CN111744000A - 免疫抑制功能降低的口蹄疫重组病毒及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于兽药生物制品技术领域，具体涉及一种免疫抑制功能降低的口蹄疫重组病毒、重组疫苗株及其制备方法和应用。本发明首先发现了FMDV 3B蛋白具有免疫抑制功能，并发现了发挥免疫抑制功能的关键位点；其次通过在FMDV 3B蛋白的三个重复拷贝中分别引入关键位点氨基酸突变，构建了FMDV 3B蛋白免疫抑制功能丧失的口蹄疫重组疫苗株，所述口蹄疫重组疫苗株在干扰素通路缺陷的口蹄疫生产细胞系BHK‑21中稳定传代，且不影响病毒滴度，而其在猪源宿主细胞(PK‑15)中毒力下降，发挥了更强的天然免疫应答诱导能力；最后，将获得的重组疫苗株制备成灭活疫苗，能够促进早期免疫应答，诱导高水平抗体产生，提高了生物安全性及免疫保护效力，具备良好的应用前景。

Description

免疫抑制功能降低的口蹄疫重组病毒及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种免疫抑制功能降低的口蹄疫重组病毒、重组疫苗株及其制备方法和应用。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是一种急性、热性、高度接触性传染病，主要侵害家畜和野生偶蹄类动物。一般成年家畜感染后会自愈，其在自然宿主中存在较高的发病率，在不同种间都表现出典型的病变。幼畜感染或者在野生动物中发生大流行的情况下，FMD可以引发较高的死亡率。FMD被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病，我国也将其列为一类动物疫病。

FMD是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的一种急性发热性疾病，伴随着蹄，口，乳房周围出现水疱，水疱破裂后形成溃疡。动物发病时会出现跛行、精神抑郁、厌食、过度流涎等，且多数病例会出现蹄冠和蹄匣脱落。FMDV也会引起生殖系统的损坏，其中典型的例子就是绵羊和山羊。大多数成年动物在感染2-3周内康复，继发感染康复时间稍长。动物感染康复后可能出现的并发症，包括暂时或永久牛奶产量降低、蹄部畸形、跛行、慢性乳腺炎、体重减轻等。

我国近年一直采取强制疫苗免疫为主的防控政策，起到了较好的预防控制效果，但仍难以有效根除FMD，其主要原因就是FMDV能够逃逸宿主免疫系统，而长期存在。更为重要的是，FMDV通过病毒蛋白靶向天然免疫通路分子，抑制天然免疫通路活化，抑制干扰素的产生，进而发挥拮抗作用。病毒自身的免疫抑制性拮抗宿主免疫应答，有利于免疫逃逸变异毒株的存活，造成持续性感染，使口蹄疫的防控变得更加复杂化。为彻底根除口蹄疫，急需提升疫苗的免疫效力，消除其免疫抑制能力，能够降低或阻断持续性感染的新型疫苗。而要想解决此问题，必须从FMDV感染与免疫调控机理研究入手，鉴定参与免疫抑制的相关病毒蛋白及其分子机制，从而为今后发展新的抗病毒策略以及研制新型疫苗提供帮助。

FMDV基因组由5'非编码区、开放阅读框(ORF)和3'非编码区组成。ORF编码一个多聚蛋白，之后逐级裂解产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白，ORF依次为L蛋白编码区，P1区、P2区和P3区，L蛋白编码区有两个起始密码子，之间相隔84个碱基，编码Lab和Lb和两种非结构蛋白，P1区编码VP4、VP2、VP3、VP1四种结构蛋白，参与组装病毒衣壳，P2区编码2A、2B、2C三种非结构蛋白，P3区编码3A、3B、3C^pro、3D^pro四种非结构蛋白，其中3B蛋白是FMDV的一个重要毒力因子，其与FMDV的5’非编码区N端结合作为引物，启动病毒3D蛋白(RNA聚合酶)对病毒RNA的合成。3B蛋白具有3个高度同源的拷贝组成，分别命名为3B1、3B2和3B3，这也是FMDV与同科其他病毒不同的地方。并且不同血清型口蹄疫病毒3B1、3B2和3B3的氨基酸序列具有高度同源性，具体序列对比结果如图1所示。同时，3B蛋白能够调节FMDV 3A蛋白的功能，进而影响病毒的复制。因此，3B蛋白具有多种功能，在FMDV复制过程中发挥着重要作用。同时，基于FMDV 3ABC非结构蛋白建立的ELISA方法已经被广泛用于FMDV感染的诊断。因此，围绕3B蛋白开展相关诊断及防控产品的开发具有重要的意义和良好的应用前景。近年来，反向遗传操作技术已经被广泛用于病毒毒力或病毒产量等生物特性的改造，而目前现有技术中还没有利用反向遗传操作技术靶向3B蛋白对FMDV的毒力或病毒的产量等生物学特性进行改造提升的方案。

基于上述问题，本发明首先发现了3B蛋白具有免疫抑制功能，并通过突变PCR、基因合成等方法构建了一系列3B质粒突变体，筛选出了发挥免疫抑制功能的关键位点；其次通过在3B蛋白的三个重复拷贝中分别引入关键位点氨基酸突变，构建了3B蛋白免疫抑制位点消除的口蹄疫重组病毒，所述口蹄疫重组病毒在干扰素通路缺陷的口蹄疫生产细胞系BHK-21中能够稳定传代，并且病毒滴度不受影响，而其在猪源宿主细胞中毒力下降，发挥了更强的天然免疫应答诱导能力，可作为重组疫苗株；最后，将获得的重组疫苗株制备成灭活疫苗，能够促进早期免疫应答，诱导高水平抗体产生，提高了生物安全性，及免疫保护效力，具备良好的应用前景。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供一种构建口蹄疫重组病毒及由重组病毒制备口蹄疫重组疫苗株的策略，所述策略是通过以下技术方案实现的：

本发明首先发现了FMDV 3B蛋白具有较强的免疫抑制作用，可用于制备免疫抑制药物或试剂，基于此，本发明的目的在于提供一种口蹄疫病毒3B蛋白在制备免疫抑制剂中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种通过仅丧失口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能制备口蹄疫重组病毒的方法。由于口蹄疫病毒3B蛋白不仅具有免疫抑制功能，而且还能与5’非编码区N端结合，启动病毒3D蛋白(RNA聚合酶)对病毒RNA的合成、调节FMDV 3A蛋白的功能，进而影响病毒的复制等。因此，本发明在不影响口蹄疫病毒3B蛋白其他功能的前提下，仅通过丧失口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能，就可以解除口蹄疫病毒3B蛋白抑制天然免疫应答的能力，降低口蹄疫病毒对宿主的致病力，可用于制备口蹄疫重组病毒。

本发明的另一目的在于提供一种通过仅丧失口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能制备口蹄疫重组疫苗株的方法。由于口蹄疫病毒3B蛋白不仅具有免疫抑制功能，而且还能与5’非编码区N端结合，启动病毒3D蛋白(RNA聚合酶)对病毒RNA的合成、调节FMDV 3A蛋白的功能，进而影响病毒的复制等。因此，本发明在不影响口蹄疫病毒3B蛋白其他功能的前提下，仅通过丧失口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能，就可以解除口蹄疫病毒3B蛋白抑制天然免疫应答的能力，降低FMDV对宿主的致病力，同时不影响口蹄疫病毒在干扰素通路缺陷的口蹄疫生产细胞系BHK-21中的生产性能，可用于制备口蹄疫重组疫苗株。

优选地，所述使口蹄疫病毒3B蛋白免疫抑制功能丧失的方法包括基因缺失技术、基因突变技术、基因插入技术。本发明的目的在于：在不影响口蹄疫病毒3B蛋白其他功能的前提下，仅使口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能丧失。其中使口蹄疫病毒3B蛋白的构象、理化特性发生改变或与宿主蛋白结合力发生改变，可以使口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能丧失，而本领域常用的方法包括基因缺失技术、基因突变技术、基因插入技术等基因工程手段。根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段使口蹄疫病毒3B蛋白的构象、理化特性或与宿主蛋白结合力发生改变，导致口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能丧失。

优选地，所述使口蹄疫病毒3B蛋白免疫抑制功能丧失的方法为：将口蹄疫病毒3B蛋白中三个拷贝3B1、3B2和3B3的第17位氨基酸缺失或突变。

优选地，所述使口蹄疫病毒3B蛋白免疫抑制功能丧失的方法为：将口蹄疫病毒3B蛋白中三个拷贝3B1、3B2和3B3的第17位氨基酸突变。

优选地，所述使口蹄疫病毒3B蛋白免疫抑制功能丧失的方法为：将口蹄疫病毒3B蛋白中三个拷贝3B1、3B2和3B3氨基酸序列的第17位突变为极性氨基酸。

优选地，所述使口蹄疫病毒3B蛋白免疫抑制功能丧失的方法为：通过基因突变技术将口蹄疫病毒3B蛋白中三个拷贝3B1、3B2和3B3氨基酸序列的第17位突变为谷氨酸。根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段仅将口蹄疫病毒3B蛋白中三个拷贝3B1、3B2和3B3氨基酸序列的第17位突变，使口蹄疫病毒3B蛋白的构象、理化特性或与宿主蛋白结合力发生改变，导致3B蛋白的免疫抑制功能丧失。

本发明的另一目的在于提供一种口蹄疫重组病毒，所述口蹄疫重组病毒是仅将亲本口蹄疫病毒中3B蛋白的免疫抑制功能丧失。由于口蹄疫病毒3B蛋白不仅具有免疫抑制功能，而且还能与5’非编码区N端结合，启动病毒3D蛋白(RNA聚合酶)对病毒RNA的合成、调节FMDV 3A蛋白的功能，进而影响病毒的复制等。因此本发明在不影响口蹄疫病毒3B蛋白其他功能的前提下，仅通过丧失口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能，就可以解除口蹄疫病毒3B蛋白抑制天然免疫应答的能力，降低口蹄疫病毒对宿主的致病力，成功构建口蹄疫重组病毒。

优选地，所述亲本口蹄疫病毒中3B蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ IDNO.7所示。

优选地，所述使口蹄疫病毒3B蛋白免疫抑制功能丧失的方法为：将亲本口蹄疫病毒中3B蛋白的三个拷贝3B1、3B2和3B3的第17位氨基酸缺失或突变。

优选地，所述使口蹄疫病毒3B蛋白免疫抑制功能丧失的方法为：将口蹄疫病毒中3B蛋白中的三个拷贝3B1、3B2和3B3氨基酸序列的第17位突变为极性氨基酸。

优选地，所述使口蹄疫病毒3B蛋白免疫抑制功能丧失的方法为：将亲本口蹄疫病毒中3B蛋白的三个拷贝3B1、3B2和3B3氨基酸序列的第17位突变为谷氨酸。根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段将口蹄疫病毒3B蛋白中三个拷贝3B1、3B2和3B3氨基酸序列的第17位突变，改变口蹄疫病毒3B蛋白的构象或理化特性，导致3B蛋白的免疫抑制功能丧失。

优选地，所述突变后的3B蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.6所示。

本发明的另一目的在于提供一种包含上述口蹄疫重组病毒的口蹄疫重组疫苗株。

本发明的另一目的在于提供一种制备口蹄疫重组病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)构建口蹄疫病毒全长感染性克隆。

(2)利用PCR定点突变等基因突变技术或基因合成技术在口蹄疫病毒全长感染性克隆的基础上，将3B蛋白的三个拷贝3B1、3B2、3B3的17位氨基酸突变为极性氨基酸。

(3)将得到含突变3B1、3B2、3B3的17位氨基酸为极性氨基酸的真核转录质粒转染口蹄疫病毒敏感细胞，获得口蹄疫重组病毒。

优选的，所述口蹄疫病毒敏感细胞为BHK-21细胞或IBRS-2细胞。

优选地，所述突变为将3B蛋白的三个拷贝3B1、3B2和3B3氨基酸序列的第17位均突变为谷氨酸。根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段将口蹄疫病毒3B蛋白中三个拷贝3B1、3B2和3B3氨基酸序列的第17位突变，改变口蹄疫病毒3B蛋白的构象、理化特性或与宿主蛋白的结合力，导致3B蛋白的免疫抑制功能丧失，成功构建口蹄疫重组病毒。

优选地，所述突变后的3B蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.6所示。

本发明的另一目的在于提供一种根据上述方法制备获得的口蹄疫重组病毒。

本发明的另一目的在于提供一种包含上述口蹄疫重组病毒的口蹄疫重组疫苗株。

本发明的另一目的在于提供一种根据上述的口蹄疫重组疫苗株制备获得的重组口蹄疫重组疫苗。

另一方面，本发明涉及所述口蹄疫重组疫苗在制备用于预防和/或控制动物口蹄疫疾病的药物中的应用。

优选地，所述口蹄疫疾病为O型口蹄疫和A型口蹄疫疾病，所述动物为猪、牛或羊。

本发明的有益效果是：

①本发明首先利用I型干扰素报告系统及qPCR等不同方法在不同细胞系中证实了3B蛋白具有免疫抑制功能，可以用于制备免疫抑制剂；

②在证实3B蛋白具有免疫抑制功能的基础上，通过丧失对口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能，可用于制备口蹄疫重组病毒及重组疫苗株；

③本发明进一步筛选出了3B蛋白发挥免疫抑制功能的关键位点，通过在3B蛋白的三个重复拷贝中分别引入关键位点氨基酸突变，解除了免疫抑制功能，并且突变不会影响口蹄疫病毒的复制，成功构建并拯救了3B蛋白免疫抑制功能丧失的口蹄疫重组病毒；

④所述口蹄疫重组病毒在干扰素通路缺陷的口蹄疫生产细胞系BHK-21中能够稳定传代，并且病毒滴度不受影响，具有良好的生产性能，而其在猪源宿主细胞中毒力下降，发挥了更强的天然免疫应答诱导能力；

⑤为了提高口蹄疫重组病毒的抗原匹配性及抗原广谱性，本发明提供了一种重组疫苗株的构建方法：利用已建立的具有较强细胞免疫应答毒株的反向遗传操作系统为框架，筛选对O型FMDV不同谱系均具有交叉保护性的O/JSCZ/2013为抗原骨架，并将3B蛋白的免疫抑制位点进行突变，构建O型口蹄疫重组疫苗株；用具有抗原匹配性高、交叉免疫保护性强的A/WH/CHA/09为抗原骨架，并将3B蛋白的免疫抑制位点进行突变，构建A型口蹄疫重组疫苗株。并以所述的重组疫苗株制备灭活疫苗，该疫苗免疫动物后能够促进机体早期免疫应答，诱导高水平抗体产生，提高了生物安全性及免疫保护效力，具备良好的应用前景。

附图说明

图1不同血清型FMDV 3B蛋白氨基酸序列比对分析；

图2 FMDV 3B蛋白对天然免疫应答通路活化的抑制作用；

图3 FMDV 3B蛋白抑制I型干扰素的表达检测；

图4 3B蛋白对FMDV在BHK-21细胞中复制影响检测；

图5 3B蛋白的免疫抑制功能丧失突变体构建方案；

图6 3B蛋白的免疫抑制功能丧失突变体对IFN-β抑制能力检测，其中3B-A/E为3B蛋白突变体；

图7 3B蛋白免疫抑制功能丧失的O型口蹄疫重组病毒拯救结果；

图8 3B蛋白免疫抑制功能丧失的A型口蹄疫重组病毒拯救结果；

图9 3B蛋白免疫抑制功能丧失的口蹄疫重组病毒及其亲本病毒感染猪源细胞后IFN-β和干扰素诱导的抗病毒基因表达差异分析结果，其中r3B为亲本病毒，r3B-A/E为3B蛋白突变的口蹄疫重组病毒rO-m3B-FMDV。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。

以下实施例中所述的相关实验获得生物安全许可和口蹄疫实验室活动许可：

中国农业科学院兰州兽医研究所根据生物安全3级实验室(BSL-3)和口蹄疫相关生物安全的相关要求，经兰州兽医研究所生物安全委员会、中国农业科学院生物安全委员会、兰州兽医研究所实验动物伦理委员会逐级上报，获得农业部关于开展高致病性FMDV病原及动物研究许可，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。

以下实施例中所述的实验细胞及质粒来源：

FLAG-CMV-7.1真核表达载体、POK12载体为商品化质粒；IFN-β、ISRE和NF-kB报告系统购买于淼灵质粒平台；Trans5α大肠杆菌感受态细胞购买于天根生化科技(北京)有限公司；HEK293T细胞、BHK-21细胞购自国家实验细胞资源共享平台。

实验中的操作如果没有特别说明均是本领域知晓的操作方法。

实施例1 3B蛋白的免疫抑制作用

首先对比不同血清型口蹄疫病毒的3B蛋白氨基酸序列，发现不同血清型口蹄疫病毒的3B蛋白的3个拷贝3B1、3B2和3B3均具有高度同源性，结果如图1所示。因此本实施中仅以流行株O/BY/CHA/2010株为例，对该流行株的3B蛋白的免疫抑制功能进行研究，具体实验如下：

1.1 3B蛋白对天然免疫应答的影响

先利用IFN-β、ISRE和NF-kB报告系统检测3B蛋白发挥的免疫抑制作用：用FLAG-3B质粒和各个报告系统分别转染HEK293T细胞，转染24h后，用干扰素诱导模式病毒SeV(仙台病毒)进行刺激，利用Luciferase试剂盒(Promega)检测报告系统表达变化。

其中，FLAG-3B质粒构建过程如下：

本发明人所用O/BY/CHA/2010株由农业部兽医局指定国家口蹄疫参考实验室保藏，公众可通过农业部兽医局批示的委托函获得。

NCBI数据库查询FMDV 3B基因序列，设计引物，3B-HindIII-F：CTCAAGCTTGCCACCATGGGACCCTACGCCGGACCACT(下划线为HindIII酶切位点)；3B-BamHI-R：atGGATCCTCACTCAGTGACGATCAAGTTCT(下划线为BamHI酶切位点)。提取O/BY/CHA/2010株感染PK-15细胞后的总RNA，随机引物反转录合成cDNA，以cDNA为模板，3B-HindIII-F和3B-BamHI-R进行PCR扩增，用HindIII和BamHI限制性内切酶酶切纯化回收的3B片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)。用相同的限制性内切酶酶切FLAG-CMV-7.1载体。37℃酶切2h，之后进行核酸电泳，回收含有粘性末端的FLAG-CMV-7.1载体线性化片段。

将纯化回收的FLAG-CMV-7.1线性化片段产物与纯化回收的3B片段进行连接。16℃过夜，将连接产物转化Trans5α大肠杆菌感受态细胞，过夜培养后，挑取单克隆，在含氨苄抗生素抗性的LB液体培养基摇菌12h，用Omega质粒提取试剂盒提取并送样测序，证实质粒成功构建，将获得的质粒命名为FLAG-3B。

转染及干扰素报告系统检测实验方法如下：

将HEK-293T细胞铺至48孔培养板，待细胞长至70％密度后，分别将报告质粒系统与FLAG-CMV7.1载体和FLAG-3B质粒进行共转染，转染24小时后，吸去上层培养液，PBS润洗2次，接种干扰素诱导模式病毒SeV(仙台病毒)。SeV感染16小时后，弃去培养基，PBS润洗2次，利用Luciferase试剂盒处理细胞样品，用Promega GloMax 20/20发光检测仪测定荧光，分析报告系统Luciferase表达差异变化。将剩余的裂解液用于SDS-PAGE实验，用FLAG抗体检测3B蛋白的表达。

结果如图2所示，在HEK-293T细胞中过表达3B蛋白后，SeV刺激诱导的ISRE、IFN-β、NF-κB报告系统的活化均显著下降，而且随着3B蛋白表达量的增加，被抑制程度越明显。这表明FMDV 3B蛋白能够抑制天然免疫应答中的ISRE、IFN-β、NF-κB通路的活化，具有抑制天然免疫应答的功能。

1.2 3B蛋白对SeV诱导的IFN-βmRNA表达的影响

进一步利用实时定量PCR方法检测3B蛋白对SeV诱导的IFN-βmRNA表达的影响：将HEK293T细胞铺至6孔板中，待细胞长至70％密度后，分别转染FLAG-CMV7.1载体和FLAG-3B质粒；转染24小时后，吸去上层培养液，PBS润洗2次，接种SeV病毒。SeV感染16小时后，弃去培养基，PBS润洗2次，收集细胞样品。用RNA提取试剂盒提取细胞样品总RNA，随机引物反转录合成cDNA。通过实时定量PCR方法检测IFN-βmRNA表达的水平。结果如图3所示，SeV感染能够诱导大量的IFN-β表达，然而，在HEK-293T细胞中过表达3B蛋白后，SeV刺激诱导的IFN-β表达量显著下降，这表明，3B蛋白能够显著抑制IFN-βmRNA的表达。

将BHK-21细胞(天然免疫自然缺陷细胞系)铺至6孔板中，待细胞长至单层后，分别转染FLAG-CMV7.1载体和FLAG-3B质粒；转染24小时后，接种FMDV感染12小时，弃去培养基，PBS润洗2次，收集细胞样品。用RNA提取试剂盒提取细胞样品总RNA，随机引物反转录合成cDNA。通过实时定量PCR方法检测口蹄疫病毒RNA表达量。结果如图4所示，由于BHK-21细胞不具备健全的免疫应答通路，因此在天然免疫缺陷BHK-21细胞中过表达3B蛋白并不影响口蹄疫病毒的复制。这表明3B蛋白在口蹄疫疫苗生产工程细胞系BHK-21细胞中不调控口蹄疫病毒的复制，具有应用于口蹄疫疫苗生产过程中的潜力。

实施例2 3B蛋白突变体真核表达质粒的构建方法

发明人在实施例1的基础上，对FMDV O/BY/CHA/2010株的3B蛋白进行突变，构建了3B蛋白突变体的真核表达质粒，采用本实施例所述的方法，同样可以构建其他血清型口蹄疫病毒3B蛋白突变体的真核表达质粒，具体过程如下：

突变策略如图5所示，在野生型FMDV O/BY/CHA/2010株3B蛋白的基础上(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)，利用基因合成技术合成3B1第17位氨基酸、3B2第17位氨基酸及3B3第17位氨基酸均突变为谷氨酸的3B蛋白基因编码序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列见SEQ ID NO.2)；并在基因序列N端添加EcoRI限制性酶切位点，在基因序列C端添加BamHI限制性酶切位点。将FLAG-CMV-7.1真核表达质粒用EcoRI和BamHI限制性内切酶进行酶切，获得线性化载体片段，约4.7kb。将合成的片段与线性化的FLAG-CMV-7.1载体片段连接，将连接产物转化Trans5α大肠杆菌感受态细胞，进行重组质粒的克隆扩增。将构建的质粒送金唯智生物技术有限公司进行测序分析，确认口蹄疫病毒3B蛋白的3个氨基酸位点成功突变，将得到含有3个氨基酸位点成功突变的质粒命名为FLAG-3B-A/E。

实施例3 3B蛋白突变体对I型干扰素表达的影响

为进一步检测3B蛋白免疫抑制位点消除突变体3B-A/E对I型干扰素表达的影响。将HEK293T细胞铺至6孔板中，待细胞长至70％密度后，分别转染等量FLAG-CMV7.1载体、FLAG-3B质粒和FLAG-3B-A/E质粒，转染24h后，吸去上层培养液，PBS润洗2次，接种干扰素诱导模式病毒SeV，感染16小时后，弃去培养基，PBS润洗2次，收集细胞样品。用RNA提取试剂盒提取细胞样品总RNA，随机引物反转录合成cDNA。利用实时定量PCR方法检测IFN-βmRNA表达变化，平行制备样品，提取细胞总蛋白，进行SDA-PAGE，Western blotting检测突变体3B蛋白的表达。

实验结果如图6所示，结果表明，在同等表达量的情况下，野生型3B蛋白能够抑制IFN-βmRNA的表达，而3B蛋白免疫抑制位点消除突变体3B-A/E不能抑制IFN-βmRNA的表达。以上结果表明，3B1第17位氨基酸、3B2第17位氨基酸和3B3第17位氨基酸均突变为谷氨酸后，3B蛋白丧失了抑制天然免疫应答的能力。因此，依据上述位点进行突变能够指导3B免疫抑制消除的重组病毒、重组疫苗株的构建，用于提升疫苗免疫效能。

综上，虽然上述实施例仅将FMDV O/BY/CHA/2010株的3B蛋白的3个拷贝3B1、3B2和3B3的第17位氨基酸均突变为谷氨酸后，使3B蛋白丧失了抑制天然免疫应答的能力，但是由于FMDV 3B蛋白的3个拷贝3B1、3B2和3B3在不同血清型口蹄疫病毒中具有高度同源性，序列比对见图1，因此，根据本领域技术人员的公知常识，也可以使不同血清型口蹄疫毒的3B蛋白的3个拷贝3B1、3B2和3B3的第17位氨基酸均突变为谷氨酸，进而使不同血清型口蹄疫毒的3B蛋白抑制天然免疫应答的能力丧失，同样能够指导3B蛋白免疫抑制消除的口蹄疫重组病毒、重组疫苗株的构建，用于提升疫苗免疫效能。

并且本实施例的目的在于使口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能丧失，其中改变口蹄疫病毒3B蛋白的构象、理化特性或与宿主蛋白的结合力，使口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能丧失，而本领域常用基因缺失技术、基因突变技术、基因插入技术等基因工程手段，改变口蹄疫病毒3B蛋白的构象、理化特性或与宿主蛋白的结合力，导致口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能丧失。根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段使口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能丧失。

实施例4 3B蛋白突变的口蹄疫重组病毒的构建

4.1重组口蹄疫病毒感染性克隆的构建

根据Genbank中公布的口蹄疫病毒基因组序列，设计合成引入拯救元件且覆盖FMDV全基因组的扩增引物，并引入合适的酶切位点。用RNAeasy Mini Kit(Qiagen)提取病毒总RNA，用引物oligNot I(5’-ttttctagagcggccgct₃₈-3’)反转录合成第一链cDNA，用具有极强延伸能力的PrimeScript Reverse Transcriptase(TaKaRa公司)反转录酶，按照产品说明书配制20μL反应体系，于42℃反应1h备用，以反转录的第一链cDNA为模板，用分段扩增引物分别扩增获得涵盖病毒全基因的基因片段。扩增用适合长片段扩增、性能优良的LA

(TaKaRa公司)DNA聚合酶，按照产品说明书配制50μL反应体系，扩增条件为：94℃5min，94℃30s，57℃30s，72℃3min(1kb/min延伸)，35个循环后，72℃10min，纯化回收PCR扩增产物，连接获得口蹄疫病毒全长基因组序列，且在病毒基因组5'端上游含有人巨细胞病毒RNA聚合酶II启动子、鼠源RNA聚合酶I启动子和核酶序列；在病毒核酸序列的3'端下游含核酶、鼠源聚合酶终止子I和聚合酶终止子II序列。

在获得口蹄疫真核转录质粒的基础上，利用PCR定点突变等基因突变技术或基因合成技术，将FMDV基因组中3B基因进行点突变，获得3B蛋白的三个拷贝3B1、3B2、3B3的17位氨基酸均突变为谷氨酸的重组真核质粒。

4.2重组病毒的拯救

当BHK-21细胞生长至80％时用于转染，在脂质体Lipofectamine^TM2000(Invitrogen)的介导下将4μg重组真核质粒转染BHK-21细胞，同时设立脂质体对照和正常细胞对照，放置于含5％CO₂的37℃培养箱中，观察细胞状态及细胞病变情况，待细胞出现90％左右病变时收获病毒，反复冻融3次后再次接种BHK-21细胞，直到病毒能稳定地产生细胞病变，出现细胞变圆，聚集成葡萄状分布，最终细胞崩解成碎片，获得FMDV 3B蛋白免疫抑制功能丧失的重组病毒。

本实施例仅将口蹄疫病毒株的3B蛋白的3个拷贝3B1、3B2和3B3的第17位氨基酸均突变为谷氨酸，使3B蛋白丧失了抑制天然免疫应答的能力。由于FMDV 3B蛋白的3个拷贝3B1、3B2和3B3在不同血清型口蹄疫病毒中具有高度同源性，序列比对见图1，因此，根据本领域技术人员的公知常识，也可以使不同血清型口蹄疫毒的3B蛋白的3个拷贝3B1、3B2和3B3的第17位氨基酸均突变为谷氨酸，进而使不同血清型口蹄疫毒的3B蛋白的免疫抑制功能丧失，同样能够指导3B免疫抑制消除的重组病毒的构建，构建获得FMDV 3B蛋白免疫抑制功能丧失的口蹄疫重组病毒。

并且本实施例的目的在于使口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能丧失，其中改变口蹄疫病毒3B蛋白的构象、理化特性或与宿主蛋白的结合力，可以使口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能丧失，而本领域常用基因缺失技术、基因突变技术、基因插入技术等基因工程手段，改变口蹄疫病毒3B蛋白的构象、理化特性或与宿主蛋白的结合力，导致口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能丧失。根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段使口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能丧失。

实施例5 3B蛋白突变的O型口蹄疫重组疫苗株的构建及鉴定

5.1重组O型口蹄疫病毒感染性克隆的构建

本发明人所用O/JSCZ/2013毒株由农业部兽医局指定国家口蹄疫参考实验室保藏，公众可通过农业部兽医局批示的委托函获得。

根据O/JSCZ/2013株基因组序列，设计合成一对扩增引物，OP12A-F(5'-TTTTCCTT AAGGGACAGGAACACGCCGTGTTTGCCTGCGT-3')和OP12A-R(5'-ACTCACATCGATGTCAAAGTGAAACCTTC-3')，用RNAeasy Mini Kit(Qiagen)提取O/JSCZ/2013毒株的总RNA，用引物oligNotI(5’-ttttctagagcggccgct₃₈-3’)反转录合成第一链cDNA，用具有极强延伸能力的PrimeScript Reverse Transcriptase(TaKaRa公司)反转录酶，按照产品说明书配制20μL反应体系，于42℃反应1h备用，以反转录的第一链cDNA为模板，用引物OP12A-F和OP12A-R与O/JSCZ/2013毒株的cDNA核酸混合，扩增获得O/JSCZ/2013毒株的基因片段。扩增用适合长片段扩增、性能优良的LA

(TaKaRa公司)DNA聚合酶，按照产品说明书配制50μL反应体系，扩增条件为：94℃5min，94℃30s，57℃30s，72℃3min30s，35个循环后，72℃10min，纯化回收PCR扩增产物，扩增产物大小为3591bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

将得到的含有O/JSCZ/2013毒株L基因、P1基因和P2基因的基因片段和O型口蹄疫病毒O/CHA/99株拯救系统的真核转录质粒prO/CHA/99，分别用AflII和ClaI双酶切后，纯化回收相应的目的片段，连接、转化至JM109感受态细胞中，测序鉴定阳性克隆，获得含O/JSCZ/2013毒株L基因P1基因及P2基因的重组质粒prO-FMDV(公开于授权专利“重组口蹄疫二价灭活疫苗及其制备方法和应用”ZL201710256450.0，其全文通过引用并入本申请中)。

重组质粒prO-FMDV中FMDV基因组序列3'UTR的PolyA的N端为限制性内切酶切位点SbfI，将重组质粒prO-FMDV经ClaI和SbfI双酶切后连接至POK12载体中，获得含3B基因片段的质粒POK-3B，以该质粒为模板对3B基因进行点突变，突变引物为m3B1-F(5'-AAAACCTCTGAAAGTGAGAgagAAGCTCCCACAGCAG-3')；m3B1-R(5'-CTGCTGTGGGAGCTTctcTCTCACTTTCAGAGGTTTT-3')；m3B2-F(5'-GAAACCGCTGAAAGTGAAAgagAAAGCCCCGGTCGTT-3')；m3B2-R(5'-AACGACCGGGGCTTTctcTTTCACTTTCAGCGGTTTC-3')；m3B3-F(5'-TGTCGCTTTGAAAGTGAAAgagAAGAACTTGATTGTC-3')；m3B3-R(5'-GACAATCAAGTTCTTctcTTTCACTTTCAAAGCGACA-3')。具体过程为：先以POK-3B为模板，m3B1-F和m3B1-R突变引物进行3B1的突变；再以3B1突变质粒为模板，m3B2-F和m3B2-R突变引物进行3B2的突变，然后以3B1和3B2的突变质粒为模板，m3B3-F和m3B3-R突变引物进行3B3的突变，最终获得3B1、3B2、3B3的17位氨基酸均突变为谷氨酸的重组质粒。扩增用保真性高的

HS DNA聚合酶(TaKaRa公司)，按照产品说明书配50μL反应体系，扩增条件为：95℃，5min；95℃，1min，55℃，1min，68℃，6min，20个循环；68℃，10min。PCR扩增产物经DpnI酶切消化模板质粒后，转化至DH5α感受态细胞中，测序鉴定阳性克隆。最终获得突变后的3B质粒POK-m3B，其中突变后3B基因编码的氨基酸如SEQ IDNO.6所示。

将获得的含有3B1、3B2、3B3的17位氨基酸均突变为谷氨酸的重组质粒POK-m3B经ClaI和SbfI双酶切回收目的片段，与重组O型真核质粒prO-FMDV经相同酶切后回收的载体片段进行连接，转化至DH5α感受态细胞中，测序鉴定阳性克隆，确认3B基因的3个氨基酸位点成功突变，最终获得含3B基因突变的重组质粒prO-m3B-FMDV。

5.2重组病毒的拯救

当BHK-21细胞生长至80％时用于转染，在脂质体Lipofectamine^TM2000(Invitrogen)的介导下将4μg重组质粒prO-m3B-FMDV转染BHK-21细胞，同时设立脂质体对照和正常细胞对照，放置于含5％CO₂的37℃培养箱中，观察细胞状态及细胞病变情况，待细胞出现90％左右病变时收获病毒，反复冻融3次后再次接种BHK-21细胞，直到病毒能稳定地产生细胞病变，出现细胞变圆，聚集成葡萄状分布，最终细胞崩解成碎片。结果如图7所示，其中A为正常对照BHK-21细胞图片，B为拯救的重组病毒rO-m3B-FMDV感染BHK-21细胞出现的CPE的图片。拯救的重组病毒rO-m3B-FMDV感染BHK-21细胞后能稳定地产生细胞病变，出现细胞变圆，聚集成葡萄状分布而崩解，最终成功获得了O型口蹄疫重组病毒，并命名为rO-m3B-FMDV。

5.3 RT-PCR鉴定重组病毒

将稳定传代的重组病毒rO-m3B-FMDV感染BHK-21细胞的上清用RNAeasy Mini Kit(Qiagen)提取总RNA，反转录后，扩增含3B的基因片段，纯化回收后送测序，结果显示获得的O型口蹄疫重组疫苗株的3B基因与理论序列一致，3B1、3B2、3B3的3个拷贝中第17位氨基酸均为谷氨酸。

综上，为了提高口蹄疫重组病毒的抗原匹配性及抗原广谱性，本实施例提供了一种O型重组疫苗株的构建方法：利用已建立的具有较强细胞免疫应答毒株的反向遗传操作系统为框架(O型口蹄疫病毒O/CHA/99株拯救系统的真核转录质粒prO/CHA/99)，替换进筛选获得的对O型FMDV不同谱系均具有交叉保护性的O/JSCZ/2013的抗原基因；同时将3B蛋白的免疫抑制位点进行突变，构建了免疫抑制降低的O型口蹄疫重组疫苗株。虽然本实施例仅将病毒框架(O型口蹄疫病毒O/CHA/99)3B蛋白的3个拷贝3B1、3B2和3B3的第17位氨基酸均突变为谷氨酸，使3B蛋白丧失了抑制天然免疫应答的能力，构建了免疫抑制降低的O型口蹄疫重组口蹄疫疫苗株。但是，由于FMDV 3B蛋白的3个拷贝3B1、3B2和3B3在不同血清型口蹄疫病毒中具有高度同源性，序列比对见图1，因此，根据本领域技术人员的公知常识，也可以以不同血清型口蹄疫病毒为框架，并将病毒框架的3B蛋白的3个拷贝3B1、3B2和3B3的第17位氨基酸均突变为谷氨酸，进而使不同血清型口蹄疫毒的3B蛋白的免疫抑制功能丧失，同样能够成功构建免疫抑制降低的口蹄疫重组疫苗株。

并且本实施例的目的在于使口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能丧失，其中改变口蹄疫病毒3B蛋白的构象、理化特性或与宿主蛋白的结合力，可以使口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能丧失，而本领域常用基因缺失技术、基因突变技术、基因插入技术等基因工程手段，改变口蹄疫病毒3B蛋白的构象、理化特性或与宿主蛋白的结合力，导致口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能丧失。根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段使口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能丧失。

实施例6 3B蛋白突变的A型口蹄疫重组疫苗株的构建及鉴定

6.1重组A型口蹄疫病毒感染性克隆的构建

本发明人所用A/WH/CHA/09毒株由农业部兽医局指定国家口蹄疫参考实验室保藏，公众可通过农业部兽医局批示的委托函获得。

根据A/WH/CHA/09毒株基因组序列，设计合成一对扩增引物，AP1-F(5'-TTTTCCTTAAGGGACAGGAACATGCTGTGTTTGCCTGCGT-3')和AP1-R(5'-TATTTTCACCGGTGCAATAATTTTCTGCTTGTGTCTGTC-3')，用RNAeasy Mini Kit(Qiagen)提取A/WH/CHA/09毒株的总RNA，用引物oligNotI(5’-ttttctagagcggccgct₃₈-3’)反转录合成第一链cDNA，用具有极强延伸能力的PrimeScript Reverse Transcriptase(TaKaRa公司)反转录酶，按照产品说明书配制20μL反应体系，于42℃反应1h备用，以反转录的第一链cDNA为模板，用引物AP1-F和AP1-R扩增获得A/WH/CHA/09毒株的基因片段。扩增用适合长片段扩增、性能优良的LA(TaKaRa公司)DNA聚合酶，按照产品说明书配制50μL反应体系，扩增条件为：94℃5min，94℃30s，57℃30s，72℃2min30s，35个循环后，72℃10min，纯化回收PCR扩增产物，核苷酸序列如SEQ ID N0.8所示。

将得到的含有A/WH/CHA/09毒株部分L基因和P1片段和O型口蹄疫病毒O/CHA/99株拯救系统的质粒prO/CHA/99分别用AflII和SgrAI双酶切后，纯化回收相应的目的片段，连接、转化至JM109感受态细胞中，测序鉴定阳性克隆，获得含A/WH/CHA/09毒株部分前导蛋白L和结构蛋白P1的重组质粒prA-FMDV(所用质粒与方法公开于授权发明专利“重组口蹄疫二价灭活疫苗及其制备方法和应用”ZL201710256450.0和“A型口蹄疫重组疫苗株及其制备方法和应用”ZL201310175324.4，其全文通过引用并入本申请中)。

重组质粒prA-FMDV中FMDV基因组序列3'UTR的PolyA的N端为限制性内切酶切位点SbfI，将重组质粒prA-FMDV经SgrAI和SbfI双酶切后连接至POK12载体中，获得含3B基因片段的质粒POK-s3B，以该质粒为模板对3B基因进行点突变，突变引物及方法同实施例5中5.1所述的方法，最终获得突变3B的质粒POK-ms3B，突变后的3B编码的氨基酸如SEQ ID NO.6所示。

将获得的含有3B1、3B2、3B3的17位氨基酸均突变为谷氨酸的重组质粒POK-ms3B经SgrAI和SbfI双酶切回收目的片段，与重组A型真核质粒prA-FMDV经相同酶切后回收的载体片段进行连接，转化至DH5α感受态细胞中，测序鉴定阳性克隆，确认3B基因的3个氨基酸位点成功突变，最终获得含3B基因突变的重组质粒prA-m3B-FMDV。

6.2重组病毒的拯救

当BHK-21细胞生长至80％时用于转染，在脂质体Lipofectamine^TM2000(Invitrogen)的介导下将4μg重组质粒prA-m3B-FMDV转染BHK-21细胞，同时设立脂质体对照和正常细胞对照，放置于含5％CO₂的37℃培养箱中，观察细胞状态及细胞病变情况，待细胞出现90％左右病变时收获病毒，反复冻融3次后再次接种BHK-21细胞，直到病毒能稳定地产生细胞病变，出现细胞变圆，聚集成葡萄状分布，最终细胞崩解成碎片；结果如图8所示，其中，A为正常对照BHK-21细胞图片，C为拯救的重组病毒rA-m3B-FMDV感染BHK-21细胞出现的CPE的图片。拯救的重组病毒rA-m3B-FMDV感染BHK-21细胞后能稳定地产生细胞病变，出现细胞变圆，聚集成葡萄状分布而崩解，最终成功获得了A型口蹄疫重组病毒，并命名为rA-m3B-FMDV。

6.3 RT-PCR鉴定重组病毒

将稳定传代的重组病毒rA-m3B-FMDV感染BHK-21细胞的上清用RNAeasy Mini Kit(Qiagen)提取总RNA，反转录后，扩增含3B的基因片段，纯化回收后送测序，结果显示获得的重组A型口蹄疫病毒的3B基因与理论序列一致，3B1、3B2、3B3的3个拷贝中第17位氨基酸均为谷氨酸。

综上，为了提高口蹄疫重组病毒的抗原匹配性及抗原广谱性，本实施例提供了一种A型重组疫苗株的构建方法：利用已建立的具有较强细胞免疫应答毒株的反向遗传操作系统为框架(O型口蹄疫病毒O/CHA/99株拯救系统的真核转录质粒prO/CHA/99)；替换进筛选获得的具有抗原匹配性高、交叉免疫保护性强的A/WH/CHA/09的抗原基因；同时将3B蛋白的免疫抑制位点进行突变，构建了免疫抑制降低的A型口蹄疫重组疫苗株。虽然本实施例仅将病毒框架(O型口蹄疫病毒O/CHA/99)3B蛋白的3个拷贝3B1、3B2和3B3的第17位氨基酸均突变为谷氨酸，使3B蛋白丧失了抑制天然免疫应答的能力，构建了免疫抑制降低的A型口蹄疫重组口蹄疫疫苗株。但是，由于FMDV 3B蛋白的3个拷贝3B1、3B2和3B3在不同血清型口蹄疫病毒中具有高度同源性，序列比对见图1，因此，根据本领域技术人员的公知常识，也可以以不同血清型口蹄疫病毒为框架，并将病毒框架的3B蛋白的3个拷贝3B1、3B2和3B3的第17位氨基酸均突变为谷氨酸，进而使不同血清型口蹄疫毒的3B蛋白的免疫抑制功能丧失，同样能够成功构建免疫抑制降低的口蹄疫重组疫苗株。

并且本实施例的目的在于使口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能丧失，其中改变口蹄疫病毒3B蛋白的构象、理化特性或与宿主蛋白的结合力，可以使口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能丧失，而本领域常用基因缺失技术、基因突变技术、基因插入技术等基因工程手段，改变口蹄疫病毒3B蛋白的构象、理化特性或与宿主蛋白的结合力，导致口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能丧失。根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段使口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能丧失。

实施例7 3B蛋白突变的口蹄疫重组病毒免疫抑制能力检测分析

用等量的3B蛋白突变的口蹄疫重组疫苗株rO-m3B-FMDV及其亲本病毒分别感染猪源PK-15细胞，感染12h后，收集细胞，提取RNA，利用qPCR检测IFN-β和干扰素诱导抗病毒基因ISG15，ISG56和MX1的mRNA表达变化。

实验结果如图9所示，其中A为qPCR测定口蹄疫病毒的结果，B为IFN-β含量检测结果，C为ISG15含量检测结果，D为MX1含量检测结果，E为ISG56含量检测结果。结果表明，3B蛋白突变的口蹄疫重组病毒复制的能力与其亲本毒相比显著下降，但其诱导的IFN-β和干扰素诱导抗病毒基因ISG15，ISG56和MX1的能力却明显高于其亲本毒。以上结果表明，3B蛋白突变的口蹄疫重组病毒对宿主细胞的致病力显著下降，而其诱导天然免疫应答的能力大幅增加。因此，3B蛋白突变的口蹄疫重组病毒可作为口蹄疫病毒疫苗种毒，能够提升疫苗的生物安全性，增加疫苗的免疫效力。

实施例8 3B蛋白突变的口蹄疫重组病毒对BHK-21细胞的致病力试验

按照常规方法对BHK-21细胞进行消化，加入含10％胎牛血清的MEM细胞培养基，分散于12孔板中，于37℃含有5％CO₂的培养箱中培养，待细胞单层长到90％时备用。用MEM以10倍倍比稀释病毒液，将各稀释度(10^-4.0～10^-9.0)的病毒液分别加入细胞板中，每个稀释度4孔，放入37℃含有5％CO₂的培养箱中进行培养，观察3天，用Reed-Muench氏法测定对BHK-21细胞的半数感染量(TCID₅₀)。按照该法测定rO-m3B-FMDV和rA-m3B-FMDV及对应亲本毒rO-FMDV和rA-FMDV的滴度，计算rO-m3B-FMDV的TCID₅₀为10^-8.33/mL，对照亲本毒rO-FMDV的TCID₅₀为10^-8.23/mL；rA-m3B-FMDV的TCID₅₀为10^-8.33/mL，对照亲本毒rA-FMDV的TCID₅₀为10^-8.5/mL。结果说明3B蛋白突变的口蹄疫重组病毒在口蹄疫病毒工程生产细胞系中的复制能力与其亲本毒没有差异，结合实例7中，3B蛋白突变的口蹄疫重组病毒对宿主细胞的致病力显著下降，而其诱导天然免疫应答的能力大幅增加。因此3B蛋白突变的口蹄疫重组病毒可作为口蹄疫病毒疫苗种毒，具有良好的生产性能及更高的生物安全性。

其中，Reed-Muench计算方法是本领域的已有技术，现有文献“Reed,L.J.andMuench,H.(1938)."A Simple Method of Estimating Fifty Percent Endpoints".TheAmerican Journal of Hygiene 27:493–497”中对此已经进行了详细地描述，该文献在此通过引用方式并入本申请用作参考。

实施例9 3B蛋白突变的口蹄疫重组病毒制备灭活疫苗免疫评价

9.1抗原制备

用悬浮BHK-21细胞制备口蹄疫重组病毒rO-m3B-FMDV及流行毒株O/BY/CHA/2010(所用悬浮细胞制备方法及参数公开于授权专利“重组口蹄疫二价灭活疫苗及其制备方法和应用”ZL201710256450.0，其全文通过引用并入本申请中)，收获的病毒液即为病毒培养物，置于-40℃保存。将rO-m3B-FMDV和O/BY/CHA/2010病毒培养物分别灭活，用3mmol/l二乙烯亚胺(Binary ethylenimine，BEI)(Sigma公司)30℃灭活30h，加入阻断剂硫代硫酸钠溶液，4℃过夜，保存备用。灭活抗原经安检合格后测定抗原含量，与ISA206佐剂(法国SEPPIC)以1∶1比例混合制备疫苗。具体按照《中华人民共和国药典》中兽用生物制品的口蹄疫灭活疫苗规程制备。

9.2重组疫苗株与流行毒株制备疫苗免疫比较试验

实验用猪购自非疫区，并经国家口蹄疫参考实验室生产的FMD液相阻断ELISA(LPB-ELISA)检测O型抗体均＜1：4。FMD非结构蛋白3ABC-ELISA抗体检测为阴性。

3B蛋白突变的重组O型口蹄疫疫苗(rO-m3B-FMDV)和流行株制备的疫苗(O/BY/CHA/2010)分别免疫7头猪，免疫抗原剂量相同，于免疫后第7d，14d，21d，28d用O型FMD液相阻断ELISA(LPB-ELISA)检测血清中的抗体水平。28d后，用1000倍SID₅₀剂量的流行毒(O/BY/CHA/2010)进行攻毒实验，设3头对照，连续观察15日。

结果如表1所示，3B蛋白突变的重组O型口蹄疫疫苗能够诱导早期免疫应答，且免疫后抗体效价随着免疫期的延长不断上升，抗体应答比流行株疫苗早，并且产生的抗体水平也比野毒株疫苗免疫组高。攻毒结果显示，重组疫苗株的保护率为100％，比流行株制备疫苗的保护率(85.7％)高。上述结果说明，与流行株制备的疫苗相比，本发明制备的3B蛋白突变的重组O型口蹄疫疫苗免疫动物后能够获得更好的免疫应答效果。

表1 3B蛋白突变的O型口蹄疫重组疫苗与流行毒株制备疫苗免疫猪后抗体应答与保护率比较

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的相关科学研究及技术研发人员来说，在参照本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 免疫抑制功能降低的口蹄疫重组病毒及其制备方法与应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 213

<212> DNA

<213> 口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)

<400> 1

ggaccctacg ccggaccact cgagcgccag agacctctga aagtgagaga gaagctgcca 60

cagcaggagg gaccttacgc cggtccgatg gagagacaga aaccactgaa agtgaaagag 120

aaagccccgg tcgtgaagga aggaccttac gagggaccgg tgaagaagcc tgtcgctttg 180

aaagtgaaag agaagaactt gatcgtcact gag 213

<210> 2

<211> 71

<212> PRT

<213> 口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)

<400> 2

Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Leu Glu Arg Gln Arg Pro Leu Lys Val Arg

1 5 10 15

Glu Lys Leu Pro Gln Gln Glu Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Met Glu Arg

20 25 30

Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Glu Lys Ala Pro Val Val Lys Glu Gly

35 40 45

Pro Tyr Glu Gly Pro Val Lys Lys Pro Val Ala Leu Lys Val Lys Glu

50 55 60

Lys Asn Leu Ile Val Thr Glu

65 70

<210> 3

<211> 213

<212> DNA

<213> 口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)

<400> 3

ggaccctacg ccggaccact cgagcgccag agacctctga aagtgagagc caagctgcca 60

cagcaggagg gaccttacgc cggtccgatg gagagacaga aaccactgaa agtgaaagcg 120

aaagccccgg tcgtgaagga aggaccttac gagggaccgg tgaagaagcc tgtcgctttg 180

aaagtgaaag ctaagaactt gatcgtcact gag 213

<210> 4

<211> 71

<212> PRT

<213> 口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)

<400> 4

Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Leu Glu Arg Gln Arg Pro Leu Lys Val Arg

1 5 10 15

Ala Lys Leu Pro Gln Gln Glu Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Met Glu Arg

20 25 30

Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala Lys Ala Pro Val Val Lys Glu Gly

35 40 45

Pro Tyr Glu Gly Pro Val Lys Lys Pro Val Ala Leu Lys Val Lys Ala

50 55 60

Lys Asn Leu Ile Val Thr Glu

65 70

<210> 5

<211> 3591

<212> DNA

<213> 口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)

<400> 5

cttaagggac aggaacacgc cgtgtttgcc tgcgtcacct ccaacgggtg gtacgcgatc 60

gacgacgaag aattctaccc ctggacgcca gatccgtccg acgtgctggt ctttgtcccg 120

tacgatcaag aaccacttaa tggagaatgg aaagcaaggg ttcagagacg gctcaaggga 180

gccggacaat ccagtccggc tactgggtca cagaaccaat caggcaacac cgggagtatc 240

atcaacaatt actacatgca gcaataccag aactccatgg acacccaact tggtgacaat 300

gctatcagcg gaggctccaa cgagggatcc acagacacaa cctccaccca cacaaccaac 360

actcagaaca atgactggtt ttcaaagttg gccagctctg ccttcagcgg tcttttcggc 420

gccctcctcg ccgataagaa aaccgaggag accactcttc tcgaggaccg catcctcacc 480

acccgaaacg gacacaccac ctcgacaacc cagtcgagtg ttggcataac gcacgggtac 540

gcaacagctg aggattttgt gaacgggcca aacacctctg gtcttgagac cagagttgtc 600

caggcggaac ggttctttaa aacccacctg ttcgactggg tcaccagtga tccgttcgga 660

cggtactact tgttggagct cccgactgac cacaaaggtg tctacggcag cctgaccgac 720

tcatacgcct acatgagaaa cggttgggat gttgaggtca ccgctgtggg gaatcagttc 780

aacggaggct gcctactggt ggccatggta cctgaacttt gttccatcga gcggagagag 840

ctgttccagc ttacgctctt cccccaccag ttcatcaacc cccggacgaa catgacagcc 900

cacatcaagg tgccctttgt tggcgtcaac cgttacgatc agtacaaggt acacaagccg 960

tggacccttg tggttatggt cgtagcccca ctgactgtca acaccgaagg cgctccgcag 1020

atcaaggtgt atgccaacat cgcacccacc aacgtgcacg tcgcgggtga gttcccttcc 1080

aaagagggga ttttccctgt ggcctgtagc gacggttatg gcggcttggt gacaactgac 1140

ccaaagacgg ctgaccccgt ttacggcaaa gtgttcaacc ccccccgcaa catgttgccg 1200

gggcggttca ccaacctcct gggcgtggct gaggcttgcc ccacgtttct gcacttcgat 1260

ggtgacgtac cgtatgtgac cactaagacg gattcggaca gggtgctcgc acaatttgac 1320

ttgtctttgg cagcaaaaca catgtcaaac accttccttg caggtcttgc ccagtactac 1380

acgcagtaca gcggcaccgt taacctgcac ttcatgttca caggtcccac tgacgcgaaa 1440

gcgcgttaca tgattgcgta tgcccctccg ggcatggagc cgcccaaaac acctgaggct 1500

gctgctcact gcattcacgc agagtgggac acgggtctga actcaaagtt taccttttcc 1560

atcccctacc tctcggcggc tgattacgcg tacaccgcgt ctgacgctgc tgagaccaca 1620

aatgttcagg gatgggtctg cttatttcaa ataacacacg ggaaagctga gggtgacgct 1680

cttgtcgtgc tggccagtgc tggcaaagac tttgagctgc gcctgcctgt ggacgctcgg 1740

caacagacca cttcgacggg cgagtcggct gaccccgtga ctgccaccgt tgagaattac 1800

ggtggcgaga cacaggtcca gaggcgccac cacacagacg tctcattcat attggacaga 1860

tttgtgaaag tcacaccaaa agactcaata aatgtattgg acctgatgca gaccccctcc 1920

cacaccctag taggggcgct cctccgcact gccacttact atttcgctga tctagaggtg 1980

gcagtgaaac acaaggggga ccttacctgg gtgccaaatg gagcacctga agcagccttg 2040

gacaacacca ccaacccaac ggcgtactat aaggcgccgc ttacccggct tgcattgccc 2100

tacacggcac cacaccgtgt tttggccacc gtttacaacg ggaaatgcaa atacgccggg 2160

ggctcactgc ccaacgtgag aggcgatctc caagagctgg ctcagaaggc agcgaggccg 2220

ctgcctactt ctttcaacta cggtgccatc aaagccactc gggtgacaga actgctgtac 2280

cgcatgaaga gggccgagac gtactgtcct cggccccttt tggctgttca cccgagtgcg 2340

gccagacaca aacagaaaat agtggcgcct gtaaagcagt ccttgaactt tgatctgctc 2400

aagttggcag gggacgtgga gtccaaccct gggcccttct tcttctctga cgtcaggtca 2460

aacttcacca aactggtgga aaccatcaac cagatgcaag aggacatgtc aacaaaacac 2520

ggacccgact ttaaccggtt ggtatcagcg tttgaggaat tggccgctgg ggtgaaagcc 2580

atcaggaccg gcctcgacga ggccaaaccc tggtacaagc tcatcaagct cctgagccgc 2640

ttgtcatgca tggccgctgt agcagcacgg tccaaggacc cagtccttgt ggctatcatg 2700

ctggctgaca ccggtcttga gattctggac agcacatttg tcgtgcagaa aatctccgac 2760

tccctctcca gtctctttca cgtgccggcc cccgtcttca gtttcggagc tccgattctg 2820

ctagccgggt tggtcaaggt cgcctcgagc ttcttccggt ccacacccga ggatctcgag 2880

agagcagaga aacagctcaa agcacgtgac atcaatgaca tcttcgccat tctcaagaac 2940

ggcgagtggc tggtcaagtt gatcctagcc atccgcgact ggattaaagc atggatcgcc 3000

tcagaagaga agtttgtcac catgacagac ttggtgcctg gcatccttga aaagcagcgg 3060

gacctcaacg acccggccaa gtacaaggaa gccaaggaat ggctcgacaa cgcgcgccaa 3120

acgtgtttga agagcgggaa cgtccacatt gccaacctgt gcaaagtggt cgccccagca 3180

ccgagcaagt cgagacctga acccgtggtc gtgtgcctcc gcggcaaatc cggtcagggt 3240

aagagtttcc ttgcgaacgt gctggcacaa gccatctcta cccactttac cggcaggact 3300

gactcagttt ggtactgtcc gccagaccct gaccacttcg acggttacaa ccagcagacc 3360

gttgttgtga tggatgattt gggccagaat cccgacggca aggacttcaa gtacttcgcc 3420

cagatggtct cgaccacggg gttcatcccg cccatggctt cacttgagga caaaggcaag 3480

cctttcaaca gcaaagtcat cattgccacc accaacctgt actcgggctt caccccgaga 3540

accatggtgt gccccgatgc gctgaaccga aggtttcact ttgacatcga t 3591

<210> 6

<211> 71

<212> PRT

<213> 口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)

<400> 6

Gly Pro Tyr Thr Gly Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Arg

1 5 10 15

Glu Lys Leu Pro Gln Gln Glu Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Met Glu Arg

20 25 30

Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Glu Lys Ala Pro Val Val Lys Glu Gly

35 40 45

Pro Tyr Glu Gly Pro Val Lys Lys Pro Val Ala Leu Lys Val Lys Glu

50 55 60

Lys Asn Leu Ile Val Thr Glu

65 70

<210> 7

<211> 71

<212> PRT

<213> 口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)

<400> 7

Gly Pro Tyr Thr Gly Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Arg

1 5 10 15

Ala Lys Leu Pro Gln Gln Glu Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Met Glu Arg

20 25 30

Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Val Lys Ala Pro Val Val Lys Glu Gly

35 40 45

Pro Tyr Glu Gly Pro Val Lys Lys Pro Val Ala Leu Lys Val Lys Ala

50 55 60

Lys Asn Leu Ile Val Thr Glu

65 70

<210> 8

<211> 2373

<212> DNA

<213> 口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)

<400> 8

cttaagggac aggaacacgc agtgtttgcc tgtgttacct ccaacgggtg gtacgcgatt 60

gacgacgagg acttttaccc ctggacacca gacccgtctg atgtcctggt gtttgtcccg 120

tatgatcaag aaccactcaa cggagaatgg aaaacaaagg ttcagaggcg acttaaaggg 180

gcagggcaat ctagccccgc caccgggtcg cagaaccagt caggcaatac cggcagcatc 240

attaacaact actacatgca gcagtaccag aactccatgg acacacaact tggtgacaac 300

gccatcagcg gaggatccaa cgaggggtcc acggacacaa cctctaccca cacaaccaac 360

acccaaaaca atgactggtt ctcaaaactg gcaagttctg cattcaccgg tcttttcggc 420

gcactgctcg ccgacaagaa gaccgaagag acaactcttc tggaggaccg tatcctcacc 480

actcgtaatg gacacaccac ctctacaact cagtcgagtg tgggggtcac ctacgggtat 540

tcaactggtg aggaccacgt ttctggacct aacacatcag gtttggagac gcgggtggta 600

caagctgaaa ggttcttcaa gaagcacttg tttgattgga caacggacaa accctttggt 660

cacattgaaa agctggaact tcccactgat cacaaaggtg tctacggaca gctggtggac 720

tcctttgcat acatgagaaa tggctgggac gtggaggtgt ctgctgttgg caaccagttc 780

aacggcgggt gccttctcgt ggccatggta cctgagttta aggagttcac cacacgtgaa 840

aagtaccagc tcaccctgtt cccccaccag ttcattagcc ccagaaccaa catgaccgcg 900

cacatcacgg tcccgtacct tggtgtgaac aggtatgacc agtacaacaa acacaaaccc 960

tggacgttgg tggtgatggt ggtttcgcca cttaccacta gctccattgg tgcatcacag 1020

attaaggtct acaccaacat cgccccgacc cacgttcacg tggctggcga gctcccgtcg 1080

aaagagggga tcgtgccagt cgcctgctcg gacgggtacg gtggcctggt gacaacagac 1140

cctaaaacag ctgaccctgc ttacggtatg gtgtacaacc cacctaggac caactacccc 1200

gggcggttta caaacttgtt ggacgtggca gaggcgtgcc ccaccttcct ctgtttcgac 1260

gacgggaaac cgtacgttgt gacaagaacg gacgagcagc gcctcttggc caagtttgac 1320

ctttcccttg ctgcaaagca catgtcaaac acctaccttt cagggatagc acagtactac 1380

gcacagtact ctggcaccat caatttgcac ttcatgttta ctggttccac tgactcaaag 1440

gcccgttaca tggtggctta cgtcccgccc ggcgtgacaa cgccaccgga cacgcctgag 1500

agagctgcgc actgcatcca cgcagaatgg gacacggggc taaactccaa attcactttt 1560

tcaatcccat acgtatctgc tgcagattac gcgtacacag cgtccgatgt ggcagacaca 1620

acaaacgtac agggatgggt ttgcatctac caaatcaccc atgggaaggc cgaacaagac 1680

actctggttg tgtcggtcag cgccggcaaa gactttgagc tgcgcctccc cattgacccc 1740

cgtgcgcaaa ccaccgccac cggggaatca gcagaccccg tcacaaccac cgtcgagaac 1800

tacggtggtg agacacaagt gcagcgacgc caccacaccg acgtcagctt cataatggac 1860

aggtttgtgc aaatcaagcc tgtgagcccc acacatgtca ttgacctcat gcaaacacac 1920

caacacgggc tggtgggcgc tatgttgcgc gcggccacct actacttttc tgatcttgag 1980

attgtggtga accacacggg tcgcctaacg tgggtaccca atggagcacc tgaggcagca 2040

ctggacaaca cgagcaaccc cactgcttac cacaaagcac cgttcacacg gcttgcactc 2100

ccttacaccg cgccacaccg cgtgttggca actgtgtaca acgggaatag caagtactct 2160

gcgcctgcaa cacggcgagg tgacttgggg tctctcgcgg cgaggctcgc cgcacagctt 2220

cctgcctcct tcaactacgg cgcgattcga gccacggaga tccaagaact cctcgtgcgc 2280

atgaagcgtg ccgagctcta ctgccccagg ccactgctgg cggtggaggt gacgtcacaa 2340

gacagacaca agcagaaaat tattgcaccg gtg 2373

Claims (10)

1.口蹄疫病毒3B蛋白在制备免疫抑制剂中的应用。

2.通过仅丧失口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能制备口蹄疫重组病毒的方法。

3.通过仅丧失口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能制备口蹄疫重组疫苗株的方法。

4.一种口蹄疫重组病毒，其特征在于，将亲本口蹄疫病毒中3B蛋白的免疫抑制功能丧失。

5.一种包含权利要求4所述口蹄疫重组病毒的口蹄疫重组疫苗株。

6.一种制备口蹄疫重组病毒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)构建口蹄疫病毒全长感染性克隆。

(2)利用基因突变技术或基因合成技术在口蹄疫病毒全长感染性克隆的基础上，将3B蛋白的三个拷贝3B1、3B2、3B3的17位氨基酸突变为极性氨基酸。

(3)将得到含突变3B1、3B2、3B3的17位氨基酸为极性氨基酸的真核转录质粒转染口蹄疫病毒敏感细胞，获得口蹄疫重组病毒。

7.如权利要求6所述方法制备获得的口蹄疫重组病毒。

8.一种包含权利要求7所述口蹄疫重组病毒的口蹄疫重组疫苗株。

9.根据权利要求8所述的口蹄疫重组疫苗株制备获得的口蹄疫重组疫苗。

10.如权利要求9所述的口蹄疫重组疫苗在制备用于预防和/或控制动物口蹄疫疾病的药物中的应用。

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