor-MCS-rrnBT1T2序列连接，构建了乳酸菌组成型表达质粒，命名为pPG-T7g10-PPT，其中HCE为芽孢杆菌组成型分泌表达启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；T7g10为翻译增强子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，PgsAanchor的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；MCS为多克隆酶切位点，至少包括Sac I和Apa I限制性内切酶酶切位点；rrnBT1T2为大肠杆菌转录终止子序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；
(3)重组质粒pPG-T7g10-VP60的构建
利用限制性核酸内切酶Sac I和Apa I分别对质粒pMD19-VP60和乳酸菌组成型表达质粒pPG-T7g10-PPT进行双酶切处理，经DNA胶回收试剂盒纯化目的片段，将回收纯化的VP60基因片段与表达载体pPG-T7g10-PPT连接，得到重组质粒pPG-T7g10-VP60；
(4)重组质粒pPG-T7g10-EGFP-VP60的构建
将编码EGFP基因连入质粒pPG-T7g10-VP60中VP60基因上游，构建融合表达EGFP和VP60的重组质粒，命名为pPG-T7g10-EGFP-VP60，然后，通过酶切方法将重组质粒pPG-T7g10-EGFP-VP60中的氯霉素抗性筛选基因切除，平端化自连后，获得EGFP标记的组成型表达兔病毒性出血症病毒VP60蛋白的乳酸菌表达质粒，命名为重组质粒pPG-T7g10-EGFP-VP60。
6.一种构建权利要求1-5任一项所述的重组乳酸菌疫苗株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)质粒pMD19-VP60的构建
将扩增得到的兔病毒性出血症病毒VP60的PCR产物插入pMD19-T simple载体中的SacI和ApaI酶切位点之间，得到质粒pMD19-VP60；
(2)乳酸菌组成型表达质粒pPG-T7g10-PPT的构建
在质粒pPG612的基础上进行改造，利用XbaI和XhoI对质粒pPG612进行双酶切，酶切后的载体片段与HCE-T7g10-PgsA anchor-MCS-rrnBT1T2序列连接，构建了乳酸菌组成型表达质粒，命名为pPG-T7g10-PPT，其中HCE为芽孢杆菌组成型分泌表达启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；T7g10为翻译增强子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，PgsAanchor的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；MCS为多克隆酶切位点，至少包括Sac I和Apa I限制性内切酶酶切位点；rrnBT1T2为大肠杆菌转录终止子序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；
(3)重组质粒pPG-T7g10-VP60的构建
利用限制性核酸内切酶Sac I和Apa I分别对质粒pMD19-VP60和乳酸菌组成型表达质粒pPG-T7g10-PPT进行双酶切处理，经DNA胶回收试剂盒纯化目的片段，将回收纯化的VP60基因片段与表达载体pPG-T7g10-PPT连接，得到重组质粒pPG-T7g10-VP60；
(4)重组质粒pPG-T7g10-EGFP-VP60的构建
将编码EGFP基因连入质粒pPG-T7g10-VP60中VP60基因上游，构建融合表达EGFP和VP60的重组质粒，命名为pPG-T7g10-EGFP-VP60，然后，通过酶切方法将重组质粒pPG-T7g10-EGFP-VP60中的氯霉素抗性筛选基因切除，平端化自连后，获得EGFP标记的组成型表达兔病毒性出血症病毒VP60蛋白的乳酸菌表达质粒，命名为重组质粒pPG-T7g10-EGFP-VP60；
(5)电转化
将步骤(4)构建得到的重组质粒pPG-T7g10-EGFP-VP60电转入乳酸菌感受态细胞中，通过流式细胞术筛选带有EGFP荧光标记的重组菌，从而获得以EGFP为筛选标记的，组成型表达兔病毒性出血症病毒VP60蛋白的重组乳酸菌，命名为pPG-T7g10-EGFP-VP60/L.casei393’。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的乳酸菌为干酪乳杆菌L.casei393。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，编码所述的兔病毒性出血症病毒VP60蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
9.权利要求1-5任一项所述的重组乳酸菌疫苗株在制备预防和治疗兔病毒性出血症药物中的用途。
10.一种兔病毒性出血症口服疫苗，其特征在于，含有权利要求1-5任一项所述的重组乳酸菌疫苗株。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107988130A (zh) * 2017-12-21 2018-05-04 东北农业大学 稳定表达猪轮状病毒vp4蛋白的乳酸菌基因工程亚单位疫苗株及其制备方法
CN113330120A (zh) * 2018-10-10 2021-08-31 生物领先公司 利用源自干酪乳杆菌的两种启动子共表达两种靶蛋白的表面表达载体以及使用其在微生物表面上表达蛋白质的方法
CN116376795A (zh) * 2023-03-29 2023-07-04 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种表达hsp70的重组乳酸菌及其制备方法与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130177582A1 (en) * 2010-04-29 2013-07-11 Riemser Arzneimittel Ag Parapoxvirus expressing the vp60 major capsid protein of the rabbit haemorrhagic disease virus
CN104436187A (zh) * 2014-11-10 2015-03-25 张文波 表达兔病毒性出血症病毒vp60蛋白疫苗

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130177582A1 (en) * 2010-04-29 2013-07-11 Riemser Arzneimittel Ag Parapoxvirus expressing the vp60 major capsid protein of the rabbit haemorrhagic disease virus
CN104436187A (zh) * 2014-11-10 2015-03-25 张文波 表达兔病毒性出血症病毒vp60蛋白疫苗

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
徐义刚: "乳酸菌作为基因工程受体菌的研究展望", 《中国微生态学杂志》 *
王玉赛: "融合表达TGEV 6Ds与PEDV ps420非抗性标记重组干酪乳杆菌表达系统", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *
鞠珑株: "组成型乳酸菌表达载体的构建及表达效果的比较", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107988130A (zh) * 2017-12-21 2018-05-04 东北农业大学 稳定表达猪轮状病毒vp4蛋白的乳酸菌基因工程亚单位疫苗株及其制备方法
CN113330120A (zh) * 2018-10-10 2021-08-31 生物领先公司 利用源自干酪乳杆菌的两种启动子共表达两种靶蛋白的表面表达载体以及使用其在微生物表面上表达蛋白质的方法
CN116376795A (zh) * 2023-03-29 2023-07-04 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种表达hsp70的重组乳酸菌及其制备方法与应用
CN116376795B (zh) * 2023-03-29 2023-11-07 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种表达hsp70的重组乳酸菌及其制备方法与应用

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