CN117210501A - 口蹄疫病毒2b蛋白免疫抑制位点突变的重组口蹄疫病毒株的构建 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及口蹄疫病毒2B蛋白免疫抑制位点突变的重组口蹄疫病毒株的构建。本发明首先发现了口蹄疫病毒2B蛋白的第105位氨基酸是抑制STING蛋白表达的关键位点，将2B蛋白的第105位氨基酸突变为A后，促进了STING蛋白的表达；其次，本发明将2B蛋白的第105位氨基酸突变为A构建并成功拯救获得了口蹄疫病毒2B蛋白的免疫抑制位点突变的口蹄疫重组病毒株rFMDV‑2B K105A，与野生型FMDV相比，rFMDV‑2B K105A的毒价显著降低，毒力降低，且抑制STING表达的能力降低同时诱导IFN‑β表达的能力显著增加，可作为重组疫苗株，具备良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及口蹄疫病毒2B蛋白免疫抑制位点突变的重组口蹄疫病毒株的构建。
背景技术
口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的传染病。FMDV属于微核糖核酸病毒科(picornaviridae)口蹄疫病毒属(aphthavirus)的成员，目前有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3(即南非口蹄疫病毒1、2、3型)和Asia1(亚洲1型)7个血清型。各型之间几乎没有免疫保护力，感染了一型口蹄疫的动物仍可感染另一型口蹄疫病毒而发病。
口蹄疫病毒2B是一个非结构蛋白，2B蛋白定位于细胞质，是个多功能蛋白，具有增加细胞膜通透性和诱导细胞自噬的功能，其羧基末端可与多种宿主膜蛋白相互作用，在病毒感染过程中发挥着重要作用。
本发明发现了口蹄疫病毒2B蛋白的第105位氨基酸是抑制STING蛋白表达的关键位点，将2B蛋白的第105位氨基酸突变为A后，促进了STING蛋白的表达，制备了减毒的重组口蹄疫病毒株，为口蹄疫疫苗的制备提供另一种思路，具备良好的应用前景。
发明内容
针对上述技术问题，本发明首先发现了口蹄疫病毒2B蛋白的第105位氨基酸是抑制STING蛋白表达的关键位点，将2B蛋白的第105位氨基酸突变为A后，促进了STING蛋白的表达；其次，本发明将2B蛋白的第105位氨基酸突变为A构建并成功拯救获得了口蹄疫病毒2B蛋白的免疫抑制位点突变的口蹄疫重组病毒株rFMDV-2B K105A，与野生型FMDV相比，rFMDV-2B K105A的毒价显著降低，毒力降低，且抑制STING表达的能力降低同时诱导IFN-β表达的能力显著增加，可作为重组疫苗株。具体包括以下内容：
第一方面，本发明提供了一种通过抑制口蹄疫病毒2B蛋白的免疫抑制功能制备口蹄疫重组病毒的应用，所述抑制口蹄疫病毒2B蛋白的免疫抑制功能为：将口蹄疫病毒2B蛋白的105-114位氨基酸突变或缺失。
优选地，所述抑制口蹄疫病毒2B蛋白的免疫抑制功能为：将口蹄疫病毒2B蛋白的105-114位氨基酸缺失。
优选地，所述抑制口蹄疫病毒2B蛋白的免疫抑制功能为：将口蹄疫病毒2B蛋白的105位氨基酸突变为丙氨酸A。
优选地，所述口蹄疫病毒为O型口蹄疫病毒。
优选地，所述口蹄疫病毒为O/BY/CHA/2010株。
第二方面，本发明提供了一种2B蛋白免疫抑制功能丧失的口蹄疫重组病毒株，将亲本口蹄疫病毒中2B蛋白的105-114位氨基酸突变或缺失。
优选地，将口蹄疫病毒2B蛋白的105-114位氨基酸缺失。
优选地，将亲本口蹄疫病毒中2B蛋白的105位氨基酸突变为丙氨酸A。
优选地，所述亲本口蹄疫病毒为O型口蹄疫病毒。
优选地，所述亲本口蹄疫病毒为O/BY/CHA/2010株。
第三方面，本发明提供了一种上述第二方面所述的口蹄疫重组病毒株在制备口蹄疫疫苗中的应用。
第四方面，本发明提供了一种2B蛋白免疫抑制功能丧失的口蹄疫重组病毒株的制备方法，所述方法为：通过基因工程手段使亲本口蹄疫病毒2B蛋白的105-114位氨基酸突变或缺失。
优选地，所述方法为：通过基因工程手段使亲本口蹄疫病毒2B蛋白的105位氨基酸突变为丙氨酸A。
优选地，所述亲本口蹄疫病毒为O型口蹄疫病毒。
优选地，所述亲本口蹄疫病毒为O/BY/CHA/2010株。
优选地，所述方法包括以下步骤：
重组质粒的构建：以亲本口蹄疫病毒O/BY/CHA/2010株的重组质粒为模板，利用定点突变PCR方法，将亲本口蹄疫病毒2B蛋白的105位氨基酸突变为丙氨酸A，构建重组质粒rFMDV-2B K105A；
病毒拯救：将重组质粒rFMDV-2B K105A转染BHK-21细胞，病毒拯救获得口蹄疫重组病毒株。
优选地，所述重组质粒的构建中定点突变引物为：
正向引物F：gacagcacgtttgtcgtggccaagatctccgactcgctc(SEQ ID NO.1所示)；
反向引物R：gagcgagtcggagatcttggccacgacaaacgtgctgtc(SEQ ID NO.2所示)。
优选地，所述病毒拯救具体方法为：
(1)提前16h将BHK-21细胞接种于T25培养瓶中；
(2)在干净的EP管中加入适量Trans Bufffer，将重组质粒rFMDV-2B K105A加入EP管中，质粒与转染试剂的比例为1μg：2μL，轻轻吹打混匀静置10min；待BHK-21细胞生长至70％-80％，使用Polyplus转染试剂将重组质粒转入细胞；
(3)将细胞瓶中的原培养基弃掉，更换新的DMEM细胞培养基；
(4)将混合液加入细胞中，轻轻摇晃混匀，置于5％ CO2培养箱37℃恒温培养；
(5)观察细胞状态与病变情况，待细胞出现90％左右病变时收获，若没有细胞病变，则于72h收获，将其标记为F1；
(6)F1反复冻融三次后再次接种BHK-21细胞，观察细胞病变情况，并按同样的方法进行传代，直至细胞能稳定的产生细胞病变，获得重组病毒；若没有细胞病变，则按上述方法盲传5代。
本发明的有益效果是：本发明首先发现了口蹄疫病毒2B蛋白的第105位氨基酸是抑制STING蛋白表达的关键位点，将2B蛋白的第105位氨基酸突变为A后，促进了STING蛋白的表达；其次，本发明将2B蛋白的第105位氨基酸突变为A构建并成功拯救获得了口蹄疫病毒2B蛋白的免疫抑制位点突变的口蹄疫重组病毒株rFMDV-2B K105A，与野生型FMDV相比，rFMDV-2B K105A的毒价显著降低，毒力降低，且抑制STING表达的能力降低同时诱导IFN-β表达的能力显著增加，可作为重组疫苗株，具备良好的应用前景。
附图说明
图1口蹄疫病毒2B蛋白的过表达、缺失以及突变对STING蛋白表达的影响结果；
图2重组质粒rFMDV-2B K105A的构建示意图；
图3口蹄疫突变重组病毒rFMDV-2B K105A的拯救结果；
图4口蹄疫突变重组病毒rFMDV-2B K105A的病毒效价测定结果；
图5感染口蹄疫突变重组病毒rFMDV-2B K105A后STING及IFN-β表达结果；其中，A为STING表达结果，B为IFN-β表达结果。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买获得。
FLAG-2B及其突变体质粒由兰州瑞博莱生物科技有限公司构建，具体包括：2B质粒(表达2B蛋白全长的质粒)、2B 1-50质粒(表达2B蛋白第1-50位氨基酸的质粒)、2B 51-100质粒(表达2B蛋白第51-100位氨基酸的质粒)、2B 101-154质粒(表达2B蛋白第101-54位氨基酸的质粒)、2B△95-104质粒(2B蛋白第95-104位氨基酸缺失的质粒)、2B△105-114质粒(2B蛋白第105-114位氨基酸缺失的质粒)、2B△115-124质粒(2B蛋白第115-124位氨基酸缺失的质粒)、2B△125-134质粒(2B蛋白第125-134位氨基酸缺失的质粒)、2B△135-144质粒(2B蛋白第135-144位氨基酸缺失的质粒)、2B△145-154质粒(2B蛋白第145-154位氨基酸缺失的质粒)、2B K105A质粒(将2B蛋白第105位赖氨酸突变为丙氨酸)、2B K106A质粒(将2B蛋白第106位赖氨酸突变为丙氨酸)、2B I107A质粒(将2B蛋白第107位异亮氨酸突变为丙氨酸)、2B S108A质粒(将2B蛋白第108位丝氨酸突变为丙氨酸)、2B D109A质粒(将2B蛋白第109位天冬氨酸突变为丙氨酸)、2B S110A质粒(将2B蛋白第110位丝氨酸突变为丙氨酸)、2BL111A质粒(将2B蛋白第111位亮氨酸突变为丙氨酸)、2B S112A质粒(将2B蛋白第112位丝氨酸突变为丙氨酸)、2B S113A质粒(将2B蛋白第113位丝氨酸突变为丙氨酸)、2B L114A质粒(将2B蛋白第114位亮氨酸突变为丙氨酸)。
FMDV(O/BY/CHA/2010)由本团队分离，并保存于中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫与新发病流行病学团队与国家口蹄疫参考实验室。
实施例1口蹄疫病毒2B抑制宿主STING蛋白表达的位点的筛选与鉴定
1.过表达2B及其突变体质粒的细胞样品的制备
将6×105个PK-15细胞铺置于6孔板的单个孔内，待细胞长至70％-80％融合度的时候，利用脂质体试剂分别转染Flag-2B及其突变体质粒2μg，转染24h。
2.STING蛋白表达水平的Western blot检测
蛋白样品的制备：将转染的细胞培养上清液弃去，用PBS清洗一次细胞样品，利用细胞铲刮下细胞，移入1.5mL离心管中，2000rpm离心5min，弃上清，保留细胞沉淀，即为收获的细胞样品(均在冰上操作)；根据收集细胞沉淀的多少加入适量的细胞裂解液，并快速反复吹打重悬细胞样品，冰上裂解5min，超声波瞬时破碎(冰上操作，超声2-3次)；4℃，13000rpm离心10min，弃去底部沉淀，取上清于另一预冷离心管中保存；取样品蛋白上清加入5×蛋白上样缓冲液，沸水煮沸变性10min，4℃，12000rpm离心5min，取适量上清进行蛋白质电泳。
SDS-PAGE凝胶电泳及其电泳图蛋白转印：SDS-PAGE凝胶及电泳缓冲液均按照分子克隆实验指南配制。每个蛋白样品上样量为40μg，同时单独选孔加入预染蛋白marker作为指示。蛋白样品在浓缩胶时，调用80V电压；待蛋白样品进入分离胶后，调取电压至120V，直至电泳结束。转印前，根据SDS-PAGE凝胶的大小剪取合适的硝酸纤维素膜(NC膜)，并在转印缓冲液中浸泡10min左右，同时剪取6层滤纸浸泡在转印液中数分钟。按照“膜正胶负”顺序放置蛋白胶：负极-海绵-3层滤纸-凝胶-NC膜-3层滤纸-海绵-正极，安装好“转印夹心三明治”后，将其放置到全湿转印槽内，加入足够转印缓冲液，接通电源(恒流240mA或恒压65V转印2-3h)，转印槽外部用冰袋辅助降温。待转印结束后，5％的TBST-脱脂乳封闭NC膜，室温作用2-3h，弃去封闭液，TBST(pH7.6)缓冲液漂洗3次，洗去残留脱脂乳封闭液，随后进行抗体孵育。抗体反应：加入TBST稀释一抗，4℃轻摇振荡过夜(或室温4-6h)，一抗回收利用。TBST轻轻漂洗3次后，再用TBST洗2-3次，每次漂洗10min。漂洗完毕后，加入HRP标记的二抗，室温作用2h，作用完毕用TBST轻轻漂洗3次，再用TBST漂洗3次，每次10min。漂洗结束后，进行显色反应。暗室中利用ECL显色试剂盒进行显色。取试剂盒中A液与B液等量混合，然后轻轻均匀地淋湿NC膜，作用1-2min后，将作用的膜放置在X光曝光夹内，在上方放置X光胶片进行曝光。曝光完成的胶片首先放入显影液中进行显影，待所需蛋白条带显示后，用自来水轻轻漂洗胶片，然后将胶片放入定影液中进行定影2-3min。定影结束后，将胶片放入自来水漂洗、进一步晾干、待晾干后标记蛋白Marker，扫描胶片保存结果。
实验结果如图1所示，过表达口蹄疫病毒2B蛋白(2B)显著抑制了宿主STING的蛋白表达，而相较于过表达的2B质粒，2B 1-50质粒、2B 51-100质粒解除了STING蛋白的表达抑制，使STING蛋白的表达增加；进一步地，相较于过表达的2B质粒，只有口蹄疫病毒2B蛋白的105-114位缺失(2B△105-114)解除了STING蛋白的表达抑制，使STING蛋白的表达增加；在此基础上，申请人进一步发现，相较于过表达的2B质粒，只有口蹄疫病毒2B蛋白的105位赖氨酸K突变为丙氨酸A(2B K105A)后解除了STING蛋白的表达抑制，使STING蛋白的表达增加。上述结果表明，只有将口蹄疫病毒2B蛋白的第105位赖氨酸K突变为丙氨酸A后，使口蹄疫病毒2B蛋白抑制STING蛋白表达的能力丧失，即，口蹄疫病毒2B蛋白的第105位氨基酸是抑制STING蛋白表达的关键位点。
实施例2FMDV 2B K105A重组毒株的拯救
1.FMDV 2B K105A重组质粒的构建
以本实验室保存的FMDV重组质粒(参考文献：Engineering Foot-and-MouthDisease Viruses with Improved Growth Properties for Vaccine Development)为模板，通过定点突变PCR，构建2B K105A突变的重组质粒rFMDV-2B K105A。扩增引物为：正向引物F：gacagcacgtttgtcgtggccaagatctccgactcgctc(SEQ ID NO.1所示)；反向引物R：gagcgagtcggagatcttggccacgacaaacgtgctgtc(SEQ ID NO.2所示)。详细的构建策略见图2。
2.重组病毒的拯救
(1)在干净的EP管中加入适量Trans Bufffer，将重组质粒rFMDV-2B K105A加入EP管中，质粒与转染试剂的比例为1μg：2μL，轻轻吹打混匀静置10min；
(2)待提前16h将BHK-21细胞接种于T25培养瓶中，待细胞生长至70％-80％，使用Polyplus转染试剂将重组质粒rFMDV-2B K105A转入细胞；
(3)将细胞瓶中的原培养基弃掉，更换新的DMEM细胞培养基；
(4)将混合液加入细胞中，轻轻摇晃混匀，置于5％ CO2培养箱37℃恒温培养，同时设置正常细胞作为阴性对照；
(5)观察细胞状态与病变情况，待细胞出现90％左右病变时收获，若没有细胞病变，则于72h收获，将其标记为F1；
(6)F1反复冻融三次后再次接种BHK-21细胞，观察细胞病变情况，并按同样的方法进行传代，直至细胞能稳定的产生细胞病变，获得重组病毒；若没有细胞病变，则按上述方法盲传5代。
结果如图3所示，野生型FMDV(O/BY/CHA/2010)能够引起BHK-21细胞产生典型的细胞病变，rFMDV-2B K105A能够引起BHK-21细胞轻微的细胞病变，表明2B K105A突变的重组毒株rFMDV-2B K105A拯救成功。
实施例3口蹄疫病毒重组毒株rFMDV-2B K105A的毒力评价
1.感染FMDV的PK-15细胞样品的制备
将6×105个PK-15细胞铺制于6孔板的单个孔内，待细胞长至100％融合度的时候，接种1MOI的野生型FMDV(O/BY/CHA/2010)和重组口蹄疫病毒株(rFMDV-2B K105A)，接种1h后换为维持液培养，并分别在接种0、6、12h收取上清液。
2.口蹄疫病毒滴度测定
感染FMDV后收集细胞上清，通过TCID50测定，进行病毒滴度分析。病毒效价的测定：提前16h将BHK-21细胞接种96孔板。在细胞形成单层细胞后，用PBS洗3遍BHK-21细胞，接种病毒(10-1-10-10)，另设两列阴性对照孔。感染孔，每孔加入100μl病毒滤液或倍比稀释病毒稀释液，37℃吸附1h，每20min轻轻摇晃一次，保证病毒吸附均匀。吸附1h后，吸去上清，用PBS轻轻洗板1次。加入病毒维持液。待48h后，每12h观察一次细胞病变情况，72h后记录病变孔数，计算TCID50，平行测定三次，取平均值为最终病毒滴度。
实验结果如图4所示，随着感染时间的延长，野生型FMDV(O/BY/CHA/2010)和重组口蹄疫病毒株(rFMDV-2B K105A)的毒价均逐渐增高。与野生型FMDV相比，rFMDV-2BK105A的毒价显著降低。结果表明，本申请所述的重组口蹄疫病毒株rFMDV-2B K105A的毒力显著降低。
实施例4口蹄疫病毒重组毒株rFMDV-2B K105A诱导天然免疫的能力评价
1.感染FMDV的PK-15细胞样品的制备
将6×105个PK-15细胞铺制于6孔板的单个孔内。待细胞长至100％融合度的时候，接种1MOI的野生型FMDV(O/BY/CHA/2010)和重组口蹄疫病毒株(rFMDV-2B K105A)，接种1h后换为维持液培养。
2.STING蛋白表达水平的Western blot检测
检测方法同实施例1中2所述。
3.IFN-β蛋白含量的检测
PK-15细胞感染野生型和重组口蹄疫病毒6h后收取上清，按照猪IFN-βELISA检测试剂盒(购自索莱宝公司)操作步骤进行IFN-β含量的检测。具体步骤如下：
将试剂盒提前平衡至室温，提前配置所需要的试剂。从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，空白孔加标准品&标本通用稀释液，其余相应孔中加标准本或不同浓度标准品(100μl/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37℃温箱孵育90分钟；提前20分钟准备生物素化抗体工作液；洗板5次；空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100μl/孔)。封住反应孔，37℃温箱孵育60分钟；提前20分钟准备酶结合物工作液，避光室温(22-25℃)放置；洗板5次；空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100μl/孔)；用新封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱，避光孵育30分钟；打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序；洗板5次；加入显色底物(TMB)100μl/孔，避光37℃孵箱，避光孵育15分钟；加入反应终止液100μl/孔，混匀后即刻测量OD450值(3分钟内)。在仪器保存读数结果并打印一份纸质结果。
结果判断：每个标准品和标本的OD值应减去空白孔的OD值，以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，用软件绘制标准曲线，通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。
结果如图5所示，野生型FMDV(O/BY/CHA/2010)感染引起了STING的降低，而重组口蹄疫病毒株(rFMDV-2B K105A)感染后，抑制STING表达的能力降低(A所示)；此外，与野生型FMDV(O/BY/CHA/2010)相比，重组口蹄疫病毒株rFMDV-2B K105A诱导IFN-β表达的能力显著增加(B所示)，降低了抑制天然免疫的能力。
上述结果表明，在亲本口蹄疫病毒的基础上(以O/BY/CHA/2010为例)，将2B蛋白的105位赖氨酸K突变为丙氨酸A，构建的重组口蹄疫病毒株rFMDV-2B K105A相较于亲本毒株的毒力显著致弱，且促进了IFN-β蛋白的表达，降低了抑制天然免疫的能力，可作为疫苗候选株，为口蹄疫疫苗的制备提供一种新思路。
以上所述的实施例仅表述了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可做出其它改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.通过抑制口蹄疫病毒2B蛋白的免疫抑制功能制备口蹄疫重组病毒的应用，其特征在于，所述抑制口蹄疫病毒2B蛋白的免疫抑制功能为：将口蹄疫病毒2B蛋白的105-114位氨基酸突变或缺失。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制口蹄疫病毒2B蛋白的免疫抑制功能为：将口蹄疫病毒2B蛋白的105位氨基酸突变为丙氨酸A。
3.一种2B蛋白免疫抑制功能丧失的口蹄疫重组病毒株，其特征在于，将亲本口蹄疫病毒中2B蛋白的105-114位氨基酸突变或缺失。
4.如权利要求3所述的口蹄疫重组病毒株，其特征在于，将亲本口蹄疫病毒中2B蛋白的105位氨基酸突变为丙氨酸A。
5.如权利要求3所述的口蹄疫重组病毒株，其特征在于，所述亲本口蹄疫病毒为O型口蹄疫病毒株。
6.如权利要求5所述的口蹄疫重组病毒株，其特征在于，所述亲本口蹄疫病毒为O/BY/CHA/2010株。
7.如权利要求3-6任一所述的口蹄疫重组病毒株在制备口蹄疫疫苗中的应用。
8.一种2B蛋白免疫抑制功能丧失的口蹄疫重组病毒株的制备方法，其特征在于，所述方法为：通过基因工程手段使亲本口蹄疫病毒2B蛋白的105-114位氨基酸突变或缺失。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法为：通过基因工程手段使亲本口蹄疫病毒2B蛋白的105位氨基酸突变为丙氨酸A。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)以亲本口蹄疫病毒O/BY/CHA/2010株的重组质粒为模板，利用定点突变PCR方法，将亲本口蹄疫病毒2B蛋白的105位氨基酸突变为丙氨酸A，构建重组质粒rFMDV-2B K105A；
(2)将重组质粒rFMDV-2B K105A转染BHK-21细胞，病毒拯救获得口蹄疫重组病毒株。
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