CN110156896A - 重组口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种重组口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法和应用。具体地，本发明以口蹄疫病毒结构蛋白构成的不含病毒核酸的病毒样颗粒，该病毒样颗粒免疫动物，能激起机体产生针对口蹄疫的免疫保护，且不具有传染性，相比传统灭活病毒疫苗有着更高的安全性。本发明还提供了上述重组口蹄疫病毒样颗粒的制备方法。

Description

重组口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程和免疫领域，更具体地涉及一种重组口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒所引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，该病毒传染性高且传播迅速。主要侵害偶蹄兽，偶见于人和其他动物。其临诊特征为口腔粘膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱。口蹄疫在世界范围内多有爆发，有强烈的传染性,一旦发病传播速度快,往往造成大流行,不易控制和消灭,带来严重的经济损失，被国际兽疫局(OIE)列为A类动物疫病名单之首,是世界各国检疫和防疫的重点对象。我国也将其列为第一类动物传染病的第一位。口蹄疫流行情况从过去的点发到现今的普发，从有季节性到无季节性。
口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属的成员，该病毒宿主范围广，遗传变异率高，抗原差异大，现存在七种血清型，0、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1，每种又有众多个不同的亚型，血清型间无交叉免疫现象。即使是免疫动物在接触新病毒后，也可形成隐性感染而持续带毒，在免疫和非免疫条件下病毒均可适应机体而长期存在。其中O型血清型最为常见，A型口蹄疫目前在我国只是零星散发。成年动物感染口蹄疫后大部分能康复，但有时幼畜病死率可达100％，能够造成感染动物相关的生产力下降，成为制约国际、国内动物和动物产品贸易的主要障碍。
疫苗免疫是控制和预防口蹄疫流行的有效技术方法。目前市场上主要采用的疫苗是病毒灭活疫苗，该类口蹄疫疫苗存在以下缺点：(1)稳定性差，保护期短，防疫效果不理想；(2)制备过程中存在散毒的安全隐患，需要P3级安全防护，成本高、操作难；(3)制备过程中，非结构蛋白去除不彻底，会造成区分自然感染及免疫动物的困难；(4)灭活不彻底将存在安全性问题。
因此，本领域迫切需要开发安全、高效、经济的新型口蹄疫疫苗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型重组口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法和应用。
具体地，本发明的目的在于提供一种新型口蹄疫病毒样颗粒的基因序列及蛋白序列，并提供了该病毒样颗粒的制备方法，该病毒样颗粒应用于提高免疫动物对口蹄疫病毒的免疫保护力，降低动物口蹄疫的发病率。
在本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白从N端至C端具有式I结构：
P1－2A－3C (I)
式中，
P1为口蹄疫病毒外壳结构蛋白VP元件，
2A为非结构蛋白2A蛋白酶，
3C为非结构蛋白3C蛋白酶，其中，所述P1-2A元件可在酶3C的酶切作用下，形成VP0蛋白、VP3蛋白和VP1蛋白。
在另一优选例中，所述的融合蛋白可自剪切并释放出3C蛋白酶。
在另一优选例中，所述的酶3C是源自所述融合蛋白的3C蛋白酶。
在另一优选例中，所述的VP0蛋白、VP3蛋白和VP1蛋白可以自我组装成与天然口蹄疫病毒非常相似的VLP。
在另一优选例中，所述非常相似是指所述VLP与天然口蹄疫病毒的相似度≥80％，较佳地，≥90％。
在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5-8所示，或者与SEQID NO.:5-8所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第一方面所述的融合蛋白。
在另一优选例中，所述的多核苷酸是经密码子优化的多核苷酸。
在另一优选例中，所述多核苷酸编码SEQ ID NO.:5-8所示的多肽；并且所述多核苷酸选自下组：
(a)序列如SEQ ID NO.:1-4所示的多核苷酸；
(b)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1-4所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸；
(c)如SEQ ID NO.:1-4所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；
(e)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在本发明的第三方面，提供了一种基因工程细胞，所述基因工程细胞为真核细胞，并且所述细胞的基因组中整合有口蹄疫病毒外壳蛋白的表达盒；或者所述细胞中含有表达载体，所述表达载体含有所述口蹄疫病毒外壳蛋白的表达盒；
其中，所述的表达盒可表达本发明第一方面所得的融合蛋白，
并且所述基因工程细胞在胞内表达所述外壳蛋白，且所述外壳蛋白在所述基因工程细胞内部形成病毒样颗粒(VLPs)。
在另一优选例中，所述的病毒样颗粒由VP0蛋白、VP3蛋白和VP1蛋白形成。
在另一优选例中，所述病毒为口蹄疫病毒O型，较佳地为FMDV O/BY/CHA/2010株口蹄疫病毒、或OJMS株口蹄疫病毒。
在另一优选例中，所述细胞为酵母细胞，优选为毕赤酵母细胞，更优选为毕赤酵母KM71菌株。
在另一优选例中，VP0蛋白可以裂解为VP4蛋白和VP2蛋白。
在另一优选例中，所述的表达盒包含外壳蛋白编码序列，并且，所述的外壳蛋白编码序列从5'至3'可操作地连接的以下元件：
VP4蛋白的编码序列、VP2蛋白的编码序列、VP3蛋白的编码序列和VP1蛋白的编码序列2A非结构蛋白基因编码区序列、3C蛋白酶编码区序列。
在另一优选例中，所述的表达盒的3'端还包含启动子。
在另一优选例中，所述的表达盒不含有分泌表达元件。
在另一优选例中，所述的表达盒不含有分泌肽、引导肽、或信号肽。
在另一优选例中，所述表达载体以毕赤酵母ppIcx载体为骨架。
在另一优选例中，所述3C蛋白酶包括突变的3C蛋白酶。
在另一优选例中，所述3C蛋白酶的第38位的甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)，且第48位的苯丙氨酸(F)突变为丝氨酸(S)。
在另一优选例中，所述外壳蛋白在相对于SEQ ID NO.:1的第791位的甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)，且第801位的苯丙氨酸(F)突变为丝氨酸(S)。
在另一优选例中，所述外壳蛋白在相对于SEQ ID NO.:3的第791位的甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)，且第801位的苯丙氨酸(F)突变为丝氨酸(S)。
在本发明的第四方面，提供了一种病毒样颗粒(VLPs)，所述VLPs由本发明第三方面所述的基因工程细胞表达。
在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明第四方面所述的病毒样颗粒，和药学上可以接受的载体。
在另一优选例中，所述药物组合物包括疫苗组合物。
在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。
在另一优选例中，所述的佐剂包括氧化铝、皂苷、quil A、胞壁酰二肽、矿物油或植物油、基于囊泡的佐剂、非离子嵌段共聚物或DEAE葡聚糖、细胞因子(包括IL-1、IL-2、IFN-r、GM-CSF、IL-6、IL-12、和CpG)。
在本发明的第六方面，提供了一种制备VLPs的方法，包括步骤：
在适合表达的条件下，培养本发明第三方面所述的细胞，从而表达出本发明第四方面所述的病毒样颗粒(VLPs)；和
分离所述病毒样颗粒(VLPs)。
在本发明的第七方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。
在本发明的第八方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第七方面所述的表达载体，或者在基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。
在本发明的第九方面，提供了一种检测试剂，所述的检测试剂含有本发明第四方面所述的病毒样颗粒(VLPs)，并且所述的病毒样颗粒偶联有可检测标记物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了重组毕赤酵母表达FMDV O/BY/CHA/2010VLP颗粒的Western Blot检测结果。其中，泳道1-3：重组毕赤酵母P12A3C(O/BY/CHA/2010)表达的VLP颗粒经抗O型FMDVVP1抗体反应的Western Blot检测结果，泳道4：阴性对照，为电转空质粒的毕赤酵母诱导表达样品经抗O型FMDV VP1抗体反应的Western Blot检测结果，泳道5、9-11：重组毕赤酵母P12A3C-[突变](O/BY/CHA/2010)表达的VLP颗粒经抗O型FMDV VP1抗体反应的WesternBlot检测结果，泳道6-8为阴性克隆。
图2显示了重组毕赤酵母表达FMDV O/BY/CHA/2010VLP颗粒的电镜观察结果。其中，图2A显示了重组毕赤酵母P12A3C(O/BY/CHA/2010)表达的VLP颗粒经电镜观察结果，图2B显示了重组毕赤酵母P12A3C-[突变](O/BY/CHA/2010)表达的VLP颗粒经电镜观察结果。
图3显示了重组毕赤酵母表达FMDV OJMS株VLP颗粒WesternBlot检测结果。其中，泳道1-3：重组毕赤酵母P12A3C(OJMS株)表达的VLP颗粒经抗O型FMDV VP1抗体反应的Western Blot检测结果，泳道4：阴性对照，为电转空质粒的毕赤酵母诱导表达样品经抗O型FMDV VP1抗体反应的Western Blot检测结果，泳道5-7：重组毕赤酵母P12A3C-[突变](OJMS株)表达的VLP颗粒经抗O型FMDV VP1抗体反应的Western Blot检测结果，M：Protein标准品。
图4显示了重组毕赤酵母表达FMDV OJMS株VLP颗粒电镜观察结果。其中，图4A显示了重组毕赤酵母P12A3C(OJMS株)表达的VLP颗粒经电镜观察结果。图4B显示了重组毕赤酵母P12A3C-[突变](OJMS株)表达的VLP颗粒经电镜观察结果。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，通过对口蹄疫病毒的表达构建物结构大量筛选和优化(包括构成元件以及编码序列等多方面的优化)，首次意外地获得了一种不仅能够在巴斯德毕赤酵母中高效表达，而且可以形成正确加工和折叠的VP蛋白，进而高效自动组装成与天然口蹄疫病毒非常相似的VLP(病毒样颗粒)。在此基础上完成了本发明。
具体地，本发明人以口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)结构蛋白构成的不含病毒核酸的病毒样颗粒(virus-like-particles,VLPs)，该病毒样颗粒免疫动物，能激起机体产生针对口蹄疫的免疫保护，且不具有传染性，相比传统灭活病毒疫苗有着更高的安全性。
具体地，本发明构建的重组基因序列为O型口蹄疫病毒(O/BY/CHA/2010株和OJMS株)的P1-2A-3C序列，该序列并不是简单的蛋白表达，3C为蛋白酶。经表达后，本发明的3C蛋白酶可以将P1-2A催化加工成口蹄疫病毒外壳蛋白VP0、VP3和VP1。接着，这3种蛋白相互联系并自我组装成与真实病毒粒子大小相同的VLPs，本发明还对3C蛋白酶进行了突变，来提高口蹄疫病毒结构蛋白的表达量。
并且，本发明人选用的巴斯德毕赤酵母表达系统属于真核表达系统。真核表达系统相较原核表达系统具有翻译后加工修饰功能,能够对其表达的蛋白进行正确的加工折叠，而且利用FMDV的3C蛋白酶进行加工，更模拟了天然病毒的加工方式，能够获得正确加工折叠及正确组装的VLPs，获得的VLPs与天然病毒颗粒相似。酵母表达系统同大肠杆菌原核表达系统一样操作简单，成本低廉，可大规模发酵，这一点优于其他的真核表达系统(如昆虫细胞表达系统，哺乳动物表达系统等)。
本发明获得的VLPs与天然病毒颗粒相似，甚至组装方式也是模拟天然病毒，可以替代传统口蹄疫灭活疫苗起到有效预防口蹄疫的效果，而且安全性要高于传统的口蹄疫病毒灭活疫苗，不存在制备过程中的散毒危险，以及病毒灭活不彻底的潜在隐患。而VLPs相对于亚单位蛋白或者重组蛋白疫苗，具有更好免疫原性，不仅能激起免疫动物的体液免疫产生中和抗体，还能激起细胞免疫应答，获得更好的预防口蹄疫效果。
本发明不同于其他专利发明利用大肠杆菌表达系统分别表达口蹄疫外壳蛋白VP1，VP0，VP3，再通过体外配伍组装成VLPs。大肠杆菌表达系统制备VLPs通常采用小泛素蛋白相关修饰(SUMO)融合蛋白系统，这一系统表达的蛋白与SUMO基团形成可溶性的融合蛋白，解决表达蛋白形成包涵体的问题，但是表达的蛋白仍存在未进行加工修饰的问题，可能影响VLPs的免疫原性，而且该系统需要分别表达口蹄疫病毒的外壳蛋白VP1，VP0，VP3与SUMO基团的融合蛋白，分别去除表达融合蛋白上的SUMO基团，然后三个外壳蛋白通过体外组装形成VLPs。
口蹄疫病毒
口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属的成员，该病毒宿主范围广，遗传变异率高，抗原差异大，现存在七种血清型，0、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1，每种又有众多个不同的亚型，血清型间无交叉免疫现象。
FMDV基因组为单股正链RNA，约8.5kb，由5’端非编码区(5’UTR)、开放阅读框(ORF)、3’端非编码区(3’UTR)和Poly(A)组成。ORF由L前导链基因、P1区结构蛋白基因、P2区非结构蛋白基因、P3区非结构蛋白基因组成，共同编码聚合蛋白。其中P1区约2208bp,依次编码1A(VP4)、1B(VP2)、1C(VP3)和1D(VP1)4种结构蛋白。4种结构蛋白最终形成五聚体单位构成病毒衣壳蛋白。其形成过程是，多聚蛋白经过初级裂解形成L-P1-2A、2BC、P3 3种前体蛋白，多肽2A催化P1-2A从2BC连接处顺式切割，3C蛋白酶完成次级裂解，P1-2A被3C蛋白酶催化加工成VP0、VP3和VP1，这3种蛋白相互联系并自我组装成二十面体的核衣壳，在病毒粒子的最后形成阶段VP0经成熟裂解为VP2和VP4，病毒RNA进入75S的空衣壳形成完整的病毒粒子。这样VP4、VP2、VP3和VP1各60分子构成病毒粒子的衣壳蛋白，呈二十面体对称结构，其中VP1、VP2和VP3位于衣壳表面，VP4位于衣壳的内部。结构蛋白P1区包含了FMDV的主要抗原位点，不仅可以诱导机体产生特异性细胞免疫应答，还能诱导机体产生中和抗体，具有很好的抗原性。其变异率VP1>VP3>VP2>VP4，VP1最容易发生变异，其变异可导致病毒抗原性的变化。FMDV共有5个抗原位点，其中3个主要抗原位点均位于VP1上，另外2个抗原位点分别位于VP2和VP3上。VP1蛋白能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞，但是仅用VP1蛋白免疫动物，虽然有一定的免疫原性，但免疫效果并不理想，只有完整的病毒颗粒和空衣壳才具有良好的免疫原性。
病毒样颗粒
病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)是指有些病毒的结构蛋白组装成不含病毒核酸的空心颗粒。形态上与真正病毒粒子相同或相似，能够刺激机体产生特异性的体液免疫和特异性的细胞免疫应答，但其不具有感染性和复制能力，较传统的病毒类疫苗有着更高的安全性，避免了在生产过程中有散毒的危险。而且VLPs不包含口蹄疫病毒的非结构蛋白，不会存在如传统口蹄疫疫苗一样在制备过程中非结构蛋白去除不彻底，从而造成很难区分自然感染及人工免疫的问题。
具体地，本发明提供了一种新型重组口蹄疫病毒样颗粒，使用该病毒样颗粒免疫动物，能激起机体产生针对口蹄疫的免疫保护，且不具有传染性，相比传统灭活病毒疫苗有着更高的安全性。并且，本发明的重组口蹄疫病毒样颗粒还可以用于代替弱毒抗原，用于FMD的血清学检测，扩大了应用范围。
本发明将O型FMDV O/BY/CHA/2010株和OJMS株的P1-2A-3C序列整合到毕赤酵母的基因组上，大量表达P1-2A-3C蛋白，并自我组装形成与真病毒外形相似的VLPs。
序列表SEQ ID No:1～SEQ ID No:4均为FMDV的P1-2A-3C基因序列，均包含2901个碱基，每个序列包含的蛋白编码序列的长度和位置均一致。自5’端最前面3个碱基ATG为起始密码子ATG，5’端第4bp-2211bp(2208bp)为FMDV的结构蛋白P1基因序列，其中第4bp-258(255bp)为VP4结构蛋白基因序列，第259bp-912bp(654bp)为VP2结构蛋白基因序列，第913-1572bp(660bp)为VP3结构蛋白基因序列,第1573bp-2211bp(639bp)为VP1结构蛋白基因序列；第2212bp-2259bp(48bp)为2A非结构蛋白基因编码区；第2260bp-2898bp(639bp)为3C非结构蛋白基因编码区，最后3个碱基TAA为终止密码子。
序列表SEQ ID No:1为FMDV O/BY/CHA/2010株经优化后的P1-2A-3C基因序列。
序列表SEQ ID No:2为FMDV O/BY/CHA/2010株P1-2A-3C[突变]的基因序列，该基因序列基本同SEQ ID No:1序列一样，仅3C非结构蛋白有2处突变，分别为第2371bp-2373bp处碱基由GGA突变为TCC，第2402bp-2404bp处碱基由TCG突变为CTG。
序列表SEQ ID No:3为优化后FMDV OJMS株的P1-2A-3C基因序列。
序列表SEQ ID No:4为优化后的FMDV OJMS株P1-2A-3C[突变]的基因序列，其3C非结构蛋白的基因序列2处做了突变，其余序列与SEQ ID No:3的基因序列一致，分别为第2371bp-2373bp处碱基由GGT突变为TCT，第2402bp-2404bp处碱基由TCG突变为CTG。
序列表SEQ ID No:5～SEQ ID No:8均为FMDV的P1-2A-3C氨基酸序列，每个序列均由966个氨基酸组成，它们包含的各个蛋白的大小和位置一致。自5’端第2-737位氨基酸(736aa)为FMDV结构蛋白P1的氨基酸序列，其中第2-86aa(85aa)为VP4结构蛋白的氨基酸序列，第87aa-304aa(218aa)为VP2结构蛋白的氨基酸序列，第305aa-524aa(220aa)为VP3结构蛋白序列,第525aa-737aa(213aa)为VP1结构蛋白序列；自第738aa-753aa(16aa)为2A非结构蛋白的氨基酸编码区；第754aa-966aa(213aa)为3C非结构蛋白氨基酸编码区。
序列表SEQ ID No:5为为FMDV O/BY/CHA/2010株P1-2A-3C的氨基酸序列。
序列表SEQ ID No:6为FMDV O/BY/CHA/2010株P1-2A-3C[突变]的氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID No:1序列仅在3C非结构蛋白上有2个氨基酸做了突变，分别为第791aa的甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)和801aa的苯丙氨酸(F)突变为丝氨酸(S)。
序列表SEQ ID No:7为FMDV OJMS株的P1-2A-3C的氨基酸序列。
序列表SEQ ID No:8为FMDV OJMS株P1-2A-3C[突变]的氨基酸序列，其3C非结构蛋白也做了与SEQ ID No:2的3C蛋白同样的突变，即序列中第791aa的甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)和801aa的苯丙氨酸(F)突变为丝氨酸(S)。
pPIC3.5K是Invitrogen公司开发的一个适用于毕赤酵母的蛋白表达载体，通过设计改造，使该载体方便插入多拷贝外源基因，共同整合至毕赤酵母基因组，提高外源蛋白的表达量。
本发明涉及的具体序列如下所示：
SEQ ID No:1
FMDV O/BY/CHA/2010株P1-2A-3C的基因序列
ATGGGAGCAGGACAATCATCTCCAGCAACTGGATCACAAAACCAATCAGGAAATACTGGATCTATCATCAACAATTACTACATGCAACAATACCAGAACTCAATGGACACTCAACTTGGAGACAATGCAATCTCTGGAGGATCAAACGAAGGATCAACTGATACTACTTCAACTCATACTACTAACACTCAGAACAATGACTGGTTCTCAAAGCTGGCAAGCTCTGCATTCTCTGGACTGTTCGGAGCACTTCTTGCAGACAAGAAGACTGAAGAAACTACTCTTCTGGAAGACAGAATCCTGACTACTAGAAACGGACATACTACTTCAACTACTCAGTCATCTGTTGGAATCACTCATGGATATGCAACTGCTGAGGACTTCGTGAATGGACCAAACACTTCTGGACTTGAGACCAGAGTTGTTCAAGCAGAGAGATTCTTCAAGACTCATCTGTTCGACTGGGTGACTTCTGACCCATTCGGAAGATGCTACTTGTTGGAACTGCCAACTGATCATAAGGGAGTGTATGGATCACTGACTGATTCCTATGCATACATGAGAAACGGATGGGATGTTGAGGTTACTGCTGTTGGAAACCAGTTCAATGGAGGATGTCTTCTTGTTGCAATGGTGCCTGAACTGTGTTCAATCGAAAGAAGAGAGCTGTTCCAGCTGACTCTGTTCCCACATCAGTTCATCAATCCTAGAACTAACATGACTGCACATATCAAGGTTCCATTCGTTGGTGTGAACAGATACGACCAGTACAAGGTTCACAAGCCTTGGACTCTGGTTGTGATGGTTGTTGCACCACTGACTGTGAACACTGAAGGTGCACCACAGATCAAGGTGTACGCAAACATCGCACCAACTAACGTTCATGTTGCTGGTGAGTTCCCATCAAAGGAGGGAATCTTCCCTGTTGCCTGCTCTGACGGATACGGAGGACTGGTGACTACTGATCCAAAGACTGCTGATCCTGTGTACGGTAAGGTGTTCAATCCACCTAGAAACATGCTGCCTGGTAGATTCACTAACCTTCTTGATGTTGCTGAGGCATGTCCAACTTTCCTGCATTTCGATGGTGATGTGCCATACGTTACTACTAAGACTGACTCTGACAGAGTGCTTGCACAGTTCGACCTGTCACTGGCAGCAAAGCACATGTCCAACACTTTCCTTGCTGGACTTGCACAGTACTACACTCAGTACTCTGGAACTGTGAACCTGCATTTCATGTTCACTGGACCAACTGATGCTAAGGCAAGATACATGATCGCATACGCACCACCAGGAATGGAACCACCTAAGACTCCTGAGGCAGCAGCACATTGCATCCATGCAGAGTGGGATACTGGACTGAACTCCAAGTTCACTTTCTCAATCCCATACCTGTCAGCAGCAGACTACGCATACACTGCATCTGATGCAGCAGAGACTACCAACGTTCAGGGATGGGTGTGCTTGTTTCAGATCACTCATGGTAAGGCTGAGGGAGATGCACTTGTGGTTCTGGCCTCTGCTGGCAAGGACTTCGAGCTGAGACTGCCTGTTGATGCTAGACAACAGACCACCTCAACTGGTGAGTCAGCTGACCCAGTGACTGCAACTGTTGAGAACTACGGTGGAGAGACACAGGTTCAGAGAAGACATCATACTGACGTCTCCTTCATCTTGGACAGATTCGTCAAGGTCACTCCAAAGGACTCAATCAACGTCTTGGACCTGATGCAGACTCCATCACACACTCTGGTTGGTGCACTCCTGAGAACTGCCACCTACTACTTCGCTGATCTTGAGGTGGCAGTGAAGCACGAAGGAGACCTTACCTGGGTGCCAAATGGAGCACCTGAAGCAGCACTTGACAACACTACCAACCCAACTGCATACCACAAGGCACCACTGACTAGACTTGCACTTCCATACACTGCACCACACAGAGTCTTGGCAACTGTGTACAACGGAAACTGCAAGTATGCAGGTGGATCACTGCCAAACGTGAGAGGAGACCTTCAGGTGCTGGCTCAGAAGGCAGCGAGACCACTGCCAACTTCTTTCAACTACGGTGCAATCAAGGCAACTAGAGTGACTGAACTGCTGTACAGAATGAAGAGAGCAGAGACTTACTGCCCTAGACCACTGTTGGCTGTTCATCCATCTGCTGCCAGACACAAACAGAAGATCGTTGCACCTGTCAAGCAGTCACTGAACTTCGATCTGCTGAAGCTGGCAGGAGATGTTGAGTCCAACCCTGGGTCTGGAGCACCACCAACTGACTTGCAGAAGATGGTCATGGGTAACACCAAGCCTGTTGAACTGATCCTTGATGGTAAGACCGTCGCAATCTGCTGCGCAACTGGAGTCTTCGGAACTGCATACCTGGTTCCTAGACATCTGTTCGCTGAGAAGTACGACAAGATCATGCTGGATGGTAGAACCATGACTGACTCTGACTACAGAGTGTTCGAGTTCGAGATCAAGGTCAAGGGACAGGATATGCTGTCTGATGCAGCACTGATGGTTCTGCACAGAGGAAACAGAGTGAGAGACATCACGAAGCACTTCAGAGACACTGCCAGAATGAAGAAGGGAACTCCTGTGGTTGGTGTGATCAACAACGCTGATGTGGGTAGACTGATCTTCTCTGGTGAGGCACTGACCTACAAGGACATCGTGGTGTGCATGGATGGTGACACTATGCCTGGACTGTTCGCATACAAGGCTGCAACCAAGGCTGGATACTGTGGTGGAGCTGTGCTTGCTAAGGATGGAGCTGACACCTTCATCGTTGGAACTCATTCTGCTGGAGGTAACGGAGTTGGATACTGCTCATGCGTGTCCAGATCCATGCTCCAGAAGATGAAGGCACACATCGATCCTGAACCACATCATGAGTAA
SEQ ID No:2
FMDV O/BY/CHA/2010株P1-2A-3C[突变]的基因序列
ATGGGAGCAGGACAATCATCTCCAGCAACTGGATCACAAAACCAATCAGGAAATACTGGATCTATCATCAACAATTACTACATGCAACAATACCAGAACTCAATGGACACTCAACTTGGAGACAATGCAATCTCTGGAGGATCAAACGAAGGATCAACTGATACTACTTCAACTCATACTACTAACACTCAGAACAATGACTGGTTCTCAAAGCTGGCAAGCTCTGCATTCTCTGGACTGTTCGGAGCACTTCTTGCAGACAAGAAGACTGAAGAAACTACTCTTCTGGAAGACAGAATCCTGACTACTAGAAACGGACATACTACTTCAACTACTCAGTCATCTGTTGGAATCACTCATGGATATGCAACTGCTGAGGACTTCGTGAATGGACCAAACACTTCTGGACTTGAGACCAGAGTTGTTCAAGCAGAGAGATTCTTCAAGACTCATCTGTTCGACTGGGTGACTTCTGACCCATTCGGAAGATGCTACTTGTTGGAACTGCCAACTGATCATAAGGGAGTGTATGGATCACTGACTGATTCCTATGCATACATGAGAAACGGATGGGATGTTGAGGTTACTGCTGTTGGAAACCAGTTCAATGGAGGATGTCTTCTTGTTGCAATGGTGCCTGAACTGTGTTCAATCGAAAGAAGAGAGCTGTTCCAGCTGACTCTGTTCCCACATCAGTTCATCAATCCTAGAACTAACATGACTGCACATATCAAGGTTCCATTCGTTGGTGTGAACAGATACGACCAGTACAAGGTTCACAAGCCTTGGACTCTGGTTGTGATGGTTGTTGCACCACTGACTGTGAACACTGAAGGTGCACCACAGATCAAGGTGTACGCAAACATCGCACCAACTAACGTTCATGTTGCTGGTGAGTTCCCATCAAAGGAGGGAATCTTCCCTGTTGCCTGCTCTGACGGATACGGAGGACTGGTGACTACTGATCCAAAGACTGCTGATCCTGTGTACGGTAAGGTGTTCAATCCACCTAGAAACATGCTGCCTGGTAGATTCACTAACCTTCTTGATGTTGCTGAGGCATGTCCAACTTTCCTGCATTTCGATGGTGATGTGCCATACGTTACTACTAAGACTGACTCTGACAGAGTGCTTGCACAGTTCGACCTGTCACTGGCAGCAAAGCACATGTCCAACACTTTCCTTGCTGGACTTGCACAGTACTACACTCAGTACTCTGGAACTGTGAACCTGCATTTCATGTTCACTGGACCAACTGATGCTAAGGCAAGATACATGATCGCATACGCACCACCAGGAATGGAACCACCTAAGACTCCTGAGGCAGCAGCACATTGCATCCATGCAGAGTGGGATACTGGACTGAACTCCAAGTTCACTTTCTCAATCCCATACCTGTCAGCAGCAGACTACGCATACACTGCATCTGATGCAGCAGAGACTACCAACGTTCAGGGATGGGTGTGCTTGTTTCAGATCACTCATGGTAAGGCTGAGGGAGATGCACTTGTGGTTCTGGCCTCTGCTGGCAAGGACTTCGAGCTGAGACTGCCTGTTGATGCTAGACAACAGACCACCTCAACTGGTGAGTCAGCTGACCCAGTGACTGCAACTGTTGAGAACTACGGTGGAGAGACACAGGTTCAGAGAAGACATCATACTGACGTCTCCTTCATCTTGGACAGATTCGTCAAGGTCACTCCAAAGGACTCAATCAACGTCTTGGACCTGATGCAGACTCCATCACACACTCTGGTTGGTGCACTCCTGAGAACTGCCACCTACTACTTCGCTGATCTTGAGGTGGCAGTGAAGCACGAAGGAGACCTTACCTGGGTGCCAAATGGAGCACCTGAAGCAGCACTTGACAACACTACCAACCCAACTGCATACCACAAGGCACCACTGACTAGACTTGCACTTCCATACACTGCACCACACAGAGTCTTGGCAACTGTGTACAACGGAAACTGCAAGTATGCAGGTGGATCACTGCCAAACGTGAGAGGAGACCTTCAGGTGCTGGCTCAGAAGGCAGCGAGACCACTGCCAACTTCTTTCAACTACGGTGCAATCAAGGCAACTAGAGTGACTGAACTGCTGTACAGAATGAAGAGAGCAGAGACTTACTGCCCTAGACCACTGTTGGCTGTTCATCCATCTGCTGCCAGACACAAACAGAAGATCGTTGCACCTGTCAAGCAGTCACTGAACTTCGATCTGCTGAAGCTGGCAGGAGATGTTGAGTCCAACCCTGGGTCTGGAGCACCACCAACTGACTTGCAGAAGATGGTCATGGGTAACACCAAGCCTGTTGAACTGATCCTTGATGGTAAGACCGTCGCAATCTGCTGCGCAACTGGAGTCTTCTCCACTGCATACCTGGTTCCTAGACATCTGTCTGCTGAGAAGTACGACAAGATCATGCTGGATGGTAGAACCATGACTGACTCTGACTACAGAGTGTTCGAGTTCGAGATCAAGGTCAAGGGACAGGATATGCTGTCTGATGCAGCACTGATGGTTCTGCACAGAGGAAACAGAGTGAGAGACATCACGAAGCACTTCAGAGACACTGCCAGAATGAAGAAGGGAACTCCTGTGGTTGGTGTGATCAACAACGCTGATGTGGGTAGACTGATCTTCTCTGGTGAGGCACTGACCTACAAGGACATCGTGGTGTGCATGGATGGTGACACTATGCCTGGACTGTTCGCATACAAGGCTGCAACCAAGGCTGGATACTGTGGTGGAGCTGTGCTTGCTAAGGATGGAGCTGACACCTTCATCGTTGGAACTCATTCTGCTGGAGGTAACGGAGTTGGATACTGCTCATGCGTGTCCAGATCCATGCTCCAGAAGATGAAGGCACACATCGATCCTGAACCACATCATGAGTAA
SEQ ID No:3
FMDV OJMS株P1-2A-3C的基因序列
ATGGGAGCAGGACAATCATCACCAGCAACTGGATCACAGAATCAATCAGGTAACACTGGTTCAATCATCAACAACTACTACATGCAACAGTACCAGAACTCAATGGACACTCAACTTGGTGACAATGCTATCTCTGGTGGTTCTAACGAAGGTTCAACTGACACTACTTCTACTCATACTACCAACACTCAGAACAACGACTGGTTCTCCAAGCTGGCTTCATCTGCATTCTCTGGTCTGTTC GGTGCACTTCTGGCTGACAAGAAGACTGAGGAGACTACTCTTCTGGAGGATCGTATCCTGACTACTCGTAACGGTCATACTACTTCTACTACTCAGTCTTCTGTGGGTGTCACTTACGGTTACGCAACTGCTGAGGACTTCGTTTCTGGTCCTAACACTTCTGGTCTTGAGACCAGAGTTGTGCAAGCTGAGAGATTCTTCAAGACTCATCTGTTCGACTGGGTCACTTCTGATCCATTCGGTAGATGCTACCTGCTGGAACTGCCTACTGACCACAAGGGTGTGTACGGTTCACTGACTGACTCCTACGCTTACATGAGAAACGGTTGGGATGTTGAGGTCACTGCTGTTGGTAATCAGTTCAATGGTGGTTGTCTGTTGGTTGCAATGGTTCCTGAACTGTGCTCCATTGACAAGAGAGAGCTGTACCAGCTGACTCTCTTCCCACATCAGTTCATCAATCCTAGAACCAACATGACTGCACACATCACTGTTCCATTCGTTGGTGTGAACAGATACGACCAGTACAAGGTGCACAAGCCTTGGACTCTGGTTGTGATGGTTGTTGCACCACTGACTGTGAACACTGAAGGTGCACCTCAGATCAAGGTGTATGCAAACATCGCACCTACTAACGTTCATGTTGCTGGTGAGTTCCCATCCAAGGAAGGTATCTTCCCTGTTGCTTGCTCTGATGGTTACGGTGGTCTGGTGACTACTGATCCTAAGACTGCTGATCCTGCATACGGTAAGGTGTTCAACCCACCTAGAAACATGTTGCCAGGTAGATTCACCAACTTCCTTGACGTTGCTGAGGCATGTCCAACCTTCCTGCACTTCGAAGGTGATGTTCCATACGTGACCACCAAGACCGACTCTGACAGAGTGCTTGCACAGTTCGACTTGTCACTGGCTGCAAAGCACATGTCCAACACTTTCCTTGCTGGTCTGGCACAGTACTACACCCAGTACTCTGGTACTATCAACCTGCATTTCATGTTCACTGGTCCTACTGACGCTAAGGCAAGATACATGATCGCATACGCACCACCTGGTATGGAACCACCTAAGACTCCTGAAGCAGCAGCACACTGCATCCATGCAGAGTGGGACACTGGTCTGAACTCCAAGTTCACCTTCTCCATCCCATACCTGTCTGCTGCTGACTACGCATACACTGCATCTGACGTTGCAGAGACCACTAACGTGCAGGGTTGGGTCTGTCTGTTTCAGATCACTCATGGTAAGGCTGATGGTGATGCACTGGTGGTGCTTGCTTCTGCTGGTAAGGACTTCGAACTGAGACTGCCTGTTGATGCTAGAACTCAGACTACCTCTACTGGTGAGTCTGCTGATCCTGTGACTGCTACTGTTGAGAACTATGGTGGTGAGACTCAGGTGCAGAGAAGACAACACACTGATGTCTCATTCATCTTGGACAGATTCGTGAAGGTGACTCCTAAGGACCAGATCAACGTGTTGGACCTGATGCAGACTCCTGCACACACTCTGGTTGGTGCACTGCTGAGAACTGCAACCTACTACTTCGCAGACCTTGAAGTGGCTGTGAAGCATGAAGGTAATCTGACCTGGGTTCCTAACGGTGCACCTGAGACTGCACTTGACAACACTACTAACCCTACTGCATACCACAAGGCACCACTGACCAGACTTGCACTGCCATACACTGCACCACACAGAGTCTTGGCAACTGTGTACAATGGTAACTGCAAGTACGGTAAGTCACCTGTGACTAACGTGAGAGGTGACAGACAAGTGTTGGCACAGAAGGCAGCTAGAACTCTGCCTACCTCATTCAACTATGGTGCTATCAAGGCAACTAGAGTGACTGAACTGCTGTACAGAATGAAGAGAGCTGAAACCTACTGTCCTAGACCACTGTTGGCTATCCATCCATCTGAAGCTAGACACAAGCAGAAGATCGTTGCACCTGTGAAGCAGCTGTTGAACTTCGATCTGCTCAAGTTGGCAGGTGATGTTGAGTCCAACCCTGGTTCTGGTGCACCACCTACTGACTTGCAGAAGATGGTGATGGGTAACACCAAGCCTGTTGAACTGATCCTGGATGGTAAGACTGTTGCTATCTGCTGTGCTACTGGTGTGTTCGGTACTGCATACCTTGTTCCTAGACATCTGTTCGCTGAGAAGTATGACAAGATCATGTTGGATGGTAGAGCCATGACTGACTCTGACTACAGAGTGTTCGAGTTCGAGATCAAGGTCAAGGGTCAGGATATGCTGTCTGATGCTGCACTGATGGTGCTTCACAGAGGTAACAGAGTCAGAGACATCACCAAGCACTTCAGAGACGTGGCTAGAATGAAGAAGGGAACTCCAGTCGTGGGTGTCATCAACAACGCTGATGTTGGTAGACTGATCTTCTCTGGTGAGGCACTGACCTACAAGGACATCGTGGTCTGCATGGATGGTGACACTATGCCTGGTCTGTTCGCATACAAGGCTGCTACCAAGGCTGGTTACTGTGGTGGTGCTGTTCTTGCCAAGGATGGTGCTGAGACCTTCATCGTTGGTACTCACTCTGCTGGTGGTAACGGTGTTGGTTACTGCTCCTGTGTCTCCAGATCCATGCTGCTGAAGATGAAGGCACACATCGACCCTGAGCCTCACCATGAGTAA
SEQ ID No:4
FMDV OJMS株P1-2A-3C[突变]的基因序列
ATGGGAGCAGGACAATCATCACCAGCAACTGGATCACAGAATCAATCAGGTAACACTGGTTCAATCATCAACAACTACTACATGCAACAGTACCAGAACTCAATGGACACTCAACTTGGTGACAATGCTATCTCTGGTGGTTCTAACGAAGGTTCAACTGACACTACTTCTACTCATACTACCAACACTCAGAACAACGACTGGTTCTCCAAGCTGGCTTCATCTGCATTCTCTGGTCTGTTCGGTGCACTTCTGGCTGACAAGAAGACTGAGGAGACTACTCTTCTGGAGGATCGTATCCTGACTACTCGTAACGGTCATACTACTTCTACTACTCAGTCTTCTGTGGGTGTCACTTACGGTTACGCAACTGCTGAGGACTTCGTTTCTGGTCCTAACACTTCTGGTCTTGAGACCAGAGTTGTGCAAGCTGAGAGATTCTTCAAGACTCATCTGTTCGACTGGGTCACTTCTGATCCATTCGGTAGATGCTACCTGCTGGAACTGCCTACTGACCACAAGGGTGTGTACGGTTCACTGACTGACTCCTACGCTTACATGAGAAACGGTTGGGATGTTGAGGTCACTGCTGTTGGTAATCAGTTCAATGGTGGTTGTCTGTTGGTTGCAATGGTTCCTGAACTGTGCTCCATTGACAAGAGAGAGCTGTACCAGCTGACTCTCTTCCCACATCAGTTCATCAATCCTAGAACCAACATGACTGCACACATCACTGTTCCATTCGTTGGTGTGAACAGATACGACCAGTACAAGGTGCACAAGCCTTGGACTCTGGTTGTGATGGTTGTTGCACCACTGACTGTGAACACTGAAGGTGCACCTCAGATCAAGGTGTATGCAAACATCGCACCTACTAACGTTCATGTTGCTGGTGAGTTCCCATCCAAGGAAGGTATCTTCCCTGTTGCTTGCTCTGATGGTTACGGTGGTCTGGTGACTACTGATCCTAAGACTGCTGATCCTGCATACGGTAAGGTGTTCAACCCACCTAGAAACATGTTGCCAGGTAGATTCACCAACTTCCTTGACGTTGCTGAGGCATGTCCAACCTTCCTGCACTTCGAAGGTGATGTTCCATACGTGACCACCAAGACCGACTCTGACAGAGTGCTTGCACAGTTCGACTTGTCACTGGCTGCAAAGCACATGTCCAACACTTTCCTTGCTGGTCTGGCACAGTACTACACCCAGTACTCTGGTACTATCAACCTGCATTTCATGTTCACTGGTCCTACTGACGCTAAGGCAAGATACATGATCGCATACGCACCACCTGGTATGGAACCACCTAAGACTCCTGAAGCAGCAGCACACTGCATCCATGCAGAGTGGGACACTGGTCTGAACTCCAAGTTCACCTTCTCCATCCCATACCTGTCTGCTGCTGACTACGCATACACTGCATCTGACGTTGCAGAGACCACTAACGTGCAGGGTTGGGTCTGTCTGTTTCAGATCACTCATGGTAAGGCTGATGGTGATGCACTGGTGGTGCTTGCTTCTGCTGGTAAGGACTTCGAACTGAGACTGCCTGTTGATGCTAGAACTCAGACTACCTCTACTGGTGAGTCTGCTGATCCTGTGACTGCTACTGTTGAGAACTATGGTGGTGAGACTCAGGTGCAGAGAAGACAACACACTGATGTCTCATTCATCTTGGACAGATTCGTGAAGGTGACTCCTAAGGACCAGATCAACGTGTTGGACCTGATGCAGACTCCTGCACACACTCTGGTTGGTGCACTGCTGAGAACTGCAACCTACTACTTCGCAGACCTTGAAGTGGCTGTGAAGCATGAAGGTAATCTGACCTGGGTTCCTAACGGTGCACCTGAGACTGCACTTGACAACACTACTAACCCTACTGCATACCACAAGGCACCACTGACCAGACTTGCACTGCCATACACTGCACCACACAGAGTCTTGGCAACTGTGTACAATGGTAACTGCAAGTACGGTAAGTCACCTGTGACTAACGTGAGAGGTGACAGACAAGTGTTGGCACAGAAGGCAGCTAGAACTCTGCCTACCTCATTCAACTATGGTGCTATCAAGGCAACTAGAGTGACTGAACTGCTGTACAGAATGAAGAGAGCTGAAACCTACTGTCCTAGACCACTGTTGGCTATCCATCCATCTGAAGCTAGACACAAGCAGAAGATCGTTGCACCTGTGAAGCAGCTGTTGAACTTCGATCTGCTCAAGTTGGCAGGTGATGTTGAGTCCAACCCTGGTTCTGGTGCACCACCTACTGACTTGCAGAAGATGGTGATGGGTAACACCAAGCCTGTTGAACTGATCCTGGATGGTAAGACTGTTGCTATCTGCTGTGCTACTGGTGTGTTCTCTACTGCATACCTTGTTCCTAGACATCTGTCTGCTGAGAAGTATGACAAGATCATGTTGGATGGTAGAGCCATGACTGACTCTGACTACAGAGTGTTCGAGTTCGAGATCAAGGTCAAGGGTCAGGATATGCTGTCTGATGCTGCACTGATGGTGCTTCACAGAGGTAACAGAGTCAGAGACATCACCAAGCACTTCAGAGACGTGGCTAGAATGAAGAAGGGAACTCCAGTCGTGGGTGTCATCAACAACGCTGATGTTGGTAGACTGATC TTCTCTGGTGAGGCACTGACCTACAAGGACATCGTGGTCTGCATGGATGGTGACACTATGCCTGGTCTGTTCGCATACAAGGCTGCTACCAAGGCTGGTTACTGTGGTGGTGCTGTTCTTGCCAAGGATGGTGCTGAGACCTTCATCGTTGGTACTCACTCTGCTGGTGGTAACGGTGTTGGTTACTGCTCCTGTGTCTCCAGATCCATGCTGCTGAAGATGAAGGCACACATCGACCCTGAGCCTCACCATGAGTAA
SEQ ID No:5
FMDV O/BY/CHA/2010株P1-2A-3C基因编码的氨基酸序列
MGAGQSSPATGSQNQSGNTGSIINNYYMQQYQNSMDTQLGDNAISGGSNEGSTDTTSTHTTNTQNNDWFSKLASSAFSGLFGALLADKKTEETTLLEDRILTTRNGHTTSTTQSSVGITHGYATAEDFVNGPNTSGLETRVVQAERFFKTHLFDWVTSDPFGRCYLLELPTDHKGVYGSLTDSYAYMRNGWDVEVTAVGNQFNGGCLLVAMVPELCSIERRELFQLTLFPHQFINPRTNMTAHIKVPFVGVNRYDQYKVHKPWTLVVMVVAPLTVNTEGAPQIKVYANIAPTNVHVAGEFPSKEGIFPVACSDGYGGLVTTDPKTADPVYGKVFNPPRNMLPGRFTNLLDVAEACPTFLHFDGDVPYVTTKTDSDRVLAQFDLSLAAKHMSNTFLAGLAQYYTQYSGTVNLHFMFTGPTDAKARYMIAYAPPGMEPPKTPEAAAHCIHAEWDTGLNSKFTFSIPYLSAADYAYTASDAAETTNVQGWVCLFQITHGKAEGDALVVLASAGKDFELRLPVDARQQTTSTGESADPVTATVENYGGETQVQRRHHTDVSFILDRFVKVTPKDSINVLDLMQTPSHTLVGALLRTATYYFADLEVAVKHEGDLTWVPNGAPEAALDNTTNPTAYHKAPLTRLALPYTAPHRVLATVYNGNCKYAGGSLPNVRGDLQVLAQKAARPLPTSFNYGAIKATRVTELLYRMKRAETYCPRPLLAVHPSAARHKQKIVAPVKQSLNFDLLKLAGDVESNPGSGAPPTDLQKMVMGNTKPVELILDGKTVAICCATGVFGTAYLVPRHLFAEKYDKIMLDGRTMTDSDYRVFEFEIKVKGQDMLSDAALMVLHRGNRVRDITKHFRDTARMKKGTPVVGVINNADVGRLIFSGEALTYKDIVVCMDGDTMPGLFAYKAATKAGYCGGAVLAKDGADTFIVGTHSAGGNGVGYCSCVSRSMLQKMKAHIDPEPHHE
SEQ ID No:6
FMDV O/BY/CHA/2010株P1-2A-3C[突变]基因编码的氨基酸序列
MGAGQSSPATGSQNQSGNTGSIINNYYMQQYQNSMDTQLGDNAISGGSNEGSTDTTSTHTTNTQNNDWFSKLASSAFSGLFGALLADKKTEETTLLEDRILTTRNGHTTSTTQSSVGITHGYATAEDFVNGPNTSGLETRVVQAERFFKTHLFDWVTSDPFGRCYLLELPTDHKGVYGSLTDSYAYMRNGWDVEVTAVGNQFNGGCLLVAMVPELCSIERRELFQLTLFPHQFINPRTNMTAHIKVPFVGVNRYDQYKVHKPWTLVVMVVAPLTVNTEGAPQIKVYANIAPTNVHVAGEFPSKEGIFPVACSDGYGGLVTTDPKTADPVYGKVFNPPRNMLPGRFTNLLDVAEACPTFLHFDGDVPYVTTKTDSDRVLAQFDLSLAAKHMSNTFLAGLAQYYTQYSGTVNLHFMFTGPTDAKARYMIAYAPPGMEPPKTPEAAAHCIHAEWDTGLNSKFTFSIPYLSAADYAYTASDAAETTNVQGWVCLFQITHGKAEGDALVVLASAGKDFELRLPVDARQQTTSTGESADPVTATVENYGGETQVQRRHHTDVSFILDRFVKVTPKDSINVLDLMQTPSHTLVGALLRTATYYFADLEVAVKHEGDLTWVPNGAPEAALDNTTNPTAYHKAPLTRLALPYTAPHRVLATVYNGNCKYAGGSLPNVRGDLQVLAQKAARPLPTSFNYGAIKATRVTELLYRMKRAETYCPRPLLAVHPSAARHKQKIVAPVKQSLNFDLLKLAGDVESNPGSGAPPTDLQKMVMGNTKPVELILDGKTVAICCATGVFSTAYLVPRHLSAEKYDKIMLDGRTMTDSDYRVFEFEIKVKGQDMLSDAALMVLHRGNRVRDITKHFRDTARMKKGTPVVGVINNADVGRLIFSGEALTYKDIVVCMDGDTMPGLFAYKAATKAGYCGGAVLAKDGADTFIVGTHSAGGNGVGYCSCVSRSMLQKMKAHIDP EPHHE
SEQ ID No:7
FMDV OJMS株P1-2A-3C基因编码的氨基酸序列
MGAGQSSPATGSQNQSGNTGSIINNYYMQQYQNSMDTQLGDNAISGGSNEGSTDTTSTHTTNTQNNDWFSKLASSAFSGLFGALLADKKTEETTLLEDRILTTRNGHTTSTTQSSVGVTYGYATAEDFVSGPNTSGLETRVVQAERFFKTHLFDWVTSDPFGRCYLLELPTDHKGVYGSLTDSYAYMRNGWDVEVTAVGNQFNGGCLLVAMVPELCSIDKRELYQLTLFPHQFINPRTNMTAHITVPFVGVNRYDQYKVHKPWTLVVMVVAPLTVNTEGAPQIKVYANIAPTNVHVAGEFPSKEGIFPVACSDGYGGLVTTDPKTADPAYGKVFNPPRNMLPGRFTNFLDVAEACPTFLHFEGDVPYVTTKTDSDRVLAQFDLSLAAKHMSNTFLAGLAQYYTQYSGTINLHFMFTGPTDAKARYMIAYAPPGMEPPKTPEAAAHCIHAEWDTGLNSKFTFSIPYLSAADYAYTASDVAETTNVQGWVCLFQITHGKADGDALVVLASAGKDFELRLPVDARTQTTSTGESADPVTATVENYGGETQVQRRQHTDVSFILDRFVKVTPKDQINVLDLMQTPAHTLVGALLRTATYYFADLEVAVKHEGNLTWVPNGAPETALDNTTNPTAYHKAPLTRLALPYTAPHRVLATVYNGNCKYGKSPVTNVRGDRQVLAQKAARTLPTSFNYGAIKATRVTELLYRMKRAETYCPRPLLAIHPSEARHKQKIVAPVKQLLNFDLLKLAGDVESNPGSGAPPTDLQKMVMGNTKPVELILDGKTVAICCATGVFGTAYLVPRHLFAEKYDKIMLDGRAMTDSDYRVFEFEIKVKGQDMLSDAALMVLHRGNRVRDITKHFRDVARMKKGTPVVGVINNADVGRLIFSGEALTYKDIVVCMDGDTMPGLFAYKAATKAGYCGGAVLAKDGAETFIVGTHSAGGNGVGYCSCVSRSMLLKMKAHIDPEPHHE
SEQ ID No:8
FMDV OJMS株P1-2A-3C[突变]基因编码的氨基酸序列
MGAGQSSPATGSQNQSGNTGSIINNYYMQQYQNSMDTQLGDNAISGGSNEGSTDTTSTHTTNTQNNDWFSKLASSAFSGLFGALLADKKTEETTLLEDRILTTRNGHTTSTTQSSVGVTYGYATAEDFVSGPNTSGLETRVVQAERFFKTHLFDWVTSDPFGRCYLLELPTDHKGVYGSLTDSYAYMRNGWDVEVTAVGNQFNGGCLLVAMVPELCSIDKRELYQLTLFPHQFINPRTNMTAHITVPFVGVNRYDQYKVHKPWTLVVMVVAPLTVNTEGAPQIKVYANIAPTNVHVAGEFPSKEGIFPVACSDGYGGLVTTDPKTADPAYGKVFNPPRNMLPGRFTNFLDVAEACPTFLHFEGDVPYVTTKTDSDRVLAQFDLSLAAKHMSNTFLAGLAQYYTQYSGTINLHFMFTGPTDAKARYMIAYAPPGMEPPKTPEAAAHCIHAEWDTGLNSKFTFSIPYLSAADYAYTASDVAETTNVQGWVCLFQITHGKADGDALVVLASAGKDFELRLPVDARTQTTSTGESADPVTATVENYGGETQVQRRQHTDVSFILDRFVKVTPKDQINVLDLMQTPAHTLVGALLRTATYYFADLEVAVKHEGNLTWVPNGAPETALDNTTNPTAYHKAPLTRLALPYTAPHRVLATVYNGNCKYGKSPVTNVRGDRQVLAQKAARTLPTSFNYGAIKATRVTELLYRMKRAETYCPRPLLAIHPSEARHKQKIVAPVKQLLNFDLLKLAGDVESNPGSGAPPTDLQKMVMGNTKPVELILDGKTVAICCATGVFSTAYLVPRHLSAEKYDKIMLDGRAMTDSDYRVFEFEIKVKGQDMLSDAALMVLHRGNRVRDITKHFRDVARMKKGTPVVGVINNADVGRLIFSGEALTYKDIVVCMDGDTMPGLFAYKAATKAGYCGGAVLAKDGAETFIVGTHSAGGNGVGYCSCVSRSMLLKMKAHIDPEPHHE
基因工程细胞发酵方法
本发明提供一种重组病毒样颗粒(VLPs)在毕赤酵母胞内表达的发酵工艺，以解决发酵工艺中胞内重组蛋白表达量低的问题。
优选地，本发明的发酵方法技术方案如下：
(1)一级种子制备：将冻干菌种或经平板活化的菌种接入一级种子培养基(30ml/250ml)中，使用振荡式恒温调速摇床进行培养，控制转速220rpm，培养温度28℃，初始pH值自然，培养时间21-23小时，到达对数生长期。
(2)二级种子制备：将一级种子培养液按1％的比例转种于二级摇瓶种子培养基(200ml/1000ml)中，使用振荡式恒温调速摇床进行培养，控制转速220rpm，培养温度28℃，初始pH值自然，培养时间21-23小时，到达对数生长期。
(3)发酵工艺：将二级种子培养液按10％的比例转接于发酵罐(20L/42L)中，通过调节搅拌转速和通气量，控制溶解氧在30±10％，控制温度为28±1℃，通过补加氨水控制pH 5.0±0.1，控制搅拌转速300～600rpm，适时添加补料，发酵培养46-50小时。
(4)菌体生长阶段：发酵培养进行到18-19小时，待甘油残余量为0～10g/L，以10-70g/(L.h)的流速补加500ml/L的甘油补料液(含12ml/L PTM1诱导液)，维持发酵液中的甘油残量为2-15g/L。
(5)产物生产阶段：发酵培养进行到29-31小时，菌体湿重达到380g/L-410g/L时，进行饥饿处理2小时后，以1-7g/(L.h)的流速补加纯甲醇(含12ml/L PTM1诱导液)诱导产PCV2Cap VLPs，诱导14-17小时。
在另一优选例中，所述一级和二级种子培养基的组成为(g/L)：含蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20，pH自然。
在另一优选例中，所述发酵培养基的组成为：40g/L甘油，0.93g/L CaSO4，18.2g/LK2SO4，14.9g/L MgSO4，4.13g/L KOH，10g/L(NH4)2SO4，26.7ml/L85％的磷酸，4.35ml/LPTM1。
在另一优选例中，所述PTM1诱导液的组成为：CuSO4·5H2O 6g/L，NaI 0.08g/L，MnSO4·H2O 3.0g/L，Na2MoO4·2H2O 0.2g/L，H3BO3 0.02g/L，CoCl2 0.5g/L，ZnCl2 20.0g/L，FeSO4·7H2O 65.0g/L，生物素0.2g/L，H2SO4 5ml/L。
在另一优选例中，所述的甘油残余量的测定方法，包括步骤：取一定量发酵液12000rpm离心2min，将获得的1ml发酵液上清液、9ml纯化水，加入酚酞指示剂，用NaOH(0.05M)滴定至变色，然后和10ml高碘酸钠(0.1M)混合，暗反应5min；在反应后的溶液中加入5ml乙二醇(25％)，摇匀后暗反应5min；反应结束后用NaOH(0.05M)滴定至变色，变色程度与前次变色程度相当，记录后一次NaOH消耗体积V(ml)；甘油残余量(g/L)＝4.6*V。
本发明采用诱导控制工艺结合恒定溶氧控制工艺、pH控制工艺、补料分批发酵控制工艺，提高了目的蛋白的胞内表达量。
组合物和施用方法
本发明还提供了一种组合物，它含有：(i)本发明的重组病毒样颗粒(VLPs)或本发明的可编码重组病毒样颗粒的多核苷酸，以及(ii)药学上或免疫学上可接受的赋形剂或佐剂。
本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于或存在于本发明的组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本发明的组合物包括药物组合物和疫苗组合物。
本发明的组合物可以是单价的(仅含有一种重组病毒样颗粒或多核苷酸)，也可以是多价的(含有多种重组病毒样颗粒或多核苷酸)。
本发明的药物组合物或疫苗组合物可制备成各种常规剂型，其中包括(但并不限于)：注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。
(1)药物组合物
本发明的药物组合物包含(或含有)治疗有效量的本发明重组病毒样颗粒或多核苷酸。
本文所用的术语“治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量。
为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.001毫克/千克至1000毫克/千克，较佳地约0.01毫克/千克至100毫克/千克体重的重组病毒样颗粒。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如本发明的重组病毒样颗粒)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体或赋形剂的充分讨论。
组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。
(ii)疫苗组合物
本发明的疫苗(组合物)可以是预防性的(即预防疾病)或治疗性的(即在患病后治疗疾病)。
这些疫苗包含免疫性抗原(包括本发明重组病毒样颗粒)，并且通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。另外，抗原也可以和细菌类毒素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。
增强免疫组合物效果的优选佐剂包括但不限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油型乳剂配方，例如，(a)MF59(参见WO90/14837)，(b)SAF，和(c)RibiTM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，(3)皂素佐剂；(4)Freund完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA)；(5)细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(6)细菌ADP-核糖基化毒素(如大肠杆菌热不稳定毒素LT)的脱毒变异体；以及(7)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。
包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(例如，可包括抗原、药学上可接受的载体以及佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。
更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫学有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量可根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如人)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。
通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，以增强佐剂效果。
此外，本发明的疫苗组合物可以是单价的或多价疫苗。
(ii i)给药途径和剂量
一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待治疗的对象可以是哺乳动物，尤其是人。
当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的重组病毒样颗粒直接施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。
给予本发明药物组合物或疫苗组合物的途径包括(但并不限于)：肌内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要，可以组合给药途径，或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。
应以“有效量”给予重组病毒样颗粒疫苗，即重组病毒样颗粒的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗相关的疾病。
代表性的疾病包括(但并不限于)：口蹄疫。
在各疫苗剂份中所选用的重组病毒样颗粒的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，在感染宿主细胞后，各剂的疫苗足以含有约1μg-1000mg，较佳地为1μg-100mg，更佳地10μg-50mg蛋白质。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量。可通过监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。
优选方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。
此外，本发明的疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予，或者与其他治疗剂一起给予。
本发明的主要优点包括：
(a)VLPs不具有感染性和复制能力，无散毒的危险，比传统减毒活疫苗更安全；
(b)本发明的VLPs能够刺激机体产生针对FMDV的特异性体液免疫和细胞免疫应答，可以起到有效预防口蹄疫病毒的效果。
(c)酵母表达系统兼具真核表达系统和原核表达系统的优点，能够对其表达的蛋白进行正确的加工折叠，且操作简单，制备过程无需P3安全防护,易大规模发酵,成本低廉；
(d)本发明的VLPs不包含口蹄疫病毒的非结构蛋白，不会存在如传统口蹄疫疫苗一样在制备过程中非结构蛋白去除不彻底，从而造成很难区分自然感染及人工免疫的问题。
(d)本发明的VLPs是利用FMDV的3C为蛋白酶模拟天然口蹄疫病毒的加工方式，获得正确加工折叠、正确组装的且与天然病毒颗粒相似VLPs。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
通用材料
重组毕赤酵母构建所用材料如下：
菌株：大肠杆菌Top10(购自Invirtrogen公司)；毕赤酵母KM71(购自Invirtrogen公司)；
质粒：pPIC3.5K(mc)(购自Invirtrogen公司)；
抗原基因：P12A3C(MYA98)(即：P12A3C(O/BY/CHA/2010))；P12A3C-m(MYA98)(即：P12A3C-m(O/BY/CHA/2010))；P12A3C(OJMS)；P12A3C-m(OJMS)(均为人工合成)；
试剂：TIANprep Mini Plasmid Kit、TIANgel Midi Purification Kit(TIANGEN公司)；
限制性内切酶、pfu酶、DNA连接酶(Fermatas公司)；
抗体：一抗为anti FMDV VP1抗体(购自Biorbyt公司)；二抗为山羊抗兔IgG(购自Abcam公司)；
实施例1
P12A3C(MYA98)(即：P12A3C(O/BY/CHA/2010))重组毕赤酵母的构建及VLPs的表达
将目的片段多次插入表达质粒pPIC3.5K中，构建多拷贝重组质粒，具体步骤如下：
1.pP12A3C(MYA98)1copy的构建
1.1获得酶切后的载体(μL)(限制性内切酶及反应缓冲液均为Fermentas公司产品)
混匀后，37℃反应2小时。酶切产物仅9.4kb一条带，回收该片段，并用核酸胶回收试剂盒TIANgel Midi Purification Kit(TIANGEN公司)纯化，得到40μL产物。
1.2获得酶切后的插入片段(μL)(限制性内切酶及反应缓冲液均为Fermentas公司产品)
混匀后，37℃反应1小时。酶切产物回收大小为3Kb左右的片段，用核酸胶回收试剂盒TIANgel Midi Purification Kit(TIANGEN公司)纯化，得到35μL产物。
1.3片段和载体的连接(μL)(连接酶及反应缓冲液均为Fermentas公司产品)
混匀后，22℃反应4小时,移至冰浴终止反应，从而获得连接产物，即质粒pP12A3C(MYA98)。
1.4重组质粒的转化
取20μL连接产物，加到50μL感受态细胞(E.coli Top10)中，轻弹混匀，冰浴30分钟→42℃水浴1.5分钟→立即至冰浴2分钟→加入250μL LB培养液，置37℃水浴培养30分钟→将菌液涂布于LB(AMP+)平板上→37℃培养过夜→第二天从阳性平板挑取诺干个克隆，接种于2.5ml LB(AMP+)液体培养基试管37℃,250rpm摇床培养过夜，以扩增阳性克隆。
1.5阳性重组克隆的鉴定
将所挑取的克隆用质粒抽提试剂盒TIANprep Mini Plasmid kit(TIANGEN公司)抽提质粒，然后对所抽得的质粒进行双酶切。
酶切反应体系(μL)
样品 10×缓冲液O EcoRI NotI
8 1 0.5 0.5
混匀后，37℃反应1.5小时。电泳鉴定，有目的条带P12A3C(MYA98)约3000bp的为阳性克隆，并送阳性克隆测序，对测序结果正确的阳性克隆.进行扩增并保种(含50％甘油的LB培养基，-80℃保存)，得到了pP12A3C(MYA98)1copy重组克隆。
2.pP12A3C(MYA98)2copy的构建
2.1pP12A3C(MYA98)1copy酶切处理(μL)(限制性内切酶及反应缓冲液均为Fermentas公司产品)
混匀后，37℃反应2小时。酶切产物切胶回收，大片段双酶切后只有一条片段约12.4kb，回收该片段；小片段样品酶切后有三条片段(2.4kb、5.3kb、4.3kb),切胶回收4.3kb片段，用核酸胶回收试剂盒TIANgel Midi Purification Kit(TIANGEN公司)对回收的片段进行纯化，得到40μL产物。
2.2大片段与小片段的连接(μL)(连接酶及反应缓冲液均为Fermentas公司产品)
混匀后，22℃反应3小时,移至冰浴终止反应，从而获得连接产物，即质粒pP12A3C(MYA98)2copy。
2.3重组质粒的转化
详见实施例1,1.4。
2.4阳性重组克隆的鉴定
将所挑取的克隆用质粒抽提试剂盒TIANprep Mini Plasmid kit(TIANGEN公司)抽提质粒，然后对所抽得的质粒进行电泳与单拷贝质粒pP12A3C(MYA98)1copy的大小进行对比，挑选出，大小大于单拷贝质粒的克隆，对这些初筛到的阳性克隆进行多组双酶切鉴定。
酶切反应体系(μL)
混匀后，37℃反应1.5小时。电泳鉴定，酶切1电泳结果有三条片段(2.5kb、5.3kb、8.3kb)；酶切2电泳结果有三条片段(2.5kb、1.1kb、12.4kb)；酶切3电泳结果有二条片段(4kp、12kb)；酶切4电泳结果有三条片段(2.5kb、5.3kb、8.3kb)；酶切5电泳结果有二条片段(4kp、12kb)，符合多组双酶切结果的为阳性克隆。送阳性克隆测序，测序结果正确的阳性克隆，进行扩增并保种(含50％甘油的LB培养基，-80℃保存)，得到了pP12A3C(MYA98)2copy重组克隆。
3.pP12A3C(MYA98)4copy的构建
3.1pP12A3C(MYA98)2copy酶切处理(μL)(限制性内切酶及反应缓冲液均为Fermentas公司产品)
混匀后，37℃反应2小时。酶切产物切胶回收，大片段双酶切后只有一条片段约16.4kb，回收该片段；小片段样品双酶切后有三条片段(2.4kb、5.3kb、8.2kb),切胶回收8.2kb片段，用核酸胶回收试剂盒TIANgel Midi Purification Kit(TIANGEN公司)对回收的片段进行纯化，得到40μL产物。
3.2大片段与小片段的连接(μL)(连接酶及反应缓冲液均为Fermentas公司产品)
混匀后，22℃反应3小时,移至冰浴终止反应，从而获得连接产物，即质粒pP12A3C(MYA98)2c。
3.3重组质粒的转化
详见实施例1,1.4。
3.4阳性重组克隆的鉴定
将所挑取的克隆用质粒抽提试剂盒TIANprep Mini Plasmid kit(TIANGEN公司)抽提质粒，然后对所抽得的质粒进行电泳与单拷贝质粒pP12A3C(MYA98)2copy的大小进行对比，挑选出，大小大于单拷贝质粒的克隆，对这些初筛到的阳性克隆进行多组双酶切鉴定。
酶切反应体系(μL)
混匀后，37℃反应1.5小时。电泳鉴定，酶切1电泳结果有三条片段(2.5kb、5.3kb、16.6kb)；酶切2电泳结果有三条片段(2.5kb、1.1kb、20kb)；酶切3电泳结果有二条片段(4kp、20kb)；酶切4电泳结果有三条片段(2.5kb、8.3kb、16.6kb)；酶切5电泳结果有二条片段(4kp、20kb)，符合多组双酶切结果的为阳性克隆。送阳性克隆测序，测序结果正确的阳性克隆，进行扩增并保种(含50％甘油的LB培养基，-80℃保存)，得到了pP12A3C(MYA98)4copy重组克隆。
4.重组P12A3C(MYA98)4copy毕赤酵母的构建
4.1pP12A3C(MYA98)4copy质粒线性化(μL)
待电转质粒 10×Tango缓冲液 Kpn2I ddH<sub>2</sub>O
25 10 4 61
混匀后，55℃反应4小时。电泳观察酶切完全后，酶切产物用酚-氯仿抽提后，无水乙醇沉淀过夜，用20μL Tris-Cl(10mM,pH8.0)或ddH2O复溶，获得纯化的线性质粒pP12A3C(MYA98)4copy。
4.2转化毕赤酵母
准备50ml对数生长期毕赤酵母KM71,离心后菌体沉淀用冰浴的ddH2O洗2次，再用冰浴的1M山梨醇洗一遍，最后用300μL 1M山梨醇重悬菌体，轻吹重悬，获得酵母感受态细胞，注意操作过程始终保证冰浴。
组别 样品 酵母感受态细胞
空白对照 Tris-Cl(10mM,pH8.0)或ddH<sub>2</sub>O 20μL 80μL
空载对照 线性化pPIC3.5K(mc)20μL 80μL
P12A3C(MYA98)4copy 线性化pP12A3C(MYA98)4copy 20μL 80μL
取80μL酵母感受态细胞与20μL线性化质粒pP12A3C(MYA98)4copy混匀，冰浴5分钟，进行电击(1500V,5ms)，电击完毕，立刻加入1ml预冷的1M山梨醇,轻吹混匀，全部移至MD平板上，铺匀，吹干，28℃静置培养，直至长出克隆。
空白对照板应无克隆长出，空载对照板和样品板均会有克隆长出。
4.3重组酵母克隆筛选、扩增及诱导表达
从转化后的MD板上，挑取诺干单克隆均匀依次点于新的MD板上，继续于28℃静置培养使得克隆增大。于24孔板中加入1ml YPD培养基，接种所挑选的克隆，28℃、230rpm摇床培养扩增，第二天以1:100比例转接克隆于新24孔板(每孔含3ml BMGY培养基)28℃、230rpm摇床培养过夜，使酵母达对数生长期(OD600＝2～6)，离心去上清，更换BMMY培养基1ml/孔，甲醇浓度为1％-1.5％，28℃、230rpm诱导表达3天，并每天补加甲醇1.0％。
4.4重组毕赤酵母克隆鉴定
收获菌体，用600-800μL将菌体进行瓷珠震荡破碎后，12000rpm离心2分钟收上清，获得酵母胞内表达样品，对样品进行Western-blot分析，一抗为Biorbyt公司的兔抗FMDVVP1抗体，二抗为Abcam公司的山羊抗兔IgG。
Western Blot结果如图1所示，阳性样品在23kDa处有特异性条带。将阳性克隆保种(含20％甘油的YPD培养基，-80℃保存)，得到了重组毕赤酵母P12A3C-(MYA98)克隆。
5.VLPs的表达及电镜观察
5.1样品制备
2ml YPD培养基中接种活化后的重组毕赤酵母P12A3C-(MYA98)克隆，28℃、230rpm摇床培养扩增，第二天以1:100比例转接克隆于150ml BMGY培养基28℃、230rpm摇床培养过夜，使酵母达对数生长期(OD600＝2～6)，离心去上清，更换为50mlBMMY培养基(甲醇浓度为1％-1.5％)，28℃、230rpm诱导表达3天，并每天补加甲醇1.0％，第三天收获菌体，每毫升菌体用600μL PBS重悬，进行瓷珠震荡破碎后，12000rpm离心2分钟收上清，收获表达产物VLPs(MYA98)。
5.2电镜样品准备
准备蔗糖梯度(4ml 15％和4ml 45％),上层加入4ml破菌样品，20000rpm,4℃离心4小时。吸取乳白色区带，经纯水透析过夜，获得初纯的目的样品VLPs(MYA98)。
5.3电镜观察VLPs
用1％的磷钨酸(pH6.8)对样品进行负染，用透射电子显微镜观察拍照
电镜观察结果如图2(A)所示。结果表明，获得了与天然口蹄疫病毒相似的正确折叠的VLP。
实施例2.P12A3C(MYA98)-m(即：P12A3C-[突变](O/BY/CHA/2010))重组毕赤酵母的构建及VLPs的表达
采用与实施例1类似的方法构建P12A3C(MYA98)-m重组毕赤酵母。
Western Blot结果如图1所示，电镜观察结果如图2(B)所示。结果表明，获得了与天然口蹄疫病毒相似的正确折叠的VLP。
实施例3.P12A3C(OJMS)(即：P12A3C(OJMS))重组毕赤酵母的构建及VLPs的表达
采用与实施例1类似的方法构建P12A3C(OJMS)重组毕赤酵母。
Western Blot结果如图3所示，电镜观察结果如图4(A)所示。结果表明，获得了与天然口蹄疫病毒相似的正确折叠的VLP。
实施例4.P12A3C-m(OJMS)(即：P12A3C-[突变](OJMS))重组毕赤酵母的构建及VLPs的表达
采用与实施例1类似的方法构建P12A3C-m(OJMS)重组毕赤酵母。
Western Blot结果如图3所示，电镜观察结果如图4(B)所示。结果表明，获得了与天然口蹄疫病毒相似的正确折叠的VLP。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白从N端至C端具有式I结构：
P1－2A－3C (I)
式中，
P1为口蹄疫病毒外壳结构蛋白VP元件，
2A为非结构蛋白2A蛋白酶，
3C为非结构蛋白3C蛋白酶，
其中，所述P1-2A元件可在3C蛋白酶的酶切作用下，形成VP0蛋白、VP3蛋白和VP1蛋白。
2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的融合蛋白。
3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸是经密码子优化的多核苷酸。
4.一种基因工程细胞，其特征在于，所述基因工程细胞为真核细胞，并且所述细胞的基因组中整合有口蹄疫病毒外壳蛋白的表达盒；或者所述细胞中含有表达载体，所述表达载体含有所述口蹄疫病毒外壳蛋白的表达盒；
其中，所述的表达盒表达权利要求1所得的融合蛋白，
并且所述基因工程细胞在胞内表达所述外壳蛋白，且所述外壳蛋白在所述基因工程细胞内部形成病毒样颗粒(VLPs)。
5.如权利要求4所述的细胞，其特征在于，所述的病毒样颗粒由VP0蛋白、VP3蛋白和VP1蛋白形成。
6.如权利要求4所述的细胞，其特征在于，所述病毒为口蹄疫病毒O型，较佳地为FMDVO/BY/CHA/2010株口蹄疫病毒、或OJMS株口蹄疫病毒。
7.如权利要求4所述的细胞，其特征在于，所述细胞为酵母细胞，优选为毕赤酵母细胞，更优选为毕赤酵母KM71菌株。
8.如权利要求4所述的细胞，其特征在于，所述3C蛋白酶包括突变的3C蛋白酶，较佳地，所述3C蛋白酶的第38位的甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)，且第48位的苯丙氨酸(F)突变为丝氨酸(S)。
9.一种病毒样颗粒(VLPs)，其特征在于，所述VLPs由权利要求4所述的基因工程细胞表达。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求9所述的病毒样颗粒，和药学上可以接受的载体。
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